BR112020010539A2

BR112020010539A2 - métodos para produção e para proliferação de células da crista neural, para produção de células nervosas, células da glia, células estromais mesenquimais, células ósseas, condrócitos, células da córnea ou células pigmentares e para cultivar células da crista neural, meio, estoque congelado, e, uso de um meio

Info

Publication number: BR112020010539A2
Application number: BR112020010539-2A
Authority: BR
Inventors: Makoto Ikeya; Yayoi Kamiya
Original assignee: Kyoto University; Takeda Pharmaceutical Company Limited
Priority date: 2017-11-30
Filing date: 2018-11-29
Publication date: 2020-11-17
Also published as: TW201940693A; CO2020007772A2; EP3719120A4; MX2020005668A; KR20200091885A; EP3719120A1; AU2018376391A1; JPWO2019107485A1; WO2019107485A1; US20210002608A1; CA3083253A1; US11959100B2; EA202091354A1; CN111492052A; JP7330466B2; IL274746A; JP2023093693A; SG11202004964WA

Abstract

Como uma técnica para propagar células da crista neural sem reduzir a capacidade de diferenciação, é provido um método para a produção de células da crista neural que inclui (1) uma etapa para obter células da crista neural e (2) uma etapa para cultivar em suspensão as células da crista neural em meio contendo um inibidor de GSK3¿ e um fator de crescimento de fibroblastos básico (bFGF), o meio incluindo o inibidor de GSK3¿ de uma concentração que exibe um efeito equivalente ao efeito exibido por CHIR99021 de uma concentração de mais que 1 ¿M a menos que 5 ¿M.

Description

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MÉTODOS PARA PRODUÇÃO E PARA PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS DA CRISTA NEURAL, PARA PRODUÇÃO DE CÉLULAS NERVOSAS, CÉLULAS DA GLIA, CÉLULAS ESTROMAIS MESENQUIMAIS, CÉLULAS ÓSSEAS, CONDRÓCITOS, CÉLULAS DA CÓRNEA OU CÉLULAS PIGMENTARES E PARA CULTIVAR CÉLULAS DA CRISTA NEURAL, MEIO, ESTOQUE CONGELADO, E,

USO DE UM MEIO Campo técnico

[001] A presente invenção refere-se a um método para a produção de células da crista neural, um método para permitir a proliferação de células da crista neural, um meio, um estoque congelado e um método para produzir vários tipos de células a partir de células da crista neural. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a um método para produzir células da crista neural, um método para permitir a proliferação de células da crista neural, um meio para uso nesses métodos, um estoque congelado que compreende células da crista neural e um método para produzir vários tipos de células nas quais a diferenciação de células da crista neural pode ser induzida. Fundamentos da Invenção

[002] As células da crista neural (NCCs) são células que se desenvolvem entre a neuroectoderme e a ectoderme epidérmica quando o tubo neural é formado a partir da placa neural durante o desenvolvimento inicial. Essas células têm multipotência para se diferenciar em muitos tipos de células, como células nervosas, células da glia, células estromais mesenquimais, células ósseas, condrócitos, células da córnea e células pigmentares, e a capacidade de se autoproliferar. Essa multipotência e capacidade de autoproliferação indicam a utilidade das células da crista neural como um medicamento celular para medicina regenerativa. Assim, existe uma demanda por uma técnica para manutenção ou proliferação eficiente de

2 / 48 células da crista neural.

[003] A Literatura Não Patentária 1 afirma que as células da crista neural são induzidas a partir de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (iPSCs), e as células estromais mesenquimais ou semelhantes são induzidas adicionalmente a partir das células da crista neural. Na literatura Não Patentária 1, as células da crista neural são cultivadas para manutenção por cultura aderente usando um meio suplementado com um inibidor de TGFβ, um fator de crescimento epidérmico (EGF) e um fator de crescimento de fibroblastos básico (bFGF (também conhecido como FGF2)).

[004] A Literatura Não Patentária 2 afirma que as células da crista neural são induzidas a partir do tubo neural embrionário de galinhas, e as células da glia ou similares são induzidas a partir das células da crista neural. Na literatura Não Patentária 2, as células da crista neural são cultivadas para manutenção por cultura em suspensão usando um meio suplementado com extratos embrionários de galinha, um fator de crescimento semelhante à insulina (IGF), bFGF e ácido retinoico (AR).

[005] A Literatura Não Patentária 3 afirma que as células da crista neural são induzidas a partir de células-tronco embrionárias humanas (ESCs) ou iPSCs humanas, e células musculares lisas ou semelhantes são adicionalmente induzidas a partir das células da crista neural. Na literatura Não Patentária 3, as células da crista neural são cultivadas para manutenção por cultura aderente usando um meio suplementado com um inibidor de GSK3β e um inibidor de TGFβ.

[006] A Literatura Não Patentária 4 afirma que as células da crista neural são induzidas a partir de iPSCs humanas e mantidas por cultura aderente ou cultura em suspensão usando um meio suplementado com um inibidor de GSK3β, um inibidor de TGFβ, EGF e bFGF. A Literatura Não Patentária 4 relata que o número e a proporção de células da crista neural em uma população de células cultivadas sob a cultura de manutenção por cultura

3 / 48 aderente foram diminuídos de maneira dependente da concentração dentro da faixa de concentração de bFGF de 0 pg/ml a 10 ng/ml (veja as figuras 5A a 5C). Na cultura de manutenção por cultura em suspensão, a presença de células positivas para Sox10 foi confirmada por cultura por 7 dias usando CHIR99021 1 µM como inibidor de GSK3µ. No entanto, se as células tinham multipotência não foi determinado.

[007] Nenhuma das Literaturas Não Patentária 1 a 4 descreve que as células da crista neural são mantidas e deixadas proliferando em cultura em suspensão usando um meio suplementado com CHIR99021 com uma concentração superior a 1 µM e bFGF. Lista de citações Literatura Não Patentária

[008] Literatura Não Patentária 1: Fukuta M. et al., “Derivation of mesenchymal stromal cells from pluripotent stem cells through a neural crest lineage using small molecule compounds with defined media.”, PLoS One, 2014, 9(12):e112291.

[009] Literatura Não Patentária 2: Kerosuo L. et al., “Crestospheres: Long-Term Maintenance of Multipotent, Premigratory Neural Crest Stem Cells.”, Stem Cell Reports, 2015, 5(4):499-507.

[0010] Literatura Não Patentária 3: Menendez L. et al., “Wnt signaling and a Smad pathway blockade direct the differentiation of human pluripotent stem cells to multipotent neural crest cells.”, Proc. Natl. Acad. Sci., 2011, 108(48):19240-5.

[0011] Literatura Não Patentária 4: Horikiri T. et al., “SOX10-Nano- Lantern Reporter Human iPS Cells; A Versatile Tool for Neural Crest Research.”, PLoS One, 2017, 12(1):e0170342. Sumário da invenção Problema técnico

[0012] As células da crista neural possuem originalmente

4 / 48 multipotência para se diferenciar em muitos tipos de células, como células nervosas, células da glia, células estromais mesenquimais, células ósseas, condrócitos, células da córnea e células pigmentares. No entanto, sabe-se que a cultura das células da crista neural reduz gradualmente a multipotência e diminui os tipos de células nas quais as células da crista neural podem se diferenciar.

[0013] Um objetivo principal da presente invenção é prover uma técnica para cultura e proliferação durante um longo período de células da crista neural que mantêm a multipotência. Solução para o Problema

[0014] Para alcançar o objetivo, a presente invenção provê os seguintes [1] a [21b].

[0015] [1] Um método para produção de células da crista neural, compreendendo as etapas de: obter células da crista neural; e cultivar em suspensão as células da crista neural em um meio compreendendo um inibidor de GSK3β e um fator de crescimento de fibroblastos básico (bFGF), em que o meio compreende o inibidor de GSK3β com uma concentração que exibe um efeito equivalente ao exibido por CHIR99021 com uma concentração superior a 1 µM.

[0016] [1a] O método de produção de acordo com [1], em que a concentração do inibidor de GSK3β é uma concentração que exibe um efeito equivalente ao exibido por CHIR99021 com uma concentração maior que 1 µM e menor que 5 µM.

[0017] [1b] O método de produção de acordo com [1], em que o efeito é avaliado com base na atividade inibidora de GSK3β do inibidor de GSK3β, em que a atividade inibidora de GSK3β do inibidor de GSK3β é determinada pelos procedimentos de: cultivar células cuja expressão do gene repórter é suprimida

5 / 48 sob o controle de GSK3β, na presença e na ausência do inibidor de GSK3β; medir um nível de expressão do gene repórter na presença e ausência do inibidor de GSK3β; e determinar a atividade inibidora de GSK3β do inibidor de GSK3β com base em uma quantidade de aumento no nível de expressão do gene repórter na presença do inibidor de GSK3β em relação ao nível de expressão do gene repórter na ausência do inibidor de GSK3β.

[0018] [2] O método de produção de acordo com [1], em que o meio compreende adicionalmente um inibidor de TGFβ.

[0019] [3] O método de produção de acordo com [1], em que o meio é meio CDM.

[0020] [4] O método de produção de acordo com [1], em que o meio compreende adicionalmente um fator de crescimento epidérmico (EGF).

[0021] [5] O método de produção de acordo com [1], em que o inibidor de GSK3β é pelo menos um elemento selecionado a partir do grupo que consiste em CHIR99021, CP21R7, CHIR98014, LY2090314, kenpaullone, AR-AO144-18, TDZD-8, SB216763, BIO, TWS-119 e SB415286.

[0022] [6] O método de produção de acordo com [5], em que o inibidor de GSK3β é CHIR99021.

[0023] [6a] O método de produção de acordo com [6], em que o CHIR99021 tem uma concentração maior que 1 µM e menor que 5 µM.

[0024] [6b] O método de produção de acordo com [6a], em que o CHIR99021 tem uma concentração de 2 ou superior e 4,5 µM ou inferior.

[0025] [6c] O método de produção de acordo com [5], em que o inibidor de GSK3β é CP21R7.

[0026] [6d] O método de produção de acordo com [6c], em que o CP21R7 tem uma concentração de 0,5 ou superior e 1 µM ou inferior.

[0027] [7] O método de produção de acordo com [2], em que o

6 / 48 inibidor de TGFβ é pelo menos um elemento selecionado a partir do grupo que consiste em SB431542, A83-01, LDN193189, Wnt3a/BIO, BMP4, GW788388, SM16, IN-1130, GW6604 e SB505124.

[0028] [7a] O método de produção de acordo com qualquer um dos

[1] a [7], em que o bFGF tem uma concentração de 20 a 40 ng/ml.

[0029] [8] O método de produção de acordo com [1], em que na etapa (2), as células da crista neural são passadas a cada 5 a 8 dias após a inoculação.

[0030] [9] O método de produção de acordo com [1], em que a etapa (1) é a etapa de induzir a diferenciação de células-tronco em células da crista neural.

[0031] [10] Um método para proliferação de células da crista neural, compreendendo a etapa de:

[0032] cultivar em suspensão as células da crista neural em um meio compreendendo um inibidor de GSK3β e um fator de crescimento de fibroblastos básico (bFGF), em que o meio compreende o inibidor de GSK3β com uma concentração que exibe um efeito equivalente ao exibido por CHIR99021 com uma concentração superior a 1 µM.

[0033] [10a] O método de proliferação de acordo com [10], em que a concentração do inibidor de GSK3β é uma concentração que exibe um efeito equivalente ao exibido por CHIR99021 com uma concentração maior que 1 µM e menor que 5 µM.

[0034] [10b] O método de proliferação de acordo com [10], em que o meio compreende adicionalmente um inibidor de TGFβ.

[0035] [10c] O método de proliferação de acordo com [10], em que o meio é meio CDM.

[0036] [10d] O método de proliferação de acordo com [10], em que o meio compreende adicionalmente um fator de crescimento epidérmico (EGF).

[0037] [10e] O método de proliferação de acordo com [10], em que o

7 / 48 inibidor de GSK3β é pelo menos um elemento selecionado do grupo que consiste em CHIR99021, CP21R7, CHIR98014, LY2090314, kenpaullone, AR-AO144-18, TDZD-8, SB216763, BIO, TWS-119 e SB415286.

[0038] [10f] O método de proliferação de acordo com [10e], em que o inibidor de GSK3β é CHIR99021.

[0039] [10g] O método de proliferação de acordo com [10f], em que o CHIR99021 tem uma concentração maior que 1 µM e menor que 5 µM.

[0040] [10h] O método de proliferação de acordo com [10g], em que o CHIR99021 tem uma concentração de 2 ou superior e 4,5 µM ou inferior.

[0041] [10i] O método de proliferação de acordo com [10e], em que o inibidor de GSK3β é CP21R7.

[0042] [10j] O método de proliferação de acordo com [10i], em que o CP21R7 tem uma concentração de 0,5 ou superior e 1 µM ou inferior.

[0043] [10k] O método de proliferação de acordo com [10b], em que o inibidor de TGFβ é pelo menos um elemento selecionado a partir do grupo que consiste em SB431542, A83-01, LDN193189, Wnt3a/BIO, BMP4, GW788388, SM16, IN-1130, GW6604 e SB505124.

[0044] [10l] O método de proliferação de acordo com [10], em que na etapa (I), as células da crista neural são passadas a cada 5 a 8 dias após a inoculação.

[0045] [11] Um meio compreendendo um inibidor de GSK3β, um fator de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) e células da crista neural, em que o meio compreende o inibidor de GSK3β com uma concentração que exibe um efeito equivalente ao exibido por CHIR99021 com uma concentração superior a 1 µM.

[0046] [11a] O meio de acordo com [11], em que a concentração do inibidor de GSK3β é uma concentração que exibe um efeito equivalente ao exibido por CHIR99021 com uma concentração maior que 1 µM e menor que 5 µM.

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[0047] [12] O meio de acordo com [11], compreendendo adicionalmente um inibidor de TGFβ.

[0048] [13] O meio de acordo com [11], em que o meio é meio CDM.

[0049] [14] O meio de acordo com [11], compreendendo adicionalmente um fator de crescimento epidérmico (EGF).

[0050] [15] O meio de acordo com [11], em que o inibidor de GSK3β é pelo menos um elemento selecionado do grupo que consiste em CHIR99021, CP21R7, CHIR98014, LY2090314, kenpaullone, AR-AO144- 18, TDZD-8, SB216763, BIO, TWS-119 e SB415286.

[0051] [16] O meio de acordo com [15], em que o inibidor de GSK3 é CHIR99021.

[0052] [16a] O meio de acordo com [16], em que o CHIR99021 tem uma concentração maior que 1 µM e menor que 5 µM.

[0053] [16b] O meio de acordo com [16a], em que o CHIR99021 tem uma concentração de 2 ou superior e 4,5 µM ou inferior.

[0054] [16c] O meio de acordo com [15], em que o inibidor de GSK3β é CP21R7.

[0055] [16d] O meio de acordo com [16c], em que o CP21R7 tem uma concentração de 0,5 ou superior e 1 µM ou inferior.

[0056] [17] O meio de acordo com [12], em que o inibidor de TGFβ é pelo menos um elemento selecionado a partir do grupo que consiste em SB431542, A83-01, LDN193189, Wnt3a/BIO, BMP4, GW788388, SM16, IN-1130, GW6604 e SB505124.

[0057] [18] Um estoque congelado compreendendo células da crista neural obtidas por um método de produção de acordo com [1].

[0058] [18a] O estoque congelado de acordo com [18], em que o estoque congelado é obtido pelas etapas de: separar as células da crista neural obtidas pelas etapas do método de produção de acordo com [1]; e

9 / 48 suspender as células da crista neural separadas em uma solução de conservação celular, seguida de congelamento.

[0059] [19] Um método para produção de células nervosas, células da glia, células estromais mesenquimais, células ósseas, condrócitos, células da córnea ou células pigmentares, compreendendo as etapas de: cultivar em suspensão células da crista neural em um meio compreendendo um inibidor de GSK3β e um fator de crescimento de fibroblastos básico (bFGF), em que o meio compreende o inibidor de GSK3β com uma concentração que exibe um efeito equivalente ao exibido por CHIR99021 com uma concentração superior a 1 µM; e diferenciar as células da crista neural obtidas na etapa (i) em células de pelo menos uma linhagem selecionada a partir do grupo que consiste em células nervosas, células da glia, células estromais mesenquimais, células ósseas, condrócitos, células da córnea e células pigmentares.

[0060] [19a] O método de produção de acordo com [19], em que a concentração do inibidor de GSK3β é uma concentração que exibe um efeito equivalente ao exibido por CHIR99021 com uma concentração maior que 1 µM e menor que 5 µM.

[0061] [19b] O método de produção de acordo com [19], em que o meio compreende adicionalmente um inibidor de TGFβ.

[0062] [19c] O método de produção de acordo com [19], em que o meio é meio CDM.

[0063] [19d] O método de produção de acordo com [19], em que o meio compreende adicionalmente um fator de crescimento epidérmico (EGF).

[0064] [19e] O método de produção de acordo com [19], em que o inibidor de GSK3β é pelo menos um elemento selecionado a partir do grupo que consiste em CHIR99021, CP21R7, CHIR98014, LY2090314, kenpaullone, AR-AO144-18, TDZD-8, SB216763, BIO, TWS-119 e SB415286.

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[0065] [19f] O método de produção de acordo com [19e], em que o inibidor de GSK3β é CHIR99021.

[0066] [19g] O método de produção de acordo com [19f], em que o CHIR99021 tem uma concentração maior que 1 µM e menor que 5 µM.

[0067] [19h] O meio de acordo com [19g], em que o CHIR99021 tem uma concentração de 2 ou superior e 4,5 µM ou inferior.

[0068] [19i] O meio de acordo com [19e], em que o inibidor de GSK3β é CP21R7.

[0069] [19j] O método de produção de acordo com [19i], em que o CP21R7 tem uma concentração de 0,5 ou superior e 1 µM ou inferior.

[0070] [19k] O método de produção de acordo com [19b], em que o inibidor de TGFβ é pelo menos um elemento selecionado a partir do grupo que consiste em SB431542, A83-01, LDN193189, Wnt3a/BIO, BMP4, GW788388, SM16, IN-1130, GW6604 e SB505124.

[0071] [19l] O método de produção de acordo com [19], em que na etapa (I), as células da crista neural são passadas a cada 5 a 8 dias após a inoculação.

[0072] [20] Um método para cultivar células da crista neural com multipotência por um longo período, compreendendo as etapas de: obter célula da crista neural; e cultivar em suspensão as células da crista neural em um meio compreendendo um inibidor de GSK3 e um fator de crescimento de fibroblastos básico, em que o meio compreende o inibidor de GSK3β com uma concentração que exibe um efeito equivalente ao exibido por CHIR99021 com uma concentração superior a 1 µM.

[0073] [20a] O método de cultura de acordo com [20], em que a concentração do inibidor de GSK3β é uma concentração que exibe um efeito equivalente ao exibido por CHIR99021 com uma concentração maior que 1 µM e menor que 5 µM.

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[0074] [20b] O método de cultura de acordo com [20], em que o meio compreende adicionalmente um inibidor de TGFβ.

[0075] [20c] O método de cultura de acordo com [20], em que o meio é meio CDM.

[0076] [20d] O método de cultura de acordo com [20], em que o meio compreende adicionalmente um fator de crescimento epidérmico (EGF).

[0077] [20e] O método de cultura de acordo com [20], em que o inibidor de GSK3β é pelo menos um elemento selecionado a partir do grupo que consiste em CHIR99021, CP21R7, CHIR98014, LY2090314, kenpaullone, AR-AO144-18, TDZD-8, SB216763, BIO, TWS-119 e SB415286.

[0078] [20f] O método de cultura de acordo com [20e], em que o inibidor de GSK3β é CHIR99021.

[0079] [20g] O método de cultura de acordo com [20f], em que o CHIR99021 tem uma concentração maior que 1 µM e menor que 5 µM.

[0080] [20h] O método de cultura de acordo com [20g], em que o CHIR99021 tem uma concentração de 2 ou superior e 4,5 µM ou inferior.

[0081] [20i] O método de cultura de acordo com [20e], em que o inibidor de GSK3β é CP21R7.

[0082] [20j] O método de cultura de acordo com [20i], em que o CP21R7 tem uma concentração de 0,5 ou superior e 1 µM ou inferior.

[0083] [20k] O método de cultura de acordo com [20b], em que o inibidor de TGFβ é pelo menos um elemento selecionado a partir do grupo que consiste em SB431542, A83-01, LDN193189, Wnt3a/BIO, BMP4, GW788388, SM16, IN-1130, GW6604 e SB505124.

[0084] [20l] O método de cultura de acordo com [20], em que na etapa (I), as células da crista neural são passadas a cada 5 a 8 dias após a inoculação.

[0085] [21] Uso de um meio que compreende um fator de crescimento

12 / 48 de fibroblastos básico e um inibidor de GSK3β com uma concentração que exibe um efeito equivalente ao exibido por CHIR99021 com uma concentração superior a 1 µM, para cultura de células da crista neural com multipotência por um longo período.

[0086] [21a] Uso de um fator de crescimento de fibroblastos básico e um inibidor de GSK3β com uma concentração que exibe um efeito equivalente ao exibido por CHIR99021 com uma concentração superior a 1 µM, para cultura de células da crista neural.

[0087] [21b] Uso de um fator de crescimento de fibroblastos básico e um inibidor de GSK3β com uma concentração que exibe um efeito equivalente ao exibido por CHIR99021 com uma concentração 1 µM, para produzir um meio de células da crista neural.

[0088] Como aqui utilizado, “pluripotência” significa a capacidade de se diferenciar em tecidos e células com várias formas e funções diferentes e de se diferenciar em células de qualquer linhagem das 3 camadas germinativas. “Pluripotência” é diferente de “totipotência”, que é a capacidade de se diferenciar em qualquer tecido do corpo vivo, incluindo a placenta, pois as células pluripotentes não podem se diferenciar na placenta e, portanto, não têm a capacidade de formar um indivíduo.

[0089] “Multipotência” significa a capacidade de ser capaz de se diferenciar em várias e em um número limitado de linhas de células. Por exemplo, células-tronco mesenquimais, células-tronco hematopoiéticas, células-tronco neurais são multipotentes, mas não pluripotentes. As células da crista neural têm multipotência para se diferenciar em células como células nervosas, células da glia, células estromais mesenquimais, células ósseas, condrócitos, células da córnea e células pigmentares.

[0090] Como aqui utilizado, “cultura” refere-se à manutenção, proliferação (crescimento) e/ou diferenciação de células em ambiente in vitro. “Cultivo” significa manter as células e/ou permitir que as células proliferem

13 / 48 (cresçam) e/ou se diferenciem do tecido ou do corpo, por exemplo, em uma placa de cultura de células ou em um frasco.

[0091] “Cultura aderente” significa a cultura em um estado em que as células estão anexadas a um recipiente, por exemplo, em um estado em que as células estão anexadas a uma placa de cultura celular ou a um frasco feito de plástico esterilizado (ou plástico revestido) na presença de um meio apropriado.

[0092] “Cultura em suspensão” significa cultura em um estado em que as células são dispersas como células únicas ou como esferas celulares, cada uma consistindo em duas ou mais células em um meio apropriado sem estar anexada a um recipiente.

[0093] “Cultura de expansão” significa cultura com o objetivo de permitir a proliferação de células desejadas.

[0094] “Inibidor da GSK3β“ é uma substância com atividade inibidora contra GSK3β (glicogênio sintase quinase 3β). A GSK3 (glicogênio sintase quinase 3) é uma proteína serina/treonina quinase e está envolvida em muitas vias de sinalização associadas à produção de glicogênio, apoptose, manutenção de células-tronco, etc. A GSK3 possui as 2 isoformas α e β. O “inibidor de GSK3β“ utilizado na presente invenção não é particularmente limitado desde que o inibidor de GSK3β tenha atividade inibidora de GSK3β. O inibidor de GSK3β pode ser uma substância com atividade inibidora de GSK3β e atividade inibidora de GSK3α.

[0095] “Inibidor de TGFβ“ é uma substância com atividade inibidora contra TGFβ (fator de crescimento transformante β). O TGFβ é uma citocina que se liga a dois tipos de receptores de proteína serina/treonina quinase e controla a proliferação celular, diferenciação celular, morte celular, etc. através da transdução de sinal, principalmente, para ativar o Smad (R-Smad). Exemplos da substância que possui atividade inibidora de TGFβ incluem substâncias que inibem a ligação do TGFβ ao seu receptor e substâncias que

14 / 48 inibem os sinais a jusante após a ligação do TGFβ ao seu receptor. Exemplos dos sinais a jusante incluem a fosforilação do receptor de TGFβI pelo receptor de TGFβII e a fosforilação do Smad pelo receptor TGFβI fosforilado. O “inibidor de TGFβ“ utilizado na presente invenção não é particularmente limitado desde que o inibidor de TGFβ tenha atividade inibidora de TGFβ.

[0096] Como aqui utilizado, “marcador” é “proteína marcadora” ou “gene marcador” e significa uma proteína que é expressa especificamente na superfície celular, no citosol e/ou no núcleo de um tipo de célula predeterminado, ou um gene do mesmo. O marcador pode ser um marcador de seleção positiva ou um marcador de seleção negativa. Preferivelmente, o marcador é um marcador da superfície celular. Particularmente, um marcador de seleção positiva de superfície celular permite concentração, isolamento e/ou detecção de células vivas.

[0097] A proteína marcadora pode ser detectada pelo uso de ensaio imunológico, por exemplo, ELISA, imunocoloração ou citometria de fluxo, usando um anticorpo específico para a proteína marcadora. Um anticorpo que se liga a uma sequência de aminoácidos específica da proteína marcadora ou a uma cadeia de açúcar específica ligada à proteína marcadora, etc. pode ser usado como anticorpo específico para a proteína marcadora. No caso de uma proteína marcadora intracelularmente expressa que não aparece na superfície das células (por exemplo, um fator de transcrição ou uma subunidade do mesmo), a proteína marcadora de interesse pode ser detectada expressando a proteína marcadora com uma proteína repórter e detectando a proteína repórter (por exemplo, Literatura Não Patentária 4). Este método pode ser utilizado preferivelmente quando não é encontrado um marcador de superfície celular apropriado. O gene marcador pode ser detectado pelo uso de um método de amplificação e/ou detecção de ácido nucleico conhecido na técnica, por exemplo, RT-PCR, microarranjo, biochip ou RNAseq.

[0098] Como aqui utilizado, a “expressão” é definida como

15 / 48 transcrição e/ou tradução de uma certa sequência de nucleotídeos acionada por um promotor intracelular.

[0099] Como aqui utilizado, o termo “compreende(m)” ou “compreender” refere-se à inclusão do(s) elemento(s) após a palavra sem limitações. Assim, isso sugere a inclusão do(s) elemento(s) após a palavra, mas não sugere a exclusão de nenhum outro elemento.

[00100] Conforme usado aqui, o termo “cerca de” ou “aproximadamente” refere-se a um valor que pode variar até mais ou menos 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 8%, 6%, 5%, 4 %, 3%, 2% ou 1% do valor de referência. Preferivelmente, o termo “cerca de” ou “aproximadamente” refere- se a uma faixa de menos ou mais 15%, 10%, 5% ou 1% do valor de referência. Efeitos vantajosos da invenção

[00101] A presente invenção provê uma técnica para cultura e proliferação durante um longo período de células da crista neural que mantêm a multipotência. Breve Descrição dos Desenhos

[00102] [Figura 1] A Figura 1 é um gráfico que mostra a variação no número total de células após o início da cultura de expansão das células da crista neural (Exemplo 1). A ordenada mostra o número total de células e “1.E+” representa um multiplicador de 10. Por exemplo, “1.E+04” significa 10000 células. A abcissa mostra os dias de cultura.

[00103] [Figura 2] A Figura 2 é um gráfico que mostra a variação na porcentagem de células positivas para expressão de SOX10 após o início da cultura de expansão das células da crista neural (Exemplo 1). A ordenada mostra a porcentagem de células positivas para expressão de SOX10 (%). A abcissa mostra os dias de cultura.

[00104] [Figura 3] A Figura 3 é um gráfico que mostra os resultados da medição da variação no número total de células das células da crista neural

16 / 48 cultivadas para expansão, por ajuste das concentrações de bFGF e EGF para 20 ng/ml (A) ou 40 ng/ml (B) e ajuste da concentração de CHIR99021 para 1, 2, 3 ou 5 µM (indicado por 1×, 2×, 3×, e 5×, respectivamente) (Exemplo 2). A ordenada mostra o número total de células e “1.E+” representa um multiplicador de 10. Por exemplo, “1.E+04” significa 10000 células. A abcissa mostra os dias de cultura.

[00105] [Figura 4] A Figura 4 é um gráfico que mostra os resultados da medição da variação no número total de células das células da crista neural cultivadas em expansão, por ajuste das concentrações de bFGF e EGF para 40 ng/ml e ajuste da concentração de CHIR99021 para 3, 3,5, 4, 4,5 ou 5 µM (Exemplo 2). A ordenada mostra o número total de células e “1.E+” representa um multiplicador de 10.

[00106] [Figura 5] A Figura 5 é um gráfico que mostra os resultados da medição da variação na porcentagem de células positivas para expressão de SOX10 das células da crista neural cultivadas em expansão, por ajuste das concentrações de bFGF e EGF para 20 ng/ml (A) ou 40 ng/ml (B) e ajuste da concentração de CHIR99021 para 1, 2, 3 ou 5 µM (indicado por 1×, 2×, 3×, e 5×, respectivamente) (Exemplo 2). A ordenada mostra a porcentagem de células positivas para expressão de SOX10 (%). A abcissa mostra os dias de cultura.

[00107] [Figura 6] A Figura 6 é um gráfico que mostra os resultados da medição da variação na porcentagem de células positivas para expressão de SOX10 das células da crista neural cultivadas em expansão, por ajuste das concentrações de bFGF e EGF para 40 ng/ml e ajuste da concentração de CHIR99021 para 3, 3,5, 4, 4,5 ou 5 µM (Exemplo 2). A ordenada mostra a porcentagem de células positivas para expressão de SOX10 (%). A abcissa mostra os dias de cultura.

[00108] [Figura 7] A Figura 7 é um gráfico que mostra a variação na porcentagem de células positivas para expressão de SOX10 após o início da

17 / 48 cultura de expansão das células da crista neural usando CP21R7 como um inibidor de GSK3β (Exemplo 3). A ordenada mostra a porcentagem de células positivas para expressão de SOX10 (%). A abcissa mostra os dias de cultura.

[00109] [Figura 8] A Figura 8 é um gráfico que mostra os resultados da medição da variação no número total de células das células da crista neural cultivadas em expansão, por ajuste da concentração de bFGF para 10, 12,5, 15,0 ou 17,5 ng/ml (Exemplo 8). A ordenada mostra o número total de células e “1.E+” representa um multiplicador de 10.

[00110] [Figura 9] A Figura 9 é um gráfico que mostra os resultados da medição da variação na porcentagem do número total de células de células positivas para expressão SOX10 de células da crista neural cultivadas em expansão, por ajuste da concentração de bFGF em 10, 12,5, 15,0 ou 17,5 ng/ml (Exemplo 8). A ordenada mostra a porcentagem de células positivas para expressão de SOX10 (%). A abcissa mostra os dias de cultura. Descrição das modalidades

[00111] A seguir, serão descritos modos adequados para a realização da presente invenção. As modalidades descritas abaixo são dadas apenas para ilustrar as modalidades típicas da presente invenção. O escopo da presente invenção não deve ser interpretado como estando limitado por essas modalidades. [Método para produzir células da crista neural e método para proliferar células da crista neural]

[00112] O método para a produção de células da crista neural de acordo com a presente invenção compreende as etapas dadas abaixo. Destas etapas, a etapa (2) é particularmente o método para proliferar as células da crista neural de acordo com a presente invenção.

[00113] (1) Obter células da crista neural; e (2) cultivar em suspensão as células da crista neural em um meio compreendendo um inibidor de GSK3 e um fator de crescimento de fibroblastos básico (bFGF), em que o meio

18 / 48 compreende o inibidor de GSK3β com uma concentração que exibe um efeito equivalente ao exibido por CHIR99021 com uma concentração superior a 1 µM. [Etapa (1) de obter células da crista neural]

[00114] A etapa (1) de obter células da crista neural é a etapa de obter células da crista neural a serem submetidas à etapa (2). Exemplos do método para obter as células da crista neural na etapa (1) incluem, mas não estão limitados a, um método para induzir a diferenciação de células-tronco em células da crista neural, um método de compra de células da crista neural disponíveis no mercado, e um método de coleta de células da crista neural de ocorrência natural.

[00115] Em uma modalidade da presente invenção, a fim de obter as células da crista neural a serem submetidas à etapa (2), a diferenciação de células-tronco nas células da crista neural pode ser induzida.

[00116] Exemplos das “células-tronco” que podem ser utilizadas na presente invenção incluem células-tronco pluripotentes. As “células-tronco pluripotentes” que podem ser usadas na presente invenção referem-se a células-tronco que podem se diferenciar em tecidos e células com várias formas e funções diferentes e têm a capacidade de se diferenciar em células de qualquer linhagem das 3 camadas germinativas (endoderme, mesoderme e ectoderme). Exemplos disso incluem, mas não estão particularmente limitados a, células-tronco embrionárias (ESCs), células-tronco embrionárias derivadas de embriões clonados obtidos por transplante nuclear, células-tronco espermatogonais, células germinativas embrionárias e células-tronco pluripotentes induzidas (também aqui referidas como “iPSCs”). As “células- tronco multipotentes” que podem ser utilizadas na presente invenção referem- se a células-tronco com a capacidade de serem capazes de diferenciar em números plurais e limitados de linhagens de células. Exemplos das “células- tronco multipotentes” que podem ser usadas na presente invenção incluem

19 / 48 células-tronco da polpa dentária, células-tronco derivadas da mucosa oral, células-tronco do folículo piloso e células-tronco somáticas derivadas de fibroblastos cultivados ou células-tronco da medula óssea. As células-tronco pluripotentes são preferivelmente ESCs e iPSCs.

[00117] As “ESCs” disponíveis incluem ESCs murinas, como várias linhas de ESCs murinas estabelecidas pelo inGenious Targeting Laboratory, Riken (Instituto de Pesquisas Físicas e Químicas) e similares, e ESCs humanas, como várias linhas de ESCs humanas estabelecidas pela University of Wisconsin, NIH, Riken, Kyoto University, National Center for Child Health and Development, Cellartis, e similares. Por exemplo, linhas CHB-1 a CHB-12, linha RUES1, linha RUES2 e linhas HUES1 a HUES28 distribuídas pela ESI Bio, linha H1 e linha H9 distribuídas pela WiCell Research, e linha KhES-1, linha KhES-2, linha KhES-3, linha KhES-4, linha KhES-5, linha SSES1, linha SSES2 e linha SSES3 distribuídas pela Riken podem ser usadas como linhas de ESCs humanas.

[00118] As “células-tronco pluripotentes induzidas” referem-se a células que são obtidas reprogramando células somáticas de mamíferos ou células-tronco indiferenciadas através da introdução de fatores particulares (fatores de reprogramação nuclear). Atualmente, existem várias “células- tronco pluripotentes induzidas” e iPSCs estabelecidas por Yamanaka, et al. introduzindo os 4 fatores Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc em fibroblastos murinos (Takahashi K, Yamanaka S., Cell, (2006) 126: 663-676); iPSCs derivadas de células humanas, estabelecidas pela introdução de 4 fatores semelhantes em fibroblastos humanos (Takahashi K, Yamanaka S., et al. Cell, (2007) 131: 861-872.); Nanog-iPSCs estabelecidas pela classificação de células usando a expressão de Nanog como um indicador após a introdução dos 4 fatores (Okita, K., Ichisaka, T., and Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317.); iPSCs produzidas por um método que não utiliza c-Myc (Nakagawa M, Yamanaka S., et al. Nature Biotechnology, (2008) 26, 101-106); iPSCs

20 / 48 estabelecidas pela introdução de 6 fatores por um método livre de vírus (Okita K et al. Nat. Methods 2011 May; 8(5): 409-12, Okita K et al. Stem Cells. 31 (3) 458-66); e similares também podem ser usadas. Além disso, células-tronco pluripotentes induzidas foram estabelecidas pela introdução dos 4 fatores OCT3/4, SOX2, NANOG e LIN28 por Thomson et al. (Yu J., Thomson JA. et al., Science (2007) 318: 1917-1920.); células-tronco pluripotentes induzidas produzidas por Daley et al. (Park IH, Daley GQ.et al., Nature (2007) 451: 141-146); células-tronco pluripotentes induzidas produzidas por Sakurada et al. (Publicação de Pedido de Patente Japonês Não Examinada No 2008-307007) e similares podem ser utilizadas.

[00119] Além disso, qualquer uma das células-tronco pluripotentes induzidas conhecidas na técnica descritas em todos os artigos publicados (por exemplo, Shi Y., Ding S., et al., Cell Stem Cell, (2008) Vol 3, Issue 5, 568- 574; Kim JB., Scholer HR., et al., Nature, (2008) 454, 646-650; Huangfu D., Melton, DA., et al., Nature Biotechnology, (2008) 26, No. 7, 795-797) ou patentes (por exemplo, Publicação de Pedido de Patente Não Examinado Japonês No 2008-307007, Publicação de Pedido de Patente Não Examinado Japonês No 2008-283972, US2008-2336610, US2009-047263, WO2007- 069666, WO2008-118220, WO2008-124133, WO2008-151058, WO2009- 006930, WO2009-006997, WO2009-007852).

[00120] As linhas de células pluripotentes induzidas disponíveis incluem várias linhas de iPSCs estabelecidas pelo NIH, Riken, Universidade de Kyoto e similares. Exemplos de tais linhas de iPSCs humanas incluem a linha HiPS-RIKEN-1A, linha HiPS-RIKEN-2A, linha HiPS-RIKEN-12A e linha Nips-B2 da Riken, e linha 253G1, linha 253G4, linha 1201C1, linha 1205D1, linha 1210B2, linha 1383D2, linha 1383D6, linha 201B7, linha 409B2, linha 454E2, linha 606A1, linha 610B1, linha 648A1, linha 1231A3 e linha FfI-01s04 da Universidade de Kyoto. A linha 1231A3 é preferida.

[00121] A indução da diferenciação de células-tronco nas células da

21 / 48 crista neural pode ser realizada de acordo com um método conhecido descrito em uma literatura (por exemplo, Literatura Não Patentária 1). No caso de usar, por exemplo, as iPSCs humanas, as iPSCs são inoculadas em uma placa ou similar, cultivadas em aderência e depois cultivadas em aderência em um meio compreendendo um inibidor de TGFβ e um inibidor de GSK3β, e podem, assim, se diferenciar nas células da crista neural.

[00122] A este respeito, o meio utilizado não é particularmente limitado e, por exemplo, o meio TeSR1 e o meio quimicamente definido (CDM) são adequadamente utilizados. Além disso, podem ser usados meio BME, meio BGJb, meio CMRL 1066, meio Glasgow MEM, meio MEM melhorado (IMEM), meio MDM melhorado (IMDM), meio Medium 199, meio Eagle MEM, meio αMEM, meio DMEM (glicose alta ou glicose baixa), meio DMEM/F12, meio de Ham, meio RPMI 1640, meio de Fischer e um meio misto dos mesmos, etc.

[00123] O meio CDM não é particularmente limitado e, por exemplo, um meio preparado a partir do meio Dulbecco modificado por Iscove (fabricado pela GE Healthcare Japan Corp.) pode ser usado. Como um exemplo mais específico, é usado o meio CDM descrito na Literatura Não Patentária 1. O meio CDM pode conter apotransferrina, monotioglicerol, albumina de soro bovino (BSA), insulina e/ou antibiótico.

[00124] O período de cultura antes da adição do inibidor de TGFβ e do inibidor de GSK3β pode ser um período em que o número de células de interesse é obtido. Este período de cultura não é particularmente limitado e é, por exemplo, de 2 a 6 dias.

[00125] Exemplos do inibidor de TGFβ incluem SB431542 (4-(5- benzol[1,3]dioxol-5-il-4-piridin-2-il-1H-imidazol-2-il)-benzamida, 4-[4-(1,3- benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1H-imidazol-2-il]-benzamida, 4-[4-(3,4- metilenodioxifenil)-5-(2-piridil)-1H-imidazol-2-il]-benzamida), A83-01 (3- (6-metilpiridin-2-il)-1-feniltiocarbamoil-4-quinolin-4-ilpirazol), LDN193189

22 / 48 (4-[6-[4-(1-piperazinil)fenil]pirazol[1,5-a]pirimidin-3-il]-quinolina), Wnt3a/BIO (membro da família Wnt 3A/(2’Z,3’E)-6-bromoindirrubin-3’- oxima), BMP4 (proteína morfogenética óssea 4), GW788388 (4-[4-[3- (piridin-2-il)-1H-pirazol-4-il]-piridin-2-il]-N-(tetra-hidro-2H-piran-4- il)benzamida), SM16 (4-[4-(1,3-benzodioxol-5-il)-5-(6-metil-2-piridinil)-1H- imidazol-2-il]-biciclo[2,2,2]octano-1-carboxamida), IN-1130 (3-[[5-(6-metil- 2-piridinil)-4-(6-quinoxalinil)-1H-imidazol-2-il]metil]-benzamida), GW6604 (2-fenil-4-[3-(piridin-2-il)-1H-pirazol-4-il]piridina) e SB505124 (2-(5- benzo[1,3]dioxol-5-il-2-terc-butil-3H-imidazol-4-il)-6-metilpiridina). Duas ou mais dessas substâncias podem ser usadas em combinação.

[00126] A concentração do inibidor de TGFβ a ser adicionado nesta etapa é ajustada adequadamente dependendo do tipo de inibidor de TGFβ a ser adicionado, e é, por exemplo, de 1 a 40 µM, preferivelmente de 5 a 20 µM.

[00127] No caso de usar SB431542 (4-[4-(1,3-benzodioxol-5-il)-5-(2- piridinil)-1H-imidazol-2-il]-benzamida), a concentração do inibidor de TGFβ a ser adicionado pode ser particularmente definido como 10 µM.

[00128] Exemplos do inibidor de GSK3β incluem CHIR98014 (2-[[2- [(5-nitro-6-aminopiridin-2-il)amino]etil]amino]-4-(2,4-diclorofenil)-5-(1H- imidazol-1-il)pirimidina), CHIR99021 (6-[[2-[[4-(2,4-diclorofenil)-5-(4- metil-1H-imidazol-2-il)-2-pirimidinil]amino]etil]amino]nicotinonitrila), CP21R7 (3-(3-amino-fenil)-4-(1-metil-1H-indol-3-il)-pirrole-2,5-diona), LY2090314 (3-[9-fluoro-1,2,3,4-tetra-hidro-2-(1- piperidinilcarbonil)pirrol[3,2,1-jk][1,4]benzodiazepin-7-il]-4-imidazo[1,2- a]piridin-3-il-1h-pirrol-2,5-diona), TDZD-8 (4-benzil-2-metil-1,2,4- tiadiazolidina-3,5-diona), SB216763 (3-(2,4-diclorofenil)-4-(1-metil-1H- indol-3-il)-1H-pirrol-2,5-diona), TWS-119 (3-[6-(3-aminofenil)-7H- pirrol[2,3-d]pirimidin-4-iloxi]fenol), kenpaullone, 1-azakenpaullone, SB415286 (3-[(3-cloro-4-hidroxifenil)amino]-4-(2-nitrofenil)-1H-pirrol-2,5-

23 / 48 diona), AR-AO144-18 (1-[(4-metoxifenil)metil]-3-(5-nitro-1,3-tiazol-2- il)ureia), CT99021, CT20026, BIO ((2’Z,3’E)-6-bromoindirrubin-3’-oxima), BIO-acetoxima, complexo ciclopentadienil de piridocarbazol-rutênio, OTDZT, alfa-4-dibromoacetofenona e lítio. Duas ou mais dessas substâncias podem ser usadas em combinação.

[00129] O inibidor de GSK3β não está limitado a essas substâncias, e oligonucleotídeos antissentido e siRNA contra o mRNA de GSK3β, anticorpos que se ligam a GSK3β, mutantes de GSK3β dominantes negativos e similares também podem ser usados como inibidor de GSK3β. Estes inibidores de GSK3 estão comercialmente disponíveis ou podem ser sintetizados de acordo com um método conhecido.

[00130] A concentração do inibidor de GSK3β a ser adicionado nesta etapa é ajustada adequadamente, dependendo do tipo de inibidor de GSK3β a ser adicionado, e é, por exemplo, 0,01 a 20 µM, preferivelmente 0,1 a 10 µM.

[00131] No caso de usar CHIR99021, a concentração do inibidor de GSK3β a ser adicionado não é particularmente limitada e pode ser, por exemplo, 0,1 a 1 µM, preferivelmente 0,5 a 1 µM, particularmente 1 µM.

[00132] O período de cultura após a adição do inibidor de TGFβ e do inibidor de GSK3β pode ser um período em que o número de células de interesse é obtido. Este período de cultura não é particularmente limitado e é, por exemplo, 6 a 14 dias, 8 a 12 dias, 9 a 11 dias ou 10 dias.

[00133] Para a cultura aderente, é usado um recipiente de cultura, por exemplo, uma placa, um frasco, uma microplaca ou uma lâmina de cultura de células, como OptiCell (nome do produto) (Nunc). O recipiente de cultura é, preferivelmente, tratado na superfície, a fim de melhorar a adesividade às células (hidrofilicidade), ou revestido com um substrato para adesão celular, como colágeno, gelatina, poli-L-lisina, poli-D-lisina, laminina, fibronectina, Matrigel (por exemplo, BD Matrigel (Nippon Becton Dickinson Company, Ltd.)) ou vitronectina.

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[00134] O “Matrigel” é uma preparação solúvel da membrana basal extraída do sarcoma de camundongo Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), rico em proteínas da matriz extracelular. O recipiente de cultura revestido com Matrigel está disponível comercialmente. O Matrigel é composto principalmente de laminina, colágeno IV, proteoglicanos de heparan sulfato e entactina/nidogênio-1,2. O Matrigel contém, além desses componentes principais, TGFβ, fator de crescimento de células epiteliais, fator de crescimento semelhante à insulina, fator de crescimento de fibroblastos, ativadores de plasminogênio tecidual 3,4 e outros fatores de crescimento produzidos naturalmente no tumor de EHS.

[00135] A temperatura da cultura não é particularmente limitada e é de 30 a 40°C (por exemplo, 37°C). Uma concentração de dióxido de carbono no recipiente de cultura é da ordem de, por exemplo, 5%.

[00136] Em uma modalidade da presente invenção, a fim de obter as células da crista neural a serem submetidas à etapa (2), podem ser adquiridas células da crista neural disponíveis comercialmente. Exemplos das células da crista neural disponíveis comercialmente incluem células da bainha da raiz externa do folículo capilar humano (fabricadas pela Cosmo Bio Co., Ltd.) e a linha de células da crista neural craniana do camundongo O9-1 (fabricada pela Merck Millipore).

[00137] Em uma modalidade da presente invenção, a fim de obter as células da crista neural a serem submetidas à etapa (2), células da crista neural de ocorrência natural podem ser coletadas. Células da crista neural existem em corpos vivos de mamíferos, por exemplo, tubo neural embrionário humano cerca de 30 dias após a fertilização, tubo neural embrionário de camundongo por volta do 9º dia fetal e pele adulta humana, suína e de roedores (Betters et al., Biologia do desenvolvimento, 2010, 344 (2): 578- 592; Jiang et al., Development, 2000, 127 (8): 1607-1616; Dupin et al., Developmental biology, 2012, 366 (1): 83-95; e Nagoshi et al., Cell Stem

25 / 48 Cell 2, April 2008, 392-403). Tais células da crista neural podem ser coletadas usando um método conhecido (por exemplo, Motohashi et al., Biology open, 2016, 5: 311-322; and Pfaltzgraff et al., Journal of Visualized Experiments, 2012, 64: 4134) e submetidas à etapa (2). [Etapa (2) de cultura de expansão de células da crista neural]

[00138] A etapa (2) da cultura de expansão das células da crista neural é a etapa de cultura de suspensão das células da crista neural em um meio compreendendo um inibidor de GSK3β e um fator de crescimento de fibroblastos básico (bFGF).

[00139] A este respeito, o meio utilizado não é particularmente limitado e, por exemplo, o meio (C) é adequadamente utilizado. Além disso, podem ser usados meio TeSR1, meio BME, meio BGJb, meio CMRL 1066, meio Glasgow MEM, meio MEM melhorado (IMEM), meio MDM melhorado (IMDM), meio Medium 199, meio Eagle MEM, meio αMEM, meio DMEM (glicose alta ou glicose baixa), meio DMEM/F12, meio de Ham, meio RPMI 1640, meio de Fischer e um meio misto dos mesmos, etc.

[00140] O inibidor de GSK3β mencionado acima pode ser usado sem limitações particulares.

[00141] O inibidor de GSK3β é, preferivelmente, pelo menos um elemento selecionado a partir do grupo que consiste em CHIR99021, CP21R7, CHIR98014, LY2090314, kenpaullone, AR-AO144-18, TDZD-8, SB216763, BIO, TWS-119 e SB415286. O inibidor de GSK3β é particularmente preferivelmente CHIR99021 ou CP21R7.

[00142] A concentração do inibidor de GSK3β a ser adicionada nesta etapa é uma concentração que exibe um efeito equivalente ao exibido pelo CHIR99021 com uma concentração maior que 1 µM (ou uma concentração maior que 1 µM e menor que 5 µM). O próprio CHIR99021 pode ser usado como inibidor de GSK3β. No caso de usar o próprio CHIR99021 como inibidor de GSK3β, como mencionado mais adiante, a concentração adequada

26 / 48 do inibidor de GSK3β a ser adicionada é uma concentração maior que 1 µM, preferivelmente 2 µM ou maior e menor que 5 µM, mais preferivelmente maior que 2 µM e 4,5 µM ou inferior, particularmente preferivelmente 3 µM ou superior e 4,5 µM ou inferior. Assim, no caso de usar um inibidor de GSK3β diferente de CHIR99021 nesta etapa, a concentração do inibidor de GSK3β a ser adicionada é uma concentração que exibe um efeito equivalente ao exibido por CHIR99021 com uma concentração superior a 1 µM, preferivelmente uma concentração que exibe um efeito equivalente ao exibido por CHIR99021 2 µM ou superior e inferior a 5 µM, mais preferivelmente com uma concentração que exibe um efeito equivalente ao exibido por CHIR99021 superior a 2 µM e 4,5 µM ou inferior, particularmente preferivelmente uma concentração que exibe um efeito equivalente ao exibido por CHIR99021 3 µM ou superior e 4,5 µM ou inferior.

[00143] As células da crista neural que mantêm a multipotência podem ser cultivadas e permitidas proliferar durante um período de cultura por mais de 9 semanas (63 dias) por cultura de suspensão das células da crista neural na presença do inibidor de GSK3β tendo concentração e bFGF.

[00144] Em uma modalidade da presente invenção, as “células da crista neural que mantêm multipotência” têm capacidade de diferenciação em células nervosas, células da glia e células estromais mesenquimais ou capacidade de diferenciação nessas células, bem como células ósseas, condrócitos, células da córnea e células pigmentares.

[00145] As “células da crista neural que mantêm a multipotência” podem ser avaliadas por uma pluralidade de métodos. Exemplos dos métodos incluem, mas não estão particularmente limitados a, um método para induzir a diferenciação das células da crista neural a serem avaliadas em cada linhagem, como células nervosas, células da glia e células estromais mesenquimais. Desde que as células da crista neural a serem avaliadas possam realmente ser diferenciadas em células nervosas, células da glia e

27 / 48 células estromais mesenquimais, etc., as células da crista neural a serem avaliadas podem ser determinadas como as “células da crista neural que mantêm a multipotência”. Outro exemplo do método inclui um método para medir a expressão de uma proteína ou gene marcador. Desde que um fator de transcrição SOX10 seja expresso nas células da crista neural a serem avaliadas, as células da crista neural a serem avaliadas podem ser determinadas como as “células da crista neural que mantêm a multipotência”. SOX10 pode ser detectado pelo uso de ensaio imunológico, por exemplo, ELISA, imunocoloração ou citometria de fluxo, usando um anticorpo específico para a proteína marcadora. O gene marcador pode ser detectado pelo uso de um método de amplificação e/ou detecção de ácido nucleico conhecido na técnica, por exemplo, RT-PCR, microarranjo ou biochip. Quando as células possuem uma inserção de uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína repórter (por exemplo, Nano-Lanterna (Saito K. et al., “Luminescent proteins for high-speed single-cell and whole-body imaging.” Nat. Commun., 2012; 3: 1262)) a jusante do gene SOX10, um gene marcador de NCCs, e expressa uma proteína de fusão de SOX10 e a proteína repórter sob o controle do promotor SOX10, um método para detectar a proteína repórter (por exemplo, medir a intensidade da fluorescência) pode ser usado.

[00146] O efeito equivalente ao exibido por CHIR99021 com uma “concentração superior a 1 µM” (ou “uma concentração superior a 1 µM e inferior a 5 µM”) quanto ao inibidor de GSK3β pode ser avaliado com base na atividade inibidora de GSK3β. A atividade inibidora de GSK3β do inibidor de GSK3β pode ser medida por um método conhecido per se e pode ser medida por, por exemplo, um método descrito em Patsch et al., Nature cell biology, 2015, 17 (8): 994-1003 ou Uno et al., Brain Res., 2009, 1296: 148-

163. Especificamente, a atividade inibidora de GSK3β pode ser medida usando a função de regulação da expressão gênica (particularmente a função de fosforilação de β-catenina) da GSK3 na via Wnt/β-catenina como um

28 / 48 índice. Mais especificamente, essa abordagem envolve: (i) cultivar células cuja expressão do gene repórter é suprimida sob o controle de GSK3β, na presença e na ausência do inibidor de GSK3β; (ii) medir um nível de expressão do gene repórter na presença e ausência do inibidor de GSK3β; e (iii) determinar a atividade inibidora de GSK3β do inibidor de GSK3β com base em uma quantidade de aumento no nível de expressão do gene repórter na presença do inibidor de GSK3β em relação ao nível de expressão do gene repórter na ausência do inibidor de GSK3β (ver Exemplo 9).

[00147] Quando o inibidor de GSK3β exibe atividade inibidora de GSK3β (% de inibição) equivalente à exibida por CHIR99021 com uma concentração superior a 1 µM nos resultados da medição, é determinado que o inibidor de GSK3β exibe o “efeito equivalente ao exibido por CHIR99021 (atividade inibidora de GSK3β equivalente ao efeito exibido por CHIR99021) com uma concentração superior a 1 µM”. Nesse contexto, o valor “equivalente” (% de inibição) refere-se a um valor que pode variar até mais ou menos 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 8%, 6%, 5%, 4 %, 3%, 2% ou 1% do valor de referência. Preferivelmente, o valor refere-se a uma faixa de menos ou mais 15%, 10%, 5% ou 1% do valor de referência.

[00148] O “efeito equivalente ao exibido por CHIR99021 com uma “concentração superior a 1 µM” (ou uma concentração superior a 1 µM e inferior a 5 µM) quanto ao inibidor de GSK3β pode ser avaliado de maneira mais adequada com base em um período para o qual as “células da crista neural que mantêm a multipotência” são cultiváveis quando as células da crista neural são cultivadas da mesma maneira que um método descrito nos Exemplos aqui. Quando as “células da crista neural que mantêm a multipotência” são cultiváveis, com seu número aumentado a partir daquele no início da cultura, pela cultura das células da crista neural em um meio compreendendo o inibidor de GSK3β por um período equivalente ao da cultura da células da crista neural em um meio compreendendo CHIR99021

29 / 48 com uma concentração superior a 1 µM, o inibidor de GSK3β é determinado para exibir o “efeito equivalente ao exibido por CHIR99021 (atividade proliferativa de células da crista neural equivalente ao efeito exibido por CHIR99021) com uma concentração superior a 1 µM”. Nesse contexto, o valor “equivalente” (período) refere-se a um valor que pode variar até mais ou menos 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 8%, 6%, 5%, 4 %, 3%, 2% ou 1% do valor de referência. Preferivelmente, o valor refere-se a uma faixa de menos ou mais 15%, 10%, 5% ou 1% do valor de referência.

[00149] No caso de usar o próprio CHIR99021 como inibidor de GSK3β, a concentração adequada do inibidor de GSK3β a ser adicionada é uma concentração superior a 1 µM, preferivelmente 2 µM ou maior e menor que 5 µM, mais preferivelmente superior a 2 µM e 4,5 µM ou inferior, particularmente preferivelmente 3 µM ou superior e 4,5 µM ou inferior. Verificou-se que o efeito de permitir a proliferação de células da crista neural, mantendo a capacidade de diferenciação por um longo período, é alto para CHIR99021 2 µM ou superior e inferior a 5 µM e mais alto, particularmente a CHIR99021 3 µM ou superior e 4,5 µM ou inferior. Especificamente, CHIR99021 com uma concentração de 3 a 4,5 µM permitiu a cultura e a proliferação de células da crista neural que mantiveram multipotência por 112 dias (16 semanas) ou mais. Além disso, o CHIR99021 com uma concentração de 2 µM manteve a multipotência por 9 semanas (63 dias) ou mais. Por outro lado, o CHIR99021 1 µM ou 5 µM diminuiu o número de células que mantiveram multipotência em 3 semanas (21 dias) e 6 semanas (42 dias), respectivamente, de cultura.

[00150] No caso de usar CP21R7 como o inibidor de GSK3β, a concentração do inibidor de GSK3β a ser adicionada é uma concentração superior a 0,1 µM, preferivelmente 0,5 µM ou superior, mais preferivelmente 1 µM ou superior. Verificou-se que o efeito de permitir a proliferação de células da crista neural, mantendo a capacidade de diferenciação por um

30 / 48 longo período, é alto para CP21R7 0,5 µM ou superior e 1 µM ou inferior. Especificamente, CP21R7 com uma concentração de 0,5 a 1 µM permitiu a cultura e a proliferação de células da crista neural que mantiveram multipotência por 84 dias (12 semanas) ou mais. Por outro lado, CP21R7 0,1 µM diminuiu o número de células que mantiveram multipotência em 3 semanas (21 dias) de cultura.

[00151] A concentração de bFGF a ser adicionado não é particularmente limitada e é, por exemplo, 10 a 200 ng/ml, preferivelmente 20 a 40 ng/ml.

[00152] O meio pode ser suplementado com um inibidor de TGFβ e/ou um fator de crescimento epidérmico (EGF), além do inibidor de GSK3β e bFGF. O inibidor de TGFβ mencionado acima pode ser usado sem limitações particulares.

[00153] O inibidor de TGFβ é, preferivelmente, pelo menos um elemento selecionado a partir do grupo que consiste em SB431542, A83-01, LDN193189, Wnt3A/BIO, BMP4, GW788388, SM16, IN-1130, GW6604 e SB505124. O inibidor de TGFβ é particularmente preferivelmente SB431542.

[00154] A concentração do inibidor de TGFβ a ser adicionado é ajustada adequadamente, dependendo do tipo de inibidor de TGF3β a ser adicionado, e é, por exemplo, 1 a 50 µM, preferivelmente 5 a 20 µM.

[00155] No caso de usar SB431542, a concentração do inibidor de TGFβ a ser adicionado não é particularmente limitada e pode ser, por exemplo, 1 a 40 µM, preferivelmente 5 a 20 µM, particularmente 10 µM.

[00156] A concentração de EGF a ser adicionado não é particularmente limitada e é, por exemplo, 5 a 100 ng/ml, preferivelmente 20 a 40 ng/ml.

[00157] Na cultura de suspensão, as células da crista neural obtidas na etapa (1) são desprendidas do recipiente de cultura e depois dispersas em um meio, e uma massa celular agregada é formada enquanto componentes do meio e a concentração interna de oxigênio do meio são uniformizados por

31 / 48 agitação ou vibração. A taxa de agitação adequada é ajustada adequadamente de acordo com a densidade celular e o tamanho de um recipiente de cultura. A agitação ou vibração excessiva aplica estresse físico nas células e inibe a formação de massa celular agregada. Assim, a taxa de agitação ou vibração é controlada para ser capaz de uniformizar os componentes do meio e a concentração interna de oxigênio do meio e não inibir a formação de massa celular agregada. A cultura em suspensão pode ser realizada ficando parada, sem agitação ou vibração.

[00158] A temperatura da cultura não é particularmente limitada e é de 30 a 40°C (por exemplo, 37°C). Uma concentração de dióxido de carbono no recipiente de cultura é da ordem de, por exemplo, 5%.

[00159] O período de cultura nesta etapa pode ser um período em que o número de células de interesse é obtido. Esta etapa permite a cultura e a proliferação das células da crista neural que mantêm a multipotência por um longo período. A proporção das células da crista neural que mantêm a multipotência para a população de células cultivadas é de pelo menos 20% ou mais, 30% ou mais ou 40% ou mais e pode ser mantida preferivelmente 50% ou mais, 60% ou mais, ou 70% ou mais, mais preferivelmente 80% ou mais, 90% ou mais ou 95% ou mais.

[00160] Durante esta cultura, as células são adequadamente passadas. A passagem é realizada a cada 5 a 8 dias após a inoculação, por exemplo. Preferivelmente, o intervalo entre passagens é um período suficiente para a expansão da massa celular agregada, e esse período é mais curto do que aquele em que uma massa celular agregada muito grande impede que oxigênio ou nutrientes atinjam as células dentro da massa celular agregada.

[00161] O período em que esta etapa permite a cultura e a proliferação das células da crista neural que mantêm a multipotência não é particularmente limitado e pode ser, por exemplo, 7 dias, 14 dias, 21 dias, 28 dias, 35 dias, 42 dias, 49 dias, 56 dias, 63 dias, 70 dias, 77 dias, 84 dias, 91 dias, 98 dias, 105

32 / 48 dias ou 112 dias ou mais. Este período é preferivelmente 35 dias ou mais, mais preferivelmente 42 dias ou mais, ainda mais preferivelmente 63 dias ou mais, particularmente preferivelmente 84 dias ou mais, mais preferivelmente 112 dias ou mais. [Meio]

[00162] A presente invenção também provê um meio para uso no método para produzir células da crista neural e o método para proliferar células da crista neural mencionadas acima, compreendendo células da crista neural. A composição preferida do meio é como mencionada acima. [Estoque de células]

[00163] A presente invenção também provê um estoque congelado compreendendo células da crista neural obtidas pelo método para produzir células da crista neural e o método para proliferar células da crista neural mencionadas acima. As células da crista neural são positivas para a expressão de SOX10 e positivas para a expressão de p75, um marcador de antígeno de superfície celular das NCCs.

[00164] O estoque congelado pode ser produzido separando as células da crista neural obtidas pelo método para produzir células da crista neural e o método para proliferar células da crista neural do meio e suspendendo as células da crista neural em uma solução de criopreservação para congelamento. A separação das células da crista neural do meio pode ser realizada usando um filtro celular ou centrifugação. As células assim separadas podem ser lavadas, se necessário. O estoque congelado pode compreender uma população celular adicional além das células da crista neural e preferivelmente compreende células da crista neural purificadas. A purificação das células da crista neural pode ser realizada, por exemplo, separando as células da crista neural de outras populações celulares por separação celular utilizando a expressão do marcador descrita acima como um índice. Um reagente convencional para uso na criopreservação de células

33 / 48 pode ser usado como solução de preservação de células. Por exemplo, o Cryostem Freezing Medium e o CELLBANKER (R) estão disponíveis comercialmente.

[00165] O estoque congelado pode ser usado como material de partida para induzir a diferenciação das células da crista neural para obter células nervosas, células da glia, células estromais mesenquimais, células ósseas, condrócitos, células da córnea e células pigmentares. Além disso, o estoque congelado pode ser usado para preparar modelos de tecidos tendo as células da crista neural como constituinte. [Método para produzir várias células a partir de células da crista neural]

[00166] O método para produção de células nervosas, células da glia, células estromais mesenquimais, células ósseas, condrócitos, células da córnea ou células pigmentares de acordo com a presente invenção compreende as etapas dadas abaixo. Destas etapas, a etapa (i) é igual à etapa (2) do método para a produção de células da crista neural de acordo com a presente invenção ou como o método para proliferação de células da crista neural de acordo com a presente invenção. (i) Cultivar em suspensão células da crista neural em um meio compreendendo um inibidor de GSK3β e um fator de crescimento de fibroblastos básico (bFGF), em que o meio compreende o inibidor de GSK3β com uma concentração que exibe um efeito equivalente ao exibido por CHIR99021 com uma concentração superior a 1 µM; e (ii) permitir a diferenciação das células da crista neural obtidas na etapa (i) em células de pelo menos uma linhagem selecionada a partir do grupo que consiste em células nervosas, células da glia, células estromais mesenquimais, células ósseas, condrócitos, células da córnea e células pigmentares. [Etapa de indução em várias células]

[00167] De acordo com o método para produzir células da crista neural e o método para proliferar células da crista neural de acordo com a presente

34 / 48 invenção, células da crista neural que mantêm multipotência para se diferenciar em células nervosas, células da glia e células estromais mesenquimais ou multipotência para se diferenciar também nessas células como células ósseas, condrócitos, células da córnea e células pigmentares podem ser obtidas.

[00168] A indução da diferenciação das células da crista neural em células de cada linhagem selecionada a partir de células nervosas, células da glia, células estromais mesenquimais, células ósseas, condrócitos, células da córnea e células pigmentares pode ser realizada de acordo com um método conhecido descrito na literatura (por exemplo, Literaturas Não Patentária 1 a 4).

[00169] Especificamente, a indução da diferenciação em células nervosas pode ser realizada com base em um método descrito na Literatura Não Patentária 1 ou 4.

[00170] Por exemplo, as células da crista neural são inoculadas em uma placa revestida com fibronectina e o meio é substituído por DMEM/F12 suplementado com suplemento N-2 (17502-048, Gibco), BDNF (028-16451, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), GDNF (074-06264, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), NT-3 (141-06643, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) e NGF (141-07601, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), seguido de cultura a 37°C por 14 dias sob 5% de CO2.

[00171] Alternativamente, as células da crista neural são inoculadas em uma placa e cultivadas por 1 dia em meio CDM contendo SB431542 10 µM e CHIR99021 1 µM, e o meio é então substituído por meio Neurobasal (21103- 049, Gibco) suplementado com Suplemento B-27 (17504-044, Gibco), Suplemento N-2, L-glutamina (073-05391, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), Penicilina/Estreptomicina (15140-122, Gibco), BDNF, GDNF, NT-3 e NGF, seguido de cultura a 37°C por 35 dias sob 5% de CO2.

[00172] As células assim cultivadas são fixadas em paraformaldeído a

35 / 48 4% e o surgimento da diferenciação em células nervosas que expressam a proteína TUBB3 é confirmado por um método de imunocoloração.

[00173] A indução da diferenciação nas células da glia pode ser realizada por uma abordagem semelhante à indução da diferenciação nas células nervosas pelo método descrito na Literatura Não Patentária 1 ou 4. Após a conclusão do período de indução da diferenciação, o surgimento da diferenciação nas células da glia é confirmado a partir da expressão da proteína GFAP.

[00174] A indução da diferenciação em células estromais mesenquimais pode ser realizada com base em um método descrito na Literatura Não Patentária 1. Especificamente, por exemplo, as células da crista neural são inoculadas a uma densidade de 6,5 × 104 células/cm2 em uma placa e cultivadas por 1 dia em meio CDM contendo SB431542 10 µM e CHIR99021 1 µM. Um dia depois, o meio é substituído por αMEM (Nacalai Tesque, Inc.) contendo soro fetal bovino 10% (FBS, Nichirei Corp.). Cerca de 4 dias depois, são observadas alterações morfológicas na célula. As células são passadas por desprendimento das células com 0,25% de tripsina-EDTA (Gibco) e inoculação a uma densidade de 1,0 × 104 células/cm2. 14 dias após o início da indução da diferenciação, a expressão de CD73, CD44, CD45 e CD105, marcadores de antígeno de superfície de células estromais mesenquimais humanas, é analisada por FACS para confirmar a diferenciação em células estromais mesenquimais.

[00175] A indução da diferenciação em células ósseas pode ser realizada com base em um método descrito na Literatura Não Patentária 1. Especificamente, por exemplo, as células estromais mesenquimais descritas acima são inoculadas em 2,5 × 105 células em uma placa revestida com fibronectina e cultivadas por 2 semanas em αMEM contendo FBS 10%, dexametasona 0,1 µM, ácido ascórbico 50 µg/ml e β-glicerofosfato 10 mM. O meio é substituído uma vez dois dias apenas pela primeira semana. Um

36 / 48 nódulo calcificado é detectado por coloração com vermelho de alizarina para confirmar a diferenciação em células ósseas.

[00176] A indução da diferenciação em condrócitos pode ser realizada com base em um método descrito na Literatura Não Patentária 1. Especificamente, por exemplo, as células estromais mesenquimais descritas acima são suspensas a uma concentração de 1,5 × 105 células/5 µl em DMEM:F12 (Invitrogen Corp.) contendo 1% (v/v) de ITS + pré-mistura (BD), AA2P 0,17 mM, Prolina 0,35 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC), dexametasona 0,1 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC), glicose 0,15% (v/v) (Sigma-Aldrich Co. LLC), Piruvato de Na 1 mM (Invitrogen Corp.), GlutaMax 2 mM, MTG 0,05 mM, 40 ng/ml de PDGF-BB e 1% (v/v) de FBS (Nichirei Corp.). 5 µL da suspensão de células são manchados em uma placa revestida com fibronectina e cultivados por 1 hora. Uma hora depois, 1 ml do meio para indução da diferenciação descrito acima é adicionado ao mesmo. 3 a 5 dias após o início da indução da diferenciação, adiciona-se ao mesmo TGF3β 10 ng/ml (R&D Systems, Inc.). 10 dias após o início da indução da diferenciação, adiciona-se ao mesmo BMP4 50 ng/ml. As células são cultivadas por 16 dias, e o surgimento da diferenciação em condrócitos é confirmado pela coloração com azul alciano.

[00177] A indução da diferenciação em células da córnea pode ser realizada com base no método descrito na Literatura Não Patentária 1. Especificamente, por exemplo, as células da crista neural são inoculadas em uma placa revestida com fibronectina e cultivadas por 1 dia em meio CDM contendo SB431542 10 µM e CHIR99021 1 µM. Um dia depois, o meio é substituído por um meio condicionado preparado pela cultura de células endoteliais da córnea humana em meio CDM. O meio é substituído uma vez dois dias. 12 dias após o início da indução da diferenciação, a expressão de ZO-1, uma molécula marcadora de células da córnea, é confirmada por um método de imunocoloração, e a expressão de COL4A1 e COL8A1 é

37 / 48 confirmada por qPCR.

[00178] A indução da diferenciação em células pigmentares pode ser realizada com base no método descrito na Literatura Não Patentária 1. Especificamente, por exemplo, as células da crista neural são inoculadas em uma placa revestida com fibronectina e cultivadas por 1 dia em meio CDM contendo SB 10 µM e CHIR 1 µM. Um dia depois, o meio é substituído por meio CDM contendo CHIR 1 µM, 25 ng/ml de BMP4 e endotelina-3 100 nM (American Peptide Company). O meio é substituído uma vez dois dias. Nos dias 7 após o início da indução da diferenciação, a diferenciação em células pigmentares é confirmada a partir da expressão dos genes MITF e c-KIT.

[00179] As células nervosas, células da glia, células estromais mesenquimais, células ósseas, condrócitos, células da córnea e células pigmentares obtidas podem ser usadas como preparação celular para medicina regenerativa.

[00180] As células da crista neural são células com multipotência para se diferenciar em muitos tipos de células, como células nervosas, células da glia, células estromais mesenquimais, células ósseas, condrócitos, células da córnea e células pigmentares, e a capacidade de se autoproliferar. A aplicação das células da crista neural aos medicamentos celulares para medicina regenerativa, etc., é esperada com base na capacidade encontrada nas células da crista neural. Se as células da crista neural que mantêm a multipotência puderem ser eficientemente mantidas ou se a proliferação for permitida, sua produção em larga escala será possível. Se um estoque das células da crista neural que mantêm a multipotência puder ser preparado, o estoque será útil como matéria-prima para os medicamentos celulares. Por exemplo, o uso de células (por exemplo, células da crista neural) posicionadas durante o processo da diferenciação de células-tronco em células de interesse (por exemplo, células nervosas) como material de partida, tem sido estudado com o objetivo de, por exemplo, simplificar métodos de produção, encurtar os

38 / 48 períodos de produção ou reduzir o custo de produção na produção de medicamentos celulares. A presente invenção é considerada capaz de produzir uma técnica útil para esse fim. Isso pode ser verdade não apenas para a produção de medicamentos celulares, mas também para a construção de sistemas de rastreamento usando várias células, etc. Exemplos [Exemplo 1: Cultura de expansão de células da crista neural] [Indução da diferenciação de iPSCs em NCCs]

[00181] Foi permitido que as iPSCs humanas se diferenciassem em células da crista neural (NCCs) de acordo com o método descrito na Literatura Não Patentária 1. As iPSCs utilizadas foram as iPSCs humanas repórter de nano-lanterna SOX10 (linha 201B7) descritos na Literatura Não Patentária 4. Essa linha celular tinha uma inserção de uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína fluorescente Nano-Lanterna (Saito K. et al., “Luminescent proteins for high-speed single-cell and whole-body imaging.” Nat. Commun., 2012; 3: 1262) a jusante do gene SOX10, um gene marcador de NCCs, e expressa uma proteína de fusão de SOX10 e Nano- Lanterna sob o controle do promotor SOX10.

[00182] As iPSCs foram inoculadas em uma placa revestida com Matrigel, cultivadas em cultura aderente por 4 dias em meio TeSR1 e, em seguida, cultivadas em cultura aderente por 10 dias em meio CDM contendo SB431542 10 µM (inibidor de TGFβ) e CHIR99021 1 µM (inibidor de GSK3β) e, assim, foi permitida a diferenciação em NCCs. [Cultura de expansão das NCCs]

[00183] As NCCs foram desprendidas da placa e cultivadas em suspensão em meio CDM contendo SB431542 10 µM, CHIR99021 3 µM, 40 ng/ml de bFGF e 40 ng/ml de EGF. As células foram passadas a cada 7 dias.

[00184] A variação no número total de células após o início da cultura de expansão é mostrada na Figura 1 e a variação na porcentagem de células

39 / 48 positivas para expressão SOX10 é mostrada na Figura 2. Para medir a porcentagem de células positivas para expressão SOX10, uma massa celular agregada foi dissociada usando o Reagente de Dissociação Celular StemPro Accutase Cell (Invitrogen Corp.) para preparar suspensões de unicelulares. As suspensões unicelulares em tampão FACS (BSA HBSS 2%) suplementadas com PI 1 µg/mL (iodeto de propídio, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) foram filtradas através de um tubo com malha de nylon 35 µm (BD Falcon) e depois analisadas usando um citômetro de fluxo (FACS Aria, BD Biosciences) para medir a proporção de células positivas para GFP em células vivas (células negativas para PI). O número total de células aumentou durante todo o período e uma alta porcentagem de células positivas para expressão de SOX10 foi confirmada mesmo em 121 dias de cultura. O SOX10 expresso serve como um marcador de NCCs com multipotência. Esses resultados indicam que as NCCs se proliferam mantendo a capacidade de diferenciação por um longo período de cultura. [Exemplo 2: Estudo sobre concentração de aditivo de meio]

[00185] O inibidor de GSK3β, bFGF e EGF foram estudados quanto à influência de suas concentrações na capacidade de autoproliferação das NCCs e sua capacidade de diferenciação na cultura de expansão das NCCs. A seguir, a cultura de expansão foi realizada sob as mesmas condições do Exemplo 1, a menos que especificado de outra forma.

[00186] A Figura 3 mostra a variação no número total de células quando as concentrações de bFGF e EGF foram definidas para 20 ng/ml (A) ou 40 ng/ml (B) e a concentração de CHIR99021 foi definida para 1, 2, 3 ou 5 µM. A taxa de proliferação celular por 1 semana na concentração CHIR99021 de 1 µM ou 2 µM foi de 8 a 30 vezes (também veja o Exemplo 8 mencionado mais adiante). A Figura 4 mostra a variação no número total de células quando as concentrações de bFGF e EGF foram definidas para 40 ng/ml e a concentração de CHIR99021 foi definida para 3, 3,5, 4, 4,5 ou 5 µM. As

40 / 48 concentrações de bFGF, EGF e CHIR99021 não teve influência na variação no número total de células.

[00187] A Figura 5 mostra a variação na porcentagem de células positivas para expressão de SOX10 quando as concentrações de bFGF e EGF foram definidas para 20 ng/ml (A) ou 40 ng/ml (B) e a concentração de CHIR99021 foi definida para 1, 2, 3 ou 5 µM. A Figura 6 mostra a variação na porcentagem de células positivas para expressão de SOX10 quando as concentrações de bFGF e EGF foram definidas para 40 ng/ml e a concentração de CHIR99021 foi definida para 3, 3,5, 4, 4,5 ou 5 µM. Quando a concentração de CHIR99021 foi de 3 a 4,5 µM, 90% ou mais de células positivas para expressão de SOX10 foram confirmadas no longo período de cultura (em 121 dias de cultura). Mesmo quando a concentração de CHIR99021 era de 2 µM, cerca de 55% ou mais de células positivas para expressão de SOX10 foram confirmadas no período de cultura relativamente longo (em 63 dias de cultura). Por outro lado, quando a concentração de CHIR99021 era de 5 µM, cerca de 55% ou mais de células positivas para expressão de SOX10 foram mantidas até 42 dias de cultura, enquanto a porcentagem de células positivas para expressão de SOX10 diminuiu para cerca de 5% ou menos em 63 dias de cultura. Quando a concentração de CHIR99021 era de 1 µM, foi observada uma diminuição na porcentagem de células positivas para expressão de SOX10 no curto período de cultura (em 21 dias de cultura), e a porcentagem de células positivas para expressão de SOX10 foi de cerca de 25% ou menos em 63 dias de cultura. As concentrações de bFGF e EGF1 não tiveram influência na variação na porcentagem de células positivas para expressão de SOX10. [Exemplo 3: Estudo sobre o inibidor de GSK3β]

[00188] As NCCs foram cultivadas em expansão da mesma maneira que no Exemplo 1, exceto que o inibidor de GSK3β usado na cultura de expansão das NCCs foi trocado de CHIR99021 para CP21R7. A concentração

41 / 48 de CP21R7 foi ajustada para 0,1, 0,5 ou 1 µM.

[00189] A variação na porcentagem de células positivas para expressão de SOX10 é mostrada na Figura 7. Na concentração de CP21R7 de 0,5 ou 1 µM, uma alta porcentagem de células positivas para expressão de SOX10 foi confirmada mesmo em 84 dias de cultura. Por outro lado, na concentração de CP21R7 de 0,1 µM, a porcentagem de células positivas para expressão de SOX10 começou a diminuir no curto período de cultura (em 21 dias de cultura). [Exemplo 4: Indução da diferenciação de células da crista neural em células nervosas]

[00190] A capacidade de diferenciação das NCCs cultivadas em expansão no Exemplo 1 em células nervosas foi confirmada.

[00191] A indução da diferenciação em células nervosas foi realizada com base no método descrito na Literatura Não Patentária 4.

[00192] As NCCs cultivadas em expansão por cultura de manutenção por 30 dias foram inoculadas em 5 × 105 células em uma placa e cultivadas por 1 dia em meio CDM contendo SB431542 10 µM e CHIR99021 1 µM. Um dia depois, o meio foi substituído por meio Neurobasal (21103-049, Gibco) suplementado com Suplemento B-27 (17504-044, Gibco), Suplemento N-2 (17502-048, Gibco), L-glutamina (073- 05391, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), Penicilina/Estreptomicina (15140-122, Gibco), BDNF (028- 16451, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), GDNF (074-06264, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), NT-3 (141-06643, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) e NGF (141-07601, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), seguido de cultura a 37°C por 35 dias sob 5% de CO2. Durante este período de cultura, o meio foi substituído a cada 3 a 4 dias.

[00193] As células foram fixadas pela adição de paraformaldeído a 4% (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) e incubação a 4°C por 1 hora. As células foram reagidas com um anticorpo anti-TUBB3 (845502, BioLegend,

42 / 48 Inc.) e um anticorpo anti-GFAP (ab7260, Abcam PLC) como anticorpos primários, reagindo adicionalmente sequencialmente com um anticorpo secundário marcado com Alexa 488 (Invitrogen Corp.) e um anticorpo secundário marcado com Alexa 568 como anticorpos secundários compatíveis com as espécies de animais imunizadas dos anticorpos primários e depois observadas em um microscópio de fluorescência.

[00194] O surgimento da diferenciação em células nervosas que expressam a proteína TUBB e células da glia que expressam a proteína GFAP foi confirmado pelas NCCs mantidas em cultura por 30 dias.

[00195] A capacidade de diferenciação em células nervosas foi adicionalmente confirmada da mesma maneira que acima, usando NCCs cultivadas por cultura de manutenção por 84 dias. Como resultado, a diferenciação em células nervosas (células positivas para periferina) e células da glia (células positivas para GFAP) foi confirmada. [Exemplo 5: Indução da diferenciação de células da crista neural em células pigmentares]

[00196] A capacidade de diferenciação das NCCs cultivadas em expansão no Exemplo 1 em células nervosas foi confirmada.

[00197] A indução da diferenciação em melanócitos foi realizada com base no método descrito na Literatura Não Patentária 1.

[00198] As NCCs cultivadas em expansão por cultura de manutenção por 84 dias foram inoculadas em uma placa de 6 poços revestida com fibronectina e cultivadas por 1 dia em meio CDM contendo SB431542 10 µM e CHIR99021 1 µM. Um dia depois, o meio foi substituído por meio CDM suplementado com BMP4 e endotelina-3 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), seguido de cultura a 37°C por 7 dias sob 5% de CO2. Durante este período de cultura, o meio foi substituído a cada 2 dias.

[00199] As células foram fixadas pela adição de paraformaldeído a 4% (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) e incubação a 4°C por 1 hora. As

43 / 48 células reagiram com um anticorpo anti-MITF (Sigma-Aldrich Co. LLC) como um anticorpo primário, reagiram adicionalmente sequencialmente com um anticorpo secundário marcado com Alexa 568 (Invitrogen Corp.) como um anticorpo secundário compatível com as espécies animais imunizadas do anticorpo primário e depois observadas em um microscópio de fluorescência. O surgimento da diferenciação em melanócitos que expressam a proteína MITF foi confirmado pelas NCCs mantidas em cultura por 84 dias. [Exemplo 6: Indução da diferenciação de células da crista neural em células estromais mesenquimais]

[00200] A capacidade de diferenciação das NCCs cultivadas em expansão no Exemplo 1 em células estromais mesenquimais foi confirmada.

[00201] A indução da diferenciação em células estromais mesenquimais foi realizada com base no método descrito na Literatura Não Patentária 1.

[00202] As NCCs cultivadas em expansão por cultura de manutenção por 84 dias foram inoculadas em uma placa para cultura de células de 6 cm de diâmetro revestida com fibronectina e cultivadas por 1 dia em meio CDM contendo SB431542 10 µM e CHIR99021 1 µM. Um dia depois, o meio foi substituído por CTS StemPro MSC SFM (Gibco, A1033201). As células foram passadas por dissociação das células com reagente de dissociação de células StemPro Accutase (Invitrogen Corp.) e inoculação a uma densidade de 1,0 a 2,0 × 106 células/placa (para a placa de 10 cm).

[00203] 14 dias após o início da indução da diferenciação em células estromais mesenquimais, as NCCs foram imunocoradas com anticorpo CD73 (BD), anticorpo CD44 (BD), anticorpo CD45 (BD) e anticorpo CD105 (eBioscience, Inc.), anticorpos contra marcadores de antígeno de superfície de células estromais mesenquimais humanas, seguido por análise FACS. O surgimento da diferenciação em células estromais mesenquimais que expressam cada uma das proteínas CD44, CD73 e CD0105 e que não

44 / 48 expressam a proteína CD45 foi confirmado pelas NCCs cultivadas em manutenção por 84 dias. [Exemplo 7: Indução da diferenciação de células da crista neural em células ósseas, condrócitos ou adipócitos]

[00204] A capacidade de diferenciação das NCCs cultivadas em expansão no Exemplo 1 em células ósseas, condrócitos ou adipócitos foi confirmada.

[00205] A indução da diferenciação em células ósseas, condrócitos ou adipócitos foi realizada com base no método descrito na Literatura Não Patentária 1.

[00206] Foi permitido que as NCCs cultivadas em expansão por cultura de manutenção por 84 dias se diferenciassem em células estromais mesenquimais pelo método descrito no Exemplo 6. As células estromais mesenquimais foram inoculadas em 4,0 × 104 células/poço em uma placa de 12 poços revestida com fibronectina e cultivadas por 4 semanas em αMEM contendo 10% de FBS, dexametasona 0,1 µM, ácido ascórbico 50 µg/ml e β- glicerofosfato 10 mM para induzir diferenciação em células ósseas. O meio foi substituído uma vez dois a três dias. Um nódulo calcificado foi detectado por coloração com vermelho de alizarina para confirmar a diferenciação em células ósseas.

[00207] A indução da diferenciação em condrócitos foi realizada da seguinte forma: células estromais mesenquimais nas quais a diferenciação de NCCs cultivadas em expansão por cultura de manutenção por 84 dias foi induzida a uma concentração de 1,5 × 105 células/5 µl em DMEM:F12 (Invitrogen Corp.) contendo 1% (v/v) de ITS + pré-mistura (BD), AA2P 0,17 mM, prolina 0,35 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC), dexametasona 0,1 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC), glicose 0,15% (v/v) (Sigma-Aldrich Co. LLC), piruvato de Na 1 mM (Invitrogen Corp.), GlutaMax 2 mM, MTG 0,05 mM, 40 ng/ml de PDGF-BB e 1% (v/v) de FBS (Nichirei Corp.). A suspensão de

45 / 48 células foi manchada a 5 µL/poço em uma placa de 12 poços revestida com fibronectina e cultivada por 1 hora. Uma hora depois, um meio suplementado adicionalmente com 10 ng/ml de TGF3 (R&D Systems, Inc.) e 100 ng/ml de BMP7 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) foi adicionado a 1 ml/poço. As células foram cultivadas por 10 dias, e o surgimento da diferenciação em condrócitos foi confirmado pela coloração com azul alciano.

[00208] A indução da diferenciação em adipócitos foi realizada da seguinte maneira: células estromais mesenquimais nas quais a diferenciação de NCCs cultivadas em expansão por cultura de manutenção por 84 dias foi induzida foram inoculadas em 4,0 × 104 células/poço em uma placa de 24 poços revestida com fibronectina e cultivadas por 4 semanas em um meio ligado ao kit “bullet” de meio de diferenciação adipogênica de células-tronco mesenquimais humanas – hMSC (Lonza Japan Ltd.). O meio foi substituído uma vez dois a três dias. Foram detectadas gotículas de óleo nas células coradas com vermelho de óleo O para confirmar a diferenciação em adipócitos.

[00209] A coloração com vermelho de alizarina S das células ósseas foi realizada da seguinte forma: as células foram fixadas pela adição de etanol a 100% e incubação à temperatura ambiente por 10 minutos. As células foram reagidas com a solução de coloração vermelho de alizarina (Merck Millipore), lavadas com água, secas e depois observadas em um microscópio.

[00210] A coloração com azul alciano dos condrócitos foi realizada da seguinte forma: as células fixadas pela adição de paraformaldeído a 4% (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) e incubação à temperatura ambiente por 30 minutos reagiram com solução de coloração com azul alciano a 1% (Muto Pure Chemicals Co., Ltd.), lavadas com água e secas.

[00211] A coloração com vermelho de óleo O dos adipócitos foi realizada da seguinte forma: as células foram fixadas em formalina a 10% à temperatura ambiente por 1 hora, reagidas com uma mistura 3:2 de uma

46 / 48 diluição de 0,5% de solução de vermelho de óleo O com isopropanol e água à temperatura ambiente por 1 hora e lavadas com água. As gotículas de óleo foram observadas em um microscópio. [Exemplo 8: Estudo sobre concentração de aditivo de meio - 2]

[00212] O bFGF foi estudado quanto à influência de sua concentração na capacidade de autoproliferação das NCCs e sua capacidade de diferenciação na cultura de expansão das NCCs. A seguir, a cultura de expansão foi realizada sob as mesmas condições do Exemplo 1, a menos que especificado de outra forma.

[00213] A Figura 8 mostra a variação no número total de células quando a concentração de CHIR99021 foi definida para 1,5 µM e a concentração de bFGF foi definida para 10, 12,5, 15,0 ou 17,5 ng/ml. A Figura 9 mostra a variação na porcentagem de células positivas para expressão de SOX10. A concentração de bFGF não influenciou a porcentagem de positividade para expressão de SOX10.

[00214] O comportamento da variação no número total de células foi substancialmente o mesmo dentro da faixa de concentração de bFGF descrita acima, e a taxa de proliferação celular estava dentro da faixa de 6 a 13 vezes por 1 semana. A taxa de proliferação celular por 1 semana no Exemplo 2 estava dentro de uma faixa superior de 8 a 30 vezes na concentração de CHIR99021 de 1 µM ou 2 µM e na concentração de bFGF de 20 ng/ml ou 40 ng/ml (ver a Figura 3), sugerindo que o bFGF contribui para a capacidade das NCCs de se autoproliferar e tem uma faixa de concentração adequada de 20 a 40 ng/ml. [Exemplo 9: Medição da atividade inibidora de GSK3β]

[00215] Um sistema experimental para avaliar a atividade inibidora de GSK3β do inibidor de GSK3β foi estabelecido.

[00216] Na via Wnt/β-catenina, a GSK3β funciona para fosforilar β- catenina na ausência do ligando Wnt. A β-catenina fosforilada é ubiquitinada

47 / 48 e degradada dentro do proteassoma. Portanto, a expressão gênica a jusante da via Wnt-β-catenina é suprimida. Se a GSK3β nessa via for inibida, a β- catenina é translocada para o núcleo, sem ser degradada, para induzir a expressão gênica a jusante da via Wnt-β-catenina, juntamente com outros fatores de transcrição, como fator de células T (TCF)/fator estimulador linfoide (LEF). A linha celular CellSensor LEF/TCF-bla HCT-116 (Thermo Fisher Scientific Inc., K1676) incorpora estavelmente na mesma LEF/TCF e incorpora um gene repórter (gene repórter de beta-lactamase) para expressar o gene repórter sob o controle da LEF/TCF. A expressão do gene repórter nesta linha celular na ausência do ligando Wnt serve como um índice para a inibição da função (função de fosforilação da β-catenina) da GSK3β. A atividade inibidora de GSK3β do inibidor de GSK3β foi medida por ensaio utilizando esta linha celular.

[00217] O ensaio foi realizado de acordo com o protocolo da Invitrogen Corp. (Protocolo de ensaio à base de células CellSensor(R) LEF/TCF-bla HCT 116).

[00218] Especificamente, as células LEF/TCF-bla HCT-116 foram suspensas em um meio de ensaio (OPTI-MEM, FBS dialisado a 0,5%, NEAA 0,1 mM, piruvato de sódio 1 mM, Pen/Strep 100 U/mL/100 µg/mL) (312.500 células/mL). A suspensão de células foi inoculada em cada poço de uma placa de ensaio (10.000 células poço) e cultivada por 16 a 24 horas.

[00219] O inibidor de GSK3β (CHIR99021 foi usado aqui) foi adicionado a cada poço (concentração: 0,316, 1,00, 3,16, 10,0, 31,6, 100, 316, 1000, 3160 e 10000 nM), e as células foram cultivadas por 5 horas.

[00220] Uma solução de substrato de beta-lactamase (mistura de substrato LiveBLAzer-FRET B/G (CCF4-AM)) foi adicionada a cada poço (8 µL/poço) e incubada por 2 horas. Um valor de fluorescência foi medido em um leitor de placas de fluorescência. A medição foi realizada em dois poços por cada condição de concentração.

48 / 48

[00221] Os resultados são mostrados na “Tabela 1”. A atividade inibidora de GSK3β exibida por CHIR99021 1 µM foi de 113,5 (média dos dois poços) em termos do valor da fluorescência.

[00222] A concentração que exibe atividade inibidora de GSK3β equivalente à exibida por CHIR99021 1 µM (valor de fluorescência: 113,5) também pode ser determinada quanto aos inibidores de GSK3β diferente do CHIR99021, medindo os valores de fluorescência sob cada condição de concentração usando este sistema experimental e preparando curvas de calibração de acordo com o método padrão. [Tabela 1] Concentração de composto Valor de fluorescência (nM) Poço 1 Poço 2 10000 88 73 3160 99 136 1000 114 113 316 101 96 100 75 60 31,6 21 45 10,0 12 23 3,16 0 14 1,00 0 0 0,316 6 0

Claims

1 /4 REIVINDICAÇÕES

1. Método para produção de células da crista neural, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (1) obter células da crista neural; e (2) cultivar em suspensão as células da crista neural em um meio compreendendo um inibidor de GSK3 e um fator de crescimento de fibroblastos básico, em que o meio compreende o inibidor de GSK3β com uma concentração que exibe um efeito equivalente ao exibido por CHIR99021 com uma concentração superior a 1 µM.

2. Método de produção de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio compreende adicionalmente um inibidor de TGFβ.

3. Método de produção de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio é meio CDM.

4. Método de produção de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio compreende adicionalmente um fator de crescimento epidérmico.

5. Método de produção de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o inibidor de GSK3β é pelo menos um elemento selecionado a partir do grupo que consiste em CHIR99021, CP21R7, CHIR98014, LY2090314, kenpaullone, AR-AO144-18, TDZD-8, SB216763, BIO, TWS-119 e SB415286.

6. Método de produção de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o inibidor de GSK3 é CHIR99021.

7. Método de produção de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o inibidor de TGFβ é pelo menos um elemento selecionado a partir do grupo que consiste em SB431542, A83-01, LDN193189, Wnt3a/BIO, BMP4, GW788388, SM16, IN-1130, GW6604 e SB505124.

2 /4

8. Método de produção de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa (2), as células da crista neural são passadas a cada 5 a 8 dias após a inoculação.

9. Método de produção de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (1) é a etapa de induzir a diferenciação de células-tronco em células da crista neural.

10. Método para proliferação de células da crista neural, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de: (I) cultivar em suspensão as células da crista neural em um meio compreendendo um inibidor de GSK3β e um fator de crescimento de fibroblastos básico, em que o meio compreende o inibidor de GSK3β com uma concentração que exibe um efeito equivalente ao exibido por CHIR99021 com uma concentração superior a 1 µM.

11. Meio, caracterizado pelo fato de que compreende um inibidor de GSK3β, um fator de crescimento de fibroblastos básico e células da crista neural, em que o meio compreende o inibidor de GSK3β com uma concentração que exibe um efeito equivalente ao exibido por CHIR99021 com uma concentração superior a 1 µM.

12. Meio de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um inibidor de TGFβ.

13. Meio de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o meio é meio CDM.

14. Meio de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um fator de crescimento epidérmico.

15. Meio de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o inibidor de GSK3β é pelo menos um elemento selecionado a partir do grupo que consiste em CHIR99021, CP21R7, CHIR98014, LY2090314, kenpaullone, AR-AO144-18, TDZD-8, SB216763, BIO, TWS- 119 e SB415286.

3 /4

16. Meio de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o inibidor de GSK3β é CHIR99021.

17. Meio de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o inibidor de TGFβ é pelo menos um elemento selecionado a partir do grupo que consiste em SB431542, A83-01, LDN193189, Wnt3a/BIO, BMP4, GW788388, SM16, IN-1130, GW6604 e SB505124.

18. Estoque congelado, caracterizado pelo fato de que compreende células da crista neural obtidas por um método de produção como definido na reivindicação 1.

19. Método para produção de células nervosas, células da glia, células estromais mesenquimais, células ósseas, condrócitos, células da córnea ou células pigmentares, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (i) cultivar em suspensão células da crista neural em um meio compreendendo um inibidor de GSK3β e um fator de crescimento de fibroblastos básico, em que o meio compreende o inibidor de GSK3β com uma concentração que exibe um efeito equivalente ao exibido por CHIR99021 com uma concentração superior a 1 µM; e (ii) diferenciar as células da crista neural obtidas na etapa (i) em células de pelo menos uma linhagem selecionada a partir do grupo que consiste em células nervosas, células da glia, células estromais mesenquimais, células ósseas, condrócitos, células da córnea e células pigmentares.

20. Método para cultivar células da crista neural com multipotência por um longo período, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (1) obter célula da crista neural; e (2) cultivar em suspensão as células da crista neural em um meio compreendendo um inibidor de GSK3β e um fator de crescimento de fibroblastos básico, em que o meio compreende o inibidor de GSK3β com

4 /4 uma concentração que exibe um efeito equivalente ao exibido por CHIR99021 com uma concentração superior a 1 µM.

21. Uso de um meio, caracterizado pelo fato de que compreende um fator de crescimento de fibroblastos básico e um inibidor de GSK3β com uma concentração que exibe um efeito equivalente ao exibido por CHIR99021 com uma concentração superior a 1 µM, para cultura de células da crista neural com multipotência por um longo período.