JP2012516685A - 上皮幹細胞および該幹細胞を含むオルガノイドのための培養培地 - Google Patents
上皮幹細胞および該幹細胞を含むオルガノイドのための培養培地 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2012516685A JP2012516685A JP2011547839A JP2011547839A JP2012516685A JP 2012516685 A JP2012516685 A JP 2012516685A JP 2011547839 A JP2011547839 A JP 2011547839A JP 2011547839 A JP2011547839 A JP 2011547839A JP 2012516685 A JP2012516685 A JP 2012516685A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- wnt
- cell
- medium
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000002220 organoid Anatomy 0.000 title claims abstract description 291
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 179
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 title claims abstract description 61
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 396
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 claims abstract description 102
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 96
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 91
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 66
- 208000003200 Adenoma Diseases 0.000 claims abstract description 64
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 59
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 59
- 229940112869 bone morphogenetic protein Drugs 0.000 claims abstract description 59
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 57
- 206010001233 Adenoma benign Diseases 0.000 claims abstract description 55
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims abstract description 51
- FABQUVYDAXWUQP-UHFFFAOYSA-N N4-(1,3-benzodioxol-5-ylmethyl)-6-(3-methoxyphenyl)pyrimidine-2,4-diamine Chemical compound COC1=CC=CC(C=2N=C(N)N=C(NCC=3C=C4OCOC4=CC=3)C=2)=C1 FABQUVYDAXWUQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 50
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 46
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 28
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims abstract description 26
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims abstract description 25
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 123
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical group C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 claims description 98
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 claims description 93
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 claims description 93
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 claims description 89
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 claims description 89
- 108700007229 noggin Proteins 0.000 claims description 67
- 102000045246 noggin Human genes 0.000 claims description 67
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 claims description 49
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 claims description 49
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 claims description 49
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 claims description 48
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 42
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 claims description 39
- 102100028412 Fibroblast growth factor 10 Human genes 0.000 claims description 38
- 102000003972 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 claims description 38
- 101000917237 Homo sapiens Fibroblast growth factor 10 Proteins 0.000 claims description 38
- PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N L-N-acetyl-Cysteine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 32
- 229960004308 acetylcysteine Drugs 0.000 claims description 32
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 claims description 29
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 claims description 23
- 230000000112 colonic effect Effects 0.000 claims description 19
- 102100028071 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 claims description 16
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 16
- 101150021185 FGF gene Proteins 0.000 claims description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 12
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims description 12
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 10
- 101100373143 Drosophila melanogaster Wnt5 gene Proteins 0.000 claims description 9
- 102000052549 Wnt-3 Human genes 0.000 claims description 9
- 108700020985 Wnt-3 Proteins 0.000 claims description 9
- -1 R-spondin 1-4 Proteins 0.000 claims description 8
- 238000002723 toxicity assay Methods 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- 239000011435 rock Substances 0.000 claims description 6
- 102100025036 Norrin Human genes 0.000 claims description 5
- 102100023715 Poly(A)-specific ribonuclease PARN Human genes 0.000 claims description 5
- NGOGFTYYXHNFQH-UHFFFAOYSA-N fasudil Chemical compound C=1C=CC2=CN=CC=C2C=1S(=O)(=O)N1CCCNCC1 NGOGFTYYXHNFQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 101710085992 Norrin Proteins 0.000 claims description 4
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 claims description 4
- 229960002435 fasudil Drugs 0.000 claims description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 4
- 241000202252 Cerberus Species 0.000 claims description 3
- 102100038367 Gremlin-1 Human genes 0.000 claims description 3
- 101001032872 Homo sapiens Gremlin-1 Proteins 0.000 claims description 3
- 108010041788 rho-Associated Kinases Proteins 0.000 claims description 3
- 102000000568 rho-Associated Kinases Human genes 0.000 claims description 3
- 102100025745 Cerberus Human genes 0.000 claims description 2
- 101710010675 Cerberus Proteins 0.000 claims description 2
- 101000602237 Homo sapiens Neuroblastoma suppressor of tumorigenicity 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101001113490 Homo sapiens Poly(A)-specific ribonuclease PARN Proteins 0.000 claims description 2
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 claims 7
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 13
- 102100033237 Pro-epidermal growth factor Human genes 0.000 description 86
- 101150017554 LGR5 gene Proteins 0.000 description 67
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 65
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 55
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 43
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 42
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 41
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 41
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 37
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 35
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 35
- 102000044880 Wnt3A Human genes 0.000 description 33
- 108700013515 Wnt3A Proteins 0.000 description 33
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 33
- 210000000277 pancreatic duct Anatomy 0.000 description 32
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 30
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 30
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 29
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 28
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 28
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 102100022762 R-spondin-1 Human genes 0.000 description 25
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 24
- 101000825954 Homo sapiens R-spondin-1 Proteins 0.000 description 23
- 108010070047 Notch Receptors Proteins 0.000 description 21
- 102000005650 Notch Receptors Human genes 0.000 description 21
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 21
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 21
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 20
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 20
- 210000001156 gastric mucosa Anatomy 0.000 description 20
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 19
- NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N Tamoxifen Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=CC=C1 NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 18
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 18
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 18
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 18
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 description 16
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 description 16
- 101001060261 Homo sapiens Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 210000002175 goblet cell Anatomy 0.000 description 15
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 15
- 239000000463 material Substances 0.000 description 15
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 14
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 13
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 13
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 13
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 13
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 13
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 12
- 101150030271 AXIN1 gene Proteins 0.000 description 12
- 102000051172 Axin Human genes 0.000 description 12
- 108700012045 Axin Proteins 0.000 description 12
- 239000012574 advanced DMEM Substances 0.000 description 12
- 210000003158 enteroendocrine cell Anatomy 0.000 description 12
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 12
- 210000004923 pancreatic tissue Anatomy 0.000 description 12
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 12
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 11
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 11
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 11
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 10
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 10
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 10
- 229940077737 brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 description 10
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 10
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 10
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 10
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 10
- 102100034540 Adenomatous polyposis coli protein Human genes 0.000 description 9
- 230000004156 Wnt signaling pathway Effects 0.000 description 9
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 9
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 9
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 9
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 9
- 229960001603 tamoxifen Drugs 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 108010011459 Exenatide Proteins 0.000 description 8
- 102400000921 Gastrin Human genes 0.000 description 8
- 108010052343 Gastrins Proteins 0.000 description 8
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- JUFFVKRROAPVBI-PVOYSMBESA-N chembl1210015 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO[C@]3(O[C@@H](C[C@H](O)[C@H](O)CO)[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C3)C(O)=O)O2)O)[C@@H](CO)O1)NC(C)=O)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 JUFFVKRROAPVBI-PVOYSMBESA-N 0.000 description 8
- AOXOCDRNSPFDPE-UKEONUMOSA-N chembl413654 Chemical compound C([C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 AOXOCDRNSPFDPE-UKEONUMOSA-N 0.000 description 8
- 210000001842 enterocyte Anatomy 0.000 description 8
- 229960001519 exenatide Drugs 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 8
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 8
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 7
- 101001039199 Homo sapiens Low-density lipoprotein receptor-related protein 6 Proteins 0.000 description 7
- 102100040704 Low-density lipoprotein receptor-related protein 6 Human genes 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 210000003890 endocrine cell Anatomy 0.000 description 7
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 7
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 7
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 7
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 7
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 7
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 7
- 210000003134 paneth cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 7
- 210000001187 pylorus Anatomy 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010088406 Glucagon-Like Peptides Proteins 0.000 description 6
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 6
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 6
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 6
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 6
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 6
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 6
- 210000000603 stem cell niche Anatomy 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 210000002237 B-cell of pancreatic islet Anatomy 0.000 description 5
- 102000003952 Caspase 3 Human genes 0.000 description 5
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 5
- 102000010792 Chromogranin A Human genes 0.000 description 5
- 108010038447 Chromogranin A Proteins 0.000 description 5
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 5
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 5
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 5
- 102000009616 Mucin 5AC Human genes 0.000 description 5
- 108010034536 Mucin 5AC Proteins 0.000 description 5
- 102100038553 Neurogenin-3 Human genes 0.000 description 5
- 101710096141 Neurogenin-3 Proteins 0.000 description 5
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 5
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 5
- 210000004966 intestinal stem cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 5
- NLMDJJTUQPXZFG-UHFFFAOYSA-N 1,4,10,13-tetraoxa-7,16-diazacyclooctadecane Chemical compound C1COCCOCCNCCOCCOCCN1 NLMDJJTUQPXZFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DODQJNMQWMSYGS-QPLCGJKRSA-N 4-[(z)-1-[4-[2-(dimethylamino)ethoxy]phenyl]-1-phenylbut-1-en-2-yl]phenol Chemical compound C=1C=C(O)C=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=CC=C1 DODQJNMQWMSYGS-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 4
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 4
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 4
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 4
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 4
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 4
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 4
- 101710181403 Frizzled Proteins 0.000 description 4
- 102000009338 Gastric Mucins Human genes 0.000 description 4
- 108010009066 Gastric Mucins Proteins 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 4
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 4
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 4
- PQMWYJDJHJQZDE-UHFFFAOYSA-M Methantheline bromide Chemical compound [Br-].C1=CC=C2C(C(=O)OCC[N+](C)(CC)CC)C3=CC=CC=C3OC2=C1 PQMWYJDJHJQZDE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical class O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 4
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 4
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 4
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 4
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 4
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 4
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 4
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 4
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 4
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 4
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 210000000651 myofibroblast Anatomy 0.000 description 4
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 4
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- 108010059616 Activins Proteins 0.000 description 3
- 102000005606 Activins Human genes 0.000 description 3
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 108010040422 Bone Morphogenetic Protein Receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000001893 Bone Morphogenetic Protein Receptors Human genes 0.000 description 3
- QASFUMOKHFSJGL-LAFRSMQTSA-N Cyclopamine Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H](CC2=C3C)[C@@H]1[C@@H]2CC[C@@]13O[C@@H]2C[C@H](C)CN[C@H]2[C@H]1C QASFUMOKHFSJGL-LAFRSMQTSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 3
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 3
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 description 3
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 3
- 108090000031 Hedgehog Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000003693 Hedgehog Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108700003486 Jagged-1 Proteins 0.000 description 3
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 3
- 101150058357 Muc2 gene Proteins 0.000 description 3
- 238000001190 Q-PCR Methods 0.000 description 3
- 101710110302 R-spondin-1 Proteins 0.000 description 3
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 3
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 3
- 102400001320 Transforming growth factor alpha Human genes 0.000 description 3
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N [14c]-nicotinamide Chemical compound N[14C](=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 3
- 239000000488 activin Substances 0.000 description 3
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 3
- QASFUMOKHFSJGL-UHFFFAOYSA-N cyclopamine Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C(CC2=C3C)C1C2CCC13OC2CC(C)CNC2C1C QASFUMOKHFSJGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 3
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 3
- 210000003780 hair follicle Anatomy 0.000 description 3
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 3
- 210000000110 microvilli Anatomy 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 3
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 3
- 108010008217 nidogen Proteins 0.000 description 3
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 239000003590 rho kinase inhibitor Substances 0.000 description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 3
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 3
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 3
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 description 2
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150096411 AXIN2 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 102100035683 Axin-2 Human genes 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 108010042086 Collagen Type IV Proteins 0.000 description 2
- 102000004266 Collagen Type IV Human genes 0.000 description 2
- 206010048832 Colon adenoma Diseases 0.000 description 2
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 2
- 102100030074 Dickkopf-related protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010055334 EphB2 Receptor Proteins 0.000 description 2
- 102100031968 Ephrin type-B receptor 2 Human genes 0.000 description 2
- 241001481760 Erethizon dorsatum Species 0.000 description 2
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 2
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 2
- 102000016970 Follistatin Human genes 0.000 description 2
- 108010014612 Follistatin Proteins 0.000 description 2
- 102000005698 Frizzled receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010045438 Frizzled receptors Proteins 0.000 description 2
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002254 Glycogen Synthase Kinase 3 Human genes 0.000 description 2
- 108010014905 Glycogen Synthase Kinase 3 Proteins 0.000 description 2
- 101000864646 Homo sapiens Dickkopf-related protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 101001063456 Homo sapiens Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5 Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 102100031036 Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5 Human genes 0.000 description 2
- 108010093434 Lonomia obliqua prothrombin activator protease Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 101100519293 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) pdx-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100037369 Nidogen-1 Human genes 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 102100032702 Protein jagged-1 Human genes 0.000 description 2
- 108700037966 Protein jagged-1 Proteins 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 102100034201 Sclerostin Human genes 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 102000004874 Synaptophysin Human genes 0.000 description 2
- 108090001076 Synaptophysin Proteins 0.000 description 2
- 101150115851 Tff2 gene Proteins 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003815 abdominal wall Anatomy 0.000 description 2
- 230000025164 anoikis Effects 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 2
- 230000006727 cell loss Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 210000003756 cervix mucus Anatomy 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007621 cluster analysis Methods 0.000 description 2
- 230000001427 coherent effect Effects 0.000 description 2
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 108700041286 delta Proteins 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 2
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 2
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003405 ileum Anatomy 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 238000013388 immunohistochemistry analysis Methods 0.000 description 2
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 2
- 210000001630 jejunum Anatomy 0.000 description 2
- 101150002688 kremen1 gene Proteins 0.000 description 2
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 2
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 2
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 2
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000012342 propidium iodide staining Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 description 2
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 2
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 2
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 238000012745 whole-mount immunostaining Methods 0.000 description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N (4S)-4-[[(4R,7S,10S,16S,19S,25S,28S,31R)-31-[[(2S)-2-[[(1R,6R,9S,12S,18S,21S,24S,27S,30S,33S,36S,39S,42R,47R,53S,56S,59S,62S,65S,68S,71S,76S,79S,85S)-47-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-18-(4-aminobutyl)-27,68-bis(3-amino-3-oxopropyl)-36,71,76-tribenzyl-39-(3-carbamimidamidopropyl)-24-(2-carboxyethyl)-21,56-bis(carboxymethyl)-65,85-bis[(1R)-1-hydroxyethyl]-59-(hydroxymethyl)-62,79-bis(1H-imidazol-4-ylmethyl)-9-methyl-33-(2-methylpropyl)-8,11,17,20,23,26,29,32,35,38,41,48,54,57,60,63,66,69,72,74,77,80,83,86-tetracosaoxo-30-propan-2-yl-3,4,44,45-tetrathia-7,10,16,19,22,25,28,31,34,37,40,49,55,58,61,64,67,70,73,75,78,81,84,87-tetracosazatetracyclo[40.31.14.012,16.049,53]heptaoctacontane-6-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-7-(3-carbamimidamidopropyl)-25-(hydroxymethyl)-19-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-28-(1H-imidazol-4-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15,18,21,24,27,30-nonaoxo-16-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14,17,20,23,26,29-nonazacyclodotriacontane-4-carbonyl]amino]-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-3-carboxy-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(1S)-1-carboxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H]3NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H]4CCCN4C(=O)[C@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O)[C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc3ccccc3)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N3CCC[C@H]3C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](Cc2ccccc2)NC(=O)[C@H](Cc2c[nH]cn2)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc2c[nH]cn2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc2ccc(O)cc2)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 1,4-dithiothreitol Chemical compound SCC(O)C(O)CS VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVSKIKFHRZPJSS-UHFFFAOYSA-N 2,4-D Chemical compound OC(=O)COC1=CC=C(Cl)C=C1Cl OVSKIKFHRZPJSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BUOYTFVLNZIELF-UHFFFAOYSA-N 2-phenyl-1h-indole-4,6-dicarboximidamide Chemical compound N1C2=CC(C(=N)N)=CC(C(N)=N)=C2C=C1C1=CC=CC=C1 BUOYTFVLNZIELF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000029791 ADAM Human genes 0.000 description 1
- 108091022885 ADAM Proteins 0.000 description 1
- FHCSBLWRGCOVPT-UHFFFAOYSA-N AZD2858 Chemical compound C1CN(C)CCN1S(=O)(=O)C1=CC=C(C=2N=C(C(N)=NC=2)C(=O)NC=2C=NC=CC=2)C=C1 FHCSBLWRGCOVPT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710112282 Adenomatous polyposis coli protein Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108010043324 Amyloid Precursor Protein Secretases Proteins 0.000 description 1
- 102000002659 Amyloid Precursor Protein Secretases Human genes 0.000 description 1
- 102000029877 BMP binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091014778 BMP binding proteins Proteins 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101150049756 CCL6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100156752 Caenorhabditis elegans cwn-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100264044 Caenorhabditis elegans cwn-2 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102000005598 Chondroitin Sulfate Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108010059480 Chondroitin Sulfate Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 108010007718 Chromogranins Proteins 0.000 description 1
- 102000007345 Chromogranins Human genes 0.000 description 1
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 101100317380 Danio rerio wnt4a gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004237 Decorin Human genes 0.000 description 1
- 108090000738 Decorin Proteins 0.000 description 1
- 102000017944 Dishevelled Human genes 0.000 description 1
- 108050007016 Dishevelled Proteins 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 description 1
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 description 1
- 101100127166 Escherichia coli (strain K12) kefB gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 102000019203 Follistatin-Related Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010012820 Follistatin-Related Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000001003 Frizzled-4 Human genes 0.000 description 1
- 108050007986 Frizzled-4 Proteins 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- 108090001072 Gastricsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004862 Gastrin releasing peptide Human genes 0.000 description 1
- 108090001053 Gastrin releasing peptide Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 102000030595 Glucokinase Human genes 0.000 description 1
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 description 1
- 244000060234 Gmelina philippensis Species 0.000 description 1
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010867 Hoechst staining Methods 0.000 description 1
- 101001043594 Homo sapiens Low-density lipoprotein receptor-related protein 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000979761 Homo sapiens Norrin Proteins 0.000 description 1
- 101000621344 Homo sapiens Protein Wnt-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000855004 Homo sapiens Protein Wnt-7a Proteins 0.000 description 1
- 101000825949 Homo sapiens R-spondin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000825960 Homo sapiens R-spondin-3 Proteins 0.000 description 1
- 101000711796 Homo sapiens Sclerostin Proteins 0.000 description 1
- 101150003028 Hprt1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 101150081517 LGR4 gene Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100021926 Low-density lipoprotein receptor-related protein 5 Human genes 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007271 Mucin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108010008692 Mucin-6 Proteins 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 101000621352 Mus musculus Protein Wnt-2 Proteins 0.000 description 1
- 101100485095 Mus musculus Wnt10b gene Proteins 0.000 description 1
- 101100317378 Mus musculus Wnt3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 241001263478 Norovirus Species 0.000 description 1
- 102000007354 PAX6 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 101150081664 PAX6 gene Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000000407 Pancreatic Cyst Diseases 0.000 description 1
- 102000034255 Pepsinogen C Human genes 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 229940123882 Porcupine inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010050808 Procollagen Proteins 0.000 description 1
- 102100022805 Protein Wnt-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100020729 Protein Wnt-7a Human genes 0.000 description 1
- 102100032733 Protein jagged-2 Human genes 0.000 description 1
- 101710170213 Protein jagged-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 102000041829 R-spondin family Human genes 0.000 description 1
- 108091078718 R-spondin family Proteins 0.000 description 1
- 102100022763 R-spondin-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100022766 R-spondin-3 Human genes 0.000 description 1
- 102100022759 R-spondin-4 Human genes 0.000 description 1
- 101710110307 R-spondin-4 Proteins 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 108091005682 Receptor kinases Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 1
- 101000767160 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Intracellular protein transport protein USO1 Proteins 0.000 description 1
- 108050006698 Sclerostin Proteins 0.000 description 1
- 206010049416 Short-bowel syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102000006467 TATA-Box Binding Protein Human genes 0.000 description 1
- 108010044281 TATA-Box Binding Protein Proteins 0.000 description 1
- 108091084789 TCF/LEF family Proteins 0.000 description 1
- 102000043043 TCF/LEF family Human genes 0.000 description 1
- 102000007000 Tenascin Human genes 0.000 description 1
- 108010008125 Tenascin Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 1
- 101150010310 WNT-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150109862 WNT-5A gene Proteins 0.000 description 1
- 101150019524 WNT2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000052547 Wnt-1 Human genes 0.000 description 1
- 108700020987 Wnt-1 Proteins 0.000 description 1
- 108700020986 Wnt-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000052556 Wnt-2 Human genes 0.000 description 1
- 102000052548 Wnt-4 Human genes 0.000 description 1
- 108700020984 Wnt-4 Proteins 0.000 description 1
- 102000043366 Wnt-5a Human genes 0.000 description 1
- 108700020483 Wnt-5a Proteins 0.000 description 1
- 101000770767 Xenopus laevis Protein Wnt-2b-A Proteins 0.000 description 1
- 101100485097 Xenopus laevis wnt11b gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009858 acid secretion Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 210000001943 adrenal medulla Anatomy 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 150000005005 aminopyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 230000000202 analgesic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000001130 anti-lysozyme effect Effects 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- RMRJXGBAOAMLHD-IHFGGWKQSA-N buprenorphine Chemical compound C([C@]12[C@H]3OC=4C(O)=CC=C(C2=4)C[C@@H]2[C@]11CC[C@]3([C@H](C1)[C@](C)(O)C(C)(C)C)OC)CN2CC1CC1 RMRJXGBAOAMLHD-IHFGGWKQSA-N 0.000 description 1
- 229960001736 buprenorphine Drugs 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 210000002318 cardia Anatomy 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000003822 cell turnover Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010008846 chordin Proteins 0.000 description 1
- 102000006533 chordin Human genes 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 210000002777 columnar cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000001608 connective tissue cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001100 crypt cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 210000001047 desmosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004921 distal colon Anatomy 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 210000001705 ectoderm cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000006599 edta-medium Substances 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 238000010218 electron microscopic analysis Methods 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003256 environmental substance Substances 0.000 description 1
- 210000005081 epithelial layer Anatomy 0.000 description 1
- 230000008508 epithelial proliferation Effects 0.000 description 1
- PJMPHNIQZUBGLI-UHFFFAOYSA-N fentanyl Chemical compound C=1C=CC=CC=1N(C(=O)CC)C(CC1)CCN1CCC1=CC=CC=C1 PJMPHNIQZUBGLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002428 fentanyl Drugs 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- IRYFCWPNDIUQOW-UHFFFAOYSA-N fluanisone Chemical compound COC1=CC=CC=C1N1CCN(CCCC(=O)C=2C=CC(F)=CC=2)CC1 IRYFCWPNDIUQOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 238000011223 gene expression profiling Methods 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 238000007417 hierarchical cluster analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 102000057239 human FGF7 Human genes 0.000 description 1
- 102000050526 human RSPO1 Human genes 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 229940125425 inverse agonist Drugs 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 1
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- DDLIGBOFAVUZHB-UHFFFAOYSA-N midazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NC=C2CN=C1C1=CC=CC=C1F DDLIGBOFAVUZHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003793 midazolam Drugs 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 239000002121 nanofiber Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000009707 neogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001272 neurogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 210000004492 nuclear pore Anatomy 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000015031 pancreas development Effects 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 230000000803 paradoxical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 238000003068 pathway analysis Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 229920001992 poloxamer 407 Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920002338 polyhydroxyethylmethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000011536 re-plating Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 108091008597 receptor serine/threonine kinases Proteins 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 210000002955 secretory cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012090 serum-supplement Substances 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 108091005475 signaling receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000035025 signaling receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- IHQKEDIOMGYHEB-UHFFFAOYSA-M sodium dimethylarsinate Chemical compound [Na+].C[As](C)([O-])=O IHQKEDIOMGYHEB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000002325 somatostatin-secreting cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000004876 tela submucosa Anatomy 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 108090000195 villin Proteins 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
- 210000002417 xiphoid bone Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0676—Pancreatic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0607—Non-embryonic pluripotent stem cells, e.g. MASC
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0676—Pancreatic cells
- C12N5/0677—Three-dimensional culture, tissue culture or organ culture; Encapsulated cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0679—Cells of the gastro-intestinal tract
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/117—Keratinocyte growth factors (KGF-1, i.e. FGF-7; KGF-2, i.e. FGF-12)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/40—Regulators of development
- C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Hematology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Description
を有するDSLペプチドである(Dontu et al.,2004、Breast Cancer Res 6:R605-R615)。このDSLペプチド(ANA spec)は、好ましくは10μM〜100nMまたは少なくとも10μMおよび100nM以下の濃度で使用される。特に培養の第一週中にNotchアゴニストを添加すると、培養効率が2〜3倍上昇する。このNotchアゴニストは、好ましくは、この幹細胞の培養の最初の7日間、2日ごとに培養培地に添加される。
a.EGF(E;0〜50ng/ml)およびR-スポンジン1(R:0〜500ng/ml)とともに500個の陰窩を三つ組みで播種し、播種から7日後に陰窩オルガノイドを計数した。b:指示された量のノギンと一緒にEGF(50ng/ml)およびR-スポンジン1(500ng/ml)とともに、500個の陰窩/陰窩オルガノイドを培養し、その後3回の継代を行った。各継代時に陰窩オルガノイドを計数した。この実験を3回繰り返した(結果は同等のものであった)。
(図2)腸陰窩培養系の確立。
a:オルガノイドへと成長する単離単一陰窩の経時変化。微分干渉画像から、陰窩底部において顆粒含有パネート細胞が明らかである(矢印)。b、c:単一単離陰窩は、陰窩オルガノイドを効率的に形成する。陰窩分裂の繰り返しを通じて、この構造から、第14日に多くのタコ足様陰窩オルガノイドが形成される。d:培養3週間後の単一オルガノイドの3D再構成共焦点像。Lgr5-GFP+幹細胞(薄灰色)は陰窩様ドメインの先端に局在する。DNAに対する対比染色:ToPro-3(濃灰色)。e:陰窩オルガノイドの概略図。オルガノイドは、絨毛様上皮により内面が覆われている中心内腔および多数の周囲の陰窩様ドメインからなる。陰窩ドメインの先端部の濃灰色細胞はLgr5+幹細胞の位置を指し、これは各陰窩ドメインに存在する。スケールバーは50μmを示す。
(図3)遺伝子発現プロファイリングのクラスター分析。
新たに単離した結腸および小腸陰窩ならびに小腸オルガノイドを用いた発現レベルのクラスター分析から、小腸オルガノイドとそれらが由来する組織である小腸陰窩との間で類似性が高いことが示された。結腸陰窩は個々の枝上に密集しており、このことから、この密接に関連する組織で遺伝子発現パターンが異なることが示される。注目すべきは、発現される全遺伝子の1.2%のみが、小腸陰窩と比較してオルガノイドに顕著に集積しており、一方、逆に小腸陰窩では2%が集積していた。これらの差別的遺伝子におけるIngenuity Pathway分析から、新たに単離した陰窩においてリンパ球痕跡が特異的に存在することが明らかになり、一方で、オルガノイドにおいて濃縮されている少数の遺伝子においては重要な経路を同定することができなかった(図示せず)。本発明者らは、後者のグループが生物学的ノイズに相当し、一方でリンパ球の痕跡は混入した上皮内免疫細胞由来であり、培養時に失われると結論付ける。
(図4)陰窩オルガノイドは基本的な陰窩-絨毛の特徴を保持する。
a〜e.Wnt活性化コードは陰窩ドメイン中で保持される。a:核β-カテニン(濃灰色、矢印)は陰窩ドメインでのみ見られた。図5での高解像度画像。星印、マトリゲル;Lu、内腔。b:CBC細胞およびTA細胞において、傾斜的にEphB2(薄灰色)が発現される。白矢印で示されるようなLgr5-GFP+幹細胞に注意。c:腸細胞により内面が覆われている中心内腔に流れ込むカスパーゼ-3+アポトーシス細胞(濃灰色、矢印)。d:>3ヶ月経過した陰窩培養物からの細胞の拡散における40本の染色体。e〜g:インビトロでのLgr5+幹細胞の細胞系譜解析。e:Lgr5-EGFP-ires-CreERT2/Rosa26-lacZレポーターマウスからの陰窩をインビトロで12時間、タモキシフェンにより刺激し、指示された日数にわたり培養した。LacZ染色(濃灰色)から、インビトロで、拡散した単一LacZ+細胞(第1日)からLacZ+陰窩全体が形成された(第2〜14日)ことが分かる。差し込み図は染色した陰窩オルガノイドのより高倍率の画像を示す。f:組織学的分析から、LacZ+陰窩-ドメイン全体(濃灰色/黒)が絨毛ドメインに流れ込むことが分かる。g:LacZ+細胞がある陰窩オルガノイドの割合は時間が経過しても安定であり続け、このことから、Lgr5+細胞が長期間継続する幹細胞活性を保持することが示される。500個の陰窩を三つ組みで播種し、LacZ+陰窩オルガノイドを計数した。エラーバーは3回の実験の標準偏差である。この実験を3回繰り返し、結果は同等であった。
(図5)図4a、図11mおよび11pのより高解像度の画像。
(図6)陰窩オルガノイドにおいて上皮下繊維芽細胞の証拠はない。
a:平滑筋アクチンに対する免疫染色(SMA;濃灰色、例は黒矢印で示される)から、上皮層の下に上皮下繊維芽細胞が存在することが明らかである。b:マトリゲル(星印)中にSMA+細胞がないことから、培養系において上皮下繊維芽細胞が存在しないことが示される。スケールバー;50μm。
(図7)a〜c:Lgr5-EGFP-ires-CreERT2/Rosa26-YFPレポーターマウスからの陰窩をインビトロでタモキシフェンにより12時間刺激し、指示された日数、画像化した。Lgr5+細胞は薄灰色であり、白色矢印により示される。d:Lgr5-EGFP-ires-CreERT2/Rosa26-YFP陰窩由来の7日間経過オルガノイドをインビトロでタモキシフェンにより12時間刺激し、指示された日数にわたり培養し、画像化した。YFP蛍光(薄灰色)から、拡散した単一YFP+細胞(第1日)から、次の5日間にわたり、インビトロで複数の子孫が生じたことが示される。第1日〜第1.5日の間、絨毛ドメインが破裂し、続いて新しい絨毛ドメインが形成される(白丸)。YFP+細胞が絨毛ドメインに向かって移動していることに注意。
(図8)選別した単一Lgr5+幹細胞から、陰窩-絨毛構造全体が生じる。a:野生型同腹子(上)と比較した、Lgr5-EGFP-ires-CreERT2腸(下)から調製されるLgr5-GFP+細胞。GFP+細胞を2つの集団、GFPhiおよびGFPlowに分けた。b:新たに単離した陰窩の共焦点顕微鏡分析から、CBC細胞中のGFPhi(黒矢印)およびCBC上のGFPlow(白矢印)が示される。c:選別したGFPhi細胞。d:培養14日後の1000個の選別GFPhi細胞(左)およびGFPlow細胞(右)。e〜f:選別から14日後、単一GFPhi細胞から、Lgr5-GFP+細胞(薄灰色の細胞)およびパネート細胞(白矢印)が陰窩底部に局在する、陰窩オルガノイドが形成される。スケールバー;50μm。f:eにおける陰窩底部のより高倍率の画像。g:増殖している細胞を可視化するために、チミジン類似体EdU(薄灰色、白矢印により例が示される)とともに1時間、オルガノイドを培養し、その後これらを固定した。陰窩ドメインのみがEdUを取り込んだことに注意。対比染色:DAPI(濃灰色)。
(図9)a:個別のウェル中で選別された単一細胞のコロニー形成効率。4回の個々の実験(各実験において100個の細胞を目視で確認し、次いで増殖について追跡)に対して平均を算出する。b:良好に増殖する単一GFhi細胞の例。c:5個の成長オルガノイドに対して、1個のオルガノイドあたりの細胞数の平均を算出した。d:単一細胞由来オルガノイドからの単一細胞縣濁液を再播種し、2週間増殖させた。
(図10)個別のウェルにおいて選別された単一細胞のコロニー形成能。良好に増殖した単一GFPhi細胞の例。矢印は、目印としての塵埃粒子を指す。スケールバー:50μm。
(図11)単一幹細胞由来オルガノイドの組成。a〜d:a:薄灰色の絨毛(腸細胞で内部が覆われている中心内腔の先端)、b:白矢印により示されるMuc2染色(杯細胞)、c.薄灰色のリゾチーム(パネート細胞)、d:薄灰色のクロモグラニンA(腸内分泌細胞)に対する三次元再構成された共焦点像。核をDAPIで対比染色した。e〜g:パラフィン切片染色。e:アルカリホスファターゼは黒色(腸細胞で内部が覆われている中心内腔の先端)、f:濃灰色のPAS(杯細胞)、g:濃灰色のリゾチーム(パネート細胞)、h:濃灰色のシナプトフィジン(腸内分泌細胞)。i〜p:陰窩オルガノイドの電子顕微鏡切片から、腸細胞が存在することが明らかになる。(i)、杯細胞(j)、パネート細胞(k)および腸内分泌細胞(l)。m/o:低出力陰窩画像は間質細胞がないことを示す。n〜o:mのより高倍率の画像。n:微絨毛の長さの違いにより示されるような、オルガノイドの内腔区画への刷子縁の成熟(黒矢印)。p:絨毛ドメインの低出力画像。Lu、アポトーシス体で満たされ、極性のある腸細胞により内面が覆われている陰窩オルガノイドの内腔。G、杯細胞;EC、腸内分泌細胞;P、パネート細胞;星印、マトリゲル。スケールバー:5μm(m、p)、1μm(n、o)。
(図12)インビボの陰窩とインビトロの培養陰窩との間の電子顕微鏡画像の比較。a、b:下に結合組織(矢印)がある陰窩の底部における正常な腸。比較については、陰窩の底部でも採取したオルガノイドのc-gを参照のこと。d:頂端膜からの高倍率画像;2個の隣接細胞の膜の間に細胞間裂溝がある(矢印)。デスモソーム(矢じり)に続いて細胞間裂溝があることに注意。e:基底部位からの高倍率(2個の隣接細胞の膜に続いて細胞内裂溝があり得る)。これらの画像は、正常マウスの腸からのaおよびbと同等である。これらの細胞間裂溝の原因は、アルデヒド固定中の浸透圧衝撃であり得る。f,g:オルガノイドを構成する全細胞は健康な状態であり、大きな空胞またはストレスのその他の兆候はない。有糸分裂像(c)および各細胞において多くの核孔(f、矢印)および無傷のミトコンドリアを認め得る。膨張の所見なく、ERおよびゴルジ(g)を見ることができる。核崩壊、核融解または核凝縮の兆候はない。従って、細胞溶解またはアポトーシスの兆候は観察されない。オルガノイドの内腔の細胞は、正常マウスの消化管で観察することができるように、予想されるアポトーシスの特性を示す。fは腸内分泌細胞の別の例を示す。Mi:有糸分裂細胞、Lu:内腔、EC:腸内分泌細胞、G:ゴルジ。
(図13)培養において結腸由来の陰窩を維持することもできる。結腸由来の単一単離陰窩は、小腸陰窩に対して使用したものと同じ培養条件を用いて、効率的に陰窩オルガノイドを形成する。陰窩分裂の繰り返しを通じて、第14日にこの構造から多くのタコ足様陰窩オルガノイドが生じる。
(図14)BDNFの添加により培養効率が向上する。EGF、ノギン、R-スポンジンおよびBDNF存在下で単一単離結腸陰窩を培養した。培養開始後第0、4および14日に取得した結腸陰窩オルガノイドの画像。
(図15)Wnt3aを添加することによって、結腸陰窩オルガノイドの培養効率がさらに向上する。EGF、ノギン、R-スポンジン存在下で単一単離結腸陰窩を培養した。Wnt3a馴化培地(+Wnt3a)を使用すると、対照培地(-Wnt3a)中で結腸オルガノイドを培養した場合と比較して、最大30%、培養効率が向上した。
(図16)APC-/-マウスから単離された腺腫はインビトロで成長し得る。APC-/-マウス由来の単一単離腺腫を分離し、R-スポンジンが培養培地中に含まれなかったことを除き上記と同様の条件を用いて培養した。a:第4日にここで示されるように腺腫オルガノイドは通常、アポトーシス細胞を含有する1つの中心内腔を含有する単純な嚢胞として成長する。b:ある1つの腺腫オルガノイドのより高倍率の画像。c:ある1つの腺腫オルガノイドをβ-カテニン(濃灰色)およびヘマトキシリン(内腔中の薄灰色)で染色した。オルガノイドの外層は、核β-カテニン染色がある上皮細胞からなる。内側の内腔は、ヘマトキシリンを取り込んでいる死細胞を含有する(濃灰色に染色)。d:明白な核β-カテニンを示す、上皮細胞の外層のより高倍率の画像。
(図17)Wnt3aを添加すると、オルガノイド形成の効率が向上する。a:Lgr5-GFPhi細胞を選別し、従来の単一細胞培養条件(単一細胞に対して上記で記載のような、EGF、ノギン、R-スポンジン、NotchリガンドおよびY-27632)に加えてWnt3a(100ng/ml)の存在下または非存在下で培養した。Wnt3aの存在下または非存在下でオルガノイドを培養したこれらの培養皿の画像は代表例である。b:細胞100個/ウェルを播種し、オルガノイド数は播種から14日後であった。オルガノイド数/皿をこのグラフで表す。
(図18)R-スポンジン1機能に対するモデル
Wnt/β-カテニンシグナル伝達は、Frizzledに対する標準的なWntリガンドの結合およびLRP5/6受容体との会合時に開始される。R-スポンジン1非存在下で、Wntシグナル伝達は、細胞表面上のLRP6の量により制限され、この量はDKK1/Kremen1介在性の内部移行によって低く維持される。R-スポンジン1は、DKK1/Kremen1介在性のLRP6ターンオーバーに拮抗し、その結果、LRP6の細胞表面レベルが向上することによってWntシグナル伝達を促進する。この図はPNAS 104:14700、2007から採用した。
(図19)パネート細胞は、小腸においてLgr5+幹細胞に隣接して位置する。Lgr5-EGFP-ires-CreERT2ノックインマウスの小腸から陰窩を単離した。ここで代表的陰窩の例を示す。GFP+細胞はLgr5+(薄灰色、黒矢印で示す)であり、これらは、通常、パネート細胞(*で示す)に隣接して位置する。
(図20)生存パネート細胞非存在下で、オルガノイド形成効率が低下する。PBS+0.1%Pluronic 127(Sigma)中で1μM Newport Green-DCF(Molecular probe)とともに室温で3分間、単離陰窩を恒温放置し、続いてPBS洗浄を行った。この後、陰窩をマトリゲル中に包埋し、上記のような標準的条件を用いて培養した。
(図21)胃オルガノイド培養の効率。(a)Lgr5-GFPマウスの胃幽門部由来の単離胃腺のGFP(矢印、GFP陽性細胞を示す)およびDIC画像。DAPIで核を染色する。倍率63x。(b)胃腺100個/ウェルをEGF(E)、R-スポンジン1(R)、ノギン(N)、EGF+R-スポンジン1(ER)、EGF+ノギン(EN)、EGF+R-スポンジン1+ノギン(ERN)、EGF+R-スポンジン1+ノギン+Wnt3A(ERNW)またはEGF+R-スポンジン1+ノギン+Wnt3A+KGF(ERNWK)とともに2つ組みで播種した。2、5および7日後に胃オルガノイド数を数えた。結果は、2回の独立した実験の平均±SEMとして示す。(b)Wnt3A組み換えタンパク質(ENRWK)またはaで述べたその他の増殖因子を補充したWnt3A馴化培地(ENRWCMK)とともに、胃腺100個/ウェルを2つ組みで播種した。播種から7日後および最初の継代から2日後に出芽オルガノイド数を数えた。
(図22)インビトロでの胃オルガノイドの形成。(a)オルガノイドへと成長する単離胃腺。播種後第1、2、5および7日の微分干渉画像。倍率10x(第1、2、5日)。第7日倍率4x、挿入図10x。(b)培養物は、機械的に分離して4〜7日ごとに継代した。少なくとも1ヶ月間にわたり培養物を増殖させた。様々な継代時の、オルガノイドから生じた出芽構造を示す代表的画像。継代1(P1)、それぞれ第8、11、20日に相当する継代2(P2)および継代4(P4)。
(図23)胃腺のマーカー。(a)Lgr5-LacZマウスからの胃培養物。播種後第5日に出芽した胃においてLacZ発現が検出され(矢印参照、LacZ陽性(濃灰色)細胞を示す)、このことから、Lgr5陽性細胞の存在が示される。倍率20x。(b)Ki67染色(黒)は、腺様構造の底部の陽性増殖細胞を示す。(c)オルガノイドの内腔の内側に存在するカスパーゼ-3(濃灰色)アポトーシス細胞。(d)胃オルガノイドに存在する胃ムチン5AC(濃灰色)陽性細胞。Lu、オルガノイド内腔。倍率20x。
(図24)膵管はインビトロで膵臓様オルガノイドを形成し得る。EGF、ノギン、R-スポンジン-1およびKGF存在下で、新たに単離した膵管を培養した。播種後第0、4および14日からの微分干渉画像。
(図25)インビトロ培養のおよそ3週間後に膵島様構造が出現する。播種後第21日からの微分干渉画像。
(図26)アキシン-LacZマウスにビヒクルを単独で(A)またはR-スポンジン(B)を注射した。2日後、膵臓を単離し、X-galでの染色によってLacZ発現の有無を調べた。Bの中央のパネルは、LacZに対して陽性染色を示す管のより高倍率の像を示し、これにより、膵管の裏打ちに沿ったアキシン-LacZの発現が示される。左パネルは、中心腺房における小さい導管細胞または挿入される導管細胞がアキシン2-LacZを発現したことを示す(例を黒矢印で示す)。倍率は各画像の角に示す。野生型マウスにおいて膵管結紮を行った。PDL後の様々な時点で膵臓を摘出し、PDLおよび非PDL領域から得た組織切片をH&Eで染色した。倍率は各時間点に対して示す(C)。wtおよびアキシン2-LacZマウスにおいて膵管結紮を行った。PDLから7日後に、この膵臓を摘出し、固定組織切片(D)またはホールマウントの器官切片(E)のX-galでの染色によってアキシン2-LacZ発現を調べた。白丸は膵臓の結紮部分を示す。PDLから5日後の膵臓組織切片におけるKi67の発現(例を矢印により示す)。倍率を示す(F)。インビボでのR-スポンジンによる処置から2日後の膵臓組織でのBrdUの取り込み(例を矢印により示す)。倍率を示す(G)。PDLまたは偽手術を行ったマウスから得た膵臓組織においてQ-PCRによって、Lgr5 mRNA発現を調べた。PDL膵臓において、PDL領域および非PDL領域をQ-PCRに供した。TATAボックス結合タンパク質(tbp)、ハウスキーピング遺伝子と比較した、Lgr5発現の上昇(倍)を示す(H)。PDLから13日後に膵臓を摘出し、固定組織切片のX-galでの染色によってLgr5-LacZ発現を調べた。染色細胞の例は黒矢印(I)で示される。
(図27)野生型マウスからの摘出後、様々な時点で取得したEM中にてインビトロで増殖させた膵管断片の画像(A、上段パネル)。腺房中心細胞は7日を超えて増殖せず、その後崩壊した(A、下段パネル)。EGF(50ng/ml)、R-スポンジン(1μg/ml)、FGF10(100ng/ml)またはノギン(100ng/ml)の存在下または非存在下で膵臓断片を成長させた。新たに単離した膵臓断片とともに培養を開始してから7日および14日後に、培養物の画像を取得した。EGF非存在下で培養物は10日を超えて生存することはなかった(B)。R-スポンジン(1μg/ml)の非存在下または存在下で、3日間、アキシン2-LacZマウスから単離した膵臓断片を培養した。X-gal染色から、R-スポンジンの存在下でのみ、3日および14日後、管細胞におけるWnt-応答性アキシン-LacZの発現が示された(例を白矢印で示す)。腺房または膵島細胞でX-gal染色は検出されなかった(C)。Lgr5-LacZマウスから管断片を単離し、R-スポンジン非存在下または存在下で3日間にわたり培養した。X-gal染色により示されるとおりのLgr5-LacZの発現から、PDL後のその発現と同様に、出芽部の先端でLgr5+細胞が示される(D)。WntアゴニストであるR-スポンジンの存在下で培養した膵臓断片由来の細胞のFACS染色。EpCAM、汎上皮細胞マーカーおよびLacZ(フルオレセイン-ジ-ガラクトピラノシド、FDG)に対して細胞を染色した。Wntシグナルの存在下で膵臓断片を培養するとLgr5+細胞の割合が顕著に増加する(E)。
(図28)PDL処置から7日後、マウスから膵臓を単離し、膵臓細胞をEpCAM-APCおよびLacZに対する蛍光基質(FluoroReporterキット)で染色し、選別し、50%Wnt3A馴化培地および10mM Y-27632を含むEM中で4日間培養した。4日後、培養培地をWntおよびY-27632不含のEM培地に交換した。指定した日に画像を取得し、4Ox倍率を示す。
(図29)膵臓オルガノイドをEMからDMに移した。FGF10の増幅用培地からの除去(その結果、DMとなる)の影響により、膵島への分化が誘導された。DM中で10日間にわたり膵臓オルガノイドを培養し、その後、インビトロで膵島様構造を検出することができた。FGF10の存在下および非存在下での培養物の画像を示すが(A)、これは、PCRにより測定した場合の、ある一定の分化マーカー、Ngn3およびソマトスタチンの発現上昇を示す。Hprtはハウスキーピング遺伝子である(B)。DMへ移した後のいくつかの時点で、PCRにより多くのマーカーの発現を評価した(C)。膵臓嚢胞からβ細胞様構造への形態変化(D)は、免疫蛍光により検出されるように、インスリンおよびC-ペプチドなどのある一定のβ細胞マーカーの出現に付随して起こった(E)。Ngn3に対する陽性免疫蛍光染色により示されるように、DM中にR-スポンジンが存在することは、β細胞の前駆細胞の再生に不可欠である(例を白矢印により示す)(F)。
(図30)ヒト膵臓断片を新たに単離し、EM中で培養した。培養開始後の指定された時点で培養物の画像を取得した。
(図31)インビトロで陰窩培養物はWntリガンドを産生する。
(A)Wnt経路の概略図。Wntリガンドが分泌される場合、これらは、自己分泌または傍分泌であり、Wntシグナル伝達経路を活性化し得る。ポーキュパインは、適正なWntリガンド分泌のために重要である。IWP阻害剤により、Wntリガンド分泌が阻害される。
(B)実施例1で示すような通常の条件下で培養したマウスオルガノイド。
(C)1μM IWPとのマウスオルガノイド培養物の恒温放置の結果、オルガノイド培養物の細胞死が起こる。
(D)Wnt3a馴化培地を添加すると、マウスオルガノイドの培養が促進される。
(E)IWP誘導性のオルガノイドの死は、Wnt3a馴化培地の添加により救出される。
10xの倍率を示す(B〜E)。
(図32)ヒト腸陰窩培養の確立。
Wnt3a馴化培地あり(A、B、E、F)およびなし(C、D、G、H)で、EGF、ノギンおよびRスポンジンが補充された培地中での3日後(A、C、E、G)および5日後(B、D、F、H)の、小腸(A〜D)および結腸(E〜H)から培養されたヒトオルガノイド。
(図33)胃オルガノイド培養の確立。
(A)EGF(E);R-スポンジン1(R);ノギン(N);EGF+R-スポンジン1(ER);EGF+ノギン(EN);EGF+R-スポンジン1+ノギン(ERN);EGF+R-スポンジン1+ノギン+Wnt3A(ERNW);EGF+R-スポンジン1+ノギン+Wnt3A+FGF10(ERNWF);EGF+R-スポンジン1+ノギン+対照馴化培地+FGF10(ERNCCMF)またはEGF+R-スポンジン1+ノギン+Wnt3A馴化培地+FGF10(ERNWCMF)とともに、全部で胃腺100個/ウェルを2つ組で播種した。2、5および7日後、胃オルガノイド数を数えた。結果は、2回の独立した実験の平均±SEMとして示す。
(B)Wnt3A馴化培地(ENRWCM)またはFGF10を補充したWnt3A馴化培地(ENRWCMF)とともに、全部で胃腺100個/ウェルを2つ組で播種した。培養7、15(継代2)および60日(継代10)後、出芽オルガノイド数を数えた。
(C)FGF7/KGF(K)またはFGF10(F)の何れか(100および1000ng/mlの両方を試験した)を補充したWnt3A馴化培地(WCM)+EGF+ノギンおよびR-スポンジン中で、全部で胃腺100個/ウェルを播種した。培養4日後(継代7)に、出芽オルガノイド数を数えた。代表的実験を示した。
(D)単離胃腺のオルガノイドへの発生。播種後第1、2、3、4、7日からの微分干渉画像。1週間後、培養物を1:5または1:6に分割する必要があった。補足資料および方法セクションに記載のように継代培養および維持を行った。培養中15日、3ヶ月、4.5および6ヶ月後の培養物の代表的画像(10x倍率)。
(E)対照馴化培地中で増殖させた5日経過培養物の例。培養物は増殖しておらず、腺ドメインを形成できなかったことに注意。これらの条件下で、培養物は7日を超えて生存しなかった。
(F)3ヶ月経過した胃オルガノイドにおけるホールマウントE-カドヘリン染色。
(図34)単一Lgr5+ve細胞からインビトロで長命の胃オルガノイドが形成される。
(A)Lgr5-EGFP-ires-CreERT2マウスの胃から新たに単離した幽門部胃ユニットの共焦点分析。矢印はGFPhi(灰色)、GFPlo(黒)およびGFP-ve(白)の別個の集団を示す。
(B)Lgr5-EGFP+ve細胞はそれらのGFP発現レベルに従い、GFPloおよびGFP-ve集団から区別される。FSC、前方散乱。
(C)単一Lgr5+ve細胞が起源である成長オルガノイドの代表例。矢印は第7日腺様ドメイン出芽部の形成を示す。最初の倍率:第1〜4日;4Ox倍率、第5〜6日;2Ox倍率、第7〜8日;10x倍率および第9日;5x倍率。
(D)単一Lgr5+ve細胞由来のオルガノイドを分離し、5〜7日ごとに分割した。3ヶ月経過培養物の代表的画像。本来の倍率:左パネル;4x倍率、右パネル;10x倍率。
(E)単一GFPhi細胞から増殖した14日経過胃培養物におけるLgr5EGFP発現細胞の共焦点分析。Lgr5-GFP+ve細胞が腺ドメインの底部に位置することに注意(白矢印;10x倍率)。
(F)チミジン類似体EdU(赤)とともに1.5時間培養したオルガノイド。腺ドメインのみがEdUを取り込む(白矢印;20x倍率)。対比染色、4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI;核)。
(G)Lgr5-EGFP-ires-CreERT2/Rosa26-YFPレポーターマウスの単一細胞培養物から2週間培養した培養物をインビトロでタモキシフェンにより20時間刺激し、指定の日に画像化した。YFP蛍光(黄色)は、拡散した単一の黄色の細胞(第1.5日)から、インビトロで複数の子孫が生じていることを示す。YFP+ve細胞が中心内腔(白色点線丸)に向かって移動することに注意。
(H)Lgr5+ve単一細胞由来の2ヶ月経過培養物からの胃特異的な遺伝子の発現分析。高(左パネル)または低(中央パネル)Wnt3A培地で維持される培養物。胃由来培養物が腸特異的な遺伝子について陰性であることに注意(右パネル)。
(I)少なくとも10日間にわたり低Wnt3A培地中で維持される培養物。上部パネル:ECad染色の共焦点像(赤、上皮由来オルガノイド)。対比染色、Hoescht 33345(青)。下パネル:Tff2(茶色、頚部粘液細胞)、過ヨウ素酸シッフ(赤、ピット細胞)、MUC5AC(茶色、ピット細胞)およびクロモグラニンA(茶色、腸内分泌細胞)に対して染色されたパラフィン切片。
材料および方法
マウス:6〜12週齢の非近交系マウスを使用した。Lgr5-EGFP-Ires-CreERT2対立遺伝子1の作製および遺伝子型解析は既に記載されている1。Rosa26-lacZまたはYFP CreレポーターマウスはJackson Labsから得た。
材料および方法
Wnt3a馴化培地
Wnt3aリガンド発現細胞株およびWnt3aリガンドのない同じ細胞株(対照培地)を3〜4週間培養する。これらの細胞は、密集状態となり増殖を停止するとすぐにWnt3aを産生するようになる。この培地を回収し、TCF応答配列-lucコンストラクト(TOP)および同じであるがTCF応答配列中に突然変異があるコンストラクト(FOP)を用いて、TOPフラッシュアッセイ、ルシフェラーゼアッセイで試験する。TOP/FOP間の比は、培養で使用しようとする培地に対して20を超えるはずである。組織を再生するための培養で使用する場合は、この培地を25〜50%希釈する。
小腸オルガノイドと比較して、結腸オルガノイドの増殖はより遅く、効率が低い。小腸と同じ増殖因子条件を用いて、増殖し、胃オルガノイド構造を形成したのは、遠位結腸から単離した結腸陰窩の5%未満であった(図13)。結腸の近位部からの結腸陰窩を増殖させるのは困難であった。本発明者らは、マイクロアレイ分析(結腸Lgr5-GFPhi細胞対結腸Lgr5-GFPlow細胞)において、BDNF(脳由来神経栄養因子)の受容体であるtrkBの上方制御を見出したので、本発明者らは、結腸オルガノイドに対するBDNFの影響を調べた。本発明者らは、常に、BDNF+培養において、BDNF-培養よりも2倍前後高い培養効率を認めた。一般には、1個の結腸オルガノイドは、およそ10個の陰窩ドメインを含有する(図14)。それらの起源と一致して、パネート細胞は検出できなかった。小腸オルガノイドと対照的に、結腸陰窩では陰窩底部にWnt-3a産生パネート細胞がなく、従ってWnt-3を補充することによって結腸陰窩の培養効率が上昇するが、小腸陰窩の培養効率は上昇しない。一般には、本発明者らがWnt-3a馴化培地を添加した場合、本発明者らは、最大で30%の培養効率を得た(図15)。
材料および方法(実施例1参照)
結果
腺腫は歴史的にインビトロで培養することが困難であった。小腸ならびに結腸由来の健康な陰窩を首尾よく培養するために上述の条件を使用したので、同様の条件がインビトロで腺腫を持続させ得るか否かを判断した。2.5mM EDTAを用いてAPC-/-マウスから腺腫を単離した後、上述と同様の条件下で単一腺腫を培養した。重要なこととして、これらの条件はインビトロで腺腫の増殖を維持するために適切であったが、しかし、R-スポンジンは不必要となった。これは、これらの細胞にAPCがなく、その結果、自動的に核β-カテニンが得られるので、Wntシグナル伝達経路を誘導する必要がもはやないという事実によって容易に説明できる。これにより、インビトロでの腺腫の培養においてR-スポンジン、Wntアゴニストが不必要となる。図16aおよび図16bの高倍率像は、正常な陰窩オルガノイド(中心内腔のある陰窩出芽部分を見ることができる)と比較して、腺腫オルガノイドが単純に嚢胞として成長することを示す。内腔内部に大量の死細胞が存在することから結論付けられ得るように、死細胞は内腔に流れ出す。正常な陰窩オルガノイドにおいて、核β-カテニンは陰窩ドメインの底部でのみ見られる(図4a参照)。腺腫オルガノイドにおいて(図16cおよび図16dの高倍率像)、遺伝子のAPC突然変異と一致して、全ての上皮細胞で核β-カテニンが見られた。これらのオルガノイドを永続的に継代することができる。
その他のWntアゴニストがR-スポンジン用量と同じ効果を有するか、即ちインビトロで陰窩-絨毛オルガノイドの形成を促進するか否かを調べるために、可溶性Wnt3aをLgr5+選別単一細胞に添加し、インビトロでの陰窩-絨毛形成における影響を評価した。
Lgr5-GFPhi細胞を選別し、従来の単一細胞培養条件(単一細胞に対して上記で記載のとおり、EGF、ノギン、R-スポンジン、NotchリガンドおよびY-27632)に加えてWnt3a(100ng/ml)を添加してまたは添加せずに培養した。本発明者らは、細胞100個/ウェルを播種し、播種から14日後にオルガノイド数を数えた。
R-スポンジン非存在下でWnt3aを添加してもコロニー形成において効果はなく、R-スポンジン非存在下で結腸の形成は皆無かそれに近かった。しかし、R-スポンジンの存在下では、Wnt3a存在下でのみ、オルガノイド形成効率の向上が認められた(図17)。このことから、両因子が、完全な上皮細胞層の形成に必要な全ての細胞への幹細胞の分化を刺激し、支持するというそれらの能力を互いに支え合うことが示される。現在の仮説は、R-スポンジンが、Frizzledを通じてシグナル伝達前にFrizzledの共受容体であるLRP6の内部移行の阻害に関与するというものである。Frizzledおよび共受容体LRP6にWnt因子が結合すると、Wntシグナル伝達経路が活性化される31。LRP6が細胞表面に存在する場合、Wnt活性化が起こる(図18)。従って、R-スポンジンが培養培地中に存在しない場合、Wnt3aはWnt経路を活性化できないが、これは、LRP6が内部に取り込まれ、Wnt因子と組み合わせてシグナル伝達に利用できず、それによりWnt経路の活性化が阻止されるからである。
胃は3つの形状領域(底部、体部および洞部)および2つの機能的腺領域(酸分泌部および幽門部)からなる。酸分泌腺領域はこの臓器の80%を構成し、幽門部領域はこの臓器の20%を構成する。哺乳動物胃上皮は、平面表面上皮、短い窩および長い腺からなる胃ユニットに編成される。この窩は、内側を粘液分泌細胞に覆われており、一方で腺は、3つの領域、峡部、頚部および底部に分けられる分泌細胞からなる。胃上皮は絶えず再生される。本発明者らの研究室で行われた追跡試験から、腺底部に位置するLGR5陽性細胞が幹細胞性の定義を満たすことが分かった(Barker et al.,準備中)。
胃ユニット単離
単離した胃を長軸方向に切開し、冷アドバンスト-DMEM/F12(Invitrogen)中で洗浄した。立体顕微鏡下で、幽門部を切り取り、胃体部から切り離し、ピンセットで噴門洞および幽門部粘膜を慎重に筋肉層から分離した。次に、組織を細切して5mm前後の小片にし、冷分離用緩衝液(Na2HPO4 28mM+KH2PO4 40mM+NaCl 480mM+KCl 8mM+スクロース 220mM+D-ソルビトール 274mM+DL-ジチオトレイトール(Dithiotreitol)2.6mM)でさらに洗浄した。穏やかに振盪させながら、単離緩衝液とともに4℃で2時間、5mM EDTA中で組織断片を恒温放置した。EDTA溶液を除去した後、10mlピペットを用いて10mlの冷分離用緩衝液中で組織断片を激しく縣濁した。死細胞を含有する最初の上清を廃棄し、10〜15ml冷分離用緩衝液で沈殿物を縣濁した。組織断片をさらに激しく縣濁した後、上清には胃ユニットが濃縮されている。10〜20回の縣濁ごとに、上清を新鮮な冷分離用緩衝液に交換し、氷上で維持し、胃ユニットの存在について調べる。胃ユニットが完全に放出されるまでこの手順を繰り返す(通常は4〜5回)。濃縮された胃ユニット縣濁液を600rpmで2〜3分間遠心し、単一細胞から単離胃ユニットを分離し、沈殿物を培養で使用する。
前のセクションで示されているように、4℃で2時間、5mM EDTAとともに恒温放置することによって、腺、峡部および窩領域を含有する胃ユニット全体をマウス胃幽門部から単離した。単離した胃ユニットを数え、ペレット化した。100個の胃ユニットを25μlのマトリゲル(BD Bioscience)と混合し、48ウェル組織培養プレート上に播種し、マトリゲルが完全に重合するまで37℃で5〜10分間恒温放置した。重合後、250μlの組織培養培地(B27、N2、200ng/ml N-アセチルシステイン、50ng/ml EGF、1μg/ml R-スポンジン1、100ng/ml ノギン、100ng/ml Wnt3A、50または100ng/ml KGFを補充したアドバンスト-DMEM/F12)を添加した。2日ごとに全培地を交換した。継代のために、1000μlピペットを用いてオルガノイドをマトリゲルから取り出し、小断片になるように機械的に分離し、新しいマトリゲルに移した。週に1回または2回、1:4の分割比で継代を行った。これらの条件下で、少なくとも1ヶ月間、培養物を維持した。
アドバンスト-DMEM/F12および補助剤N2およびB-27血清不含サプリメントをInvitrogenから購入し、N-アセチルシステインをSigmaから購入した。マウス組み換えEGF、ノギンおよびヒトKGFはPeprotechから購入し、Wnt3A組み換えタンパク質はStem Cell Researchから購入した。言及した増殖因子から、R-スポンジン1およびKGFに対してのみ様々な濃度を試験した。50ng/mlで、R-スポンジン1は培養物成長を阻害する。50または100ng/mlの何れかでKGFを使用することができるが、出芽効率は100ng/mlの条件でより高くなる。既に記載のようにWnt3A馴化培地を調製した(Willert K,Brown JD,Danenberg E,Duncan AW,Weissman IL,Reya T,Yates JR 3rd,Nusse R.Nature 2003 May 22;423(6938):448-52)。
X-gal染色のために、室温で1〜2時間、100mM MgCl2を含むPBS中の0.25%グルタルアルデヒド(Sigma)とともにマトリゲル中でオルガノイドを直接固定した。その後、洗浄溶液(PBS中、0.01%デオキシコール酸ナトリウム+0.02%NP40+5mM MgCl2)で3回培養物を洗浄し、0.21%K4Fe(CN)6および0.16%K3Fe(CN)6の存在下で1mg/ml X-Gal(Invitrogen)とともに37℃で16時間恒温放置した。PBS中での洗浄後、PBS中の2%PFAにより室温にて15分間、培養物を後固定した。全ての試薬をSigmaから得た。
現在まで、胃培養物が単層で増殖されてきた。しかし、単層培養は、いくつかの分化した胃細胞(ピット粘液細胞、腸内分泌細胞および増殖性の粘液不含細胞)により形成される胃ユニット全体の特性を再現する能力を欠く。最近、本発明者らの研究室は、インビボ細胞系譜解析により、腸陰窩の底部に存在するLgr5陽性細胞が真の腸幹細胞であることを明らかにした(Barker N,van Es JH,Kuipers J,Kujala P,van den Born M,Cozijnsen M,Haegebarth A,Korving J,Begthel H,Peters PJ,Clevers H.Nature.2007;449:1003-7)。腸上皮のように、胃上皮は絶えず再生される。Lgr5陽性細胞が幽門部胃腺ユニットの底部で見出されており、追跡実験から、自己再生および多分化能を示すことにより、これらのLGR5陽性細胞が幹細胞性の定義を満たすことが分かった(Barker et al.,準備中)。本発明者らは、3-D構造で単一Lgr5+細胞から腸陰窩を培養することができたので、同様の条件が、インビトロで幽門部胃ユニットの成長を維持できるか否かを調べた。
材料および方法
新たに単離した膵臓を刻んで小片にし、オービタルシェーカーにおいて(80rpm、37℃)10分間、消化酵素混合物(300U/ml XI型コラゲナー(Sigma)、0.01mgディスパーゼI(Roche)および0.1mg DNase)とともにDMEM(Invitrogen)中で恒温放置した。恒温放置後、機械的なピペッティング操作によって組織断片を穏やかに分離させた。標準重力で1分間、未消化断片を沈殿させ、新しい試験管に上清を移した。上清を70μm細胞ストレイナーに通し、残渣をDMEMで洗浄した。逆向きにした細胞ストレイナーをDMEMですすぐことによって細胞ストレイナーに残存する断片を回収し、ペレット化した。この分画は殆ど膵臓腺房組織からなり、膵管を含んでいだ。このペレットをマトリゲルと混合し、小腸オルガノイド培養系として培養した(実施例1の材料および方法を参照)。37℃で5〜10分間、マトリゲルを恒温放置した。マトリゲルの重合後、500μlの組織培養培地(B27、N2、200ng/ml N-アセチルシステイン、50ng/ml EGF、1μg/ml R-スポンジン1、100ng/ml ノギン、50または100ng/ml KGF(Peprotech)を補充したアドバンスト-DMEM/F12)を添加した。2日ごとに増殖因子を添加した。4-6日ごとに全培地を交換した。継代のために、1000μlピペットを用いてオルガノイドをマトリゲルから取り出し、機械的に分離させて小片にし、新しいマトリゲルに移した。週に1回または2回、1:4の分割比で継代を行った。これらの条件下で、少なくとも2ヶ月間、培養を維持した。
EGFの存在下で、培養から3〜4日後、膵臓組織は単純な嚢胞構造を形成した。ノギンおよびR-スポンジン培養は嚢胞構造の大きさを相乗的に拡大したが、オルガノイドの形態形成には影響しなかった。KGFは、出芽形成ならびに培養効率を顕著に誘導した。増殖因子の最適の組み合わせ(EGF、ノギン、R-スポンジン-1およびKGF)を用いて、膵管の80%超が増殖因子の最良の組み合わせで成長した。
材料および方法
新たに単離した膵臓を刻んで小片にし、オービタルシェーカー(80rpm、37℃)において10分間、消化酵素混合物(300U/ml XI型コラゲナー(Sigma)、0.01mg/ml ディスパーゼI(Roche)および0.1mg/ml DNase)とともにDMEM(Invitrogen)中で恒温放置した。恒温放置後、機械的なピペッティング操作によって組織断片を穏やかに分離させた。標準重力で1分間、未消化断片を沈殿させた。消化酵素混合物で10分間、未消化断片をさらに消化した。未消化断片が殆ど膵管から構成されるようになるまでこの消化手順を繰り返した。顕微鏡下で膵管構造を未消化断片から手作業で拾った。膵管をマトリゲルと混合し、小腸オルガノイド培養系のように培養した(実施例1の材料および方法を参照)。37℃で5〜10分間、マトリゲルを恒温放置した。マトリゲルの重合後、500μlの組織培養培地(1xGlutamax、ペニシリン/ストレプトマイシン、10mM Hepes、B27、N2、10mM N-アセチルシステイン、10nM [Leu15]-ガストリンI、100nM エキセンジン4、10mMニコチンアミド、50ng/ml EGF、1μg/ml R-スポンジン1、100ng/ml ノギン、50もしくは100ng/ml FGF7(KGF)またはFGF10(Peprotech)を補充したアドバンスト-DMEM/F12)を添加した。この培養培地を2日ごとに交換した。継代のために、1000μlピペットを用いてオルガノイドをマトリゲルから取り出し、機械的に分離させて小片にし、新しいマトリゲルに移した。週に1回または2回、1:4の分割比で継代を行った。これらの条件下で、少なくとも10ヶ月間、培養を維持した。
EGFの存在下で、培養から3〜4日後、膵臓組織は単純な嚢胞構造を形成した。ノギンおよびR-スポンジン培養は嚢胞構造の大きさを相乗的に拡大したが、オルガノイドの形態形成に影響しなかった。FGF7(KGF)/FGF10は、出芽形成ならびに培養効率を顕著に誘導した。増殖因子の最適の組み合わせ(EGF、ノギン、R-スポンジン-1およびFGF7(KGF)/FGF10)を用いて、膵管の80%超が増殖因子の最良の組み合わせで成長した。
材料および方法
マウス、試薬および組織
次のマウス、アキシン-LacZノックイン(Lustig et al.Mol Cell Biol.2002)、Lgr5-LacZノックイン(Barker et al.,2007)、Lgr5-GFP(Barker et al.,2007)から膵臓組織を得た。アキシン-LacZマウスに100μgの精製ヒトR-スポンジン1(A.Abo、Nuvelo Inc、CA、USAの好意により提供)をIP注射し、膵臓でのLacZ発現分析のために48時間後に屠殺した。
RNA easyミニキット(Quiagen)によりRNAを単離し、Moloneyマウス白血病ウイルス逆転写酵素(Promega)を用いて逆転写した。サーマルサイクラー中でcDNAを増幅した。
Leica SP5を備える共焦点顕微鏡、倒立顕微鏡(Nikon DM-IL)または実体顕微鏡(Leica、MZ16-FA)の何れかにより、陰窩オルガノイドの画像を取得した。免疫組織化学のために、室温にて1時間、4%パラホルムアルデヒド(PFA)で試料を固定し、標準技術(Barker et al.,Nature 2007)でパラフィン切片を処理した。既に記載のように(Barker et al.,Nature 2007)免疫組織化学を行った。ホールマウント免疫染色のために、ディスパーゼ(Invitrogen)を用いて膵臓オルガノイドをマトリゲルから単離し、4%PFAで固定し、次いで0.1%Triton X-100で透過処理した。次に、免疫組織化学のために抗体を使用した;抗BrdU(Amersham)、抗Ki67(Dako)、抗インスリン(Sigma)、抗C-ペプチド(Cell Signaling)、抗Ngn3(Developmental hybridoma studies bank)。
R-スポンジン(1μg/ml)存在下または非存在下で膵臓オルガノイドを培養し、マトリゲルから機械的にまたは酵素(TrypLE)により取り出した。37℃で10分間にわたりTrypLEによって単離オルガノイドをさらに消化した。分離させた細胞を40μm細胞ストレイナー(BD bioscience)に通し、APC結合抗EpCAM(eBioscience)で染色した。製造者のプロトコールに従って、FluoReporterキット(Invitrogen)によりLacZを染色した。パルス幅パラメーター、側方散乱パラメーターおよびヨウ化プロピジウム染色により単一生存細胞にゲートをかけた。
PDL処理から7日後、マウスから膵臓を摘出し、上述のように膵管を単離した。37℃で20分間、TrypLE Express(Invitrogen)とともに単離膵管を恒温放置し、続いて40μm細胞ストレイナー(BD bioscience)に通した。実施例7に記載のようにLacZ(FluoroReporterキット)に対してEpCAM-APCおよび蛍光基質を用いて細胞を染色した。細胞を分析し、フローサイトメーター(MoFlo;Dako Cytomation)によって単一生存上皮細胞を選別し、EM培地中で回収した。選別細胞をペレット化し、マトリゲルと混合し、4日間にわたり50%Wnt馴化培地および10mM Y-27632を含むEM培地とともに培養した。4日後、培養培地をWntおよびY-27632不含のEM培地に交換した。
増幅する消化管様オルガノイドを継続的に生成させるために、小腸由来の単一Wnt依存性Lgr5+幹細胞を培養することができる(Sato et al.,2009)。健康な成体膵臓において、Wnt経路は活性があり、その結果、Lgr5は発現されない。部分的管結紮(PDL)による損傷において、本発明者らは、Wnt経路が確実に活性化されるようになり、一方でLgr5発現が再生管の出芽部で出現することに気付く。腸培養系から改変された条件下で、新たに単離した成体の管断片はLgr5の発現を惹起し、>30週間にわたり1週間で10倍増幅する出芽嚢胞を形成する。成長刺激の除去によって、これらの嚢胞は、内分泌およびβ細胞マーカーを発現する、未熟な膵島形態を有する構造に変換される。損傷膵臓由来のWnt刺激を受けた単一細胞もこれらの長期培養を開始させることができる。本発明者らは、最適条件下で培養される場合、成体前駆細胞にはヘイフリックの限界が当てはまらないと結論付ける。従って、器官特異的な成体幹細胞の増幅に有利である培養法は、ES-またはiPS-に基づく組織生成に対する代替法となり得る。
胚性膵臓発生の間、膵管ネットワークにおいてニューロゲニン3+またはインスリン発現細胞が見られ、膵管細胞が内分泌前駆細胞および、結果として成熟内分泌細胞を生じさせることが示唆された。ヒト膵管細胞がインビトロでグルコース応答性インスリン産生細胞に分化することが示されており(Bonner-Weir,S et al 2000 PNAS)、この知見により膵管細胞がβ細胞補充療法に対する魅力的なソースとなった。しかし、内分泌分化能を喪失せずに導管細胞を増幅させることは困難であった。既に報告された培養系において、ヒト膵管細胞は、上皮の特性を失うかまたは2週間〜5週間後に老化が起こった(Trautmann B et al.Pancreas vol.8 248-254)。従って、内分泌分化能を保持するヒト膵管細胞を増殖させるための強固な培養系はない。マウス膵臓オルガノイド培養系の確立を生かし、ここで、本発明者らはヒト膵臓オルガノイド培養系の確立を試みた。
Leiden University Medical Center,The Netherlandsからヒト膵臓を得た。重要なこととして、上記(実施例7)でマウス膵臓断片に対して記載されているものと同じ条件下で、新たに単離したヒト膵臓断片もインビトロで増殖させることができる(図30)。
実施例1および2に記載のように、今回初めて、マウス小腸および結腸上皮に対する長期培養条件を生み出すことが可能となった。陰窩-絨毛オルガノイドは、一連の推測される増殖因子および細胞外マトリクスを補充することにより増殖する。このオルガノイドは、活発に分裂し、腸に存在する全ての主要な分化細胞系統を生ずる腸幹細胞を含有する。この実施例において、本発明者らは、これらの培養条件がマウス腸上皮に特異的なものではなく、ヒト腸上皮を増殖させるためにも使用できることを示す。
マウス結腸オルガノイド培養
実施例1に記載のようにマウスオルガノイド培養物を培養した。Wnt分泌を阻害するために、Wnt産生阻害剤(IWP-2)を使用した(Chen et al.,Nat Chem Biol.2009 Feb;5(2)100-7)。
切除した正常結腸標本からヒト結腸陰窩を単離し、確立されたオルガノイド培養系(Sato et al.,2009 Nature May 14;459(7244):262-5)を用いて7日間にわたりオルガノイド構造として培養した。このプロトコールはマウス由来オルガノイド培養に対して最適化されたものなので、本発明者らは、ヒト結腸オルガノイドの最適な成長を確実にするために、Wnt3a馴化培地の添加により僅かな改変を行った。この馴化培地を得るために、このリガンドをコードする適切な発現コンストラクトを遺伝子移入することによって、細胞株においてWnt3aを発現させる。この細胞株を培養し、分泌されたリガンドを含む培養培地を適切な時間間隔で回収する。例えば、細胞は、それらが密集状態に到達し、増殖を停止した瞬間にWnt3Aの産生を開始する。空の発現コンストラクトを遺伝子移入または感染させなかった細胞からの培養培地を陰性対照として使用した。馴化培地を回収し、例えばWnt3aなどのWntアゴニストの存在を定量するための、ルシフェラーゼ発現がTCF応答性エレメントによる制御下にあるアッセイにおいて試験した(Korinek et al.,1997.Science 275 1784-1787)。
腸上皮の増殖はWntシグナル伝達経路に依存する。しかしWntソースの正確な位置は不明である(Gregorieff and Clevers,2005,Genes Dev.Apr 15;19(8):877-90)。マウス腸オルガノイドが独立してニッチで増殖したので(Sato et al.,2009 Nature May 14;459(7244):262-5)、本発明者らは、これらのオルガノイドがそれら自身のWntリガンドを産生し得ると仮定した。これを調べるために、本発明者らは、ポーキュパイン阻害剤と恒温放置することによってWnt分泌を阻害した。ポーキュパインはWnt分泌に重要である(概略図31A)。1μM IWPとの恒温放置(Chen et al.,Nat Chem Biol.2009 Feb;5(2):100-7)の結果、オルガノイドが死滅した(図31BおよびC)。Wnt3a馴化培地を添加することによりオルガノイドを救出し得、このことから、オルガノイドが実際にWntリガンドを産生することが示される(図31DおよびE)。
実施例5に記載のように、長期にわたり胃上皮を培養するために使用できる培養培地を確認した。ここで、本発明者らは、オルガノイド培養に対する最適化条件を記載する。
胃ユニット単離、単一細胞分離およびEGFP+ve細胞選別
一部改変して、既に記載のようにマウス幽門部から胃腺を単離した(Bjerknes and Cheng,2002,Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol.Sep;283(3):G767-77)。簡潔に述べると、顕微鏡下で、大弯に沿って胃を切開し、食塩水で洗浄し、幽門を単離した。胃の筋層を除去し、残存した上皮を5mmの小片に分け、10mM EDTA(培養または染色の場合)または5mM EGTA(RNA単離の場合)を含有する緩衝食塩水溶液(Na2HPO4 28mM、KH2PO4 40mM、NaCl 480mM、KCl 8mM、スクロース 220mM、D-ソルビトール 274mM、DL-ジチオトレイトール(Dithiotreitol)2.6mM)中で3〜5時間、4℃で恒温放置した。キレート剤を除去した後、10mlピペットを用いて緩衝液中で組織断片を激しく縣濁した。縣濁および遠心後、沈殿物中に胃腺が濃縮された。腺単離後、細胞を回収し、10mg/mlトリプシンおよび0.8単位/μl DNAseI(マイクロアレイ分析に対して)を補充したカルシウム不含SMEM培地(Invitrogen)中で再懸濁するかまたは0.8単位/μl DNAase(培養用)を補充したTrypleExpress(GIBCO)中で再懸濁した。両事例において、37℃で20〜25分間恒温放置した後、細胞を沈降させ、40μMメッシュに通してろ過した。フローサイトメトリー(MoFlo、Beckman Coulter)によりEGFPhiおよびEGFPlo細胞を選別した。前方散乱およびパルス幅パラメーターにより単一生存上皮細胞にゲートをかけた。定められる場合、ヨウ化プロピジウムの陰性染色に対して細胞にゲートをかけ、Trizol LS(Invitrogen)中で回収し、製造者のプロトコールに従いRNAを単離するかまたは胃培養培地中で回収し、マトリゲル(BD Bioscience)中で包埋し、下記で詳述するプロトコールに従い培養した。
培養のために、単離した胃腺を計数し、全部で100個の腺を50μlのマトリゲル(BD Bioscience)と混合し、24ウェルプレート中に播種した。マトリゲルの重合後、胃培養培地(増殖因子(50ng/m EGF(Peprotech)、1μg/ml R-スポンジン1、100ng/ml ノギン(Peprotech)、100ng/ml FGF10(Preprotech)およびWnt3A馴化培地を含有する、B27、N2およびnアセチルシステイン(Invitrogen)を補充したアドバンスト-DMEM/F12)で表面を覆った。単一細胞培養のために、全部で選別EGFPhi細胞100個/ウェルを胃培養培地中で回収し、マトリゲル(BD Bioscience)中で包埋した。マトリゲルの重合後、胃培養培地で表面を覆った。播種後の最初の2日間、アノイキスを回避するために、この培地に10μM ROCK阻害剤であるY-27632(Sigma Aldrich)も補充した。2日ごとに増殖因子を添加し、4日ごとに全培地を交換した。継代のために、胃オルガノイドをマトリゲルから取り出し、機械的に分離し、新しいマトリゲルへと移した。1:5〜1:8の分割比で1〜2週間ごとに継代を行った。Wnt3Aの必要性を確認するために、Wnt3A馴化培地の代わりに、マウスWnt3A組み換えタンパク質(Stem cell technologies)を補充した。インビトロでの追跡実験のために、2週間経過した胃オルガノイドを胃培養培地中の100nMの4-ヒドロキシタモキシフェンとともに20時間恒温放置し、Lgr5-CreERT2を活性化した。続いてYFPを可視化し、共焦点顕微鏡(Leica、SP5)を用いて生存オルガノイドにおいて記録した。
他所に記載のプロトコール(Willert et al.,2003,Nature,May 22;423(6938):448-52)に従いWnt3a培地を調製した。van de Weteringおよび共同研究者らにより記載されるように(van de Wetering et al.,2001 Cancer Res Jan 1;61(1):278-84)、Wnt3a馴化培地および対照馴化培地のWnt活性を試験するために、TOP/FOPアッセイを使用した。TOP/FOP比≧50を高Wnt培地とみなし、胃オルガノイド培養培地で1:1希釈した。この高Wnt3a培地(TOP/FOP比〜5)の1:10希釈物は低Wnt培地とみなし、分化目的に使用した。
免疫組織化学に対して、胃オルガノイドをPBSで1回洗浄し、RTで15-20分間、パラホルムアルデヒド4%を用いてすぐに固定した。言及される場合、胃オルガノイドをパラフィン中で包埋し、標準技術を用いて処理した。ホールマウント染色に対して、試料をPBS0.5%Triton-X100-1%BSAで透過処理し、一次抗体とともにo/nで恒温放置した。PBS 0.3%Triton X100で数回洗浄した後、試料を二次抗体とともに恒温放置した。製造者の説明書(Click-IT;Invitrogen)に従い、EdU染色を行った。TOPRO3ヨウ素またはHoescht33342で核を染色した。共焦点顕微鏡(Leica、SP5)を用いて胃腺および胃オルガノイドの画像を取得した。Volocity Software(Improvision)を用いて三次元再構成を行った。
RNeasy Mini RNA抽出キット(Qiagen)を用いて胃細胞培養物または新たに単離した組織からRNAを抽出し、Moloneyマウス白血病ウイルス逆転写酵素(Promega)を用いて逆転写した。既に記載のように(Huch et al.,2009)、サーマルサイクラー(GeneAmp PCR System 9700;Applied Biosystems,London,UK)でcDNAを増幅した。使用したプライマーを下記で示す(遺伝子シンボルの次にフォワード(5'-3')およびリバース(5'-3')プライマーが続く)。
インビトロでの胃ユニットの最適成長を調べるために、本発明者らは、胃腺ユニットを単離し、これをマトリゲル中で縣濁し、様々な条件下で培養した。胃培養物の成長条件は、馴化培地の形でのWnt3Aへの強い依存を除き、小腸培養の条件と同様であった(EGF、ノギンおよびR-スポンジン1を含む)。精製Wnt3aタンパク質を用いてこの必要性を確認した(図33A)。さらに、FGF10は、出芽事象を推進するためのおよび培養物の多ユニットオルガノイドへの増幅のための必須成分であることが分かった(図33B)。実施例5で使用したFGF7(KGF)の代わりにFGF10を使用することができ、その場合でも結果として、培養開始から4日後、出芽オルガノイドの割合が2倍上昇した(図33C)。新たに形成された胃オルガノイドでは、それらの極性を維持しながら、胃腺-ドメイン出芽部が中心内腔周囲に分布する、継続的な出芽事象が起こった(図33D)。Wnt3A馴化培地非存在下で、胃オルガノイドは急速に衰退した(図33E)。各週に、オルガノイドを機械的に分離し、それらの播種前密度の1/5に分割した。E-Cad染色により明らかにされるように、培養した幽門部ユニットは単層上皮構造であった(図33F)。本発明者らは、上記特性の検出可能な喪失なく、少なくとも8ヶ月間にわたり胃オルガノイドを首尾よく培養した。
[請求項1001]
絨毛様上皮または結腸陰窩オルガノイドにより内面が覆われている中心内腔を含む、陰窩−絨毛オルガノイド。
[請求項1002]
細胞外マトリクスを提供する段階と、
上皮幹細胞、該上皮幹細胞を含む単離組織断片、または腺腫細胞を、細胞外マトリクスと一緒に恒温放置する段階と、
動物またはヒト細胞用の基本培地であって、
骨形成タンパク質(BMP)阻害剤、
5〜500ナノグラム/mlの分裂促進増殖因子、
が添加され、
上皮幹細胞および単離組織断片を培養する場合はWntアゴニストが添加される前記基本培地を含む細胞培養培地の存在下で、該幹細胞、単離組織断片、または腺腫細胞を培養する段階と
を含む、上皮幹細胞、該上皮幹細胞を含む単離組織断片、または腺腫細胞を培養するための方法。
[請求項1003]
前記BMP阻害剤がノギン(Noggin)であり、前記分裂促進増殖因子が上皮増殖因子およびケラチン生成細胞増殖因子であり、かつ前記WntアゴニストがR-スポンジン1である、請求項1002記載の方法。
[請求項1004]
前記BMP阻害剤が、ノギン、DAN、およびサーベラス(Cerberus)およびグレムリン(Gremlin)を含むDAN様タンパク質から選択される、請求項1002記載の方法。
[請求項1005]
前記Wntアゴニストが、Wnt、R-スポンジン1〜4、ノリン(Norrin)、およびGSK-阻害剤の1以上から選択される、請求項1002または請求項1004記載の方法。
[請求項1006]
前記Wntアゴニストが、R-スポンジン1およびWnt-3aを含み、かつ/または分裂促進増殖因子がEGFである、請求項1002および請求項1003〜1005記載の方法。
[請求項1007]
前記培養培地が、Y-27632、ファスジル、およびH-1152から選択されるRock(Rho-キナーゼ)阻害剤をさらに含む、請求項1002〜1006のいずれか一項記載の方法。
[請求項1008]
前記培養培地がnotchアゴニストをさらに含む、請求項1002〜1007のいずれか一項記載の方法。
[請求項1009]
上皮幹細胞、該上皮幹細胞を含む単離組織断片、または腺腫細胞を、B27、N2、およびN-アセチルシステインが補充された、ノギン、EGF、ならびにWntアゴニストとしてR-スポンジン1および/またはWnt-3を含む培地中で、細胞外マトリクスと接触させて培養する、好ましくは請求項1002〜1008のいずれか一項記載の、結腸陰窩を取得および/または培養するための方法。
[請求項1010]
上皮幹細胞、該上皮幹細胞を含む単離組織断片、または腺腫細胞を、細胞外マトリクスと接触させて、
第一段階で、B27、N2、およびN-アセチルシステインが補充された、EGF、KGFもしくはFGF、およびR-スポンジン1をWntアゴニストとして含む培地中で、
続いて第二段階で、B27、N2、およびN-アセチルシステインが補充された、EGFおよびR-スポンジン1をWntアゴニストとして含む培地中で
培養する段階を含む、膵臓オルガノイドを取得および/または培養するための、好ましくは請求項1002〜1008のいずれか一項記載の方法。
[請求項1011]
上皮幹細胞、該上皮幹細胞を含む単離組織断片、または腺腫細胞が、細胞外マトリクスと接触させて、
第一段階でノギンをBMP阻害剤として、上皮増殖因子およびFGF10を分裂促進増殖因子として、R-スポンジン1およびWnt-3aをWntアゴニストとして含み、さらにB27、N2、N-アセチルシステインを含む培地中で、
続いて第二段階で、B27、N2、およびN-アセチルシステインが補充された、上皮増殖因子、およびWntアゴニストとしてR-スポンジン1およびWnt-3a、ノギンならびにFGF10を含む培地であって、第二段階でのWnt-3の濃度が、第一段階で与えられるWnt-3a濃度と比較して低い、前記培地中で、
培養する段階を含む、好ましくは請求項1002〜1008のいずれか一項記載の、胃断片を取得および/または培養するための方法。
[請求項1012]
骨形成タンパク質(BMP)阻害剤、
Wntアゴニスト、および
5〜500ナノグラム/mlの上皮増殖因子(EGF)
が添加されている基本培地であって、動物またはヒト細胞用の基本培地を含む、細胞培養培地。
[請求項1013]
細胞外マトリクス上で上皮幹細胞または単離組織断片を培養するための、請求項1012記載の培養培地の使用。
[請求項1014]
請求項1002〜1009記載の方法により取得可能な絨毛様上皮または結腸陰窩オルガノイドによって内面が覆われている中心内腔を含む、陰窩-絨毛オルガノイド。
[請求項1015]
好ましくは請求項1002〜1008または請求項1010記載の方法により取得可能な、膵島様構造を含む、膵臓オルガノイド。
[請求項1016]
好ましくは請求項1002〜1008または請求項1011記載の方法により取得可能な、中心内腔を含む、胃オルガノイド。
[請求項1017]
薬物探索スクリーニング、毒性アッセイ、または再生医療における、請求項1001または請求項1014記載の陰窩-絨毛オルガノイドまたは結腸陰窩、請求項1015記載の膵臓オルガノイドまたは請求項1016記載の胃オルガノイドの使用。
[請求項1018]
骨形成タンパク質(BMP)阻害剤、および
5〜500ナノグラム/mlの上皮増殖因子(EGF)、
が添加されている基本培地であって、動物またはヒト細胞用の基本培地を含む細胞培養培地の、腺腫細胞を培養するための使用。
Claims (18)
- 絨毛様上皮または結腸陰窩オルガノイドにより内面が覆われている中心内腔を含む、陰窩−絨毛オルガノイド。
- 細胞外マトリクスを提供する段階と、
上皮幹細胞、該上皮幹細胞を含む単離組織断片、または腺腫細胞を、細胞外マトリクスと一緒に恒温放置する段階と、
動物またはヒト細胞用の基本培地であって、
骨形成タンパク質(BMP)阻害剤、
5〜500ナノグラム/mlの分裂促進増殖因子、
が添加され、
上皮幹細胞および単離組織断片を培養する場合はWntアゴニストが添加される前記基本培地を含む細胞培養培地の存在下で、該幹細胞、単離組織断片、または腺腫細胞を培養する段階と
を含む、上皮幹細胞、該上皮幹細胞を含む単離組織断片、または腺腫細胞を培養するための方法。 - 前記BMP阻害剤がノギン(Noggin)であり、前記分裂促進増殖因子が上皮増殖因子およびケラチン生成細胞増殖因子であり、かつ前記WntアゴニストがR-スポンジン1である、請求項2記載の方法。
- 前記BMP阻害剤が、ノギン、DAN、およびサーベラス(Cerberus)およびグレムリン(Gremlin)を含むDAN様タンパク質から選択される、請求項2記載の方法。
- 前記Wntアゴニストが、Wnt、R-スポンジン1〜4、ノリン(Norrin)、およびGSK-阻害剤の1以上から選択される、請求項2または請求項4記載の方法。
- 前記Wntアゴニストが、R-スポンジン1およびWnt-3aを含み、かつ/または分裂促進増殖因子がEGFである、請求項2および請求項3〜5記載の方法。
- 前記培養培地が、Y-27632、ファスジル、およびH-1152から選択されるRock(Rho-キナーゼ)阻害剤をさらに含む、請求項2〜6のいずれか一項記載の方法。
- 前記培養培地がnotchアゴニストをさらに含む、請求項2〜7のいずれか一項記載の方法。
- 上皮幹細胞、該上皮幹細胞を含む単離組織断片、または腺腫細胞を、B27、N2、およびN-アセチルシステインが補充された、ノギン、EGF、ならびにWntアゴニストとしてR-スポンジン1および/またはWnt-3を含む培地中で、細胞外マトリクスと接触させて培養する、好ましくは請求項2〜8のいずれか一項記載の、結腸陰窩を取得および/または培養するための方法。
- 上皮幹細胞、該上皮幹細胞を含む単離組織断片、または腺腫細胞を、細胞外マトリクスと接触させて、
第一段階で、B27、N2、およびN-アセチルシステインが補充された、EGF、KGFもしくはFGF、およびR-スポンジン1をWntアゴニストとして含む培地中で、
続いて第二段階で、B27、N2、およびN-アセチルシステインが補充された、EGFおよびR-スポンジン1をWntアゴニストとして含む培地中で
培養する段階を含む、膵臓オルガノイドを取得および/または培養するための、好ましくは請求項2〜8のいずれか一項記載の方法。 - 上皮幹細胞、該上皮幹細胞を含む単離組織断片、または腺腫細胞が、細胞外マトリクスと接触させて、
第一段階でノギンをBMP阻害剤として、上皮増殖因子およびFGF10を分裂促進増殖因子として、R-スポンジン1およびWnt-3aをWntアゴニストとして含み、さらにB27、N2、N-アセチルシステインを含む培地中で、
続いて第二段階で、B27、N2、およびN-アセチルシステインが補充された、上皮増殖因子、およびWntアゴニストとしてR-スポンジン1およびWnt-3a、ノギンならびにFGF10を含む培地であって、第二段階でのWnt-3の濃度が、第一段階で与えられるWnt-3a濃度と比較して低い、前記培地中で、
培養する段階を含む、好ましくは請求項2〜8のいずれか一項記載の、胃断片を取得および/または培養するための方法。 - 骨形成タンパク質(BMP)阻害剤、
Wntアゴニスト、および
5〜500ナノグラム/mlの上皮増殖因子(EGF)
が添加されている基本培地であって、動物またはヒト細胞用の基本培地を含む、細胞培養培地。 - 細胞外マトリクス上で上皮幹細胞または単離組織断片を培養するための、請求項12記載の培養培地の使用。
- 請求項2〜9記載の方法により取得可能な絨毛様上皮または結腸陰窩オルガノイドによって内面が覆われている中心内腔を含む、陰窩-絨毛オルガノイド。
- 好ましくは請求項2〜8または請求項10記載の方法により取得可能な、膵島様構造を含む、膵臓オルガノイド。
- 好ましくは請求項2〜8または請求項11記載の方法により取得可能な、中心内腔を含む、胃オルガノイド。
- 薬物探索スクリーニング、毒性アッセイ、または再生医療における、請求項1または請求項14記載の陰窩-絨毛オルガノイドまたは結腸陰窩、請求項15記載の膵臓オルガノイドまたは請求項16記載の胃オルガノイドの使用。
- 骨形成タンパク質(BMP)阻害剤、および
5〜500ナノグラム/mlの上皮増殖因子(EGF)、
が添加されている基本培地であって、動物またはヒト細胞用の基本培地を含む細胞培養培地の、腺腫細胞を培養するための使用。
Applications Claiming Priority (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US14962209P | 2009-02-03 | 2009-02-03 | |
US61/149,622 | 2009-02-03 | ||
EP09151970.2 | 2009-02-03 | ||
EP09151970 | 2009-02-03 | ||
EP09171831.2 | 2009-09-30 | ||
EP09171831 | 2009-09-30 | ||
PCT/NL2010/000017 WO2010090513A2 (en) | 2009-02-03 | 2010-02-03 | Culture medium for epithelial stem cells and organoids comprising said stem cells. |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012158676A Division JP5722835B2 (ja) | 2009-02-03 | 2012-07-17 | 上皮幹細胞および該幹細胞を含むオルガノイドのための培養培地 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2012516685A true JP2012516685A (ja) | 2012-07-26 |
JP5458112B2 JP5458112B2 (ja) | 2014-04-02 |
Family
ID=42144924
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011547839A Active JP5458112B2 (ja) | 2009-02-03 | 2010-02-03 | 上皮幹細胞および該幹細胞を含むオルガノイドのための培養培地 |
JP2012158676A Active JP5722835B2 (ja) | 2009-02-03 | 2012-07-17 | 上皮幹細胞および該幹細胞を含むオルガノイドのための培養培地 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012158676A Active JP5722835B2 (ja) | 2009-02-03 | 2012-07-17 | 上皮幹細胞および該幹細胞を含むオルガノイドのための培養培地 |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US8642339B2 (ja) |
EP (4) | EP4253529A3 (ja) |
JP (2) | JP5458112B2 (ja) |
KR (1) | KR101904224B1 (ja) |
CN (1) | CN102439135B (ja) |
AU (1) | AU2010211428B2 (ja) |
CA (1) | CA2751332C (ja) |
DK (2) | DK3061808T3 (ja) |
ES (2) | ES2948761T3 (ja) |
HK (1) | HK1163746A1 (ja) |
HR (2) | HRP20230650T1 (ja) |
HU (2) | HUE062459T2 (ja) |
IL (1) | IL214381A (ja) |
MX (1) | MX2011008044A (ja) |
NZ (1) | NZ594271A (ja) |
PL (3) | PL3061808T3 (ja) |
RU (1) | RU2555545C2 (ja) |
SG (1) | SG173492A1 (ja) |
WO (1) | WO2010090513A2 (ja) |
Cited By (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013535201A (ja) * | 2010-07-29 | 2013-09-12 | コーニンクレッカ ネザーランド アカデミー ヴァン ウェテンシャッペン | 肝臓オルガノイド、その使用、およびそれを得るための培養方法 |
JP2015149949A (ja) * | 2014-02-17 | 2015-08-24 | 学校法人明治大学 | 免疫抑制剤の評価方法、及び免疫抑制剤評価キット |
JP2016512958A (ja) * | 2013-02-25 | 2016-05-12 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | 上皮幹細胞の液体培養 |
JP2016513469A (ja) * | 2013-03-15 | 2016-05-16 | ザ ジャクソン ラボラトリー | 非胚性幹細胞の単離とその使用 |
JP2016533745A (ja) * | 2013-08-20 | 2016-11-04 | シーシービー − セントロ デ クリオジェニア ブラジル エルティーディーエー.Ccb − Centro De Criogenia Brasil Ltda. | 多能性幹細胞及び前駆細胞を生産するためのプロセス |
JP2017522016A (ja) * | 2014-06-27 | 2017-08-10 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 培養哺乳動物輪部幹細胞、その産生方法及びその使用 |
JP2017530099A (ja) * | 2014-09-12 | 2017-10-12 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | Wntシグナリングアゴニスト分子 |
JP2017532964A (ja) * | 2014-10-17 | 2017-11-09 | チルドレンズ ホスピタル メディカル センター | 多能性幹細胞を使用するヒト小腸のin vivoモデル、並びにそれを作製、及び使用する方法 |
WO2018038042A1 (ja) * | 2016-08-24 | 2018-03-01 | 学校法人慶應義塾 | ヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用2dオルガノイド及びその使用 |
JPWO2017199811A1 (ja) * | 2016-05-18 | 2019-04-11 | 学校法人慶應義塾 | オルガノイド培養用細胞培養培地、培養方法、及びオルガノイド |
JP2020014477A (ja) * | 2013-12-16 | 2020-01-30 | フレゼニウス メディカル ケア ドイッチェランド ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 膵島様細胞構造体及びそれを調製する方法 |
JP2020115872A (ja) * | 2014-05-28 | 2020-08-06 | チルドレンズ ホスピタル メディカル センター | 前駆細胞を指向性分化によって胃組織に変換するための方法及びシステム |
US11746150B2 (en) | 2017-12-19 | 2023-09-05 | Surrozen Operating, Inc. | Anti-LRP5/6 antibodies and methods of use |
US11773171B2 (en) | 2017-12-19 | 2023-10-03 | Surrozen Operating, Inc. | WNT surrogate molecules and uses thereof |
US12006368B2 (en) | 2017-12-19 | 2024-06-11 | Surrozen Operating, Inc. | Anti-frizzled antibodies and methods of use |
Families Citing this family (99)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2022848A1 (en) | 2007-08-10 | 2009-02-11 | Hubrecht Institut | A method for identifying, expanding, and removing adult stem cells and cancer stem cells |
US9464275B2 (en) * | 2008-08-21 | 2016-10-11 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Ex vivo culture, proliferation and expansion of intestinal epithelium |
GB201111244D0 (en) * | 2011-06-30 | 2011-08-17 | Konink Nl Akademie Van Wetenschappen Knaw | Culture media for stem cells |
US9752124B2 (en) | 2009-02-03 | 2017-09-05 | Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen | Culture medium for epithelial stem cells and organoids comprising the stem cells |
CA2751332C (en) | 2009-02-03 | 2024-04-02 | Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen | Culture medium for epithelial stem cells and organoids comprising said stem cells |
US8563307B2 (en) | 2009-02-24 | 2013-10-22 | James Wang | Treatment of immunosuppression-related disorders |
US9345486B2 (en) | 2009-03-16 | 2016-05-24 | University Of Washington | Nanofibrous conduits for nerve regeneration |
WO2011140441A2 (en) | 2010-05-06 | 2011-11-10 | Children's Hospital Medical Center | Methods and systems for converting precursor cells into intestinal tissues through directed differentiation |
US8679474B2 (en) | 2010-08-04 | 2014-03-25 | StemBios Technologies, Inc. | Somatic stem cells |
WO2012030854A2 (en) | 2010-09-01 | 2012-03-08 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Compositions and methods for modulating emt and uses thereof |
JP5850419B2 (ja) * | 2010-11-11 | 2016-02-03 | 国立大学法人大阪大学 | 細胞の三次元構造体、及び、これを製造する方法 |
WO2012118799A2 (en) | 2011-02-28 | 2012-09-07 | President And Fellows Of Harvard College | Cell culture system |
GB201106395D0 (en) * | 2011-04-14 | 2011-06-01 | Hubrecht Inst | Compounds |
CN102787094B (zh) * | 2011-05-17 | 2015-09-23 | 李晖 | 培养基、细胞培养用试剂盒及细胞培养方法 |
EP3611257A1 (en) * | 2011-08-29 | 2020-02-19 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Method for preparing induced paraxial mesoderm progenitor (ipam) cells and their use |
TWI571513B (zh) | 2011-09-28 | 2017-02-21 | 幹細胞生物科技股份有限公司 | 體幹細胞及其製備方法 |
US20140328808A1 (en) * | 2011-10-27 | 2014-11-06 | National University Corporation Tokyo Medical And Dental University | Technique for isolating/culturing colorectal epithelial stem cell, and technique for transplanting colorectal epithelium employing said technique |
US20140302491A1 (en) * | 2011-10-28 | 2014-10-09 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Ex Vivo Culture, Proliferation and Expansion of Primary Tissue Organoids |
PT3045912T (pt) | 2011-12-19 | 2018-12-12 | Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen | Um ensaio quantitativo rápido para medir a função do cftr num modelo de cultura primária intestinal |
WO2013131000A1 (en) * | 2012-03-01 | 2013-09-06 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Emt-inducing transcription factors cooperate with sox9 |
EP2876160B1 (en) * | 2012-07-06 | 2020-05-13 | Kyoto Prefectural Public University Corporation | Differentiation marker for and differentiation control for ocular cells |
EP2716298A1 (en) * | 2012-10-03 | 2014-04-09 | Institut Pasteur | A nod2-dependant pathway of cytoprotection of stem cells |
JP6495174B2 (ja) * | 2012-12-06 | 2019-04-03 | ステムバイオス テクノロジーズ,インコーポレイテッド | Lgr5+体性幹細胞 |
EP2746769A1 (en) | 2012-12-21 | 2014-06-25 | Stembios Technologies, Inc. | Method for evaluating effect of action on subject based on stem celldynamics |
DK3702443T3 (da) * | 2013-03-14 | 2022-04-04 | Brigham & Womens Hospital Inc | Sammensætninger og fremgangsmåder til opformering og dyrkning af epiteliale stamceller |
US20160237400A1 (en) * | 2013-03-15 | 2016-08-18 | The Jackson Laboratory | Isolation of non-embryonic stem cells and uses thereof |
WO2014153294A1 (en) * | 2013-03-17 | 2014-09-25 | The Regents Of The University Of California | Method to expand and transduce cultured human small and large intestinal stem cells |
JP6253265B2 (ja) * | 2013-06-05 | 2017-12-27 | 学校法人関西医科大学 | 食道上皮幹細胞の単離方法 |
JP6437184B2 (ja) * | 2013-06-05 | 2018-12-12 | 学校法人関西医科大学 | 舌上皮幹細胞の単離方法 |
US9589445B2 (en) | 2013-08-07 | 2017-03-07 | Nike, Inc. | Activity recognition with activity reminders |
KR102456567B1 (ko) | 2013-08-09 | 2022-10-19 | 알데릭스, 인코포레이티드 | 인산염 수송을 억제하기 위한 화합물 및 방법 |
US11390852B2 (en) | 2014-01-14 | 2022-07-19 | Yale University | Compositions and methods of preparing airway cells |
WO2015173425A1 (en) * | 2014-05-16 | 2015-11-19 | Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen | Improved culture method for organoids |
JP2017524377A (ja) * | 2014-06-20 | 2017-08-31 | ラトガース,ザ ステート ユニバーシティ オブ ニュー ジャージー | 単一細胞由来オルガノイド |
EP3189134A1 (en) | 2014-09-03 | 2017-07-12 | The Brigham and Women's Hospital, Inc. | Compositions, systems, and methods for generating inner ear hair cells for treatment of hearing loss |
GB201421092D0 (en) | 2014-11-27 | 2015-01-14 | Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen | Culture medium |
GB201421094D0 (en) | 2014-11-27 | 2015-01-14 | Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen | Culture medium |
US9777052B2 (en) | 2014-12-02 | 2017-10-03 | The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma | R-spondin variants, compositions, and methods of use |
CN107636149A (zh) | 2015-04-03 | 2018-01-26 | 普罗帕格尼克斯公司 | 上皮细胞的离体增殖 |
US10100285B2 (en) | 2015-04-03 | 2018-10-16 | Propagenix Inc. | Ex vivo proliferation of epithelial cells |
JP6662518B2 (ja) * | 2015-04-09 | 2020-03-11 | 国立大学法人 東京医科歯科大学 | 腸上皮間リンパ球をインビトロで維持・増殖させる方法 |
CN104862272B (zh) * | 2015-05-29 | 2018-08-10 | 吉林大学 | Y-27632抑制剂在cd44阳性肠干细胞分选中的应用 |
WO2017036533A1 (en) * | 2015-09-03 | 2017-03-09 | Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) | Three-dimensional hydrogels for culturing adult epithelial stem cells and organoids |
EP3892717A1 (en) | 2015-09-11 | 2021-10-13 | Propagenix Inc. | Ex vivo proliferation of epithelial cells |
EP3359645A1 (en) | 2015-10-05 | 2018-08-15 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Method and culture medium for ex vivo culturing of epidermis-derived stem cells |
CN108291197B (zh) | 2015-10-21 | 2022-09-16 | 印第安纳大学研究与技术公司 | 生成人内耳感觉上皮和感觉神经元的方法 |
WO2017142069A1 (ja) | 2016-02-18 | 2017-08-24 | 学校法人慶應義塾 | 細胞培養培地、培養方法、及びオルガノイド |
GB201603569D0 (en) | 2016-03-01 | 2016-04-13 | Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen | Improved differentiation method |
JP7112957B2 (ja) * | 2016-03-09 | 2022-08-04 | ベイジン パーカンズ オンコロジー カンパニー リミテッド | 腫瘍細胞懸濁培養及び関連方法 |
CN105695394A (zh) * | 2016-04-07 | 2016-06-22 | 中山大学 | 一种小鼠唾液腺类器官体的体外培养方法 |
ES2929758T3 (es) | 2016-05-05 | 2022-12-01 | Childrens Hospital Med Ct | Métodos para la fabricación in vitro de tejido del fondo gástrico y composiciones relacionadas con el mismo |
CN105950539B (zh) * | 2016-05-23 | 2020-01-07 | 华东师范大学 | 人小肠3d类器官研究p-糖蛋白模型的构建方法和应用 |
GB201610748D0 (en) * | 2016-06-20 | 2016-08-03 | Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen | Improved diffrentation method |
CN106190980A (zh) * | 2016-07-12 | 2016-12-07 | 张云霞 | 一种基于人食管癌组织用于体外培养食管癌肿瘤类器官的专用培养基及培养方法 |
US12104174B2 (en) | 2016-09-13 | 2024-10-01 | President And Fellows Of Harvard College | Methods relating to intestinal organ-on-a-chip |
US11180735B2 (en) | 2016-10-28 | 2021-11-23 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods to preserve tumor-stromal interactions in culture and therapeutic predictive applications thereof |
CN110382012B (zh) * | 2016-11-04 | 2023-08-25 | 儿童医院医学中心 | 肝类器官疾病模型以及其制备和使用方法 |
US20190284536A1 (en) * | 2016-11-21 | 2019-09-19 | Beijing Percans Oncology Co., Ltd. | Epithelial tumor cell cultures |
KR102558606B1 (ko) | 2016-12-05 | 2023-07-26 | 칠드런즈 호스피탈 메디칼 센터 | 결장 유사장기 및 이를 제조 및 사용하는 방법 |
EP3574019A4 (en) | 2017-01-26 | 2021-03-03 | Surrozen, Inc. | TISSUE SPECIFIC, WNT SIGNAL REINFORCEMENT MOLECULES AND USES THEREOF |
US10767164B2 (en) | 2017-03-30 | 2020-09-08 | The Research Foundation For The State University Of New York | Microenvironments for self-assembly of islet organoids from stem cells differentiation |
CN107012116A (zh) * | 2017-05-09 | 2017-08-04 | 华东师范大学 | 一种小肠3d类器官研究bcrp介导药物转运模型的构建方法与应用 |
WO2018218344A1 (en) * | 2017-05-29 | 2018-12-06 | Stemcell Technologies Canada Inc. | Compositions and methods for obtaining organoids |
CN109136188A (zh) * | 2017-06-15 | 2019-01-04 | 上海集技生物技术有限公司 | 一种活检肠道肿瘤类器官的培养、传代、冻存和复苏方法及其应用 |
CN108118026A (zh) * | 2017-11-29 | 2018-06-05 | 宁夏医科大学总医院 | 一种人子宫内膜腺上皮细胞的分离培养方法及优化培养基 |
BR112020010539A2 (pt) | 2017-11-30 | 2020-11-17 | Kyoto University | métodos para produção e para proliferação de células da crista neural, para produção de células nervosas, células da glia, células estromais mesenquimais, células ósseas, condrócitos, células da córnea ou células pigmentares e para cultivar células da crista neural, meio, estoque congelado, e, uso de um meio |
CN107841487A (zh) * | 2017-12-13 | 2018-03-27 | 章毅 | 培养味觉干细胞的方法 |
EP3530732A1 (en) | 2018-02-23 | 2019-08-28 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Ovarian cancer organoid culture |
CN110452875A (zh) * | 2018-05-07 | 2019-11-15 | 北京吉尚立德生物科技有限公司 | 一种用于培养肺癌实体瘤原代细胞的培养基 |
FR3081168B1 (fr) * | 2018-05-21 | 2022-03-11 | Univ Bordeaux | Systeme de culture cellulaire en bioreacteur |
CN110592018A (zh) * | 2018-06-13 | 2019-12-20 | 北京吉尚立德生物科技有限公司 | 一种结直肠癌实体瘤原代细胞的培养方法 |
SG11202101297UA (en) * | 2018-08-08 | 2021-03-30 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Method for culturing cancer tissue or tissue analogous to cancer tissue |
CN109055304B (zh) * | 2018-08-16 | 2021-12-07 | 洪玥 | 一种非柱状上皮干细胞培养基及培养方法 |
US11617745B2 (en) | 2018-08-17 | 2023-04-04 | Frequency Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for generating hair cells by downregulating FOXO |
CN109207428B (zh) * | 2018-09-12 | 2022-03-22 | 上海易对医生物医药科技有限公司 | 循环肿瘤细胞的分离和培养方法 |
WO2020066818A1 (ja) * | 2018-09-26 | 2020-04-02 | 株式会社オーガンテクノロジーズ | 毛包上皮性幹細胞の生体外増殖方法 |
CN111197024B (zh) * | 2018-11-16 | 2023-08-18 | 杭州捷诺飞生物科技股份有限公司 | 类胰腺结构体及其构建方法与应用 |
US20220135943A1 (en) | 2019-02-19 | 2022-05-05 | Miltenyi Biotec B.V. & Co.Kg | Cell culture medium and method for generation of epithelial organoids from epithelial stem cells |
CN109679913A (zh) * | 2019-02-26 | 2019-04-26 | 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院 | 嗅觉干细胞三维培养方法 |
GB201903573D0 (en) | 2019-03-15 | 2019-05-01 | Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen | Culture method for head and neck organoids |
GB201906978D0 (en) | 2019-05-17 | 2019-07-03 | Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen | Improved culture method using integrin agonist |
CN114667150A (zh) * | 2019-07-03 | 2022-06-24 | 康奈尔大学 | 胰岛和β-细胞类器官的功能性血管化的方法 |
EP3772538A1 (en) | 2019-08-09 | 2021-02-10 | Urosphere | Method for differentiating epithelial stem cells |
EP3789049A1 (en) * | 2019-09-06 | 2021-03-10 | QGel SA | Method for obtaining healthy intestinal organoids |
US11629385B2 (en) | 2019-11-22 | 2023-04-18 | Tempus Labs, Inc. | Tumor organoid culture compositions, systems, and methods |
MX2022006746A (es) | 2019-12-04 | 2022-06-14 | Precision Cancer Tech Inc | Metodo y kit para el crecimiento celular. |
JP2023505265A (ja) | 2019-12-05 | 2023-02-08 | テンパス・ラボズ・インコーポレイテッド | ハイスループット薬物スクリーニングのためのシステムおよび方法 |
US12031977B2 (en) | 2019-12-10 | 2024-07-09 | Massachusetts Institute Of Technology | Ex vivo system for determining multiple drug-drug transporter interactions and methods of use thereof |
GB202004706D0 (en) | 2020-03-31 | 2020-05-13 | Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen | Methods and tools for studying enteroendocrine cells |
CN113528425B (zh) * | 2020-04-15 | 2023-05-30 | 合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司 | 一种用于乳腺上皮肿瘤细胞的培养基和培养方法 |
US11561178B2 (en) | 2020-04-20 | 2023-01-24 | Tempus Labs, Inc. | Artificial fluorescent image systems and methods |
CN111534477B (zh) * | 2020-05-13 | 2021-12-21 | 江苏省人民医院(南京医科大学第一附属医院) | 小鼠肺组织原代上皮干细胞球培养方法 |
CN114085803B (zh) * | 2020-08-24 | 2024-04-26 | 北京大学 | 建立具有再生特性的类器官培养体系 |
GB202109913D0 (en) | 2021-07-09 | 2021-08-25 | Stichting Hubrecht Organoid Tech | Organoid-derived monolayers and uses thereof |
CN114134102A (zh) * | 2021-11-10 | 2022-03-04 | 杭州同创越诚基因科技有限公司 | 从结肠黏膜组织中分离隐窝并诱导产生结肠类器官的方法 |
CN114574426A (zh) * | 2022-01-25 | 2022-06-03 | 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一种鸭小肠隐窝干细胞分离鉴定和3d类器官培养的方法 |
GB202204266D0 (en) | 2022-03-25 | 2022-05-11 | Stichting Hubrecht Organoid Tech | Methods for co-culturing genotoxic bacteria and organoids |
WO2023217128A1 (zh) * | 2022-05-10 | 2023-11-16 | 上海赛立维生物科技有限公司 | 胃粘膜上皮前体样细胞及其制备方法和应用 |
CN115322948B (zh) * | 2022-07-20 | 2023-08-29 | 创芯国际生物科技(广州)有限公司 | 一种微量原代组织类器官培养前的扩增培养方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002018544A2 (en) * | 2000-08-31 | 2002-03-07 | Loyola University Chicago | Method and reagents for treatment of skin disorders by modulating the notch pathway |
WO2005117994A2 (en) * | 2004-06-03 | 2005-12-15 | Stowers Institute For Medical Research | Bmp pathway methods and compositions |
Family Cites Families (115)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5464758A (en) | 1993-06-14 | 1995-11-07 | Gossen; Manfred | Tight control of gene expression in eucaryotic cells by tetracycline-responsive promoters |
ATE208494T1 (de) | 1994-05-04 | 2001-11-15 | Mount Sinai Hospital Corp | Modulatoren der cytokine der tgf-beta überfamilie und verfahren zu ihrer bestimmung |
US6043092A (en) | 1996-03-18 | 2000-03-28 | University Of Pittsburgh | Cell culture media for mammalian cells |
US6133027A (en) | 1996-08-07 | 2000-10-17 | City Of Hope | Inducible expression system |
US6207455B1 (en) | 1997-05-01 | 2001-03-27 | Lung-Ji Chang | Lentiviral vectors |
AU741747B2 (en) | 1997-05-13 | 2001-12-06 | University Of North Carolina At Chapel Hill, The | Lentivirus-based gene transfer vectors |
US5994136A (en) | 1997-12-12 | 1999-11-30 | Cell Genesys, Inc. | Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors |
US6218181B1 (en) | 1998-03-18 | 2001-04-17 | The Salk Institute For Biological Studies | Retroviral packaging cell line |
EP0953633A1 (en) | 1998-04-28 | 1999-11-03 | Livercell L.L.C. | Cell culturing method and medium for producing proliferated, normal, differentiated human liver cells |
WO2000050049A2 (en) | 1999-02-24 | 2000-08-31 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Artificial salivary gland |
DE19909769A1 (de) | 1999-03-05 | 2000-09-07 | Bundesrepublik Deutschland Let | Von SIVagm abgeleitete lentivirale Vektoren, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung zur Genübertragung in Säugerzellen |
FR2794473B1 (fr) | 1999-06-03 | 2003-09-26 | Centre Nat Rech Scient | Procede de multiplication de cellules souches |
WO2001023528A1 (en) | 1999-09-27 | 2001-04-05 | University Of Florida Research Foundation | Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures |
JP2003530124A (ja) | 2000-04-05 | 2003-10-14 | 麒麟麦酒株式会社 | 新規幹細胞成長因子様ポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する方法および物質 |
JP2002247978A (ja) | 2001-02-23 | 2002-09-03 | Kazumori Funatsu | 肝細胞オルガノイドおよびその製造方法 |
US20030032034A1 (en) | 2001-03-05 | 2003-02-13 | Tang Y. Tom | Methods and materials relating to stem cell growth factor-like polypeptides and polynucleotides |
US7411052B2 (en) | 2001-03-05 | 2008-08-12 | Nuvelo, Inc. | Methods and materials relating to stem cell growth factor-like polypeptides and polynucleotides |
US20030003088A1 (en) * | 2001-05-03 | 2003-01-02 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Human pancreatic pluripotential stem cell line |
WO2003076564A2 (en) * | 2001-05-16 | 2003-09-18 | The General Hospital Corporation | Tissue-engineered organs |
AU2002331669A1 (en) * | 2001-08-23 | 2003-03-10 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | An organotypic intestinal culture and methods of use thereof |
JP4208715B2 (ja) | 2001-08-30 | 2009-01-14 | ヌヴェロ, インコーポレイテッド | 幹細胞増殖因子様ポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する方法および材料 |
EP1434796A2 (en) | 2001-10-03 | 2004-07-07 | Incyte Genomics, Inc. | Secreted proteins |
US20050053588A1 (en) | 2001-10-18 | 2005-03-10 | Li Yin | Conversion of liver stem and progenitor cells to pancreatic functional cells |
CA2692325C (en) * | 2001-12-07 | 2015-10-20 | Geron Corporation | Islet cells from human embryonic stem cells |
CA2469941A1 (en) | 2001-12-10 | 2003-07-03 | Nuvelo, Inc. | Novel nucleic acids and polypeptides |
GB0130738D0 (en) | 2001-12-21 | 2002-02-06 | Serono Internat S A | Protein |
US7193069B2 (en) | 2002-03-22 | 2007-03-20 | Research Association For Biotechnology | Full-length cDNA |
AU2003302702B2 (en) | 2002-12-05 | 2008-08-07 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | Cultured human pancreatic islets, and uses thereof |
EP1440981A3 (en) | 2003-01-21 | 2005-11-23 | Research Association for Biotechnology | Full-length human cdna |
US20070020637A1 (en) | 2003-01-21 | 2007-01-25 | Research Association For Biotechnology | Full-length cDNA |
US20060172304A1 (en) | 2003-02-27 | 2006-08-03 | Elaine Fuchs | Method for modulating epithelial stem cell lineage |
WO2004087896A2 (en) | 2003-03-31 | 2004-10-14 | Pfizer Products Inc. | Hepatocyte differentiation of stem cells |
US20040229355A1 (en) | 2003-05-14 | 2004-11-18 | Board Of Regents University Of Texas System | Culture medium for long-term culture of hepatocytes |
US20070010008A1 (en) | 2005-06-29 | 2007-01-11 | Tissuetech, Inc. | Ex vivo expansion of primary animal cells |
WO2005110009A2 (en) | 2003-07-22 | 2005-11-24 | Immunex Corporation | COMPOSITIONS AND METHODS RELATING TO TSP-30a, b, c AND d |
US20050058687A1 (en) | 2003-09-12 | 2005-03-17 | Becton, Dickinson And Company | Covalently attached collagen VI for cell attachment and proliferation |
SI2157192T1 (sl) | 2003-10-10 | 2013-11-29 | Deutsches Krebsforschungszentrum | Sestavki za diagnozo in terapijo bolezni, povezanih z aberantno ekspresijo Futrinov (R-Spondinov) |
WO2005040391A1 (en) | 2003-10-27 | 2005-05-06 | Murdoch Childrens Research Institute | Compositions and methods for differentiating stem cells |
TW200536859A (en) | 2004-01-27 | 2005-11-16 | Nuvelo Inc | Gastrointestinal proliferative factor and uses thereof |
SE0400974D0 (sv) | 2004-04-15 | 2004-04-15 | Cellmax Technologies Ab | Dipole design |
US7790458B2 (en) * | 2004-05-14 | 2010-09-07 | Becton, Dickinson And Company | Material and methods for the growth of hematopoietic stem cells |
SE0402734D0 (sv) | 2004-11-10 | 2004-11-10 | Anders Grubb | Antimiicrobial compounds |
US8597947B2 (en) | 2004-12-29 | 2013-12-03 | Hadasit Medical Research Services & Development Limited | Undifferentiated stem cell culture systems |
US7439327B2 (en) | 2005-01-18 | 2008-10-21 | Nuvelo, Inc. | Stem cell factor-like proteins and uses thereof |
US20060182724A1 (en) * | 2005-02-15 | 2006-08-17 | Riordan Neil H | Method for expansion of stem cells |
EP1860180A4 (en) | 2005-02-23 | 2009-03-11 | Found Biomedical Res & Innov | METHOD FOR IN VITRO AMPLIFICATION OF ENDOTHELIAL PROGENITOR CELL |
JP2006325444A (ja) | 2005-05-24 | 2006-12-07 | Toyobo Co Ltd | 細胞増殖培地 |
AU2006202209B2 (en) * | 2005-05-27 | 2011-04-14 | Lifescan, Inc. | Amniotic fluid derived cells |
WO2007013666A2 (en) | 2005-07-26 | 2007-02-01 | Kirin Pharma Kabushiki Kaisha | Anti-tumor agents comprising r-spondins |
WO2007030290A2 (en) | 2005-09-07 | 2007-03-15 | Maine Medical Center Research | Cristin/r-spondin ligands active in the wnt signaling pathway and methods, compositions and kits relating thereto |
CA2621161A1 (en) | 2005-09-08 | 2007-03-15 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Sec Retary Of The Department Of Health And Human Services | Methods for promoting stem cell proliferation and survival |
US20090118176A1 (en) | 2005-10-07 | 2009-05-07 | Emtage Peter C R | Stem Cell Factor-Like Protein Scfa1 and Uses Thereof |
JP5087004B2 (ja) | 2005-10-24 | 2012-11-28 | エージェンシー フォー サイエンス,テクノロジー アンド リサーチ | 中胚葉、内胚葉及び中内胚葉細胞の細胞運命を指定する方法 |
JP2007116926A (ja) | 2005-10-25 | 2007-05-17 | Reprocell Inc | 体外における幹細胞の維持と純化に関する方法、組成物およびシステム |
EP1792979A1 (en) | 2005-12-01 | 2007-06-06 | Stiftung Caesar Center of Advanced European Studies and Research | Cell culture system for the enrichment and expansion of stem cells |
US8673635B2 (en) | 2005-12-21 | 2014-03-18 | Universite Catholique De Louvain | Isolated liver stem cells |
SG10202109176RA (en) * | 2006-02-23 | 2021-09-29 | Viacyte Inc | Compositions and methods useful for culturing differentiable cells |
US7989204B2 (en) * | 2006-04-28 | 2011-08-02 | Viacyte, Inc. | Hepatocyte lineage cells |
EP4438720A2 (en) * | 2006-04-28 | 2024-10-02 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
US8741643B2 (en) * | 2006-04-28 | 2014-06-03 | Lifescan, Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage |
US8415153B2 (en) * | 2006-06-19 | 2013-04-09 | Geron Corporation | Differentiation and enrichment of islet-like cells from human pluripotent stem cells |
JP2008044926A (ja) | 2006-08-14 | 2008-02-28 | Trustees Of Columbia Univ In The City Of New York | Wnt信号伝達に関係した分泌タンパク質 |
JP2008061569A (ja) | 2006-09-07 | 2008-03-21 | Toyobo Co Ltd | 幹細胞の培養方法及びその培地 |
US8628964B2 (en) * | 2006-10-11 | 2014-01-14 | Drexel University | Fetal pulmonary cells and uses thereof |
AU2007312538B2 (en) | 2006-10-20 | 2012-10-04 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Offentlichen Rechts | Rspondins as modulators of angiogenesis and vasculogenesis |
RU2323252C1 (ru) | 2006-10-25 | 2008-04-27 | Антонина Ивановна Колесникова | Способ культивирования мезенхимальных стволовых клеток человека ex vivo |
US20080182328A1 (en) | 2006-12-19 | 2008-07-31 | The Burnham Institute | Mammalian extraembryonic endoderm cells and methods of isolation |
WO2008075796A1 (ja) | 2006-12-21 | 2008-06-26 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | 血球回復促進剤 |
WO2008088524A2 (en) | 2006-12-28 | 2008-07-24 | Nuvelo, Inc. | Thrombospondin-domain-deficient r-spondin 1 protein as gastrointestinal tract epithelial proliferation factor |
WO2008094597A2 (en) | 2007-01-30 | 2008-08-07 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Early mesoderm cells, a stable population of mesendoderm cells that has utility for generation of endoderm and mesoderm lineages and multipotent migratory cells (mmc) |
US20080233088A1 (en) * | 2007-02-16 | 2008-09-25 | Varian Medical Systems Technologies, Inc. | Preparative regimen for engraftment, growth and differentiation of non-hematopoeitic cells in vivo after transplantation |
CA2689658A1 (en) | 2007-06-20 | 2008-12-24 | Actogenix Nv | Methods and compositions for treating mucositis |
ES2553169T5 (es) | 2007-07-02 | 2023-11-30 | Oncomed Pharm Inc | Composiciones y métodos para el tratamiento y el diagnóstico del cáncer |
BRPI0814425A2 (pt) | 2007-07-18 | 2014-10-21 | Lifescan Inc | Diferenciação de células-tronco embrionárias humanas |
EP2022848A1 (en) | 2007-08-10 | 2009-02-11 | Hubrecht Institut | A method for identifying, expanding, and removing adult stem cells and cancer stem cells |
JP2009195142A (ja) | 2008-02-20 | 2009-09-03 | Institute Of Physical & Chemical Research | 肝臓卵形細胞の取得方法 |
US20110191868A1 (en) | 2008-04-10 | 2011-08-04 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods for identification and use of agents targeting cancer stem cells |
AU2009274517B2 (en) | 2008-07-25 | 2015-03-26 | The University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Compositions for Mesoderm derived ISL1+ Multipotent cells (IMPs), epicardial progenitor cells (EPCs) and multipotent CXCR4+CD56+ cells (C56Cs) and methods of use |
WO2010016766A2 (en) | 2008-08-08 | 2010-02-11 | Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen | Antibodies recognizing endogenous human lgr5 and/or lgr6 |
US9464275B2 (en) * | 2008-08-21 | 2016-10-11 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Ex vivo culture, proliferation and expansion of intestinal epithelium |
WO2010049752A1 (en) | 2008-10-31 | 2010-05-06 | Katholieke Universiteit Leuven | Optimized methods for differentiation of cells into cells with hepatocyte and hepatocyte progenitor phenotypes, cells produced by the methods, and methods for using the cells |
DK2373160T3 (en) | 2008-12-08 | 2018-01-02 | Soligenix Inc | TOPIC ACTIVE STEROIDS FOR USE IN RADIATION |
NO2373784T3 (ja) | 2008-12-17 | 2018-03-24 | ||
CA2751332C (en) | 2009-02-03 | 2024-04-02 | Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen | Culture medium for epithelial stem cells and organoids comprising said stem cells |
EP2412800A1 (en) | 2010-07-29 | 2012-02-01 | Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen | Liver organoid, uses thereof and culture method for obtaining them |
US9752124B2 (en) | 2009-02-03 | 2017-09-05 | Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen | Culture medium for epithelial stem cells and organoids comprising the stem cells |
GB201111244D0 (en) | 2011-06-30 | 2011-08-17 | Konink Nl Akademie Van Wetenschappen Knaw | Culture media for stem cells |
EP2408466B1 (en) | 2009-03-18 | 2015-10-21 | The Brigham and Women's Hospital, Inc. | Dikkopf2 (Dkk2) and active fragments thereof for use in the treatment of kidney or pancreas injuries |
US20120207744A1 (en) | 2009-03-19 | 2012-08-16 | Mendlein John D | Reprogramming compositions and methods of using the same |
US20120039912A1 (en) | 2009-04-15 | 2012-02-16 | Galapagos Sasu | Rspondin-3 inhibition in bone disorders |
WO2010129294A2 (en) | 2009-04-27 | 2010-11-11 | Schulz Thomas C | Small molecules supporting pluripotent cell growth and methods thereof |
US20110002897A1 (en) | 2009-06-11 | 2011-01-06 | Burnham Institute For Medical Research | Directed differentiation of stem cells |
EP3399026B1 (en) | 2010-06-14 | 2024-06-26 | The Scripps Research Institute | Reprogramming of cells to a new fate |
SG188666A1 (en) | 2010-09-30 | 2013-05-31 | Agency Science Tech & Res | Methods and reagents for detection and treatment of esophageal metaplasia |
KR102482184B1 (ko) | 2010-12-22 | 2022-12-28 | 페이트 세러퓨틱스, 인코포레이티드 | 단세포 분류 및 iPSC의 증강된 재프로그래밍을 위한 세포 배양 플랫폼 |
GB201106395D0 (en) | 2011-04-14 | 2011-06-01 | Hubrecht Inst | Compounds |
CA2839102A1 (en) | 2011-06-29 | 2013-01-03 | The Penn State Research Foundation | Compositions, methods and kits for treating leukemia |
US20130052729A1 (en) | 2011-08-29 | 2013-02-28 | Olivier Pourquie | Method for preparing induced paraxial mesoderm progenitor (ipam) cells and their use |
US9663573B2 (en) | 2011-10-05 | 2017-05-30 | Genentech, Inc. | Methods of treating liver conditions using Notch2 antagonists |
GB201117469D0 (en) | 2011-10-10 | 2011-11-23 | Cell Guidance Systems Ltd | Culture media for pluripotent stem cells |
US20140328808A1 (en) | 2011-10-27 | 2014-11-06 | National University Corporation Tokyo Medical And Dental University | Technique for isolating/culturing colorectal epithelial stem cell, and technique for transplanting colorectal epithelium employing said technique |
PT3045912T (pt) | 2011-12-19 | 2018-12-12 | Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen | Um ensaio quantitativo rápido para medir a função do cftr num modelo de cultura primária intestinal |
WO2014066649A1 (en) | 2012-10-26 | 2014-05-01 | The Regents Of The University Of California | A strategy for engineering various 3d tissues, organoids and vasculature |
EP2956538B1 (en) | 2013-02-13 | 2018-11-14 | Wake Forest University Health Sciences | Bioengineered liver constructs and methods relating thereto |
US20150368616A1 (en) | 2013-02-14 | 2015-12-24 | The Cleveland Clinic Foundation | Methods for induction of cell fates from pluripotent cells |
CN105121632B (zh) | 2013-02-18 | 2021-08-10 | 大学健康网络 | 由多能干细胞生成肝细胞和胆管细胞的方法 |
DK3702443T3 (da) | 2013-03-14 | 2022-04-04 | Brigham & Womens Hospital Inc | Sammensætninger og fremgangsmåder til opformering og dyrkning af epiteliale stamceller |
EP2970383B1 (en) | 2013-03-15 | 2021-04-21 | Board of Regents, The University of Texas System | Method of treating fibrosis |
AU2014255755B2 (en) | 2013-04-16 | 2018-10-25 | Orbsen Therapeutics Limited | Medical use of syndecan-2 |
WO2015173425A1 (en) | 2014-05-16 | 2015-11-19 | Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen | Improved culture method for organoids |
US11920164B2 (en) | 2014-07-30 | 2024-03-05 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Media for culturing naive human pluripotent stem cells |
JP2017534269A (ja) | 2014-10-08 | 2017-11-24 | エージェンシー フォー サイエンス,テクノロジー アンド リサーチ | 幹細胞を肝臓細胞系譜に分化させる方法 |
GB201421092D0 (en) | 2014-11-27 | 2015-01-14 | Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen | Culture medium |
GB201421094D0 (en) | 2014-11-27 | 2015-01-14 | Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen | Culture medium |
EP3690022A1 (en) | 2016-05-18 | 2020-08-05 | Keio University | Cell culture medium for culturing organoid, culture method, and organoid |
-
2010
- 2010-02-03 CA CA2751332A patent/CA2751332C/en active Active
- 2010-02-03 HR HRP20230650TT patent/HRP20230650T1/hr unknown
- 2010-02-03 EP EP23176802.9A patent/EP4253529A3/en active Pending
- 2010-02-03 PL PL16151949T patent/PL3061808T3/pl unknown
- 2010-02-03 PL PL10703131.2T patent/PL2393917T3/pl unknown
- 2010-02-03 ES ES18182285T patent/ES2948761T3/es active Active
- 2010-02-03 HU HUE18182285A patent/HUE062459T2/hu unknown
- 2010-02-03 PL PL18182285.9T patent/PL3441458T3/pl unknown
- 2010-02-03 US US13/147,163 patent/US8642339B2/en active Active
- 2010-02-03 DK DK16151949.1T patent/DK3061808T3/da active
- 2010-02-03 ES ES10703131.2T patent/ES2579909T3/es active Active
- 2010-02-03 NZ NZ594271A patent/NZ594271A/en unknown
- 2010-02-03 RU RU2011136704/10A patent/RU2555545C2/ru active
- 2010-02-03 MX MX2011008044A patent/MX2011008044A/es active IP Right Grant
- 2010-02-03 CN CN201080013109.9A patent/CN102439135B/zh active Active
- 2010-02-03 JP JP2011547839A patent/JP5458112B2/ja active Active
- 2010-02-03 SG SG2011055399A patent/SG173492A1/en unknown
- 2010-02-03 KR KR1020117020340A patent/KR101904224B1/ko active IP Right Grant
- 2010-02-03 AU AU2010211428A patent/AU2010211428B2/en active Active
- 2010-02-03 EP EP18182285.9A patent/EP3441458B9/en active Active
- 2010-02-03 EP EP10703131.2A patent/EP2393917B1/en active Active
- 2010-02-03 HU HUE10703131A patent/HUE028647T2/en unknown
- 2010-02-03 WO PCT/NL2010/000017 patent/WO2010090513A2/en active Application Filing
- 2010-02-03 EP EP16151949.1A patent/EP3061808B1/en active Active
- 2010-02-03 DK DK10703131.2T patent/DK2393917T3/en active
-
2011
- 2011-08-01 IL IL214381A patent/IL214381A/en active IP Right Grant
-
2012
- 2012-05-08 HK HK12104502.9A patent/HK1163746A1/zh unknown
- 2012-07-17 JP JP2012158676A patent/JP5722835B2/ja active Active
-
2013
- 2013-11-13 US US14/079,545 patent/US10947510B2/en active Active
-
2016
- 2016-07-05 HR HRP20160791TT patent/HRP20160791T1/hr unknown
-
2018
- 2018-08-27 US US16/113,445 patent/US20190100728A1/en active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002018544A2 (en) * | 2000-08-31 | 2002-03-07 | Loyola University Chicago | Method and reagents for treatment of skin disorders by modulating the notch pathway |
WO2005117994A2 (en) * | 2004-06-03 | 2005-12-15 | Stowers Institute For Medical Research | Bmp pathway methods and compositions |
Non-Patent Citations (19)
Title |
---|
JPN6012001842; J.Cell.'Physiol. Vol.200, 2004, p.31-44 * |
JPN6012001843; Dev.Biol. Vol.245, 2002, p.187-199 * |
JPN6012001844; 実験医学 Vol.16, No.3, 1998, p.200-229 * |
JPN6012001845; Exp.Cell.Res. Vol.260, 2000, p.1-8 * |
JPN6012001846; 感染・炎症・免疫 Vol.34, No.2, 2004, p.40-52 * |
JPN6012045969; G.I.Research Vol.12, No.2, 2004, p.3-10 * |
JPN6012045970; Gastroenterology Vol.128, No.4, Suppl.2, 2005, p.A702 * |
JPN6012045971; J.Gastroenterol. Vol.29, 1994, p.59-62 * |
JPN6012045972; 生化学 抄録, 2007, 3P-1232 * |
JPN6012045974; J.Biosci.Bioeng. Vol.106, No.3, 2008, p.237-242 * |
JPN6012045976; バイオテクノロジージャーナル Vol.11-12, 2007, p.701-705 * |
JPN6012045977; Biochem.Biophys.Res.Commun. Vol.374, 2008, p.356-360 * |
JPN6013016570; Stem Cells Vol.22, 2004, p.265-274 * |
JPN6013016572; Biochem.Biophys.Res.Commun. Vol.346, 2006, p.131-139 * |
JPN6013016574; Exp.Neurol. Vol.201, 2006, p.525-529 * |
JPN6013016575; J.Surg.Res. Vol.56, 1994, p.500-504 * |
JPN6013016578; IOVS Vol.43, No.4, 2002, p.987-994 * |
JPN6013016580; Nature Vol.449, 2007, p.1003-1007 * |
JPN6013016582; Nature Med. Vol.15, No.6, 200906, p.701-706 * |
Cited By (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013535201A (ja) * | 2010-07-29 | 2013-09-12 | コーニンクレッカ ネザーランド アカデミー ヴァン ウェテンシャッペン | 肝臓オルガノイド、その使用、およびそれを得るための培養方法 |
JP2016512958A (ja) * | 2013-02-25 | 2016-05-12 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | 上皮幹細胞の液体培養 |
JP2016513469A (ja) * | 2013-03-15 | 2016-05-16 | ザ ジャクソン ラボラトリー | 非胚性幹細胞の単離とその使用 |
JP2020018321A (ja) * | 2013-03-15 | 2020-02-06 | ザ ジャクソン ラボラトリーThe Jackson Laboratory | 非胚性幹細胞の単離とその使用 |
JP2016533745A (ja) * | 2013-08-20 | 2016-11-04 | シーシービー − セントロ デ クリオジェニア ブラジル エルティーディーエー.Ccb − Centro De Criogenia Brasil Ltda. | 多能性幹細胞及び前駆細胞を生産するためのプロセス |
JP2020014477A (ja) * | 2013-12-16 | 2020-01-30 | フレゼニウス メディカル ケア ドイッチェランド ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 膵島様細胞構造体及びそれを調製する方法 |
JP7560944B2 (ja) | 2013-12-16 | 2024-10-03 | フレゼニウス メディカル ケア ドイッチェランド ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 膵島様細胞構造体及びそれを調製する方法 |
JP2015149949A (ja) * | 2014-02-17 | 2015-08-24 | 学校法人明治大学 | 免疫抑制剤の評価方法、及び免疫抑制剤評価キット |
JP7059317B2 (ja) | 2014-05-28 | 2022-04-25 | チルドレンズ ホスピタル メディカル センター | 前駆細胞を指向性分化によって胃組織に変換するための方法及びシステム |
JP2020115872A (ja) * | 2014-05-28 | 2020-08-06 | チルドレンズ ホスピタル メディカル センター | 前駆細胞を指向性分化によって胃組織に変換するための方法及びシステム |
JP2017522016A (ja) * | 2014-06-27 | 2017-08-10 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 培養哺乳動物輪部幹細胞、その産生方法及びその使用 |
US11142577B2 (en) | 2014-09-12 | 2021-10-12 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | WNT signaling agonist molecules |
JP2020186267A (ja) * | 2014-09-12 | 2020-11-19 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | Wntシグナリングアゴニスト分子 |
JP2017530099A (ja) * | 2014-09-12 | 2017-10-12 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | Wntシグナリングアゴニスト分子 |
JP2017532964A (ja) * | 2014-10-17 | 2017-11-09 | チルドレンズ ホスピタル メディカル センター | 多能性幹細胞を使用するヒト小腸のin vivoモデル、並びにそれを作製、及び使用する方法 |
JPWO2017199811A1 (ja) * | 2016-05-18 | 2019-04-11 | 学校法人慶應義塾 | オルガノイド培養用細胞培養培地、培養方法、及びオルガノイド |
JP7367951B2 (ja) | 2016-05-18 | 2023-10-24 | 慶應義塾 | オルガノイド培養用細胞培養培地 |
JPWO2018038042A1 (ja) * | 2016-08-24 | 2019-06-20 | 学校法人慶應義塾 | ヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用2dオルガノイド及びその使用 |
WO2018038042A1 (ja) * | 2016-08-24 | 2018-03-01 | 学校法人慶應義塾 | ヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用2dオルガノイド及びその使用 |
US11746150B2 (en) | 2017-12-19 | 2023-09-05 | Surrozen Operating, Inc. | Anti-LRP5/6 antibodies and methods of use |
US11773171B2 (en) | 2017-12-19 | 2023-10-03 | Surrozen Operating, Inc. | WNT surrogate molecules and uses thereof |
US12006368B2 (en) | 2017-12-19 | 2024-06-11 | Surrozen Operating, Inc. | Anti-frizzled antibodies and methods of use |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5722835B2 (ja) | 上皮幹細胞および該幹細胞を含むオルガノイドのための培養培地 | |
JP7275196B2 (ja) | 幹細胞のための培養培地 | |
US20180072995A1 (en) | Culture medium for epithelial stem cells and organoids comprising the stem cells | |
ES2825713T3 (es) | Medio de cultivo para células madre epiteliales y organoides que comprenden dichas células madre |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20120418 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120717 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120903 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20121127 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20121204 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130301 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20130410 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130809 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20130809 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130930 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20130930 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20131022 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20131127 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20131128 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20131219 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20140110 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5458112 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |