CN103230397B - 特非那定在制备斑马鱼心功能损伤模型中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及特非那定在制备斑马鱼心功能损伤模型中的应用，步骤如下：将受精后2～3天的发育正常的斑马鱼置于含有特非那定的养殖用水溶液中，28℃下恒温培养24～48小时，制得斑马鱼心功能损伤模型。本发明首次利用特非那定建立斑马鱼心功能损伤模型，建立的斑马鱼心功能损伤模型具有制作简便、快速、稳定可靠和重复性好的优点，降低了心功能损伤模型的制作成本，提高了实验研究结果的可靠性。

Description

特非那定在制备斑马鱼心功能损伤模型中的应用
技术领域
本发明涉及特非那定在制备斑马鱼心功能损伤模型中的应用，特别涉及利用特非那定制备斑马鱼心功能损伤模型，用于筛选心脏保护作用药物中的应用，属于药物筛选技术领域。
背景技术
心功能损伤是各种心脏腔室结构改变或心肌受损所导致心脏功能进行性障碍综合征。临床表现为心脏扩大、心律失常及心力衰竭等。心功能损伤是心脏整体机能异常的综合反映。病毒感染、自身免疫反应、遗传、药物中毒和代谢异常等都可以引起心功能损伤。开发具有防止、延缓心功能损伤的发生和/或缓解临床心功能损伤症状作用的药物，将会带来显著的经济和社会效益。
药物筛选是发现、开发药物过程中的一个重要的环节，实验动物心功能损伤模型的建立对评价和筛选心功能损伤预防/治疗药物至关重要。目前，心功能损伤动物模型以啮齿类为主的哺乳动物体内评价模型，大多采用冠状动脉结扎手术，建立大鼠心功能损伤动物模型。哺乳动物体内评价模型可从整体水平直观地反映药物的心脏保护作用，但不适合新药研发早期药物毒性的高通量筛选。由于哺乳类动物模型建模方法的局限性，越来越多的研究人员使用斑马鱼进行药物心功能损伤的评价。
据文献报道，利用斑马鱼模型进行化合物心功能损伤评价实验的研究结果表明，斑马鱼与哺乳动物的心脏对药物的反应非常相似[Sukardi H,Chng HT,Chan EY,Gong Z,Lam SH.Zebrafish for drug toxicity screening:bridging the in vitro cell-based models and in vivomammalian models.Expert Opin.Drug Metab.Toxicol.2011,7(5):579-589.]。斑马鱼个体小，成鱼体长3-4厘米，样品用量少；斑马鱼基因组与人类基因组同源性达到85%左右；易于养殖，养殖成本低；体外发育，胚胎透明，胚胎发育快，受精后48小时，心脏就已经发育成熟；产卵量大，每对亲鱼每周可产200-300个卵，利于大规模的检测。斑马鱼的心脏包含心房、心室和静脉窦，心电图谱也与哺乳动物类似，这说明利用斑马鱼建立心功能损伤模型切实可行。
然而，目前将斑马鱼用来心功能损伤评价都是基于正常的斑马鱼。方芳等[方芳，赵杰，余林中，罗佳波。乌头碱对斑马鱼心脏毒性的初步研究。中药药理与临床，2012,28（2）：31-33.]观察了乌头碱对斑马鱼心脏的影响，王思锋等[王思锋，刘可春，王希敏，何秋霞，韩利文，侯海荣。雷公藤红素对斑马鱼胚胎心脏毒性的初步研究。中国药理学通报，2009，25（5）：634-636。]研究了雷公藤红素对斑马鱼心脏的损伤作用。他们都是以正常发育的2天的斑马鱼为模型，观察斑马鱼心脏形态和心率的变化。该方法的优势是根据斑马鱼心脏形态和心率的变化能够直接快速的发现化合物潜在的致心脏功能受损特性。但是在药物筛选过程中，致心功能受损特性大多属于副作用，要尽可能避免。因此，心功能损伤模型在药物筛选领域应用对于筛选具有保护心脏作用的药物可能更有意义。然而感到遗憾的是，在斑马鱼这个新生模式生物上尚未建立一个稳定并被认可的心功能损伤模型。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，本发明的目的之一是提供特非那定在制备斑马鱼心功能损伤模型中的应用。本发明的目的之二是利用建立的斑马鱼心功能损伤模型，筛选、定性或定量评价用于保护心脏的药物的方法。
特非那定在制备斑马鱼心功能损伤模型中的应用。
上述应用，步骤如下：
将受精后2～3天的发育正常的斑马鱼置于含有特非那定浓度为5～20μmol·L-1的养殖用水溶液中，28℃下恒温培养24～48小时，制得斑马鱼心功能损伤模型。
根据本发明优选的，所述的养殖用水溶液是向养殖用水中加入二甲基亚砜配制的体积浓度不大于0.5%的溶液。
根据本发明优选的，特非那定浓度为5μmol·L-1。
利用上述制备斑马鱼心功能损伤模型筛选用于保护心脏的药物的方法，步骤如下：
（1）将受精后2～3天的发育正常的斑马鱼置于含有特非那定浓度为5～20μmol·L-1的养殖用水溶液中，28℃下恒温培养4～24小时后，加入待测化合物，使待测化合物浓度为0.1～1000μmol·L-1，继续培养20～24小时，得到给药斑马鱼；
或者，将受精后2～3天的发育正常的斑马鱼置于含有特非那定浓度为5～20μmol·L-1、待测化合物浓度为0.1～1000μmol·L-1的养殖用水溶液中，28℃下恒温培养24～48小时，得到给药斑马鱼；
（2）将步骤（1）制得的给药斑马鱼用质量浓度为0.3‰的三卡因麻醉，然后用3%甲基纤维素固定于载玻片上，在显微镜下观察斑马鱼心脏形态，或者，显微镜下观察记录斑马鱼心率和测量动脉球-静脉窦距离；
（3）取斑马鱼心功能损伤模型，用质量浓度为0.3‰的三卡因麻醉，然后用3%甲基纤维素固定于载玻片上，在显微镜下观察模型斑马鱼心脏形态，或者，显微镜下观察记录模型斑马鱼心率和测量动脉球-静脉窦距离；
（4）将步骤（2）得到的斑马鱼心脏形态与步骤（3）得到的模型斑马鱼心脏形态进行比较；待测化合物组的斑马鱼心脏水肿面积和血细胞淤积面积与心脏损伤模型组的心脏水肿面积和血细胞淤积面积相比减少20%以上或者与溶剂对照组/空白对照组的心脏水肿面积和血细胞淤积面积相当，则待测化合物具有心脏保护作用；
或者，将步骤（2）得到的斑马鱼心率和测量动脉球-静脉窦距离长度数据与步骤（3）得到的模型斑马鱼心率和测量动脉球-静脉窦距离长度进行比较；经统计分析后，化合物处理组的心率与心脏损伤模型组的心率相比升高且满足统计学上的p值＜0.05，动脉球-静脉窦距离缩短且满足统计学上的p值＜0.05，则待测化合物具有心脏保护作用。
根据本发明优选的，所述步骤（1）中特非那定浓度为5μmol·L-1。
根据本发明优选的，所述步骤（1）中养殖用水溶液是向养殖用水中加入二甲基亚砜配制的体积浓度不大于0.5%的溶液。
根据本发明优选的，所述步骤（2）或步骤（3）中，显微镜下观察的温度为25℃。
根据本发明优选的，所述步骤（2）或步骤（3）中，心脏形态为心包水肿形态和心脏出血形态。
根据本发明优选的，所述步骤（2）或步骤（3）中，测量动脉球-静脉窦距离的方法如下，使待测量斑马鱼胚胎呈侧卧状态，使两侧眼、体节重合，尾部与身体处于同一水平面，通过体视显微镜的目镜中的测微尺测量动脉球与静脉窦之间的距离。
上述养殖用水为本领域常用斑马鱼养殖用水，养殖用水中含有：摩尔浓度为5mM的NaCl、摩尔浓度为0.17mM的KCl、摩尔浓度为0.33mM的CaCl2、摩尔浓度为0.33mM的Mg2SO4，以及质量百分浓度为10-5%的甲基蓝，去离子水配制而成。
有益效果
1、本发明首次利用特非那定建立斑马鱼心功能损伤模型，建立的斑马鱼心功能损伤模型具有制作简便、快速、稳定可靠和重复性好的优点，降低了心功能损伤模型的制作成本，提高了实验研究结果的可靠性。
2、本发明提供利用斑马鱼心功能损伤模型筛选具有心功能损伤保护作用药物的方法，该方法通过观察斑马鱼心脏形态实现了定性分析，通过记录斑马鱼心率和测量动脉球-静脉窦距离进行定量分析。
附图说明
图1：特非那定对斑马鱼心功能损伤的形态学照片
其中：A、空白对照组，B、溶剂对照组，C、1μmol·L-1的特非那定处理组，D、5μmol·L-1的特非那定处理组，E、10μmol·L-1的特非那定处理组，F、15μmol·L-1的特非那定处理组，G、20μmol·L-1的特非那定处理组；
图2：尼卡地尔对特非那定引起斑马鱼心功能损伤的修复作用形态学照片。
其中：A、空白对照组，B、溶剂对照组，C、5μmol·L-1的特非那定处理组，D、5μmol·L-1的特非那定+1μmol·L-1尼卡地尔处理组，E、5μmol·L-1的特非那定+10μmol·L-1尼卡地尔处理组，F、5μmol·L-1的特非那定+100μmol·L-1尼卡地尔处理组；
图3：卡维地洛对特非那定引起斑马鱼心功能损伤的预防作用形态学照片。
其中：A、空白对照组，B、溶剂对照组，C、5μmol·L-1的特非那定处理组，D、5μmol·L-1的特非那定+1μmol·L-1卡维地洛处理组，E、5μmol·L-1的特非那定+10μmol·L-1卡维地洛处理组，F、5μmol·L-1的特非那定+100μmol·L-1卡维地洛处理组。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
实验材料
养殖用水(Embryo Medium)
养殖用水配方如表1所示
表1.养殖用水的配方
实验动物
健康AB品系或野生型斑马鱼（均可购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所），饲养在28℃、光周期14小时的鱼房中，并且将雄鱼与雌鱼分开饲养。鱼房固定于每天早上9:00开始光照，并喂食丰年虾，而下午16:00再度喂食丰年虾一次，如此饲育之斑马鱼可确保鱼卵质量与产量稳定。待鱼进食完毕后把鱼捞出来置于配对盒中，每盒中含一对公母鱼，并在配对盒上层插入隔板将公、母分开，避免鱼在预定时间之前产卵。隔日，欲使用鱼卵前先将隔板抽出，让鱼可以开始进行追尾，约隔3～5分钟后鱼就会开始产卵。收集鱼卵，以清水小心的冲掉杂质后，将干净的鱼卵转置到注有胚胎培养液的培养皿后即可。
试剂配制
将药物粉末以二甲基亚砜溶解，药物溶解公式为：
体积摩尔浓度(M)=(药品重量(g)/分子量)/体积(L)
从Sigma公司购买的特非那定（tefenadine），原始溶液为浓度为10mM溶于二甲基亚砜的溶液。
从Sigma公司购买的尼卡地尔（nicorandil，CAS号65141-46-0，50mg），用二甲基亚砜溶解配制成10mM的贮液。
从Sigma公司购买的卡维地洛（carvedilol，CAS号72956-09-3，50mg），原始溶液为浓度为10mM溶于二甲基亚砜的溶液。
美西律购自Sigma公司（CAS号5370-01-4，1g），用二甲基亚砜溶解配制成10mM的贮液。
以上药物使用时皆须用上述培养用水稀释使用。
实施例1.斑马鱼心功能损伤模型的建立方法
1斑马鱼仔鱼的获得与使用
利用野生型的斑马鱼进行交配，配对前一天需使用隔板，以确保胚胎时期的一致性。使用同一对的胚胎进行实验，生出的胚胎时间控制在半小时以内，降低胚胎间发育时间的差异性，将胚胎收在加有胚胎培养液的培养皿中，使胚胎不易发霉外，也让水中矿物质含量一致，放入28℃保温箱中饲养两天。从斑马鱼胚胎出生后12小时加入0.2mmol·L-1的苯硫脲，每天更换一次新鲜药液，直至生后两天。将出生后两天的斑马鱼置于解剖镜下，选取发育正常的斑马鱼仔鱼，放入24孔板中，每孔5尾。
2化合物处理
设置7个实验组：1个空白对照组，1个溶剂对照组，5个心功能损伤诱导剂处理组。移除微孔板中的养殖用水，空白对照组中加入2ml养殖用水，溶剂对照组加入2ml含体积浓度0.1%二甲基亚砜的养殖用水溶液，心功能损伤诱导剂处理组2ml分别加入1μmol·L-1,5μmol·L-1,10μmol·L-1,15μmol·L-1,20μmol·L-1的特非那定溶液，由养殖用水与相应浓度的特非那定储液配制获得。然后，放入28℃恒温培养箱中培养24小时。每组3个平行孔。
3定性分析
0.3‰（质量百分比）的三卡因溶液麻醉斑马鱼，然后用3%（质量百分比）甲基纤维素固定于载玻片上，接着在倒置显微镜下观察心脏形态。
溶剂对照组和空白对照组中心脏形态正常。1μmol·L-1特非那定处理组无可见心脏形态学改变。5μmol·L-1，10μmol·L-1特非那定处理组出现血细胞在心脏淤积和心房心室肿大。15μmol·L-1和20μmol·L-1的特非那定处理组出现心包水肿，卵黄囊水肿、卵黄囊出血等（图1）。
4定量分析
加入浓度为0.3‰（质量百分比）的三卡因麻醉斑马鱼，然后用3%（质量百分比）甲基纤维素固定于载玻片上，在一个安静的环境下，保持室温25℃，记录15秒内斑马鱼的心跳数，所得心跳数乘以4为每分钟斑马鱼的心率。
拨动斑马鱼胚胎，使其呈侧卧状态，尽量使两侧眼、体节重合，尾部与身体处于同一水平面。位置摆好后，在体视显微镜下观察，通过目镜测微尺测量两者间距离。
统计结果显示5个特非那定处理组，斑马鱼的心率分别为132±14次/分，120±8次/分，109±6次/分，82±5次/分和28±7次/分（表2）。表明随着特非那定浓度增加，斑马鱼的心率逐渐下降，呈现浓度依赖性。静脉窦-动脉球间距随着特非那定浓度的升高而增长（表2）。通过One-Way ANOVA分析，5μmol·L-1,10μmol·L-1,15μmol·L-1,20μmol·L-1的特非那定处理组心率和静脉窦-动脉球间距与溶剂对照组有显著的统计学差异。因此，选择5μmol·L-1特非那定处理组作为斑马鱼心功能损伤模型组。
表2特非那定对斑马鱼心率和静脉窦-动脉球间距的影响
组别μmol·L-1 心率 静脉窦-动脉球间距
空白对照 138±9 120±8
溶剂对照 142±11 127±8
1 132±14 136±6
5 120±8* 178±5*
10 109±6** 188±7**
15 82±5** 203±4**
20 28±7** 221±7**
注：*，p<0.05,**,p<0.01vs.溶剂对照组
实施例2.尼卡地尔对特非那定引起的斑马鱼心功能损伤的保护作用
1斑马鱼仔鱼的获得与使用
利用野生型的斑马鱼进行交配，配对前一天需使用隔板，以确保胚胎时期的一致性。使用同一对的胚胎进行实验，生出的胚胎时间控制在半小时以内，降低胚胎间发育时间的差异性，将胚胎收在加有胚胎培养液的培养皿中，使胚胎不易发霉外，也让水中矿物质含量一致，放入28℃保温箱中饲养两天。从斑马鱼胚胎出生后12小时加入0.2mmol·L-1的苯硫脲，每天更换一次新鲜药液，至出生后两天。将出生后两天的斑马鱼置于解剖镜下，选取发育正常的斑马鱼仔鱼，放入24孔板中，每孔5尾。
2化合物处理
设置6个实验组：1个空白对照组，1个溶剂对照组，1个心功能损伤模型组，3个尼卡地尔处理组。移除微孔板中的养殖用水，空白对照组中加入2ml养殖用水，溶剂对照组加入2ml含体积浓度0.1%二甲基亚砜的养殖用水溶液，心功能损伤模型组加入2ml5μmol·L-1特非那定溶液，尼卡地尔处理组分别加入先加入2ml5μmol·L-1特非那定溶液，放入28℃恒温培养箱中培养24小时孵育4小时后，再分别加入1μmol·L-1,10μmol·L-1,100μmol·L-1的尼卡地尔溶液共同孵育20小时。每组3个平行孔。
3定性分析
0.3‰（质量百分比）的三卡因麻醉斑马鱼，然后用3%甲基纤维素固定于载玻片上，接着在倒置显微镜下观察心脏形态。
溶剂对照组和空白对照组中心脏形态正常。心功能损伤模型组出现血细胞在心脏区域淤积和心脏肿大。随着尼卡地尔浓度的增加，心脏区域的血细胞数量和心脏的大小逐渐恢复正常（图2）。因此，可通过观察心脏形态定性分析尼卡地尔的心脏损伤保护作用。
4定量分析
加入浓度为0.3‰（质量百分比）的三卡因麻醉斑马鱼，然后用3%（质量百分比）甲基纤维素固定于载玻片上，在一个安静的环境下，保持室温25℃，记录15秒内斑马鱼的心跳数，所得心跳数乘以4为每分钟斑马鱼的心率。
拨动斑马鱼胚胎，使其呈侧卧状态，尽量使两侧眼、体节重合，尾部与身体处于同一水平面。位置摆好后，在体视显微镜下观察，通过目镜测微尺测量两者间距离。
从表3可以看出，与溶剂对照组相比，心功能损伤模型组的心率显著下降，静脉窦-动脉球间距明显增长。随着尼卡地尔浓度提高，心率逐渐升高静脉窦-动脉球间距逐渐缩短。因此，可通过记录心率和测量静脉窦-动脉球间距定量分析尼卡地尔的心功能损伤保护作用。
表3尼卡地尔对特非那定引起的斑马鱼心率和静脉窦-动脉球间距变化的拮抗作用
组别μmol·L-1 心率（次/分） 静脉窦-动脉球间距（μm）
空白对照 140±10a 122±6a
溶剂对照 142±9a 125±5a
特非那定5 118±9b 185±6b
特非那定5+尼卡地尔1 115±7bc 203±14bc
特非那定5+尼卡地尔10 129±6b 168±11d
特非那定5+尼卡地尔100 138±8a 134±7a
注：数据后所标字母为p>0.05的采用相同字母表示，p<0.05的采用不同的字母
实施例3.卡维地洛对特非那定引起的斑马鱼心功能损伤的保护作用
1斑马鱼仔鱼的获得与使用
利用野生型的斑马鱼进行交配，配对前一天需使用隔板，以确保胚胎时期的一致性。使用同一对的胚胎进行实验，生出的胚胎时间控制在半小时以内，降低胚胎间发育时间的差异性，将胚胎收在加有胚胎培养液的培养皿中，使胚胎不易发霉外，也让水中矿物质含量一致，放入28℃保温箱中饲养两天。从斑马鱼胚胎出生后12小时加入0.2mmol·L-1的苯硫脲，每天更换一次新鲜药液，至出生后2天。将出生后两天的斑马鱼置于解剖镜下，选取发育正常的斑马鱼仔鱼，放入24孔板中，每孔5尾。
2化合物处理
设置6个实验组：1个空白对照组，1个溶剂对照组，1个心功能损伤模型组，3个卡维地洛处理组。移除微孔板中的养殖用水，空白对照组中加入2ml养殖用水，溶剂对照组加入2ml含体积浓度0.1%二甲基亚砜的养殖用水溶液，心功能损伤模型组加入2ml5μmol·L-1特非那定溶液，卡维地洛处理组分别加入2ml1μmol·L-1,10μmol·L-1,100μmol·L-1的卡维地洛溶液孵育4小时后，再分别加入5μmol·L-1特非那定溶液共同孵育20小时。每组3个平行孔。
3定性分析
0.3‰（质量百分比）的三卡因麻醉斑马鱼，然后用3%（质量百分比）甲基纤维素固定于载玻片上，接着在倒置显微镜下观察心脏形态。
溶剂对照组和空白对照组中心脏形态正常。心脏损伤模型组出现血细胞在心脏区域淤积和心脏肿大。随着卡维地洛浓度的增加，心脏区域血细胞淤积和心脏肿大现象逐渐消失（图3）。因此，可通过观察心脏形态定性分析卡维地洛的心脏损伤保护作用。
4定量分析
加入浓度为0.3‰（质量百分比）的三卡因麻醉斑马鱼，然后用3%（质量百分比）甲基纤维素固定于载玻片上，在一个安静的环境下，保持室温25℃，记录15秒内斑马鱼的心跳数，所得心跳数乘以4为每分钟斑马鱼的心率。
拨动斑马鱼胚胎，使其呈侧卧状态，尽量使两侧眼、体节重合，尾部与身体处于同一水平面。位置摆好后，在体视显微镜下观察，通过目镜测微尺测量两者间距离。
从表4可以看出，与溶剂对照组相比，心脏损伤模型组的心率显著下降，静脉窦-动脉球间距明显增长。随着卡维地洛浓度提高，心率逐渐升高静脉窦-动脉球间距逐渐缩短。因此，可通过记录心率和测量静脉窦-动脉球间距定量分析卡维地洛的心脏损伤保护作用。
表4卡维地洛对特非那定引起的斑马鱼心率和静脉窦-动脉球间距变化的拮抗作用
组别μmol·L-1 心率（次/分） 静脉窦-动脉球间距（μm）
空白对照 140±12a 124±10a
溶剂对照 140±11a 123±9a
特非那定5 123±6b 189±15b
特非那定5+卡维地洛1 105±9bc 191±12bc
特非那定5+卡维地洛10 128±7b 159±9d
特非那定5+卡维地洛100 136±16a 131±17a
注：数据后所标字母为p>0.05的采用相同字母表示，p<0.05的采用不同的字母。

Claims (6)

1.利用斑马鱼心功能损伤模型筛选用于保护心脏的药物的方法，其特征在于，步骤如下：
（1）将受精后2～3天的发育正常的斑马鱼置于含有特非那定浓度为5～20μmol·L-1的养殖用水溶液中，28℃下恒温培养4～24小时后，加入待测化合物，使待测化合物浓度为0.1～1000μmol·L-1，继续培养20～24小时，得到给药斑马鱼；
或者，将受精后2～3天的发育正常的斑马鱼置于含有特非那定浓度为5～20μmol·L-1、
待测化合物浓度为0.1～1000μmol·L-1的养殖用水溶液中，28℃下恒温培养24～48小时，得到给药斑马鱼；
斑马鱼心功能损伤模型采用如下方法制备：
将受精后2～3天的发育正常的斑马鱼置于含有特非那定浓度为5～20μmol·L-1的养殖用水溶液中，28℃下恒温培养24～48小时，制得斑马鱼心功能损伤模型；
（2）将步骤（1）制得的给药斑马鱼用质量浓度为0.3‰的三卡因麻醉，然后用3%甲基纤维素固定于载玻片上，在显微镜下观察斑马鱼心脏形态，或者，显微镜下观察记录斑马鱼心率和测量动脉球-静脉窦距离；
（3）取斑马鱼心功能损伤模型，用质量浓度为0.3‰的三卡因麻醉，然后用3%甲基纤维素固定于载玻片上，在显微镜下观察模型斑马鱼心脏形态，或者，显微镜下观察记录模型斑马鱼心率和测量动脉球-静脉窦距离；
（4）将步骤（2）得到的斑马鱼心脏形态与步骤（3）得到的模型斑马鱼心脏形态进行比较；待测化合物组的斑马鱼心脏水肿面积和血细胞淤积面积与心脏损伤模型组的心脏水肿面积和血细胞淤积面积相比减少20%以上或者与溶剂对照组/空白对照组的心脏水肿面积和血细胞淤积面积相当，则待测化合物具有心脏保护作用；
或者，将步骤（2）得到的斑马鱼心率和测量动脉球-静脉窦距离长度数据与步骤（3）得到的模型斑马鱼心率和测量动脉球-静脉窦距离长度进行比较；经统计分析后，化合物处理组的心率与心脏损伤模型组的心率相比升高且满足统计学上的p值＜0.05，动脉球-静脉窦距离缩短且满足统计学上的p值＜0.05，则待测化合物具有心脏保护作用。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中特非那定浓度为5μmol·L-1。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中养殖用水溶液是向养殖用水中加入二甲基亚砜配制的体积浓度不大于0.5%的溶液。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）或步骤（3）中，显微镜下观察的温度为25℃。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）或步骤（3）中，心脏形态为心包水肿形态和心脏出血形态。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）或步骤（3）中，测量动脉球-静脉窦距离的方法如下，使待测量斑马鱼胚胎呈侧卧状态，使两侧眼、体节重合，尾部与身体处于同一水平面，通过体视显微镜的目镜中的测微尺测量动脉球与静脉窦之间的距离。
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