CN115261306B - 斑马鱼心血管疾病模型、构建方法和用途 - Google Patents
斑马鱼心血管疾病模型、构建方法和用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及动物模型技术领域，具体涉及斑马鱼心血管疾病模型、构建方法和用途。现有技术中采用花生四烯酸单独构造的血栓模型，其存在高剂量花生四烯酸与乙醇协同毒性会导致斑马鱼胚胎致畸甚至死亡的问题，而低剂量花生四烯酸又会导致成模率低，稳定性差等问题。针对现有技术的不足，本发明提供一种将葡萄糖和花生四烯酸结合起来进行斑马鱼心血管疾病的模型建立，该模型与单一花生四烯酸造模相比，具有成模率高、稳定性好等优点。
Description
技术领域
本发明涉及动物模型技术领域，具体涉及斑马鱼心血管疾病模型、构建方法和用途。
背景技术
目前缺血性心血管疾病被认为是世界范围疾病和死亡的主要原因，血栓性疾病可以引起组织器官坏死，诱发一系列各种严重的心脑血管疾病。血栓是血液中一些纤维蛋白和血小板聚集在一起造成血管堵塞的一个病理过程，它会阻碍循环系统的血液流动，严重时会发生心肌梗死、脑梗死、动脉粥样硬化等一系列疾病。其中血小板、外源性和内源性凝血因子、促炎因子、血流等因素的改变是影响血栓形成的主要因素。
斑马鱼是一种小型的热带淡水鱼，与小鼠、兔等常见的实验动物模型相比，斑马鱼具有许多生物优势，如体型小、成本低、繁殖周期短、身体透明易于观察、易于维护、所需测试化合物少等优点。并且它们与人类相关的同源基因比例为87％，与疾病相关基因的同源性为99％，它和人体血小板粘附、活化、聚集和释放反应的主要因子相同，具有凝血因子和血小板受体，对临床常用的抗凝和抗血小板药物有反应，是一种模拟哺乳动物凝血和血栓形成的新型动物模型，可用于抗血栓药物的筛选和药效评价。
现有文献报道的斑马鱼血栓模型大多单独采用较高剂量花生四烯酸处理1-1.5h，比如文献1(Qi Y,Zhao X,Liu H,Wang Y,Zhao C,Zhao T,et al.Identification of aQuality Marker(Q-Marker)of Danhong Injection by the Zebrafish ThrombosisModel.Molecules.2017；22(9).)采用40μM花生四烯酸AA处理1h建立斑马鱼血栓模型。又比如文献2(王木兰，潘永明，金敏，徐孝平，王德军，马全鑫，et al.斑马鱼血栓模型的建立与冠心宁片的干预作用.2016；24(4):432-8.)采用80μmol/L花生四烯酸建立活体斑马鱼血栓模型。
然而，在高浓度花生四烯酸同时存在乙醇暴露情况下，高于40μmol/L花生四烯酸及乙醇协同毒性会导致斑马鱼胚胎致畸甚至死亡。而低于40μmol/L的花生四烯酸又会导致斑马鱼心脏红细胞染色强度增高，尾部红细胞染色强度降低，导致造模成功率及模型稳定下降。
发明内容
现有技术中采用花生四烯酸单独构造的血栓模型，其存在高剂量花生四烯酸与乙醇协同毒性会导致斑马鱼胚胎致畸甚至死亡的问题，而低剂量花生四烯酸又会导致成模率低，稳定性差等问题。针对现有技术的不足，本发明提供一种将葡萄糖和花生四烯酸结合起来进行斑马鱼心血管疾病的模型建立，该模型与单一花生四烯酸造模相比，具有成模率高、稳定性好等优点。
本发明解决的第一个技术问题是：提供一种斑马鱼心血管疾病模型的制备方法，其包括以下步骤：对2-5dpf斑马鱼胚胎采用葡萄糖溶液处理后，再用花生四烯酸处理，诱导血栓的形成；然后利用荧光显微镜进行定量和/或定性分析。
其中，所述斑马鱼为转基因斑马鱼Tg(gata1：DsRed)。
优选地，对2.5dpf斑马鱼胚胎进行血栓模型诱导。
其中，所述葡萄糖溶液体积浓度为2.0％-4.0％，溶剂为胚胎培养水。
优选地，葡萄糖溶液体积浓度为3.0％。
其中，所述胚胎培养水是将1g海盐、0.36g碳酸氢钠和1.5mL 0.1％甲基蓝定容至4L，用氢氧化钠调节pH至7.0。
其中，所述葡萄糖溶液中处理时间为12-20h。优选地，处理时间为12h。
其中，所述花生四烯酸浓度为20μmol/L-40μmol/L。优选地，所述花生四烯酸浓度为30μmol/L。
其中，所述花生四烯酸处理时间为30-50min。优选地，处理时间为40min。
其中，所述花生四烯酸用DMSO溶解，DMSO浓度保持在0.001％以下。
其中，所述定量分析中，用邻联茴香胺作为染色液，避光染色时间为20-30min。
优选地，所述定量分析中，用2mL邻联茴香胺作为染色液，避光染色时间为20min。
其中，所述邻联茴香胺为20mL无水乙醇、30mg 3,3-二甲氨基联苯胺、41mg无水乙酸钠、0.325mL 30％过氧化氢溶液定容至50mL而得。
其中，所述定量分析是分析斑马鱼心脏和尾部红细胞的染色强度。
进一步地，以斑马鱼心脏和尾部红细胞的染色强度作为血栓发生的程度指标。
其中，所述定性分析中，用20μL 0.4％的三卡因对胚胎进行麻醉。
其中，所述定性分析是分析红细胞聚集情况。
有益效果：本发明首次将葡萄糖和低浓度花生四烯酸结合起来进行斑马鱼心血管疾病的模型建立，在对斑马鱼的处理时间和剂量进行不断优化后，建立了一种适用于评估白酒健康的血栓心血管疾病模型，该模型与单一花生四烯酸造模相比，具有成模率高、稳定性好优点。且建模过程简单，成本低廉，并且模型成功率高，结果稳定。
附图说明
图1为实施例4斑马鱼心脏红细胞染色图；其中，a为空白对照组；b为3.0％葡萄糖；c为30μmol/L花生四烯酸；d为30μmol/L花生四烯酸+3.0％葡萄糖；
图2为实施例4斑马鱼尾部红细胞染色图；其中，a为空白对照组；b为3.0％葡萄糖；c为30μmol/L花生四烯酸；d为30μmol/L花生四烯酸+3.0％葡萄糖；
图3为实施例4荧光显微镜下Tg(gata1：DsRed)斑马鱼红细胞聚集情况图；其中，a为空白对照组；b为3.0％葡萄糖；c为30μmol/L花生四烯酸；d为30μmol/L花生四烯酸+3.0％葡萄糖。
具体实施方式
血栓是是心脑血管疾病的一种重要表型，血栓性疾病可以引起组织器官坏死，诱发一系列各种严重的心脑血管疾病。
目前血栓模型多采用花生四烯酸单独造模，但高剂量花生四烯酸与乙醇协同毒性会导致斑马鱼胚胎致畸甚至死亡的问题，而低剂量花生四烯酸又会导致成模率低，稳定性差等问题。而本发明将葡萄糖和花生四烯酸结合起来进行斑马鱼心血管疾病的模型建立，主要包括步骤为：收集并挑选健康斑马鱼胚胎，培养水中先后加入葡萄糖和花生四烯酸进行培养，随后用邻联茴香胺染色，于显微镜下观察记录斑马鱼心脏和尾部红细胞的染色强度，以斑马鱼心脏和尾部红细胞的染色强度作为血栓发生的程度指标。该模型与单一花生四烯酸造模相比，具有成模率高、稳定性好优点。
然而花生四烯酸和葡萄糖诱导建模存在的技术难点在于：花生四烯酸和葡萄糖以及酒样中的酒精对胚胎模型存在协同毒性，因此，本发明创造性地对花生四烯酸和葡萄糖以及酒样中的酒精组合剂量及斑马鱼胚胎日龄及处理时间进行不断优化，从而建立适用于评估白酒健康的血栓心血管疾病模型。并采用红细胞荧光标记斑马鱼Tg(gata1：DsRed)观察红细胞聚集情况。
其斑马鱼模型具体制备过程如下：
1.将正常养殖的转基因斑马鱼Tg(gata1：DsRed)按雄性和雌性以1:1或1:2的比例放入交配缸中，并用隔板隔开。第二天早上，移除屏障，雌性开始产卵。产卵后30min内采集胚胎，并且吸出死亡和未受精的卵、粪便等杂物后用清水冲洗3次。然后在28.5℃下培养24小时，添加1-苯基-2-硫脲(PTU)抑制黑色素的产生；
2.在2-5dpf斑马鱼时，优选在2.5dpf，挑选20条正常发育的斑马鱼放入6孔板中，注意每个6孔板不能超过20个斑马鱼胚胎，否则会影响斑马鱼的发育，移入用胚胎培养水配制的2.0％-4.0％葡萄糖溶液处理12-20h，随后加入20μmol/L-40μmol/L的花生四烯酸处理30-50min诱导血栓的形成，吸弃胚胎培养水，将胚胎培养水吸干换成邻联茴香胺染色液，用邻联茴香胺染色液于6孔板中避光染色20-30min；
3.移除染色液，用胚胎培养水快速清洗3遍；
4.将斑马鱼用1％(质量)低熔点琼脂糖固定，使用荧光显微镜(德国莱卡M205 FA立体显微镜)对斑马鱼进行拍照并保存；
5.利用ImageJ计算斑马鱼心脏和尾部的染色强度；
6.同时Tg(gata1：DsRed)转基因胚胎中进行血细胞聚集情况的分析，其处理方法同步骤1、2。在成像过程中，胚胎用20μL 0.4％的三卡因进行麻醉后，将斑马鱼固定在1％低熔点琼脂糖中，使用荧光显微镜(德国莱卡M205 FA立体显微镜)进行斑马鱼血液荧光的拍摄，然后对斑马鱼血细胞聚集情况进行分析。
上述斑马鱼模型具体制备过程中，在斑马鱼2-5dpf均可进行血栓模型的诱导，在低于2dpf时加入葡萄糖处理会影响斑马鱼的出壳率，导致死亡率增加。在高于3dpf加入葡萄糖处理时，斑马鱼均已出壳，此时操作难度会大大，并且实验周期较长。因此，对2-5dpf斑马鱼胚胎采用葡萄糖溶液处理，优选采用2.5dpf斑马鱼胚胎。
上述斑马鱼模型具体制备过程中，申请人对葡萄糖浓度进行了探索，发现葡萄糖浓度为3.0％对血流速度的影响最明显，浓度在4％以上，比如6％时，会对斑马鱼发育造成影响，增加死亡率。
上述斑马鱼模型具体制备过程中，葡萄糖处理时间过久会导致斑马鱼死亡率增加，处理时间短不会造成血栓模型。因此，采用葡萄糖溶液处理时间为12-20h。优选地，处理时间为12h。
上述斑马鱼模型具体制备过程中，花生四烯酸是血栓成功的关键，葡萄糖主要起协同增效的作用，使用单一的花生四烯酸建模时，成模率较高，花生四烯酸的浓度筛选能够进一步提高血栓成功率，当3.0％葡萄糖与30μmol/L的花生四烯酸共同处理时成模率可达到76.8％。
上述斑马鱼模型具体制备过程中，花生四烯酸用DMSO溶解，DMSO浓度保持在0.001％以下，同时用相同浓度的DMSO进行空白对照。
上述斑马鱼模型具体制备过程中，邻联茴香胺染色液配方：20mL的无水乙醇、30mg的3,3-二甲氨基联苯胺、41mg无水乙酸钠和0.325mL 30％过氧化氢溶液加入容量瓶定容至50mL。
本发明还采用上述斑马鱼模型评估白酒对血栓形成影响的方法，包括以下步骤：
(1)在斑马鱼2dpf时加入白酒预处理；
(2)在斑马鱼2.5d时加入用胚胎培养水配制的3.0％葡萄糖溶液处理12h；
(3)在斑马鱼3dpf时加入30μmol/L的花生四烯酸处理40min；
(4)用邻联茴香胺染料避光染色20min，并用荧光显微镜对斑马鱼的红细胞聚集情况进行拍摄；
(5)用ImageJ计算斑马鱼心脏和尾部的红细胞染色强度，以此评估白酒对血栓形成的影响。
名词解释：dpf：Dayspast fertilization为斑马鱼胚胎受精后发育的天数；
DMSO：Dimethyl Sulphoxide二甲基亚砜。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实验材料：花生四烯酸购置上海源叶生物科技有限公司；3,3-二甲氨基联苯胺、无水乙酸钠、葡萄糖和DMSO等购置生工生物工程(上海)股份有限公司；无水乙醇购置西陇科学股份有限公司；阿司匹林购置MedChemExpress(MCE)；五粮液酒购置四川省宜宾五粮液集团有限公司。
斑马鱼饲养环境：实验用的斑马鱼鱼系为Tg(gata1：DsRed)，其饲养水温为28.5℃，电导率500-600μS/cm，pH 6.5-7.5，系统水压为145-180kPa，明/暗周期为14h/10h。
斑马鱼胚胎的收集：挑选健康、性成熟的斑马鱼，按雌雄1:1或者1:2的比例放入繁殖缸中，用挡板将雌鱼和雄鱼分开，繁殖缸中的水量标准为没过斑马鱼鱼背2cm。第二天清晨移除挡板，收集胚胎，在28.5℃下培养24小时，添加1-苯基-2-硫脲(PTU)抑制黑色素的产生放入28℃培养箱，每日换水1次。
实施例1葡萄糖浓度对斑马鱼血栓模型的影响
1、斑马鱼血栓模型的建立
在2.5dpf斑马鱼时，挑选20条正常发育的斑马鱼放入6孔板中(注意每个6孔板不能超过20个斑马鱼胚胎，否则会影响斑马鱼的发育)，分别移入用胚胎培养水配制1.0-6.0％高糖溶液处理12h，观察斑马鱼存活状态，结果如表1所示。
实验结果表示，葡萄糖浓度为3.0％时，对斑马鱼血流速度的影响最明显，浓度在4％-6％时，会对斑马鱼发育造成影响，增加死亡率。因此，采用葡萄糖浓度为3.0％对斑马鱼进行处理及后期血栓构建。
表1葡萄糖浓度对斑马鱼血栓模型建立的影响
实施例2葡萄糖处理时间对斑马鱼血栓模型的影响
1、斑马鱼血栓模型的建立
在2.5dpf斑马鱼时，挑选20条正常发育的斑马鱼放入6孔板中(注意每个6孔板不能超过20个斑马鱼胚胎，否则会影响斑马鱼的发育)，分别移入用胚胎培养水配制3.0％高糖溶液分别处理12h、20h、1-6天，观察斑马鱼存活状态，结果如表2所示。
实验结果表示，当葡萄糖浓度为3.0％时，葡萄糖处理时间过久会导致斑马鱼死亡率增加，处理时间短不会造成血栓模型。因此，采用葡萄糖浓度为3.0％，处理时间为12h，对斑马鱼进行处理及后期血栓构建。
表2葡萄糖处理时间对斑马鱼血栓模型建立的影响
实施例3花生四烯酸处理时间对斑马鱼血栓模型的影响
1、斑马鱼血栓模型的建立
在2.5dpf斑马鱼时，挑选20条正常发育的斑马鱼放入6孔板中(注意每个6孔板不能超过20个斑马鱼胚胎，否则会影响斑马鱼的发育)，分别移入用胚胎培养水配制花生四烯酸30μmol/L分别处理30-90min，观察斑马鱼存活状态，结果如表3所示。
实验结果表示，当花生四烯酸浓度为30μmol/L，分别处理30-50min时，斑马鱼存活率为100％。
表3花生四烯酸处理时间对斑马鱼血栓模型建立的影响
| 编号 | 花生四烯酸浓度(μmol/L) | 处理时间(min) | 死亡率(％) |
| 1 | 30 | 30 | 0 |
| 2 | 30 | 40 | 0 |
| 3 | 30 | 50 | 0 |
| 4 | 30 | 60 | 18.33±2.35 |
| 5 | 30 | 70 | 40±8.16 |
| 6 | 30 | 80 | 55±4.08 |
| 7 | 30 | 90 | 78.33±6.24 |
实施例4花生四烯酸浓度对斑马鱼血栓模型的影响
基于斑马鱼最佳处理阶段和化合物最佳处理时间长度，通过优化花生四烯酸浓度建立斑马鱼血栓模型。设计方案如下：
1、斑马鱼血栓模型的建立
在2.5dpf斑马鱼时，挑选20条正常发育的斑马鱼放入6孔板中(注意每个6孔板不能超过20个斑马鱼胚胎，否则会影响斑马鱼的发育)，移入用胚胎培养水配制3.0％高糖溶液处理12h，随后加入30μmol/L的花生四烯酸处理40min诱导血栓的形成。
2、邻联茴香胺染色
吸弃胚胎培养水，用邻联茴香胺染色液于6孔板中避光染色20min，移除染色液，用胚胎培养水快速清洗3遍，将斑马鱼用1％低熔点琼脂糖固定，使用荧光显微镜(德国莱卡M205FA立体显微镜)对斑马鱼进行拍照并保存。
3、用ImageJ计算斑马鱼心脏和尾部的染色强度。
图1、图2、图3分别为斑马鱼心脏红细胞染色图、斑马鱼尾部红细胞染色图、荧光显微镜下Tg(gata1：DsRed)斑马鱼红细胞聚集情况图，其中，a为空白对照组；b为3.0％葡萄糖；c为30μmol/L花生四烯酸；d为30μmol/L花生四烯酸+3.0％葡萄糖。
统计学处理结果显示30μmol/L的花生四烯酸和3％葡萄糖共同处理时，斑马鱼心脏红细胞染色强度显著降低，尾部红细胞强度与对照组相比显著增加。
其中，花生四烯酸用DMSO溶解，DMSO浓度保持在0.001％以下，同时用相同浓度的DMSO进行空白对照。
其中，邻联茴香胺染色液配方：20mL的无水乙醇、30mg的3,3-二甲氨基联苯胺、41mg无水乙酸钠和0.325mL 30％过氧化氢溶液加入容量瓶定容至50mL。
实施例5
本实施例的斑马鱼血栓模型建立具体步骤如实施例4，区别仅在于采用葡萄糖浓度为3％，花生四烯酸浓度为20μmol/L诱导血栓形成。
实施例6
本实施例的斑马鱼血栓模型建立具体步骤如实施例4，区别仅在于采用葡萄糖浓度为3％，花生四烯酸浓度为40μmol/L诱导血栓形成。
对比例1
本对比例的斑马鱼血栓模型建立具体步骤如实施例4，区别仅在于只采用葡萄糖浓度为3％，未采用花生四烯酸进行血栓模型诱导形成。
对比例2
本对比例的斑马鱼血栓模型建立具体步骤如实施例4，区别仅在于只采用30μmol/L的花生四烯酸进行血栓模型诱导形成。
对比例3
本对比例的斑马鱼血栓模型建立具体步骤如实施例4，区别仅在于采用葡萄糖浓度为3％，花生四烯酸浓度为10μmol/L诱导血栓形成。
对比例4
本对比例的斑马鱼血栓模型建立具体步骤如实施例4，区别仅在于采用葡萄糖浓度为3％，花生四烯酸浓度为50μmol/L诱导血栓形成。
血栓形成率(％)＝(1-血栓诱导剂处理组染色强度/空白对照组染色强度)x100％。
根据实施例和对比例的统计学处理结果可知：使用3.0％葡萄糖处理斑马鱼时，血液流速会变得缓慢，但不会造成斑马鱼血液堵塞；使用单一的花生四烯酸建模时，成模率在60％；3.0％葡萄糖与30μmol/L的花生四烯酸共同处理时成模率可达到76.8％左右。具体结果见表4。
表4实施例和对比例的血栓成功率结果
| 葡萄糖浓度 | 花生四烯酸浓度(单位为μmol/L) | 血栓成功率(％) | |
| 实施例4 | 3％ | 30 | 76.8±8.58 |
| 实施例5 | 3％ | 20 | 59.7±4.32 |
| 实施例6 | 3％ | 40 | 70.2±6.01 |
| 对比例1 | 3％ | - | 0 |
| 对比例2 | - | 30 | 60±7.91 |
| 对比例3 | 3％ | 10 | 24.5±3.39 |
| 对比例4 | 3％ | 50 | 28.5±2.67 |
需要说明的是，本说明书中描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例以及不同实施例的特征进行结合和组合。
Claims (9)
1.斑马鱼心血管疾病模型的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：对2-5dpf斑马鱼胚胎采用体积浓度为3.0%的葡萄糖溶液处理12-20h后，再用浓度为30 μmol/L的花生四烯酸处理30-50 min，诱导血栓的形成；然后利用荧光显微镜进行定量和/或定性分析。
2.根据权利要求1所述的斑马鱼心血管疾病模型的制备方法，其特征在于：所述葡萄糖溶液处理时间为12h。
3.根据权利要求1所述的斑马鱼心血管疾病模型的制备方法，其特征在于：所述花生四烯酸处理时间为40 min。
4.根据权利要求1所述的斑马鱼心血管疾病模型的制备方法，其特征在于：所述定量分析中，用邻联茴香胺作为染色液，避光染色时间为20-30min。
5.根据权利要求4所述的斑马鱼心血管疾病模型的制备方法，其特征在于：用2mL邻联茴香胺作为染色液，避光染色时间为20min。
6.根据权利要求1所述的斑马鱼心血管疾病模型的制备方法，其特征在于：所述定量分析是分析斑马鱼心脏和尾部红细胞的染色强度。
7.根据权利要求1所述的斑马鱼心血管疾病模型的制备方法，其特征在于：所述定性分析中，用0.4%的三卡因对胚胎进行麻醉。
8.根据权利要求7所述的斑马鱼心血管疾病模型的制备方法，其特征在于：三卡因用量为20uL。
9.根据权利要求1所述的斑马鱼心血管疾病模型的制备方法，其特征在于：所述定性分析是分析红细胞聚集情况。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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