CN105334196B - 一种检测3D类器官中P-gp介导的Rh123转运的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测3D类器官中p‑糖蛋白(P‑glycoprotein,P‑gp)介导的罗丹明123(Rh123)转运的方法及其在筛选P‑gp的抑制剂中的应用。首先对C57BL/6小鼠的小肠隐窝进行分选，接种到含有基质胶的培养皿中，并在Advanced DMEM/F12培养基中培养，形成3D类器官。然后利用该3D类器官模型定性定量检测P‑gp介导的Rh123的转运及P‑gp的抑制剂维拉帕米(Verapamil)对Rh123转运的影响，具体包括3D类器官分别与①P‑gp的底物Rh123②Rh123和Verapamil共孵育，使用超声破碎法释放3D类器官中的Rh123，最后在多功能酶标仪上对Rh123的浓度进行检测。该方法具有简便、快速、灵敏度高的优点，可结合3D类器官模型开展P‑gp介导的药物转运的研究，也可进行P‑gp抑制剂体外筛选的研究。

Description

一种检测3D类器官中P-gp介导的Rh123转运的方法及应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种检测3D类器官中P-gp介导的Rh123转运的方法及其在筛选P-gp抑制剂中的应用。

背景技术

目前在临床上，口服给药是最常见的给药方式，而且相对于静脉等其他的给药方式，具有相对安全和方便的优点。药物进入机体内，一般要经过吸收、分布、代谢和排泄的过程，对于口服药物来说，其在小肠的吸收最为重要，因为这是药物在机体内发挥药效的前提。有研究表明，在新药研发过程中，大约40％的先导化合物在临床阶段被否决的最常见原因包括了药动学性质不理想，尤其是口服后吸收性较差，造成药物的生物利用度太低。因此，在化合物筛选的早期阶段，不仅要关注化合物的活性，也要对其药动学性质进行合理的评估，以期减少后期研究的投入和降低失败的风险。其中，基于p-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)转运体介导的药物筛选及药物吸收与外排的研究在新药研发中占有重要的地位。

P-gp是腺苷三磷酸(ATP)依赖性药物外排转运体，属于ATP结合盒(ATP bindingcassette,ABC)转运体家族中最大的一个亚型，亦是最重要的亚型之一。1976年，Juliano等人首次在秋水仙碱耐药的中国仓鼠卵巢细胞中发现了高分子质量(170kD)的细胞膜糖蛋白，并因其表达水平与细胞膜的通透性、细胞内的药物浓度以及细胞耐药程度有关而将其命名为P-gp。研究发现，P-gp在小肠粘膜的上皮细胞等正常的组织和细胞中也有表达。机体出于对自身的保护，药物等外来的有害物质在小肠的吸收就会受到限制，这也是造成口服药物在体内生物利用度降低的原因之一，进而影响了药效的发挥。因此，P-gp在药代动力学，特别是在药物的吸收与外排的过程中发挥着重要的作用。另外，P-gp在肿瘤细胞中的过度表达限制了抗肿瘤药物的摄取，是造成肿瘤细胞多药耐药(Multidrug resistance,MDR)现象产生的重要原因。

随着技术的发展及科研的需要，多种利用体外模型来模拟人的小肠上皮，并进行P-gp介导的药物转运的研究相继被报道。其中，基于人的结肠癌细胞系(caco-2)建立的细胞单层转运模型是国内外应用最广泛的模型。在转运小室(Transwell)的碳酸聚酯膜上培养caco-2细胞，通过细胞之间的紧密连接形成具有极性的细胞单层，可用于研究P-gp底物的吸收与外排。虽然该模型被视为体外研究药物转运的标准，但是，其存在的一些局限性依然不能被忽视。例如，caco-2肿瘤细胞在生理和形态上与正常的小肠上皮细胞有很大的差别；而且，细胞的培养条件和代数会对模型的稳定性造成影响；另外，培养周期(21天)过长也是高通量筛选的一个制约因素。因此，非常有必要建立一种全新的体外研究P-gp介导的药物转运的模型。

2009年，Toshiro Sato等人报道了在体外利用单个小肠隐窝可以分化形成绒毛状的上皮结构。小肠隐窝中存在的干细胞在适宜的条件下具有分化再生功能，在基质胶中可以形成一个三维的球状类器官(organoid)结构，因此称之为3D类器官。3D类器官中新形成的隐窝向外侧突起，内侧形成了绒毛状的结构，相比于caco-2细胞转运模型，3D类器官是由正常的小肠干细胞分化而来，因此其在生理上与小肠上皮更为相似。而且，P-gp在3D类器官中的表达的位置与表达量与其在小肠中的表达没有明显差异。另外，培养周期短(3-5天)也为P-gp介导的药物转运的筛选节约了时间和经济成本。

目前，利用3D类器官模型进行P-gp介导的药物转运的研究已有报道。罗丹明123(Rh123)作为P-gp的底物，被P-gp通过外排作用从培养基(基底侧)中转运至3D类器官的腔中(肠腔侧)。而且由于Rh123可以自发荧光，激发波长为485nm，发射波长为535nm，这也为Rh123的检测和定量提供了便利。虽然已有的报道通过荧光定量显微镜对3D类器官中的Rh123进行实时监测，根据荧光的强弱来反应其浓度的高低。但是该方法每次只能对一个3D类器官进行监测，而且每次监测需要在整个实验过程中对荧光强度进行实时追踪。该方法不仅过程繁琐，而且需要耗费大量的时间。

发明内容

为了克服现有技术中的上述缺陷，本发明提出了一种全新的体外研究P-gp介导的Rh123转运的检测方法。该检测方法具有简便、快速、灵敏度高的优点，可利用3D类器官模型进行P-gp介导的药物转运的研究，也可进行P-gp抑制剂体外筛选的研究。

具体地，本发明提出了一种检测3D类器官中P-gp介导的Rh123转运的方法及应用。所述方法包括：(1)3D类器官分别与①P-gp的底物Rh123②Rh123和P-gp的抑制剂共孵育；(2)3D类器官的收集，超声破碎法使其中的Rh123释放；(3)在多功能酶标仪上对Rh123的荧光强度进行检测，进而可以得知3D类器官中Rh123的浓度。

所述“3D类器官模型”指的是小肠隐窝中的干细胞在基质胶中，利用含有Responding,m-noggin和m-EGF等生长因子的Advanced DMEM/F12培养基提供必要的营养成分，进行分化再生而形成的三维的球状结构。所述3D类器官模型中间是由细胞围成的一个球状空腔，模拟的是小肠的肠腔侧；而外周的突起是由干细胞分化形成的新的隐窝，模拟的是小肠的基底侧。

所述P-gp底物包括地高辛(Digoxin)、洛哌丁胺(Loeramide)、奎尼丁(Quinidine)、长春花碱(Vinblastine)和Rh123等；优选使用P-gp底物Rh123。所述P-gp底物Rh123在本发明中的作用是作为一种探针，指示3D类器官中P-gp的活性。Rh123可被P-gp从培养基中(基底侧)转运至3D类器官的腔侧(肠腔侧)。在相同的转运时间内，3D类器官的腔侧Rh123的浓度的高低与P-gp活性呈正相关。

所述P-gp介导的药物指的是可与P-gp的活性位点结合，并借助ATP提供的能量进行转运的药物。Rh123作为P-gp的底物，可以与3D类器官上的P-gp结合而被转运。如当P-gp的活性位点被抑制剂抑制时，P-gp介导的Rh123转运就会受到限制，3D类器官腔侧的Rh123浓度就会降低。

所述P-gp的抑制剂包括克拉霉素(Clarithromycin)、酮康唑(Ketoconazole)、利托那韦(Ritonavir)、奎尼丁(Quinidine)和Verapamil等；优选地，所述P-gp抑制剂为维拉帕米(Verapamil)。

所述P-gp的抑制剂Verapamil在本发明中的作用是作为一种阳性抑制剂来验证所建立的方法是否正确可靠，从而保证方法可以用于P-gp抑制剂的筛选。Verapamil作用机制是与P-gp的底物Rh123竞争性地结合P-gp的活性位点，从而减弱P-gp对Rh123的外排作用，最终导致3D类器官腔侧Rh123浓度的降低。

超声破碎法的具体操作条件为：在400瓦特(W)的工作电压下，超声时间为5秒(s)，间隙时间为2s，工作次数为3次。

3D类器官破碎的程度为：在上述操作条件下，由细胞团状沉淀变成混悬状浊液时，离心并测定上清中的Rh123的荧光强度。

其中，所述步骤(1)中，3D类器官培养至第三天时，对96板中各个孔的3D类器官进行计数，然后吸掉培养基；并分别加入新的含药培养基：对照组(Control)只含有Rh123；给药组同时含有Rh123和维拉帕米(Verapamil)，其中Rh123的浓度为10μM，P-gp抑制剂Verapamil的浓度为20μM。

更具体地，所述步骤(1)中在3D类器官培养前包括小鼠小肠隐窝的分选：

①取C57BL/6小鼠的小肠，将其分成若干片段，并从中间剪开，用预冷的磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline,PBS)清洗干净。用盖玻片清除小肠绒毛，并将其转入含有适量PBS的离心管中，置于冰上。

②用含青霉素/链霉素(P/S)的PBS清洗3-4次，再将小肠片段转移至含有EDTA的PBS中，于4℃冰箱消化。

③将消化好的小肠片段转移至离心管，加入含有P/S的PBS，用力地摇晃数次后，收集悬浮液，用细胞过滤网过滤、离心、沉淀即为小肠的隐窝。

④弃上清，用Advanced DMEM/F12培养基重悬沉淀，计数。(培养基中含有Responding,m-noggin和m-EGF三种生长因子，可诱导小肠细胞的分裂及隐窝的扩增。)

⑤取重悬液转移至离心管中，离心。

⑥用预冷的基质胶(Matrigel)重悬沉淀并计数，隐窝的数量控制在5-10个/μl为最佳(基质胶具有在22-35℃为固态，在4℃为液态的特性)。

⑦接板：将96孔板放入细胞培养箱中预热，向每个孔中加入重悬液。

⑧将接种好的96孔板放置于细胞培养箱中，使基质胶凝固后加入培养基。

更进一步地，所述步骤(1)中，在培养3D类器官后，还包括进一步对3D类器官模型验证的步骤；包括(i)3D类器官形态的观察；(ii)mRNA水平上证明3D类器官中P-gp的表达的量；(iii)免疫组织化学法确证P-gp在3D类器官中表达的位置。

其中，所述步骤(i)中，将培养好的3D类器官放置在显微镜下进行观察。

其中，所述步骤(ii)中，包括mRNA的提取；以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA；mdrla引物的设计与验证；mdrla基因的PCR扩增；

其中，所述步骤(iii)中，包括将3D类器官的取材与固定；脱水与浸蜡；包埋与切片；免疫组化，①脱蜡②抗原修复③去除过氧化氢酶④抗原位点封闭⑤添加I抗⑥回收I抗⑦PBST润洗后，滴加显色液显色⑧蒸馏水润洗后，于苏木精中染色，酒精去色，自来水返蓝⑨封片⑩显微镜下成像。

其中，所述步骤(2)中，3D类器官与Rh123共孵育后，在不同的时间点分别对3D类器官进行收集。用PBS清洗每个孔，以清除残留的Rh123。然后将其置于冰上，使基质胶变为液态。将基质胶连同PBS离心5min。弃去上清，用PBS进行重悬，超声波对3D类器官进行破碎，释放其中的Rh123。

其中，所述步骤(3)中，将超声破碎后的3D类器官进行离心，取上清用多功能酶标仪进行检测。为了消除因3D类器官的个数差异而带来影响，将每个孔的计算所得浓度与个数进行了相除，即换算成单个3D类器官中的Rh123浓度。

本发明还提出了一种将所述方法应用于检测待测药物的应用，其中，所述待测药物包括P-gp的抑制剂。

本发明的有益效果在于：本发明首次利用超声破碎法对3D类器官进行破碎处理，并且利用多功能酶标仪对Rh123的浓度进行检测，其优点在于：

(1)相比于caco-2细胞等转运模型，3D类器官是由正常的小肠干细胞分化而来，因此其在生理上与小肠上皮更为相似。而且，P-gp在3D类器官中的表达的位置与表达量与其在小肠中的表达没有明显差异。另外，培养周期短(3-5天)也为P-gp介导的药物转运的筛选节约了时间和经济成本。

(2)超声波细胞粉碎机对3D类器官的裂解彻底，操作简单。相对于细胞裂解液等裂解方法，避免了外来试剂对样品检测的干扰。

(3)利用多功能酶标仪可同时对多个样品进行检测，实现高通量筛选，而且易于操作，可以在短时间内完成检测。另外，仪器对Rh123的荧光检测的灵敏度很高，可以达到纳摩尔级别。

附图说明

图1为mdr1a基因的引物退火温度的摸索结果。其中，PCR产物大小为238bp，该引物的最适退火温度为59℃。

图2为3D类器官模型的验证结果。A图为显微镜下3D类器官的形态；B图为C57BL/6小鼠小肠、隐窝和3D类器官中mdr1a基因表达的检测结果；C图为小鼠小肠(左)与3D类器官(右)切片的免疫组化结果(箭头所指为P-gp的表达位置)，可以看出P-gp表达在小肠的绒毛侧和3D类器官的腔侧。

图3为Rh123的标准曲线。在5-500nM的范围内，Rh123的浓度与荧光强度呈线性，回归方程为：y＝55.27x+94.15，相关系数r²＝0.999，权重为：1/x²。

图4为不同处理组3D类器官中Rh123的浓度随时间的变化。在不同的时间点(20、40、60、80和100min)，3D类器官中肠腔侧的Rh123的浓度随着孵育时间的延长而增加，且给药组(Verapamil)测得的Rh123的浓度明显低于对照组(Control，只含有Rh123)。每个时间点三个平行数据，*代表P值<0.05。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1 C57BL/6小鼠隐窝的分选及3D类器官的培养

(1)取6-8周龄C57BL/6小鼠的小肠，将其分成5-8cm长的片段若干，从中间剪开，用预冷的磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline,PBS)清洗干净。用盖玻片清除小肠绒毛，并将其转入含有适量PBS的50ml离心管中，置于冰上。

(注：以下所有步骤都要在无菌环境中操作，且隐窝须尽可能置于冰上。)

(2)在生物安全柜中，用含青霉素/链霉素(P/S)的PBS清洗3-4次，再将小肠片段转移至25ml含有2mM EDTA的PBS中，于4℃冰箱消化10min。

(3)将消化好的小肠片段转移至50ml离心管，加入25ml含有P/S的PBS，用力地摇晃50次，收集悬浮液；再次将小肠片段转移至另一个50ml离心管，并加入25ml含P/S的PBS，继续用力摇晃50次，收集悬浮液。合并悬浮液，用直径为70μm的细胞过滤网过滤至离心管中，室温下900rpm离心5min，沉淀即为小肠的隐窝。

(4)弃上清，用2ml的Advanced DMEM/F12培养基重悬沉淀，取适量的重悬液计数。(培养基中含有Responding,m-noggin和m-EGF三种生长因子，可诱导小肠细胞的分裂及隐窝的扩增。)

(5)取适当体积的重悬液转移至1.5ml的离心管中，室温下900rpm离心5min。

(6)用预冷的基质胶(Matrigel)重悬沉淀并计数，隐窝的数量控制在5-10个/μl为最佳。(基质胶具有在22-35℃为固态，在4℃为液态的特性。)

(7)接板：将96孔板放入37℃细胞培养箱中预热，向每个孔中加入5μl的重悬液，使每个孔中隐窝的数量控制在25-50个。

(8)将接种好的96孔板于细胞培养箱中放置10-15min，使基质胶凝固；每孔加100μl培养基，然后每隔一天换一次培养基。

实施例2 3D类器官模型的验证

2.1 3D类器官形态的观察

C57BL/6小鼠的隐窝培养至第四天时，将其放置在带有Olympus DP 71照相系统的Olympus IX 71显微镜下观察并拍照，结果如图2-A所示。从图2-A中可以看出隐窝分化而成的类器官结构，中间由细胞围成一个球状的空腔，而外周的“出芽”是由干细胞分化而形成的新的隐窝。

2.2 mRNA水平上证明3D类器官中P-gp的表达

(1)C57BL/6小鼠小肠、隐窝及3D类器官中mRNA的提取

分别取适量小鼠的经过匀浆处理的小肠、隐窝和培养四天的3D类器官，置于1.5mlEP管中，并向其中加入适量Trizol，提取总RNA。

(2)cDNA的获取

以mRNA(1000ng)为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA。

(3)mdr1a引物的设计与验证

编码小鼠P-gp的基因有mdr1a和mdr1b两种，而在小肠中主要表达的是mdr1a。根据需要设计mdr1a cDNA上游引物-F:CATTGCGATAGCAGGAGT；下游引物-R:CTGGGTGAAGGAGAACGT。经验证，该引物的PCR产物比较单一，大小为238bp，且最适退火温度为59℃，结果如图1所示。

(4)PCR与琼脂糖凝胶电泳

以cDNA(1000ng)为模板，延伸时间为40s，退火温度为59℃，扩增34个循环，得到长度为238bp的产物。配制浓度为1.5％(w/v)的琼脂糖凝胶进行电泳，结果如图2-B所示。从图中可以看出，mdr1a基因在3D类器官中也有表达，且与C57BL/6小鼠的小肠及隐窝中的表达量没有明显的差别。其中，β-actin作内参。

2.3免疫组织化学法确证P-gp在3D类器官中表达的位置

(1)小肠组织的取材与固定

取6-8周龄C57BL/6小鼠的小肠，纵向剪开，用预冷的生理盐水清洗干净内容物。剪成5cm长度的片段，用镊子夹住，卷成瑞士卷形状(小肠绒毛在外侧)，用1ml注射器针头固定，置于4％(w/v,g/100ml)的多聚甲醛中，在4℃摇床过夜。

(2)3D类器官的取材与固定

从37℃培养箱中取出已培养四天的3D类器官，将96孔板置于冰上，取出其中的培养基，并加入150μl的预冷的PBS，用枪头在各孔中搅动，使基质胶分散在PBS中，并转移至15ml离心管中。收集适量的3D类器官，在4℃下800rpm离心5min。弃上清后，收集沉淀即为3D类器官。用称量纸将3D类器官包裹，置于4％多聚甲醛中，于4℃摇床过夜。

(3)脱水与浸蜡

将多聚甲醛固定的组织转移到包埋盒中，用自来水冲洗适当的时间，以去除组织中残留的多聚甲醛。通过酒精梯度脱水法进行小肠组织和3D类器官的脱水处理，用二甲苯对组织进行透明处理。脱水透明顺序为：50％酒精1h；75％酒精1h；85％酒精1h；95％酒精1h；100％酒精1h；酒精：二甲苯(1:1)20min；二甲苯I 15min；二甲苯II 15min。将组织从二甲苯中取出，放入蜡缸。浸蜡程序：蜡I 30min；蜡II 2h；蜡III过夜(约8h)。

(4)包埋与切片

将浸蜡完毕的组织块进行包埋，使组织固定在石蜡块中。其中3D类器官是球状，横切面和纵切面结构相同，所以包埋没有方向性。而小肠组织应将肠壁竖直放置，这样包埋的组织块切出的小肠切片呈螺旋状，能清楚地看到小肠绒毛，有利于形态结构观察。

切片前，用刀片削去组织周围多余的石蜡，将蜡块修成边缘整齐的正方形或长方形。切片时，将蜡块固定到切片机上，切片厚度为4μm，用毛笔或镊子小心挑取切片放到42℃水浴中展片，再将切片贴于载玻片上，做好标记，置于62℃烤片2h。冷却后，可长期保存。

(5)免疫组化

①脱蜡

具体程序为：将组织切片置于二甲苯I 10min；二甲苯II 10min；100％酒精5min；95％酒精5min；85％酒精5min；75％酒精5min；纯水3min。

②抗原修复

配制200ml 10mM的柠檬酸钠修复液倒入修复盒中，将切片逐一插入盒中，注意方向。盖紧盖子放入水浴中100℃反应20min后，自然冷却至室温。

③去除过氧化氢酶

将修复之后的切片浸入3％的过氧化氢，避光放置10min。先用蒸馏水润洗2-3次，再用PBST(PBS+0.1％(v/v)Triton X-100)润洗2次，每次3min。

④抗原位点封闭

用滤纸将组织周围液体擦干，滴加50μl封闭液(5％(w/v,g/100ml)脱脂奶粉)，在湿盒内静置，反应20min。

⑤添加I抗

甩掉封闭液，滤纸擦干残留在组织周围的液体，加50μl P-gp的特异性单克隆抗体。于湿盒内，在4℃冰箱中过夜。

⑥回收I抗，并用PBST润洗3遍，滴加生物素标记的II抗。反应15min并用PBST润洗后，滴加50μl链亲和素标记-HRP(辣根过氧化物酶)，在避光条件下，反应15min。

⑦PBST润洗后，滴加50μl DAB显色液显色3-5min。

⑧蒸馏水润洗后，于苏木精中染色1-2min(染细胞核，便于确定抗体分布，利于观察)，自来水润洗3次，75％酒精(含1％盐酸)去色20秒，蒸馏水润洗3次，放在自来水中20min返蓝。

⑨封片

将组织切片依次放入75％酒精3min；85％酒精3min；95％酒精3min；100％酒精5min；酒精：二甲苯(1:1)5min；二甲苯I 5min；二甲苯II 10min。取出切片，擦干后滴加适量树脂胶，盖上盖玻片，过夜晾干。

(6)将切片置于带有LEICA DFC310FX照相系统的LEICA DM4000 B LED显微镜下观察并拍照。结果如图2-C(箭头所指为P-gp的表达位置)，从小肠的免疫组化的结果可以看出，P-gp表达于小肠的绒毛侧，而从3D类器官的结果中可以看出，P-gp表达在3D类器官的内侧即腔侧。这也说明了3D类器官所形成的球状结构，其内侧模拟的是小肠的肠腔侧，而外侧模拟的是基底侧。

实施例3 3D类器官中P-gp介导的Rh123的检测及Verapamil对Rh123转运的影响

(1)Rh123标准曲线的建立

配制浓度为1mM的Rh123贮存液，并用PBS依次稀释成500,200,100,50,20,10,5nM的标准液,每个浓度有三个平行。利用多功能酶标仪(FLUOStar OPTIMA)进行检测，参数设定为激发波长为485nm，发射波长为535nm，测定不同浓度下Rh123的荧光强度。以Rh123的浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，进行线性回归，如图3所示。在5-500nM的范围内，Rh123的浓度与荧光强度呈线性，回归方程为：y＝55.27x+94.15，相关系数r²＝0.999，权重因子为1/x²。

(2)3D类器官与P-gp的底物Rh123共孵育

实验分为两组。3D类器官培养至第三天时，对96孔板各个孔里的3D类器官进行计数；弃去原有的培养基，并分别加入新的培养基：对照组(Control)只含有Rh123；给药组同时含有Rh123和维拉帕米(Verapamil)。Rh123的浓度为10μM，Verapamil的浓度为20μM。

(3)3D类器官的收集与破碎

在不同的时间点(20,40,60,80,100min)分别对3D类器官进行收集。首先用PBS清洗每个孔两遍，每遍5min，以清除残留的Rh123。再将其置于冰上，使基质胶变为液态。将基质胶连同PBS转移至1.5ml EP管中，在4℃1500rpm的条件下离心5min。弃去上清，用100μl的PBS进行重悬，并用超声波细胞粉碎机对3D类器官进行破碎，功率设为400W，使其中的Rh123释放。每个时间点三个平行数据。

(4)Rh123浓度的检测

将超声破碎后的3D类器官在4℃12000rpm的条件下离心5min，取75μl的上清在多功能酶标仪上进行检测，检测条件同“Rh123标准曲线的建立”。为了消除因3D类器官的个数差异而带来影响，将每个孔的计算所得浓度与个数进行了相除，结果如图4所示。从图中可以看出，采用本发明的检测方法可以准确的检测出3D类器官中Rh123的浓度。而且，由于P-gp的外排作用，3D类器官中的Rh123的浓度随着孵育时间的延长而增加。另外，在不同的时间点，给药组测得的Rh123的浓度明显低于对照组。产生此结果的原因是Verapamil对3D类器官上的P-gp产生了抑制作用，使得P-gp的外排作用减弱，导致3D类器官腔侧Rh123浓度的降低。因此，通过本发明的方法可以方便地检测药物对P-gp介导的Rh123转运的作用，从而确定该药物是否是P-gp的抑制剂。

Rh123在本发明中的作用是作为P-gp的一种探针底物，根据其在3D类器官腔侧的浓度来指示P-gp的活性。Rh123可被P-gp从培养基中(基底侧)转运至3D类器官的腔侧(肠腔侧)。在相同的转运时间内，3D类器官的腔侧Rh123的浓度的高低与P-gp活性呈正相关。药物被P-gp转运的条件是与P-gp上的活性位点结合，并且由ATP提供能量。当P-gp的抑制剂存在时，其活性位点被竞争性抑制或者ATP的酶活被抑制，P-gp介导的Rh123转运就会受到限制，3D类器官腔侧的Rh123浓度就会降低。因此，该发明可以用作P-gp抑制剂的体外筛选模型。

目前，已知的P-gp的抑制剂有很多，包括克拉霉素(Clarithromycin)、酮康唑(Ketoconazole)、利托那韦(Ritonavir)、奎尼丁(Quinidine)和维拉帕米(Verapamil)等，本发明中应用Verapamil作为阳性抑制剂来验证所建立的方法是否正确可靠，以及是否可以用于P-gp抑制剂的筛选。

本发明的有益效果在于：通过超声波破碎法使3D类器官中的Rh123释放，并利用多功能酶标仪对其进行检测，方法简单，快速，耗时短，灵敏度高，且可以实现高通量检测，为P-gp抑制剂的体外筛选提供了新的方法。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

Claims (6)

1.一种检测3D类器官中P‐gp介导的Rh123转运的方法，所述方法包括以下步骤：(1)3D类器官与Rh123共孵育；(2)3D类器官的收集，利用超声破碎法释放其中的Rh123；(3)使用多功能酶标仪对Rh123的荧光强度进行检测；

其中，步骤(1)中，所述3D类器官与含有所述Rh123的培养基进行共孵育，其中给药组同时含有Rh123和Verapamil，其中所述Rh123的浓度为10μM，所述Verapamil的浓度为20μM；

步骤(1)中，在培养3D类器官后，进一步包括对3D类器官模型验证的步骤，包括(i)3D类器官形态的观察；(ii)mRNA水平上证明3D类器官中P‐gp的表达的量；(iii)免疫组织化学法确证P‐gp在3D类器官中表达的位置，其中，步骤步骤(ii)中，包括mRNA的提取；以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA；mdr1a引物的设计与验证；PCR扩增mdr1a基因；其中，所述mdr1a的引物序列为：上游引物‐F:CATTGCGATAGCAGGAGT；下游引物‐R:CTGGGTGAAGGAGAACGT；

所述步骤(2)中，超声破碎法的具体操作条件为：在400瓦特(W)的工作电压下，超声时间为5秒(s)，间隙时间为2s，工作次数为3次；

所述步骤(3)中，还包括将每个孔的计算所得浓度与3D类器官的个数进行相除，换算成单个3D类器官中的Rh123浓度。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，在不同的时间点分别对3D类器官进行收集。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中在3D类器官培养前包括小鼠隐窝的分选步骤。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(i)中，将培养好的3D类器官放置在显微镜下进行形态观察。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(iii)中，包括3D类器官的取材与固定；脱水与浸蜡；包埋与切片；免疫组化。

6.将权利要求1所述的方法应用于检测待测药物的应用，其特征在于，所述待测药物包括P‐gp的抑制剂。