CN112841091B - 一种研究哒螨灵诱导动物先天性心脏病的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种研究哒螨灵诱导动物先天性心脏病的方法及其应用，以斑马鱼为研究对象：S1.对斑马鱼胚胎细胞进行哒螨灵类药物暴露；S2.观察哒螨灵对斑马鱼心脏形态和功能的量化；S3.对斑马鱼心脏切片，进行组织病理学研究；S4.测定斑马鱼的氧化应激分析；S5.检测哒螨灵暴露诱导的斑马鱼细胞凋亡；S6.检测斑马鱼基因转录水平；本方法结合心脏毒理学与分子生物学知识，从心脏毒性角度探讨哒螨灵对水生生物斑马鱼的毒性作用，对于哒螨灵诱导动物心脏病的原因进行探究，最终得到螨灵能够诱导动物发生心脏病的结论，为阐明哒螨灵对斑马鱼心脏毒性的分子机制和人类疾病预防、建立农药鉴定机制和设计环境友好型农药提供了理论指导。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种研究哒螨灵诱导动物先天性心脏病的方法及其应用。
背景技术
先天性心脏病(CHD)是指在胚胎发育的过程中出现了心脏、血管结构和功能上的异常，是自然流产，死产以及新生儿和婴儿死亡率的主要原因，也是许多药物流产的根本原因；先天性心脏病是中国胎儿和新生儿期最常见的先天畸形，始终位居出生缺陷监测的首位，并呈上升趋势；环境污染的日益严重是先天性心脏病患病率增加的重要原因，农业农药暴露表现出与先天性心脏病的相关关系；我国每年农药用量337万吨，在农药被广泛的应用的同时，由于农药残留引发的各种疾病日趋严重，人类的生命健康受到了前所未有的威胁；许多环境污染物已被归类为内分泌干扰物，胚胎在心脏形成过程中遇到各种外界环境致畸原可能会引发先天性心脏病；大量流行病学及病理学研究表明，环境污染导致人类死亡率及致病率的增加，尤其是心血管类疾病引起的健康问题；了解环境污染物对先天性心脏病的影响，是探索先天性心脏病病因，提高先天性心脏病预防水平的重要举措；
自2018年起，柑橘已经成为我国栽种面积最为广、产量最高的水果，其中赣州为重要的产地之一；但柑橘红蜘蛛、黄蜘蛛等害螨对我国柑橘产业造成严重威胁；哒螨灵(化学名称：2-叔丁基-5-(4-叔丁基苄硫基)-4-氯哒嗪-3-(2H)酮，CAS号：96489-71-3)是一种广谱、触杀性杀螨杀虫剂，可主要用于防治柑橘等作物上各种螨虫，在我国应用极为广泛；截止到2019年，在柑橘登记农药品种中，哒螨灵制剂多达240种；哒螨灵具有一定的毒性，长期食用可在人体蓄积从而对人体造成危害；已有研究表明，哒螨灵通过在多巴胺能神经元细胞中迅速引发线粒体功能障碍和氧化损伤而诱发神经毒性；但目前对其是否会引起其他毒性作用，及其具体分子机制还知之甚少；尤其对于哒螨灵是否能够诱导动物先天性心脏病的这一课题，目前对于领域的研究仍属于空白状态。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明旨在提供一种研究哒螨灵诱导动物先天性心脏病的方法及其应用，本方法通过结合心脏毒理学与分子生物学的知识，从心脏毒性角度探讨哒螨灵对水生生物斑马鱼的毒性作用，对于哒螨灵诱导动物心脏病的原因进行探究，最终得到螨灵能够诱导动物发生先天性心脏病的结论，为阐明哒螨灵对斑马鱼心脏毒性的分子机制和人类疾病预防、建立农药鉴定机制和设计环境友好型农药提供理论指导。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种研究哒螨灵诱导动物先天性心脏病的方法，本方法以斑马鱼为研究对象，包括
步骤一：哒螨灵对斑马鱼胚胎毒性分析
S1.对斑马鱼胚胎进行哒螨灵类药物暴露；S2.观察哒螨灵对斑马鱼心脏形态和功能的量化；
步骤二：哒螨灵对斑马鱼发育的表型记录
S3.对斑马鱼心脏切片，进行组织病理学研究；
步骤三：哒螨灵对斑马鱼心脏毒性机理
S4.测定斑马鱼的氧化应激分析；S5.检测哒螨灵暴露诱导的斑马鱼细胞凋亡；S6.检测斑马鱼基因转录水平。
优选的，所述的步骤S1的具体过程包括：
S101.在体式显微镜下观察并选择受精后6小时(hpf)发育良好的斑马鱼胚胎，转移到6孔板中，每孔20个胚胎，进行哒螨灵暴露；
S102.在28.5±0.5℃条件下，分别用浓度为20、40、80、160、320、640和1280μg/L的哒螨灵溶液进行暴露实验，统计24h、48h、72h和96h的斑马鱼胚胎死亡数量，分析哒螨灵在不同暴露时长的半致死浓度；
S103.将受精后6小时(hpf)发育良好的斑马鱼胚胎暴露于浓度为20、30、40μg/L哒螨灵溶液中，于72hpf时结束哒螨灵暴露，并检测心脏毒性及机理；
S104.将12、24、36、48和60hpf的发育良好的斑马鱼胚胎暴露于40μg/L哒螨灵溶液中，并连续暴露12小时，然后更换为普通鱼液，并72hpf时检测心脏毒性及机理。
优选的，所述的步骤S2的具体过程包括：
S201.在72hpf对斑马鱼进行去壳后拍摄心脏表型，并测量心脏和心包面积、静脉窦与动脉球(SV-BA)的距离；
S202.在48和72hpf时统计心脏的心跳节律和快慢。
优选的，所述的步骤S3的具体过程包括：
S301.多聚甲醛固定：在72hpf时，将斑马鱼心脏用PFA在4℃固定过夜，再用1×PBS漂洗3次，每次5分钟；
S302.酒精脱水：按照70％(洗5次，每次5分钟)，80％(洗1次，每次5分钟)，90％(洗1次，每次5分钟)，95％，(洗1次，每次5分钟)，100％(洗2次，每次10分钟)的乙醇脱水；
S303.透明：脱完水后先用1/2乙醇与1/2二甲苯混合液处理20分钟，再用二甲苯透明5-10分钟；
S304.然后，进行石蜡包埋，具体步骤为：先用1/2二甲苯与1/2石蜡混合液加入有斑马鱼组织的试管中，在65℃烘箱放置30-50min，然后将液体更换为石蜡后再放置30min-1h；
S305.最后，利用切片机将斑马鱼切成5-7μm切片，制备斑马鱼心脏组织切片；
S306.苏木精和伊红染色：石蜡切片用苏木精和伊红染色，并用中性树脂密封，使用显微镜观察组织病理学变化；
S307.使用Tg(myl7:GFP；gata1:DsRed)转基因细胞系在共聚焦激光扫描显微镜观察心脏内红细胞数量。
优选的，所述的步骤S4的具体过程包括：
S401.将72hpf的活斑马鱼用鱼液洗涤除去哒螨灵残留，然后在20μM DCFH-DA探针中28℃避光孵育30min；
S402.然后用鱼液洗涤3次，除去多余的DCFH-DA后，通过荧光立体显微镜在恒定设置下拍摄荧光显微图像；
S403.比较对照组和处理间荧光强度差异，研究处理组氧化应激水平；
S404.采用紫外可见分光光度法测定过氧化物歧化酶活性、过氧化氢酶活性和丙二醛含量，每次处理收集50个胚胎，重复3次。
优选的，所述的步骤S5的具体过程包括：
S501.将72hpf的胚胎用鱼液洗涤，除去哒螨灵残留；
S502.将清洗后的胚胎用浓度为5mg/LAO的工作液在28.5℃暗箱中染色30min，然后用鱼液洗涤3次；
S503.通过荧光立体显微镜对胚胎进行拍照，观察细胞凋亡。
优选的，所述的步骤S6的具体过程包括：
S601.使用TriZol试剂从每次处理的胚胎中提取总RNA，然后使用Prime
RT试剂盒对RNA进行逆转录；
S602.在荧光定量PCR仪上采用SYBR Green检测试剂盒定量检测基因转录水平，以β-actin为内对照；
S603.使用2-ΔΔCT方法显示基因表达的相对变化，且每次处理在72hpf收集30个胚胎，重复3次。
优选的，可以用于建立基于斑马鱼模型的快速鉴定农药心脏毒性的方法，快速检测哒螨灵。
本发明的有益效果是：本发明公开了一种研究哒螨灵诱导动物先天性心脏病的方法及其应用，与现有技术相比，本发明的改进之处在于：
针对现有技术中对于哒螨灵是否能够诱导动物先天性心脏病的问题，本发明设计了一种研究哒螨灵诱导动物先天性心脏病的方法及其应用，本方法通过结合心脏毒理学与分子生物学的相关知识，从心脏毒性角度探讨哒螨灵对水生生物斑马鱼的毒性作用，对于哒螨灵诱导动物心脏病的原因进行探究，最终得到螨灵能够诱导动物发生心脏病的结论，为阐明哒螨灵对斑马鱼心脏毒性的分子机制和人类疾病预防、建立农药鉴定机制和设计环境友好型农药提供了理论指导，同时对于设计一种基于斑马鱼模型快速鉴定农药心脏毒性的技术提供了理论支持，具有巨大的市场前景。
附图说明
图1为本发明研究哒螨灵诱导动物心脏病的方法的技术路线图。
图2为本发明实施例1哒螨灵处理斑马鱼胚胎的致死曲线图。
图3为本发明实施例1哒螨灵暴露对斑马鱼胚胎表型特征的影响图。
图4为本发明实施例1哒螨灵暴露对斑马鱼胚胎心脏结构和功能的影响图。
图5为本发明实施例1哒螨灵暴露对斑马鱼氧化应激反应的影响图。
图6为本发明实施例1哒螨灵暴露对斑马鱼细胞凋亡的影响图。
图7为本发明实施例1哒螨灵暴露对斑马鱼心脏发育相关基因表达的影响图。
图8为本发明实施例2在心脏发育的不同阶段进行哒螨灵暴露对斑马鱼胚胎心脏形态和功能的影响图。
其中：在图3中：图(a)为在白光和荧光下观测到的不同浓度的哒螨灵对斑马鱼胚胎心脏表型特征的影响图；图(b)为不同浓度的哒螨灵对斑马鱼胚胎的体长表型特征的影响图；图(c)为不同浓度的哒螨灵对斑马鱼胚胎的静脉窦与动脉球的距离的影响图；图(d)为不同浓度的哒螨灵对斑马鱼胚胎的心包面积表型特征的影响图；图(e)为不同浓度的哒螨灵对斑马鱼胚胎的心脏面积表型特征的影响图；
在图4中：图(a)为不同浓度的哒螨灵对斑马鱼胚胎的组织切片的影响图；图(b)为48和72hpf时，不同浓度的哒螨灵对斑马鱼胚胎的心率的影响图；图(c)为不同浓度的哒螨灵对斑马鱼胚胎的心脏壁的厚度表型特征的影响图；图(d)为哒螨灵对斑马鱼胚胎心脏内红细胞数量的影像图；图(e)为哒螨灵对斑马鱼胚胎心脏活跃度的影像图；
在图5中：图(a)、图(b)、图(c)、图(d)分别表示哒螨灵浓度为0μg/L、20μg/L、30μg/L、40μg/L时斑马鱼胚胎地区的荧光图，图(e)、图(f)、图(g)、图(h)分别表示哒螨灵浓度为0μg/L、20μg/L、30μg/L、40μg/L时斑马鱼心脏地区的荧光图，图(i)为心脏区域相对荧光强度图，图(j)为不同浓度的哒螨灵的情况下的CAT活性图，图(k)为不同浓度的哒螨灵的情况下的SOD活性图，图(l)为不同浓度的哒螨灵的情况下的MDA含量图；
在图6中：图(a)、图(c)、图(e)、图(g)分别表示哒螨灵浓度为0μg/L、20μg/L、30μg/L、40μg/L时斑马鱼头部的细胞凋亡图，图(b)、图(d)、图(f)、图(h)分别表示哒螨灵浓度为0μg/L、20μg/L、30μg/L、40μg/L时斑马鱼尾部的细胞凋亡图，亮绿点代表凋亡细胞；
在图8中：图(a)为在白光和荧光下观测到的不同阶段进行哒螨灵暴露对斑马鱼胚胎心脏表型特征的影响图；图(b)为不同阶段进行哒螨灵暴露对斑马鱼胚胎的心率表型特征的影响图；图(c)为不同阶段进行哒螨灵暴露对斑马鱼胚胎的静脉窦与动脉球的距离的影响图；图(d)为不同阶段进行哒螨灵暴露对斑马鱼胚胎的心包面积表型特征的影响图；(e)为不同阶段进行哒螨灵暴露对斑马鱼胚胎的心脏面积表型特征的影响图。
具体实施方式
为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。
斑马鱼作为新兴的疾病研究的模式动物，有其他脊椎模式动物所不具备的优势，如体外受精与发育、性成熟快、繁殖力强、胚胎透明、实验周期短、饲养成本低等。所以可以直接进行活体观察组织和器官发育的整个过程。此外，在技术上，斑马鱼可以像线虫和果蝇一样，进行细胞标记和细胞谱系跟踪，也可以像爪蟾一样进行胚胎的细胞移植。在基因水平，已经发展了转基因、基因过量表达技术、随机及靶基因定向诱变等。因此利用斑马鱼作为疾病研究动物模型，为研究相关的病理生理学提供了有利的方法；
心脏是斑马鱼发育和发挥功能的第一个器官；斑马鱼和人类心脏的形态、生理、分子和病理学特征相似；此外，斑马鱼的心脏由心室和心房组成，房室腔与3周人类胚胎心脏相似；由于易于遗传操作、透明、体积小、育种和维护费用低，并且能够在早期发育中无主动循环生存，因此被广泛用于检测环境毒素和评价药物毒性。斑马鱼心脏的早期发育标志基因有vmhc、nppa和myh6，转录因子有gata4、nkx2.5、tbx5和tbx2b；这些在斑马鱼中已明确表达，这对研究斑马鱼的毒理机制有很大帮助。因此，斑马鱼是心血管研究的理想脊椎动物模型。
参照附图1-7所示的一种研究哒螨灵诱导动物先天性心脏病的方法，本研究使用Tg(myl7:GFP)和Tg(myl7:GFP；gata1:DsRed)转基因鱼系和野生型(AB鱼系)进行实验，所述方法包括
步骤一：哒螨灵对斑马鱼胚胎毒性分析
S1.对斑马鱼胚胎细胞进行哒螨灵类药物暴露，具体为：
S101.在体式显微镜下选择受精后6小时(hpf)发育良好的斑马鱼胚胎，转移到6孔板中，每孔20个胚胎进行哒螨灵暴露；
S102.在28.5±0.5℃条件下，分别用浓度为20、40、80、160、320、640和1280μg/L的哒螨灵溶液进行暴露实验，通过统计24h、48h、72h和96h的斑马鱼胚胎死亡数量分析哒螨灵在不同暴露时长的半致死浓度；
S103.将受精后6小时(hpf)发育良好的斑马鱼胚胎暴露于浓度为20、30、40μg/L哒螨灵溶液中，于72hpf时结束哒螨灵暴露并检测心脏毒性及机理；所有实验均遵循中国食品药品检定研究院的实验动物护理和使用指导原则；
S104.将12、24、36、48和60hpf的发育良好的斑马鱼胚胎暴露于40μg/L哒螨灵溶液中，并连续暴露12小时，然后更换为普通鱼液，并72hpf时检测心脏毒性及机理。
其中，所述心脏毒性指标包括：心脏表型，并测量心包面积、静脉窦与动脉球(SV-BA)的距离以及体长、心脏心率。
S2.观察哒螨灵对斑马鱼心脏形态和功能的量化，具体为：
S201.利用荧光立体显微镜在72hpf对斑马鱼进行去壳后拍摄心脏表型，并采用ImageJ软件测量心包面积、静脉窦与动脉球(SV-BA)的距离以及体长；
S202.记录在48和72hpf下计数心脏心跳节律和快慢(每20s搏动次数)。
步骤二：哒螨灵对斑马鱼发育的表型记录
S3.对斑马鱼心脏切片，进行组织病理学研究，具体为：
S301.多聚甲醛固定：在72hpf时，将斑马鱼心脏用PFA在4℃固定过夜，再用1×PBS漂洗3次，每次5分钟；
S302.酒精脱水：按照70％(洗5次，每次5分钟)，80％(洗1次，每次5分钟)，90％(洗1次，每次5分钟)，95％，(洗1次，每次5分钟)，100％(洗2次，每次10分钟)的乙醇脱水；
S303.透明：脱完水后先用1/2乙醇与1/2二甲苯混合液处理20分钟，再用二甲苯透明5-10分钟；
S304.然后，进行石蜡包埋，具体步骤为：先用1/2二甲苯(500μl)与1/2石蜡(500μl)混合液加入有斑马鱼组织的试管中，在65℃烘箱放置30-50min，然后将液体更换为石蜡后再放置30min-1h；
S305.最后，利用切片机将斑马鱼切成5-7μm切片，制备斑马鱼心脏组织切片；
S306.石蜡切片用苏木精和伊红染色，并用中性树脂密封，使用显微镜观察组织病理学变化；其中，心壁厚度采用ImageJ软件通过HE染色图像测量；
S307.使用Tg(myl7:GFP；gata1:DsRed)转基因细胞系和共聚焦激光扫描显微镜观察红细胞数量，在斑马鱼心跳的视频中使用DanioScope软件获得心脏活动，进行组织病理学观察。
步骤三：哒螨灵对斑马鱼心脏毒性机理
S4.利用荧光激活细胞分选法测定斑马鱼的氧化应激分析，根据标准方案，使用二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)，通过荧光激活细胞分选(FACS)测定哒螨灵暴露诱导的氧化应激生成，具体为：
S401.将72hpf的活斑马鱼用鱼液洗涤除去哒螨灵残留，然后在20μM DCFH-DA探针中28℃避光孵育30min；
S402.然后用鱼液洗涤3次，除去多余的DCFH-DA后，通过荧光立体显微镜在恒定设置下拍摄荧光显微图像；
S403.通过比较对照组和处理间荧光强度差异，研究处理组的氧化应激水平(通过比较对照组和处理间荧光强度差异)；
S404.采用紫外可见分光光度法测定过氧化物歧化酶活性、过氧化氢酶活性和丙二醛含量，每次处理收集50个胚胎，重复3次；
S5.利用吖啶橙(AO)染色技术检测哒螨灵暴露诱导的斑马鱼细胞凋亡，具体为：
S501.将72hpf的胚胎用鱼液洗涤，除去哒螨灵残留；
S502.将清洗后的胚胎用浓度为5mg/LAO的工作液在28.5℃暗箱中染色30min，然后用鱼液洗涤3次；
S503.通过荧光立体显微镜对胚胎进行拍照，观察细胞凋亡情况；
S6.利用实时荧光定量PCR检测斑马鱼基因转录水平，基于哒螨灵引起的心脏形态和功能、氧化应激和胚胎凋亡，拟评估胚胎中与心脏发育相关的基因表达(gata4、myh6、nkx2.5、nppa、tbx2b、tbx5和vmhc)、心脏瓣膜(klf2a)、atp酶(atp2a1)、WNT信号转导(lef1)、BMP信号转导(id1和id2)、细胞凋亡(bax、bcl2和p53)和心肌肌钙蛋白C(tnnc1a)，具体为：
S601.使用TriZol试剂从每次处理的胚胎中提取总RNA，然后使用Prime
RT试剂盒对RNA进行逆转录；
S602.在荧光定量PCR仪上采用SYBR Green检测试剂盒定量检测基因转录水平，以β-actin为内对照；
S603.使用2-ΔΔCT方法显示基因表达的相对变化，且每次处理在72hpf收集30个胚胎，重复3次。
S7.统计分析：利用单因素方差分析来确定在心脏发育的不同阶段暴露于哒螨灵的斑马鱼胚胎心脏形态和功能的差异，然后进行Duncana试验。治疗组与对照组的差异采用T检验，显著性阈值为0.05。
实施例1：
(1)哒螨灵急性毒性LC50的确定
统计哒螨灵处理48、72、96小时后的致死率，LC50(50％致死浓度)及相应表型：处理48小时后LC50(50％致死浓度)为296.3μg/L、72小时后LC50(50％致死浓度)为110.0μg/L、96小时后LC50(50％致死浓度)为27.5μg/L(图2)；
(2)哒螨灵的心脏毒性
如图3显示，哒螨灵处理的胚胎形态明显异常；随着哒螨灵浓度的增加，斑马鱼体长明显减小；哒螨灵处理的斑马鱼出现严重的心包水肿，处理组的心包面积较对照组明显增大；与对照组相比，斑马鱼心脏环化失败，并随着哒螨灵浓度的增加而被拉长，与对照组相比，处理组心脏面积和SV-BA距离也显著增加；
(3)哒螨灵对斑马鱼心脏功能的影响
如图4所示，哒螨灵暴露导致斑马鱼胚胎心肌细胞数量显著减少，导致心肌层变薄。哒螨灵导致斑马鱼心脏组织中的红细胞明显减少，处理组胚胎的心率随着哒螨灵浓度的增加而显著降低，并伴有心率紊乱，说明哒螨灵导致心脏的泵血效率降低；
(4)氧化应激反应
斑马鱼心脏地区的荧光强度随着哒螨灵浓度的增加而增加，表明哒螨灵暴露导致胚胎增强活性氧积累,尤其是心脏区域(图5)。哒螨灵暴露导致CAT活性升高，而SOD活性和MDA含量减少，表明哒螨灵暴露导致氧化应激的显著增加。
(5)细胞凋亡
如图6所示，哒螨灵暴露诱导斑马鱼胚胎细胞凋亡。
(7)心脏发育相关的基因表达
在涉及心脏发育的基因中，哒螨灵暴露上调gata4和vmhc，下调nkx2.5、nppa和心脏环化因子tbx5(图7)。
因此，通过上述7个过程可以看出，哒螨灵能够抑制斑马鱼心脏的结构和功能，进而诱导心脏病的发生，因此可以得到哒螨灵能够诱导动物体或人体发生先天性心脏病的结论；并且，在心脏环化的关键阶段(24-36hpf)，胚胎对哒螨灵最敏感；因此，可以据此进行基于斑马鱼模型的农药的心脏毒性快速鉴定。
实施例2：一种基于斑马鱼模型快速鉴定农药心脏毒性的技术(方法)
(1)原理
斑马鱼是新兴的器官发育和疾病研究的模式动物，有其他脊椎模式动物所不具备的优势，如产卵量大、繁殖周期快、突变表型明显、胚体透明、胚胎发育同步且发育速度快、易养殖、个体小、养殖花费少、能大规模繁育等；由于斑马鱼可以直接进行活体观察组织和器官发育的整个过程，因此，斑马鱼作为模式动物越来越受到相关研究重视；
心脏是斑马鱼发育和发挥功能的第一个器官，胚胎受精后3天，斑马鱼的心脏结构和功能即趋于完善；斑马鱼和人类心脏的形态、生理、分子和病理学特征相似。此外，斑马鱼的心脏由心室和心房组成，房室腔与3周人类胚胎心脏相似；由于易于遗传操作、透明、体积小、育种和维护费用低，并且能够在早期发育中无主动循环生存，因此，可以基于斑马鱼模型构建快速鉴定农药心脏毒性的技术。
(2)实验方法
以哒螨灵为例，实验方法如下：
步骤一：S1.对斑马鱼胚胎细胞进行哒螨灵类药物暴露：
与实施例1步骤S104相同，将12、24、36、48和60hpf的发育良好的斑马鱼胚胎暴露于40μg/L哒螨灵溶液中，并连续暴露12小时，然后更换为普通鱼液，并72hpf时检测心脏毒性及机理；
其中，所述心脏毒性指标包括：心脏表型，并测量心包面积、静脉窦与动脉球(SV-BA)的距离以及体长、心脏心率。
步骤二：S2.观察哒螨灵对斑马鱼心脏形态和功能的量化，具体为：
S201.利用荧光立体显微镜在72hpf对斑马鱼进行去壳后拍摄心脏表型，并采用ImageJ软件测量心包面积、静脉窦与动脉球(SV-BA)的距离以及体长；
S202.记录在48和72hpf下计数心脏心跳节律和快慢(每20s搏动次数)。
步骤三：实验结果观察
在心脏发育的不同阶段，胚胎心脏对哒螨灵的敏感性不同；
如图8所示，在24-36hpf时，哒螨灵暴露对胚胎造成最大的心脏毒性，表现为最低的心率、最长的SV-BA距离和最严重的心包水肿；第二个受哒螨灵影响最严重的时间阶段是48-60hpf，其中心包水肿是最严重的，心率、SV-BA距离和心脏面积也较为；然而，36-48hpf和60-72hpf的斑马鱼胚胎对哒螨灵暴露反应不大。
(4)结论
以哒螨灵为例，研究发现，在斑马鱼胚胎受精后48小时进行农药暴露12小时，可以观察到斑马鱼胚胎心脏发生了严重的心脏畸形，与长时间农药暴露(受精后6-72小时暴露共66小时)心脏表型的结果相同，且基于斑马鱼进行农药的心脏毒性鉴定，最快仅需要24小时，时间大大缩短，因此，利用本技术可以基于斑马鱼模型，在胚胎受精48小时时进行，农药暴露12小时即可快速检测柑橘等农作物上残留的哒螨灵等的心脏毒性，具有检测时间短、检测结果准确的特点。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (5)
1.一种研究哒螨灵诱导动物先天性心脏病的方法，其特征在于：本方法以斑马鱼为研究对象，包括
步骤一：哒螨灵对斑马鱼胚胎毒性分析
S1.对斑马鱼胚胎进行哒螨灵类药物暴露；
所述的步骤S1的具体过程包括：
S101.在体式显微镜下观察并选择受精后6小时发育良好的斑马鱼胚胎，转移到6孔板中，每孔20个胚胎，进行哒螨灵暴露；
S102.在28.5±0.5℃条件下，分别用浓度为20、40、80、160、320、640和1280μg/L的哒螨灵溶液进行暴露实验，统计24h、48h、72h和96h的斑马鱼胚胎死亡数量，分析哒螨灵在不同暴露时长的半致死浓度；
S103.将受精后6小时发育良好的斑马鱼胚胎暴露于浓度为20、30、40 μg/L哒螨灵溶液中，于72hpf时结束哒螨灵暴露，并检测心脏毒性及机理；
S104.将12、24、36、48和60hpf的发育良好的斑马鱼胚胎暴露于40μg/L哒螨灵溶液中，并连续暴露12小时，然后更换为普通鱼液，并72hpf时检测心脏毒性及机理；
S2.观察哒螨灵对斑马鱼心脏形态和功能的量化；
所述的步骤S2的具体过程包括：
S201.在72小时对斑马鱼进行去壳后拍摄心脏表型，并测量心脏和心包面积、静脉窦与动脉球的距离；
S202.在48和72hpf时统计心脏的心跳节律和快慢；
步骤二：哒螨灵对斑马鱼发育的表型记录
S3.对斑马鱼心脏切片，进行组织病理学研究；
所述的步骤S3的具体过程包括：
S301.多聚甲醛固定：在72hpf时，将斑马鱼心脏用PFA在4℃固定过夜，再用1×PBS漂洗3次，每次5分钟；
S302.酒精脱水：按照70%乙醇清洗5次，每次5分钟，80%乙醇清洗1次，每次5分钟，90%乙醇清洗1次，每次5分钟，95%乙醇清洗1次，每次5分钟，100%乙醇清洗2次，每次10分钟，对斑马鱼心脏进行脱水；
S303.透明：脱完水后先用1/2乙醇与1/2二甲苯混合液处理20分钟，再用二甲苯透明5-10分钟；
S304.然后，进行石蜡包埋，具体步骤为：先用1/2二甲苯与1/2石蜡混合液加入有斑马鱼组织的试管中，在65℃烘箱放置 30-50 min，然后将液体更换为石蜡后再放置30 min-1h；
S305.最后，利用切片机将斑马鱼切成5-7μm切片，制备斑马鱼心脏组织切片；
S306.苏木精和伊红染色：石蜡切片用苏木精和伊红染色，并用中性树脂密封，使用显微镜观察组织病理学变化；
S307.使用Tg转基因细胞系在共聚焦激光扫描显微镜观察心脏内红细胞数量；
步骤三：哒螨灵对斑马鱼心脏毒性机理
S4.测定斑马鱼的氧化应激分析；S5.检测哒螨灵暴露诱导的斑马鱼细胞凋亡；S6.检测斑马鱼基因转录水平。
2.根据权利要求1所述的一种研究哒螨灵诱导动物先天性心脏病的方法，其特征在于：所述的步骤S4的具体过程包括：
S401.将72hpf的活斑马鱼用鱼液洗涤除去哒螨灵残留，然后在20μM DCFH-DA探针中28℃避光孵育30min；
S402.然后用鱼液洗涤3次，除去多余的DCFH-DA后，通过荧光立体显微镜在恒定设置下拍摄荧光显微图像；
S403.比较对照组和处理间荧光强度差异，研究处理组氧化应激水平；
S404.采用紫外可见分光光度法测定过氧化物歧化酶活性、过氧化氢酶活性和丙二醛含量，每次处理收集50个胚胎，重复3次。
3.根据权利要求1所述的一种研究哒螨灵诱导动物先天性心脏病的方法，其特征在于：所述的步骤S5的具体过程包括：
S501.将72hpf的胚胎用鱼液洗涤，除去哒螨灵残留；
S502.将清洗后的胚胎用浓度为5mg/LAO的工作液在28.5℃暗箱中染色30 min，然后用鱼液洗涤3次；
S503.通过荧光立体显微镜对胚胎进行拍照，观察细胞凋亡。
4.根据权利要求1所述的一种研究哒螨灵诱导动物先天性心脏病的方法，其特征在于：所述的步骤S6的具体过程包括：
S601.使用TriZol试剂从每次处理的胚胎中提取总RNA，然后使用Prime Script®RT试剂盒对RNA进行逆转录；
S602.在荧光定量PCR仪上采用SYBR Green检测试剂盒定量检测基因转录水平，以β-actin为内对照；
S603.使用2-ΔΔCT方法显示基因表达的相对变化，且每次处理在72hpf收集30个胚胎，重复3次。
5.根据权利要求1所述的一种研究哒螨灵诱导动物先天性心脏病的方法，其特征在于：用于建立基于斑马鱼模型的快速鉴定农药心脏毒性的方法，快速检测哒螨灵。
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