CN106667982A

CN106667982A - 一种制备斑马鱼血栓模型的方法

Info

Publication number: CN106667982A
Application number: CN201710104532.3A
Authority: CN
Inventors: 林瑞超; 李发荣; 樊娇娇; 赵崇军; 张文婷; 夏青
Original assignee: Beijing University of Chinese Medicine
Current assignee: Beijing University of Chinese Medicine
Priority date: 2017-02-24
Filing date: 2017-02-24
Publication date: 2017-05-17
Anticipated expiration: 2037-02-24
Also published as: CN106667982B

Abstract

本发明公开了一种制作斑马鱼血栓动物模型的方法，包括步骤为：收集并挑选斑马鱼鱼卵，培养水中加入肾上腺素溶液常规培养4～30小时后，使用邻联茴香胺染色，于显微镜下观察记录斑马鱼尾红细胞的染色面积，以斑马鱼尾红细胞的染色面积作为血栓发生的程度指标。该方法制作过程简单，成本低廉，可广泛推广，模型成功率高，结果稳定，斑马鱼的血栓形成与人类的血栓形成分子机制高度相似，可以用于抗血栓药物的筛选和药效评价。

Description

一种制备斑马鱼血栓模型的方法

技术领域

本发明属于医药领域，涉及一种制备斑马鱼血栓模型的方法。

背景技术

心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)是一类心脏或者血管相关的疾病。主要包括冠状动脉疾病如心绞痛、心肌梗塞，以及其他心血管疾病如中风、高血压心脏病、外周动脉疾病、静脉血栓等，是世界范围内致死和致残的主要疾病之一。《中国心血管病报告2015》显示：2014年，中国心血管病死亡率仍居疾病死亡构成的首位，高于肿瘤及其他疾病。其中，农村心血管病死亡率从2009年起超过并持续高于城市水平。心血管病占居民疾病死亡构成在农村为44.60％，在城市为42.51％。血栓形成或栓塞是导致心脏和外周血管事件的最后关键环节,是心血管疾病致死和致残的直接原因。临床常用的抗血栓药物如华法林，阿司匹林，氯吡格雷等，长期使用容易导致出血风险。溶栓药物如链激酶(Strepto kinase,SK),尿激酶(Urokinase,UK),蚓激酶(Lumbrukinase),尿激酶原(Pro-urokinase),葡激酶(Staphylokinase),重组组织型纤溶酶原激活剂等，均有较好的溶栓效应，但是由于血栓形成后的治疗窗口期在0-6小时左右，超过时限，即便是溶栓治疗，产生的临床意义也有限，所以开发新型的安全，高效的抗血栓生成药物仍然意义重大。

通过手术结扎、激光损伤、化学物质诱导等多种方法可以成功地诱导小鼠、大鼠，家兔等高等动物的血栓模型，但由于使用大鼠、小鼠等动物造模时，所需动物数量巨大、实验操作复杂，周期长、试验费用高、模型可重复性较差等原因，这类血栓动物模型仅适用于少数药物的抗血栓效应评价，尚不适用于抗血栓药物的大规模筛选。

和传统的哺乳类动物模型如啮齿类大鼠、小鼠相比较，斑马鱼动物模型具有饲养成本低，观察方便，易于实现高通量筛选，可有效模拟人类疾病病理特征等优点，已经成为公认的理想药物筛选模型。斑马鱼的血栓形成和凝血机制与人类相似，是很好的研究血栓形成的动物模型。现在已经通过不同的方法建立了多种斑马鱼血栓模型，如JagadeeswaranP研究团队用氯化铁、苯肼、或者激光损伤产生了相应的血栓模型。张勇研究小组发表了用苯肼诱导斑马鱼血栓研究的论文，刘可春课题组利用ADP成功的诱导了斑马鱼血栓模型。这些斑马鱼血栓模型或者由于操作繁琐，需要昂贵的设备，或者模型稳定性较差。

发明内容：

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种制备斑马鱼血栓动物模型的新方法。

本发明提供了一种制备斑马鱼血栓动物模型的方法，它利用肾上腺素作为血栓诱导剂。

具体的，它包括以下步骤：

1)挑选发育正常的斑马鱼30条左右移入微孔板，微孔板中事先加入用胚胎培养水配制的一定浓度肾上腺素溶液，药液加好后加盖封闭,置于培养箱内培养4-30小时后，吸弃培养水，用移液枪吸取等体积邻联茴香胺染色液于微孔板中避光染色15min；

或

挑选发育正常的斑马鱼30条左右，在其卵黄部位注射一定浓度肾上腺素溶液，注射完成后移入事先加入胚胎培养水的微孔板中，然后加盖封闭,置于培养箱内培养4-30小时后，吸弃培养水，用移液枪吸取等体积邻联茴香胺染色液于微孔板中避光染色15min；

2)移除染色液，用DMSO快速清洗3遍；

3)将斑马鱼转入新的微孔板中，加入DMSO；

4)取斑马鱼置载玻片上，于显微镜下对斑马鱼进行拍照并保存；

5)利用图像处理软件(如Image-Pro Plus 6)计算斑马鱼躯干部及尾部血管染色面积，记录斑马鱼尾部血管红细胞的染色面积作为血栓发生程度的指标。

其中，所述的斑马鱼幼鱼指的是受精后发育3-14天的幼鱼。

其中，所述的肾上腺素的浓度在2mmol/L～30mmol/L之间。

其中，所述的置于培养箱内培养时间为4-30小时。

其中，所述的斑马鱼指各种实验用品系的斑马鱼。

其中，斑马鱼胚胎培养用水配方：5mmol/L NaCl,0.17mmol/L KCl,0.4mmol/LCaCl₂,0.16mmol/L MgSO₄。

其中，邻联茴香胺染色液配方：含0.6mg/mL邻联茴香胺,0.01moL/L醋酸钠,0.65％H₂0₂,、40％酒精，溶剂为水。

0.65％H₂0₂是指：体积浓度为0.65％的H₂0₂。

40％酒精是指：体积浓度为40％酒精。

其中，斑马鱼幼鱼的选取：按照常规技术饲养斑马鱼，收集斑马鱼受精卵，受精卵进行消毒和清洗后,移入斑马鱼胚胎培养用水中(斑马鱼胚胎培养用水配方：5mmol/LNaCl,0.17mmol/L KCl,0.4mmol/L CaCl₂,0.16mmol/L MgSO₄),28℃下控光培养。在斑马鱼发育至5dpf,在倒置显微镜下挑选发育正常的斑马鱼幼鱼。

优选的，本发明动物模型的制备方法，包括以下步骤：

挑选健康性成熟的斑马鱼,按雌雄1∶2的比例放入交配缸内,次日清晨获得胚胎，用胚胎培养水进行清洗,除去死卵,放入28℃下控光培养箱，每日更换胚胎培养水两次，在斑马鱼发育至5dpf时，在体视显微镜下挑选发育正常的斑马鱼幼鱼进行实验，挑选发育正常的斑马鱼30条左右移入6孔板，6孔板中事先加入用胚胎培养水配制的浓度为4mmol/mL肾上腺素溶液，药液加好后置于培养箱(28℃)内培养8小时后，吸弃培养水，用移液枪吸取等体积邻联茴香胺染色液(含0.6mg/mL邻联茴香胺,0.01moL/L醋酸钠,0.65％,H₂0₂,、40％酒精)于微孔板中避光染色15min；移除染色液，用DMSO快速清洗3遍；取斑马鱼置载玻片上，于显微镜下对斑马鱼进行拍照并保存；利用图像处理软件计算斑马鱼躯干部及尾部血管染色面积。

进一步优选的，本发明动物模型的制备方法，包括以下步骤：

挑选健康性成熟的斑马鱼,按雌雄1∶2的比例放入交配缸内,次日清晨获得胚胎，用胚胎培养水进行清洗,除去死卵,放入28℃下控光培养箱，每日更换胚胎培养水两次，在斑马鱼发育至5dpf时，在体视显微镜下挑选发育正常的斑马鱼幼鱼进行实验，空白对照组、模型对照组、阳性药组各挑选发育正常的斑马鱼幼鱼30条移入6孔板，6孔板中除空白对照组外均加入用胚胎培养水配制的浓度为4mmol/mL肾上腺素溶液，空白对照组仅加入胚胎培养用水，阳性药组加入Warfarin至终浓度为300μmol/L，药液加好后置于28℃培养箱内培养8小时后，吸弃培养水，用移液枪吸取等体积邻联茴香胺染色液(含0.6mg/mL邻联茴香胺,0.01moL/L醋酸钠,0.65％,H₂0₂,、40％酒精)于微孔板中避光染色15min；移除染色液，用DMSO快速清洗3遍；取斑马鱼置载玻片上，于显微镜下对斑马鱼进行拍照并保存；利用图像处理软件计算斑马鱼躯干部及尾部血管染色面积，

血栓增加率和血栓抑制率的计算方法为：

血栓增加率％＝模型对照组斑块染色面积*100/空白对照组斑块染色面积；

血栓抑制率％＝(模型对照组斑块染色面积-阳性药组斑块染色面积)*100/模型对照组斑块染色面积，

其中，空白对照组溶液的配制：使用去离子水配制含5mmol/L NaCl,0.17mmol/LKCl,0.4mmol/L CaCl2,0.16mmol/L MgSO4，

其中，阳性药组溶液的配制：使用去离子水配制含5mmol/L NaCl,0.17mmol/LKCl,0.4mmol/L CaCl2,0.16mmol/L MgSO4,4mmol/mL肾上腺素，300μmol/L Warfarin。

本发明的另一个目的在于提供斑马鱼血栓动物模型的使用方法：

斑马鱼躯干部及尾部血管染色面积代表了血栓发生的程度，待评价药物可以在造模前加入，或者与肾上腺素同时加入，或者在肾上腺素加入后2-4小时内加入均可，通过比较空白对照组，模型对照组以及给药组的染色面积，可以定量的比较药物的抗血栓生成效应。

本发明采用肾上腺素诱导斑马鱼形成血栓动物模型，模型成功率高，稳定，肾上腺素功能众多，可以较好地模拟临床病理状态下血栓的发生，同时操作简便，可以在微孔板中操作，易于实现高通量筛选。

该方法制作过程简单，成本低廉，可广泛推广，模型成功率高，结果稳定，斑马鱼的血栓形成与人类的血栓形成分子机制高度相似，可以用于抗血栓药物的筛选和药效评价。

显然，根据本发明的上述内容，在不脱离本发明上述基本技术思想的前提下，还可以做出其他多种形式的修改、替换及变更。

对说明书中出现的以下名词进行解释、说明：

Dpf：Days past fertilization斑马鱼胚胎受精后发育的天数

DMSO：Dimethyl Sulphoxide二甲基亚砜

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明内容再做进一步说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1：本发明动物模型的制备

实验方法：斑马鱼饲养条件为：水温27.5-28.5℃，电导率450-850μS/cm，pH值6.8-7.2，明/暗周期为14h/10h。

挑选健康性成熟的斑马鱼,按雌雄1∶2的比例放入交配缸内,次日清晨获得胚胎，用胚胎培养水进行清洗,除去死卵,放入28℃下控光培养箱，每日更换胚胎培养水两次。在斑马鱼发育至5dpf时，在体视显微镜下挑选发育正常的斑马鱼幼鱼进行实验。空白对照组、模型对照组、阳性药组(Warfarin华法林，>98％，湖北兴银河化工有限公司)各挑选发育正常的斑马鱼幼鱼30条移入6孔板，6孔板中除空白对照组外均加入用胚胎培养水配制的浓度为4mmol/mL肾上腺素溶液，空白对照组仅加入胚胎培养用水，阳性药组加入Warfarin至终浓度为300μmol/L。药液加好后置于培养箱(28℃)内培养8小时后，吸弃培养水，用移液枪吸取等体积邻联茴香胺染色液(含0.6mg/mL邻联茴香胺,0.01moL/L醋酸钠,0.65％,H₂0₂,、40％酒精)于微孔板中避光染色15min；移除染色液，用DMSO快速清洗3遍；取斑马鱼置载玻片上，于显微镜下对斑马鱼进行拍照并保存；利用图像处理软件(如Image-Pro Plus 6)计算斑马鱼躯干部及尾部血管染色面积。

血栓增加率和血栓抑制率的计算方法为：

血栓抑制率％＝(模型对照组斑块染色面积-阳性药组斑块染色面积)*100/模型对照组斑块染色面积。

其中，空白对照组溶液的配制：使用去离子水配制含5mmol/L NaCl,0.17mmol/LKCl,0.4mmol/L CaCl₂,0.16mmol/L MgSO₄，

其中，阳性药组溶液的配制：使用去离子水配制含5mmol/L NaCl,0.17mmol/LKCl,0.4mmol/L CaCl₂,0.16mmol/L MgSO₄,4mmol/mL肾上腺素，300μmol/L Warfarin。

其中，4mmol/mL肾上腺素溶液:将肾上腺素溶解于胚胎培养水中使其含5mmol/LNaCl,0.17mmol/L KCl,0.4mmol/L CaCl₂,0.16mmol/L MgSO₄，4mmol/mL肾上腺素。

实验结果：

表1显示了华法林对AH诱导的斑马鱼尾部血栓面积影响，从数据可以看出，肾上腺素诱导后，血栓面积是原来面积的685％，华法林处理后，血栓面积大大降低，仅为原来的147％，华法林对肾上腺素诱导的血栓生成抑制率达到78.5％。说明本模型可以有效的诱导血栓发生，阳性药华法林可以有效地抑制肾上腺素诱导的血栓生成。

表1华法林对AH诱导的斑马鱼尾部血栓面积影响(n＝30)

	尾部血栓面积(像素)	血栓增加率％	血栓抑制率％
				CK	141.65±182.76	100	-----
AH	970.35±459.32	685	0
				Warfarin	207.85±236.22	147	78.5

实施例2：本发明动物模型的制备

挑选健康性成熟的斑马鱼,按雌雄1∶2的比例放入交配缸内,次日清晨获得胚胎，用胚胎培养水进行清洗,除去死卵,放入28℃下控光培养箱，每日更换胚胎培养水两次。在斑马鱼发育至3dpf时，在体视显微镜下挑选发育正常的斑马鱼幼鱼进行实验。空白对照组、模型对照组、阳性药组(Warfarin，>98％，湖北兴银河化工有限公司)各挑选发育正常的斑马鱼30条左右移入12孔板，12孔板中除空白组外均加入用胚胎培养水配制的浓度为2mmol/mL肾上腺素溶液，空白对照组仅加入胚胎培养用水，阳性药组加入Warfarin至终浓度为300μmol/L。药液加好后置于培养箱(28℃)内培养30小时后，吸弃培养水，用移液枪吸取等体积邻联茴香胺染色液(含0.6mg/mL邻联茴香胺,0.01moL/L醋酸钠,0.65％,H₂0₂,、40％酒精)于微孔板中避光染色15min；移除染色液，用DMSO快速清洗3遍；取斑马鱼置载玻片上，于显微镜下对斑马鱼进行拍照并保存；利用图像处理软件(如Image-Pro Plus 6)计算斑马鱼躯干部及尾部血管染色面积。

实施例3：本发明动物模型的制备

挑选健康性成熟的斑马鱼,按雌雄1∶2的比例放入交配缸内,次日清晨获得胚胎，用胚胎培养水进行清洗,除去死卵,放入28℃下控光培养箱，每日更换胚胎培养水两次。在斑马鱼发育至14dpf时，在体视显微镜下挑选发育正常的斑马鱼幼鱼进行实验。空白对照组、模型对照组、阳性药组(Warfarin，>98％，湖北兴银河化工有限公司)各挑选发育正常的斑马鱼30条左右移入24孔板，24孔板中除空白组外均加入用胚胎培养水配制的浓度为30mmol/mL肾上腺素溶液，空白对照组仅加入胚胎培养用水，阳性药组加入Warfarin至终浓度为300μmol/L，。药液加好后置于培养箱(28℃)内培养4小时后，吸弃培养水，用移液枪吸取等体积邻联茴香胺染色液(含0.6mg/mL邻联茴香胺,0.01moL/L醋酸钠,0.65％,H₂0₂,、40％酒精)于微孔板中避光染色15min；移除染色液，用DMSO快速清洗3遍；取斑马鱼置载玻片上，于显微镜下对斑马鱼进行拍照并保存；利用图像处理软件(如Image-Pro Plus 6)计算斑马鱼躯干部及尾部血管染色面积。

实施例4、

传统动物模型的制备

1.大鼠血栓模型

1.1.实验动物

150只SD大鼠,SPF级,年龄8～12w，体重300±209,雌雄不限。饲养条件为室温20～25℃,光线、通风良好,自由饮水、进食。适应性喂养2周。

1.2.实验试剂

3％碘酒消毒，75％的酒精脱碘，0.9％生理盐水；

1.3.试验设备

手术显微镜(镇江中天光学仪器有限责任公司；XTS-6A型)；

显微手术器械(上海医疗器械有限公司；Q/CYAEin-2000)；

彩色病理图像分析仪(日本OLYMpUS；BX50)；

显微镜摄像头(日本JVC；TK-C1381)；

直柄式电动石膏锯(浙江医疗器械有限公司)；

无水石膏绷带(浙江义乌捷康医疗用品有限公司；生产许可证2000308号)。

1.4.实验操作

实验大鼠不麻醉，3％碘酒消毒，75％酒精脱碘，消毒范围为剑突以下至足趾末端，铺无菌洞巾，行腹股沟处内侧切口，长约1cm，分离皮下组织，暴露股动、静脉和股神经，显露出长约1.5cm的股静脉，用同一厂家，同一批号新制12.5mm全齿蚊式血管钳分三段各钳夹1次，力量为血管钳紧1扣，每次持续3s，钳夹完毕，用1号丝线全层间断缝合皮肤切口，不放置引流，按同法处理另一侧后，行骸人字石膏固定，石膏厚度6层，固定石膏时开窗暴露切口位置，便于观察局部组织反应情况，切口用酒精纱布包扎。造模后大鼠正常饮水，颗粒饲料喂养，不使用抗菌素。

2.苯肼诱导的斑马鱼血栓模型

1.1.实验动物

AB系野生型斑马鱼。每次交配准备4～5对成年斑马鱼，平均每对能产200～300个胚胎。在受精后6h(即6hpf，hours post fertilization)和24hpf对胚胎进行清理(移除已死亡胚胎)，并根据胚胎的发育阶段挑选合适的胚胎。

1.2.实验试剂

苯肼(阿拉丁)、无水乙醇、邻联茴香胺染色液(含0.6mg/mL邻联茴香胺、0.01mol/L醋酸钠、0.65％H₂O₂、40％乙醇)；

1.3.试验设备

解剖显微镜(SMZ645，Nikon公司，日本)，电动聚焦连续变倍荧光显微镜(AZlOO，Nikon公司，日本)，12孔板(Nest Biotech)。

1.4.实验操作

在斑马鱼胚胎发育至2d时，在解剖显微镜挑选发育正常的斑马鱼胚胎，将其分到12孔板中，每孔30尾，分别设置血栓诱导剂处理组(0.5μmol/L～8μmol/L)、溶剂对照组(0.1％的酒精)、1个空白对照组(胚胎养殖用水)。之后28℃恒温培养箱培养1d。用邻联茴香胺染色液(含0.6mg/mL邻联茴香胺、0.01mol/L醋酸钠、0.65％H202、40％乙醇)对血栓诱导剂处理组、溶剂对照组、空白对照组进行染色，整个染色过程需避光操作。移除微孔板中的液体，加入等体积浓度为0.64mmol/L的甲磺酸麻醉斑马鱼，用3％甲基纤维素胶固定于双凹载玻片上后，置于荧光显微镜下观察各实验组斑马鱼尾静脉血栓形成情况。

本发明与传统的模型制备方法相比较，具有以下特点：

1.与其他实验动物模型相比，斑马鱼血栓模型具有检测快捷，成本低廉，便于抗血栓药物的高通量筛选的优点。

通过研究发现，关于血栓动物模型的研究很多，目前已经利用小鼠，大鼠、小型猪等多种实验动物，利用不同方法构建了相应的血栓实验动物模型。血栓模型的造模方法分为以下几类，第一类是对动物进行物理损伤形成血栓模型，比如光化学反应可导致血管内皮细胞损伤、血小板聚集和血栓形成。Herrmann等采用异硫氰酸荧光素作光敏剂引发光化学反应，使仓鼠面颊部血管的血小板发生聚集等。第二类是通过外界环境刺激或者药物(如肾上腺素)刺激造成动物情绪变化剧烈，从而导致血栓发生，如长期冷刺激，注射醋酸氢化可的松或者肾上腺素等方法造成血栓模型，其中注射肾上腺素加冰浴刺激是比较广泛的造模方法，目前使用最多。第三类方法是基于血液流变学特征的改变，通过注射高分子右旋糖苷诱导动物微循环减慢，形成类似血瘀进而形成血栓的动物模型，此模型在日本、韩国也受到关注。在以上模型中，判断血栓模型是否成功的基本指标包括血液流变学、血小板聚集性、血小板功能、血栓的形成及血栓面积、微循环等以及与此相关的生化因子如血小板活化相关因子，内皮素、细胞黏附分子、炎症因子等的变化。

以上基于小鼠、大鼠等哺乳动物的血栓模型可以很好的模拟人类血栓发生时的病理变化，对于验证药物的有效性，了解药物的作用机制有巨大的促进作用。以上模型的缺点在于使用较多的实验动物，造模周期较长，实验开销相对较多，在探讨具体的药物作用机制方面更具优势，但对于以药物活性评测、药物筛选为目的的实验则不适用，所以建立快速检测，成本低廉的血栓实验动物模型有重要的意义。

和传统的哺乳类动物模型如啮齿类大鼠、小鼠相比较，斑马鱼动物模型具有许多天然的优势。首先，斑马鱼体积小，成鱼体长仅3-4cm，幼龟体长只有1-2mm，可以使用96孔或者384孔微孔板进行大模规模实验操作，所以斑马鱼动物模型适合高通量、高内涵自动化分析；斑马鱼饲养成本低，占地空间小，200m²的空间可养殖50000条以上成鱼，而且药物用量少(微克级，为小鼠实验用药量的1/100到1/1000)；另外斑马鱼产卵量大，胚胎发育周期短，一对成鱼每周可产卵200-400枚，从受精卵到完整的胚胎仅需要24h，受精后60h左右，斑马鱼的心、脑、肝、肾、脾、胰腺、血液和血管等器官均已建成，斑马鱼发育7d之内，胚胎透明，结合荧光标记技术可以在显微镜下清晰的观察到器官的形态变化及功能变化，如心跳、心率、血流、肝脏、肾脏、心包形态上的异常等；斑马鱼基因组与人类相似度达85％，疾病相关的基因和人类的相似度高达99％，可以模拟人类的发病过程，用于药物筛选可以极大地降低药物筛选周期及成本，是非常理想的药物筛选模型。对于成分复杂的中药来说，分离纯化成本极高，而微克级的样品即可满足斑马鱼药物效应的观察，这对于其它模型来说是很难实现的。同时，斑马鱼作为整体动物模型，能够反映药物对于整体动物的作用效果，符合中药整体性作用的理论特点，比离体的细胞、分子药物筛选模型更能真实的反映中药多成分、多靶点的作用模式，能够有效的防止体外筛选中的漏筛现象，所以斑马鱼药物筛选模型尤其适用于成分复杂的中药活性物质的筛选。

2.与其他斑马鱼血栓模型相比，基于肾上腺素诱导的模型具有稳定，可重复性强，与人类血栓的形成机制相似度高等优点。

目前利用斑马鱼制作血栓动物模型的研究已开展了近十年，也取得了一些进展。已有的研究显示，斑马鱼的血栓形成和凝血机制与人类相似，在人类中存在的与血栓形成相关的基因在斑马鱼中均存在，功能也完全相似，所以斑马鱼是很好的研究血栓形成的动物模型。Jagadeeswaran P研究团队尝试用多种方法建立斑马鱼血栓模型，如氯化铁诱导的血栓模型，苯肼诱导的血栓模型及激光损伤诱导的血栓模型。其中苯肼诱导的血栓模型经进一步的研究证实，苯肼诱导的血栓并不是由于血小板聚集引起的血栓，不能模拟疾病发生时血栓的形成过程，用传统的抗血栓药物阿司匹林作用也不能抑制苯肼的诱导作用，国内张勇研究小组发表了用苯肼诱导斑马鱼血栓研究的论文，但该论文未对血栓的组成进一步的检测，仅仅限于血栓形态学的观测，所以该血栓模型的有效性仍然值得探讨；氯化铁诱导的血栓模型可以有效模拟人类疾病时血栓的发生，华法林等抗凝药物也可以对抗氯化铁诱导的血栓形成，但是该模型中，氯化铁是用滤纸贴在麻醉后的斑马鱼身体上，依靠药物的自然扩散作用扩散至血管导致形成血栓，操作十分繁琐，而且血栓通常在几十秒内形成，主要是由于氯化铁引发自由基爆发导致血栓形成，诱发血栓效应太过剧烈，药物的抗血栓效应难以观察，无法进行高通量的筛选，所以并不适合药物的筛选。Jagadeeswaran等用激光诱导的斑马鱼血栓模型同样是在几十秒内形成血栓，难以观察到药物的作用效果，同时由于该模型需要昂贵的激光器、显微操作装置等精密仪器，亦不适用于高通量筛选的需要。刘可春课题组利用ADP成功的诱导了斑马鱼血栓模型，但仅报道了ADP可以诱导血栓形成，血栓的形成证据是通过观察血小板荧光转基因斑马鱼(CD 41:GFP)背部的荧光亮斑证实的，缺乏血栓形成率等造模关键指标，同时也缺乏阳性药物的验证实验，所以该斑马鱼血栓模型的稳定性仍需要进一步的验证。我们前期利用ADP诱导斑马鱼血栓模型的实验发现，该模型的血栓成功率很低，ADP浓度较低时，很难诱发血栓形成，而ADP浓度较高时，极易导致斑马鱼的死亡，说明该模型存在不稳定性，我们推测可能的原因是ADP是生物体内能量代谢十分重要的分子，生物体内有丰富的磷酸酯酶可以使ADP分解为AMP或者转化为ATP,该过程可以极为迅速的进行，所以进入斑马鱼体内的ADP会被快速分解，在血液中难以达到诱发血栓形成的有效浓度，所以导致该模型不太稳定。

在以上研究的基础上，我们尝试了利用肾上腺素溶液作为诱导剂诱导斑马鱼产生以微循环障碍为特征的血栓动物模型。肾上腺素是非常重要的血小板活化剂，我们的前期实验证实，肾上腺素溶液可以有效的诱导降低斑马鱼微循环速度，促进斑马鱼血栓的形成，模型稳定，重复性高，利用血小板荧光转基因斑马鱼Tg(CD 41:GFP)可以在显微镜下观察到明显的血小板聚集，诱导的血栓主要位于斑马鱼尾部静脉血管，血栓诱导率可高达90％以上。

Claims

1.一种制备斑马鱼血栓模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)挑选发育正常的斑马鱼幼鱼20-45条移入微孔板，微孔板中加入用胚胎培养水配制的一定浓度的肾上腺素溶液，药液加好后加盖封闭,置于培养箱内培养4-30小时后，吸弃培养水，用移液枪吸取等体积邻联茴香胺染色液于微孔板中避光染色15min；

或

挑选发育正常的斑马鱼幼鱼20-45条，在其卵黄部位注射一定浓度的肾上腺素溶液，注射完成后移入事先加入胚胎培养水的微孔板中，然后加盖封闭,置于培养箱内培养4-30小时后，吸弃培养水，用移液枪吸取等体积邻联茴香胺染色液于微孔板中避光染色15min；

2)移除染色液，用DMSO快速清洗3遍；

3)将斑马鱼转入新的微孔板中，加入DMSO；

5)利用图像处理软件计算斑马鱼躯干部及尾部血管染色面积，记录斑马鱼尾部血管红细胞的染色面积作为血栓发生程度的指标。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述的斑马鱼幼鱼指的是受精后发育3-14天的幼鱼，所述的斑马鱼指各种实验用品系的斑马鱼。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述的肾上腺素溶液的浓度在2mmol/L～30mmol/L之间。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述置于培养箱内培养时间为4-30小时。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，斑马鱼胚胎培养用水配方：5mmol/L NaCl,0.17mmol/L KCl,0.4mmol/L CaCl₂,0.16mmol/L MgSO₄。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，邻联茴香胺染色液配方：含0.6mg/mL邻联茴香胺,0.01moL/L醋酸钠,0.65％,H₂0₂,、40％酒精，溶剂为水。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：挑选健康性成熟的斑马鱼,按雌雄1∶2的比例放入交配缸内,次日清晨获得胚胎，用胚胎培养水进行清洗,除去死卵,放入28℃下控光培养箱，每日更换胚胎培养水两次，在斑马鱼发育至5dpf时，在体视显微镜下挑选发育正常的斑马鱼幼鱼进行实验，挑选发育正常的斑马鱼30条移入6孔板，6孔板中加入用胚胎培养水配制的浓度为4mmol/mL肾上腺素溶液，药液加好后置于28℃培养箱内培养8小时后，吸弃培养水，用移液枪吸取等体积邻联茴香胺染色液(含0.6mg/mL邻联茴香胺,0.01moL/L醋酸钠,0.65％,H₂0₂,、40％酒精)于微孔板中避光染色15min；移除染色液，用DMSO快速清洗3遍；取斑马鱼置载玻片上，于显微镜下对斑马鱼进行拍照并保存；利用图像处理软件计算斑马鱼躯干部及尾部血管染色面积。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，

血栓增加率和血栓抑制率的计算方法为：

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

血栓增加率和血栓抑制率的计算方法为：

其中，空白对照组溶液的配制：使用去离子水配制含5mmol/L NaCl,0.17mmol/L KCl,0.4mmol/L CaCl₂,0.16mmol/L MgSO₄，

其中，阳性药组溶液的配制：使用去离子水配制含5mmol/L NaCl,0.17mmol/L KCl,0.4mmol/L CaCl₂,0.16mmol/L MgSO₄,4mmol/mL肾上腺素，300μmol/L Warfarin。

10.如权利要求1所述的斑马鱼血栓模型的使用方法，包括以下步骤：

斑马鱼躯干部及尾部血管染色面积代表了血栓发生的程度，待评价药物在造模前加入，或者与肾上腺素溶液同时加入，或者在肾上腺素溶液加入后2-4小时内加入均可，通过比较空白对照组，模型对照组以及给药组的染色面积，可以定量的比较药物的抗血栓生成效应。