CN109929804A - 一种人卵巢癌细胞系及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种人卵巢癌细胞系，其特征在于，命名为人卵巢腺癌原发耐药株W038，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:C2017246。本发明人卵巢腺癌原发耐药株W038细胞侵袭能力弱且迁移能力弱，可作为侵袭迁移双阴性对照组，体外软琼脂集落形成试验验证致瘤性证明成克隆能力强，体外药敏实验验证对多种药物均为耐药，与临床特征相符。本发明公开的制备方法可以纯化癌细胞系至99％以上，其中，筛选培养基成分能够选择性杀伤间质细胞，对肿瘤细胞生长具有高选择性，同时，能够提高肿瘤细胞的增殖速度，缩短培养周期。不仅可用于纯化卵巢癌细胞系，也可用于纯化制备其他癌种细胞系。

Description

一种人卵巢癌细胞系及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，特别涉及一种人卵巢癌细胞系及其制备方法和应用。

背景技术

卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，不同国家中卵巢癌发生率在1/100000－17/100000不等，我国卵巢癌发病率仅次于宫颈癌和宫体癌，居第三位。在美国，卵巢癌仅次于宫体癌居第二位，也是该国女性第五大常见的恶性肿瘤。因缺乏有效的早期诊断方法，大多数患者出现症状而得以诊断时已经为晚期。目前上皮性卵巢癌致死率居妇科恶性肿瘤首位。尽管患者在手术和化疗后有明显好转，但长期预后仍然较差。大多数患者(75％-80％)被确诊时已是卵巢癌晚期(Ⅲ、Ⅳ期)；III期患者的5年生存率约为40％，IV期患者的5年生存率约为20％。此外，即使经过初期化疗成功后，仍有30％-40％的I期和II期卵巢癌患者经历复发。因此亟待需要新的治疗策略，以防止该疾病的复发及恶化。要理解该病的生物学机理并找到更有效的治疗方法，我们还有很长的路要走。尽管卵巢癌的问题已经很突出，但对于它的发生机制却知之甚少，而且目前在治疗方面进展也极其缓慢，导致卵巢癌的死亡率并没有较大改观。对卵巢癌的发生机制不清以及目前的治疗难以取得进展，在一定程度上是由于缺乏适宜的体外研究体系，无法对卵巢癌的发生及进展过程中的生物学事件加以研究。细胞系可以更好地应用于研究该病的生物学机制，进而开发更有效的治疗战略。

卵巢癌派生出的连续细胞系首次报道于70年代，并详细描述了卵巢肿瘤细胞的培养特征(Ioachim等，1974)。在过去的30年中，卵巢肿瘤细胞系的数量急剧增长，其中一些细胞系作为人类卵巢癌的模型被广泛使用，它们能反映该病的临床问题。这些应用包括药物抗性的机制、新药筛选和药物开发、原癌基因/抑癌基因表达的分析、黏附和转化的模型建立以及通过肽生长因子、细胞因子和激素对增殖的控制研究。

虽然现有的细胞系能广泛地代表该病的临床类型，但是仍然存在空缺之处。这些空缺包括相关临床细节(年龄、阶段、样本部位及治疗历史)不见记录，大多数卵巢癌细胞系为欧洲及美国科研机构所建立并报道。国家实验细胞资源共享平台包括中国典型培养物保藏中心细胞库、中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心、中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心、中国食品药品检定研究院等细胞库共收录保藏人卵巢癌细胞系21种，其中只有两种人卵巢癌细胞系HO-8910和HO-8910PM取材于中国人临床标本，其余细胞系均取材白种人和黑种人。

另外，在化疗过程中，肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性是化疗失败的最主要原因。在现有的卵巢癌细胞系中，缺乏对多种化疗药物产生联合耐药的细胞系模型，极大程度地限制了对这一领域的研究，因此，急需寻找一种人卵巢癌细胞系来解决这些问题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的一个方面是提供了一种人卵巢癌细胞系，其对于更有效地筛选潜在的致癌物或抗癌药物，发展新的治疗方法以及研制抗肿瘤疫苗至关重要。

本发明提供的技术方案为：

一种人卵巢癌细胞系，命名为人卵巢腺癌原发耐药株W038，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:C2017246。

本发明的另一个方面是提供了一种上述人卵巢癌细胞系的子代细胞。

上述子代细胞可以为人卵巢腺癌原发耐药株W038经体外或体内传代、分化后得到的细胞，所述子代细胞表达与人卵巢腺癌原发耐药株W038相同或相关的一种或多种标志物。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，本发明所述人卵巢癌细胞系对至少6种药物分别或同时产生耐药性。

更优选地，上述药物为化疗药物，选自紫杉醇、卡铂、顺铂、奥沙利铂、多西他赛或阿霉素中的一种或几种。

本发明中的人卵巢癌细胞系为原发耐药细胞系，其对多种化疗药物均产生耐药性。与现有技术中经诱导得到的耐药细胞株不同，本发明原发耐药细胞系更具有干细胞特性，更贴近临床样本情况，并且耐药倍数更稳定。同时，与现有技术中单一耐药细胞系相比，本发明的人卵巢癌细胞系为多药耐药细胞系，其在研究单一或多种药物耐药过程中具有极大优势。

本发明的另一个方面是提供了一种上述人卵巢癌细胞系的制备方法，具体为，取卵巢癌患者腹水，去除红细胞，将剩余细胞在完全培养基中继续培养，当培养至汇合度不低于70％时，将完全培养基换成筛选培养基，培养至全部为卵巢癌上皮细胞，即得；

其中，所述筛选培养基含有体积百分比为5％～20％的无细胞腹水。

在现有技术中，用临床样本建立卵巢肿瘤细胞系的成功率只有不到30％。失败的原因常常归结于上皮细胞缺乏增殖，这常伴随有间质细胞的过度增殖。患者腹水中常含有大量肿瘤细胞，由此建立细胞系的成功率要比用实体瘤组织建立的成功率高很多。

建立可长期生存的卵巢癌细胞系是比较困难的，本领域技术人员所面临的困难主要是培养物中成纤维细胞的过度增生、难以确定培养条件，难以连续传代以及建立细胞系之后的鉴定。本发明人针对这些难点问题系统地研发了相对简化易行的细胞培养方法，成功从卵巢癌患者的腹水样本中建立起上皮卵巢癌细胞系，它们对于更有效地筛选潜在的致癌物或抗癌药物，发展新的治疗方法以及研制抗肿瘤疫苗至关重要。

在本发明的一个实施方式中，所述卵巢癌患者腹水来源于亚洲中国女性，年龄，61岁，高级别腺癌，原发卵巢癌，FIGO IIIc期，腹膜内广泛转移。

在本发明的制备方法中，上述去除红细胞的方法可以为任意合适的方法，作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述去除红细胞的方法为使用红细胞裂解液，在4℃下1000rpm离心7分钟。

上述细胞培养的方法可以为任意合适的方法，常规为在培养箱中以37℃，5％CO₂的条件下培养。

上述完全培养基可以为任意合适的含有血清的哺乳动物细胞培养基，如含有血清的RPMI 1640、含有血清的DMEM、含有血清的MEM等。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述完全培养基为含有血清的DMEM培养基。更优选地，所述完全培养基为含有10％FBS的DMEM培养基。

在本发明的制备方法中，作为优选，所述筛选培养基含有体积百分比为8％～15％的无细胞腹水。

更优选地，在本发明的一个实施方式中，所述筛选培养基含有体积百分比为15％的无细胞腹水。

上述无细胞腹水(CFA)可以为任意癌症患者产生的腹水，优选为卵巢癌患者的腹水。同时，上述无细胞腹水(CFA)可通过任意合适的方法制得，作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述无细胞腹水的制备方法为：收集产生血纤维网的无腹水细胞，3000rpm离心10min去除细胞，并0.2μm无菌滤膜过滤除菌，-20℃冻存备用。

作为优选，上述筛选培养基由以下体积百分比的成分组成：5％～20％的无细胞腹水、3％～15％的胎牛血清、1％的双抗，其余为哺乳动物细胞培养基。

上述哺乳动物细胞培养基可以为任意合适的哺乳动物细胞培养基，如RPMI1640、DMEM、MEM等。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述哺乳动物细胞培养基为DMEM培养基。

更优选地，在本发明的一个实施方式中，上述筛选培养基由以下体积百分比的成分组成：8％～15％的无细胞腹水、5％的胎牛血清、1％的双抗，其余为DMEM培养基。

上述筛选培养基可以很好地抑制间皮细胞增殖并间接损伤间皮细胞，使其皱缩易脱落，而对癌细胞无伤害。同时，能够提高肿瘤细胞的增殖速度，缩短培养周期。

在本发明的制备方法中，作为优选，上述去除红细胞后，将细胞在完全培养基中继续培养至细胞悬液中的间质细胞黏附，然后将上皮细胞凝块吹起，转移至其他培养瓶继续培养。

作为优选，所述将细胞在完全培养基中继续培养1～2小时。

在本发明的制备方法中，作为优选，在将完全培养基换成筛选培养基后，可以包含进一步去除间质细胞的步骤，具体为，去除筛选培养基，洗涤细胞沉淀后加入细胞消化液，当间质细胞收缩变圆但上皮细胞还未收缩时，轻拍敲打培养瓶使间质细胞脱离，去除间质细胞后，在筛选培养基中继续培养至全部为上皮肿瘤细胞。

本发明的另一个方面是提供了一种上述人卵巢癌细胞系或上述子代细胞在构建卵巢癌发生、发展或转移的细胞或动物模型中的应用。

作为优选，所述动物模型为哺乳动物模型；更优选地，所述哺乳动物模型为鼠模型；进一步地，所述鼠模型可以为小鼠模型或大鼠模型。

本发明的另一个方面是提供了一种上述人卵巢癌细胞系或上述子代细胞在开发、筛选或评价用于治疗卵巢癌药物中的应用。

本发明的另一个方面是提供了一种上述人卵巢癌细胞系或上述子代细胞在研究肿瘤干细胞模型中的应用。

本发明的另一个方面是提供了一种人卵巢癌细胞模型，该细胞模型包含上述人卵巢癌细胞系或上述子代细胞。

本发明的有益效果为：

本发明人卵巢腺癌原发耐药株W038细胞侵袭能力弱且迁移能力弱，可作为侵袭迁移双阴性对照组，体外软琼脂集落形成试验验证致瘤性证明成克隆能力强，体外药敏实验验证对多种药物均为耐药，与临床特征相符。本发明提供的制备方法可以纯化癌细胞系至99％以上，其中，筛选培养基成分能够选择性杀伤间质细胞，对肿瘤细胞生长具有高选择性，同时，能够提高肿瘤细胞的增殖速度，缩短培养周期。不仅可用于纯化卵巢癌细胞系，也可用于纯化制备其他癌种细胞系。

生物保藏信息：

保藏编号：CCTCC No:C2017246

保藏日期：2017年10月29日

保藏单位：中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学

分类命名：人卵巢腺癌原发耐药株W038

附图说明

图1为不同培养阶段的卵巢癌上皮细胞的细胞形态图，其中，A为完全培养基培养一周后的混合细胞，B为选择培养基培养一周后损伤间质细胞，C为去除间质细胞，纯化后的卵巢癌上皮细胞；

图2为流式细胞术分析鉴定本发明细胞表型的结果图；

图3为免疫组化鉴定本发明细胞表型的结果图；

图4为Transwell实验比较不同细胞的迁移和侵袭能力的结果图。

具体实施方式

本发明公开了一种人卵巢癌细胞系，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：细胞系的构建

1.卵巢腹水样品的收集

从外科手术中获得的液体样品，在收集和运输过程中，所有试剂和仪器必须无菌，离体后6h之内运输到实验室处理。样品应标记上“腹水、腹膜液或腹膜冲洗液”字样。并在表格中记录相关信息。建议病人姓名不要记录而已住院号作为ID号码，同时将表格上的信息转移到实验记录本上，以确保相关的临床信息与由该样本建立起来的任何肿瘤细胞系相吻合。

2.卵巢癌细胞的原代接种前处理

1)无菌操作下，将腹水转移到无菌圆锥形底的50mL离心管，1000rpm4℃离心7min；

2)弃上清；

3)加入2mL红细胞裂解液(ACK)混合均匀进行裂解；

4)1000rpm4℃离心7min，弃上清；

5)若仍含有大量血红细胞的话，重复以上裂解步骤；

6)10mL PBS缓冲液洗涤细胞沉淀2次；

7)用5mL培养基重悬得到的细胞沉淀，此为最终细胞悬液。

3.去除间质细胞及原代细胞接种

1)用血球计数器和活力染料，如台盼蓝，对上面得到的最终细胞悬液中的活细胞进行大致计数；

2)调整最终细胞浓度为2×10⁵个活细胞每毫升培养基，向T25培养瓶中加入7-10mL细胞悬液；

3)用含有1％PS的完全培养基培养4天后，如果汇合度达70％，换液，加入筛选培养基，如果汇合度没到70％，则换液继续培养至70％汇合度，再进行后续操作；

4)用筛选培养基37℃，5％CO₂培养箱继续培养至全部细胞为上皮细胞。

上述筛选培养基的配方为：5％FBS+15％CFA+1％PS+DMEM培养基

上述完全培养基的配方为：10％FBS+DMEM培养基

实施例2：细胞系的构建

1.卵巢腹水样品的收集

从外科手术中获得的液体样品，在收集和运输过程中，所有试剂和仪器必须无菌，离体后6h之内运输到实验室处理。样品应标记上“腹水、腹膜液或腹膜冲洗液”字样。并在表格中记录相关信息。建议病人姓名不要记录而已住院号作为ID号码，同时将表格上的信息转移到实验记录本上，以确保相关的临床信息与由该样本建立起来的任何肿瘤细胞系相吻合。

2.卵巢癌细胞的原代接种前处理

1)无菌操作下，将腹水转移到无菌圆锥形底的50mL离心管，1000rpm4℃离心7min；

2)弃上清；

3)加入2mL红细胞裂解液(ACK)混合均匀进行裂解；

4)1000rpm4℃离心7min，弃上清；

5)若仍含有大量血红细胞的话，重复以上裂解步骤；

6)10mL PBS缓冲液洗涤细胞沉淀2次；

7)用5mL培养基重悬得到的细胞沉淀，此为最终细胞悬液。

3.去除间质细胞及原代细胞接种

1)用血球计数器和活力染料，如台盼蓝，对上面得到的最终细胞悬液中的活细胞进行大致计数；

2)调整最终细胞浓度为2×10⁵个活细胞每毫升培养基，向T25培养瓶中加入7-10mL细胞悬液；

3)将细胞培养瓶置于37℃，5％CO₂培养箱，培养2h，在显微镜下观察，细胞悬液中的间质细胞黏附后，将上皮凝块吹起，转移到新T25培养瓶中置于37℃，5％CO₂培养箱培养，此为第一次去除间质细胞；

4)用含有1％PS的完全培养基培养5天后，如果汇合度达80％，换液，加入筛选培养基，培养过夜，如果汇合度没到80％，则换液继续培养至80％汇合度，再进行后续操作；

5)用10mL PBS缓冲液洗涤细胞沉淀2次；

6)加入1mL37℃的胰蛋白酶/EDTA(1:1)溶液，轻轻混匀使整个培养瓶的细胞都浸在溶液中；

7)显微镜下观察间皮细胞收缩变圆，但是上皮癌细胞还没有收缩的时间节点，轻拍敲打培养瓶助间皮细胞脱离，此为第二次大量去除间质细胞；

8)用10mL PBS缓冲液洗涤细胞沉淀3次；

9)用筛选培养基37℃，5％CO₂培养箱继续培养至全部细胞为上皮细胞。

上述筛选培养基的配方为：5％FBS+5％CFA+1％PS+DMEM培养基

上述完全培养基的配方为：10％FBS+DMEM培养基

利用上述方法构建人卵巢腺癌原发耐药株W038，其不同培养阶段的卵巢癌上皮细胞的细胞形态如图1所示。从图中可以看出，图1的A为对照组，为完全培养基培养一周后的腹水混合细胞，不管是间皮细胞还是癌细胞，均舒展生长，贴壁牢固，难以纯化分离癌细胞。而图1的B为使用实施例中的方法，可以看出，该方法可以很好地选择性培养肿瘤细胞。

腹水来源的肿瘤细胞的培养，难点在于间皮细胞的增殖及去除，本发明实施例的培养方法及筛选培养基可以很好地解决这一问题，有效减少间皮细胞污染，分离纯化出纯度高的肿瘤细胞，结果如图1的C和图2所示。

实施例3：细胞系的传代培养及冻存

1.换液

接种原代培养物每3-4天用新鲜筛选培养基换液一次，换液时用无菌巴氏吸管吸走旧培养基，再换新吸管加入新的完全培养基。

2.避免交叉污染

为了减少或避免新培养的细胞系被其他来源的细胞污染的可能性，采用以下防护措施：

如果有条件则建立原代培养细胞系时，实验室不再培养其他已建的细胞系，如果条件不允许，则尽量保证新建原代培养细胞系在独立的超净台和培养箱中培养，所用培养基单独装于无菌容器中并单独标记，每次培养操作均在细胞培养超净台中进行，且每次操作换无菌新吸管或枪头，同一传代次数细胞系放入培养箱同一层中，最后建立的细胞系应受到细心养护。

3.传代培养

不同肿瘤衍生出的细胞群体生长时间不同，生长至90％汇合时用37℃的胰蛋白酶/EDTA溶液1:1分瓶。

细胞传代方法1:3～1:4传代，5～7天1次。

4.更换培养基

第一次分瓶后，流式细胞术(FCM)鉴定细胞表型，并收集上清液检查支原体状态。分瓶后更换培养基为生长培养基，生长至90％汇合时1:3分瓶。

5.冻存

生长至后续实验及储备留种所需足够数量时，冻存液冻存，液氮保存。

冻存液成分为：含有10％DMSO的血清溶液。

6.复苏

从液氮中拿出含有细胞的冻存管，在37℃水浴中快速复温，75％乙醇擦拭冷冻管，将细胞悬液转移到15mL离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，用含10％血清的完全培养基重悬细胞，调整理想细胞浓度，37℃，5％CO₂培养箱培养。

实施例4：细胞系的鉴定

以下方法均使用本发明实施例1和实施例2中构建的细胞系，以及实施例1和实施例2中构建的细胞系的子代细胞进行。

1.FCM鉴定细胞表型

1)PBS缓冲液清洗需检测细胞，胰酶消化收集细胞；

2)1000rpm离心5min，弃上清；

3)4％多聚甲醛溶液固定15min，离心，弃上清；

4)PBS缓冲液清洗2次；

5)0.3％TritonX-100的PBS室温打孔15mins；

6)PBS缓冲液清洗2次；

7)细胞计数，每管流式管10⁵个细胞；

8)实验组1:500加入FITC-CK7,同型抗体对照组1:500加入FITC-CDX-2，室温避光孵育染色30min；

9)PBS缓冲液清洗1次；

10)在BD FACSCanto II流式细胞仪上上机检测结果，FlowJo 7.6软件分析检测结果。

结果如图2所示，结果表明，本发明中成功培养的W038细胞FCM证明是纯化的上皮癌细胞，100％细胞均表达上皮卵巢肿瘤标志物CK7。

2.免疫组化鉴定细胞表型

常规胸腹水直接涂片法检查中，癌细胞的检出率低，易漏诊，采用胸腹腔积液沉淀物石蜡包埋切片法，不仅收集的细胞数增加，切片质量高，同时可根据需要重复切片，结合免疫组织化学对肿瘤进行标记，提高了胸腹腔积液肿瘤细胞的检出率。

取300mL腹水，52A型医用低速离心机，离心半径40cm，2500r/min离心15min，弃上清，沉淀物用试镜纸过滤包裹，Caroy液固定2h，如腹水肿瘤细胞和纤维蛋白成分多，则会凝结为块状，可将此直接包裹固定。将处理好的沉淀物凝结块于梯度乙醇内脱水，二甲苯透明1h，54℃以下低熔点石蜡浸2次，各1h，石蜡包埋，4-6um连续切片，10个切面，将切片裱于数张载玻片上，HE染色，光镜观察。免疫组化，细胞角蛋白CK等，免疫组化诊断标准：胞质和(或)胞膜着棕黄色颗粒者为阳性细胞。

组化结果如图3所示：PAX-8(+)，WT-1(-)，ER(-)，PR(-)，CDX-2(-)，CK7(+)，P53(90％+)。

3.STR鉴定

用基因指纹技术对细胞和其他肿瘤细胞比较，确认细胞系为人源的，来自于所属病人资源，没有被培养室的其他细胞系污染。

1)检材处理和检验方法

取适量检材用Chelex100提取DNA，采用MicroreaderTM21ID System STR复合扩增试剂盒进行扩增，在ABI 3130xl型遗传分析仪上对STR位点和性别基因Amelogenin进行检测。用Gene Mapper v3.2software(ABI)对各STR位点进行基因型分析。该细胞DNA扩增后图谱清晰，分型结果良好。

2)检验结果

实验中阳性及阴性性对照结果均正确。

该细胞株的STR位点和Amelogenin位点的基因分型结果见表1所示。

3)检验结论

①该株细胞DNA进行细胞STR分型结果显示，在各基因座均未出现三等位基因现象。细胞中没有发现人类细胞交叉污染。②该株细胞DNA分型在ATCC与DSMZ细胞库中未找到与其细胞分型100％相匹配的细胞。

表1细胞W038的STR位点和Amelogenin位点的基因分型结果

4)支原体检测

取2μl细胞沉淀，采用Mycoplasma Detection Set扩增试剂盒(M&CGeneTechnology)进行巢式PCR扩增，用2.0％琼脂糖凝胶电泳对目的条带进行检测，PCR产物的片段大小对应的支原体种类见表2。实验中阴性对照(NTC)无条带，阳性对照(P)有条带，证明本次实验结果准确可靠。样品W038中未检测到支原体。

表2PCR产物的片段大小对应的支原体种类

实施例5：生物功能学验证

以下方法均使用本发明实施例1和实施例2中构建的细胞系，以及实施例1和实施例2中构建的细胞系的子代细胞进行。

1.Transwell实验

1)迁徙实验证明迁移能力

目前研究认为肿瘤侵袭与转移是一个多步骤的过程，首先肿瘤细胞之间黏附降低，依赖与周围基质的黏附能力，细胞骨架的伸缩能力和对细胞外基质的重构进行移动，然后突破基底膜进入循环系统经免疫逃避发生远处转移。利用Transwell小室(聚碳酸酯膜直径6.5mm，微孔大小8.0μm)检测细胞迁移能力，以常规方法用无血清培养基制备单细胞悬1.0×10⁵个/ml，每孔加入200μl细胞悬液。Transwell培养板下室加入500μl含10％胎牛血清的完全培养基，37℃，5％CO²，95％湿度培养24h。24h后取出Transwell培养板上室甲醇固定15min，1％结晶紫染色15min，200倍正置显微镜下计数，成像。结果证明W038迁移能力弱，与其他细胞系迁移能力比较如表3和图4所示。

表3比较不同细胞的迁移能力(×200)(Mean±SD，n＝4)

组别	N	细胞数(个)
			W038	4	2.0±0.816
A549	4	21.33±5.51
			A2780	4	97.0±9.42
293T	4	0

2)Transwell侵袭实验证明侵袭能力

基底膜的降解是肿瘤浸润和转移的关键步骤。利用Matrigel和Transwell构建侵袭小室进行高侵袭性和低侵袭性细胞群的分离(聚碳酸酯膜直径6.5mm，微孔大小8.0μm)。将60μl/孔1:3稀释的Matrigel铺于Transwell培养板上室的聚碳酸酯膜上，37℃，30min，让Matrigel聚合成胶。以常规方法用无血清培养基制备单细胞悬1.0×10⁵个/ml，每孔加入200μl细胞悬液。Transwell培养板下室加入500μl含10％胎牛血清的完全培养基，37℃，5％CO²，95％湿度培养36h。36h后取出Transwell培养板上室甲醇固定15min，1％结晶紫染色15min，200倍正置显微镜下计数，成像。结果如表4和图4所示W038侵袭能力弱，为低侵袭性细胞株。

表4比较不同细胞的侵袭能力(×200)(Mean±SD，n＝4)

组别	N	细胞数(个)
			W038	4	0
A549	4	12.1±5.14
			A2780	4	53.6±7.21
293T	4	0

2.体外软琼脂集落形成试验验证致瘤性

5％琼脂糖高压灭菌，按以下比例加入24well：底层0.5％琼脂糖：5％琼脂与培养基按1：9配制，0.8mL/孔(底层)，凝固5min。顶层0.3％琼脂糖：将W038及对照细胞A549、A2780、293T经胰酶消化，用培养基制成细胞悬液，按细胞悬液9.4mL加5％琼脂糖0.6mL比率配制，0.8mL/孔，使每孔细胞为25，50，100个/孔，各设3复孔。37℃5％CO₂及饱和湿度的培养箱中培养14天，倒置显微镜下观察克隆形成情况。

判断标准：直径>75μm或含50个细胞以上的细胞集落为一克隆，计算克隆形成率。

结果分析知W038成球能力最强，且与对照组差异明显。A549成球能力次之，293T细胞形成率为0，A2780克隆形成不是球形，成球能力次于A549细胞。

3.体外验证对化疗药物的敏感性

1)临床化疗药物

本研究选用6种临床常用化疗药物：紫杉醇(Tax，辰欣药业股份有限公司)，卡铂(CBP，齐鲁制药有限公司)，顺铂(DDP，江苏豪森药业股份有限公司)，奥沙利铂(Oxa，江苏恒瑞医药股份有限公司)，多西他塞(Doc，江苏恒瑞医药股份有限公司)，阿霉素(THP，深圳万乐药业有限公司)。

2)药物敏感试验

取对数生长期的细胞，均匀接种于96well，3000cell/well，100μl细胞悬液，37℃，5％CO₂，95％湿度培养12h。然后按照6个浓度梯度分别加入6种抗肿瘤药物，同时设空白对照和阴性对照组，各组均设3个复孔，置37℃，5％CO₂，95％湿度培养48h。然后加入检测试剂CCK-8，于酶标仪上以450nm检测光密度值(OD值)。抑制率(IR)＝(对照组OD-实验组OD)/(对照组OD-空白组OD)×100％，重复3次试验取平均值以计算抑制率。采用GraphPad Prism5.0软件分析数据。

3)结果分析

根据计算出的IR值按以下标准判断每种药物的敏感性：IR＜30％，耐药；30％＜IR＜50％，轻度敏感；50％＜IR＜80％，中度敏感；IR＞80％，高度敏感。多次实验，IR值取平均值。采用均数±标准差进行结果分析。临床6种药Tax、CBP、DDP、Oxa、Doc、THP的IR分别为28.12±5.42％、13.41±2.01％、46.78±3.90％、21.56±8.01％、29.23±1.10％、29.67±4.12％，其中Tax、CBP、Oxa、Doc、THP结果均为耐药，与临床特征相符。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (11)

1.一种人卵巢癌细胞系，其特征在于，命名为人卵巢腺癌原发耐药株W038，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:C2017246。

2.一种如权利要求1所述的人卵巢癌细胞系的子代细胞。

3.根据权利要求1所述的人卵巢癌细胞系，其特征在于，所述人卵巢癌细胞系对至少6种药物分别或同时产生耐药性。

4.根据权利要求3所述的人卵巢癌细胞系，其特征在于，所述药物为化疗药物，选自紫杉醇、卡铂、顺铂、奥沙利铂、多西他赛或阿霉素中的一种或几种。

5.一种如权利要求1、3或4所述的人卵巢癌细胞系的制备方法，其特征在于，取卵巢癌患者腹水，去除红细胞，将剩余细胞在完全培养基中继续培养，当培养至汇合度不低于70％时，将完全培养基换成筛选培养基，培养至全部为卵巢癌上皮细胞，即得；

其中，所述筛选培养基含有体积百分比为5％～20％的无细胞腹水。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述去除红细胞后，将细胞在完全培养基中继续培养至细胞悬液中的间质细胞黏附，然后将上皮细胞凝块吹起，转移至其他培养瓶继续培养。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述筛选培养基由以下体积百分比的成分组成：5％～20％的无细胞腹水、3％～15％的胎牛血清、1％的双抗，其余为哺乳动物细胞培养基。

8.一种如权利要求1、3或4所述的人卵巢癌细胞系或权利要求2所述的子代细胞在构建卵巢癌发生、发展或转移的细胞或动物模型中的应用。

9.一种如权利要求1、3或4所述的人卵巢癌细胞系或权利要求2所述的子代细胞在研发、筛选或评价用于治疗卵巢癌药物中的应用。

10.一种如权利要求1、3或4所述的人卵巢癌细胞系或权利要求2所述的子代细胞在研究肿瘤干细胞模型中的应用。

11.一种人卵巢癌细胞模型，其特征在于，包含如权利要求1、3或4所述的人卵巢癌细胞系或权利要求2所述的子代细胞。