JP2017525351A - 多能性幹細胞の培養用培地 - Google Patents

多能性幹細胞の培養用培地 Download PDF

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Abstract

ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤及びＡｘｉｎ安定化剤と、また任意にＰＫＣ阻害剤とを含む培養培地が開示される。それを含む細胞培養物及びその使用もまた開示される。【選択図】なし

Description

本発明は、そのいくつかの実施形態では、概して、多能性幹細胞、より具体的には無感作多能性幹細胞を生成及び拡大するため使用され得る新規な培養培地に関する。
誘導多能性（ｉＰＳ）細胞と呼ばれるＥＳＣ様細胞は、本来的には無感作マウスＥＳＣとの全ての特徴を共有するＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃの種々の転写因子の異所性発現によって体細胞から生成され得る。リプログラミングプロセスは、典型的には少なくとも１週間の期間の広範な細胞増殖を必要とし、その後、特定の画分の子孫細胞が、予測不可能なパターン及び異なる待ち時間でＥＳ様状態への変換に成功する。追加の及び代替的な転写因子、及び幾つかの外因性因子を置き換えることができるか、又はＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃ（ＯＳＫＭ）と併用した場合にリプログラミング効率を押し上げることができる小分子の同定において飛躍的な進歩が達成されている。様々な酵素及びクロマチンリモデリング因子（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｒｅｍｏｄｅｌｅｒ）が、必要とされる初期及び後期のクロマチン変化の促進においてリプログラミング因子と協同することが確認され、ドナー子孫細胞の画分における確実なｉＰＳＣリプログラミングをもたらす（例えば、Ｗｄｒ５、Ｕｔｘ、Ｔｅｔ２）。
これらの前進にもかかわらず、体細胞のリプログラミング効率は低いままである。さらに、リプログラミング因子の過剰発現によりチャレンジされた各個別の体性エピゲノムについて、結果は非常に推計学的であり、大半の細胞は異なるレベルのリプログラミングを推測する。
胚性幹細胞（ＥＳＣ）は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）サイトカイン及びマウス胚フィーダー（ＭＥＦ）細胞の存在下、ｉｎ ｖｉｔｒｏで発生する胚の内部細胞開（ＩＣＭ）を外植することによってマウス胚から最初に単離された。マウスＥＳＣは、初期のＩＣＭの分子サインを再現し、したがって、「無感作多能性細胞」と呼ばれる。これは、Ｏｃｔ、Ｎａｎｏｇ、及びＫｌｆの多能性遺伝子の発現、エピブラスト及び体性初期系列特異的マーカーの欠失、並びに雌性細胞において活性な両方のＸ染色体を有する前Ｘ不活性化状態の維持を含む。さらに、上記細胞は、それらの細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、またマウス胚盤胞への注入により全ての細胞型へとロバストに分化できることから無制限の発生可能性を保持し、キメラ動物の三胚葉及び生殖系列に効率的に寄与する。最終的には、マウスＥＳ細胞の高い成長率及びオープンクロマチン構造は、相同組換えを介する効率的な遺伝子特異的ターゲッティングを可能とすることによって、マウス遺伝学に対して最も価値のある手段の一つとしてこれらの細胞を与えた。
最近では、ＥｐｉＳＣと呼ばれる劇的に異なる種類の多能性細胞が、ＦＧＦ２［「塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）」としても知られる］及びアクチビンで補足された成長条件において、移植後のエピブラストの外植によって得られた。ＥｐｉＳＣは多能性であるが、ＥＳＣと比べると制限された発生可能性を有するため、「プライム多能性細胞」と呼ばれる。ＥｐｉＳＣは動物キメラの生成に非常に非効率的であり、既にＸ染色体不活性化を経ており、初期分化系列決定マーカーの不均一な発現を示す。無感作ネズミ科多能性細胞がアクチビン及びＦＧＦ２のシグナル伝達を促進することによってｉｎ ｖｉｔｒｏでプライムＥｐｉＳＣ様状態へと分化し得るのに対し、ＥｐｉＳＣｓは既定のシグナル伝達刺激によってＥＳＣ様無感作多能性へと後成的に戻ることができる。
注目すべきことに、ヒト由来のＥＳＣは、マウスＥＳＣよりもＥｐｉＳＣ細胞と幾つかの特徴を共有する。マウスＥＳＣとは対照的に、ヒトＥＳ細胞の維持は、（ＬＩＦ／Ｓｔａｔ３シグナル伝達よりも）ＦＧＦ２及びアクチビンＡを必要とし、それらは単一細胞としての継代に非常に感受性であり、エピブラスト及び系列決定マーカーの不均一な発現を呈し、（ＩＣＭで活性な遠位Ｏｃｔ４エンハンサーではなく）近位エンハンサーエレメントを利用して移植後のエピブラストにおけるＯｃｔ４の発現を制御する。したがって、ヒトＥＳＣとマウスエピブラストＥｐｉＳＣの分子及び生物学的な類似性は、ヒトＥＳＣがマウスＥＳＣの無感作状態よりもプライム多能性状態に対応し、これは疾患関連研究に対するヒトＥＳＣの使用を妨げる従来のヒトＥＳＣの生物学的特性に関する根本的な理由となり得ることを示唆する。これは、面倒な培養条件、相同性組換えによる低い遺伝子ターゲッティング効率、及び異なるヒトＥＳＣ株とｉＰＳＣ株の間の分化傾向における劇的な不均一性を含む。
従来の／プライムのヒトＥＳＣはＩＣＭから得られるという事実は、プライム状態はヒトにおいて単離され得る多能性の唯一の又は「デフォルト」の状態であるという誤った信念を導いた。追加のシグナル伝達分子又は転写因子がＬＩＦサイトカインと共に外因的に提供される場合に限り、非肥満糖尿病誘発性（ＮＯＤ）マウス胚盤胞からマウス無感作ＥＳＣ細胞を得ることができる（例えば、無感作ＮＯＤ ＥＳＣ及びｉＰＳＣをＰＤ０３２５９０１／ＣＨＩＲ９９０２１／ＬＩＦ又はケンパウロン／ＣＨＩＲ９９０２１／ＬＩＦ又はＫｌｆ４／Ｌｉｆ及びｃ−Ｍｙｃ／ＬＩＦの恒常的発現条件において増やすことができた）。これらの追加の因子の不在下で（又はＬＩＦのみの条件において）、マウスＩＣＭから単離された場合であっても、無感作状態は、おそらくは正常な初期発生の間にｉｎ ｖｉｖｏ分化を模倣するプロセスにあるＥｐｉＳＣ細胞と区別することがほとんどできない、多能性状態のｉｎ ｖｉｔｒｏでの取得によってマスクされる。これらの知見は、先に考慮された「非許容」株から完全に多能性で無感作のＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞の生成を可能とした。ＮＯＤマウスにおける実験は、ヒトにおける無感作又はマウスのＥＳＣ様幹細胞の誘導を可能とする適切な条件が考案されたかどうか、また無感作ヒト多能性状態の安定化が（ＮＯＤマウス及びラットＥＳＣ／ｉＰＳＣに対して適用されたものと類似する又は異なる）追加の不特定の因子を必要とするかどうかという疑問をもたらした。さらに、外植された胚盤胞がｉｎ ｖｉｔｒｏでプライム状態へと分化する可能性に対する支持は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで得られたヒト雌性ＥＳＣ株におけるＸ染色体ダイナミクスの注意深いモニタリングによって作成され、細胞がこの誘導後のｉｎ ｖｉｔｒｏ適合プロセスの一部としてＸ染色体不活性化を経て、これが高濃度の酸素によって加速され、ＬＩＦ又は不特定のシグナルを提供する特定の種類のフィーダー細胞の添加によって部分的に減衰され得ることを実証した。これらの結果は、ＸａＸａ（ＸＩＳＴ体の不在に基づくＸ活性、Ｘ活性）無感作細胞がヒトＩＣＭに存在する可能性があり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで捕捉された従来のヒトＥＳＣはそれらのＩＣＭ対応物を十分に反映していないことを示した。
これらの観察は、適切な条件は、今までのところ、ヒトを含み得る、プライム又はＥｐｉＳＣ様の細胞を生じた種の範囲からの無感作幹細胞の単離を可能とするように考案されていない可能性をもたらした。実際、フォローアップ研究では、ネズミ科のＥＳＣとより広範囲に亘って特徴を共有する代替的なヒト多能性細胞状態を得る可能性に関して証拠が提供された。先に示されるように（非特許文献１）、ｉｎ ｖｉｔｒｏでネズミ科ＥＳＣと幾つかの特徴を共有する新規な多能性状態の安定化をもたらした、無感作多能性状態を支持するリプログラミング因子及び／又は小分子を導入することを含むスクリーニングのアプローチを採用した（非特許文献１）。ＯＣＴ４／ＫＬＦ４又はＫＬＦ２／ＫＬＦ４の過剰発現と共にＬＩＦサイトカイン及びＥＲＫ１／２阻害剤であるＰＤ０３２５９０１及びＧＳＫ３ｂ阻害剤であるＣＨＩＲ９９０２１（２ｉ補足条件と略記される−ＥＲＫ１／２シグナル伝達の２つの小分子阻害剤、及びＷＮＴシグナル伝達を促進するためのＧＳＫ３β、「ＰＤ／ＣＨ」条件又は「２ｉ」条件と略記される）での増殖は、その後、マウスＥＳＣのそれを思わせるような、誤ってヒト無感作多能性状態と呼ばれた従来のＥＳ細胞及びｉＰＳＣ細胞への変換を誘導した（非特許文献１）。これらの先に記載された無感作ヒトＥＳＣは、胚芽期の組織分化、及びｉｎ ｖｉｖｏの奇形種形成を含む幾つかの利用可能な基準によって多能性である。重要なことには、それらは従来の「プライム」ヒトＥＳＣ／ｉＰＳＣと後成的及び分子的に明確に異なる。非特許文献１によって生成された「無感作」ｈＰＳＣは、両方のＸアレルにＸＩＳＴメチル化、すなわち高い単一細胞クローニング効率を呈し、無感作マウスＥＳ細胞に似た遺伝子発現パターンを示した（ＭＨＣクラスＩ発現の欠如、及び９７７３個の発現されたオルソログ遺伝子に対する異種間無作為遺伝子クラスタリングにおいてネズミ科無感作ＥＳＣとクラスター化される）（非特許文献１）。それにもかかわらず、先に公開され／樹立された株の真の多能性及びそれらの安定性に対して疑いをかける、多数の制限及び未解決の問題が残されている。導入遺伝子依存性無感作ＥＳＣ／ｉＰＳＣのみが１８継代を超えて維持可能であった。フォルスコリンは、２ｉ／ＬＩＦと共に外因性因子の置換を可能としたが、１９継代以下に対してのみであり、培養物は高い分化傾向を保持した（非特許文献１）。ＸＩＳＴは、先に参照された無感作ヒトＥＳＣ／ｉＰＳＣにおいて完全にメチル化され、該細胞はいかなるＸＩＳＴの転写も欠き（非特許文献１）、これは明らかに（ＸＩＳＴ体、すなわちＸＩＳＴ被覆Ｘ染色体を形成せずに）ＸＩＳＴ転写を明確に示すヒト胚盤胞に対するｉｎ ｖｉｖｏの結果と矛盾する（非特許文献２）。総括すると、これらの知見は、これまでのところ単離された細胞はヒトＩＣＭの確実な特徴を反映せず、多能性の減弱及び分化傾向の増強を保持することを示唆する。多くの異なるグループによって作成された実在する公開されたデータは、遺伝子修飾されていない多能性無感作ヒト幹細胞は、これまでのところ適切に単離されておらず、かかる細胞の拡大を可能とする条件及びそれらの分子特性（必要に応じて存在することが証明される）は未知であるという概念を裏付ける理論的根拠を強調する（非特許文献３、非特許文献１）
多細胞生物は、臓器及び器官の一生涯の適合を保証するためのホメオスタシス機構を進化させた。これらの機構のうち、望ましくない適合性の低い細胞の排除を調節する機構は、組織発生及びホメオスタシスに必須である。明らかに傷害された又は過剰増殖の細胞は、通常、よく特性評価された細胞自律性アポトーシス経路を作動させるか、又はがんを生じるのに対し、生存可能な細胞の適合性を査定して組織の細胞組成を最適化する機構はそれほどよく理解されていない。候補の機構は、ハエで最初に説明された「細胞競合」（「細胞チーティング」としても知られる）の現象である。
ハエにおける研究は、成長する臓器の細胞は、それらの適合性を隣接細胞のそれと比較することができ、フィッター細胞（ｆｉｔｔｅｒ ｃｅｌｌ）集団（競合者）と直面した場合に、適合性は低いが生存可能な細胞は排除される（打ち負かされる）。生存のための細胞競合は、分化増殖からの寄与に加えて、細胞の非自律的な機構による適合性の低い集団のアポトーシス性又は老化により媒介される排除によって実行されることから、積極的なプロセスである。ハエにおける競合を誘発する細胞パラメーターは、タンパク質合成能力における相違、成長因子受容性、及びｄＭｙｃの発現レベル、細胞同化作用の主要な活性化因子を含む。超競合（ｓｕｐｅｒ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ）又はチーティング（ｃｈｅａｔｉｎｇ）は細胞競合の変形であり、ここでは適度にＭｙｃを過剰発現している細胞が野生型（ＷＴ）細胞を打ち負かす。細胞競合による細胞集団の置換は、競合細胞のほとんどがサイズ制御機構に従うことから、表現型上はサイレントである。このプロセスは、幹細胞ニッチ及び子孫細胞プールから最適以下の細胞を排除する機構を提供する可能性があることから、組織性能の長期維持に重要な可能性がある。さらに、生存のための細胞競合は、再生中の組織補填を増強するようにはたらく可能性がある。
最近では、マウスにおいて細胞競合が特性評価されている。或る一つの研究は、細胞競合はマウスエピブラストＥ６．５段階における隣接細胞間のＭｙｃ用量における不均衡によって促進され、またマウス胚におけるｃ−Ｍｙｃ過剰発現細胞は「チーター」として行動し、同じ種に属する同じマウス胚内の隣接細胞を打ち負かすことを示した（非特許文献４及び非特許文献５）。他の研究は、マウス胚性幹細胞又は造血幹細胞におけるＰ５３の部分的又は完全な枯渇が、それらにおいてＷＴマウス細胞を打ち負かす能力を与えることを示した。
更なる背景技術として、非特許文献６、非特許文献７、特許文献１、非特許文献８、非特許文献９、及び非特許文献１０が挙げられる。
国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０８／０４５１６号（“Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ”，Ｊａｅｎｉｓｃｈ；Ｒｕｄｏｌｆ；ｅｔ ａｌ．）
Ｈａｎｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１０ｂ Ｏｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｄｅ Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２ Ｄｅｊｏｓｅｚ Ｍ ｅｔ ａｌ．， ２０１３．"Ｓａｆｅｇｕａｒｄｓ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｓｈｏｗｎ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｃｈｅａｔｅｒ ｓｃｒｅｅｎ"．Ｓｅｅ ｃｏｍｍｅｎｔ ｉｎ ＰｕｂＭｅｄ Ｃｏｍｍｏｎｓ ｂｅｌｏｗ Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３ Ｓｅｐ ２７；３４１（６１５３）：１５１１−４ Ｃｌａｖｅｒiａ Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，２０１３．"Ｍｙｃ−ｄｒｉｖｅｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｍｂｒｙｏ"．Ｎａｔｕｒｅ． ２０１３ Ａｕｇ １；５００（７４６０）：３９−４４ Ｘｕ Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，２０１３（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８８：９７６７−９７７８） Ｌｕｏ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，２０１３（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ． Ｍａｒ ２６． ｄｏｉ：１０．１００２／ｓｔｅｍ．１３７４．［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］） Ｋｉｍ，Ｈ．，Ｗｕ，Ｊ．，Ｙｅ，Ｓ．，Ｔａｉ，Ｃ．−Ｉ．，Ｚｈｏｕ，Ｘ．，Ｙａｎ，Ｈ．，Ｌｉ，Ｐ．，Ｐｅｒａ，Ｍ．，ａｎｄ Ｙｉｎｇ，Ｑ．−Ｌ． （２０１３）．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｂ−ｃａｔｅｎｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｍａｉｎｔａｉｎｓ ｍｏｕｓｅ ｅｐｉｂｌａｓｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ４，１?１１ Ｌｉ，Ｘ．，Ｚｈｕ，Ｌ．，Ｙａｎｇ，Ａ．，Ｌｉｎ，Ｊ．，Ｔａｎｇ，Ｆ．，Ｊｉｎ，Ｓ．，Ｗｅｉ，Ｚ．，Ｌｉ，Ｊ．，ａｎｄ Ｊｉｎ，Ｙ．（２０１１）．Ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ−ＮＦＡＴ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｃｒｉｔｉｃａｌｌｙ Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｅａｒｌｙ Ｌｉｎｅａｇｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ８，４６?５８ Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｔ．，Ｕｅｄａ，Ｊ．，Ｈｏ，Ｊ．Ｃ．，Ｉｗａｓａｋｉ，Ｋ．，Ｐｏｅｌｌｉｎｇｅｒ，Ｌ．，Ｈａｒａｄａ，Ｉ．，ａｎｄ Ｓａｗａｄａ，Ｙ．（２０１２）．Ｄｕａｌ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｒｃ ａｎｄ ＧＳＫ３ Ｍａｉｎｔａｉｎｓ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，Ｗｈｏｓｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｉｓ Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌｌｙ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ Ｓｒｃ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３０，１３９４?１４０４
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、Ａｘｉｎ安定化剤とを含む培養培地が提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地はＰＫＣ阻害剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、Ａｘｉｎ安定化剤と、ＰＫＣ阻害剤とを含む培養培地が提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＲＣ阻害剤、アスコルビン酸、ＰＫＡアゴニスト、ＹＡＰ／ＴＡＺ阻害剤、ＮＯＴＣＨ阻害剤、ＳＨＨ阻害剤、ＴＧＦβＲ阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、ＦＧＦＲ阻害剤、ＪＮＫ阻害剤、ＥＲＫ５阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤、ＡＲＡＦｉ、ＣＲＡＦｉ、ｐ３８阻害剤、ＧＳＫ３ｂ阻害剤、ＬＳＤ１阻害剤、ＰＩ３Ｋ活性化剤、ＳＭＡＤ活性化剤、及びＤＯＴ１Ｌ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記ＳＭＡＤ活性化剤は、アクチビンＡ、ＴＧＦβ１、及びＢＭＰ４からなる群から選択される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＰＩ３Ｋ活性化剤は、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＳＣＦ、及びＦＧＦ２からなる群から選択される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培地はＧＳＫ３ｂ阻害剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、Ａｘｉｎ安定化剤と、ＰＫＣ阻害剤と、ＧＳＫ３ｂ阻害剤とを含む培養培地が提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＲＣ阻害剤、アスコルビン酸、ＰＫＡアゴニスト、ＹＡＰ／ＴＡＺ阻害剤、ＮＯＴＣＨ阻害剤、ＳＨＨ阻害剤、ＴＧＦβＲ阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、ＦＧＦＲ阻害剤、ＪＮＫ阻害剤、ＥＲＫ５阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤、ＡＲＡＦｉ、ＣＲＡＦｉ、ｐ３８阻害剤、ＬＳＤ１阻害剤、ＰＩ３Ｋ活性化剤、ＳＭＡＤ活性化剤、及びＤＯＴ１Ｌ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦβ１）、アクチビンＡ、ＧＳＫ３ｂ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、Ｐ３８阻害剤、ＪＮＫ阻害剤、ＮＯＴＣＨ阻害剤、ＳＲＣ阻害剤、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）、インスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦＩＩ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達阻害剤、ソニックヘッジホッグ経路（ＳＨＨ）阻害剤、ＥＲＫ５阻害剤、フォルスコリン、ケンパウロン、ＢａｙＫ８６４４、Ｇ９ａ／Ｇｌｐの阻害剤（例えば、ＢＩＸ０１２９４又はＵＮＣ０６３８）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＹＡＰ／ＴＡＺ阻害剤、Ｌ−アスコルビン酸、ＬＳＤ１阻害剤、及びＤＯＴ１Ｌ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、トランスフォーミング増殖因子受容体（ＴＧＦＲ）阻害剤、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）阻害剤、アクチビンＡ、ＧＳＫ３ｂ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、Ｐ３８阻害剤、ＪＮＫ阻害剤、ＮＯＴＣＨ阻害剤、ＳＲＣ阻害剤、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）、インスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦＩＩ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達阻害剤、ソニックヘッジホッグ経路（ＳＨＨ）阻害剤、ＥＲＫ５阻害剤、フォルスコリン、ケンパウロン、ＢａｙＫ８６４４、Ｇ９ａ／Ｇｌｐの阻害剤（例えば、ＢＩＸ０１２９４又はＵＮＣ０６３８）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＹＡＰ／ＴＡＺ阻害剤、Ｌ−アスコルビン酸、ＬＳＤ１阻害剤、及びＤＯＴ１Ｌ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、アクチビンＡ、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦβ１）、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）阻害剤、ＧＳＫ３ｂ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、Ｐ３８阻害剤、ＪＮＫ阻害剤、ＮＯＴＣＨ阻害剤、ＳＲＣ阻害剤、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）、インスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦＩＩ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達阻害剤、ソニックヘッジホッグ経路（ＳＨＨ）阻害剤、ＥＲＫ５阻害剤、フォルスコリン、ケンパウロン、ＢａｙＫ８６４４、Ｇ９ａ／Ｇｌｐの阻害剤（例えば、ＢＩＸ０１２９４又はＵＮＣ０６３８）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＹＡＰ／ＴＡＺ阻害剤、Ｌ−アスコルビン酸、ＬＳＤ１阻害剤、及びＤＯＴ１Ｌ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子受容体（ＴＧＦＲ）阻害剤、ＧＳＫ３ｂ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、Ｐ３８阻害剤、ＪＮＫ阻害剤、ＮＯＴＣＨ阻害剤、ＳＲＣ阻害剤、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）、インスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦＩＩ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達阻害剤、ソニックヘッジホッグ経路（ＳＨＨ）阻害剤、ＥＲＫ５阻害剤、フォルスコリン、ケンパウロン、ＢａｙＫ８６４４、Ｇ９ａ／Ｇｌｐの阻害剤（例えば、ＢＩＸ０１２９４又はＵＮＣ０６３８）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＹＡＰ／ＴＡＺ阻害剤、Ｌ−アスコルビン酸、ＬＳＤ１阻害剤、及びＤＯＴ１Ｌ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＳＲＣ阻害剤とを含む培養培地が提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地はＡＸＩＮ複合安定化剤（ＡＸＩＮｓ）を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地はＧＳＫ３β阻害剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地はｐ３８阻害剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、ｐ３８阻害剤と、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＳＲＣ阻害剤及びＡＸＩＮ複合安定化剤（ＡＸＩＮｓ）からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤とを含む培養培地が提供される。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＳＴＡＴ３活性化剤と、トランスフォーミング増殖因子ベータ受容体（ＴＧＦβＲ）阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤と、ｐ３８阻害剤と、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）とを含む培養培地が提供される。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、細胞と、本発明の幾つかの実施形態の培養培地とを含む細胞培養物が提供される。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、無感作多能性幹細胞（ＰＳＣ）を生成する方法であって、
本発明の幾つかの実施形態の培養培地中で感作ＰＳＣ細胞をインキュベートし、感作ＰＳＣから無感作ＰＳＣを生成させることを含み、
（ｉ）無感作ＰＳＣが雌性ＰＳＣである場合、無感作雌性ＰＳＣがＸ不活性特異的転写産物（ＸＩＳＴ）遺伝子のプロモーターの２つの非メチル化アレルを有し、及び
（ｉｉ）無感作ＰＳＣが雄性ＰＳＣである場合、無感作雄性ＰＳＣがＸＩＳＴ遺伝子のプロモーターの１つの非メチル化アレルを有し、及び／又は
無感作ＰＳＣにおける転写因子Ｅ３（ＴＦＥ３）の発現レベルが、免疫染色アッセイによって特定される１以上である細胞質に対する核の発現比率を特徴とし、及び／又は
無感作ＰＳＣが前記無感作ＰＳＣの細胞表面上でのＣ−ＫＩＴ（ＣＤ１１７）の陽性発現を特徴とし、
それによって前記無感作ＰＳＣを生成する、
方法が提供される。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、無感作多能性幹細胞（ＰＳＣ）を生成する方法であって、
感作ＰＳＣからの無感作ＰＳＣの生成を可能とする条件下で、感作ＰＳＣ細胞をインキュベートすることを含み、
該無感作ＰＳＣが、非メチル化Ｘ不活性特異的転写産物（ＸＩＳＴ）遺伝子を含み、ここで、
（ｉ）無感作ＰＳＣが雌性ＰＳＣである場合、無感作雌性ＰＳＣがＸＩＳＴ遺伝子のプロモーターの２つの非メチル化アレルを有し、及び
（ｉｉ）無感作ＰＳＣが雄性ＰＳＣである場合、無感作雄性ＰＳＣがＸＩＳＴ遺伝子のプロモーターの１つの非メチル化アレルを有し、及び／又は
転写因子Ｅ３（ＴＦＥ３）の発現レベルが、免疫染色アッセイによって特定される１以上である細胞質に対する核の発現比率を特徴とし、
ここで、上記条件が、ＫＯ−ＤＭＥＭと、Ｎ２補足物（Ｇｉｂｃｏ）と、Ｂ２７補足物と、ＬＩＦと、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤と、Ａｘｉｎ安定化剤とを含む培養培地を含み、それによって無感作ＰＳＣを生成する、方法が提供される。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、無感作多能性幹細胞（ＰＳＣ）を生成する方法であって、
感作ＰＳＣからの無感作ＰＳＣの生成を可能とする条件下で、感作ＰＳＣ細胞をインキュベートすることを含み、
該無感作ＰＳＣが、非メチル化Ｘ不活性特異的転写産物（ＸＩＳＴ）遺伝子を含み、ここで、
（ｉ）無感作ＰＳＣが雌性ＰＳＣである場合、無感作雌性ＰＳＣがＸＩＳＴ遺伝子のプロモーターの２つの非メチル化アレルを有し、及び
（ｉｉ）無感作ＰＳＣが雄性ＰＳＣである場合、無感作雄性ＰＳＣがＸＩＳＴ遺伝子のプロモーターの１つの非メチル化アレルを有し、及び／又は
転写因子Ｅ３（ＴＦＥ３）の発現レベルが、免疫染色アッセイによって特定される１以上である細胞質に対する核の発現比率を特徴とし、
ここで、上記条件が、ＤＭＥＭ−Ｆ１２／ＮＥＵＲＯｂａｓａｌ（ＧＩＢＣＯ）１：１ミックスと、Ｎ２補足物（Ｇｉｂｃｏ）と、Ｂ２７補足物（ＧＩＢＣＯ）と、ＬＩＦ（ＳＴＡＴ３活性化剤）と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤と、Ａｘｉｎ安定化剤とを含む培養培地を含み、
それによって無感作ＰＳＣを生成する、方法が提供される。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、無感作多能性幹細胞（ＰＳＣ）を生成する方法であって、
感作ＰＳＣからの無感作ＰＳＣの生成を可能とする条件下で、感作ＰＳＣ細胞をインキュベートすることを含み、
該無感作ＰＳＣが、非メチル化Ｘ不活性特異的転写産物（ＸＩＳＴ）遺伝子を含み、ここで、
（ｉ）無感作ＰＳＣが雌性ＰＳＣである場合、無感作雌性ＰＳＣがＸＩＳＴ遺伝子のプロモーターの２つの非メチル化アレルを有し、及び
（ｉｉ）無感作ＰＳＣが雄性ＰＳＣである場合、無感作雄性ＰＳＣがＸＩＳＴ遺伝子のプロモーターの１つの非メチル化アレルを有し、及び／又は
転写因子Ｅ３（ＴＦＥ３）の発現レベルが、免疫染色アッセイによって特定される１以上である細胞質に対する核の発現比率を特徴とし、
ここで、上記条件が、ＤＭＥＭ−Ｆ１２と、Ｎ２補足物（Ｇｉｂｃｏ）と、Ｂ２７補足物と、ＬＩＦ（ＳＴＡＴ３活性化剤）と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤と、Ａｘｉｎ安定化剤とを含む培養培地を含み、
それによって無感作ＰＳＣを生成する、方法が提供される。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、無感作多能性幹細胞（ＰＳＣ）を生成する方法であって、
感作ＰＳＣからの無感作ＰＳＣの生成を可能とする条件下で、感作ＰＳＣ細胞をインキュベートすることを含み、
該無感作ＰＳＣが、非メチル化Ｘ不活性特異的転写産物（ＸＩＳＴ）遺伝子を含み、ここで、
（ｉ）無感作ＰＳＣが雌性ＰＳＣである場合、無感作雌性ＰＳＣがＸＩＳＴ遺伝子のプロモーターの２つの非メチル化アレルを有し、及び
（ｉｉ）無感作ＰＳＣが雄性ＰＳＣである場合、無感作雄性ＰＳＣがＸＩＳＴ遺伝子のプロモーターの１つの非メチル化アレルを有し、及び／又は
転写因子Ｅ３（ＴＦＥ３）の発現レベルが、免疫染色アッセイによって特定される１以上である細胞質に対する核の発現比率を特徴とし、
ここで、上記条件が、ＫＯ−ＤＭＥＭと、Ｎ２補足物（Ｇｉｂｃｏ）と、Ｂ２７補足物と、ＬＩＦと、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３ｂ阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤と、Ａｘｉｎ安定化剤とを含む培養培地を含み、
それによって無感作ＰＳＣを生成する、方法が提供される。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、無感作多能性幹細胞（ＰＳＣ）を生成する方法であって、
感作ＰＳＣからの無感作ＰＳＣの生成を可能とする条件下で、感作ＰＳＣ細胞をインキュベートすることを含み、
該無感作ＰＳＣが、非メチル化Ｘ不活性特異的転写産物（ＸＩＳＴ）遺伝子を含み、ここで、
（ｉ）無感作ＰＳＣが雌性ＰＳＣである場合、無感作雌性ＰＳＣがＸＩＳＴ遺伝子のプロモーターの２つの非メチル化アレルを有し、及び
（ｉｉ）無感作ＰＳＣが雄性ＰＳＣである場合、無感作雄性ＰＳＣがＸＩＳＴ遺伝子のプロモーターの１つの非メチル化アレルを有し、及び／又は
転写因子Ｅ３（ＴＦＥ３）の発現レベルが、免疫染色アッセイによって特定される１以上である細胞質に対する核の発現比率を特徴とし、
ここで、上記条件が、ＤＭＥＭ−Ｆ１２／ＮＥＵＲＯｂａｓａｌ（ＧＩＢＣＯ）１：１ミックスと、Ｎ２補足物（Ｇｉｂｃｏ）と、Ｂ２７補足物と、ＬＩＦ（ＳＴＡＴ３活性化剤）と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３ｂ阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤と、Ａｘｉｎ安定化剤とを含む培養培地を含み、
それによって無感作ＰＳＣを生成する、方法が提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、無感作多能性幹細胞（ＰＳＣ）を生成する方法であって、
感作ＰＳＣからの無感作ＰＳＣの生成を可能とする条件下で、感作ＰＳＣ細胞をインキュベートすることを含み、
該無感作ＰＳＣが、非メチル化Ｘ不活性特異的転写産物（ＸＩＳＴ）遺伝子を含み、ここで、
（ｉ）無感作ＰＳＣが雌性ＰＳＣである場合、無感作雌性ＰＳＣがＸＩＳＴ遺伝子のプロモーターの２つの非メチル化アレルを有し、及び
（ｉｉ）無感作ＰＳＣが雄性ＰＳＣである場合、無感作雄性ＰＳＣがＸＩＳＴ遺伝子のプロモーターの１つの非メチル化アレルを有し、及び／又は
転写因子Ｅ３（ＴＦＥ３）の発現レベルが、免疫染色アッセイによって特定される１以上である細胞質に対する核の発現比率を特徴とし、
ここで、上記条件が、ＤＭＥＭ−Ｆ１２と、Ｎ２補足物（Ｇｉｂｃｏ）と、Ｂ２７補足物と、ＬＩＦ（ＳＴＡＴ３活性化剤）と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３ｂ阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤とを含む培養培地を含み、
それによって無感作ＰＳＣを生成する、方法が提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、誘導はフィーダー細胞を欠く培養条件下で行われる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、誘導は、フィーダー細胞上での培養を含む培養条件下で行われる。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、体細胞から誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の生成を改善する方法であって、
（ａ）Ｎａｎｏｇ、ＥＳＲＲＢ、ＫＬＦ２、ＴＢＸ３、ＥＲＡＳ、及びＫＬＦ１７からなる群から選択される第１の因子と、Ｎａｎｏｇ、ＥＳＲＲＢ、ＫＬＦ２、ＴＢＸ３、ＥＲＡＳ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、及びＫＬＦ１７からなる群から選択される第２の因子とを上記体細胞内で発現し、ここで、第１及び第２の因子が同一ではない、並びに
（ｂ）上記体細胞においてＭｂｄ３及び／又はＧａｔａｄ２ａの発現及び／又は活性を阻害することによって、体細胞からのｉＰＳＣの生成を改善すること、
を含む方法が提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地はＲＯＣＫ阻害剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地はＪＮＫ阻害剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）インデューサー、トランスフォーミング増殖因子受容体（ＴＧＦＲ）阻害剤、及び線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）インデューサー、トランスフォーミング増殖因子受容体（ＴＧＦＲ）阻害剤、及び線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）阻害剤からなる群から選択される少なくとも２つの薬剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＴＧＦインデューサーを更に含み、ここで、ＴＧＦインデューサーは、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦβ１）、トランスフォーミング増殖因子ベータ２（ＴＧＦβ２）、及びアクチビンからなる群から選択される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＴＧＦインデューサーは、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦβ１）、トランスフォーミング増殖因子ベータ２（ＴＧＦβ２）、及びアクチビンからなる群から選択される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤及び／又はＢＭＰ阻害剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）、インスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦＩＩ）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、ソニックヘッジホッグ経路（ＳＨＨ）阻害剤、ＥＲＫ５阻害剤、フォルスコリン、ケンパウロン、ＢａｙＫ８６４４、Ｇ９ａ及び／又はＧｌｐの阻害剤（例えば、ＢＩＸ０１２９４又はＵＮＣ０６３８）、並びに幹細胞因子（ＳＣＦ）からなる群から選択される少なくとも１つの追加の薬剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ｂＦＧＦと、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ｂＦＧＦと、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＢＭＰ阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ｂＦＧＦと、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ｂＦＧＦと、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＢＭＰ阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ｂＦＧＦと、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＢＭＰ阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ｂＦＧＦと、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ｂＦＧＦと、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＢＭＰ阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ｂＦＧＦと、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ｂＦＧＦと、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＢＭＰ阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＢＭＰ阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤と、ＢＭＰ阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＦＧＦ２と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＦＧＦ２と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＢＭＰ阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＦＧＦ２と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＦＧＦ２と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤と、ＢＭＰ阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＢＭＰ阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤と、ＢＭＰ阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＢＭＰ阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤と、ＢＭＰ阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＢＭＰ阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＰＫＣ阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＰＫＣ阻害剤と、ＢＭＰ阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＦＧＦ受容体阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＦＧＦ受容体阻害剤と、ＢＭＰ阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＦＧＦ受容体阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＦＧＦ受容体阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤と、ＢＭＰ阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＦＧＦ受容体阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＦＧＦ受容体阻害剤と、ＢＭＰ阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＦＧＦ受容体阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＦＧＦ受容体阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤と、ＢＭＰ阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、Ｓｒｃファミリーキナーゼ阻害剤と、ＴＧＦ受容体阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、Ｓｒｃファミリーキナーゼ阻害剤と、ＴＧＦ受容体阻害剤と、ＢＭＰ阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、Ｓｒｃファミリーキナーゼ阻害剤と、ＴＧＦ受容体阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、Ｓｒｃファミリーキナーゼ阻害剤と、ＴＧＦ受容体阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤と、ＢＭＰ阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＳＴＡＴ３活性化剤は白血病抑制因子（ＬＩＦ）及びインターロイキン６（ＩＬ６）からなる群から選択される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＢＭＰ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＲＣ阻害剤、及びＡＸＩＮ複合安定化剤（ＡＸＩＮｓ）からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤を含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＳＴＡＴ３活性化剤と、トランスフォーミング増殖因子ベータ１受容体（ＴＧＦβＲ）阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤と、ｐ３８阻害剤と、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含む培養培地は、ＢＭＰ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＲＣ阻害剤、及びＡＸＩＮ複合安定化剤（ＡＸＩＮｓ）からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地はＮ２補足物及びＢ２７補足物からなる群から選択される補足物を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地はアスコルビン酸を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地はオレイン酸を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地はリノレン酸及び／又はピペコリン酸を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は動物血清を欠く。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は血清代替物を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培地は、多能性幹細胞を少なくとも２継代に亘って未分化状態に維持することができる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記多能性幹細胞は無感作多能性幹細胞である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地はＭＢＤ３阻害剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地はクロモドメインヘリカーゼＤＮＡ結合タンパク質４（ＣＨＤ４）阻害剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地はＰ６６アルファコイルドコイルドメイン又はｐ６６アルファ阻害剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、感作ＰＳＣは、プライムＰＳＣ、胚盤胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、及び体細胞からなる群から選択される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、感作ＰＳＣは体細胞を含み、そして、上記方法は該体細胞を脱分化条件に供することによって誘導多能性幹細胞を得ることを更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、脱分化条件は、体細胞内で、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｎａｎｏｇ、ＥＳＲＲＢ、ＫＬＦ２、ＴＢＸ３、ＥＲＡＳ、ｃ−Ｍｙｃ、及びＫＬＦ１７からなる群から選択される少なくとも２つの因子を外因的に発現することを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記Ｍｂｄ３活性の阻害は、Ｍｂｄ３のヌクレオソームリモデリング及び脱アセチル化酵素（ＮｕＲＤ）複合体への結合を阻害することによって行われる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記Ｍｂｄ３のＮｕＲＤ複合体への結合の阻害は、クロモドメインヘリカーゼＤＮＡ結合タンパク質４（ＣＨＤ４）阻害剤を使用して行われる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記Ｍｂｄ３のＮｕＲＤ複合体への結合の阻害は、Ｐ６６アルファコイルドコイルドメインを使用して行われる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記Ｍｂｄ３活性の阻害は、ヌクレオソームリモデリング及び脱アセチル化酵素（ＮｕＲＤ）複合体に対するＭｂｄ３の結合を阻害することによって行われ、ここで、Ｍｂｄ３の結合のＮｕＲＤ複合体への阻害はＰ６６アルファコイルドコイルドメインを使用して行われる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記Ｍｂｄ３発現の阻害は、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤を使用して行われる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記方法は、ＥＳ細胞発現Ｒａｓ（ＥＲＡＳ）コーディング配列を外因性に発現すること、又は体細胞においてＥＲＡＳの内因性発現を活性化することを更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記発現は、上記Ｍｂｄ３の阻害が上記発現に先立ってＭｂｄ３のレベルを１０％〜３０％とするように少なくとも４８時間に亘ってもたらされる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記発現は約４８時間後になされ、上記阻害は約４８時間後になされる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ｉＰＳＣはネズミ科ｉＰＳＣである。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記方法は、ＬＩＦと、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３ｂ阻害剤とを含む培地中でネズミ科ｉＰＳＣを培養することを更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記方法は、ＳＲＣ阻害剤、及びＡＸＩＮ複合安定化剤（ＡＸＩＮｓ）からなる群から選択される薬剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ｉＰＳＣがヒトｉＰＳＣである場合、上記方法は、
（ｃ）ヒトｉＰＳＣを、ＬＩＦと、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３ｂ阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）と、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦβ１）とを含む培養培地中でヒトｉＰＳＣを培養することを更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培地はＲＯＣＫ阻害剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培地は、ＳＲＣ阻害剤とＡＸＩＮ複合安定化剤（ＡＸＩＮｓ）を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、工程（ｃ）は工程（ａ）の発現から約４８時間後に行われる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記発現は、上記因子のＤＮＡトランスフェクションを使用して行われる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記発現は上記因子のＲＮＡトランスフェクションを使用して行われる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記発現は上記因子のタンパク質のトランスフェクションを使用して行われる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、雌性細胞におけるＸＩＳＴ遺伝子のプロモーターの非メチル化アレルは、配列番号７０によって示されるＸＩＳＴプロモーターアンプリコン中の２０％未満のＣｐＧ部位がメチル化されている。
本発明の幾つかの実施形態によれば、雄性細胞中のＸＩＳＴ遺伝子のプロモーターの非メチル化アレルは、配列番号７０に示されるＸＩＳＴプロモーターアンプリコン中２０％未満のＣｐＧ部位がメチル化されている。
本発明の幾つかの実施形態によれば、Ｇ９ａの阻害剤及び／又はＧｌｐの阻害剤はＢＩＸ０１２９４及びＵＮＣ０６３８からなる群から選択される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、Ｇ９ａの阻害剤及び／又はＧｌｐの阻害剤は、ＢＩＸ０１２９４である。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、Ｃ−ＭＹＣ、Ｎ−ＭＹＣ、Ｌ−ＭＹＣ、ＥＤＡＲ（エクトジスプラシンＡ受容体）、ＭＤＭ２、及びＥＲＡＳからなる群から選択される発がんタンパク質を過剰発現するように、及び／又はＰ５３及びＮＦカッパーＢ阻害剤アルファからなる群から選択される腫瘍抑制タンパク質を下方制御するように遺伝子修飾された単離された無感作多能性幹細胞が提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記腫瘍抑制遺伝子の下方制御は、前記腫瘍抑制タンパク質のドミナントネガティブ変異体を細胞に導入することによって行われる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記腫瘍抑制タンパク質のドミナントネガティブは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ３９８８３．１（配列番号２１２）に示されるＰ５３タンパク質中にＰ５３ Ｒ１７２Ｈドミナントネガティブ変異を含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記腫瘍抑制タンパク質のドミナントネガティブは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＣ１６７９９．１（配列番号２１０）に示されるＰ５３タンパク質中にＲ１７５Ｈ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２４８Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｒ２７３Ｈ、及び／又はＲ２８２Ｗのドミナントネガティブ変異（複数の場合がある）を含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、前記腫瘍抑制タンパク質のドミナントネガティブは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０６５３９０．１（配列番号２１１）に示されるＮＦカッパーＢ阻害剤アルファタンパク質中にＳ３２Ｄ及びＳ３６Ｄの変異、Ｓ３２Ｅ及びＳ３６Ｅの変異、Ｓ３２Ｄ及びＳ３６Ｅの変異、及び／又はＳ３２Ｅ及びＳ３６Ｄの変異を含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の遺伝子修飾された単離された無感作多能性幹細胞は、
（ｉ）前記無感作ＰＳＣが雌性ＰＳＣである場合、前記無感作雌性ＰＳＣがＸ不活性特異的転写産物（ＸＩＳＴ）遺伝子のプロモーターの２つの非メチル化アレルを有し、及び
（ｉｉ）前記無感作ＰＳＣが雄性ＰＳＣである場合、前記無感作雄性ＰＳＣが前記ＸＩＳＴ遺伝子の前記プロモーターの１つの非メチル化アレルを有し、
及び／又は
前記無感作ＰＳＣにおける転写因子Ｅ３（ＴＦＥ３）の発現レベルが、免疫染色アッセイによって特定される１以上である細胞質に対する核の発現比率を特徴とし、
及び／又は
無感作ＰＳＣが前記無感作ＰＳＣの細胞表面上でのＣ−ＫＩＴ（ＣＤ１１７）の陽性発現を特徴とする。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記無感作多能性幹細胞は霊長類細胞である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記無感作多能性幹細胞はヒト細胞である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の単離された無感作多能性幹細胞、又は本発明の幾つかの実施形態の始原生殖細胞を宿主動物の胚に導入することによってキメラ動物を生成することを含む、キメラ動物を生成する方法が提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記胚は着床前胚である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記方法は、前記着床前胚をｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで生育させることを更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記導入はｉｎ ｖｉｖｏで行われる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記導入はｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで行われる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記着床前胚は少なくとも４個の細胞を含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記着床前胚は１２８個以下の細胞を含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記宿主動物はマウスである。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記単離された無感作多能性幹細胞は宿主動物に対して同種である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記単離された無感作多能性幹細胞は宿主動物に対して異種である。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、本発明の幾つかの実施形態の単離された無感作多能性幹細胞と、培養培地とを含む細胞培養物が提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は前記多能性幹細胞を少なくとも５継代に亘って無感作状態に維持することができる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の細胞培養物に含まれる上記培養培地は上又は以下に記載される培養培地のいずれかである。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の細胞培養物に含まれる培養培地は、本発明の幾つかの実施形態の培養培地である。本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の細胞培養物に含まれる培養培地は、培養培地１〜培養培地１４７のいずれかである。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の細胞培養物に含まれる培養培地は、その全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１４／１７４４７０号に記載される培養培地のいずれかである。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の細胞培養物に含まれる培養培地は、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＳＴＡＴ３活性化剤と、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦβ１）、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＮＯＴＣＨ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の細胞培養物に含まれる上記培養培地は、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＳＴＡＴ３活性化剤と、トランスフォーミング因子受容体（ＴＧＦＲ）阻害剤、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）阻害剤、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＮＯＴＣＨ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＳＴＡＴ３活性化剤は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）及びインターロイキン６（ＩＬ６）からなる群から選択される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）、インスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦＩＩ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達阻害剤、ソニックヘッジホッグ経路（ＳＨＨ）阻害剤、ＥＲＫ５阻害剤、フォルスコリン、ケンパウロン、ＢａｙＫ８６４４、Ｂｉｘ１２９４、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）からなる群から選択される少なくとも１つの追加の薬剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）、インスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦＩＩ）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、ソニックヘッジホッグ経路（ＳＨＨ）阻害剤、ＥＲＫ５阻害剤、フォルスコリン、ケンパウロン、ＢａｙＫ８６４４、Ｂｉｘ１２９４、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）からなる群から選択される少なくとも１つの追加の薬剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＳＴＡＴ３活性化剤はＬＩＦを含み、上記少なくとも１つの薬剤はＰＫＣ阻害剤を含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＳＴＡＴ３活性化剤はＬＩＦを含み、上記少なくとも１つの薬剤はＴＧＦβ１及びタンパク質キナーゼＣ阻害剤を含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地はＦＧＦＲ阻害剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地はＴＧＦＲ阻害剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＳＴＡＴ３活性化剤はＬＩＦを含み、上記少なくとも１つの薬剤はＴＧＦβ１及びタンパク質キナーゼＣ阻害剤を含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地はＦＧＦＲ阻害剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＳＴＡＴ３活性化剤はＬＩＦを含み、上記少なくとも１つの薬剤はｂＦＧＦ及びＴＧＦβ１を含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地はＲＯＣＫ阻害剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地はタンパク質キナーゼＣ阻害剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記ＳＴＡＴ３活性化剤はＬＩＦを含み、上記少なくとも１つの薬剤はｂＦＧＦ、ＲＯＣＫ阻害剤、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤、ＮＯＴＣＨ阻害剤、及びトランスフォーミング増殖因子受容体（ＴＧＦＲ）阻害剤を含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地はソニックヘッジホッグ経路（ＳＨＨ）阻害剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＳＴＡＴ３活性化剤はＬＩＦを含み、上記少なくとも１つの薬剤はＮＯＴＣＨ阻害剤、及び線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）阻害剤を含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、インスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦＩＩ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、及びトランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦβ１）からなる群から選択される薬剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、白血病抑制因子（ＬＩＦ）と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３ｂ阻害剤と、ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、タンパク質キナーゼＣ阻害剤とを含む培養培地が提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の培養培地はＦＧＦＲ阻害剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の培養培地はＴＧＦＲ阻害剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、白血病抑制因子（ＬＩＦ）と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３ｂ阻害剤と、ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、タンパク質キナーゼＣ阻害剤とを含む培養培地が提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の培養培地はＦＧＦＲ阻害剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、白血病抑制因子（ＬＩＦ）と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３ｂ阻害剤と、ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）と、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦβ１）とを含む培養培地が提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の培養培地はＲＯＣＫ阻害剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の培養培地はタンパク質キナーゼＣ阻害剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の培養培地は、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、ＩＧＦ１、ＩＧＦＩＩ、フォルスコリン、ＦＧＦＲ阻害剤、ＴＧＦＲ阻害剤、ケンパウロン、ＢａｙＫ８６４４、Ｂｉｘ１２９４、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）からなる群から選択される因子を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の培養培地はＢＭＰ Ｉ型受容体（ＡＬＫ２、３、６）阻害剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の培養培地は、アスコルビン酸を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の培養培地は、オレイン酸を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の培養培地は、リノール酸を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の培養培地は、ピペコリン酸を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の培養培地は動物血清を欠いている。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の培養培地は血清代替物を更に含む。
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び／又は科学用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものに類似する又はそれらと等価な方法及び材料を本発明の実施形態の実施又は試験に使用することができるが、例示的な方法及び／又は材料が以下に記載される。矛盾する場合には、定義を含む特許明細書が優先される。さらに、材料、方法、及び例は解説に過ぎず、必ずしも限定を意図するものではない。
本発明の幾つかの実施形態は、添付の図面を参照して、例としてのみ記載される。ここで、詳細には図面に対する具体的な参照により、特定のものは、例として、また本発明の実施形態の実例となる考察の目的で示されることが強調される。これに関して、図面と共に考慮される記載は、当業者にとって本発明の実施形態が如何にして実施され得るかを明らかにする。
図１は、Ｏｃｔ４−ＧＦＰレポーターを有するＷＩＢＲ３ ｈＥＳＣ株のＦＡＣＳ分析を説明するグラフである。以下の基本培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ２１１０３−０４９）及びＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０６−１１７０−５０−１Ａ）の１：１のミックス、すなわち、合計４７５ｍｌ、ペニシリン−ストレプトマイシン５ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０３−０３３−１Ｂ）、Ｌ−グルタミン５ ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ − ０２−０２２−１Ｂ）、ＮＥＡＡ−５ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０１−３４０−１Ｂ）、５０μｌの５０ｍＭストックベータ−メルカプトエタノール（１バイル）、Ｂ２７補足物５ｍｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １７５０４−０４４）、インスリン（Ｓｉｇｍａ Ｉ−１８８２）、アポトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ Ｔ−１１４７）、最終濃度１００μｇ／ｍｌ、プロゲステロン（Ｓｉｇｍａ Ｐ８７８３）、最終濃度０．０２μｇ／ｍｌ、プトレシン（ＳｉｇｍａＰ５７８０）、最終濃度１６μｇ／ｍｌ、亜セレン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ｓ５２６１）、Ｌ−アスコルビン酸二リン酸（Ｓｉｇｍａ Ａ８９６０）（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）、ＢＳＡ（１００×画分Ｖ ７．５％溶液Ｇｉｂｃｏ １５２６０−０３７に対して指示される補足の条件１〜４０により、５％Ｏ２においてゼラチン／ＤＲ４フィーダー被覆プレート上で細胞を拡大した。細胞を最大２１継代まで拡大し、ＯＣＴ４−ＧＦＰ＋レポーターについてＦＡＣＳ分析により評価した。結果は、上記細胞が記載される条件で多能性を維持することを示した。 図２は、デルタＰＥＯｃｔ４−ＧＦＰレポーターを有するＷＩＢＲ３ ｈＥＳＣ株（Ｇａｆｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２０１３に記載される）のＦＡＣＳ分析を説明するグラフである。細胞を、以下の基本培地、すなわち、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ２１１０３−０４９）及びＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０６−１１７０−５０−１Ａ）の１：１のミックス、すなわち、合計４７５ｍｌ、ペニシリン−ストレプトマイシン５ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０３−０３３−１Ｂ）、Ｌ−グルタミン５ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ − ０２−０２２−１Ｂ）、ＮＥＡＡ−５ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０１−３４０−１Ｂ）、５０μｌの５０ｍＭストックベータ−メルカプトエタノール（１バイル）、Ｂ２７補足物５ｍｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １７５０４−０４４）、インスリン（Ｓｉｇｍａ Ｉ−１８８２）１２．５マイクロｇ／ｍｌインスリン）、アポトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ Ｔ−１１４７）最終濃度１００μｇ／ｍｌ、プロゲステロン（Ｓｉｇｍａ Ｐ８７８３）、最終濃度０．０２μｇ／ｍｌ、プトレシン（ＳｉｇｍａＰ５７８０）、最終濃度１６μｇ／ｍｌ、亜セレン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ｓ５２６１）、培地５００ｍｌ当たり３ｍＭストック溶液５μｌを添加、Ｌ−アスコルビン酸二リン酸（Ｓｉｇｍａ Ａ８９６０）（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）、ＢＳＡ（１００×画分Ｖ ７．５％溶液Ｇｉｂｃｏ １５２６０−０３７）に対する条件１〜条件４０の指示される補足により、５％Ｏ２でゼラチン／ＤＲ４フィーダー被覆プレート上で拡大した。上記細胞を最大２１継代まで拡大し、ＯＣＴ４−ＧＦＰ＋レポーターについてＦＡＣＳ分析により評価した。結果は、細胞が記載される条件で多能性を維持することを示す。 図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ、図３Ｅおよび図３Ｆは、示される選択条件のＰ１２における多能性細胞コロニーの代表的な画像である。図３Ａ−条件１、図３Ｂ−条件２、図３Ｃ−条件３、図３Ｄ−条件４、図３Ｅ−条件９、図３Ｆ−条件１１。ＷＩＳ２ ｈＥＳＣ株を、以下の基本培地、すなわち、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ２１１０３−０４９）及びＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０６−１１７０−５０−１Ａ）の１：１のミックス、すなわち、合計４７５ｍｌ、ペニシリン−ストレプトマイシン５ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０３−０３３−１Ｂ）、Ｌ−グルタミン５ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ−０２−０２２−１Ｂ）、ＮＥＡＡ ? ５ ｍｌ （Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０１−３４０−１Ｂ）、５０μｌの５０ｍＭストックベータ−メルカプトエタノール（１バイル）、Ｂ２７補足物５ｍｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １７５０４−０４４）、インスリン（Ｓｉｇｍａ Ｉ−１８８２）１２．５マイクロｇ／ｍｌインスリン）、アポトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ Ｔ−１１４７）、最終濃度１００μｇ／ｍｌ、プロゲステロン（Ｓｉｇｍａ Ｐ８７８３）、最終濃度０．０２μｇ／ｍｌ、プトレシン（ＳｉｇｍａＰ５７８０）、最終濃度１６μｇ／ｍｌ、亜セレン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ｓ５２６１）、培地５００ｍｌ当たり３ｍＭストック溶液５μｌを添加、Ｌ−アスコルビン酸二リン酸（Ｓｉｇｍａ Ａ８９６０）（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）、ＢＳＡ（１００×画分Ｖ ７．５％溶液Ｇｉｂｃｏ １５２６０−０３７により、５％Ｏ２においてビトロネクチン被覆プレート上で拡大した。 図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃおよび図４Ｄは、示される選択条件でＰ２０における多能性細胞コロニーの代表的な画像である。図４Ａ−条件９、図４Ｂ−条件１０、図４Ｃ−条件１１、図４Ｄ−条件４。ＷＩＳ２ ｈＥＳＣ株を、以下の基本培地、すなわち、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ２１１０３−０４９）及びＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０６−１１７０−５０−１Ａ）の１：１のミックス、すなわち、合計４７５ｍｌ、ペニシリン−ストレプトマイシン５ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０３−０３３−１Ｂ）、Ｌ−グルタミン５ ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ−０２−０２２−１Ｂ）、ＮＥＡＡ−５ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０１−３４０−１Ｂ）、５０μｌの５０ｍＭストックベータ−メルカプトエタノール（１バイル）、Ｂ２７補足物５ｍｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １７５０４−０４４）、インスリン（Ｓｉｇｍａ Ｉ−１８８２）１２．５マイクロｇ／ｍｌインスリン）、アポトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ Ｔ−１１４７）、最終濃度１００μｇ／ｍｌ、プロゲステロン（Ｓｉｇｍａ Ｐ８７８３）、最終濃度０．０２μｇ／ｍｌ、プトレシン（ＳｉｇｍａＰ５７８０）、最終濃度１６μｇ／ｍｌ、亜セレン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ｓ５２６１）、培地５００ｍｌ当たり３ｍＭストック溶液５μｌを添加、Ｌ−アスコルビン酸二リン酸（Ｓｉｇｍａ Ａ８９６０）（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）、ＢＳＡ（１００×画分Ｖ ７．５％溶液Ｇｉｂｃｏ １５２６０−０３７−５００ｍｌ培地ボトル当たり０．１６ｍｌにより、５％Ｏ２においてゼラチン／ＤＲ４フィーダー細胞被覆プレート上で拡大した。 図５Ａ、図５Ｂおよび図５Ｃは、示された選択条件におけるＰ１８〜Ｐ２０の多能性細胞コロニーの代表的な画像である。図５Ａ−条件９、図５Ｂ−条件１０、図５Ｃ−条件４。ＷＩＳ２ ｈＥＳＣ株を以下の基本培地、すなわち、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ２１１０３−０４９）及びＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０６−１１７０−５０−１Ａ）の１：１のミックス、すなわち、合計４７５ｍｌ、ペニシリン−ストレプトマイシン５ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０３−０３３−１Ｂ）、Ｌ−グルタミン５ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ−０２−０２２−１Ｂ）、ＮＥＡＡ?５ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０１−３４０−１Ｂ）、５０μｌの５０ｍＭストックベータ−メルカプトエタノール （１バイル）、Ｂ２７補足物５ｍｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １７５０４−０４４）、インスリン（Ｓｉｇｍａ Ｉ−１８８２）−最終濃度１２．５μｇ／ｍｌのインスリン）、アポトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ Ｔ−１１４７）、最終濃度１００μｇ／ｍｌ、プロゲステロン（Ｓｉｇｍａ Ｐ８７８３）、最終濃度０．０２μｇ／ｍｌ、プトレシン（ＳｉｇｍａＰ５７８０）、最終濃度１６μｇ／ｍｌ、亜セレン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ｓ５２６１）、培地５００ｍｌ当たり３ｍＭストック溶液５μｌを添加、Ｌ−アスコルビン酸二リン酸（Ｓｉｇｍａ Ａ８９６０）（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）、ＢＳＡ（１００×画分Ｖ ７．５％溶液Ｇｉｂｃｏ １５２６０−０３７−５００ｍｌ培地ボトル当たり０．１６ｍｌを用いて５％Ｏ２でゼラチン／ＤＲ４フィーダー細胞被覆プレート上で拡大した。細胞をアルカリホスファターゼ幹細胞マーカー（ＡＰ）に対して染色し、示される選択条件においてＰ１８〜Ｐ２０で多能性細胞コロニーの代表的な画像に示されるように陽性とわかった。 図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄ、図６Ｅおよび図６Ｆは、Ｌ−グルタミンを含まない特定の条件下で拡大されたヒト無感作ＥＳＣ／ｉＰＳＣの画像である。図６Ａ−条件１、図６Ｂ−条件２、図６Ｃ−条件３、図６Ｄ−条件４、図６Ｅ−条件９、図６Ｆ−条件１１。ＦＸ７１ヒトｉＰＳＣ株を、以下の基本培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ２１１０３−０４９）及びＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０６−１１７０−５０−１Ａ）の１：１のミックス、すなわち、合計４７５ｍｌ、ペニシリン−ストレプトマイシン５ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０３−０３３−１Ｂ）、ＮＥＡＡ−５ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０１−３４０−１Ｂ）、５０μｌの５０ｍＭストックベータ−メルカプトエタノール（１バイル）、Ｂ２７補足物５ｍｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １７５０４−０４４）、インスリン（Ｓｉｇｍａ Ｉ−１８８２）−１２．５〜２５μｇ／ｍｌインスリン、アポトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ Ｔ−１１４７）、最終濃度１００μｇ／ｍｌ、プロゲステロン（Ｓｉｇｍａ Ｐ８７８３）、最終濃度０．０２μｇ／ｍｌ、プトレシン（ＳｉｇｍａＰ５７８０）、最終濃度１６μｇ／ｍｌ、亜セレン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ｓ５２６１）、培地５００ｍｌ当たり３ｍＭストック溶液５μｌを添加、Ｌ−アスコルビン酸二リン酸（Ｓｉｇｍａ Ａ８９６０）（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）、ＢＳＡ（１００×画分Ｖ ７．５％溶液Ｇｉｂｃｏ １５２６０−０３７−５００ｍｌ培地ボトル当たり０．１６ｍｌにより５％Ｏ２においてゼラチン／ＤＲ４フィーダー細胞被覆プレート上で細胞を拡大した。種々のＷＩＳ−ＮＨＳＭ条件における細胞の代表的な画像が示され、これらの条件において外因性Ｌ−グルタミン補足によらないコロニーの拡大を示す。 図７は、ＷＩＳ−ＮＨＳＭ条件を設計するための戦略を示す概略図であり、小分子及びその濃度範囲の非限定的な例を含む。 図８は、ヒト無感作ｉＰＳＣ及びＥＳＣの誘導及び維持について試験した種々のＷＩＳ−ＮＨＳＭの例（条件４１〜６０）の補足を示す。使用した基本培地は下記実施例５に記載する。 図９は、ヒト無感作ｉＰＳＣ及びＥＳＣの誘導及び維持について試験した種々のＷＩＳ−ＮＨＳＭの例（条件６１〜８０）の補足を示す。使用した基本培地は下記実施例５に記載する。 図１０は、ヒト無感作ｉＰＳＣ及びＥＳＣの誘導及び維持について試験した種々のＷＩＳ−ＮＨＳＭの例（条件８１〜９９）の補足を示す。使用した基本培地は下記実施例５に記載する。 図１１は、ヒト無感作ｉＰＳＣ及びＥＳＣの誘導及び維持について試験した種々のＷＩＳ−ＮＨＳＭの例（条件１００〜１１９）の補足を示す。使用した基本培地を下記実施例５に記載する。 図１２は、ヒト無感作ｉＰＳＣ及びＥＳＣの誘導及び維持について試験した種々のＷＩＳ−ＮＨＳＭの例（条件１２０〜１３１）の補足を示す。使用した基本培地を下記実施例５に記載する。 図１３は、デルタＰＥＯｃｔ４−ＧＦＰレポーター（Ｇａｆｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２０１３に記載される）を有するＷＩＢＲ３ ｈＥＳＣ株のＦＡＣＳ分析を説明するグラフである。細胞を、以下の基本培地、すなわちＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ２１１０３−０４９）及びＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０６−１１７０−５０−１Ａ）の１：１のミックス、すなわち、合計４７５ｍｌ、ペニシリン−ストレプトマイシン５ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０３−０３３−１Ｂ）、Ｌ−グルタミン５ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ−０２−０２２−１Ｂ）、ＮＥＡＡ−５ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０１−３４０−１Ｂ）、５０μｌの５０ｍＭストックベータ−メルカプトエタノール（１バイル）、Ｂ２７補足物５ｍｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １７５０４−０４４）、インスリン（Ｓｉｇｍａ Ｉ−１８８２）−１ボトル当たり６．２５ｍｇのインスリンを添加しおよそ１２．５マイクロｇ／ｍｌの追加のインスリンを生じる）、アポトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ Ｔ−１１４７）最終濃度１００μｇ／ｍｌ、プロゲステロン（Ｓｉｇｍａ Ｐ８７８３）、最終濃度０．０２μｇ／ｍｌ、プトレシン（ＳｉｇｍａＰ５７８０）、最終濃度１６μｇ／ｍｌ、亜セレン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ｓ５２６１）、培地５００ｍｌ当たり３ｍＭストック溶液５μｌを添加、ＢＳＡ（１００×画分Ｖ ７．５％溶液Ｇｉｂｃｏ １５２６０−０３７−５００ｍｌ培地ボトル当たり０．１６ｍｌを添加、に対する条件４１〜９９（以下の実施例５に記載される）の指示される補足により、５％Ｏ２でゼラチン／ＤＲ４フィーダー被覆プレート上で拡大した。細胞を２８日間の継代（合計６継代）拡大し、ＯＣＴ４−ＧＦＰ＋レポーターについてＦＡＣＳ分析により評価した。結果は、上記細胞が記載される条件でそれらの多能性を維持することを示す。これらの条件で細胞が多能性を失うことから、２ｉ／ＬＩＦ／ＰＫＣｉ（５マイクロＭ）条件を陰性対照として使用した。 図１４は、デルタＰＥＯｃｔ４−ＧＦＰレポーターを有するＷＩＢＲ３ ｈＥＳＣ株（Ｇａｆｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２０１３に記載される）のＦＡＣＳ分析を説明するグラフである。細胞を、以下の基本培地、すなわち、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ２１１０３−０４９）及びＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０６−１１７０−５０−１Ａ）の１：１のミックス、すなわち、合計４７５ｍｌ、ペニシリン−ストレプトマイシン５ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０３−０３３−１Ｂ）、Ｌ−グルタミン５ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ−０２−０２２−１Ｂ）、ＮＥＡＡ−５ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０１−３４０−１Ｂ）、５０μｌの５０ｍＭストックベータ−メルカプトエタノール（１バイル）、Ｂ２７補足物１０ｍｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １７５０４−０４４）、インスリン（Ｓｉｇｍａ Ｉ−１８８２）−１ボトル当たり６．２５ｍｇのインスリンを添加しおよそ１２．５マイクロｇ／ｍｌの追加のインスリンを生じる）、アポトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ Ｔ−１１４７）最終濃度１００μｇ／ｍｌ、プロゲステロン（Ｓｉｇｍａ Ｐ８７８３）、最終濃度０．０２μｇ／ｍｌ、プトレシン（ＳｉｇｍａＰ５７８０）、最終濃度１６μｇ／ｍｌ、亜セレン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ｓ５２６１）、培地５００ｍｌ当たり３ｍＭストック溶液５μｌを添加、ＢＳＡ（１００×画分Ｖ ７．５％溶液Ｇｉｂｃｏ １５２６０−０３７−５００ｍｌ培地ボトル当たり０．１６ｍｌを添加、に対して条件４１〜９９（以下の実施例５に記載される）の指示される補足により、５％Ｏ２でＬＡＭＩＮＩＮ−５２１被覆プレート（ＢＩＯＬＡＭＩＮＡ ＩＮＣ．−カタログ番号ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｂｉｏｌａｍｉｎａ（ｄｏｔ）ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ−ｌｎ−５２１）上で拡大した。細胞を２８日間の継代（合計６継代）拡大し、ＯＣＴ４−ＧＦＰ＋レポーターについてＦＡＣＳ分析により評価した。結果は、上記細胞が記載される条件でそれらの多能性を維持することを示す。これらの条件で細胞が多能性を失うことから、２ｉ／ＬＩＦ／ＰＫＣｉ（５マイクロＭ）条件を陰性対照として使用した。 図１５は、デルタＰＥＯｃｔ４−ＧＦＰレポーターを有するＷＩＢＲ３ ｈＥＳＣ株（Ｇａｆｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２０１３に記載される）のＦＡＣＳ分析を説明するグラフである。細胞を、以下の基本培地、すなわち、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ２１１０３−０４９）及びＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０６−１１７０−５０−１Ａ）の１：１のミックス、すなわち、合計４７５ｍｌ、ペニシリン−ストレプトマイシン５ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０３−０３３−１Ｂ）、Ｌ−グルタミン５ ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ−０２−０２２−１Ｂ）、ＮＥＡＡ−５ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０１−３４０−１Ｂ）、５０μｌの５０ｍＭストックベータ−メルカプトエタノール（１バイル）、Ｂ２７補足物１０ｍｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １７５０４−０４４）、インスリン（Ｓｉｇｍａ Ｉ−１８８２）−１ボトル当たり６．２５ｍｇのインスリンを添加しおよそ１２．５マイクロｇ／ｍｌの追加のインスリンを生じる）、アポトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ Ｔ−１１４７）、最終濃度１００μｇ／ｍｌ、プロゲステロン（Ｓｉｇｍａ Ｐ８７８３）、最終濃度０．０２μｇ／ｍｌ、プトレシン（ＳｉｇｍａＰ５７８０）、最終濃度１６μｇ／ｍｌ、亜セレン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ｓ５２６１）、培地５００ｍｌ当たり３ｍＭストック溶液５μｌを添加、ＢＳＡ（１００×画分Ｖ ７．５％溶液Ｇｉｂｃｏ １５２６０−０３７−５００ｍｌ培地ボトル当たり０．１６ｍｌを添加、に対して条件１００〜１３１（以下の実施例５に記載される）の指示される補足により、５％Ｏ２においてゼラチン／ＤＲ４フィーダー被覆プレート上で拡大した。細胞を２８日間の継代（合計６継代）拡大し、ＯＣＴ４−ＧＦＰ＋レポーターについてＦＡＣＳ分析により評価した。結果は、上記細胞が記載される条件でそれらの多能性を維持することを示す。これらの条件で細胞が多能性を失うことから、２ｉ／ＬＩＦ／ＰＫＣｉ（５マイクロＭ）条件を陰性対照として使用した。 図１６は、デルタＰＥＯｃｔ４−ＧＦＰレポーターを有するＷＩＢＲ３ ｈＥＳＣ株（Ｇａｆｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２０１３に記載される）のＦＡＣＳ分析を説明するグラフであり、以下の基本培地、すなわち、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ２１１０３−０４９）及びＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０６−１１７０−５０−１Ａ）の１：１のミックス、すなわち、合計４７５ｍｌ、ペニシリン−ストレプトマイシン５ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０３−０３３−１Ｂ）、Ｌ−グルタミン５ ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ−０２−０２２−１Ｂ）、ＮＥＡＡ−５ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０１−３４０−１Ｂ）、５０μｌの５０ｍＭストックベータ−メルカプトエタノール（１バイル）、Ｂ２７補足物１０ｍｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １７５０４−０４４）、インスリン（Ｓｉｇｍａ Ｉ−１８８２）−１ボトル当たり６．２５ｍｇのインスリンを添加しおよそ１２．５マイクロｇ／ｍｌの追加のインスリンを生じる）、アポトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ Ｔ−１１４７）、最終濃度１００μｇ／ｍｌ、プロゲステロン（Ｓｉｇｍａ Ｐ８７８３）、最終濃度０．０２μｇ／ｍｌ、プトレシン（ＳｉｇｍａＰ５７８０）、最終濃度１６μｇ／ｍｌ、亜セレン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ｓ５２６１）、培地５００ｍｌ当たり３ｍＭストック溶液５μｌを添加、ＢＳＡ（１００×画分Ｖ ７．５％溶液Ｇｉｂｃｏ １５２６０−０３７−５００ｍｌ培地ボトル当たり０．１６ｍｌを添加、に対して条件１００〜１３１（以下の実施例５に記載される）の指示される補足により、５％Ｏ２においてＬＡＭＩＮＩＮ−５２１被覆プレート（ＢＩＯＬＡＭＩＮＡ ＩＮＣ．−カタログ番号ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｂｉｏｌａｍｉｎａ（ｄｏｔ）ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ−ｌｎ−５２１）上で拡大した。細胞を２８日間の継代（合計６継代）拡大し、ＯＣＴ４−ＧＦＰ＋レポーターについてＦＡＣＳ分析により評価した。結果は、上記細胞が記載される条件でそれらの多能性を維持することを示す。これらの条件で細胞が多能性を失うことから、２ｉ／ＬＩＦ／ＰＫＣｉ（５マイクロＭ）条件を陰性対照として使用した。 図１７Ａ−Ｆは、ＸＩＳＴプロモーターのバイサルファイトシーケンシング分析を示す。ＸＩＳＴプロモーターアンプリコンの単一クローン中の６個のＣｐＧ部位のバイサルファイトシーケンシング分析を示す。黒丸＝メチル化ＣｐＧ部位、白丸＝非メチル化ＣｐＧ部位。無感作ＰＳＣについて、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２でＤＲ４放射線照射ＭＥＦ細胞及び０．２％ゼラチン被覆プレート上で１４日間に亘って指示される培養培地（図１７Ａ〜図１７Ｅ）中で拡大した。全ての培養培地は、Ｌ−アスコルビン酸（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）を含んだ。感作条件について（プライムＰＳＣ）、細胞をマトリゲル被覆プレート上、ｍＴＥＳＲ１（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−カタログ番号０５８５０）中で培養した。図１７Ａ−培養培地は、Ｓｒｃｉ １μＭ、ＥＲＫ１／２ｉ １μＭ、ＬＩＦ ２０ｎｇ／ｍｌを含んだ。図１７Ｂ−培養培地は、ＡＸＩＮｓ ５μＭ、ＥＲＫ１／２ｉ １μＭ、ＬＩＦ ２０ｎｇ／ｍｌを含んだ。図１７Ｃ−培養培地は、ＡＸＩＮｓ ５μＭ、ＥＲＫ１／２ｉ １μＭ、ＬＩＦ ２０ｎｇ／ｍｌ、ＰＫＣｉ ４μＭ、ＧＳＫ３ｉ １．５μＭを含んだ。図１７Ｄ−培養培地は、ＡＸＩＮｓ ５μＭ、ＥＲＫ１／２ｉ １μＭ、ＬＩＦ ２０ｎｇ／ｍｌ、ＰＫＣｉ ４μＭ、ＧＳＫ３ｉ １．５μＭ、Ｐ３８ｉ ２μＭ、及びＪＮＫｉ５μＭを含んだ。図１７Ｅ−培養培地は、ＡＸＩＮｓ ５μＭ、ＥＲＫ１／２ｉ １μＭ、ＬＩＦ ２０ｎｇ／ｍｌ、ＰＫＣｉ ４μＭ、ＧＳＫ３ｉ １．５μＭ、Ｐ３８ｉ ２μＭ、ＪＮＫｉ ５μＭ、及びＳＲＣｉ １μＭを含んだ。小分子の略語の対訳：ＬＩＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＲＫ１／２ｉ（ＰＤ０３２５９０１ １μＭ）、ＡＸＩＮｓ（ＩＷＲ１ ５μＭ）、ＰＫＣｉ（Ｇｏ６９８３ ４μＭ）、ＧＳＫ３βｉ（ＣＨＩＲ９９０２１ １．５μＭ）、Ｐ３８ｉ（ＢＩＲＢ７９６ ２μＭ）、ＪＮＫｉ（ＳＰ６００１２５ ５μＭ）、ＳＲＣｉ（ＣＧＰ７７６７５ １μＭ）を含んだ。無感作ＰＳＣでは、両方のアレルが脱メチル化（非メチル化）されていることに留意されたい（図１７Ａ〜図１７Ｅ、雌性細胞）。対照的に、感作（すなわち、プライムＰＳＣ）では、ＸＩＳＴプロモーターは雄性細胞において完全にメチル化され、雌性細胞の１つのアレルでメチル化されている（図１７Ｆ）ことに留意されたい。これらの結果は、結論的には、雄性及び雌性無感作ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣが様々なＷＩＳ−ＮＨＳＭ条件下で独特の前Ｘ不活性化状態を保持することを実証する。 図１８は、無感作状態に多能性幹細胞を維持するための戦略を提示する機構であり、本発明の幾つかの実施形態による培養培地に対する小分子及び濃度範囲の例を含む。 図１９は、ヒト無感作ＰＳＣを無感作状態及び未分化状態に維持することができる、並びにＥＳＣ誘導のための、本発明の幾つかの実施形態の培養培地の非限定的な例を提供する。基本培地は以下の実施例６に記載される。 図２０は、本発明の幾つかの実施形態の培養培地（以下の実施例６及び図１９に記載される培地１３２〜培地１４７）中で培養された場合のＧＦＰ陽性細胞（「ＧＦＰ＋」）の割合を示すヒストグラムである。Ｏｃｔ４−ＧＦＰレポーター（Ｇａｆｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２０１３に記載される）を有するＷＩＢＲ３ ｈＥＳＣ株を、以下の実施例欄の実施例６に記載される基本培地を用いて５％Ｏ２においてゼラチン／ＤＲ４放射線照射ＭＥＦ被覆プレート上で拡大し、ここで、これらの実験に使用される基本培地はＬ−アスコルビン酸二リン酸（Ｓｉｇｍａ Ａ８９６０）も含んだ（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）。上記細胞を最大２３継代まで拡大し、ＯＣＴ４−ＧＦＰ＋レポーターについてＦＡＣＳ分析により評価した。結果は、記載される条件においてそれらの多能性を維持することを示す。２ｉ／ＬＩＦ／ＰＫＣｉ（５マイクロＭ）条件を、これらの条件において細胞が多能性を失うことから、陰性対照として使用した。 図２１は、本発明の幾つかの実施形態の培養培地（以下の実施例６及び図１９に記載される培地１３２〜培地１４７）中で培養された場合のＧＦＰ陽性細胞（「ＧＦＰ＋」）の割合を示すヒストグラムである。デルタＰＥＯｃｔ４−ＧＦＰレポーター（Ｇａｆｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２０１３に記載される）を有するＷＩＢＲ３ ｈＥＳＣ株を、以下の実施例欄の実施例６に記載される基本培地を用いて５％Ｏ２においてマトリゲル被覆プレート上で拡大し、ここで、これらの実験に使用される基本培地はＬ−アスコルビン酸二リン酸（Ｓｉｇｍａ Ａ８９６０）も含んだ（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）。上記細胞を最大２３継代まで拡大し、ＯＣＴ４−ＧＦＰ＋レポーターについてＦＡＣＳ分析により評価した。結果は、記載される条件においてそれらの多能性を維持することを示す。２ｉ／ＬＩＦ／ＰＫＣｉ（５マイクロＭ）条件を、これらの条件において細胞が多能性を失うことから、陰性対照として使用した。 図２２Ａ−Ｃは、雄性及び雌性の無感作ｈＥＳＣ又はｉＰＳＣがＷＩＳ−ＮＨＳＭ条件（本発明の幾つかの実施形態の培地）において独特の前Ｘ不活性化状態を保持することを実証するバイサルファイトシーケンシング分析の結果を示す。黒丸＝メチル化ＣｐＧ部位、白丸＝非メチル化ＣｐＧ部位。ＸＩＳＴプロモーターアンプリコンの単一クローン中の６個のＣｐＧ部位のバイサルファイトシーケンシング分析を示す。無感作細胞においていずれのアレルもメチル化されていることに留意されたい。細胞を、３７℃で５％Ｏ２条件においてＤＲ４放射線照射ＭＥＦ細胞及び０．２％ゼラチン被覆プレート上で１４日間に亘り指示される培養条件で拡大した。全ての培養培地はＬ−アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）を含んだ。図２２Ａ−ＡＸＩＮｓ ５μＭ、ＥＲＫ１／２ｉ １μＭ、ＬＩＦ ２０ｎｇ／ｍｌ、ＰＫＣｉ ２μＭ、ＧＳＫ３ｉ １．５μＭ、Ｐ３８ｉ ０．２５μＭ、ＪＮＫｉ ５μＭ、ＳＲＣｉ ０．５マイクロＭを含む培養培地。図２２Ｂ−ＡＸＩＮｓ ５μＭ、ＥＲＫ１／２ｉ １μＭ、ＬＩＦ ２０ ｎｇ／ｍｌ、ＰＫＣｉ ２μＭ、ＧＳＫ３ｉ １．５μＭ、Ｐ３８ｉ ０．２５μＭ、ＪＮＫｉ ５μＭ、ＳＲＣｉ ０．５μＭ、及びＧ９ａｉ ０．５μＭ。小分子の略語の対訳：ＬＩＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＲＫ１／２ｉ（ＰＤ０３２５９０１、１μＭ）、ＡＸＩＮｓ（ＩＷＲ１、５μＭ）、ＰＫＣｉ（Ｇｏ６９８３、２μＭ）、ＧＳＫ３βｉ（ＣＨＩＲ９９０２１、１．５μＭ）、Ｐ３８ｉ（ＢＩＲＢ７９６、０．２５μＭ）、ＪＮＫｉ（ＳＰ６００１２５、５μＭ）、ＳＲＣｉ（ＣＧＰ７７６７５、０．５μＭ）、及びＧ９ａｉ（ＢＩＸ０１２９４、０．５μＭ）を含む培養培地。図２２Ｃ−非無感作条件（プライムＰＳＣ）は、マトリゲル被覆プレート上、ｍＴＥＳＲ１（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−カタログ番号０５８５０）中で細胞を培養することを含んだ。無感作ＰＳＣにおいて雌性細胞の両方のアレルは脱メチル化されていた（非メチル化）（図２２Ａ〜図２２Ｂ、雌性細胞を示す右パネル）。対照的には、感作（すなわち、プライムＰＳＣ）では、ＸＩＳＴプロモーターは、雄性細胞において完全にメチル化され（図２２Ｃ、左パネル、雄性細胞）、雌性細胞の１つのアレルでメチル化されている（図２２Ｃ、右パネル、雌性細胞）ことに留意されたい。これらの結果は、結論的には、雄性及び雌性の無感作ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣが、本発明の幾つかの実施形態の様々な培養培地のもと、独特の前Ｘ不活性状態を保持することを実証する。 図２３Ａ−Ｄは、ＬＩＳ ３８ ｔｇ−ｐＴｒｉｐ ｌｃｋ ＥＧＦＰ ｈＴＰ５３ ｃｒｉｓｐｒの生成を示す。図２３Ａ−野生型ＬＩＳ３８（配列番号１９５）及びＣｒｉｓｐｒ＿Ｃ２（配列番号１９６）の配列を示す。２つの配列（配列番号１３４及び配列番号１３５）間の配列アラインメントは、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９−ｓｇＲＮＡ標的化領域によるＴＰ５３のエクソン３の部分の欠失を示す。図２３Ｂ−ＷＴ親細胞株（左レーン）と比較したＬＩＳ３８ ｔｇ−ｐＴｒｉｐ ｌｃｋ ＥＧＦＰ ｐ５３ ｃｒｉｓｐｒ標的化細胞（右レーン）ＷＴ ｐ５３タンパク質の喪失を示すウェスタン免疫ブロット。図２３Ｃ−４６ＸＹ正常核型を示す、ＬＩＳ３８ ｔｇ−ｐＴｒｉｐ ｌｃｋ ＥＧＦＰ ｐ５３ ｃｒｉｓｐｒ細胞の核型分析。図２３Ｄ−ＬＩＳ３８ ｔｇ−ｐＴｒｉｐ ｌｃｋ ＥＧＦＰ ｐ５３ ｃｒｉｓｐｒ細胞の代表的な画像。左：明視野画像、右：ＧＦＰ蛍光発光陽性シグナルを示す暗視野画像。これは、細胞株がＧＦＰ蛍光タンパク質によって恒常的に標識化され、マイクロインジェクションの後の宿主組織においてこの細胞株由来の細胞の追跡を可能とする。要約すると、これらの結果は、この場合ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９ ｓｇＲＮＡ媒介ターゲッティング、及び後の恒常的に発現された蛍光タンパク質で細胞を標的化することによって、Ｐ５３タンパク質が枯渇したヒト無感作ＰＳＣ株を生成する方法を説明する。これらの細胞を宿主胚に注入してキメラ胚を生成することができる。 図２４Ａ−Ｂは、ＬＩＳ ３８ ＥＧＦＰ ｈＴＰ５３ Ｃ２無感作ヒトｉＰＳ細胞のマウス桑実胚へのマイクロインジェクションが、高い寄与レベル及びキメラ化レベルを有する異種間ヒト化マウスを生成することを示す。図２４Ａ−ＬＩＳ ３８ ＥＧＦＰ ｈＴＰ５３無感作ヒトｉＰＳ細胞を注入されたマウス胚。図２４Ｂ−同じ分析を使用する注入されていないマウス胚。ＧＦＰ標識化ヒト無感作ｉＰＳ由来細胞のＥ９．５マウス胚の種々の場所への広範囲の統合を示す代表的な画像である。対比染色にＨｏｅｃｈｓｔ及びＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒを使用した。第１のカラムは胚全体を示す。第２〜第４のカラム（左から）は、頭部領域（第１のカラムの画像中の白色の正方形）に焦点を当てた拡大画像を示す。図２４Ａは、ヒトｉＰＳ由来細胞（ＧＦＰ陽性細胞）が表在性頭蓋組織の大部分へと統合された、注入された胚を示す。図２４Ｂは、ヒト無感作ｉＰＳ由来細胞により注入されていない対照胚を示し、ＧＦＰ陽性細胞はこの対照胚では検出されていない。 図２５Ａ−Ｃは、Ｃ−ＫＩＴ（ＣＤ１１７）細胞表面抗原の発現に対するＷＩＢＲ３ ｈＥＳＣプライム又は無感作ＰＳＣのＦＡＣＳ分析を示す。プライムＰＳＣ（以下に記載される）に対する条件下又は「無感作」条件（培地１３６又は培地１３８）下で生育されたＷＩＢＲ３ ｈＥＳＣを、その後、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡを使用して単一細胞懸濁物へと分離した。細胞表面抗原の標識化のため、細胞を一次抗体（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｎｔ ４２１複合マウス抗ヒトＣＤ１１７（Ｃ−ＫＩＴ）ＩｇＧ、ＢＤカタログ番号５６２４３４、１：２００希釈）と共にインキュベートするか、氷冷ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中２％（体積／体積）ウシ胎児血清（ＦＢＳ））中で３０分間染色せずに置いて（対照）、２回洗浄した。その後、細胞標識をＦＡＣＳＤｉｖａバージョン６．１．３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を備えるフローサイトメーターＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩを使用して分析した。ＭＦＩ＝平均蛍光強度。プライムＰＳＣがＣ−ＫＩＴを発現しない（すなわち、それらはＣＤ１１７陰性である）のに対し（図２５Ａ）、無感作ＰＳＣはＣ−ＫＩＴを発現する（すなわち、それらはＣＤ１１７陽性である）（図２５Ｂ及び図２５Ｃ）。これらの結果は、Ｃ−ＫＩＴがヒト無感作であるがプライムでないＰＳＣの新規なマーカーであることを支持する。 図２６Ａ−Ｃは、ノックインｍＣｈｅｒｒｙ蛍光レポーターを有するヒトＥＳＲＲＢ（遺伝子／転写因子）座のターゲッティングを示す。図２６Ａ−ターゲッティング機構を説明する。ハサミはＣＲＩＳＰＲ−ｓｇＲＮＡ切断部位を示す。内因性ヒトＥＳＲＲＢ座と共発現されるｍＣｈｅｒｒｙレポーターを生成するため、本発明者らは、ヒトＥＳＲＲＢ遺伝子の最後のエクソンとインフレームにｐ２ａ−ｍＣｈｅｒｒｙコーディング配列をノックインすることを選択した。本発明者らは、ＥＳＲＲＢの停止コドン領域に特異的なオリゴをＣＡＳ９ニッカ―ゼ及びｓｇＲＮＡをコードするｐｘ３３５プラスミドに挿入した。図２６Ａに示されるようにドナーコンストラクトを生成した。本発明者らは、ＷＩＢＲ３ヒトＥＳＣ ＯＣＴ４ ＧＦＰノックイン細胞株を標的とした。ターゲッティングの効率は外部ＰＣＲによって検証したところ約３０％（４８クローン中１５クローン）であった。また、外因性及び抗ｍＣｈｅｒｒｙプローブを用いて正しいターゲッティングをサザンブロット（ＳＢ）によって検証した（図２６Ｂ）。フリッパーゼによるＮｅｏカセット切除の後、１つのクローンに由来する全標的化遺伝子座を増幅し、配列決定した。クローン２〜６を正確に標的化した（図２６Ｃ）。 図２６Ｄ−ＨはＰＳＣにおけるＥＳＲＲＢ−ｍＣｈｅｒｒｙレポーターの発現を示すＦＡＣＳ分析である。ＥＳＲＲＢ ｍＣｈｅｒｒｙノックインレポーターと共に（図２６Ｅ、図２６Ｆ、及び図２６Ｈ）又はそれを含まずに（図２６Ｄ及び図２６Ｇ）指示された条件で拡大されたＷＩＢＲ３ ｈＥＳＣを、０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡを使用して単一細胞懸濁物に分離し、氷冷ＦＡＣＳバッファー（２％（体積／体積））、ＰＢＳ（リン酸緩衝溶液）中ウシ胎児血清（ＦＢＳ）に再懸濁した。その後、ＥＳＲＲＢ−ｍＣｈｅｒｒｙ発現についてＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアバージョン６．１．３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてフローサイトメトリーＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩを使用して同時に細胞を分析した。ＭＦＩ＝平均蛍光強度。上記結果は、如何にして無感作条件１３６が具体的にＥＳＲＲＢ ｍＣｈｅｒｒｙ発現を誘導するのか（図２６Ｅ〜図２６Ｄと比較して）、及びＢＩＸ０１２９４を培養培地から除去すると（図２６Ｅと比較した図２６Ｈ）又はアクチビンＡを添加するとこの効果が喪失されることを示す（図２６Ｆ）。これらの結果は、本明細書に記載される幾つかの無感作組成物は、具体的には、無感作多能性転写因子ＥＳＲＲＢを誘導することを示す。
本発明は、幾つかの実施形では、概して多能性幹細胞、より具体的には無感作多能性幹細胞を生成及び拡大するために使用され得る新規な培養培地に関する。
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、以下の実施例による説明又は例示に述べられる詳細にその適用を必ずしも限定するものではないことが理解される。本発明は、他の実施形態であってもよく、又は様々な方法で実施され又は実行されることが可能である。
本発明者らは、霊長類（例えば、ヒト）無感作多能性幹細胞を単離し、生成し、またその細胞を無感作状態に維持するのに必要な新規な条件を明らかにした。
したがって、以下の実施例欄の実施例５、及び図７〜図１６に示されるように、本発明者らは、以下に説明され、ＯＣＴ４−ＧＦＰ＋（陽性）細胞の発現によって証明された、「無感作状態」に無感作ＰＳＣを維持することができる培養培地を含む、新規な条件を明らかにした。かかる培養培地は、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＭＥＫ／ＥＲＫ／１／２阻害剤（例えば、ＰＤ０３２５９０１）と、Ａｘｉｎ安定化剤とを含む。
本明細書で使用される「無感作状態」の文言は、雌性細胞のＸ不活性特異的転写産物（ＸＩＳＴ）遺伝子のプロモーターの両方のアレルが非メチル化されるか、又は雄性細胞のＸＩＳＴアレルのプロモーターがメチル化されている、未分化状態であることを指す。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、Ａｘｉｎ安定化剤とを含む培養培地が提供される。
本明細書で使用される「培養培地」の文言は、幹細胞の成長を支持し、それらを未分化状態に維持するため使用される固体又は液体の物質を指す。本明細書で使用される「培養培地」の文言は、幹細胞を未分化状態に維持することができる液体物質を指すことが好ましい。
本発明により使用される培養培地は、塩、栄養素、ミネラル、ビタミン、アミノ酸、核酸、サイトカイン、増殖因子及びホルモン等のタンパク質等の物質の組合せであって、それらの全てが細胞増殖に必要であり、幹細胞を未分化状態に維持することができる物質の組合せを含む水系培地であってもよい。例えば、培養培地は、以下に更に記載される必要な添加剤によって補足された、Ｋｏ−ＤＭＥＭ（米国ニューヨーク州グランドアイランドのＧｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製品）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（米国ニューヨーク州グランドアイランドのＧｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ製品）、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（米国ニューヨーク州グランドアイランド２１１０３−０４９のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製品）、又はＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＨＥＰＥＳを含まない、イスラエル国ベイトハメックのＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）等の合成組織培養培地であってもよい。
特定の実施形態によれば、上記培地はＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地とＤＭＥＭ Ｆ／１２の１：１ミックスである。
更に別の実施形態によれば、上記培地はＭＴＥＳＲ１（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）であってもよい。幾つかの例では、この培地は、ＴＧＦベータ及びＦＧＦ２を既に含んでおり、したがって、これらの増殖因子を含むそれらの培地の調製にのみ適している。他の例では、上記培地はＦＧＦ及びＴＧＦを用いずに生成される（例えば、Ｌｕｄｗｉｎｇ ａｎｄ Ｔｈｏｍｓｏｎ：Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２：１Ｃ．２．１−１Ｃ．２．１６を参照されたい）。
本発明の培養培地に含まれる全ての原料は、実質的に純粋であり、組織培養グレードであることが好ましい。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は血清を欠き、例えば任意の動物血清を欠く。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、任意の動物汚染物質、すなわち動物の細胞、流体又は病原体（例えば、ウイルス感染動物細胞）を欠き、例えば、異物不含である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ヒト由来血清を欠く。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（米国ニューヨーク州グランドアイランドのＧｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＡＬＢＵＭＡＸ（登録商標）ＩＩ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１０２１−０２９；細胞培養用脂質リッチウシ血清アルブミン）又は科学的に明確な脂質濃縮物（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１９０５−０３１）等の血清代替物（すなわち、血清の置換物）を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、化学的に明確な血清不含補足物であるＮ２補足物（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１７５０２−０４８）を更に含む。５００ｍｌの培養培地に対して５ｍｌのＮ２ミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加することができる。
代替的には、以下の材料（Ｎ２補足物を置換する）を５００ｍｌの培養培地に添加することができ、すなわち、最終濃度１２．５マイクロｇ／ｍｌの（μｇ／ｍｌ）組換えインスリン（Ｓｉｇｍａ Ｉ−１８８２）、最終濃度５００μｇ／ｍｌのアポトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ Ｔ−１１４７）、最終濃度０．０２μｇ／ｍｌのプロゲステロン（Ｓｉｇｍａ−Ｐ８７８３）、最終濃度１６μｇ／ｍｌのプトレシン（Ｓｉｇｍａ−Ｐ５７８０）、培養培地５００ｍｌ当たり５マイクロＬ（μｌ）のセレン酸ナトリウムの３ｍＭストック（Ｓｉｇｍａ−Ｓ５２６１）を添加することができる［すなわち、最終濃度３ｎＭ（例えば、ＷＩＳ−ＮＨＳＭ）］。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）血清代替物は、少なくとも０．５％、例えば約０．５％〜２５％の範囲、例えば約５％、約１０％、約１５％、約２０％、又は約２５％の濃度で提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＡＬＢＵＭＡＸ（商標）は、少なくとも０．０１％、例えば約０．０１％〜１０％の範囲、例えば約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、又は約１０％、例えば１％の濃度で提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、規定される脂質濃縮物は、少なくとも約０．１％、例えば０．１％〜５％の範囲、例えば約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、例えば約１％の濃度で提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、Ｎ２補足物（例えば、培養培地５００ｍｌ当たり５ｍｌのＮ２）と、規定される脂質濃縮物（培養培地５００ｍｌ当たり５ｍｌの規定される脂質濃縮物）とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、Ｎ２補足物（例えば、培養培地５００ｍｌ当たり５ｍｌのＮ２）と、ＡＬＢＵＭＡＸ（登録商標）ＩＩ（例えば１％、Ａｌｂｕｍａｘ（登録商標）ＩＩ、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、抗生物質（例えば、ペニシリン−ストレプトマイシン）、Ｌ−グルタミン、ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）を更に含んでもよい。
本明細書で使用される「ＳＴＡＴ３」の用語は、転写因子３遺伝子産物のシグナル伝達兼転写活性化因子（急性期応答因子）（遺伝子ＩＤ６７７４）を指す。サイトカイン及び増殖因子に応答して、ＳＴＡＴファミリーメンバーは受容体関連キナーゼによってリン酸化された後、それらが転写活性化因子として作用する細胞核へと移行する、ホモダイマー又はヘテロダイマーを形成する。既知のＳＴＡＴ３活性化剤として、限定されないが、インターフェロン（ＩＦＮ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、インターロイキン５（ＩＬ５）、インターロイキン６（ＩＬ６）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、及び骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）が挙げられる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の培地に使用されるＳＴＡＴ３活性化剤は、ＬＩＦ、ＩＬ６、及びＥＧＦからなる群から選択される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の培地に使用されるＳＴＡＴ３活性化剤は、ＬＩＦ及びＩＬ６からなる群から選択される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の培地に使用されるＳＴＡＴ３活性化剤はＬＩＦである。
本明細書で使用される「白血病抑制因子（ＬＩＦ）」の用語は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１２４４０６４．１（配列番号１１９）によって示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを指し、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１２５７１３５（配列番号３０）によって示されるヌクレオチド配列によってコードされる。本発明の幾つかの実施形態による方法によって使用されるＬＩＦは、本明細書に記載される他の因子と共に、無感作霊長類（例えばヒト）ＰＳＣの未分化成長を、それらの多能性能力を維持しながら、支持し得ることが好ましい。ＬＩＦは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、及びＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ等の様々な製造元から得ることができる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＬＩＦは１ミリリットル当たり約０．５ナノグラム（ｎｇ／ｍｌ）〜約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲、例えば約１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、例えば約１ｎｇ／ｍｌ〜９００ｎｇ／ｍｌ、例えば約１ｎｇ／ｍｌ〜８００ｎｇ／ｍｌ、例えば約１ｎｇ／ｍｌ〜７００ｎｇ／ｍｌ、例えば約１ｎｇ／ｍｌ〜６００ｎｇ／ｍｌ、例えば約１ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ、例えば約１ｎｇ／ｍｌ〜４００ｎｇ／ｍｌ、例えば約１ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌ、例えば約１ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌ、例えば約１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、例えば約１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、例えば約２ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、例えば約４ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、例えば約５ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、例えば約１０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、例えば約１０ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌ、例えば約１０ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌ、例えば約２０ｎｇ／ｍｌで提供される。
本明細書で使用される「インターロイキン６（ＩＬ６）」の用語は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００５９１．１（配列番号１２０）によって示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを指し、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００６００．３（配列番号１１１）によって示される核酸によってコードされる。本発明の幾つかの実施形態による方法によって使用されるＩＬ６は、本明細書に記載される他の因子と共に、無感作霊長類（例えばヒト）ＰＳＣの未分化成長を、それらの多能性能力を維持しながら、支持し得ることが好ましい。ＩＬ６は、Ｓｐｅｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、及びＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ等の様々な製造元から得ることができる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＩＬ６は、約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲、例えば約０．１ｎｇ／ｍｌ〜９０ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．１ｎｇ／ｍｌ〜８０ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．１ｎｇ／ｍｌ〜７０ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．１ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．１ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．１ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．１ｎｇ／ｍｌ〜８ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．１ｎｇ／ｍｌ〜７ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．１ｎｇ／ｍｌ〜６ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．１ｎｇ／ｍｌ〜５ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．１ｎｇ／ｍｌ〜４ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．１ｎｇ／ｍｌ〜３ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．１ｎｇ／ｍｌ〜４ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．５ｎｇ／ｍｌ〜４ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．５ｎｇ／ｍｌ〜４ｎｇ／ｍｌ、例えば約３ｎｇ／ｍｌで提供される。
本明細書で使用される「ＥＧＦ」の用語は、上皮細胞増殖因子遺伝子産物を指す。コードされるタンパク質（ＥＧＦ）は、タンパク質分解性に切断されて５３アミノ酸内皮細胞増殖因子ペプチドを生じる大きな前駆体分子として合成される。ＥＧＦタンパク質は、数多くの細胞型の成長、増殖、及び分化において重要な役割を果たす強力な細胞分裂促進因子として作用し、高親和性細胞表面受容体である内皮細胞増殖因子受容体を結合することによって作用する。本明細書の幾つかの実施形態によって使用され得るＥＧＦタンパク質は、選択的スプライシングによってもたらされるＥＧＦアイソフォーム１〜３のいずれかを含む。したがって、転写バリアント１［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１９６３．４（配列番号１７９）］は、最も長い転写産物を表し、最も長いアイソフォーム、すなわちアイソフォーム１をコードする［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１９５４．２（配列番号１７８）］。バリアント１と比較してコーディング領域にインフレームエクソンを欠く転写バリアント２［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１１７８１３０．１（配列番号１８１）］は、アイソフォーム２をコードする［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１１７１６０１．１（配列番号１８０）］。バリアント１と比較してコーディング領域にインフレームエクソンを欠く転写バリアント３［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１１７８１３１．１（配列番号１８３）］は、アイソフォーム３をコードする［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１１７１６０２．１（配列番号１８２）］。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＥＧＦは、約１ｎｇ／ｍｌ〜約２０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲、例えば約２ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、例えば約３ｎｇ／ｍｌ〜１９ｎｇ／ｍｌ、例えば約４ｎｇ／ｍｌ〜１８ｎｇ／ｍｌ、例えば約５ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌ、例えば約１ｎｇ／ｍｌ、例えば約２ｎｇ／ｍｌ、例えば約３ｎｇ／ｍｌ、例えば約４ｎｇ／ｍｌ、例えば約５ｎｇ／ｍｌ、例えば約６ｎｇ／ｍｌ、例えば約７ｎｇ／ｍｌ、例えば約８ｎｇ／ｍｌ、例えば約９ｎｇ／ｍｌ、例えば約１０ｎｇ／ｍｌ、例えば約１１ｎｇ／ｍｌ、例えば約１２ｎｇ／ｍｌ、例えば約１３ｎｇ／ｍｌ、例えば約１４ｎｇ／ｍｌ、例えば約１５ｎｇ／ｍｌ、例えば約１６ｎｇ／ｍｌ、例えば約１７ｎｇ／ｍｌ、例えば約１８ｎｇ／ｍｌ、例えば約１９ｎｇ／ｍｌ、例えば約２０ｎｇ／ｍｌで提供される。
本明細書で使用される「ＥＲＫ１」の用語は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２７３７．２（配列番号３３）によって示されるマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ３）アイソフォーム１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１０３５１４５．１（配列番号３４）によって示されるＭＡＰＫ３アイソフォーム２、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１１０３３６１．１（配列番号３５）によって示されるＭＡＰＫ３アイソフォーム３、及び／又はＭＡＰＫシグナル伝達活性を有するＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ８４４９０（配列番号３６）によって示されるＥＲＫ１を指す。
本明細書で使用される「ＥＲＫ２」の用語は、ＭＡＰＫシグナル伝達活性を有する、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２７３６．３（配列番号３７）、及び／又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿６２０４０７．１（配列番号３８）によって示されるマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ１（ＭＡＰＫ１）を指す。
本明細書で使用される「ＥＲＫ１／２阻害剤」の用語は、リン酸化ＥＲＫ１／２タンパク質のウェスタンブロットタンパク質検出によって特定されるＥＲＫ１／２の活性を阻害することができる任意の分子を指す。
ＥＲＫ１／２阻害剤（ＭＥＫ／１／２阻害剤としても知られる）の非限定的な例として、ＰＤ０３２５９０１ （ＡＸＯＮＭＥＤＣＨＥＭ−ＡＸＯＮ１４０８）、ＰＤ９８０５９（ＡＸＯＮＭＥＤＣＨＥＭ−Ａｘｏｎ１２２３）、及びＰＤ１８４３５２（ＡＸＯＮＭＥＤＣＨＥＭ−ＡＸＯＮ１３６８）が挙げられる。
ＥＲＫ１／２活性の阻害は、その活性がＥＲＫ１／２の活性に直接影響を及ぼすタンパク質（複数の場合がある）の阻害によっても達成され得ることが理解される。かかるタンパク質（複数の場合がある）は、ＭＥＫ／ＥＲＫ経路の「上流」であるとされ、すなわち、その阻害が後のＥＲＫ１／２タンパク質活性の阻害をもたらすタンパク質（例えば、Ａ−ＲＡＦ、Ｂ−ＲＡＦ、及びＣ−ＲＡＦ）とされる。ＥＲＫ１／２活性の阻害ももたらすＢＲＡＦ及びＣＲＡＦのタンパク質の阻害剤の非限定的な例として、トシル酸ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６ＡＸＯＮＭＥＤＣＨＥＭ−ＡＸＯＮ１３９７としても知られる）又は以下に更に説明されるＳＢ５９０８８５（ＴＯＣＲＩＳ＃２６５０）が挙げられる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＰＤ０３２５９０１は、約０．０１マイクロＭ（μＭ）〜約５０μＭの濃度範囲、例えば約０．０５μＭ〜４５μＭ、例えば約０．１μＭ〜５０μＭ、例えば約０．１μＭ〜４５μＭ、例えば約０．１μＭ〜４０μＭ、例えば約０．１μＭ〜３５μＭ、例えば約０．１μＭ〜３０μＭ、例えば約０．１μＭ〜２５μＭ、例えば約０．１μＭ〜２０μＭ、例えば約０．１μＭ〜１５μＭ、例えば約０．１μＭ〜１０μＭ、例えば約０．２μＭ〜１０μＭ、例えば約０．３μＭ〜１０μＭ、例えば約０．４μＭ〜１０μＭ、例えば約０．５μＭ〜１０μＭ、例えば約０．６μＭ〜１０μＭ、例えば約０．７μＭ〜１０μＭ、例えば０．８μＭ〜１０μＭ、例えば０．９μＭ〜１０μＭ、例えば０．９μＭ〜９μＭ、例えば０．９μＭ〜８μＭ、例えば０．９μＭ〜７μＭ、例えば０．９μＭ〜６μＭ、例えば０．８μＭ〜５μＭ、例えば０．８μＭ〜４μＭ、例えば０．８μＭ〜３μＭ、例えば０．８μＭ〜２μＭ、例えば０．８μＭ〜１．５μＭ、例えば０．９μＭ〜１．２μＭ、例えば約１μＭで提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＰＤ９８０５９は、約０．１マイクロＭ（μＭ）〜約７０μＭの濃度範囲、例えば約０．１μＭ〜６５μＭ、例えば約０．１μＭ〜５５μＭ、例えば約０．１μＭ〜５０μＭ、例えば約０．１μＭ〜４５μＭ、例えば約０．１μＭ〜４０μＭ、例えば約０．１μＭ〜３５μＭ、例えば約０．１μＭ〜３０μＭ、例えば約０．１μＭ〜２５μＭ、例えば約０．１μＭ〜２０μＭ、例えば約０．１μＭ〜１５μＭ、例えば約２μＭ〜２０μＭ、例えば約５μＭ〜１５μＭ、例えば約１０μＭ、例えば約０．１μＭ〜１０μＭ、例えば約０．２μＭ〜１０μＭ、例えば約０．３μＭ〜１０μＭ、例えば約０．４μＭ〜１０μＭ、例えば約０．５μＭ〜１０μＭ、例えば約０．６μＭ〜１０μＭ、例えば約０．７μＭ〜１０μＭ、例えば０．８μＭ〜１０μＭ、例えば０．９μＭ〜１０μＭ、例えば０．９μＭ〜９μＭ、例えば０．９μＭ〜８μＭ、例えば０．９μＭ〜７μＭ、例えば０．９μＭ〜６μＭ、例えば０．８μＭ〜５μＭ、例えば０．８μＭ〜４μＭ、例えば０．８μＭ〜３μＭ、例えば０．８μＭ〜２μＭ、例えば０．８μＭ〜１．５μＭ、例えば０．９μＭ〜１．２μＭで提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＰＤ１８４３５２は、約０．１マイクロＭ（μＭ）〜約７０μＭの濃度範囲、例えば約０．１μＭ〜６０μＭ、例えば約０．１μＭ〜５０μＭ、例えば約０．５μＭ〜５０μＭ、例えば約０．５μＭ〜４５μＭ、例えば約０．５μＭ〜４０μＭ、例えば約０．１μＭ〜３５μＭ、例えば約０．５μＭ〜３０μＭ、例えば約０．５μＭ〜２５μＭ、例えば約０．５μＭ〜２０μＭ、例えば約０．５μＭ〜１５μＭ、例えば約０．５μＭ〜１０μＭ、例えば０．５μＭ〜９μＭ、例えば０．５μＭ〜８μＭ、例えば０．５μＭ〜７μＭ、例えば０．９μＭ〜６μＭ、例えば０．８μＭ〜５μＭ、例えば０．８μＭ〜４μＭ、例えば０．８μＭ〜３μＭ、例えば約３μＭ、例えば０．８μＭ〜２μＭ、例えば０．８μＭ〜１．５μＭ、例えば０．９μＭ〜１．２μＭで提供される。
ＡＸＩＮ分解複合体は、腫瘍抑制因子であるＡｘｉｎ及び大腸腺腫症（ＡＰＣ）、Ｓｅｒ／ＴｈｒキナーゼＧＳＫ−３及びＣＫ１を含む多タンパク質の「分解複合体」である。
ＧＳＫ３ｂ阻害剤の使用は、細胞質及び核の下流機能を有するベータカテニンエフェクタの安定化を可能とする。ＧＳＫ３ｂ阻害剤とＡＸＩＮ分解複合体小分子の併用は、核で見られる安定化されたベータカテニン機能を犠牲にして、細胞質で安定化されたベータカテニン機能を増すことができる。かかるアプローチを使用してマウス及びヒトの霊長類細胞においてＦＧＦ２シグナル伝達に対する依存を減少した（Ｋｉｍ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，２０１３． Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｂ−ｃａｔｅｎｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｍａｉｎｔａｉｎｓ ｍｏｕｓｅ ｅｐｉｂｌａｓｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ４，１−１１）。
最近、分解複合体の構造及び／又は活性を安定化する、２つのグループの化学物質（ＩＷＲ−１−Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ １０１６１、及びＸＡＶ９３９−ＴＯＣＲＩＳカタログ番号３７４８、又はＳｉｇｍａカタログ番号Ｘ３００４）が同定された（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５：１００−１０７，２００９、及びＨｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ：４６１：６１４−６２０，２００９）。タンキラーゼのＰＡＲＰドメインを遮断することによって、ＸＡＶ９３９及びＩＷＲ−１が、安定性の増加、及び標準的なＷｎｔシグナル伝達の阻害をもたらすＡＸＩＮ２のポリＡＤＰ−リボース修飾（ＰＡＲｓｙｌａｔｉｏｎ）及びユビキチン化を変更すると考えられる。ＩＷＲ化合物は、直接的な相互作用により、ベータカテニン分解複合体（Ａｐｃ、Ａｘｉｎ１／２、Ｃｋ１、及びＧｓｋ３ｂからなる）の一部であるＡｘｉｎタンパク質の安定化を誘導する。
本発明の幾つかの実施形態により使用され得る追加のＡＸＩＮ安定化剤として、限定されないが、ＩＷＰ２（ＴＯＣＲＩＳから入手可能、カタログ番号３５３３、例えば約２マイクロＭの濃度）、リゾフォスファチジン酸（ＬＰＡ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、カタログ番号ｓｃ２０１０５３から入手可能、例えば約１マイクロＭ〜１０マイクロＭの濃度）、ＷＮＴ５ａ（ＲｎＤ ｓｙｓｔｅｍから入手可能、カタログ番号６４５−ＷＮ−０１０、例えば約１ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌの濃度）が挙げられる。
特定の実施形態によれば、ＡＸＩＮ複合安定化剤は小分子化合物である。
別の実施形態によれば、ＡＸＩＮ複合安定化剤はＩＷＲ−１である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＡＸＩＮ安定化剤（例えば、ＩＷＲ−１）は、約０．１μＭ〜７０μＭ、例えば約０．２μＭ〜約７０μＭ、例えば約０．２μＭ〜６０μＭ、例えば約０．２μＭ〜５５μＭ、例えば約０．２μＭ〜５０μＭ、例えば約０．２μＭ〜４５μＭ、例えば約０．２μＭ〜４０μＭ、例えば約０．２μＭ〜３５μＭ、例えば約０．２μＭ〜３０μＭ、例えば約０．２μＭ〜２５μＭ、例えば約０．２μＭ〜２０μＭ、例えば約０．２μＭ〜１５μＭ、例えば約０．２μＭ〜１０μＭ、例えば約０．３μＭ〜１０μＭ、例えば約０．４μＭ〜１０μＭ、例えば約０．５μＭ〜１０μＭ、例えば約０．６μＭ〜１０μＭ、例えば約０．７μＭ〜１０μＭ、例えば０．８μＭ〜１０μＭ、例えば０．９μＭ〜１０μＭ、例えば０．９μＭ〜９μＭ、例えば１μＭ〜８μＭ、例えば１μＭ〜７μＭ、例えば１μＭ〜６μＭ、例えば１μＭ〜５μＭ、例えば約１μＭ〜３μＭ、例えば約２μＭ、例えば約５μＭの濃度で提供される。
別の実施形態によれば、ＡＸＩＮ複合体安定化剤はＸＡＶ９３９である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＡＸＩＮ安定化剤（例えば、ＸＡＶ９３９、ＩＷＰ２、及び／又はＬＰＡ）は、約０．１μＭ〜７０μＭ、例えば約０．１μＭ〜２０μＭ、例えば約０．２μＭ〜約７０μＭ、例えば約０．２μＭ〜６０μＭ、例えば約０．２μＭ〜５５μＭ、例えば約０．２μＭ〜５０μＭ、例えば約０．２μＭ〜４５μＭ、例えば約０．２μＭ〜４０μＭ、例えば約０．２μＭ〜３５μＭ、例えば約０．２μＭ〜３０μＭ、例えば約０．２μＭ〜２５μＭ、例えば約０．２μＭ〜２０μＭ、例えば約０．２μＭ〜１５μＭ、例えば約０．２μＭ〜１０μＭ、例えば約０．３μＭ〜１０μＭ、例えば約０．４μＭ〜１０μＭ、例えば約０．５μＭ〜１０μＭ、例えば約０．６μＭ〜１０μＭ、例えば約０．７μＭ〜１０μＭ、例えば０．８μＭ〜１０μＭ、例えば０．９μＭ〜１０μＭ、例えば１μＭ〜１０μＭ、例えば０．９μＭ〜９μＭ、例えば１μＭ〜８μＭ、例えば１μＭ〜７μＭ、例えば１μＭ〜６μＭ、例えば１μＭ〜５μＭ、例えば約１μＭ〜３μＭ、例えば約２μＭの濃度範囲で提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＡＸＩＮ安定化剤ＷＮＴ５ａは、約１ｎｇ／ｍｌ〜約２０ｎｇ／ｍｌ、例えば約２ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、例えば約３ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、例えば約４ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、例えば約５ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、例えば約６ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、例えば約７ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、例えば約８ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、例えば約９ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、例えば約１０ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、例えば約１０ｎｇ／ｍｌ〜１９ｎｇ／ｍｌ、例えば約１０ｎｇ／ｍｌ〜１８ｎｇ／ｍｌ、例えば約１０ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌ、例えば約２０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地はＰＫＣ阻害剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＰＫＣ阻害剤とを含む培養培地が提供される。
本明細書で使用される「タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）」の用語は、ＰＫＣα（アルファ）、ＰＫＣβ（ベータ）、ＰＫＣγ（ガンマ）、ＰＫＣδ（デルタ）、ＰＫＣζ（ゼータ）、及びＰＫＣμ（ミュー）のタンパク質アイソフォームを指す。
本明細書で使用される「タンパク質キナーゼＣ阻害剤」の用語は、非リン酸化ＰＫＣアイソフォームに対してリン酸化のレベルを減少することによって特定されるタンパク質キナーゼＣの活性を阻害することができる任意の分子を指す。
タンパク質キナーゼＣ阻害剤の非限定的な例は、広範囲のスペクトラムのタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤（ＩＣ５０値は、ＰＫＣα、ＰＫＣβ、ＰＫＣγ、ＰＫＣδ、ＰＫＣζ、及びＰＫＣμに対してそれぞれ７ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、１０ｎＭ、６０ｎＭ、及び２００００ｎＭである）を有する、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の強力で細胞浸透性の可逆的な、ＡＴＰ競合阻害剤である、Ｇｏ６９８３（ＣＡＳ １３３０５３−１９−７）である。Ｇｏ６９８３はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（カタログ番号３６５２５１−５００ＵＧ）及びＴＯＣＲＩＳ（カタログ番号２２８５）等の様々な供給元から入手可能である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、Ｇｏ６９８３は、約０．５μＭ〜１００μＭ、例えば約１μＭ〜約１００μＭ、例えば約１μＭ〜９０μＭ、例えば約１μＭ〜８０μＭ、例えば約１μＭ〜７０μＭ、例えば約１μＭ〜６０μＭ、例えば約１μＭ〜５５μＭ、例えば約１μＭ〜５０μＭ、例えば約１μＭ〜４５μＭ、例えば約１μＭ〜４０μＭ、例えば約１μＭ〜３５μＭ、例えば約１μＭ〜３０μＭ、例えば約１μＭ〜２５μＭ、例えば約１μＭ〜２０μＭ、例えば約１μＭ〜１５μＭ、例えば約１μＭ〜１０μＭ、例えば約２μＭ〜１０μＭ、例えば約３μＭ〜１０μＭ、例えば約４μＭ〜１０μＭ、例えば約４μＭ〜６μＭ、例えば約５μＭの範囲の濃度で提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培地はＧＳＫ３ｂ阻害剤を更に含む。
したがって、本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、Ａｘｉｎ安定化剤と、ＰＫＣ阻害剤と、ＧＳＫ３ｂ阻害剤とを含む培養培地が提供される。
本明細書で使用される「ＧＳＫ３ｂ」の用語は、そのキナーゼ活性によりＷＮＴシグナル伝達経路制御活性を有するＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２０８４．２（配列番号１２１）及び／又はＮＰ＿００１１３９６２８．１（配列番号１２２）によって示されるグリコーゲン合成キナーゼ３ベータタンパク質を指す。
本明細書で使用される「ＧＳＫ３ｂ阻害剤」の用語は、（細胞に存在する総ＧＳＫ３ｂのうち）リン酸化ＧＳＫ３ｂのレベルを特異的に阻害することによって特定されるＧＳＫ３ｂの活性を阻害することができる任意の分子を指す。
ＧＳＫ３ｂ阻害剤の非限定的な例としてＣＨＩＲ９９０２１（ＡＸＯＮＭＥＤＣＨＥＭ−ＡＸＯＮ１３８６）、ＢＩＯ（ＡＸＯＮＭＥＤＣＨＥＭ−Ａｘｏｎ１６９３）、及びケンパウロン（ＴＯＣＲＩＳ−カタログ番号１３９８）が挙げられる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＣＨＩＲ９９０２１は、約０．１μＭ〜５０μＭの濃度範囲、例えば約０．２μＭ〜約５０μＭ、例えば約０．２μＭ〜４５μＭ、例えば約０．２μＭ〜５０μＭ、例えば約０．２μＭ〜４５μＭ、例えば約０．２μＭ〜４０μＭ、例えば約０．２μＭ〜３５μＭ、例えば約０．２μＭ〜３０μＭ、例えば約０．２μＭ〜２５μＭ、例えば約０．２μＭ〜２０μＭ、例えば約０．２μＭ〜１５μＭ、例えば約０．２μＭ〜１０μＭ、例えば約０．２μＭ〜１０μＭ、例えば約０．３μＭ〜１０μＭ、例えば約０．４μＭ〜１０μＭ、例えば約０．５μＭ〜１０μＭ、例えば約０．６μＭ〜１０μＭ、例えば約０．７μＭ〜１０μＭ、例えば０．８μＭ〜１０μＭ、例えば０．９μＭ〜１０μＭ、例えば０．９μＭ〜９μＭ、例えば１μＭ〜８μＭ、例えば１μＭ〜７μＭ、例えば１μＭ〜６μＭ、例えば１μＭ〜５μＭ、例えば２μＭ〜４μＭ、例えば約３μＭで提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＢＩＯは、約０．１μＭ〜７０μＭの濃度範囲、例えば約０．２μＭ〜約７０μＭ、例えば約０．２μＭ〜６０μＭ、例えば約０．２μＭ〜５５μＭ、例えば約０．２μＭ〜５０μＭ、例えば約０．２μＭ〜４５μＭ、例えば約０．２μＭ〜４０μＭ、例えば約０．２μＭ〜３５μＭ、例えば約０．２μＭ〜３０μＭ、例えば約０．２μＭ〜２５μＭ、例えば約０．２μＭ〜２０μＭ、例えば約０．２μＭ〜１５μＭ、例えば約０．２μＭ〜１０μＭ、例えば約０．３μＭ〜１０μＭ、例えば約０．４μＭ〜１０μＭ、例えば約０．５μＭ〜１０μＭ、例えば約０．６μＭ〜１０μＭ、例えば約０．７μＭ〜１０μＭ、例えば０．８μＭ〜１０μＭ、例えば０．９μＭ〜１０μＭ、例えば０．９μＭ〜９μＭ、例えば１μＭ〜８μＭ、例えば１μＭ〜７μＭ、例えば１μＭ〜６μＭ、例えば１μＭ〜５μＭ、例えば約５μＭ、例えば２μＭ〜４μＭで提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ケンパウロンは、約０．１μＭ〜７０μＭの濃度範囲、例えば約０．２μＭ〜約７０μＭ、例えば約０．２μＭ〜６０μＭ、例えば約０．２μＭ〜５５μＭ、例えば約０．２μＭ〜５０μＭ、例えば約０．２μＭ〜４５μＭ、例えば約０．２μＭ〜４０μＭ、例えば約０．２μＭ〜３５μＭ、例えば約０．２μＭ〜３０μＭ、例えば約０．２μＭ〜２５μＭ、例えば約０．２μＭ〜２０μＭ、例えば約０．２μＭ〜１５μＭ、例えば約０．２μＭ〜１０μＭ、例えば約０．３μＭ〜１０μＭ、例えば０．４μＭ〜１０μＭ、例えば約０．５μＭ〜１０μＭ、例えば約０．６μＭ〜１０μＭ、例えば約０．７μＭ〜１０μＭ、例えば０．８μＭ〜１０μＭ、例えば０．９μＭ〜１０μＭ、例えば０．９μＭ〜９μＭ、例えば１μＭ〜８μＭ、例えば１μＭ〜７μＭ、例えば１μＭ〜６μＭ、例えば１μＭ〜５μＭ、例えば２μＭ〜４μＭ、例えば約５μＭで提供される
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培地は、ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＲＣ阻害剤、アスコルビン酸、ＰＫＡアゴニスト、ＹＡＰ／ＴＡＺ阻害剤、ＮＯＴＣＨ阻害剤、ＳＨＨ阻害剤、ＴＧＦβＲ阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、ＦＧＦＲ阻害剤、ＪＮＫ阻害剤、ＥＲＫ５阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤、ＣＲＡＦ阻害剤、ＡＲＡＦ阻害剤、ｐ３８阻害剤、ＧＳＫ３ｂ阻害剤、ＬＳＤ１阻害剤、ＰＩ３Ｋ活性化剤（又はブースター）、ＳＭＡＤ活性化剤、及びＤＯＴ１Ｌ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤を更に含む。
本明細書で使用される「ＲＯＣＫ」の用語は、セリン／トレオニンキナーゼ活性を有し、細胞質分裂、平滑筋収縮、アクチンストレス線維と接着点の形成、及びｃ−ｆｏｓ血清応答要素の活性化を調節する、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００５３９７．１（Ｐ１６０ＲＯＣＫ、配列番号５０）及びＮＰ＿００４８４１．２（ＲＯＣＫ２、配列番号５１）に示されるタンパク質を指す。
本明細書で使用される「ＲＯＣＫ阻害剤」の用語は、ＲＯＣＫリン酸化レベルの阻害剤（ウェスタンブロット分析によって検出される）によって特定される、ＲＯＣＫの活性を阻害することができる任意の分子を指す。
ＲＯＣＫ阻害剤の非限定的な例として、Ｙ２７６３２（ＴＯＣＲＩＳカタログ番号１２５４）、ブレビスタチン（ＴＯＣＲＩＳカタログ番号１７６０）、及びチアゾビビン（Ａｘｏｎ Ｍｅｄｃｈｅｍ−Ａｘｏｎ１５３５）が挙げられる。ブレビスタチンはＲＯＣＫ経路の下流エフェクタであるミオシンＩＩ ＡＴｐａｓｅの選択的阻害剤であり、したがって、効果的にＲＯＣＫ経路阻害をもたらす（その全体が参照により本明細書に完全に援用される、Ｃｈｅｎ Ｇ１， Ｈｏｕ Ｚ ｅｔ ａｌ．Ａｃｔｉｎ−ｍｙｏｓｉｎ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｉｔｙ ｉｓ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｄｕｃｅｄ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２０１０；７（２）：２４０−８）。
本発明の幾つかの実施形態によれば、Ｙ２７６３２は、約０．１μＭ〜１００μＭの濃度範囲、例えば約０．１μＭ〜約９０μＭ、例えば約０．１μＭ〜８５μＭ、例えば約０．１μＭ〜８０μＭ、例えば約０．１μＭ〜７０μＭ、例えば約０．１μＭ〜６０μＭ、例えば約０．１μＭ〜５５μＭ、例えば約０．１μＭ〜５０μＭ、例えば約０．１μＭ〜４５μＭ、例えば約０．１μＭ〜４０μＭ、例えば約０．１μＭ〜３５μＭ、例えば約０．１μＭ〜３０μＭ、例えば約０．１μＭ〜２５μＭ、例えば約１μＭ〜２０μＭ、例えば約１μＭ〜１５μＭ、例えば約１μＭ〜１０μＭ、例えば約２μＭ〜１０μＭ、例えば約３μＭ〜１０μＭ、例えば約４μＭ〜１０μＭ、例えば約４μＭ〜６μＭ、例えば約５μＭで提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ブレビスタチンは、約０．５μＭ〜約１０μＭの濃度範囲、例えば約０．５μＭ〜約９μＭ、例えば約０．５μＭ〜８．５μＭ、例えば約０．５μＭ〜８μＭ、例えば約０．５μＭ〜７μＭ、例えば約０．５μＭ〜６μＭ、例えば約０．５μＭ〜５．５μＭ、例えば約０．５μＭ〜５μＭ、例えば約０．５μＭ〜４．５μＭ、例えば約０．５μＭ〜４μＭ、例えば約０．５μＭ〜３．５μＭ、例えば約０．５μＭ〜３μＭ、例えば約０．５μＭ〜２．５μＭ、例えば約１μＭ〜２μＭ、例えば約５μＭで提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、チアゾビビンは、約０．１μＭ〜約５μＭの濃度範囲、例えば約０．１μＭ〜約４μＭ、例えば約０．１μＭ〜約３μＭ、例えば約０．２μＭ〜約２．５μＭ、例えば約０．３μＭ〜約２μＭ、例えば約０．３μＭ〜約１ＭμＭ、例えば約０．３μＭ〜約０．８μＭ、例えば０．４〜０．６μＭ、例えば約０．４μＭ、例えば約０．５μＭで提供される。
本明細書で使用される「ＳＲＣ」の用語は、胚の発生及び細胞成長の調節に役割を果たす可能性のあるＳＲＣがん原遺伝子である非受容体チロシンキナーゼを指す。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、その活性がｃ−ＳＲＣキナーゼによるリン酸化によって阻害され得るチロシンタンパク質キナーゼである。上記タンパク質をコードする２つの転写バリアント（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００５４０８．１（配列番号１３４）がこの遺伝子に対して見出された［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５４１７．４（配列番号１３５）、及びＮＭ＿１９８２９１．２（配列番号１３６）］。
Ｓｒｃシグナル伝達は、内皮の間葉への移行を促進し、ＪＮＫ経路の上流の刺激因子である。ＳＲＣ経路の小分子阻害は、マウス多能性細胞の拡大を指示することが示されている（Ｌｉ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，２０１１．Ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ−ＮＦＡＴ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｃｒｉｔｉｃａｌｌｙ Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｅａｒｌｙ Ｌｉｎｅａｇｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ８，４６−５８、及びＳｈｉｍｉｚｕ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，２０１２．Ｄｕａｌ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｒｃ ａｎｄ ＧＳＫ３ Ｍａｉｎｔａｉｎｓ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，Ｗｈｏｓｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｉｓ Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌｌｙ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ Ｓｒｃ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３０，１３９４−１４０４）。「ｓｒｃファミリーキナーゼ阻害剤」の文言は、ｓｒｃキナーゼファミリーの機能を妨げる又は阻害するのに有効な任意の薬剤を指す。かかる薬剤は、限定されないが、標的遺伝子の発現を減少させる、並びに接着斑キナーゼ、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、パキシリン、Ｃａｓ、ｐ１９０ＲｈｏＧＡＰ、Ｒａｓ、Ｅ−カドヘリン、ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ、ＮＥＤＤ９、その他等の直接及び間接のｃ−Ｓｒｃ基質の機能を阻害するように機能する、小分子、化学物質、及び核酸が挙げられる。薬剤の例として、ダサチニブ、ＳＵ６６５６、及びＡＺＤ０５５３０が挙げられる。また、Ｓｒｃ阻害剤はＷｙｅｔｈから入手可能であり、例えば、４−［（２，４−ジクロロ−５−メトキシフェニル）アミノ］−７−［３−（４−エチル−１−ピペラジニル）プロポキシ］−６−メトキシ−３−キノリンカルボニトリル、４−［（２，４−ジクロロ−５−メトキシフェニル）アミノ］−６−メトキシ−７−［２−（４−メチル−１−ピペラジニル）エトキシ］−３−キノリンカルボニトリル、４−［（２，４−ジクロロ−５−メトキシフェニル）アミノ］−７−［２−（４−エチル−１−ピペラジニル）エトキシ］−６−メトキシ−３−キノリンカルボニトリル、４−［（２，４−ジクロロ−５−メトキシフェニル）アミノ］−６−メトキシ−７−［（１−メチルピペリジン−４−イル）メトキシ］−３−キノリンカルボニトリル、４−［（２，４−ジクロロ−５−メトキシフェニル）アミノ］−６−メトキシ−７−［２−（１−メチルピペリジン−４−イル）エトキシ］−３−キノリンカルボニトリル、４−［（２，４−ジクロロ−５−メトキシフェニル）アミノ］−６−メトキシ−７−［３−（１−メチルピペリジン−４−イル）プロポキシ］キノリン−３−カルボニトリル、４−［（２，４−ジクロロ−５−メトキシフェニル）アミノ］−７−［（１−エチルピペリジン−４−イル）メトキシ−］−６−メトキシキノリン−３−カルボニトリル、４−［（２，４−ジクロロ−５−メトキシフェニル）アミノ］−６−エトキシ−７−［３−（４−メチルピペラジン−１−イル）プロポキシ］キノリン−３−カルボニトリル、４−［（２，４−ジクロロ−５−メトキシフェニル）アミノ］−６−エトキシ−７−［（１−メチルピペリジン−４−イル）メトキシ］キノリン−３−カルボニトリル、４−［（２，４−ジクロロ−５−メトキシフェニル）アミノ］−６−エトキシ−７−［３−（４−エチルピペラジン−１−イル）プロポキシ］キノリン−３−カルボニトリル、４−［（２，４−ジクロロ−５−メトキシフェニル）アミノ］−６−エトキシ−７−［３−（１−メチルピペリジン−４−イル）プロポキシ］キノリン−３−カルボニトリル、４−［（２，４−ジクロロ−５−メトキシフェニル）アミノ］−６−エトキシ−７−［２−（４−メチル１−ピペラジニル）エトキシ］キノリン−３−カルボニトリル、４−［（２，４−ジクロロ−５−メトキシフェニル）アミノ］−６−エトキシ−７−［２−（１−メチルピペリジン−４−イル）エトキシ］キノリン−３−カルボニトリル、又は４−［（２，４−ジクロロ−５−メトキシフェニル）アミノ］−６−メトキシ−７−［３−（４−プロピル−１−ピペラジニル）プロポキシ］−３−キノリンカルボニトリル、及びそれらの薬学的に許容可能な塩が挙げられる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、Ｓｒｃファミリーキナーゼに対する阻害活性を有する薬剤は小分子薬剤である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、Ｓｒｃファミリーキナーゼに対する阻害活性を有する薬剤は化学薬剤である。
非受容体チロシンキナーゼのＳｒｃファミリーに対する阻害活性を有する好適な化合物として、国際特許出願の国際公開第０１／９４３４１号、第０２／１６３５２号、第０２／３０９２４号、第０２／３０９２６号、第０２／３４７４４号、第０２／０８５８９５号、第０２／０９２５７７号（ＰＣＴ／ＧＢ０２／０２１１７に基づく）、第０２／０９２５７８号（ＰＣＴ／ＧＢ０２／０２１２４に基づく）、及び第０２／０９２５７９号（ＰＣＴ／ＧＢ ０２／０２１２８に基づく）に記載されるキナゾリン誘導体、国際公開第０３／００８４０９号（ＰＣＴ／ＧＢ ０２／０３１７７に基づく）、第０３／０４７５８４号、及び第ＷＯ ０３／０４８１５９号に記載されるキノリン誘導体、並びに欧州特許出願第０２２９２７３６．２号（２００２年１１月４日付出願）及び第０３２９０９００．４号（２００３年４月１０日付出願）に記載されるキナゾリン誘導体が挙げられる。
特定の４−アニリノ−３−シアノキノリン誘導体は、Ｓｒｃ依存性細胞増殖の阻害に有用であることがＪｏｕｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１，４４，８２２−８３３及び３９６５−３９７７に開示されている。ＳＫＩ ６０６として知られる４−アニリノ−３−シアノキノリンＳｒｃ阻害剤は、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，６３，３７５に記載される。
Ｓｒｃキナーゼ阻害特性を有する他の化合物は、例えば国際特許出願の国際公開第９６／１００２８号、第９７／０７１３１号、第９７／０８１９３号、第９７／１６４５２号、第９７／２８１６１号、第９７／３２８７９号、及び第９７／４９７０６号に記載される。
Ｓｒｃ阻害特性を有する他の化合物は、例えばＪ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９９，１４（Ｓｕｐｐｌ．１），Ｓ４８７、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，１９９９，３，６３９−６４７、Ｊｏｕｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７，４０，２２９６−２３０３、Ｊｏｕｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，４１，３２７６−３２９２、並びにＢｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００２，１２，１３６１及び３１５３に記載される。
特定のＳｒｃキナーゼ阻害剤として以下が挙げられる。
（ｉ）国際特許出願の国際公開第９６／１００２８号に記載される方法によって得ることができる、４−アミノ−５−（３−メトキシフェニル）−７−｛（４−［２−（２−メトキシエチルアミノ）エトキシ］フェニル）−｝−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン及び４−アミノ−５−（３−メトキシフェニル）−７−（４−｛（２−［ジ−（２−メトキシエチル）アミノ］エトキシ｝フェニル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン、
（ｉｉ）ＰＰＩとしても知られ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，１９９９，３，６３９−６４８に記載される、４−アミノ−７−ｔｅｒｔ−ブチル−５−（４−トルイル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、
（ｉｉｉ）Ｊｏｕｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４５，３３９４に記載される方法によって得ることができる、２−（２，６−ジクロロアニリノ）−６，７−ジメチル−１，８−ジヒドロイミダゾ［４，５−ｈ］イソキノリン−９−オン及び２−（２，６−ジクロロアニリノ）−７−［（Ｅ）−３−ジエチルアミノプロパ−１−エニル］−６−メチル−１，８−ジヒドロイミダゾ［４，５−ｈ］イソキノリン−９−オン、
（ｉｖ）Ｊｏｕｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７，４０，２２９６−２３０３及びＪｏｕｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１，４４，１９１５に記載される方法によって得ることができる、１−［６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−（４−ジエチルアミノブチル）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル］−３−エチルウレア、
（ｖ）ＰＤ１６６２８５としても知られ、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９７，２８３，１４３３−１４４４に記載される、６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−［４−（２−ジエチルアミノエトキシ）アニリノ］−８−メチル−８Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−オン、
（ｖｉ）ＰＤ１６２５３１としても知られ、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，２０００，１１，５１−６４に記載される化合物、
（ｖｉｉ）ＰＤ１６６３２６としても知られ、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２０００，６０，８８５−８９８に記載される化合物、並びに
（ｖｉｉｉ）ＰＤ１７３９５５としても知られ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９９，５９，６１４５−６１５２に記載される化合物。
Ｓｒｃキナーゼ阻害特性を有し得る他の化合物は、例えば、国際特許出願の国際公開第０２／０７９１９２号、第０３／０００１８８号、第０３／０００２６６号、第０３／０００７０５号、第０２／０８３６６８号、第０２／０９２５７３号、第０３／００４４９２号、第００／４９０１８号、第０３／０１３５４１号、第０１／００２０７号、第０１／００２１３号、及び第０１／００２１４号に記載される。
特定のＳｒｃ阻害剤として、国際特許出願の国際公開第０１／９４３４１号に提示されるものが挙げられる。
更に特定のＳｒｃ阻害剤として、以下の国際特許出願の国際公開第０２／１６３５２号、第０２／３０９２４号、第０２／３０９２６号、及び第０２／３４７４４号による化合物が挙げられる。例示的な薬剤として、限定されないが、ダサチニブ、及びＡＺＤ０５３０が挙げられる。
他の例示的な薬剤として、ＣＧＰ７７６７５（ＡＸＯＮ ＭＥＤＣＨＥＭ ２０９７）、ＳＵ ６６５６、ＡＺＤ０５３０、ダサチニブ、ボスチニブ、及びＷＨ−４−０２３が挙げられる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、Ｓｒｃファミリーキナーゼ阻害剤（例えばＣＧＰ７７６７５）は、約０．１μＭ〜１００μＭの濃度範囲、例えば０．１μＭ〜７０μＭ、例えば約０．２μＭ〜約７０μＭ、例えば約０．２μＭ〜６０μＭ、例えば約０．２μＭ〜５５μＭ、例えば約０．２μＭ〜５０μＭ、例えば約０．２μＭ〜４５μＭ、例えば約０．２μＭ〜４０μＭ、例えば約０．２μＭ〜３５μＭ、例えば約０．２μＭ〜３０μＭ、例えば約０．２μＭ〜２５μＭ、例えば約０．２μＭ〜２０μＭ、例えば約０．２μＭ〜１５μＭ、例えば約０．２μＭ〜１０μＭ、例えば約０．３μＭ〜１０μＭ、例えば約０．４μＭ〜１０μＭ、例えば約０．５μＭ〜１０μＭ、例えば約０．６μＭ〜１０μＭ、例えば約０．７μＭ〜１０μＭ、例えば０．８μＭ〜１０μＭ、例えば０．９μＭ〜１０μＭ、例えば０．９μＭ〜９μＭ、例えば１μＭ〜８μＭ、例えば１μＭ〜７μＭ、例えば１μＭ〜６μＭ、例えば１μＭ〜５μＭ、例えば約１μＭ〜３μＭ、例えば約１．５μＭで提供される。
アスコルビン酸（ビタミンＣとしても知られる）は、抗酸化特性を有する糖酸（Ｃ６Ｈ８Ｏ６、分子量１７６．１２グラム／モル）である。本発明の幾つかの実施形態の培養培地によって使用されるアスコルビン酸は、天然アスコルビン酸、合成アスコルビン酸、アスコルビン酸塩（例えば、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カルシウム、アスコルビン酸カリウム）、アスコルビン酸のエステル形態（例えば、アスコルビン酸パルミテート、アスコルビン酸ステアレート）、その機能的誘導体（本発明の培養培地に使用された場合に同じ活性／機能を示すアスコルビン酸に由来する分子）、又はそのアナログ（例えば、本発明の培養培地に使用された場合にアスコルビン酸について観察されるものと類似の活性を示すアスコルビン酸の機能的等価物）であってもよい。本発明の幾つかの実施形態の培養培地に使用され得るアスコルビン酸製剤の非限定的な例として、Ｌ−アスコルビン酸及びアスコルビン酸３−リン酸が挙げられる。
アスコルビン酸は、米国ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ（例えば、カタログ番号Ａ２２１８、Ａ５９６０、Ａ７５０６、Ａ０２７８、Ａ４４０３、Ａ４５４４、Ａ２１７４、Ａ２３４３、９５２０９、３３０３４、０５８７８、９５２１０、９５２１２、４７８６３、０１−６７３０、０１−６７３９、２５５５６４、Ａ９２９０２、Ｗ２１０９０１）等の様々な製造元から得ることができる。
本発明の幾つかの実施形態の培養培地に含まれるアスコルビン酸の濃度は、約１μｇ／ｍｌ〜最大２００μｇ／ｍｌ、例えば１０μｇ／ｍｌ〜１５０μｇ／ｍｌ、例えば１０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、例えば１０μｇ／ｍｌ〜６０μｇ／ｍｌ、例えば２０μｇ／ｍｌ〜６０μｇ／ｍｌ、例えば３０μｇ／ｍｌ〜６０μｇ／ｍｌ、例えば５０μｇ／ｍｌである。
本明細書で使用される「ＰＫＡ」の用語は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１２２９７８６．１（配列番号１３７）、ＮＰ＿００１２２９７８７．１（配列番号１３８）、ＮＰ＿００１２２９７８８．１（配列番号１３９）、ＮＰ＿００１２２９７８９．１（配列番号１４０）、ＮＰ＿００１２２９７９０．１（配列番号１４１）、ＮＰ＿００１２２９７９１．１（配列番号１４２）、ＮＰ＿００２７２２．１（配列番号１４３）、ＮＰ＿８９１９９３．１（配列番号１４４）、ＮＰ＿９９７４６１．１（配列番号１４５）、ＮＰ＿００２７２１．１（配列番号１４６）、及びＮＰ＿９９７４０１．１（配列番号１４７）に示される、ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼとしても知られる、タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）を指す。
本明細書で使用される「ＰＫＡアゴニスト」の文言は、ＰＫＡのレベル及び／又は活性を高める任意の分子（例えば、小分子、ペプチド、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ）を指す。例えば、ＰＫＡタンパク質（又は少なくともその触媒ドメイン）をコードするＲＮＡ又はｃＤＮＡを使用してＰＫＡのレベル及び／又は活性を高めることができる。また、追加的に又は代替的に、ＰＫＡに結合してそれを活性化する、ＰＫＡのアゴニストはサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）であってもよい。追加的に又は代替的に、ＰＫＡのアゴニストは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の３’，５’−サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）及びピロリン酸への変換を触媒してｃＡＭＰのレベルを高める、酵素アデニル酸シクラーゼの任意の活性化剤であってもよい。本発明の幾つかの実施形態の培養培地に使用され得るＰＫＡアゴニストの非限定的な例としてフォルスコリン及びＡＩＣＡＲが挙げられる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態による培養培地に含まれるフォルスコリンの濃度は、約０．１μＭ〜２０μＭ、例えば約０．５μＭ〜約１５μＭ、例えば約１μＭ〜約１０μＭ、例えば約２μＭ〜８μＭ、例えば約４μＭ〜６μＭである。
本明細書で使用される「ＹＡＰ」又は「ＹＡＰ１」の用語は、本明細書において同じ意味で使用され、「Ｙｅｓ関連タンパク質１」を指す。本明細書で使用される「ＴＡＺ」の用語はＴａｆａｚｚｉｎを指す。
本明細書で使用される「ＹＡＰ／ＴＡＺ阻害剤」の用語は、「ＹＡＰ及び／又はＴＡＺ」の機能を阻害することができる任意の分子を指す。例として、限定されないが、約０．１μＭ〜約１０μＭの濃度で含まれ得るベルテポルフィン（ＶＰ）、約０．１μＭ〜約５μＭの濃度で含まれ得る９Ｅ１が挙げられる。
ベルテポルフィンに関する更なる情報は、Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｒ．ａｎｄ Ｈａｌｄｅｒ Ｇ．２０１４（その全体が参照により本明細書に完全に援用される、“Ｔｈｅ ｔｗｏ ｆａｃｅｓ ｏｆ Ｈｉｐｐｏ：ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｈｉｐｐｏ ｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ”．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．１３（１）：６３−７９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｄ４１６１．Ｅｐｕｂ ２０１３ Ｄｅｃ １３．Ｒｅｖｉｅｗ）から得ることができる。
１型膜貫通タンパク質のＮｏｔｃｈファミリーのメンバーは、複数の上皮細胞増殖因子様（ＥＧＦ）リピートからなる細胞外ドメイン、及び複数の異なるドメインタイプからなる細胞内ドメインを含む構造的特性を共有する。Ｎｏｔｃｈファミリーメンバーは、細胞の運命決定を制御することによって様々な発生プロセスにおいて役割を果たす。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達ネットワークは、物理的に近接する細胞間の相互作用を調節する進化的に保存された細胞内シグナル伝達経路である。ヒトでは、Ｎｏｔｃｈファミリーは、トランスゴルジネットワークにおいて切断され、ヘテロダイマーとして細胞表面に提示されるｎｏｔｃｈ１［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿０１１５１７０１９．１（配列番号１８４）］、トランスゴルジネットワークにおいて切断され、ヘテロダイマーとして細胞表面に提示されるｎｏｔｃｈ２［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０７７７１９．２アイソフォーム１（配列番号１８５）及びＮＰ＿００１１８６９３０．１アイソフォーム２（配列番号１８６）］、ｎｏｔｃｈ３［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００４２６．２（配列番号１８７）］、及びトランスゴルジネットワークにおいて切断され、ヘテロダイマーとして細胞表面に提示されるｎｏｔｃｈ４［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００４５４８．３（配列番号１８８）］を含む。
ＮＯＴＣＨシグナル伝達阻害剤として、限定されないが以下のガンマセクレターゼ阻害剤、ＤＡＰＴ（Ａｘｏｎ Ｍｅｄｃｈｅｍ １４８４−最終濃度０．０５マイクロＭ〜５０マイクロＭ）、ＬＹ２８８６７２１塩酸塩（Ａｘｏｎ Ｍｅｄｃｈｅｍ １９６４−最終濃度０．０５マイクロＭ〜５０マイクロＭ）］、ＤＢＺ（Ａｘｏｎ Ｍｅｄｃｈｅｍ−Ａｘｏｎ １４８８−最終濃度０．０５マイクロＭ〜５０マイクロＭ）が挙げられる。
ソニックヘッジホッグ経路（ＳＨＨ）タンパク質［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００１８４．１、配列番号１８９］は、初期胚のパターニング（ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ）の手段である。神経管腹側、前後四肢軸、及び体節腹側のパターニングにおいて主要な誘導シグナルとして関係があるとされている。上記タンパク質は、自己触媒的に切断される前駆体として生成され、Ｎ末端部分は可溶性であって、シグナル伝達活性を含むのに対し、Ｃ末端部分は前駆体のプロセッシングに関与する。より重要なことには、Ｃ末端産物はＮ末端産物のコレステロール部分に共有結合的に付着し、Ｎ末端産物を細胞表面に限定し、発生している胚全体に自由に拡散することを防止する。
ソニックヘッジホッグ経路（ＳＨＨ）阻害剤として、限定されないが、ＧＡＮＴ６１（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ−最終濃度０．０５マイクロＭ〜５０マイクロＭ）、ＲＵ−ＳＫＩ ４３（Ａｘｏｎ Ｍｅｄｃｈｅｍ−Ａｘｏｎ ２０３５−最終濃度０．０５マイクロＭ〜５０マイクロＭ）］が挙げられる。
本明細書で使用される「トランスフォーミング増殖因子受容体（ＴＧＦＲ）」（「ＴＧＦβＲ」としても知られる）の用語は、ＴＧＦ−βＩ型受容体ＡＬＫ５、Ｉ型アクチビン／ノーダル（ｎｏｄａｌ）受容体ＡＬＫ４、及びＩ型ノーダル受容体ＡＬＫ７を指す。
本明細書で使用される「ＴＧＦＲ阻害剤（又はＴＧＦＲｉ）」の用語は、リン酸化ＡＬＫ４、５、及び７によって特定される、ＴＧＦＲ発現及び／又は活性レベルを阻害することができる分子を指す。
ＴＧＦＲ阻害剤の非限定的な例として、ＳＢ４３１５４２、及びＡ８３−０１小分子化合物が挙げられる。
本発明の実施形態によれば、ＴＧＦＲ阻害剤は、約０．１μＭ〜３０μＭ、例えば約１μＭ〜３０μＭ、例えば５μＭ〜２５μＭ、例えば５〜１０μＭ、例えば０．１μＭ〜５μＭ、例えば０．２μＭ〜４μＭ、例えば０．５μＭ〜３μＭの濃度範囲で提供される。
ＢＭＰ（骨形成タンパク質）シグナル伝達阻害剤として、限定されないが、ＬＤＮ１９３１８９（ＡＸＯＮ１５０９−最終濃度０．０１マイクロＭ〜２０マイクロＭ、例えば０．２マイクロＭ）、Ｋ０２２８８（Ａｘｏｎ２１８９、最終濃度０．１マイクロＭ〜２０マイクロＭ）、塩酸ドルソモルフィン（ＡＸＯＮ２１５０、最終濃度０．１マイクロＭ〜２０マイクロＭ）が挙げられる。
本明細書で使用される「線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）」の用語は、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、及びＦＧＦＲ３を指す。
本明細書で使用される「ＦＧＦＲ阻害剤（又はＦＧＦＲｉ）」の用語は、リン酸化ＦＧＦＲ１、２、及び３のレベルによって特定されるＦＧＦＲ発現及び／又は活性を阻害することができる分子を指す。
ＦＧＦＲ阻害剤の非限定的な例として、ＰＤ１７３０７４、及びＳＵ５４０１が挙げられる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＦＧＦＲ阻害剤（ＦＧＦＲｉ）はＰＤ１７３０７４であり、約０．０１μＭ〜４０μＭ、例えば約０．０２μＭ〜４０μＭ、例えば約０．０５μＭ〜４０μＭ、例えば約０．１μＭ〜４０μＭ、約０．５μＭ〜４０μＭ、約１μＭ〜４０μＭ、例えば約２μＭ〜４０μＭ、例えば約５μＭ〜４０μＭ、約１０μＭ〜４０μＭ、例えば約０．０５μＭ〜５μＭ、例えば約０．１μＭ〜５μＭの濃度範囲で提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＦＧＦＲ阻害剤（ＦＧＦＲｉ）はＳＵ５４０１であり、約０．１μＭ〜４０μＭ、例えば約０．５μＭ〜４０μＭ、約１μＭ〜４０μＭ、例えば約２μＭ〜４０μＭ、約５μＭ〜４０μＭ、約１０μＭ〜４０μＭの濃度範囲で提供される。
上に記載されるように、上記培養培地は、ＥＲＫ１／２阻害剤（ＥＲＫ１／２ｉ）を含む。ＥＲＫ１／２阻害剤は、ＪＮＫ阻害剤（複数の場合がある）（ＪＮＫｉ）、ＥＲＫ５阻害剤（複数の場合がある）（ＥＲＫ５ｉ、例えばＢＩＸ０２１８９）、ＢＲＡＦ阻害剤（複数の場合がある）（ＢＲＡＦｉ、例えばＳＢ５９０８８５）、ＡＲＡＦ阻害剤（複数の場合がある）（ＡＲＡＦｉ）、ＣＲＡＦ阻害剤（複数の場合がある）（ＣＲＡＦｉ）、及びｐ３８阻害剤（複数の場合がある）（ｐ３８ｉ、例えばＢＩＲＢ７９６、ＡＸＯＮＭＥＤＣＨＥＭ−Ａｘｏｎ１３５８）も含む、ＭＡＰＫ阻害剤（複数の場合がある）のファミリーに属することに留意されたい。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の培地は、ＪＮＫ阻害剤、ＥＲＫ５阻害剤（例えば、ＢＩＸ０２１８９）、ＢＲＡＦ阻害剤（例えば、ＳＢ５９０８８５）、ＡＲＡＦｉ、ＣＲＡＦｉ、及びｐ３８阻害剤（例えば、ＢＩＲＢ７９６、ＡＸＯＮＭＥＤＣＨＥＭ−Ａｘｏｎ１３５８）からなる群から選択される阻害剤を更に含む。
本明細書で使用される「ＪＮＫ」の用語は、増殖、分化、転写調節、及び発生等の幅広い細胞プロセスに関与する、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿６２０６３７．１（アイソフォームアルファ２）（配列番号４６）、ＮＰ＿６２０６３５．１（アイソフォームベータ２）（配列番号４７）、ＮＰ＿６２０６３４．１（アイソフォームベータ１）（配列番号４８）、ＮＰ＿００２７４１．１（アイソフォームアルファ１）（配列番号４９）に示されるマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ８（ＭＡＰＫ８）タンパク質を指す。
本明細書で使用される「ＪＮＫ阻害剤」の用語は、ウェスタンブロット分析によるＪＮＫファミリーメンバータンパク質のリン酸化によって特定されるＪＮＫの活性を阻害することができる任意の分子を指す。例として、限定されないがＳＰ６００１２５（ＴＯＣＲＩＳ−カタログ番号１４９６）、及びＡＥＧ３４８２（ＡＸＯＮＭＥＤＣＨＥＭ−ＡＸＯＮ１２９１、例えば０．１μＭ〜１０μＭの濃度）が挙げられる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＳＰ６００１２５は、約０．５μＭ〜１００μＭ、例えば約１μＭ〜約１００μＭ、例えば約１μＭ〜９０μＭ、例えば約１μＭ〜８０μＭ、例えば約１μＭ〜７０μＭ、例えば約１μＭ〜６０μＭ、例えば約１μＭ〜５５μＭ、例えば約１μＭ〜５０μＭ、例えば約１μＭ〜４５μＭ、例えば約１μＭ〜４０μＭ、例えば約１μＭ〜３５μＭ、例えば約１μＭ〜３０μＭ、例えば約１μＭ〜２５μＭ、例えば約１μＭ〜２０μＭ、例えば約１μＭ〜１５μＭ、例えば約１μＭ〜１０μＭ、例えば約２μＭ〜１０μＭ、例えば約３μＭ〜１０μＭ、例えば約４μＭ〜１０μＭ、例えば約４μＭ〜６μＭ、例えば約５μＭの濃度範囲で提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＥＲＫ５阻害剤、例えばＢＩＸ０２１８９は、約０．５μＭ〜１００μＭ、例えば約１μＭ〜約１００μＭ、例えば約１μＭ〜９０μＭ、例えば約１μＭ〜８０μＭ、例えば約１μＭ〜７０μＭ、例えば約１μＭ〜６０μＭ、例えば約１μＭ〜５５μＭ、例えば約１μＭ〜５０μＭ、例えば約１μＭ〜４５μＭ、例えば約１μＭ〜４０μＭ、例えば約１μＭ〜３５μＭ、例えば約１μＭ〜３０μＭ、例えば約１μＭ〜２５μＭ、例えば約１μＭ〜２０μＭ、例えば約１μＭ〜１５μＭ、例えば約１μＭ〜１０μＭ、例えば約２μＭ〜１０μＭ、例えば約３μＭ〜１０μＭ、例えば約４μＭ〜１０μＭ、例えば約４μＭ〜６μＭ、例えば約５μＭの濃度範囲で提供される。
また、記載されるように、本発明の幾つかの実施形態の培養培地は、ＲＡＦキナーゼ阻害剤を含んでもよい。
ＲＡＦキナーゼは、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路において機能するセリン／トレオニンキナーゼである。本発明の幾つかの実施形態の培地に使用されるＲＡＦ阻害剤によって阻害されるＲＡＦキナーゼタンパク質として、ＡＲＡＦ［Ａ−Ｒａｆがん原遺伝子、セリン／トレオニンキナーゼ、アイソフォーム１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１６４５．１、配列番号１９０）、アイソフォーム２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１２４３１２５．１、配列番号１９１）、及びアイソフォーム３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１２４３１２６．１、配列番号１９２）］、ＢＲＡＦ［Ｂ−Ｒａｆがん原遺伝子、セリン／トレオニンキナーゼ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００４３２４．２（配列番号１９３）］、及びＲＡＦ１［ＣＲＡＦ、又はｃ−Ｒａｆとしても知られる、Ｒａｆ−１がん原遺伝子、セリン／トレオニンキナーゼ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２８７１．１（配列番号１９４）］が挙げられる。
ＲＡＦ阻害剤は、例えば、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ〜４．０ｍｍｏｌ／Ｌ超のＩＣ５０で野生型Ｃ−Ｒａｆを阻害する化合物である。
ＲＡＦキナーゼ阻害剤の例は、国際公開第００／０９４９５号及び第０５／０２８４４４号に開示され、その内容は参照により本明細書に援用される。
ＲＡＦキナーゼ阻害剤の例として、（４−ｔｅｒｔ−ブチル−フェニル）−４−ピリジン−４−イルメチル−イソキノリン−１−イル）−アミン、［４，７］ビイソキノリニル−１−イル−４−（ｔｅｒｔ−ブチル−フェニル）−アミン、（４−ｔｅｒｔ−ブチル−フェニル）−（４−キナゾリン−６−イル−イソキノリン−１−イル）−アミン、［４，７］ビイソキノリニル−１−イル−（２−ｔｅｒｔブチル−ピリミジン−５−イル）−アミンが挙げられる。
Ｃ−Ｒａｆに対してより特異的であるがＢ−Ｒａｆに対しても阻害活性を有する、ＲＡＦ阻害剤の非限定的な例は、ソラフェニブである。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ソラフェニブは、約０．１マイクロＭ（μＭ）〜約７０μＭ、例えば約０．１μＭ〜６０μＭ、例えば約０．１μＭ〜５０μＭ、例えば約０．５μＭ〜５０μＭ、例えば約０．５μＭ〜４５μＭ、例えば約０．５μＭ〜４０μＭ、例えば約０．１μＭ〜３５μＭ、例えば約０．５μＭ〜３０μＭ、例えば約０．５μＭ〜２５μＭ、例えば約０．５μＭ〜２０μＭ、例えば約０．５μＭ〜１５μＭ、例えば約０．５μＭ〜１０μＭ、例えば０．５μＭ〜９μＭ、例えば０．５μＭ〜８μＭ、例えば０．５μＭ〜７μＭ、例えば０．９μＭ〜６μＭ、例えば０．８μＭ〜５μＭ、例えば約５μＭ、例えば０．８μＭ〜４μＭ、例えば０．８μＭ〜３μＭ、例えば０．８μＭ〜２μＭ、例えば０．８μＭ〜１．５μＭ、例えば０．９μＭ〜１．２μＭの濃度範囲で提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＢＲＡＦｉ（例えばＳＢ５９０８８５）は、約０．１μＭ〜１００μＭ、例えば約０．１μＭ〜９０μＭ、例えば約０．１μＭ〜８０μＭ、例えば約０．１μＭ〜７０μＭ、例えば約０．１μＭ〜６０μＭ、例えば約０．１μＭ〜５０μＭ、例えば約０．１μＭ〜４０μＭ、例えば約０．１μＭ〜３０μＭ、例えば約０．１μＭ〜２０μＭ、例えば約０．１μＭ〜１０μＭ、例えば約０．１μＭ〜５μＭ、例えば約０．１μＭ〜２μＭ、例えば約０．１μＭ〜１μＭ、例えば約０．５μＭで提供される。
本明細書で使用される「ｐ３８」の用語は、「ｐ３８α（アルファ）」マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ１４（ＭＡＰＫ１４）であって、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１３０６．１（配列番号３９）によって示されるＭＡＰＫ１４アイソフォーム１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿６２０５８１．１（配列番号４０）によって示されるＭＡＰＫ１４アイソフォーム２、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿６２０５８２．１（配列番号４１）によって示されるＭＡＰＫ１４アイソフォーム３、及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿６２０５８３．１（配列番号４２）によって示されるＭＡＰＫ１４アイソフォーム４、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２７４２．３（配列番号４３）によって示される「ｐ３８β（ベータ）」（ＭＡＰＫ１１）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２９６０．２（配列番号４４）によって示される「ｐ３８γ（ガンマ）」（ＭＡＰＫ１２）、及び／又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２７４５．１（配列番号４５）によって示される「ｐ３８δ（デルタ）」（ＭＡＰＫ１３）を指し、それらの全てはキナーゼ活性を有し、シグナルトランスダクションに関与する。
本明細書で使用される「ｐ３８阻害剤」は、リン酸化ｐ３８レベルのウェスタンブロット定量によって特定されるｐ３８ファミリーメンバーの活性を阻害することができる任意の分子（例えば、小分子又はタンパク質）を指す。
ｐ３８阻害剤の非限定的な例として、ＳＢ２０３５８０（ＡＸＯＮＭＥＤＣＨＥＭ−Ａｘｏｎ１３６３）、及びＳＢ２０２１９０（ＡＸＯＮＭＥＤＣＨＥＭ−Ａｘｏｎ１３６４）、ＬＹ ２２２８８２０（ＡＸＯＮＭＥＤＣＨＥＭ−Ａｘｏｎ１８９５）、ＢＩＲＢ７９６（Ａｘｏｎ Ｍｅｄｃｈｅｍ１３５８）、及びＰＤ１６９３１６（ＡＸＯＮＭＥＤＣＨＥＭ−Ａｘｏｎ１３６５、例えば約０．１μＭ〜約１０μＭの濃度）が挙げられる。
また、ＢＭＰシグナル伝達はｐ３８シグナル伝達の活性化剤であることから、ｐ３８の阻害剤の例として、ドルソモルフィン（ＡＸＯＮＭＥＤＣＨＥＭ−Ａｘｏｎ２１５０）、及びＬＤＮ１９３１８９（ＡＸＯＮ ＭＥＤＣＨＥＭ ＡＸＯＮ１５０９）のようなＢＭＰ阻害剤が挙げられ、又は組換えＮＯＧＧＩＮタンパク質［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００５４４１．１（配列番号１１８）］等のＢＭＰ経路の他の阻害剤を使用してＢＭＰシグナル伝達の小分子阻害剤を置き換えることができる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＳＢ２０３５８０は、約０．５μＭ〜７０μＭの濃度範囲、例えば約１μＭ〜約７０μＭ、例えば約１μＭ〜６０μＭ、例えば約１μＭ〜５５μＭ、例えば約１μＭ〜５０μＭ、例えば約１μＭ〜４５μＭ、例えば約１μＭ〜４０μＭ、例えば約１μＭ〜３５μＭ、例えば約１μＭ〜３０μＭ、例えば約１μＭ〜２５μＭ、例えば約１μＭ〜２０μＭ、例えば約１μＭ〜１５μＭ、例えば約１μＭ〜１０μＭ、例えば約２μＭ〜１０μＭ、例えば約３μＭ〜１０μＭ、例えば約４μＭ〜１０μＭ、例えば約４μＭ〜６μＭ、例えば約５μＭ、例えば約１０μＭで提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＳＢ２０２１９０は、約０．１μＭ〜約５０μＭの濃度範囲、例えば約０．５μＭ〜約５０μＭ、例えば約１μＭ〜約５０μＭ、例えば約１μＭ〜４５μＭ、例えば約１μＭ〜４０μＭ、例えば約１μＭ〜３５μＭ、例えば約１μＭ〜３０μＭ、例えば約１μＭ〜２５μＭ、例えば約１μＭ〜２０μＭ、例えば約１μＭ〜１５μＭ、例えば約１μＭ〜１０μＭ、例えば約１μＭ〜９μＭ、例えば約１μＭ〜８μＭ、例えば約１μＭ〜７μＭ、例えば約２μＭ〜７μＭ、例えば約３μＭ〜７μＭ、例えば約４μＭ〜７μＭ、例えば約４μＭ〜６μＭ、例えば約５μＭで提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＢＩＲＢ７９６は、約０．０５μＭ〜約３０μＭの濃度範囲、例えば約０．１μＭ〜約３０μＭ、例えば約０．２μＭ〜３０μＭ、例えば約０．２μＭ〜２５μＭ、例えば約０．２μＭ〜２０μＭ、例えば約０．２μＭ〜１５μＭ、例えば約０．２μＭ〜１０μＭ、例えば約０．２μＭ〜８μＭ、例えば約０．２μＭ〜６μＭ、例えば約０．５μＭ〜６μＭ、例えば約０．５μＭ〜５μＭ、例えば約０．５μＭ〜４μＭ、例えば約０．５μＭ〜３μＭ、例えば約０．５μＭ〜２μＭ、例えば約１μＭ〜３μＭ、例えば約１μＭ〜２．５μＭ、例えば約２μＭ、例えば約０．１μＭ、例えば約１μＭで提供される。
本明細書で使用される「ＬＳＤ１」の用語は、幾つかのヒストン脱アセチル化酵素複合体の構成成分である、リジン（Ｋ）特異的脱メチル化酵素１Ａ（遺伝子ＩＤ ＫＤＭ１Ａ）核タンパク質を指す。該タンパク質はＳＷＩＲＭドメイン、ＦＡＤ結合モチーフ、及びアミンオキシダーゼドメインを含み、ヒストン脱メチル化酵素として機能することによって遺伝子サイレンシングを行う。
ＬＳＤ１阻害剤の非限定的な例として、限定されないが、約０．１μＭ〜約１０μＭ、例えば約５μＭの濃度のトラニルシプロミン（ＴＣＰ）が挙げられる。
ＰＩ３Ｋブースターの例として、例えば、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１、例えば最終濃度０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲）、インスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦＩＩ、例えば最終濃度０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲）、幹細胞因子（ＳＣＦ、例えば０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲）、及びＦＧＦ２が挙げられる。
「インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）」の用語は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１１１１２８３．１（配列番号１６３）、ＮＭ＿００１１１１２８４．１（配列番号１６５）、ＮＭ＿００１１１１２８５．１（配列番号１６７）、及びＮＭ＿０００６１８．３（配列番号１６１）によってそれぞれコードされる、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１１０４７５３．１（配列番号１６２）、ＮＰ＿００１１０４７５４．１（配列番号１６４）、ＮＰ＿００１１０４７５５．１（配列番号１６６）、及びＮＰ＿０００６０９．１（配列番号１６０）によって示される、インスリン様増殖因子のアイソフォーム１〜アイソフォーム４のいずれかを指す。
「インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ２）」の用語は、インスリン様増殖因子ＩＩのアイソフォーム１（バリアント１、２、４、及び５によってコードされる）、及びアイソフォーム２（バリアント３によってコードされる）を指す。バリアント１は、最も優位な転写産物［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００６１２．５（配列番号１６９）及びＮＰ＿０００６０３．１（配列番号１６８）］を表す。バリアント２は、２つの選択的５’コーディングエクソンを含み、したがって、バリアント１と比較して異なる５’ＵＴＲを有する［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１００７１３９．５（配列番号１７１）、及びＮＰ＿００１００７１４０．２（配列番号１７０）］。バリアント３は、バリアント１と比較して、５’末端の２つの選択的エクソン、すなわち１つの非コーディングエクソン及び別のコーディングエクソンを含む。これは、アイソフォーム１と比較して明確に異なるＮ末端を有する、上流ＡＵＧ（バリアント１及びバリアント２では見られない）及びより長いアイソフォーム（２）の使用をもたらす［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１１２７５９８．２（配列番号１７３）、及びＮＰ＿００１１２１０７０．１（配列番号１７２）］。バリアント（４）は、バリアント１と比較して５’ＵＴＲエクソンにおいて異なる［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１２９１８６１．２（配列番号１７５）、及びＮＰ＿００１２７８７９０．１（配列番号１７４）］。このバリアント（５）は、バリアント１と比較して５’ＵＴＲエクソンにおいて異なる［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１２９１８６２．２（配列番号１７７）、及びＮＰ＿００１２７８７９１．１（配列番号１７６）］。
本明細書において同じ意味で使用される「幹細胞因子」又は「ＳＣＦ」の用語は、ＫＩＴ遺伝子座によってコードされるチロシンキナーゼ受容体のリガンド（「ＫＩＴリガンド」又は「ＫＩＴＬＧ」としても知られる）を指し、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００８９９．４（配列番号１５７）によってコードされる、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００８９０．１（配列番号１５６）に示されるキットリガンドアイソフォームｂ前駆体、及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３９９４．５（配列番号１５９）によってコードされる、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００３９８５．２（配列番号１５８）に示されるキットリガンドアイソフォームａ前駆体を指す。
特定の実施形態によれば、ＰＩ３ＫブースターはＦＧＦ２である。
本明細書において同じ意味で使用される「塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）」又は「ＦＧＦ２」の用語は、ヘパリンに結合し、幅広い分裂促進活性及び血管新生活性を持つ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーのポリペプチドを指す。ＢＦＧＦ遺伝子のｍＲＮＡは、複数のポリアデニル化部位を含み、非ＡＵＧ（ＣＵＧ）及びＡＵＧ開始コドンから選択的に翻訳されて、明確に異なる特性を有する５個の異なったアイソフォームを生じる。ＣＵＧ開始アイソフォームは核に局在し、細胞内分泌効果を担う一方、ＡＵＧ開始形態は大半が細胞質にあり、このＦＧＦの傍分泌及び自己分泌を担う。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の培地によって使用されるｂＦＧＦは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１９９７（配列番号２９）に提示される。ＢＦＧＦは、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ＲｎＤ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ等の様々な製造元から得ることができる。本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の培地によって使用されるｂＦＧＦは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号２３３−ＦＢ）より提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ｂＦＧＦは、１ミリリットル当たり約０．５ナノグラム（ｎｇ／ｍｌ）〜約５００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲、例えば約１ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ、例えば約１ｎｇ／ｍｌ〜４００ｎｇ／ｍｌ、例えば約１ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌ、例えば約１ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌ、例えば約１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、例えば約１ｎｇ／ｍｌ〜８０ｎｇ／ｍｌ、例えば約１ｎｇ／ｍｌ〜７０ｎｇ／ｍｌ、例えば約１ｎｇ／ｍｌ〜７０ｎｇ／ｍｌ、例えば約１ｎｇ／ｍｌ〜６０ｎｇ／ｍｌ、例えば約１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、例えば約１ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌ、例えば約１ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌ、例えば約１ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、例えば約２ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、例えば約２ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、例えば約３ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、例えば約４ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、例えば約８ｎｇ／ｍｌで提供される。
本明細書で使用される「ＳＭＡＤ」の用語は、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達に応答して膜貫通セリン／トレオニン受容体キナーゼによってリン酸化及び活性化されるタンパク質のファミリーを指す。可能性のあるＳＭＡＤ活性化剤は、ＴＧＦβサイトカインであることに留意されたい。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＳＭＡＤ活性化剤は、アクチビンＡ、ＴＧＦβ１、及び骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）からなる群から選択される。
トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）インデューサーとして、例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、及びアクチビンが挙げられる。
特定の実施形態によれば、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）インデューサーはＴＧＦβ１である。
本明細書で使用される「ＴＧＦβ１」の文言は、トランスフォーミング増殖因子ベータのアイソフォームベータ−１（β１）（例えば、ホモサピエンスＴＧＦβ１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００６６０．５、配列番号３１に示される配列によってコードされる、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００６５１、配列番号２８）を指す。ＴＧＦβは、形質転換の誘導において作用し、また陰性自己分泌増殖因子としても作用する。ＴＧＦβ１アイソフォームは、米国ミネソタ州ミネアポリスのＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ等の様々な化学物質供給元から得ることができる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＴＧＦβ１は、１ミリリットル当たり約０．１ナノグラム（ｎｇ／ｍｌ）〜約５００ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．１ｎｇ／ｍｌ〜４００ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．１ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．１ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．１ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．１ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、例えば約１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．１ｎｇ／ｍｌ〜８ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．１ｎｇ／ｍｌ〜７ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．１ｎｇ／ｍｌ〜６ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．１ｎｇ／ｍｌ〜５ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．１ｎｇ／ｍｌ〜４ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．１ｎｇ／ｍｌ〜３ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．１ｎｇ／ｍｌ〜２ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．５ｎｇ／ｍｌ〜２ｎｇ／ｍｌ、例えば約０．５ｎｇ／ｍｌ〜１．５ｎｇ／ｍｌ、例えば約１ｎｇ／ｍｌで提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、アクチビンＡ（インヒビンベータＡ、ＩＮＨＢＡ、遺伝子ＩＤ３６２４、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２１８３．１、配列番号１１７をコードする、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２１９２．２（配列番号１２３））を含むＴＧＦ／アクチビン経路の活性化剤を使用してＴＧＦβ１を置き換えることができる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＴＧＦβ１サイトカインを組換えノーダル／及び／又はアクチビン、及び／又はトランスフォーミング増殖因子ベータ２（ＴＧＦβ２）及び／又はＧＤＦ３及び／又はＧＤＦ−９で置き換えることができる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の培養培地中のアクチビンＡの濃度は約１ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌ、例えば約２０ｎｇ／ｍｌである。
本明細書で使用される「ＢＭＰ４」の用語は、トランスフォーミング増殖因子ベータスーパーファミリーの一部である、骨形成タンパク質ファミリーのメンバーを指す［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１１９３．２（配列番号１４８）］。上記スーパーファミリーは、増殖因子及び分化因子の大きなファミリーを含む。ＢＭＰ４はヒトにおいて軟骨内の骨形成の開始に重要な役割を果たし、発現の減少は様々な骨疾患と関連している。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地中のＢＭＰ４タンパク質の濃度は、約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約２０ｎｇ／ｍｌ、例えば約５ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌである。
本明細書で使用される「ＤＯＴ１Ｌ」［ＤＯＴ１様ヒストンＨ３Ｋ７９メチルトランスフェラーゼ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿１１５８７１．１（配列番号１４９）］の用語は、ヒストンＨ３のリジン７９をメチル化するメチルトランスフェラーゼを指す。ＤＯＴ１Ｌは遊離コアヒストンに対して不活性であるが、ヌクレオソームに対して著しいヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を示す。
ＤＯＴ１Ｌ阻害剤の非限定的な例として、限定されないがＳＧＣ０９４６が挙げられる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地中のＳＧＣ０９４６の濃度は、約０．０５μＭ〜約１０μＭ、例えば約０．１μＭ〜約１０μＭ、例えば約１μＭ、例えば約２μＭ、例えば約５μＭである。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培地はＧ９ａ［「ＥＨＭＴ２真性染色質ヒストン−リジン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ２」としても知られる、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１２７６３４２．１（アイソフォームａ、配列番号１９７）、ＮＰ＿０７９５３２．５（アイソフォームｂ、配列番号１９８）、ＮＰ＿００１２７６３４２．１（アイソフォームｃ、配列番号１９９）］及び／又はＧｌｐ（「ＥＨＭＴ１真性染色質ヒストン−リジン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ１」としても知られるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０７９０３３．４（アイソフォーム１、配列番号２００）及びＮＰ＿００１１３８９９９．１（アイソフォーム２、配列番号２０１）］の阻害剤を更に含み、これらは、Ｈ３Ｋ９ｍｅ２［ヒストンＨ３上のＬｙｓ（Ｋ）９のジメチル化（ｍｅ２）］の一部を形成する（各々がその全体において参照により本明細書に完全に援用される、Ｋｕｂｉｃｅｋ Ｓ１，Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ ＲＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｖｅｒｓａｌ ｏｆ Ｈ３Ｋ９ｍｅ２ ｂｙ ａ ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｇ９ａ ｈｉｓｔｏｎｅ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２００７，２５（３）：４７３−８１、及びＶｅｄａｄｉ Ｍ１，Ｂａｒｓｙｔｅ−Ｌｏｖｅｊｏｙ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｂｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｇ９ａ ａｎｄ ＧＬＰ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１１，７（８）：５６６−７４）。タンパク質リジンメチルトランスフェラーゼＧ９ａ及びＧＬＰは、非ヒストン標的のジメチル化と同様、ヒストンＨ３上のＬｙｓ９の脱メチル化（Ｈ３Ｋ９ｍｅ２）を介して様々な遺伝子の転写抑制を調節する。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記阻害剤はＧ９ａヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴａｓｅ）活性及び／又はＨ３Ｋ９ｍｅ２のｉｎ ｖｉｔｒｏでの生成を選択的に損なうことができる。
本明細書の幾つかの実施形態の培養培地に使用され得るＧ９ａ及び／又はＧｌｐの阻害剤の非限定的な例として、例えば、Ｇ９ａ及び／又はＧＬＰのＲＮＡ又はタンパク質生成物のレベルをノックダウンするｓｉＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡが挙げられる。
本発明の幾つかの実施形態の培養培地に使用され得るＧ９ａ及び／又はＧｌｐの阻害剤の非限定的な例として、例えばＧ９ａ及び／又はＧｌｐの活性を特異的に阻害する、及び／又はＨ３Ｋ９ｍｅ２の生成を阻止する若しくは損なう小分子が挙げられる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、Ｇ９ａ及び／又はＧｌｐを阻害する、及び／又はＨ３Ｋ９ｍｅ２の生成を阻止する若しくは損なう小分子はＢＩＸ−０１２９４（ジアゼピン−キナゾリン−アミン誘導体）及び／又はＵＮＣ０６３８である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、Ｇ９ａ及び／又はＧｌｐを阻害する、及び／又はＨ３Ｋ９ｍｅ２の生成を阻止する若しくは損なう小分子はＢＩＸ−０１２９４（以下「ＢＩＸ０１２９４」とも呼ぶ）である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地中のＢＩＸ０１２９４の濃度は、約０．０５マイクロＭ〜約５マイクロＭ、例えば０．０５マイクロＭ（μＭ）〜約４μＭ、例えば約０．０８μＭ〜３μＭ、例えば約０．１μＭ〜３μＭ、例えば約０．１μＭ〜２μＭ、例えば約０．１μＭ〜１μＭ、例えば約０．２μＭ〜１μＭ、例えば約０．３μＭ〜１μＭ、例えば約０．４μＭ〜１μＭ、例えば約０．４μＭ〜０．８μＭ、例えば約０．４μＭ〜０．６μＭ、例えば約０．５μＭ〜０．６μＭ、例えば約０．５マイクロＭである。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地中のＢＩＸ０１２９４の濃度は約０．０５μＭ〜約５マイクロＭである。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地中のＵＮＣ０６３８の濃度は、約０．０１μＭ〜約５マイクロＭ、例えば０．０２μＭ〜５μＭ、例えば０．０４〜５μＭ、例えば０．０６μＭ〜５μＭ、例えば０．０５マイクロＭ（μＭ）〜約４μＭ、例えば約０．０８μＭ〜３μＭ、例えば約０．０８μＭ〜２μＭ、例えば約０．０８μＭ〜１μＭ、例えば約０．０８μＭ〜０．５μＭ、例えば約０．１μＭ〜１μＭ、例えば約０．１μＭ〜０．８μＭ、例えば約０．１μＭ〜０．６μＭ、例えば約０．１μＭ〜０．４μＭ、例えば約０．１μＭ〜０．３μＭ、例えば約０．１μＭ〜０．２μＭ、例えば約０．１マイクロＭである。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培地は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦβ１）、アクチビンＡ、ＧＳＫ３ｂ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、Ｐ３８阻害剤、ＪＮＫ阻害剤、ＮＯＴＣＨ阻害剤、ＳＲＣ阻害剤、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）、インスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦＩＩ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達阻害剤、ソニックヘッジホッグ経路（ＳＨＨ）阻害剤、ＥＲＫ５阻害剤、フォルスコリン、ケンパウロン、ＢａｙＫ８６４４、Ｇ９ａ及び／又はＧｌｐ阻害剤（例えば、ＢＩＸ０１２９４又はＵＮＣ０６３８）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＹＡＰ／ＴＡＺ阻害剤、Ｌ−アスコルビン酸、ＬＳＤ１阻害剤、及びＤＯＴ１Ｌ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地中のＢａｙＫ８６４４の濃度は約０．５μＭ〜約１０μＭである。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培地は、トランスフォーミング増殖因子受容体（ＴＧＦＲ）阻害剤、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）阻害剤、アクチビンＡ、ＧＳＫ３ｂ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、Ｐ３８阻害剤、ＪＮＫ阻害剤、ＮＯＴＣＨ阻害剤、ＳＲＣ阻害剤、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）、インスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦＩＩ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達阻害剤、ソニックヘッジホッグ経路（ＳＨＨ）阻害剤、ＥＲＫ５阻害剤、フォルスコリン、ケンパウロン、ＢａｙＫ８６４４、Ｇ９ａ及び／又はＧｌｐ阻害剤（例えば、ＢＩＸ０１２９４又はＵＮＣ０６３８）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＹＡＰ／ＴＡＺ阻害剤、Ｌ−アスコルビン酸、ＬＳＤ１阻害剤、及びＤＯＴ１Ｌ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培地は、アクチビンＡ、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦβ１）、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）、ＧＳＫ３ｂ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、Ｐ３８阻害剤、ＪＮＫ阻害剤、ＮＯＴＣＨ阻害剤、ＳＲＣ阻害剤、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）、インスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦＩＩ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達阻害剤、ソニックヘッジホッグ経路（ＳＨＨ）阻害剤、ＥＲＫ５阻害剤、フォルスコリン、ケンパウロン、ＢａｙＫ８６４４、Ｇ９ａ及び／又はＧｌｐ阻害剤（例えば、ＢＩＸ０１２９４又はＵＮＣ０６３８）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＹＡＰ／ＴＡＺ阻害剤、Ｌ−アスコルビン酸、ＬＳＤ１阻害剤、及びＤＯＴ１Ｌ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培地は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子受容体（ＴＧＦＲ）阻害剤、ＧＳＫ３ｂ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、Ｐ３８阻害剤、ＪＮＫ阻害剤、ＮＯＴＣＨ阻害剤、ＳＲＣ阻害剤、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）、インスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦＩＩ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達阻害剤、ソニックヘッジホッグ経路（ＳＨＨ）阻害剤、ＥＲＫ５阻害剤、フォルスコリン、ケンパウロン、ＢａｙＫ８６４４、Ｇ９ａ及び／又はＧｌｐ阻害剤（例えば、ＢＩＸ０１２９４又はＵＮＣ０６３８）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＹＡＰ／ＴＡＺ阻害剤、Ｌ−アスコルビン酸、ＬＳＤ１阻害剤、及びＤＯＴ１Ｌ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の培養培地は、以下の実施例の欄の実施例５に記載される培養培地のいずれかである（例えば、培養培地４１〜１３１）。
追加的に又は代替的に、以下の図１〜図２及び実施例の欄の実施例１〜実施例４は、ＯＣＴ４−ＧＦＰ＋（陽性）細胞の発現によって証明される「無感作状態」に無感作ＰＳＣを維持するため使用され得る追加の条件を実証する。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＳＲＣ阻害剤とを含む培養培地が提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の培養培地はＡＸＩＮ複合安定化剤（ＡＸＩＮｓ）を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の培養培地はＧＳＫ３β阻害剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の培養培地はｐ３８阻害剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、ｐ３８阻害剤と、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＳＲＣ阻害剤、及びＡＸＩＮ複合安定化剤（ＡＸＩＮｓ）からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤とを含む培養培地が提供される。
本発明のこの態様の培地は、Ｓｒｃファミリーキナーゼ阻害剤を含みＡＸＩＮ複合安定化剤を含まなくてもよい。代替的には、本発明のこの態様の培地は、ＡＸＩＮ複合安定化剤を含んで、Ｓｒｃファミリーキナーゼ阻害剤を含まなくてもよい。更に代替的には、本発明のこの態様の培地は、Ｓｒｃファミリーキナーゼ阻害剤とＡＸＩＮ複合安定化剤とを含んでもよい。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、本発明の幾つかの実施形態の培地は、化学的に明確であり、異物を含まない（動物汚染物質を含まない、又は非ヒト汚染物質を含まない）。
上記培養培地のＳＲＣｉ及び／又はＡＸＩＮ小分子化合物による補足は、動物成分（ＡＬＢＵＭＡＸ１、ＡＬＢＵＭＡＸ２、ノックアウト血清代替物−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含まない培地でのヒト無感作多能性細胞の拡大を可能とし、Ｂ２７（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ製の規定された異物を含まないＢ２７補足物）のような規定される補足物の仕様のみに頼ることができる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地はＲＯＣＫ阻害剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地はＪＮＫ阻害剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、培地５００ｍｌ当たり約５ｍｌの規定された脂質濃縮物、ＬＩＦ（約２０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（約８ｎｇ／ｍｌ）、ＴＧＦｂ１（約１ｎｇ／ｍｌ）、ＥＲＫ１／２ｉ（約１μＭのＰＤ０３２５９０１）、ＧＳＫ３βｉ（ＣＨＩＲ９９０２１、約３μＭ）、ｐ３８ｉ（ＳＢ２０３５８０、約５μＭ）、及びＪＮＫｉ（ＳＰ６００１２５、約５μＭ〜１０μＭ）を含むＮ２補足物（例えば、培養培地５００ｍｌ当たり約５ｍｌのＮ２）を含む、ＫＯ−ＤＭＥＭを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、約１％〜２％のＡｌｂｕｍａｘ（登録商標）ＩＩ、ＬＩＦ（約２０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（約８ｎｇ／ｍｌ）、ＴＧＦβ１（約１ｎｇ／ｍｌ）、ＥＲＫ１／２ｉ（約１μＭのＰＤ０３２５９０１）、ＧＳＫ３ｂｉ（ＣＨＩＲ９９０２１、約３μＭ）、ｐ３８ｉ（ＳＢ２０３５８０、約５μＭ）、及びＪＮＫｉ（ＳＰ６００１２５、５μＭ〜約１０μＭ）を含むＮ２補足物（例えば、培養培地５００ｍｌ当たり約５ｍｌのＮ２）を含む、ＫＯ−ＤＭＥＭを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、約１５％のノックアウトＳＲ（Ｇｉｂｃｏ）、ＬＩＦ（約２０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（約８ｎｇ／ｍｌ）、ＴＧＦβ１（約１ｎｇ／ｍｌ）、ＥＲＫ１／２ｉ（約１μＭのＰＤ０３２５９０１）、ＧＳＫ３ｂｉ（ＣＨＩＲ９９０２１、約３μＭ）、ｐ３８ｉ（ＳＢ２０３５８０、約５μＭ）、及びＪＮＫｉ（ＳＰ６００１２５、約５μＭ〜１０μＭ）を含むＮ２補足物（例えば、培養培地５００ｍｌ当たり約５ｍｌのＮ２）を含む、ＫＯ−ＤＭＥＭを含む。
また、或る一つの実施形態では、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、ｐ３８阻害剤と、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＳＲＣ阻害剤及びＡＸＩＮ複合安定化剤（ＡＸＩＮｓ）からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤とを含む培地は、ＲＯＣＫ阻害剤を含んでもよい。
また、別の実施形態では、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、ｐ３８阻害剤と、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＳＲＣ阻害剤及びＡＸＩＮ複合安定化剤（ＡＸＩＮｓ）からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤とを含む培地は、ＲＯＣＫ阻害剤を含んでもよく、また任意にＲＯＣＫ阻害剤はＪＮＫ阻害剤を含んでもよい。
本明細書に記載される培養培地は、追加のシグナル伝達最適化成分を含んでもよい。かかる最適化成分は、ＰＩ３Ｋブースター、ＴＧＦサイトカイン（又はインデューサー）、形態形成制御遺伝子（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅ）阻害剤、及びＦＧＦ受容体阻害剤を含んでもよい。
形態形成制御遺伝子阻害剤の例として、ＮＯＴＣＨ阻害剤、ＳＨＨ阻害剤、及びＴＧＦβ受容体阻害剤が挙げられる。
本発明によって考慮される最適化剤の特定の組合せとして、以下の薬剤、ｂＦＧＦ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦＲ阻害剤、及びＦＧＦ受容体阻害剤の少なくとも１つが挙げられる。
特定の実施形態によれば、形態形成制御遺伝子阻害剤はＴＧＦβ受容体阻害剤である。
本発明によって考慮される最適化剤の他の組合せとして、以下の薬剤、ｂＦＧＦ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦＲ阻害剤、及びＦＧＦ受容体阻害剤の少なくとも２つが挙げられる。
特定の実施形態では、本発明の培地はタンパク質キナーゼＣ阻害剤及び／又はＢＭＰ阻害剤を含んでもよい。
別の実施形態では、本発明の培地はタンパク質キナーゼＣ阻害剤及び／又はＢＭＰ阻害剤を含まない。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）、インスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦＩＩ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達阻害剤、ソニックヘッジホッグ経路（ＳＨＨ）阻害剤、ＥＲＫ５阻害剤、フォルスコリン、ケンパウロン、ＢａｙＫ８６４４、Ｇ９ａ及び／又はＧｌｐ阻害剤（例えば、ＢＩＸ０１２９４又はＵＮＣ０６３８）、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）からなる群から選択される少なくとも１つの追加の薬剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）、インスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦＩＩ）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）シグナル伝達阻害剤、ソニックヘッジホッグ経路（ＳＨＨ）阻害剤、ＥＲＫ５阻害剤、フォルスコリン、ケンパウロン、ＢａｙＫ８６４４、Ｇ９ａ及び／又はＧｌｐ阻害剤（例えば、ＢＩＸ０１２９４又はＵＮＣ０６３８）、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）からなる群から選択される少なくとも１つの追加の薬剤を更に含む。
本発明によって意図される例示的な培地として以下が挙げられる。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ｂＦＧＦと、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ｂＦＧＦと、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＢＭＰ阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ｂＦＧＦと、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ｂＦＧＦと、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＢＭＰ阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ｂＦＧＦと、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ｂＦＧＦと、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＢＭＰ阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ｂＦＧＦと、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ｂＦＧＦと、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＢＭＰ阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＢＭＰ阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＲＡＦ阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＲＡＦ阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＲＡＦ阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤を含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＲＡＦ阻害剤と、ｂＦＧＦと、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤と、ＢＭＰ阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＦＧＦ２と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＦＧＦ２と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＢＭＰ阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＦＧＦ２と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＦＧＦ２と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤と、ＢＭＰ阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＢＭＰ阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤と、ＢＭＰ阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＢＭＰ阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤と、ＢＭＰ阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＢＭＰ阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＰＫＣ阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＰＫＣ阻害剤と、ＢＭＰ阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＦＧＦ受容体阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＦＧＦ受容体阻害剤と、ＢＭＰ阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＦＧＦ受容体阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＦＧＦ受容体阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤と、ＢＭＰ阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＦＧＦ受容体阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＦＧＦ受容体阻害剤と、ＢＭＰ阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＦＧＦ受容体阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＦＧＦ受容体阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤と、ＢＭＰ阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、Ｓｒｃファミリーキナーゼ阻害剤と、ＴＧＦ受容体阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、Ｓｒｃファミリーキナーゼ阻害剤と、ＴＧＦ受容体阻害剤と、ＢＭＰ阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、Ｓｒｃファミリーキナーゼ阻害剤と、ＴＧＦ受容体阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤とを含む培地。
ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、Ｓｒｃファミリーキナーゼ阻害剤と、ＴＧＦ受容体阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤と、ＢＭＰ阻害剤とを含む培地。
別の意図される培養培地は、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＳＴＡＴ３活性化剤と、トランスフォーミング増殖因子ベータ受容体（ＴＧＦβＲ）阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤と、ｐ３８阻害剤と、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）とを含むものである。
また、この培地は、ＢＭＰ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＲＣ阻害剤、及びＡＸＩＮ複合安定化剤（ＡＸＩＮｓ）からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は４つの薬剤を含んでもよい。
本発明の幾つかの実施形態により使用され得る培養培地の非限定的な例は、以下の実施例の欄の実施例１に記載される（例えば、培養培地１〜４０）。
本発明の幾つかの実施形態の培養培地に使用されるタンパク質性因子（例えば、ＬＩＦ、ＩＬ６、ＴＧＦβ１、又はｂＦＧＦ）はいずれも、組換えで発現され得る、又は生化学的に合成され得る。さらに、ｂＦＧＦ及びＴＧＦβ等の天然起源のタンパク質性因子を生物学的試料から（例えば、ヒト血清、細胞培養物から）当該技術分野でよく知られている方法を使用して精製することができる。
本発明のタンパク質性因子（例えば、ＬＩＦ、ＩＬ６、ＴＧＦβ１、又はｂＦＧＦ）の生化学合成は、標準的な固相技術を使用して行われ得る。これらの方法は、排他的固相合成、部分的固相合成法、フラグメント縮合、及び古典的溶液合成を含む。
本発明のタンパク質性因子（例えば、ＬＩＦ、ＩＬ６、ＴＧＦβ１、又はｂＦＧＦ）の組換え発現は、Ｂｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４、Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０−８９、Ｂｒｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１０：５１１−５１４、Ｔａｋａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：３０７−３１１、Ｃｏｒｕｚｚｉ ｅｔ ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：１６７１−１６８０、Ｂｒｏｇｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：８３８−８４３、Ｇｕｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：５５９−５６５、及びＷｅｉｓｓｂａｃｈ＆Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，１９８８，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｓｅｃｔｉｏｎ ＶＩＩＩ，ｐｐ４２１−４６３によって記載されるような組換え技術を使用して生成され得る。
例えば、ＬＩＦ、ＩＬ６、ＴＧＦβ１、又はｂＦＧＦを生成するため、ＬＩＦ、ＩＬ６、ＴＧＦβ１、又はｂＦＧＦをコードするポリヌクレオチド［例えば、配列番号３０（ＬＩＦ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１２５７１３５）、配列番号３１（ＴＧＦβ１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００６６０）、配列番号３２（ＢＦＧＦ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２００６）、配列番号１１１（ＩＬ６、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００６００．３）］を、好ましくは宿主細胞［すなわち、選択したポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えばＬＩＦ、ＩＬ６、ＴＧＦβ１、又はｂＦＧＦ）が発現される細胞］における発現に適した核酸コンストラクトに結合する。天然由来のＬＩＦ、ＩＬ６、ＴＧＦβ１、又はｂＦＧＦと同様の量及びパターンのグリコシル化を伴うＬＩＦ、ＩＬ６、ＴＧＦβ１、又はｂＦＧＦを生成するため、採用される宿主細胞は真核生物宿主細胞であることが好ましく、ヒト細胞又はＣＨＯ細胞等）の哺乳動物宿主細胞であることがより好ましい。目的のポリペプチド（例えば、上に記載されるタンパク質性因子）を産生するため使用され得る核酸コンストラクト（又は発現ベクター）の更なる説明は、以下に提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地はＭＢＤ３阻害剤を更に含む。
本明細書で使用される「ＭＢＤ３」の用語は、コリプレッサー（ｃｏ−ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）及びクロマチンリモデリング機能活性を有する、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００３９１７．１（配列番号７）に示されるメチル−ＣｐＧ−結合ドメイン３タンパク質を指す。
本明細書で使用される「ＭＢＤ３阻害剤」の用語は、ＭＢＤ３の発現レベル及び／又は活性を下方制御することができる、及び／又はＭＢＤ３とＯＣＴ４との及び／又はＭＢＤ３とＳＯＸ２との、及び／又はＭＢＤ３とＫＬＦ４との、及び／又はＭＢＤ３とＣ−Ｍｙｃとの相互作用を干渉することができる、及び／又はＭＢＤ３のヌクレオソームリモデリングデアセチラーゼ（ＮｕＲＤ）への結合を阻害する、任意の薬剤（例えば分子）を指す。ＭＢＤ３の下方制御は、転写及び／又は翻訳を干渉する様々な分子［例えば、ＲＮＡサイレンシング剤（例えば、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）、リボザイム、及びＤＮＡザイム］を使用して遺伝子レベル及び／又は転写産物レベルに、又は例えば抗体（例えば、中和抗体）、アンタゴニスト、例えばＭＢＤ３と活性若しくは能力を阻害していずれかのリプログラミング因子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、又はｃ−Ｍｙｃ）と直接相互作用する小分子、ペプチドを切断する酵素等を使用してタンパク質レベルに影響を及ぼし得る。
ＭＢＤ３阻害剤の非限定的な例として、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより提供されるｍＢＤ３ＨＳＳ１４７５８１（３＿ＲＮＡＩ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）：ＡＧＧＵＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＣＣＣＧＡＣＣＵＧＡＡ（配列番号５２）、及びＭＢＤ３ＨＳＳ１４７５８１（３＿ＲＮＡＩ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）：ＵＵＣＡＧＧＵＣＧＧＧＣＵＵＧＣＣＣＵＵＧＡＣＣＵ（配列番号５３）、ＭＢＤ３ ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡが挙げられる。使用可能なＭＢＤ３ ｍＲＮＡに対する別の好適なｓｉＲＮＡは、ヒト細胞においてＭＢＤ３のノックダウンに効率的であることがわかった、ＨＳＳ１４７５８０成分及びＨＳＳ１４７５８１成分（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）、カタログ番号１２９９００１）を含む商業的に入手可能なＭＢＤ３である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、Ｍｂｄ３のＮｕＲＤ複合体への結合の阻害は、クロモドメインヘリカーゼＤＮＡ結合タンパク質４（ＣＨＤ４）阻害剤を使用して行われる。
ＣＨＤ４阻害剤の非限定的な例として、ヒト細胞において効率的にＣＨＤ４をノックダウンすることがわかったＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）から入手可能なＣＨＤ４ Ｓｔｅａｌｔｈ ｓｉＲＮＡ ＨＳＳ１０１８５０等のヒトＣＨＤ４ ｓｉＲＮＡが挙げられる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、Ｍｂｄ３のＮｕＲＤ複合体への結合の阻害は、Ｐ６６アルファコイルドコイルドメイン（Ｐ６６α−ＣＣ）を使用して行われる。
Ｐ６６α−ＣＣ（配列番号１１４）のペプチドを、そのまま上記培地に添加することもでき、又はＰ６６α−ＣＣ配列をコードするベクター（例えば、配列番号１１３に示されるヌクレオチド配列を含むベクター）から組換えで発現させることもできる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、Ｍｂｄ３のＮｕＲＤ複合体への結合は、２Ａ含有ＧＡＴＡジンクフィンガードメイン（ＧＡＴＡＤ２Ａ）タンパク質［「転写リプレッサーｐ６６−アルファ、例えばアイソフォーム１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１２８７８７５．１（タンパク質に対して配列番号１５０）及びＮＭ＿００１３００９４６．１（ポリヌクレオチドに対して配列番号１５１）、並びにアイソフォーム２、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０６０１３０．３（タンパク質に対して配列番号１５２）及びＮＭ＿０１７６６０．３（ポリヌクレオチドに対して配列番号１５３）の阻害剤を使用して行われる。かかる阻害剤は、例えば、小分子、ＧＡＴＡＤ２Ａをコードするポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡ、又はドミナントネガティブペプチドであってもよい。
本発明の幾つかの実施形態によれば、Ｍｂｄ３発現の阻害は、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤を使用して（例えば、上に記載される薬剤及び分子を使用して）行われる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培地は、内因性ＥＲＡＳ及び／又は組換えＥＲＡＳの発現を増加する薬剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＭＢＤ３阻害剤は、同じ（例えば、同一の）であるがＭＢＤ３阻害剤を含まない条件下でインキュベート及び／又は培養された場合に同じ細胞において、ＭＢＤ３のＲＮＡ及び／又はタンパク質のそれぞれの発現レベルと比較して、細胞において少なくとも約３０％、例えば少なくとも約３５％、例えば少なくとも約４０％、例えば少なくとも約４５％、例えば少なくとも約５０％、例えば少なくとも約５５％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約６５％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％、例えば少なくとも約８０％のＭＢＤ３のＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現レベルの下方制御に十分な量で提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＭＢＤ３阻害剤は、同じ（例えば、同一の）であるがＭＢＤ３阻害剤を含まない条件下でインキュベート及び／又は培養された場合に同じ細胞において、ＭＢＤ３のＲＮＡ及び／又はタンパク質のそれぞれの発現レベルと比較して、細胞において約３０％〜９０％、例えば約３０％〜８５％、例えば約４０％〜８５％、例えば約５０％〜８５％、例えば約６０％〜８５％、例えば約７０％〜８５％、例えば約８０％〜８５％、例えば約８５％のＭＢＤ３のＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現レベルの下方制御に十分な量で提供される。
細胞中のＭＢＤ３の発現レベルは、リアルタイム逆転写ＰＣＲ、ウェスタンブロット等の様々な方法によって特定され得る。例えば、かかるアッセイを採用する場合、ＭＢＤ３ｆｌｏｘ／−コンストラクトによって形質移入された細胞においてＭＢＤ３タンパク質レベルの約８５％の阻害があった（データは示されていない）。
本発明によって意図される追加の培養培地として、その全内容が参照により本明細書に援用される、ＰＣＴ ＩＢ２０１４／０６０９５４に開示されるものが挙げられる。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、細胞と本発明の幾つかの実施形態の培養培地とを含む細胞培養物が提供される。
上記細胞は任意の細胞、例えば原核生物又は真核生物の細胞、例えば霊長類の細胞、例えば哺乳動物の細胞、例えばヒト細胞であってもよい。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記細胞は体細胞、幹細胞、プライム多能性幹細胞、感作多能性幹細胞、及び／又は無感作多能性幹細胞である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、無感作多能性幹細胞を少なくとも２継代、例えば、少なくとも５継代、１０継代、２０継代、３０継代、４０継代、５０継代、６０継代、７０継代、８０継代、９０継代、又は１００継代に亘って未分化状態に維持することができる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、プライム無感作多能性幹細胞はホモサピエンス（ヒト）、サル、チンパンジー、ゴリラ、アカゲザル、及び／又はヒヒの細胞である。
「無感作多能性幹細胞（ＰＳＣ）」の文言は、ＰＳＣを形成することができ、前Ｘ不活性化状態を呈し、したがってＰＳＣの起源となり得るとされる細胞を指す。
本発明の幾つかの実施形態の無感作ＰＳＣ（前Ｘ不活性化状態及び無感作状態にある）は、分化に際して、Ｘ染色体アレルのうち１つの不活性化し、及びＸＩＳＴ遺伝子のプロモーターのアレルのうち１つをメチル化することができる。
本発明の幾つかの実施形態による前Ｘ不活性化は、雌性細胞におけるＸ不活性特異的転写産物（ＸＩＳＴ）遺伝子のプロモーターの２つの非メチル化アレルの存在、及び雄性細胞におけるＸＩＳＴ遺伝子のプロモーターの１つの非メチル化アレルの存在を特徴とする。
ＸＩＳＴ遺伝子は、ヒトＸｑ１３．２染色体に位置し、クローンＮＣ＿００００２３．１０によって示される配列を有する（７３０４０４８６．７３０７２５８８、補足、ＧｅｎＢａｎｋ版ＧＲＣｈ３７．ｐ１０に基づく。ＸＩＳＴ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿００１５６４．２（配列番号２０）によって提示される非コーディングＲＮＡを有する。
本発明の幾つかの実施形態によれば、雌性細胞におけるＸＩＳＴ遺伝子のプロモーターの２つの非メチル化アレルの存在は、ＸＩＳＴプロモーターにおいて約２０％未満のＣｐＧメチル化リード配列（ｒｅａｄｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ）（すなわち、配列番号７０によって示されるＸＩＳＴプロモーターアンプリコンにおいて２０％未満のＣｐＧがメチル化されている）、例えば、約１９％未満、約１８％未満、約１７％未満、約１６％未満、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、例えば０％（例えば、全く無い）のＸＩＳＴプロモーターにおけるＣｐＧメチル化リード配列を有することを指す。
本発明の幾つかの実施形態によれば、雄性細胞におけるＸＩＳＴ遺伝子のプロモーターの１つの非メチル化アレルの存在は、ＸＩＳＴプロモーターにおいて約２０％未満のＣｐＧメチル化リード配列（すなわち、配列番号７０によって示されるＸＩＳＴプロモーターアンプリコンにおいて２０％未満のＣｐＧがメチル化されている）、例えば、約１９％未満、約１８％未満、約１７％未満、約１６％未満、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、例えば０％のＸＩＳＴプロモーターにおけるＣｐＧメチル化リード配列を有することを指す。
メチル化された又は非メチル化のいずれであってもよいＣｐＧアイランドを含むＸＩＳＴプロモーターの非限定的な例は、配列番号７０によって示されるＸＩＳＴプロモーターアンプリコンに提示される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、雌性細胞におけるＸＩＳＴ遺伝子のプロモーターの非メチル化アレルは、配列番号７０によって示されるＸＩＳＴプロ―モーターアンプリコンにおいて２０％未満のメチル化されたＣｐＧ部位を含む。雌性無感作多能性幹細胞におけるＸＩＳＴ遺伝子の非メチル化アレルの非限定的な例を図１７Ａ〜図１７Ｅに示す。
本発明の幾つかの実施形態によれば、雄性細胞におけるＸＩＳＴ遺伝子のプロモーターの非メチル化アレルは、配列番号７０によって示されるＸＩＳＴプロ―モーターアンプリコンにおいて２０％未満のメチル化されたＣｐＧ部位を含む。雄性無感作多能性幹細胞におけるＸＩＳＴ遺伝子の非メチル化アレルの非限定的な例を図１７Ａ〜図１７Ｅに示す。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ヒト無感作ＰＳＣは、ヒトプライムＰＳＣにおけるＣｐＧアイランドのメチル化レベルと比較して、ＸＩＳＴ遺伝子のプロモーターにおけるＣｐＧアイランドのメチル化の減少を特徴とする。
ヒト無感作ＥＳＣは、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）定量分析によって特定される、各細胞における総グアニンヌクレオチドのうち著しく低レベルの総メチル化シトシン（例えば１％〜２％）を特徴とする。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ヒト無感作ＰＳＣは、無感作ＰＳＣ細胞において、総グアニンヌクレオチドのうち０％〜３％の総メチル化シトシンを特徴とする。比較のため、プライムＰＳＣ又は体細胞は、プライムＰＳＣ細胞において総グアニンヌクレオチドのうち３．５％〜５％の総メチル化シトシンを有する。
したがって、本発明の幾つかの実施形態の無感作多能性幹細胞は、上に説明される「無感作状態」にある。
したがって、本発明の幾つかの実施形態の培養培地は、無感作ＰＳＣを無感作状態に維持することができる。本明細書で使用される「単離された」の用語は、天然環境から、例えば霊長類（例えば哺乳動物）の胚又は霊長類（例えば哺乳動物）の身体から少なくとも部分的に分離されたことを指す。
本発明の幾つかの実施形態によれば、感作ＰＳＣは、プライムＰＳＣ、胚性幹細胞、線維芽細胞、誘導多能性幹細胞（プライムｉＰＳＣの）、及び体細胞からなる群から選択される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、感作ＰＳＣは胚性幹細胞ではない。
「胚性幹細胞」の文言は、３つ全ての胚性生殖細胞層（すなわち、内胚葉、外胚葉、及び中胚葉）の細胞へと分化することができるか、又は未分化状態を保持することができる胚性細胞を指す。「胚性幹細胞」の文言は、妊娠後（例えば、胚盤胞）胚の着床前（すなわち、着床前胚盤胞）に形成される胚組織、着床後／原腸胚形成前の段階の胚盤胞から得られる拡張胚盤胞細胞（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ ｃｅｌｌ）（国際公開第２００６／０４０７６３号を参照されたい）、及び妊娠中のいずれかの時期、好ましくは妊娠１０週の前の胎児の生殖器組織から得られる胚性生殖（ＥＧ）細胞から得られる細胞を含んでもよい。
誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ、胚様幹細胞）は、多能性を備える（すなわち、３つの胚性生殖細胞層、すなわち内胚葉、外胚葉及び中胚様へと分化することができる）成人体細胞の脱分化によって得られる。本発明の幾つかの実施形態によれば、かかる細胞は、分化した組織（例えば、皮膚等の体細胞組織）から得られ、細胞をリプログラムする遺伝子操作によって脱分化を経て胚性幹細胞の特性を獲得する。本発明の幾つかの実施形態によれば、誘導多能性幹細胞は、体性幹細胞におけるＯｃｔ−４、Ｓｏｘ２、Ｋｆｌ４、及びｃ−Ｍｙｃの発現を誘導することによって形成される。
本発明の幾つかの実施形態の胚性幹細胞を、よく知られた細胞培養法を使用して得ることができる。例えば、ヒト胚性幹細胞は、ヒト胚盤胞から単離され得る。ヒト胚盤胞は、典型的にはヒトのｉｎ ｖｉｖｏ着床前胚又は体外受精（ＩＶＦ）胚から得られる。代替的には、単一細胞ヒト胚を胚盤胞段階まで拡大することができる。ヒトＥＳ細胞の単離のため、胚盤胞から透明帯を除去し、栄養外胚葉細胞を溶解し、穏やかなピペッティングによって無傷のＩＣＭから除去する免疫手術によって内部細胞塊（ＩＣＭ）を単離する。
その後、ＩＣＭを、その成長を可能とする適切な培地を含む組織培養フラスコに蒔く。９日後〜１５日後、ＩＣＭ由来の成長を機械的な分離、又は酵素分解のいずれかによってクランプへと分離し、その後、細胞を新しい組織培養培地上に再度蒔く。未分化の形態学を呈するコロニーをマイクロピペットによって個別に選択し、機械的にクランプへと分離し、再度蒔く。その後、得られたＥＳ細胞を、４日毎〜７日毎に定期的に分ける。ヒトＥＳ細胞の生成方法に関する更なる詳細については、Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，［米国特許第５，８４３，７８０号、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５，１９９８、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３，１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：７８４４，１９９５］、Ｂｏｎｇｓｏ ｅｔ ａｌ．，［Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ ４：７０６，１９８９］、及びＧａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，［Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．６９：８４，１９９８］を参照されたい。
ＥＳ細胞を生成する別の方法はＣｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌｕｍｅ ２，Ｉｓｓｕｅ ２，１１３−１１７，７ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００８に記載される。この方法は、体外受精プロセス中の胚から単一細胞を除去することを含む。胚は、このプロセスでは破壊されない。
また、商業的に入手可能な幹細胞を本発明の幾つかの実施形態に従って使用可能であることも理解される。ヒトＥＳ細胞は、ＮＩＨヒト胚性幹細胞登録［Ｈｙｐｅｒｔｅｘｔ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ：／／ｇｒａｎｔｓ（ｄｏｔ）ｎｉｈ（ｄｏｔ）ｇｏｖ／ｓｔｅｍ＿ｃｅｌｌｓ／ｒｅｇｉｓｔｒｙ／ｃｕｒｒｅｎｔ（ｄｏｔ）ｈｔｍ］から購入することができる。商業的に入手可能な胚性幹細胞下部の非限定的な例は、ＢＧ０１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＢＧ０４、ＣＹ１２、ＣＹ３０、ＣＹ９２、ＣＹ１０、ＴＥ０３、ＴＥ３２、ＣＨＢ−４、ＣＨＢ−５、ＣＨＢ−６、ＣＨＢ−８、ＣＨＢ−９、ＣＨＢ−１０、ＣＨＢ−１１、ＣＨＢ−１２、ＨＵＥＳ １、ＨＵＥＳ ２、ＨＵＥＳ ３、ＨＵＥＳ ４、ＨＵＥＳ ５、ＨＵＥＳ ６、ＨＵＥＳ ７、ＨＵＥＳ ８、ＨＵＥＳ ９、ＨＵＥＳ １０、ＨＵＥＳ １１、ＨＵＥＳ １２、ＨＵＥＳ １３、ＨＵＥＳ １４、ＨＵＥＳ １５、ＨＵＥＳ １６、ＨＵＥＳ １７、ＨＵＥＳ １８、ＨＵＥＳ １９、ＨＵＥＳ ２０、ＨＵＥＳ ２１、ＨＵＥＳ ２２、ＨＵＥＳ ２３、ＨＵＥＳ ２４、ＨＵＥＳ ２５、ＨＵＥＳ ２６、ＨＵＥＳ ２７、ＨＵＥＳ ２８、ＣｙＴ４９、ＲＵＥＳ３、ＷＡ０１、ＵＣＳＦ４、ＮＹＵＥＳ１、ＮＹＵＥＳ２、ＮＹＵＥＳ３、ＮＹＵＥＳ４、ＮＹＵＥＳ５、ＮＹＵＥＳ６、ＮＹＵＥＳ７、ＵＣＬＡ １、ＵＣＬＡ ２、ＵＣＬＡ ３、ＷＡ０７７（Ｈ７）、ＷＡ０９（Ｈ９）、ＷＡ１３（Ｈ１３）、ＷＡ１４（Ｈ１４）、ＨＵＥＳ ６２、ＨＵＥＳ ６３、ＨＵＥＳ ６４、ＣＴ１、ＣＴ２、ＣＴ３、ＣＴ４、ＭＡ１３５、Ｅｎｅａｖｏｕｒ−２、ＷＩＢＲ１、ＷＩＢＲ２、ＷＩＢＲ３、ＷＩＢＲ４、ＷＩＢＲ５、ＷＩＢＲ６、ＨＵＥＳ ４５、Ｓｈｅｆ ３、Ｓｈｅｆ ６、ＢＪＮｈｅｍ１９、ＢＪＮｈｅｍ２０、ＳＡ００１、ＳＡ００１である。
さらに、ＥＳ細胞は、マウス（Ｍｉｌｌｓ ａｎｄ Ｂｒａｄｌｅｙ，２００１）、ゴールデンハムスター［Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．１２７：２２４−７］、ラット［Ｉａｎｎａｃｃｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．１６３：２８８−９２］、ウサギ［Ｇｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．１９９３，Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ．３６：１３０−８；Ｇｒａｖｅｓ＆Ｍｏｒｅａｄｉｔｈ，１９９３， Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ．１９９３，３６：４２４−３３］、幾つかの飼育動物種［Ｎｏｔａｒｉａｎｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔｉｌ Ｓｕｐｐｌ．４３：２５５−６０；Ｗｈｅｅｌｅｒ １９９４， Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔｉｌ Ｄｅｖ．６：５６３−８；Ｍｉｔａｌｉｐｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃｌｏｎｉｎｇ．３：５９−６７］、及び非ヒト霊長類種（アカゲザル及びキヌザル）を含む他の種［Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．９２：７８４４−８；Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ．５５：２５４−９］からも同様に得ることができる。
拡張胚盤胞細胞（ＥＢＣ）は、原腸陥入前のステージの受精後少なくとも９日の胚盤胞から得ることができる。胚盤胞を培養する前に、内部細胞塊を露出するように、透明帯を消化する［例えば、タイロード酸性溶液（米国ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）］。その後、胚盤胞を全胚として受精から少なくとも９日間、１４日以下の間（すなわち、原腸陥入事象の前）標準的な胚性幹細胞培養法を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで培養する。
ＥＧ細胞は、当業者に既知の実験技術を使用して、（ヒト胎児の場合）妊娠約８週〜１１週の胎児から得られた始原生殖細胞から生成される。生殖隆起を分離し、その後機械的な分離によって細胞へと脱凝集される小さな塊に切断する。その後、ＥＧ細胞を適切な培地を用いて組織培養フラスコで生育させる。細胞がＥＧ細胞と形態学的一致が観察されるまで、典型的には７日〜３０日後、又は１継代〜４継代後、毎日培地交換を行って細胞を培養する。ヒトＥＳ細胞の生成方法に関する更なる詳細については、Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３７２６，１９９８］及び米国特許第６，０９０，６２２号を参照されたい。
誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）（胚様幹細胞）は、Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、及びＫＬＦ４等の転写因子を用いた体細胞の遺伝子操作、例えば線維芽細胞、肝細胞、胃上皮細胞等の体細胞のレトロウイルスによる形質移入によって体細胞から生成され得る［Ｙａｍａｎａｋａ Ｓ，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２００７，１（１）：３９−４９、Ａｏｉ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ Ａｄｕｌｔ Ｍｏｕｓｅ Ｌｉｖｅｒ ａｎｄ Ｓｔｏｍａｃｈ Ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００８ Ｆｅｂ １４．（Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ）、ＩＨ Ｐａｒｋ， Ｚｈａｏ Ｒ， Ｗｅｓｔ ＪＡ，ｅｔ ａｌ． Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ｗｉｔｈ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ ２００８；４５１：１４１−１４６、Ｋ Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔａｎａｂｅ Ｋ，Ｏｈｎｕｋｉ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｂｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ ２００７；１３１：８６１−８７２］。他の胚様幹細胞は、卵母細胞への核移植、胚性幹細胞との融合、又はレシピエント細胞が有糸分裂で停止している場合であれば接合子への核移植によって作成され得る。
本明細書に記載される培地において細胞を培養することは、任意のベシクル（ｖｅｓｉｃｌｅ）、例えばプレート、チャンバー、バイオリアクター等によってなされる場合がある。
本発明の方法によって選択され及び／又は培養され得る細胞の数は、小さなバッチ、例えば１００×１０４細胞〜大きなバッチ、例えば１００×１０６細胞又は１００×１０７細胞を含む任意の数であってもよい。
細胞はバイオリアクター（又はマルチレベル産業フラスコ）において培養されてもよく、そのサイズは培養される細胞の数に従って選択される。
本明細書で使用される「バイオリアクター」の用語は、モニターされ、制御された環境下での生物学的及び／又は生化学的なプロセスがその中で発展し、条件、例えばｐＨ、温度、圧力、栄養素供給、及び老廃物の除去を操作する、任意の装置を指す。本発明の１つお実施形態によれば、本発明による使用に適した基本的なクラスのバイオリアクターとして、固定型バイオリアクター、撹拌フラスコバイオリアクター、回転壁バイオリアクター、中空繊維バイオリアクター、及び直接注入バイオリアクターが挙げられる。
特定の実施形態によれば、上記細胞を接着性表面上で培養（すなわち拡大）する。
かかる表面の例を以下に提示する。
１．ラミニン／フィブロネクチン被覆プレート。フィブロネクチンの供給元：Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ウシフィブロネクチンＦ１１４１、又はヒトフィブロネクチンＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＦＣ０１０。ラミニンの供給元：Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈユーイング肉腫由来ラミニンＬ２０２０、Ｈｕｍａｎ Ｂｉｏｌａｍｉｎｉｎ ５１１又はＨｕｍａｎ Ｂｉｏｌａｍｉｎｉｎ ５２１（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ ＩＮＣ）。例えば、ラミニン／フィブロネクチン被覆プレートを得るため、ラミニンとフィブロネクチンを２μｇ／ｍｌの最終濃度で混合し、プレートのウェルを３７℃で少なくとも２時間に亘って被覆することによってかかる表面を生成することができる。
２．ゼラチン及びビトロネクチン被覆プレート（例えば、０．２％ゼラチン及び１μｇ／ｍｌビトロネクチン被覆プレート）上で拡大することができる。例えば、かかる表面は、ゼラチン溶液をビトロネクチンと混合し、そのミックスを使用して３７℃で少なくとも１時間に亘ってウェルを被覆することにより生成され得る。被覆プレートを３７℃で最大４日間放置することができ、なおも細胞に対して使用可能であることに留意されたい。
３．細胞を、０．２％ゼラチン／放射線照射したマウス又はヒト線維芽細胞フィーダー細胞により被覆したプレート上で拡大することができる。
４．ヒト無感作細胞を０．２％ゼラチンのみで被覆されたプレート上で拡大することができる。
５．ヒト無感作細胞をマトリゲル又はゲルトレックス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のみで被覆したプレート上で拡大することができる。例えば、かかる表面は、プレートを３７℃で１時間に亘ってＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）溶液と共にインキュベートすることによって生成され得る。
本出願に記載される培養培地を無数の目的に使用してもよい。
特定の実施形態によれば、上記培養培地を細胞の拡大（すなわち数の増加）、例えば無感作ＰＳＣの拡大に使用する。
無感作ＰＳＣを培養することは、２４時間毎〜４８時間毎に（同一の組成の）「新しい」培地で培養培地を置き換えること、及び３日毎〜５日後に各培養皿（例えばプレート）を２個又は３個の培養皿（例えばプレート）に継代することを含むことに留意されたい。したがって、培養物中の細胞が約６０％〜９０％のコンフルエンスに達すると、上清を廃棄し、培養皿を洗浄し［例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）により］、細胞を、例えばトリプシン処理（０．２５％又は０．０５％のトリプシン＋ＥＤＴＡ）を使用して、例えば単一の細胞又は細胞クランプが互いから分離されるまで、培養皿からの酵素分離に供する。
本発明者らによって明らかにされた培養条件は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及び／又はｃ−Ｍｙｃの因子の更なる外因性の発現を必要とすることなく無感作ＰＳＣ状態でのヒトｉＰＳＣ等のヒトＰＳＣの維持を可能とする。これは、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及び／又はｃ−Ｍｙｃの因子の外因性の発現を必要とし、これらの因子の撤回により無感作ＰＳＣが自発的に分化し、未分化及び多能性幹細胞に維持することが不可能であった、無感作ヒトＰＳＣの生成に対する以前の全ての試みと明らかに対照的である（例えば、Ｈａｎｎａ Ｊ，２０１０ｂを参照されたい）。
別の態様によれば、本明細書に記載される培養培地は無感作多能性幹細胞を生成するため使用される。
より具体的には、本発明の態様によれば、無感作多能性幹細胞（ＰＳＣ）を生成する方法であって、
本明細書に記載されるいずれかの培養培地中で感作ＰＳＣ細胞をインキュベートすることを含み、
該培養培地が感作ＰＳＣからの無感作ＰＳＣの生成を可能とし、
（ｉ）無感作ＰＳＣが雌性ＰＳＣである場合、無感作雌性ＰＳＣがＸ不活性特異的転写産物（ＸＩＳＴ）遺伝子のプロモーターの２つの非メチル化アレルを有し、及び
（ｉｉ）無感作ＰＳＣが雄性ＰＳＣである場合、無感作雄性ＰＳＣが前記ＸＩＳＴ遺伝子のプロモーターの１つの非メチル化アレルを有し、
及び／又は
無感作ＰＳＣにおける転写因子Ｅ３（ＴＦＥ３）の発現レベルが、免疫染色アッセイによって特定される１以上である細胞質に対する核の発現比率を特徴とし、
及び／又は
無感作ＰＳＣが該無感作ＰＳＣの細胞表面上でのＣ−ＫＩＴ（ＣＤ１１７）の陽性発現を特徴とし、
それによって無感作ＰＳＣが生成される、方法が提供される。
したがって、本発明の無感作ＰＳＣは無感作状態を特徴とする。これは、例えば、試験したいずれの培養培地も無感作ＰＳＣを特徴づける独特の前Ｘ不活性状態を保持することができたことを示す、図１７Ａ〜図１７Ｅ及び図２２Ａ〜図２２Ｂにおいて実証される。よって、図１７Ａ〜図１７Ｅは、ＸＩＳＴプロモーターにおいて（配列番号７０に示されるアンプリコンのセットにおいて）特定されるかかる非メチル化アレルの例を示す。これらの結果は、結論的には、試験したどの培養培地で培養された雄性及び雌性の無感作ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣも様々なＷＩＳ−ＮＨＳＭ条件下で独特の前Ｘ不活性化状態を保持することを実証する。
対照的に、図１７Ｆ及び図２２Ｃは、雄性細胞におけるＸＩＳＴ遺伝子のプロモーターが完全にメチル化されている（すなわち、ＸＩＳＴプロモーターのほとんどのＣｐＧ部位がメチル化されている）、及び雌性細胞におけるＸＩＳＴ遺伝子のプロモーターの１つのアレルがメチル化されている、感作ＰＳＣの例を示す。
上に記載されるように、本発明の幾つかの実施形態の無感作ＰＳＣは、転写因子Ｅ３（ＴＦＥ３）の独特の発現レベルを特徴とする。したがって、無感作ＰＳＣにおけるＴＦＥ３の発現レベルは、免疫染色アッセイによって特定される１に等しいか又は１より高い細胞質に対する核の発現比率を特徴とする。
以下の実施例の欄の表１及び実施例５は、試験した培養培地はいずれも、核と細胞質の間のＴＦＥ３富化比率が１より大きいことを特徴とする無感作状態に無感作ＰＳＣを維持することができた。
上に記載されるように、また図２５Ａ〜図２５Ｃに示されるように、本発明の幾つかの実施形態の無感作ＰＳＣは、Ｃ−ＫＩＴタンパク質（ＣＤ１１７としても知られる）のＰＳＣの細胞表面上での陽性発現を特徴とする。プライムＰＳＣは、細胞の細胞表面はもちろん、Ｃ−ＫＩＴを全く発現しないことに留意されたい。図２５Ａ〜図２５Ｃに示される結果は、Ｃ−ＫＩＴはヒト無感作であるがプライムではないＰＳＣの新規なマーカーであるという結論を支持する。
がん原遺伝子ｃ−ｋｉｔのヒトホモログであるＣ−ＫＩＴは、ネコ肉腫ウイルスがん遺伝子ｖ−ｋｉｔの細胞ホモログとして最初に同定された。このタンパク質は、ＭＧＦ（肥満細胞増殖因子、「幹細胞因子」としても知られる）に対するタイプ３膜貫通受容体である。Ｃ−ＫＩＴタンパク質の配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００２１３．１（アイソフォーム１前駆体に対して配列番号２０２）、及びＮＰ＿００１０８７２４１．１（アイソフォーム２前駆体に対して配列番号２０３）に提示される。
無感作ＰＳＣでのＣ−ＫＩＴの発現は、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ分析）等の任意の免疫染色アッセイ、及び／又は例えば、蛍光顕微鏡を使用する免疫蛍光技術、及び／又は放射性標識抗体によって特定され得る。
感作多能性幹細胞から無感作多能性幹細胞を生成する例示的な培養培地として以下が挙げられる。
１．ＫＯ−ＤＭＥＭと、Ｎ２補足物と、Ｂ２７補足物と、ＬＩＦと、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３ｂ阻害剤と、ｐ３８阻害剤と、ＳＲＣ阻害剤とを含む培養培地。
２．ＤＭＥＭ−Ｆ１２／ＮＥＵＲＯｂａｓａｌ（ＧＩＢＣＯ）の１：１ミックスと、Ｎ２補足物と、Ｂ２７補足物と、ＬＩＦと、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３ｂ阻害剤と、ｐ３８阻害剤と、ＳＲＣ阻害剤とを含む培養培地。
３．ＤＭＥＭ−Ｆ１２と、Ｎ２補足物と、Ｂ２７補足物と、ＬＩＦと、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３ｂ阻害剤と、ｐ３８阻害剤と、ＳＲＣ阻害剤とを含む培養培地。
４．ＫＯ−ＤＭＥＭと、Ｎ２補足物（Ｇｉｂｃｏ）と、Ｂ２７補足物と、ＬＩＦと、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤と、Ａｘｉｎ安定化剤とを含む培養培地。
５．ＤＭＥＭ−Ｆ１２／ＮＥＵＲＯｂａｓａｌ（ＧＩＢＣＯ）の１：１ミックスと、Ｎ２補足物（Ｇｉｂｃｏ）と、Ｂ２７補足物（ＧＩＢＣＯ）と、ＬＩＦ（ＳＴＡＴ３活性化剤）と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤と、Ａｘｉｎ安定化剤とを含む培養培地。
６．ＤＭＥＭ−Ｆ１２と、Ｎ２補足物（Ｇｉｂｃｏ）と、Ｂ２７補足物と、ＬＩＦ（ＳＴＡＴ３活性化剤）と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤と、Ａｘｉｎ安定化剤とを含む培養培地。
７．ＫＯ−ＤＭＥＭと、Ｎ２補足物（Ｇｉｂｃｏ）と、Ｂ２７補足物と、ＬＩＦと、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３ｂ阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤と、Ａｘｉｎ安定化剤とを含む培養培地。
８．ＤＭＥＭ−Ｆ１２／ＮＥＵＲＯｂａｓａｌ（ＧＩＢＣＯ）の１：１ミックスと、Ｎ２補足物（Ｇｉｂｃｏ）と、Ｂ２７補足物（ＧＩＢＣＯ）と、ＬＩＦ（ＳＴＡＴ３活性化剤）と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３ｂ阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤と、Ａｘｉｎ安定化剤とを含む培養培地。
９．ＤＭＥＭ−Ｆ１２と、Ｎ２補足物（Ｇｉｂｃｏ）と、Ｂ２７補足物と、ＬＩＦ（ＳＴＡＴ３活性化剤）と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３ｂ阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤と、Ａｘｉｎ安定化剤とを含む培養培地。
１０．ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、Ａｘｉｎ安定化剤とを含む培養培地。
１１．ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、Ａｘｉｎ安定化剤と、ＰＫＣ阻害剤とを含む培養培地。
１２．ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、Ａｘｉｎ安定化剤と、ＰＫＣ阻害剤と、ＧＳＫ３ｂ阻害剤とを含む培養培地。
１３．ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＳＲＣ阻害剤とを含む培養培地。
１４．ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＳＲＣ阻害剤と、ＡＸＩＮ複合安定化剤（ＡＸＩＮｓ）とを含む培養培地。
１５．ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＳＲＣ阻害剤と、ＡＸＩＮ複合安定化剤（ＡＸＩＮｓ）と、ＧＳＫ３β阻害剤とを含む培養培地。
１６．ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＳＲＣ阻害剤と、ＡＸＩＮ複合安定化剤（ＡＸＩＮｓ）と、ＧＳＫ３β阻害剤と、ｐ３８阻害剤とを含む培養培地。
１７．ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、ｐ３８阻害剤と、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＳＲＣ阻害剤及びＡＸＩＮ複合安定化剤（ＡＸＩＮｓ）からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤とを含む培養培地。
１８．ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＳＴＡＴ３活性化剤と、トランスフォーミング増殖因子ベータ受容体（ＴＧＦβＲ）阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤と、ｐ３８阻害剤と、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）とを含む培養培地。
１９．以下の実施例の欄の実施例１（培養培地１〜４０）、実施例５（培養培地４１〜１３１）、及び実施例６（培養培地１３２〜１４７）に記載されるいずれかの培養培地。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地中で感作ＰＳＣ細胞をインキュベートすることは、フィーダー細胞を欠く培養条件下で、すなわちフィーダー層不含条件下で（例えば、マトリゲル、ラミニン、及び／又はフィブロネクチンの被覆表面上で）行われる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地中で感作ＰＳＣ細胞をインキュベートすることは、多能性幹細胞の成長を支持する線維芽細胞［例えば、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）］等のフィーダー細胞上で培養することを含む、培養条件下で行われる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、無感作ＰＳＣが体細胞に由来する場合、上記方法は、体細胞を脱分化条件に供して、誘導多能性幹細胞を得ることを更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、脱分化条件は、ＯＣＴ４［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２６９２．２（配列番号５４）及びＮＭ＿００２７０１．４（配列番号５５）］、ＳＯＸ２［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００３０９７．１（配列番号５６）及びＮＭ＿００３１０６．３（配列番号５７）］、ＫＬＦ４［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００４２２６．３（配列番号５８）及びＮＭ＿００４２３５．４（配列番号５９）］、ｃ−Ｍｙｃ［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２４５８．２（配列番号６０）、及びＮＭ＿００２４６７．４（配列番号６１）］、ＥＳＲＲＢエストロゲン関連受容体ベータＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４４５２．３（配列番号１２４）及びＮＰ＿００４４４３．３（配列番号１２５）、Ｋｒｕｐｐｅｌ様因子２、ＫＬＦ２、［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５７３５４．１（配列番号１２６）及びＮＭ＿０１６２７０．２（配列番号１２７）］ＴＢＸ３［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００５９８７．３ ＮＰ＿０５７６５３．３（配列番号１２８及び１２９）ＮＭ＿００５９９６．３ ＮＭ＿０１６５６９．３（配列番号１３０及び配列番号１３１）］、ＥＲＡＳ［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿８５３５１０．１（配列番号１３２）及びＮＭ＿１８１５３２．３（配列番号１３３）、及びＫｒｕｐｐｅｌ様因子１７、ＫＬＦ１７［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿７７５７５５．３（配列番号１５４）及びＮＭ＿１７３４８４．３（配列番号１５５、転写産物コーディングＫＬＦ１７タンパク質）］からなる群から選択される少なくとも２つ、例えば少なくとも３つ、少なくとも４つ以上の増殖因子を体細胞内で外因的に発現することを含む。
本明細書で使用される「外因的に発現する」の文言は、その細胞内で自然には発現され得ない又はその細胞での過剰発現が望まれる異種性核酸配列を発現することを指す。外因性ポリヌクレオチドは、リボ核酸（ＲＮＡ）分子及び／又はポリペプチド分子を産生するように安定した又は一過性の方式で細胞に導入され得る。外因性ポリヌクレオチドは、その細胞の内因性核酸配列と同一又は部分的に相同である核酸配列を含み得ることに留意されたい。
本発明の更に別の態様によれば、体細胞から誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の生成を改善する方法であって、
（ａ）体細胞内でＮａｎｏｇ、ＥＳＲＲＢ、ＫＬＦ２、ＴＢＸ３、ＥＲＡＳ、及びＫＬＦ１７からなる群から選択される第１因子、並びにＥＳＲＲＢ、ＫＬＦ２、ＴＢＸ３、ＥＲＡＳ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、及びＫＬＦ１７からなる群から選択される第２因子を発現し、前記第１及び第２の因子が同一ではない、並びに
（ｂ）体細胞においてＭｂｄ３及び／又はＧａｔａｄ２ａ発現及び／又は活性を阻害することによって、体細胞からのｉＰＳＣの生成を改善すること
を含む方法が提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記因子を発現することは、上記因子のＤＮＡトランスフェクションを使用して行われる。
哺乳動物細胞へのＤＮＡトランスフェクションの方法は当該技術分野で知られており、その全体が参照により本明細書に完全に援用される参照文献（Ｍａｎｓｏｕｒ ｅｔ ａｌ．２０１２）に記載されるものを含む。発現ベクターの生成及び細胞へのベクターの投与様式の更なる説明が以下に提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記因子の発現は、増殖因子のＲＮＡトランスフェクションを使用して行われる。
哺乳動物細胞へのＲＮＡトランスフェクションの方法は当該技術分野で知られており、その全体が参照により本明細書に完全に援用される参照文献（Ｗａｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１０）に記載されるものを含む。
いったん得られると、細胞を培地（例えば、本明細書において上に開示されるもの）中で培養し、順次継代する。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記因子の外因的発現は、培養物中１０日以下、例えば１継代以下等の制限時間に対しなされる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、一旦、無感作ｉＰＳＣが体細胞から生成されると、Ｎａｎｏｇ、ＥＳＲＲＢ、ＫＬＦ２、ＴＢＸ３、ＥＲＡＳ Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４ｃ−Ｍｙｃの因子の外因的発現を伴わずに、また単離されたＮａｎｏｇ、ＥＳＲＲＢ、ＫＬＦ２、ＴＢＸ３、ＥＲＡＳ Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４ｃ−Ｍｙｃの因子の培養培地への添加を伴わずに、本発明の幾つかの実施形態の培養培地（例えば、ＷＩＳ−ＮＨＳＭ培地）中で更に培養される。
本明細書で使用される「単離された…因子」の文言は、宿主細胞（例えば、細菌）において発現ベクターから組換えにより発現される、生化学的に合成される、又は生体試料（例えば血清又は細胞）から単離される因子を指す。
本発明の幾つかの実施形態の方法を、（例えば、本明細書において上に開示される培地を使用して）Ｍｂｄ３発現の更なる阻害を伴わずに、Ｎａｎｏｇ、ＥＳＲＲＢ、ＫＬＦ２、ＴＢＸ３、ＥＲＡＳ Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４ｃ−Ｍｙｃの因子の体細胞での発現を使用する体細胞からのｉＰＳＣの生成と比較して、体細胞からのｉＰＳＣの生成を改善するために使用することができる。
例えば、ヒト体細胞を使用する場合、上記方法は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ＥＲＫ１／２阻害剤、ＧＳＫ３ｂ阻害剤、ｐ３８阻害剤、ＪＮＫ阻害剤、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦβ１）、及びＭＢＤ３阻害剤、また任意にＲＯＣＫ阻害剤を含む培地を使用することでなされ得る。体細胞を増殖因子（例えば、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃの少なくとも２つ）のＤＮＡトランスフェクションを使用して脱分化に供する場合、その後、上記方法は、ＭＢＤ３発現の更なる阻害を伴わずに体細胞においてＤＮＡトランスフェクションを使用してＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃを発現する場合に得られるｉＰＳＣの収率と比較して、少なくとも約３０％、例えば少なくとも約４０％、例えば少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約９０％、例えば少なくとも約９５％、例えば少なくとも約９９％、例えば１００％多いｉＰＳＣをもたらす。
例えば、ヒト体細胞を使用する場合、上記方法は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ＥＲＫ１／２阻害剤、ＧＳＫ３ｂ阻害剤、ｐ３８阻害剤、ＪＮＫ阻害剤、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦβ１）、及びＭＢＤ３阻害剤、また任意にＲＯＣＫ阻害剤を含む培地を使用することで影響を受ける場合がある。
体細胞を増殖因子（例えば、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃの少なくとも２つ）のＲＮＡトランスフェクションを使用して脱分化に供する場合、その後、上記方法は、Ｍｂｄ３発現の更なる阻害を伴わずに体細胞においてＲＮＡトランスフェクションを使用してＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃを発現する場合に得られるｉＰＳＣの収率と比較して、少なくとも約５％、例えば少なくとも約１０％、例えば少なくとも約２０％、例えば少なくとも約３０％、例えば少なくとも約４０％、例えば少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約７５％、例えば少なくとも約９９％、例えば１００％多いｉＰＳＣをもたらす。さらに、従来の方法（ＭＢＤ３阻害を伴わず、本発明の幾つかの実施形態の培地を用いない）が、ヒト体細胞の脱分化を達成するため１０回〜２０回のＲＮＡトランスフェクションを採用するのに対し、本発明の幾つかの実施形態の方法は、ヒト体細胞の脱分化を達成するため１回〜４回のＲＮＡトランスフェクションを採用し、したがって一層効率的で手間がかかる。
本発明者らは、多能性幹細胞におけるＥＲＡＳの過剰発現又は内因性ヒトＥＲＡＳの活性化は、多能性幹細胞における無感作状態を誘導するため使用され得ることを明らかにした。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記方法は、ＥＳ細胞発現Ｒａｓ（ＥＲＡＳ）コーディング配列（例えば、配列番号１０９）を外因的に発現すること、又は体細胞においてＥＲＡＳの内因的発現を活性化することを更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＥＲＡＳの内因的発現を活性化することは、例えば、その全体が参照により本明細書に完全に援用される、Ｋａｍｅｄａ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００５；２３：１５３５−１５４０による図３のＡ−１、Ａ２、又はＡ−３の四角で囲まれた配列において、内因性ＥＲＡＳ遺伝子（配列番号１０８）の未熟なポリアデニル化部位を除去することによって行われる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、Ｍｂｄ３の阻害が、発現に先立ってＭｂｄ３のレベルの１０％〜３０％とするように少なくとも４８時間に亘ってなされる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、発現は約４８時間に亘ってなされ、阻害は少なくとも約４８時間後になされる。
Ｍｂｄ３の阻害が４８時間後に行われる場合、阻害は１００％のＭＢＤ３の活性の発現レベルとなり得ることに留意されたい。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ｉＰＳＣはネズミ科ｉＰＳＣである。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の方法に従って生成された無感作多能性幹細胞、又は本発明の幾つかの実施形態の方法に従って生成されたｉＰＳＣを分化条件に供することによって分化細胞を生成することを含む、分化細胞を生成する方法が提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の無感作ＰＳＣ又はｉＰＳＣは、細胞系列特異的細胞を生成するため使用され得る。
本明細書で使用される「細胞系列特異的細胞を生成すること」の文言は、細胞系列特異的な表現型と関連する少なくとも１つの特性を優性に呈する細胞を含む培養物における混合された細胞集団の富化を指す。全ての細胞系列は、３つの胚性生殖細胞層に由来する。したがって、例えば、肝細胞及び膵臓細胞は胚性内胚葉に由来し、骨性、軟骨性、弾性、線維性の結合組織、ヨット（ｙａｃｈｔｓ）、心筋細胞、骨髄細胞、血管細胞（主に、内皮細胞及び平滑筋細胞）、及び造血幹細胞は胚性中胚葉から分化し、神経、網膜、及び上皮の細胞は胚性外胚葉に由来する。
細胞系列特異的細胞を、拡大された未分化な無感作ＰＳＣを特定の細胞系列の分化に適した培養条件に対して直接誘導することによって得ることができる。
以下は、ＥＢの細胞系列特異的細胞への分化を誘導するための幾つかの手順及びアプローチの非限定的な説明である。本発明は、ＥＢの生成を通して機能しない、本明細書に記載される細胞のｅｘ ｖｉｖｏの分化に対する追加のプロトコルを意図することが理解される。
神経前駆細胞
本発明の幾つかの実施形態のＥＢを神経前駆体へと分化させるため、４日齢のＥＢを５ｍｇ／ｍｌのインスリン、５０ｍｇ／ｍｌのトランスフェリン、３０ｎＭの塩化セレン、及び５ｍｇ／ｍｌのフィブロネクチンを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で５日間〜１２日間培養する（Ｉｔｓ ｍｅｄｉｕｍ，Ｏｋａｂｅ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．５９：８９−１０２）。得られた神経前駆体を更に移植して、ｉｎ ｖｉｖｏで神経細胞を生成する（Ｂｒｉｓｔｌｅ， Ｏ．ｅｔ ａｌ．，１９９７．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｎｅｕｒａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｂｒａｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９４：１４８０９−１４８１４）。それらの移植に先立って、神経前駆体をトリプシン処理し、０．１％のＤＮａｓｅの存在下で単一細胞懸濁物へと粉砕することが理解される。
オリゴデンドロサイト及びミエリン形成細胞
本発明の幾つかの実施形態のＥＢは、修飾ＳＡＴＯ培地、すなわちウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ピルビン酸塩、プロゲステロン、プトレシン、チロキシン、トリヨードチロニン、インスリン、トランスフェリン、セレン酸ナトリウム、アミノ酸、神経栄養因子３、毛様体神経栄養因子、及びＨｅｐｅｓを含むＤＭＥＭ中で培養することによってオリゴデンドロサイト及びミエリン形成細胞へと分化することができる（Ｂｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｅ．＆Ｓａｔｏ，Ｇ．Ｈ．，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６，５１４−５１７；Ｒａｆｆ，Ｍ．Ｃ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｒ．Ｈ．，＆Ｎｏｂｌｅ，Ｍ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ ３０３：３９０−３９６）。簡潔には、ＥＢを０．２％トリプシン／ＥＤＴＡ（３７℃で５分間）使用して分離し、単一細胞懸濁物へと粉砕する。懸濁した細胞を、５％ウマ血清及び５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で補足されたＳＡＴＯ培地を含むフラスコに蒔く。培養４日後にフラスコを穏やかに振蕩してゆるく付着した細胞（主にオリゴデンドロサイト）を懸濁し、一方、アストロサイトはフラスコに付着したままのこり、更に馴化培地を生じる。初期のオリゴデンドロサイトを、更に２日間に亘ってＳＡＴＯを含む新たなフラスコに移す。合計６日間の培養後、オリゴスフェア（ｏｌｉｇｏｓｐｈｅｒｅ）を部分的に分離して細胞移植用のＳＡＴＯ培地に再懸濁するか、又は完全に分離して先の振蕩工程に由来するオリゴスフェア馴化培地に播く［Ｌｉｕ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，（２０００）．Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｉｎｔｏ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｍｙｅｌｉｎａｔｅ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ａｆｔｅｒ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９７：６１２６−６１３１］のいずれかを行う。
肥満細胞
肥満細胞の分化のため、本発明の幾つかの実施形態の２週齢のＥＢを、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、２０％（体積／体積）ＷＥＨＩ−３細胞馴化培地、及び５０ｎｇ／ｍｌ組換えラット幹細胞因子（ｒｒＳＣＦ、Ｔｓａｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０００．Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｓｔ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ： Ａｎ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｖｅｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｌｅｔｈａｌ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｍｉｃｅ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９７：９１８６−９１９０）で補足されたＤＭＥＭ培地を含む組織培養皿に移す。培養物を、細胞を毎週新たなフラスコに移し、半分の培養培地を入れ替えることによって拡大する。
血液−リンパ球細胞
本発明の幾つかの実施形態のＥＢから血液−リンパ球細胞を生成するため、２日齢〜３日齢のＥＢを、調整可能な酸素含有量のインキュベーターを使用して、７．５％ＣＯ２及び５％Ｏ２の存在下でガス透過性培養皿に移す。分化の１５日後、細胞を回収し、いずれもスイス国バーゼルのＦ． Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｌｔｄから入手可能であるコラゲナーゼ（０．１単位／ｍｇ）及びディスパーゼ（０．８単位／ｍｇ）により穏やかに消化することによって分離する。ＣＤ４５陽性細胞を、抗ＣＤ４５モノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ｍ１／９．３．４．ＨＬ．２、及びＰｏｔｏｃｎｉｋ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｈｅｍａｔｏ−ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９７，９４：１０２９５−１０３００）．に記載されるヤギ抗ラット免疫グロブリンに結合された常磁性マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して単離する。単離されたＣＤ４５陽性細胞をＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）上の単一通過を使用して更に富化することができる。
ＥＢは複雑な構造であることから、ＥＢの特定の分化した細胞、組織、又は臓器への分化はＥＢからの細胞系列特異的細胞の単離を必要とする場合があることに留意されたい。
かかる単離は、蛍光励起セルソーター（ＦＡＣＳ）によるＥＢの細胞のソーティング、又はＥＢに含まれる細胞、組織及び／又は組織用構造物の機械的分離によってなされてもよい。
ＦＡＣＳ分析によるＥＢ由来分化細胞の単離方法は当該技術分野で知られている。或る１つの方法によれば、ＥＢをトリプシン及びＥＤＴＡ（それぞれ、０．０２５％及び０．０１％）の溶液を使用して脱凝集し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）で洗浄し、特定の細胞系列細胞への細胞表面抗原特性に対する蛍光標識された抗体と共に氷上で３０分間インキュベートする。Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００２．９９：４３９１−４３９６）に記載されるように、例えば、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（米国カリフォルニア州サンジョーズのＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）から入手可能な蛍光標識されたＰＥＣＡＭ１抗体（３０８８４Ｘ）等の血小板内皮細胞接着分子−１（ＰＥＣＡＭ１）に対する抗体を付着することによって内皮細胞を単離する。ＣＤ３４−ＦＩＴＣ、ＣＤ４５−ＰＥ、ＣＤ３１−ＰＥ、ＣＤ３８−ＰＥ、ＣＤ９０−ＦＩＴＣ、ＣＤ１１７−ＰＥ、ＣＤ１５−ＦＩＴＣ、クラスＩ−ＦＩＴＣ、これらのＩｇＧ１はいずれもＰｈａｒＭｉｎｇｅｎから入手可能であり、ＣＤ１３３／１−ＰＥ（ＩｇＧ１）（カナダ国オーバーンのＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃから入手可能）、及びＩｍｍｕｎｏｔｅｃｈ（フロリダ州マイアミ）から入手可能なグリコフォリンＡ−ＰＥ（ＩｇＧ１）等の蛍光標識化抗体を使用して、造血幹細胞を単離する。生存細胞（すなわち、固定を伴わない）を、ＰＣ−ＬＹＳＩＳ又はＣＥＬＬＱＵＥＳＴのいずれかのソフトウェアにより死細胞を排除するため、ヨウ化プロピジウムを使用してＦＡＣｓｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で分析した。Ｋａｕｆｍａｎ，Ｄ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．，（Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００１，９８：１０７１６−１０７２１）に記載されるように、磁気的に標識された二次抗体及び磁気分離カラム（ＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して単離された細胞を更に富化できることがわかる。
ＥＢから拍動する心筋細胞の機械的単離に関する例がＸｕ ｅｔ ａｌに対する米国特許出願番号第２００３００２２３６７号に開示される。簡潔には、本発明の幾つかの実施形態の４日齢のＥＢをゼラチン被覆プレート又はチャンバースライドへと移し、付着及び分化させる。分化の８日目から観察される自発的に収縮する細胞を機械的に分離し、低カルシウム培地又はＰＢＳを含む１５ｍＬチューブに収集する。コラゲナーゼ活性に応じて、３７℃で６０分間〜１２０分間に亘ってコラゲナーゼＢ消化を使用して細胞を分離する。その後、分離した細胞を分化ＫＢ培地（８５ｍＭ ＫＣＩ、３０ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４、５ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ｍＭ ＥＧＴＡ、５ｍＭ クレアチン、２０ｍＭグルコース、２ｍＭ Ｎａ２ＡＴＰ、５ｍＭピルビン酸塩、及び２０ｍＭタウリン、ｐＨ７．２に緩衝、Ｍａｌｔｓｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７５：２３３，１９９４）に再懸濁し、３７℃で１５分間〜３０分間インキュベートする。分離の後、細胞をチャンバースライドに蒔き、分化培地で培養して拍動可能な単一の心筋細胞を生成する。
単離された細胞系列特異的細胞の分化及び拡大に適した培養条件は、様々な組織培養培地、増殖因子、抗生物質、アミノ酸等を含み、特定の細胞型及び／又は細胞系列を拡大及び分化させるためにどの条件を適用すべきかを決定することは当業者の能力の範囲内である。［Ｆｉｊｎｖａｎｄｒａａｔ ＡＣ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ．２００３；５８：３０３−１２、Ｓａｃｈｉｎｉｄｉｓ Ａ， ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ．２００３；５８：２７８−９１、Ｓｔａｖｒｉｄｉｓ ＭＰ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ ＡＧ，２００３；Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ．３１（Ｐｔ １）：４５−９において論評される］。
細胞系列特異的初代培養物に加えて、本発明のＥＢを培養物中での無限の拡大が可能な細胞系列特異的細胞の生成に使用することができる。
本発明の幾つかの実施形態の細胞を、当該技術分野で既知の方法、例えば、細胞においてテロメラーゼ遺伝子を発現することを誘導することによって（Ｗｅｉ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．，２００３．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２３：２８５９?２８７０）、又はＮＩＨ ３Ｔ３ ｈｐｈ−ＨＯＸ１１レトロウイルスプロデューサー細胞と上記細胞を共培養することによって（Ｈａｗｌｅｙ，Ｒ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，１９９４．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ９：１−１２）、ＥＢ由来細胞を不死化することによって産生することができる。
以下は、本発明の幾つかの実施形態の無感作ＰＳＣ又はｉＰＳＣから細胞系列特異的細胞の分化及び／又は拡大に適した培養条件の非限定的な例である。無感作ＰＳＣ又はｉＰＳＣの分化細胞への分化を誘導するため、無感作の未分化及び多能性状態に細胞を維持するため使用される培地は、適切な分化培地と交換されなければならないことに留意されたい。
実質的Ｔｒｉｖｅｄｉ Ｐ ａｎｄ Ｈｅｍａｔｔｉ Ｐ．Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ．２００８，３６（３）：３５０−９に記載されるように、無感作ＰＳＣの培養物中に形成された線維芽細胞様の分化した細胞の画分を機械的に増加することによって、無感作ＰＳＣからＣＤ７３陽性及びＳＳＥＡ−４陰性である間葉系間質細胞を生成することができる。簡潔には、ｈＥＳＣの分化を誘導するため、培地交換の間隔を３日〜５日まで増加すると、無感作ＰＳＣコロニー周辺の細胞は紡錘形の線維芽細胞様の細胞となる。これらの条件下で９日後〜１０日後、培養物中の約４０％〜５０％の細胞が線維芽細胞様の外観を獲得した際に、無感作ＰＳＣコロニーの未分化部分を物理的に除去し、残りの分化細胞を同じ条件下で新しい培養プレートへと継代する。
無感作ｈＰＳＣのドーパミン（ＤＡ）ニューロンへの分化を誘導するため、細胞を、実質的Ｖａｚｉｎ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２００９ Ａｕｇ １２；４（８）：ｅ６６０６に及びＥｌｋａｂｅｔｚ Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２００８ Ｊａｎｕａｒｙ １５；２２：１５２−１６５に記載されるように、マウス間質細胞株ＰＡ６若しくはＭＳ５と共培養することができ、又は間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２）、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ２）、及びエフリンＢ１（ＥＦＮＢ１）の組合せと共に培養することができる。
中脳ドーパミン（ｍｅｓＤＡ）ニューロンを生成するため、無感作ｈＰＳＣを、本質的にＦｒｉｌｉｎｇ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００９，１０６：７６１３−７６１８に記載される転写因子Ｌｍｘ１ａを発現するように（例えば、ＰＧＫプロモーター及びＬｍｘ１ａを含むレトロウイルスベクターを使用して）遺伝子修飾することができる。
無感作ｈＰＳＣから肺上皮（ＩＩ型肺細胞）を生成するため、無感作ＰＳＣを商業的に入手可能な細胞培養培地（メリーランド州カレッジパークのＳｍａｌｌ Ａｉｒｗａｙ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｃａｍｂｒｅｘ）の存在下で、又は代替的にはＲｉｐｐｏｎ ＨＪ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ａｍ Ｔｈｏｒａｃ Ｓｏｃ． ２００８；５：７１７−７２２に記載される肺細胞（例えばＡ５４９ヒト肺腺がん細胞株）から収集された馴化培地の存在下で培養することができる。
無感作ｈＰＳＣ細胞の神経細胞への分化を誘導するため、多能性幹細胞をＴＧＦ−ｂ阻害剤（ＳＢ４３１５４２、Ｔｏｃｒｉｓ、例えば１０ｎＭ）及びノギン（Ｒ＆Ｄ、例えば５００ｎｇ／ｍｌ）で捕捉された血清置換培地の存在下で約５日間培養することができ、その後、該細胞を、Ｃｈａｍｂｅｒｓ ＳＭ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９，２７：２７５−２８０に実質的に記載される、５００ｎｇ／ｍｌのノギンの存在下で徐々に増量するＮ２培地（例えば、２日毎に２５％、５０％、７５％に変更する）（Ｌｉ ＸＪ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５，２３：２１５−２１）により培養する。
本発明は、その幾つかの実施形態によれば、当該技術分野で既知の任意の分化プロトコルを使用して、本発明の無感作多能性幹細胞から生成された細胞、組織、及び臓器の使用を考慮する。
本発明の幾つかの実施形態教示に従って得られる細胞系列特異的細胞又は細胞株がヒト胚において自然に発生するものと同様の分化プロセスによって発生されることから、それらをヒト細胞に基づく治療法及び組織再生に更に使用することができることが理解される。
したがって、本発明の幾つかの実施形態による発明は、細胞置換療法を必要とする障害の治療に対する、本発明の幾つかの実施形態の拡大された及び／又は分化した細胞系列特異的細胞又は細胞株の使用を予想する。
例えば、ＰＳＣ又はＰＳＣ由来細胞の治療的移植によって治療可能であると現在予測されている疾患として、パーキンソン病、心筋梗塞、若年型糖尿病、及び白血病が挙げられる（Ｇｅａｒｈａｒｔ Ｊ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８，２８２：１０６１；Ｒｏｓｓａｎｔ ａｎｄ Ｎａｇｙ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９９９，１７：２３）。
例えば、オリゴデンドロサイト前駆体を、ミエリン障害の治療に使用することができ（Ｒｅｐａｉｒ ｏｆ ｍｙｅｌｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ：Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｔｏｄａｙ． １９９７．ｐｐ．５５４−５６１）、軟骨細胞又は間葉系細胞を骨及び軟骨の欠損に使用することができ（米国特許第４，６４２，１２０号）、上皮細胞系列の細胞を創傷又は火傷の皮膚再生に使用することができる（米国特許第５，７１６，４１１号）。
特定の遺伝子産物が失われている［例えば、嚢胞性線維症患者のＣＦＴＲ遺伝子産物の喪失（Ｄａｖｉｅｓ ＪＣ， ２００２． Ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｌｕｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｊ． Ｒ． Ｓｏｃ． Ｍｅｄ． ９５ Ｓｕｐｐｌ ４１：５８−６７）］遺伝性障害等の特定の障害に対して、ＰＳＣ由来細胞を、個体への投与に先立って変異遺伝子を過剰発現するように操作されることが好ましい。他の障害に対して、ＰＳＣ由来細胞を特定の遺伝子を排除するように操作しなければならないことがわかる。
遺伝子の過剰発現及び排除をノックイン及び／又はノックアウトのコンストラクトを使用して行うことができる［例えば、Ｆｕｋｕｓｈｉｇｅ，Ｓ．ａｎｄ Ｉｋｅｄａ，Ｊ．Ｅ．：Ｔｒａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｂｙ Ｃｒｅ−ｌｏｘ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．ＤＮＡ Ｒｅｓ ３（１９９６）７３−５０、Ｂｅｄｅｌｌ，Ｍ．Ａ．，Ｊｅｒｋｉｎｓ，Ｎ．Ａ．ａｎｄ Ｃｏｐｅｌａｎｄ，Ｎ．Ｇ．：Ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｐａｒｔ Ｉ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１（１９９７）１−１１、Ｂｅｒｍｉｎｇｈａｍ，Ｊ．Ｊ．，Ｓｃｈｅｒｅｒ，Ｓ．Ｓ．，Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｓ．，Ａｒｒｏｙｏ，Ｅ．，Ｋａｌｌａ，Ｋ．Ａ．，Ｐｏｗｅｌｌ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ｇ．：Ｔｓｔ−１／Ｏｃｔ−６／ＳＣＩＰ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ａ ｕｎｉｑｕｅ ｓｔｅｐ ｉｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｎｏｒｍａｌ ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １０（１９９６）１７５１−６２を参照されたい］。
細胞置換療法に加えて、本発明の幾つかの実施形態の細胞系列特異的細胞を利用してｃＤＮＡライブラリを調製することもできる。上記細胞系列特異的細胞をから標準的な技術によってｍＲＮＡを調製し、更に逆転写してｃＤＮＡを形成する。ｃＤＮＡ調製物を胚性線維芽細胞からのヌクレオチド及び他の望ましくない特異性で減算して当該技術分野で既知の技術によって均等化ｃＤＮＡライブラリを産生することができる。
本発明の幾つかの実施形態の細胞系列特異的細胞を、細胞系列前駆体の最終的に分化した細胞への分化に影響を及ぼす因子（小分子薬物、ペプチド、ポリヌクレオチド等）又は条件（培養条件又は操作等）をスクリーニングするために使用することができる。例えば、成長に影響する物質、毒物、又は可能性のある分化因子を、それらの培養培地への添加によって試験することができる。
本明細書に記載されるように生成される無感作多能性幹細胞を、始原細胞の生成に対する開始材料として使用することができる。
したがって、本発明の幾つかの実施形態の別の態様によれば、霊長類無感作多能性幹細胞を始原生殖細胞へと誘導することができる選択された培養培地中で霊長類無感作多能性幹細胞を培養することを含む、始原生殖細胞を生成する方法が提供される。
特定の実施形態によれば、培養培地はＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤と、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、霊長類無感作多能性幹細胞は、
非メチル化Ｘ不活性特異的転写産物（ＸＩＳＴ）遺伝子を含み、
（ｉ）無感作ＰＳＣが雌性ＰＳＣである場合、無感作雌性ＰＳＣはＸＩＳＴ遺伝子のプロモーターの２つの非メチル化アレルを有し、
（ｉｉ）無感作ＰＳＣが雄性ＰＳＣである場合、無感作雄性ＰＳＣは前記ＸＩＳＴ遺伝子のプロモーターの１つの非メチル化アレルを有し、及び／又は
転写因子Ｅ３（ＴＦＥ３）の発現レベルが、免疫染色アッセイによって特定される１以上である、細胞質に対する核の発現比率を特徴とする。
本発明の幾つかの実施形態によれば、始原生殖細胞はＣＤ６１（インテグリンベータ３）陽性発現パターンを特徴とする。
本発明の幾つかの実施形態によれば、始原生殖細胞は、ＣＤ６１＋／ＳＳＥＡ４＋発現パターン（発現サイン）を特徴とする。
本発明の幾つかの実施形態によれば、霊長類無感作多能性幹細胞を始原生殖細胞へと誘導することができる選択される上記培養培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、及び上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、本発明の幾つかの実施形態の方法によって生成された霊長類始原生殖細胞を含む霊長類始原生殖細胞の単離集団が提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約９０％、例えば少なくとも約９５％、例えば少なくとも約９９％、例えば１００％のＣＤ６１＋／ＳＳＥＡ４＋発現パターンを特徴とする始原生殖細胞を含む。
本発明の幾つかの実施形態の始原生殖細胞（ＰＧＣ）の単離集団は、精子又は卵子の成熟及び生成を完了するため成人ヒト精巣又は卵巣に注入可能であることに留意されたい。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の始原生殖細胞を被験体の生殖腺組織に投与することにより、それを必要とする被験体を治療することを含む、治療を必要とする被験体における治療方法が提供される。
「被験体」の用語は、哺乳動物、例えば霊長類、好ましくは病状を患う任意の年齢のヒトを指す。
「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」の用語は病状（疾患、障害、又は状態）の発症を阻害すること、予防すること、若しくは停止すること、及び／又は病状の低減、寛解、又は退縮をもたらすことを指す。当業者は、様々な方法論及びアッセイを使用して病状の発症の査定を行うことができ、同様に、様々な方法論及びアッセイを使用して病状の低減、寛解、又は退縮を査定してもよい。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記被験体は不妊を患う。
本発明の幾つかの実施形態の実施形態の態様によれば、本発明の幾つかの実施形態の霊長類始原生殖細胞と、不妊治療用の医薬とを備えるキットが提供される。
また、上記キットは、適切なバッファー及びキットの貯蔵寿命を改善する防腐剤を含んでもよい。
上記キットは、使用に関する適切な指示書、及び被験体の不妊治療等の被験体の治療における使用に対するＦＤＡ承認を示すラベルを含んでもよい。
本発明の幾つかの実施形態の単離された無感作多能性幹細胞を、キメラヒト−マウス生物の生成に使用してもよく、他にも記載されるように（参照により本明細書に完全に援用されるＧａｆｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２０１３；Ｄｅｃ １２；５０４（７４７９）：２８２−６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２７４５．Ｅｐｕｂ ２０１３ Ｏｃｔ ３０）ｉｎ ｖｉｖｏでのマウス胚の発生を補助するために使用してもよい。
本発明者らは、（例えば、本発明の幾つかの実施形態の単離された無感作多能性幹細胞、プライムＰＳＣ、又は本発明の幾つかの実施形態の始原生殖細胞の）ドナー細胞の特定の遺伝子修飾（複数の場合がある）は、キメラ動物の生成効率を改善し得ることを明らかにした。ドナー細胞における、例えば、Ｃ−ＭＹＣ、Ｎ−ＭＹＣ、Ｌ−ＭＹＣ、ＥＤＡＲ（エクトジスプラシンＡ受容体）、ＭＤＭ２、及びＥＲＡＳからなる群から選択される発がんタンパク質の過剰発現、及び／又はＰ５３及びＮＦカッパーＢ阻害剤アルファからなる群から選択される腫瘍抑制タンパク質の下方制御は、キメラマウスの生成を改善し得る。
したがって、本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、Ｃ−ＭＹＣ、Ｎ−ＭＹＣ、Ｌ−ＭＹＣ、ＥＤＡＲ（エクトジスプラシンＡ受容体）、ＭＤＭ２、及びＥＲＡＳからなる群から選択される発がんタンパク質を過剰発現するように、及び／又はＰ５３及びＮＦカッパーＢ阻害剤アルファからなる群から選択される腫瘍抑制タンパク質を下方制御させるように遺伝子修飾された単離された無感作多能性幹細胞が提供される。
例えば、実施例８に記載され、図２４Ａに示されるように、本発明者らは、マウス桑実胚（宿主細胞として使用される）へのＬＩＳ ３８ ＥＧＦＰ ｈＴＰ５３ Ｃ２無感作ヒトｉＰＳ細胞（ヒトドナー細胞として使用されていた）のマイクロインジェクションによって異種間キメラヒト化マウスを生成することができた。
発がん遺伝子タンパク質の過剰発現は、細胞において発がん遺伝子の内因性発現を上方制御することによって（例えば、プロモーター及び／又はエンハンサー因子の付加及び／又は置換、及び／又発がん遺伝子の内因性発現を増す分子、例えば小分子の導入）、及び／又は以下に更に説明される核酸コンストラクト（又は発現ベクター）を使用して以下に記載される発がんタンパク質（複数の場合がある）の少なくとも機能性部分をコードする異種性ポリヌクレオチドの発現によって行われ得る。
本明細書で使用される「Ｃ−ＭＹＣ」（ＭＲＴＬ、ＭＹＣＣ、ｃ−Ｍｙｃ、ｂＨＬＨｅ３９としても知られる）の用語は、ホモサピエンス由来の発がん性タンパク質ｖ−ｍｙｃトリ骨髄球しゅ症ウイルス発がん遺伝子ホモログ（遺伝子ＩＤ４６０９）、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２４５８．２（配列番号２０４）に示されるタンパク質を指す。ｃ−ＭＹＣの過剰発現を、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＧ＿００７１６１．１（配列番号２１３）に示される核酸配列、又はその機能性部分、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２４５８．２（配列番号２０４）のアミノ酸１〜４５４をコードする核酸配列を含む異種性ポリヌクレオチドの発現によって行うことができる。
本明細書で使用される「Ｎ−ＭＹＣ」（ＭＹＣＮ、ＮＭＹＣ、ＯＤＥＤ、ＭＯＤＥＤ、Ｎ−ｍｙｃ、ｂＨＬＨｅ３７としても知られる）の用語は、ホモサピエンス由来の発がん性タンパク質ｖ−ｍｙｃトリ骨髄球しゅ症ウイルス発がん遺伝子神経芽細胞種由来ホモログ（遺伝子ＩＤ４６１３）、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１２８０１５７．１（配列番号２０５）によって示されるタンパク質を指す。Ｎ−ＭＹＣの過剰発現は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＧ＿００７４５７．１（配列番号２１４）によって示される核酸配列、又はその機能性部分、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１２８０１５７．１（配列番号２０５）のアミノ酸１〜４６４をコードする核酸配列を含む異種性ポリヌクレオチドの発現によって行われ得る。
本明細書で使用される「Ｌ−ＭＹＣ」（ＬＭＹＣ、Ｌ−Ｍｙｃ、ＭＹＣＬ１、ｂＨＬＨｅ３８としても知られる）の用語は、ホモサピエンスに由来する発がん性タンパク質ｖ−ｍｙｃトリ骨髄球しゅ症ウイルス発がん遺伝子肺がん由来ホモログ、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１０２８２５３．１アイソフォーム１（配列番号２０６）によって示されるタンパク質を指す。Ｌ−ＭＹＣの過剰発現は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１０３３０８１．２（配列番号２１５）に示される核酸配列、又はその機能性部分、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１０２８２５３．１アイソフォーム１（配列番号２０６）のアミノ酸１〜３６５をコードする核酸を含む異種性ポリヌクレオチドの発現によって行われ得る。
本明細書で使用される「ＥＤＡＲ」（ＤＬ、ＥＤ３、ＥＤ５、ＥＤ１Ｒ、ＥＤＡ３、ＨＲＭ１、ＥＤＡ１Ｒ、ＥＣＴＤ１０Ａ、ＥＣＴＤ１０Ｂ、ＥＤＡ−Ａ１Ｒとしても知られる）の用語は、ホモサピエンスに由来する発がんタンパク質エクトジスプラシンＡ受容体（遺伝子ＩＤ１０９１３）、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０７１７３１．１（配列番号２０７）によって示されるタンパク質を指す。ＥＤＡＲの過剰発現は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＧ＿００８２５７．１（配列番号２１６）によって示される核酸配列、又はその機能性部分、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０７１７３１．１（配列番号２０７）のアミノ酸１〜４８４をコードする核酸配列を含む異種性ポリヌクレオチドの発現によって行われ得る。
本明細書で使用される「ＭＤＭ２」（ＨＤＭＸ、ｈｄｍ２、ＡＣＴＦＳとしても知られる）の用語は、がん原遺伝子である、ホモサピエンスに由来するＥ３ユビキチンタンパク質リガーゼ（遺伝子ＩＤ４１９３、ＧｅｎＢａｎｋ：ＧＱ８４８１９６．１）、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣＸ３１１５６．１（配列番号２０８）によって示されるタンパク質を指す。ＭＤＭ２の過剰発現は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＱ８４８１９６．１（配列番号２１７）によって示される核酸配列、又はその機能性部分、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣＸ３１１５６．１（配列番号２０８）のアミノ酸１〜４６６をコードする核酸配列を含む異種性ポリヌクレオチドの発現によって行われ得る。
本明細書で使用される「ＥＲＡＳ」（ＨＲＡＳ２、ＨＲＡＳＰとしても知られる）の用語は、ホモサピエンス遺伝子ＩＤ３２６６に由来するＥＳ細胞発現ＲＡＳ、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿８５３５１０．１（配列番号２０９）に示されるタンパク質を指す。ＥＲＡＳの過剰発現は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１８１５３２．３（配列番号２１８）によって示される核酸配列、又はその機能性部分、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿８５３５１０．１（配列番号２０９）のアミノ酸１〜２３３をコードする核酸配列を含む異種性ポリヌクレオチドの発現によって行われ得る。
腫瘍抑制タンパク質の下方制御は、様々な様式によって達成され得る。
本明細書で使用される「Ｐ５３」（ＴＰ５３、ＢＣＣ７、ＬＦＳ１、ＴＲＰ５３としても知られる）の用語は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＣ１６７９９．１（配列番号２１０）に示されるような腫瘍タンパク質Ｐ５３（遺伝子ＩＤ７１５７）を指す。
本明細書で使用される「ＮＦカッパーＢ阻害剤アルファ」（ＮＦＫＢＩＡ、ＩＫＢＡ、ＭＡＤ−３、ＮＦＫＢＩとしても知られる）の用語は、ホモサピエンス（遺伝子ＩＤ４７９２）由来のＢ細胞阻害剤アルファにおけるカッパー軽ポリペプチド遺伝子エンハンサーの核因子、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０６５３９０．１（配列番号２１１）に示されるタンパク質を指す。
本発明の幾つかの実施形態の腫瘍抑制タンパク質（例えば、Ｐ５３及び／又はＮＦカッパーＢ阻害剤アルファ）の下方制御は、転写及び／又は翻訳を干渉する様々な分子を使用して遺伝子レベル及び／又は転写産物レベルに対してなされ得る［例えば、ＲＮＡサイレンシング剤（例えば、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）、リボザイム及びＤＮＡザイム、又はドミナントネガティブ変異体の使用］。下方制御は、タンパク質産生の完全な不在、及び／又はタンパク質活性の完全な阻害であってもよく、又はタンパク質産生及び／又はタンパク質活性の部分的な阻害であってもよいことに留意されたい。さらに、下方制御は、下方制御が起こる細胞及び下方制御の目的において、及び／又は細胞若しくは生成されたキメラ動物に対する腫瘍抑制タンパク質の下方制御の効果に対して、永続的であってもよく、一過性であってもよいことに留意されたい。下方制御剤の説明を以下に提示する。
Ｐ５３ドミナントネガティブ変異体は、野生型のマウス又はヒトｐ５３との混合テトラマーを形成することによってドミナントネガティブ様式で内因性ｐ５３活性を抑制し、そのようにしてその標的遺伝子におけるｐ５３応答配列へのｐ５３の結合を減少する、変異型のマウス又はヒトｐ５３タンパク質として説明される（ｄｅ Ｖｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９（５）：２９４８−５３、Ｗｉｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００４（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２３，２３３０−２３３８に記載され、各々、その全体が参照により本明細書に完全に援用される）。
本発明の幾つかの実施形態の細胞においてＰ５３を下方制御させるために使用され得る、Ｐ５３ドミナントネガティブ変異体の非限定的な例として、以下が挙げられる。
Ａ）実質的にｄｅ Ｖｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００２（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９（５）：２９４８−５３）；Ｗｉｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００４（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２３，２３３０−２３３８）に記載され、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ３９８８３．１（配列番号２１２）によって示されるマウスＰ５３タンパク質におけるＲ１７２Ｈドミナントネガティブ変異体。遺伝子変異に対する受け入られている命名法によれば、「Ｒ１７２Ｈ」はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ３９８８３．１（配列番号２１２）に示される１７２位の「Ｒ」アミノ酸（すなわちアルギニン）の「Ｈ」アミノ酸（すなわちヒスチジン）による置換を指す。
Ｂ）実質的にＰｅｔｉｔｊｅａｎ Ａ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ．２００７ Ｊｕｎ；２８（６）：６２２−９．”Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ｐ５３ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｎ ＴＰ５３ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ： ｌｅｓｓｏｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ＩＡＲＣ ＴＰ５３ ｄａｔａｂａｓｅ“、及びＦｒｅｅｄ−Ｐａｓｔｏｒ ＷＡ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｅ ｃｏｍｍｅｎｔ ｉｎ ＰｕｂＭｅｄ Ｃｏｍｍｏｎｓ ｂｅｌｏｗ Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２０１２ Ｊｕｎ １５；２６（１２）：１２６８−８６．“Ｍｕｔａｎｔ ｐ５３：ｏｎｅ ｎａｍｅ，ｍａｎｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”）に記載され、各々、その全体が本明細書に完全に援用される、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＣ１６７９９．１（配列番号２１０）によって示されるヒトＰ５３タンパク質におけるＲ１７５Ｈ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２４８Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｒ２７３Ｈ、又はＲ２８２Ｗのドミナントネガティブ変異体。
発がん遺伝子のように作用し、Ｐ５３機能を阻害するＮＦカッパーＢ阻害剤アルファのドミナントネガティブ変異体は、Ｓ３２及びＳ３６の両方のアミノ酸残基をＤ（アスパラギン酸−Ａｓｐ）又はＥ（グルタミン酸−Ｇｌｕ）のいずれかに変更することによって作製された（Ｚｈｏｕ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２００３．“Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｄｏｍｉｎａｎｔ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｕｔａｎｔ ＮＦ−ｋＢ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ （ＩｋＢｍ）ｒｅｐｒｅｓｓｅｓ ｐ５３−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ：ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＩｋＢｍ ａｎｄ ｐ５３．“Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２２（５０）：８１３７−４４）。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の細胞においてＮＦカッパーＢ阻害剤アルファを下方制御するために使用され得る、ＮＦカッパーＢ阻害剤アルファドミナントネガティブ変異体は、配列番号２１１に示されるヒトＮＦカッパーＢ阻害剤アルファタンパク質においてＳ３２Ｄ、及びＳ３６Ｄの突然変異を含む［３２位の「Ｓ」（セリン）アミノ酸の「Ｄ」（グルタミン酸）アミノ酸による置換、及び３６位の「Ｓ」の「Ｄ」による置換を意味する］。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の細胞においてＮＦカッパーＢ阻害剤アルファを下方制御するために使用され得る、ＮＦカッパーＢ阻害剤アルファドミナントネガティブ変異体は、配列番号２１１に示されるヒトＮＦカッパーＢ阻害剤アルファタンパク質においてＳ３２Ｅ、及びＳ３６Ｅの突然変異を含む［３２位の「Ｓ」（セリン）アミノ酸の「Ｅ」（グルタミン酸）による置換、及び３６位の「Ｓ」の「Ｅ」による置換を意味する］。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の細胞においてＮＦカッパーＢ阻害剤アルファを下方制御するために使用され得る、ＮＦカッパーＢ阻害剤アルファドミナントネガティブ変異体は、配列番号２１１に示されるヒトＮＦカッパーＢ阻害剤アルファタンパク質においてＳ３２Ｄ、及びＳ３６Ｅの突然変異を含む［３２位の「Ｓ」（セリン）アミノ酸の「Ｄ」（アスパラギン酸）アミノ酸による置換、及び３６位の「Ｓ」（セリン）の「Ｅ」（グルタミン酸）による置換を意味する］。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の細胞においてＮＦカッパーＢ阻害剤アルファを下方制御するために使用され得る、ＮＦカッパーＢ阻害剤アルファドミナントネガティブ変異体は、配列番号２１１に示されるヒトＮＦカッパーＢ阻害剤アルファタンパク質においてＳ３２Ｅ、及びＳ３６Ｄの突然変異を含む［３２位の「Ｓ」（セリン）アミノ酸の「Ｅ」（グルタミン酸）アミノ酸による置換、及び３６位の「Ｓ」（セリン）の「Ｄ」（アスパラギン酸）による置換を意味する］。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の遺伝種修飾された単離された無感作多能性幹細胞は、以下を特徴とする。
（ｉ）無感作ＰＳＣが雌性ＰＳＣである場合、無感作雌性ＰＳＣがＸ不活性特異的転写産物（ＸＩＳＴ）遺伝子のプロモーターの２つの非メチル化アレルを有し、及び
（ｉｉ）無感作ＰＳＣが雄性ＰＳＣである場合、無感作雄性ＰＳＣがＸＩＳＴ遺伝子のプロモーターの１つの非メチル化アレルを有し、及び／又は
無感作ＰＳＣにおける転写因子Ｅ３（ＴＦＥ３）の発現レベルが、免疫染色アッセイによって特定される１以上である細胞質に対する核の発現比率を特徴とし、及び／又は
無感作ＰＳＣが該無感作ＰＳＣの細胞表面上でのＣ−ＫＩＴ（ＣＤ１１７）の陽性発現を特徴とする。
本発明の幾つかの実施形態によれば、遺伝子修飾された無感作多能性幹細胞は霊長類細胞である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、遺伝子修飾された無感作多能性幹細胞はヒト細胞である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の単離された無感作多能性幹細胞、又は本発明の幾つかの実施形態の始原生殖細胞を宿主動物の胚に導入してキメラ動物を生成することを含む、キメラ動物を生成する方法が提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、キメラ動物の生成に使用される単離された無感作多能性幹細胞は、Ｃ−ＭＹＣ、Ｎ−ＭＹＣ、Ｌ−ＭＹＣ、ＥＤＡＲ（エクトジスプラシンＡ受容体）、ＭＤＭ２、及びＥＲＡＳからなる群から選択される発がん遺伝子を過剰発現するように、及び／又はＰ５３及びＮＦカッパーＢ阻害剤アルファからなる群から選択される腫瘍抑制タンパク質を下方制御するように遺伝子修飾される。
本明細書で使用される「キメラ動物」の文言は、少なくとも２つの遺伝学的に明確に異なる個体の細胞を含む動物を指す。
キメラ動物は、２つの異なる種、又は同じ種に属する２つの異なる個体の細胞で構成され得ることに留意されたい。
本発明の幾つかの実施形態によれば、単離された無感作多能性幹細胞、又は始原生殖細胞は宿主動物に対して同種異系である。
本明細書で使用される「同種異系」の用語は、同じ種の少なくとも２つの遺伝学的に異なる個体を指す。
本発明の幾つかの実施形態によれば、単離された無感作多能性幹細胞又は始原生殖細胞は、宿主動物に対して異種である。
本明細書で使用される「異種」の用語は、異なる種の少なくとも２つの個体を指す。
本発明の幾つかの実施形態によれば、宿主細胞は霊長類、例えば哺乳動物である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、宿主動物はマウスである。
本発明の幾つかの実施形態によれば、宿主動物はブタである。
本発明の幾つかの実施形態によれば、宿主動物はサルである。
本発明の幾つかの実施形態によれば、宿主動物はチンパンジーである。
本発明の幾つかの実施形態によれば、宿主動物は非ヒトである。
本発明の幾つかの実施形態によれば、胚は着床前胚である。
本明細書で使用される「着床前胚」の用語は、８細胞期、１６細胞期、初期桑実胚、後期桑実胚、初期胚盤胞、及び／又は後期胚盤胞の胚を指す。
単離された無感作多能性幹細胞、又は始原生殖細胞は着床前胚に導入されることから、それらは正常な胚を形成する可能性があることに留意されたい。
本発明の幾つかの実施形態によれば、着床前胚は少なくとも４個の細胞を含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、着床前胚は１２８個以下の細胞を含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、宿主動物へのドナー細胞の導入はｉｎ ｖｉｖｏで行われる。
動物の桑実胚への細胞のｉｎ ｖｉｖｏ投与の方法は、Ｇａｆｎｉ Ｏ，Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ Ｌ，Ｍａｎｓｏｕｒ ＡＡ，Ｍａｎｏｒ ＹＳ，Ｃｈｏｍｓｋｙ Ｅ，Ｂｅｎ−Ｙｏｓｅｆ Ｄ，Ｋａｌｍａ Ｙ，Ｖｉｕｋｏｖ Ｓ，Ｍａｚａ Ｉ，Ｚｖｉｒａｎ Ａ，Ｒａｉｓ Ｙ，Ｓｈｉｐｏｎｙ Ｚ，Ｍｕｋａｍｅｌ Ｚ，Ｋｒｕｐａｌｎｉｋ Ｖ，Ｚｅｒｂｉｂ Ｍ，Ｇｅｕｌａ Ｓ，Ｃａｓｐｉ Ｉ，Ｓｃｈｎｅｉｒ Ｄ，Ｓｈｗａｒｔｚ Ｔ，Ｇｉｌａｄ Ｓ，Ａｍａｎｎ−Ｚａｌｃｅｎｓｔｅｉｎ Ｄ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｓ，Ａｍｉｔ Ｉ，Ｔａｎａｙ Ａ，Ｍａｓｓａｒｗａ Ｒ，Ｎｏｖｅｒｓｈｔｅｒｎ Ｎ，Ｈａｎｎａ ＪＨ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１３ Ｄｅｃ １２；５０４（７４７９）：２８２−６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２７４５．Ｅｐｕｂ ２０１３ Ｏｃｔ ３０．、及びＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｂｙ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ；Ｍａｒｉｎａ Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ；Ｋｒｉｓｔｉｎａ Ｖｉｎｔｅｒｓｔｅｎ Ｎａｇｙ；Ａｎｄｒａｓ Ｎａｇｙのように当該技術分野でよく知られており、それらの各々が参照により本明細書に完全に援用される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、宿主動物の胚へのドナー細胞（例えば、本発明の幾つかの実施形態の単離された無感作多能性幹細胞、又は本発明の幾つかの実施形態の始原生殖細胞）の導入は、宿主の初期の着床前胚へのドナー細胞のマイクロインジェクションによって行われる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、桑実胚は少なくとも４個の細胞を含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、桑実胚は、１２８個以下の細胞を含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記導入はｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで行われる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記細胞を導入することは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏでの発生している宿主胚の直接的な注入又はそれとの凝集によって行われる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、宿主動物の胚にドナー細胞（例えば、本発明の幾つかの実施形態の単離された無感作多能性幹細胞、又は本発明の幾つかの実施形態の始原生殖細胞）を導入することは、ドナー細胞と宿主の着床前胚の（例えば、数時間、又は一晩に亘る）凝集によって行われる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記方法は、着床前胚をｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで生育させることを更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記方法は、キメラ動物におけるキメラ化レベルを試験することを更に含む。
一旦形成されると、キメラ動物におけるキメラ化レベルを、宿主細胞内のドナー細胞を追う様々な手段により評価することができる。これは、例えば、蛍光顕微鏡を使用して調べることができる、蛍光タンパク質［例えば、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ（配列番号２２２（ＤＮＡに対して）及び配列番号２２１（タンパク質に対して））、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（配列番号２２０（ＤＮＡに対して）、及び配列番号２１９（タンパク質に対して）等、それらの配列はよく知られており、ＮＣＢＩウェブサイト（ｎｃｂｉ（ｄｏｔ）ｎｌｍ（ｄｏｔ）ｎｉｈ（ｄｏｔ）ｇｏｖ）より入手可能である］を発現する等の（それらの宿主細胞への導入に先立って）ドナー細胞を追跡可能な標識（レポータータンパク質）を発現するように遺伝子修飾することにより達成され得る。本明細書の図２４Ａ〜図２４Ｂを参照されたい。
本明細書で使用される、目的のタンパク質（例えば、蛍光タンパク質）を発現するように細胞を遺伝子修飾する方法は当該技術分野で知られており、以下に更に説明される。
したがって、キメラ動物の生成効率を容易に評価することができる。簡潔には、宿主動物にドナー細胞を導入した後、蛍光顕微鏡を使用して胚の発生を調べ、注入された胚の総数のうちの蛍光標識された胚を数える。
さらに、各胚において、ドナー細胞の数（例えば、ＧＰＦによって標識化される）を各キメラ動物１匹当たりについて計数する。
（ドミナントネガティブＰ５３によって）下方制御されたＰ５３と共に本発明の幾つかの実施形態の遺伝子修飾された無感作ＰＳＣを使用することにより、本発明者らは、少なくとも２０％の成功率でキメラ動物を得ることができ、ここで、各キメラ動物におけるドナー細胞の平均割合が約１０％〜約４９％であった（図２４Ａ〜図２４Ｂ及びデータは示されていない）。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の単離された遺伝子修飾された無感作多能性幹細胞と、培養培地とを含む細胞培養物が提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、少なくとも５継代、例えば少なくとも約１０継代、１５継代、２０継代、２５継代、３０継代、４０継代、５０継代、１００継代、２００継代、５００継代、１０００継代、例えば３０００継代に亘って前記多能性幹細胞を無感作状態に維持することができる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の細胞培養物に含まれる培養培地は、本明細書に記載されるいずれかの培養培地である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の細胞培養物に含まれる培養培地は、本発明の幾つかの実施形態の培養培地である。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の細胞培養物に含まれる培養培地は培養培地１〜１４７のいずれかである。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の細胞培養物に含まれる培養培地は、その全体が参照により本明細書に完全に援用される、国際公開第２０１４／１７４４７０号に記載される培養培地のいずれかである。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の細胞培養物に含まれる培養培地は、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＳＴＡＴ３活性化剤と、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦβ１）、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＮＯＴＣＨ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の細胞培養物に含まれる培養培地は、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＳＴＡＴ３活性化剤とトランスフォーミング増殖因子受容体（ＴＧＦＲ）阻害剤、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）阻害剤、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＮＯＴＣＨ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＳＴＡＴ３活性化剤は白血病抑制因子（ＬＩＦ）、及びインターロイキン６（ＩＬ６）からなる群から選択される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）、インスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦＩＩ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達阻害剤、ソニックヘッジホッグ経路（ＳＨＨ）阻害剤、ＥＲＫ５阻害剤、フォルスコリン、ケンパウロン、ＢａｙＫ８６４４、Ｂｉｘ０１２９４、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）からなる群から選択される少なくとも１つの追加の薬剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）、インスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦＩＩ）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、ソニックヘッジホッグ経路（ＳＨＨ）阻害剤、ＥＲＫ５阻害剤、フォルスコリン、ケンパウロン、ＢａｙＫ８６４４、Ｂｉｘ０１２９４、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）からなる群から選択される少なくとも１つの追加の薬剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＳＴＡＴ３活性化剤はＬＩＦを含み、少なくとも１つの薬剤はＰＫＣ阻害剤を含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＳＴＡＴ３活性化剤はＬＩＦを含み、少なくとも１つの薬剤はＴＧＦβ１及びタンパク質キナーゼＣ阻害剤を含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地はＦＧＦＲ阻害剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、ＴＧＦＲ阻害剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＳＴＡＴ３活性化剤はＬＩＦを含み、少なくとも１つの薬剤はＴＧＦβ１及びタンパク質キナーゼＣ阻害剤を含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地はＦＧＦＲ阻害剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＳＴＡＴ３活性化剤はＬＩＦを含み、少なくとも１つの薬剤はｂＦＧＦ及びＴＧＦβ１を含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地はＲＯＣＫ阻害剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地はタンパク質キナーゼＣ阻害剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＳＴＡＴ３活性化剤はＬＩＦを含み、少なくとも１つの薬剤はｂＦＧＦと、ＲＯＣＫ阻害剤と、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤と、ＮＯＴＣＨ阻害剤と、トランスフォーミング増殖因子受容体（ＴＧＦＲ）阻害剤とを含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地はソニックヘッジホッグ経路（ＳＨＨ）阻害剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＳＴＡＴ３活性化剤はＬＩＦを含み、少なくとも１つの薬剤はＮＯＴＣＨ阻害剤、及び線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）阻害剤を含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記培養培地は、インスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦＩＩ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、及びトランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦβ１）からなる群から選択される薬剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、白血病抑制因子（ＬＩＦ）と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３ｂ阻害剤と、ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、タンパク質キナーゼＣ阻害剤とを含む培養培地が提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の培養培地はＦＧＦＲ阻害剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の培養培地はＴＧＦＲ阻害剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、白血病抑制因子（ＬＩＦ）と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３ｂ阻害剤と、ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、タンパク質キナーゼＣ阻害剤とを含む培養培地が提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の培養培地はＦＧＦＲ阻害剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、白血病抑制因子（ＬＩＦ）と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３ｂ阻害剤と、ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）と、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦβ１）とを含む培養培地が提供される。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の培養培地はＲＯＣＫ阻害剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の培養培地はタンパク質キナーゼＣ阻害剤を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の培養培地は、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、ＩＧＦ１、ＩＧＦＩＩ、フォルスコリン、ＦＧＦＲ阻害剤、ＴＧＦＲ阻害剤、ケンパウロン、ＢａｙＫ８６４４、Ｂｉｘ０１２９４、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）からなる群から選択される因子を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の培養培地はＢＭＰ受容体Ｉ型（ＡＬＫ２、３、６）阻害剤を更に含んでいる。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の培養培地はアスコルビン酸を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の培養培地はオレイン酸を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の培養培地はリノレン酸を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態培養培地は、ピペコリン酸を更に含む。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態培養培地は、動物血清を欠く。
本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態の培養培地は、血清代替物を更に含む。
一旦キメラ動物が形成され、生育されると、キメラ動物の細胞を細胞療法に使用可能であることに留意されたい。例えば、本発明の幾つかの実施形態に基づいてキメラ動物において生成された成熟した分化細胞（例えば、造血幹細胞、肝臓肝細胞、インスリン酸性ベータ細胞）を成人ヒトにおける移植又はバイオメディカル用途に使用することができる。
したがって、本発明の幾つかの実施形態によれば、本発明の幾つかの実施形態のキメラ動物から分化した細胞、細胞系列、組織、又は臓器を単離する方法が提供される。
かかる分化した細胞、組織又は臓器を単離する方法は、当該技術分野でよく知られており、上に記載される。
したがって、キメラ動物を形成するため使用された無感作ＰＳＣがヒト細胞である場合、これらの細胞は形成されたキメラ動物からさらに単離可能であり、ヒト被験体の治療に使用され得る。
本発明の幾つかの実施形態によれば、上記方法は、ヒト由来（ヒト起源）細胞又は組織をキメラ動物から単離することを更に含む。
かかるヒト起源細胞、組織、又は臓器の使用の非限定的な例として、細胞療法、組織補填、臓器又は組織の移植が挙げられる。
以下は、細胞において目的のポリペプチド（例えば、ＯＣＴ４、ｃ−ＭＹＣ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、ＴＧＦβ１の上に記載されるいずれかのタンパク質、Ｃ−ＭＹＣ、Ｎ−ＭＹＣ、Ｌ−ＭＹＣ、ＥＤＡＲ（エクトジスプラシンＡ受容体）、ＭＤＭ２、及びＥＲＡＳ等の発がん性タンパク質、ＧＦＰ又はＲＦＰ等のレポータータンパク質）を発現するため使用され得る発現ベクター及びその投与様式の非限定的な説明である。
哺乳動物細胞において外因性タンパク質を発現するため、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、哺乳動物細胞の発現に適した核酸コンストラクトに結合されていることが好ましい。かかる核酸コンストラクトは、構成的で誘導可能な方式で細胞においてポリヌクレオチド配列の転写を制御するためのプロモーター配列を含む。
本発明の幾つかの実施形態の核酸コンストラクト（本明細書では「発現ベクター」とも呼ぶ）は、このベクターを原核生物、真核生物、又は好ましくは両方（例えば、シャトルベクター）における複製及び統合に適するように、追加の配列を含む。さらに、典型的なクローニングベクターは、転写及び翻訳の開始配列、転写及び翻訳のターミネーター、並びにポリアデニル化シグナルも含む場合がある。例として、かかるコンストラクトは、典型的には、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、二本鎖ＤＮＡ合成の起点、及び３’ＬＴＲ又はそれらの一部を含む。
本発明の幾つかの実施形態の核酸コンストラクトは、典型的には、それが入れられる宿主細胞からペプチドの分泌のためのシグナル配列を含む。この目的に対するシグナル配列は、哺乳動物シグナル配列、又は本発明の幾つかの実施形態のポリペプチドバリアントのシグナル配列であることが好ましい。
真核生物のプロモーターは、典型的には、２種類の認識配列、すなわちＴＡＴＡボックス及び上流プロモーターエレメントを含む。転写開始部位の２５塩基対〜３０塩基対上流に位置するＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡ合成を開始するためＲＮＡポリメラーゼの制御に関与すると考えられる。他の上流プロモーターエレメントは、転写が開始される速度を決定する。
エンハンサーエレメントは、連結される相同又は異種のプロモーターから最大１０００倍まで転写を賦活することができる。エンハンサーは、転写開始部位から下流又は上流に入れられた場合に活性である。多くのウイルス由来のエンハンサーエレメントは、幅広い宿主範囲を有し、様々な組織で活性である。例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサーは、多くの細胞型に適している。本発明の幾つかの実施形態に適した他のエンハンサー／プロモーターの組合せとして、ポリオーマウイルスに由来するもの、ヒト若しくはネズミ科のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、マウス白血病ウイルス、マウス若しくはラウス肉腫ウイルス、及びＨＩＶ等の様々なレトロウイルス由来の長い末端反復が挙げられる。参照により本明細書に援用されるＥｎｈａｎｃｅｒｓ ａｎｄ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８３を参照されたい。
発現ベクターの構築において、プロモーターは、その天然の状況での翻訳開始部位からとほぼ同じ、異種性の翻訳開始部位からの距離に位置していることが好ましい。しかしながら、当該技術分野で知られるように、この距離の幾つかの変化はプロモーター機能を喪失することなく適応され得る。
また、ｍＲＮＡ翻訳効率を高めるためポリアデニル化配列を発現ベクターに付加することができる。２つの明確に異なる配列因子、すなわちポリアデニル化部位から下流に位置するＧＵ又はＵに富む配列、及び上流の１１〜３０ヌクレオチドに位置する高度に保存された６個のヌクレオチドＡＡＵＡＡＡの配列が正確で効率的なポリアデニル化に必要である。本発明の幾つかの実施形態に適した停止シグナル及びポリアデニル化シグナルとしてＳＶ４０由来のものが挙げられる。
既に記載されたエレメントに加えて、本発明の幾つかの実施形態の発現ベクターは、典型的にはクローニングされた核酸の発現レベルを増すこと、又は組換えＤＮＡを有する細胞の同定を容易にすることが意図される他の特殊なエレメントを含んでもよい。例えば、幾つかの動物ウイルスは、寛容な細胞型においてウイルスゲノムの染色体外の複製を促進するＤＮＡ配列を含む。これらのウイルスのレプリコンを持つプラスミドは、プラスミド上で又は宿主細胞のゲノムのいずれかによって運ばれる遺伝子によって適切な因子が提供される限り、エピソーム的に複製される。
上記ベクーは、真核生物のレプリコンを含んでもよく、含まなくてもよい。真核生物のレプリコンが存在する場合であれば、ベクターは適切な選択可能なマーカーを使用して真核生物において増幅可能である。ベクターが真核生物のレプリコンを含まない場合、エピソームの増幅は不可能である。代わりに、組換えＤＮＡが、プロモーターが所望の核酸の発現を制御する、操作された細胞のゲノムへと統合する。
本発明の幾つかの実施形態の発現ベクターは、例えば、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）及びプロモーターキメラポリペプチドのゲノム統合に対する配列等の単一のｍＲＮＡからの幾つかのタンパク質翻訳を可能とする追加のポリヌクレオチド配列を更に含むことができる。
上記発現ベクターに含まれる個々のエレメントは、様々な配置で配列され得ることが理解される。例えば、エンハンサーエレメント、プロモーター等、及び目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列（複数の場合がある）であっても、「ヘッドトゥーテール」の配置で配列可能であり、逆方向の相補鎖（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）として存在する場合があり、又は逆平行鎖として相補的配置で配列され得る。かかる様々な配置は発現ベクターの非コーディングエレメントと共に生じる可能性がある一方、発現ベクター内のコーディング配列の選択的配置もまた想定される。
哺乳動物の発現ベクターに対する例として、限定されないが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１、Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能なｐＣＩ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅから入手可能なｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、及びｐＢＫ−ＣＭＶ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能なｐＴＲＥＳ、並びにそれらの誘導体が挙げられる。
また、レトロウイルスベクター等の真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含む発現ベクターも使用することができる。ＳＶ４０ベクターはｐＳＶＴ７及びｐＭＴ２を含む。ウシパピローマウイルス由来のベクターはｐＢＶ−１ＭＴＨＡを含み、エプスタインバールウイルス由来のベクターはｐＨＥＢＯ及びｐ２Ｏ５を含む。他の例示的なベクターは、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、並びにＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳がんウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、又は真核生物細胞における発現に有効であることが示されている他のプロモーターの制御下でタンパク質を発現させる、任意の他のベクターを含む。
上に記載されるように、ウイルスは、多くの場合に宿主防御機構を回避するように進化した非常に特殊な感染性物質である。典型的には、ウイルスは特定の細胞型において感染し、増殖する。ウイルスベクターの標的特異性は、所定の細胞型を特異的に標的とするその本来の特異性を利用し、それによって組換え遺伝子を感染細胞へと導入する。したがって、本発明の幾つかの実施形態によって使用されるベクターの種類は、形質転換される細胞型に依存する。形質転換される細胞型に従って好適なベクターを選択する技量は、十分に当業者の能力の範囲内であり、本明細書ではそれ自体の選択の検討の一般的な説明は提示されない。例えば、骨髄細胞は、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−１）を使用して標的化が可能であり、Ｌｉａｎｇ ＣＹ ｅｔ ａｌ．，２００４（Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ．１４９：５１−６０）に記載されるように、腎細胞はバキュロウイルスＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ（ＡｃＭＮＰＶ）存在する異種性プロモーターを使用して標的化が可能である。
組換えウイルスベクターは、それらが水平感染等の利点及びターゲッティング特異性を提供することから、目的のタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの発現に有用である。水平感染は、例えばレトロウイルスの生活環に固有であり、それによって単一の感染した細胞が、出芽して近隣の細胞に感染する多くの子孫ウイルスを産生するプロセスである。結果は、広範囲が急速に感染され、その大半は最初に元のウイルス粒子によって感染されたことである。感染性物質が娘子孫（ｄａｕｇｈｔｅｒ ｐｒｏｇｅｎｙ）を通してのみ拡散する垂直型の感染とは対照である。また、水平に拡散することができないウイルスベクターも産生され得る。この特性は、所望の目的が明示される遺伝子の限局性の数の標的細胞のみへの導入である場合に有用な可能性がある。
本発明の幾つかの実施形態の発現ベクターの幹細胞への導入に様々な方法を使用することができる。かかる方法は、一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９，１９９２）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９８９）、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｍａｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈ．（１９９５）、Ｖｅｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ Ｍｉｃｈ．（１９９５）、Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ Ｍａｓｓ．（１９８８）、及びＧｉｌｂｏａ ｅｔ ａｔ．［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４（６）：５０４−５１２，１９８６］に記載され、例えば、安定で一過性のトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、及び組換えウイルスベクターによる感染が含まれる。更に、陽性−陰性選択方法については米国特許第５，４６４，７６４号及び第５，４８７，９９２号を参照されたい。
ウイルス感染による核酸の導入は、ウイルスの感染の性質に起因してより高いトランスフェクション効率を得ることができるため、リポフェクション及びエレクトロポレーション等の他の方法に対して幾つかの利点を与える。
現在では、好ましいｉｎ ｖｉｖｏ核酸移送技術は、アデノウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、及び脂質系システム等のウイルス又は非ウイルスによるトランスフェクションを含む。遺伝子の脂質媒介移送に有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ−Ｃｈｏｌ［Ｔｏｎｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１４（１）：５４−６５（１９９６）］である。遺伝子療法における使用に最も好ましいコンストラクトはウイルスであり、最も好ましくはアデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルス、又はレトロウイルスである。レトロウイルスコンストラクト等のウイルスコンストラクトは、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサー若しくは遺伝子座規定エレメント（複数の場合がある）、又は選択的スプライシング、核ＲＮＡ核外遊出若しくはメッセンジャーの翻訳後修飾等の他の手段によって遺伝子発現を制御する他のエレメントを含む。また、かかるベクターは、ウイルスコンストラクトに既に存在しなければ、パッケージングシグナル、末端反復（ＬＴＲ）又はその部分、及び使用されるウイルスに対して適切なネガティブ鎖プライマー結合部位を含む。さらに、かかるコンストラクトは、典型的には、それが入れられる宿主細胞からのペプチドの分泌様のシグナル配列を含む。この目的に対するシグナル配列は、哺乳動物のシグナル配列、又は本発明の幾つかの実施形態のポリペプチドバリアントのシグナル配列であることが好ましい。また、上記コンストラクトは、ポリアデニル化を制御するシグナル、また同様に１又は複数の制限酵素部位及び翻訳停止配列を含んでもよい。例として、かかるコンストラクトは、典型的には５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、二本鎖ＤＮＡ合成起点、３’ＬＴＲ、又はそれらの部分を含む。陽イオン性脂質、ポリリジン、及びデンドリマー等の非ウイルスの他のベクターを使用することができる。
挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳に必要なエレメントを含有する以外に、本発明の幾つかの実施形態の発現コンストラクトは、発現されるペプチドの安定性、産生、精製、収率、又は毒性を増強するように操作された配列を含むこともできる。例えば、本発明の幾つかの実施形態の目的のポリペプチドと異種性タンパク質とを含む融合タンパク質又は切断可能な融合タンパク質の発現を操作することができる。かかる融合タンパク質を、該融合タンパク質が親和性クロマトグラフィーによって、例えば異種性タンパク質に特異的なカラム上の固定化によって容易に単離され得るように設計することができる。切断部位が目的のタンパク質と異種性タンパク質との間に操作される場合、目的のタンパク質は、切断部位を妨害する適切な酵素又は薬剤による処理によってクロマトグラフィーカラムから放出され得る［例えば、Ｂｏｏｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９：６５−７０、及びＧａｒｄｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１５８５４−１５８５９を参照されたい］。
上に言及されるように、様々な原核生物又は真核生物の細胞を宿主発現系として使用して本発明の幾つかの実施形態のポリペプチドを発現することができる。これらは、限定されないが、コーディング配列を含む、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、若しくはコスミドＤＮＡによって形質転換された細菌等の微生物、コーディング配列を含む組換え酵母発現ベクターによって形質転換された酵母、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ、タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）によって感染されるか、又はコーディング配列を含む、Ｔｉプラスミド等の組換えプラスミド発現ベクターによって形質転換された植物細胞系を含む。また、哺乳動物発現系を使用して本発明の幾つかの実施形態のポリペプチドを発現することもできる。
細菌コンストラクトの例として、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターのｐＥＴシリーズが挙げられる［Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５：６０−８９）。
酵母では、米国特許第５，９３２，４４７号に開示される、構成的又は誘導可能なプロモーターを含む幾つかのベクターを使用することができる。代替的には、外来ＤＮＡ配列の酵母染色体への統合を促進するベクターを使用することができる。
植物発現ベクターが使用される場合、コーディング配列の発現は幾つかのプロモーターによって制御される。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ ＲＮＡ及び１９Ｓ ＲＮＡ等のウイルスプロモーター［Ｂｒｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１０：５１１−５１４］、又はＴＭＶに対する外被タンパク質プロモーター［Ｔａｋａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７） ＥＭＢＯ Ｊ．６：３０７−３１１］を使用することができる。代替的には、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット等の植物プロモーター［Ｃｏｒｕｚｚｉ ｅｔ ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：１６７１−１６８０、及びＢｒｏｇｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：８３８−８４３］、又はヒートショックプロモーター、例えば、ダイズｈｓｐ１７．５−Ｅ若しくはｈｓｐ１７．３−Ｂ［Ｇｕｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：５５９−５６５］を使用することができる。これらのコンストラクトを、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、当業者によく知られている他の技術を使用して植物細胞に導入することができる。例えば、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ＆Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，１９８８，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｓｅｃｔｉｏｎ ＶＩＩＩ，ｐｐ４２１−４６３を参照されたい。
当該技術分野でよく知られ、本明細書において如何に更に説明される昆虫及び哺乳動物の宿主細胞系等の他の発現系もまた、本発明の幾つかの実施形態によって使用され得る。
形質転換細胞を、多量の目的の組換えポリペプチド（例えば、ＬＩＦ、ＴＧＦβ１、ｂＦＧＦ、ＯＣＴ４、ｃ−ｍｙｃ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ−４）の発現を可能とする有効な条件下で培養する。所定時間の培養の後、組換えポリペプチドの回収を行う。本明細書で使用される「組換えポリペプチドの回収」の文言は、ポリペプチドを含む全発酵培地を収集するが、分離又は精製の追加工程を伴う必要はないことを指す。
したがって、限定されないが、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、濾過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、等電点電気泳動、及び示差可溶化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）等の様々な標準的なタンパク質精製技術を使用して、目的のポリペプチドを精製することができる。
目的のポリペプチドは、「実質的に純粋な」形態で回収されることが好ましい。
本明細書で使用される「実質的に純粋な」の文言は、培養中にヒト胚性幹細胞の未分化状態の維持において、目的のポリペプチド（例えば、ＬＩＦ、ＴＧＦβ１、ｂＦＧＦ）の有効な使用を可能とする純度を指す。
以下は、本発明の幾つかの実施形態により使用され得る下方制御剤の非限定的な説明である。
本明細書で使用される「ＲＮＡサイレンシング」の文言は、対応するタンパク質コーディング遺伝子の発現の阻害又は「サイレンシング」をもたらすＲＮＡ分子によって媒介される一群の調節機構［例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、転写因子サイレンシング（ＴＧＳ）、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）、クエリング（ｑｕｅｌｌｉｎｇ）、コサプレッション、及び翻訳抑制］を指す。ＲＮＡサイレンシングは、植物、動物、及び真菌を含む多くの種類の生物において観察されている。
本明細書で使用される「ＲＮＡサイレンシング剤」の用語は、標的遺伝子の発現を特異的に阻害する又は「サイレンシングする」ことが可能なＲＮＡを指す。特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、転写後サイレンシング機構によりｍＲＮＡ分子の完全なプロセッシング（例えば、完全な翻訳及び／又は発現）を阻止することができる。ＲＮＡサイレンシング剤として、非コーディングＲＮＡ分子、例えば、対合鎖を含むＲＮＡ二本鎖、また同様にそれに対してかかる小さな非コーディングＲＮＡが生成され得る前駆体ＲＮＡが挙げられる。例示的なＲＮＡサイレンシング剤として、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びｓｈＲＮＡ等のｄｓＲＮＡが挙げられる。或る一つの実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、ＲＮＡ干渉を誘導することができる。別の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は翻訳抑制を媒介することができる。
ＲＮＡ干渉は、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって媒介される動物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを指す。植物で対応するプロセスは、一般的には、転写後遺伝子サイレンシング又はＲＮＡサイレンシングと呼ばれ、真菌ではクエリングとも呼ばれる。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは、外来遺伝子の発現を阻止するため使用される進化的に保存された細胞防御機構と考えられ、多様な植物相及び系列によって一般的に共有される。外来遺伝子発現からのかかる防御は、ウイルス感染に由来する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の産生に応答して、又は相同な一本鎖ＲＮＡ若しくはウイルスゲノムＲＮＡを特異的に破壊する細胞応答を介する宿主ゲノムへのトランスポゾンエレメントの無作為の統合から進化した可能性がある。
細胞内の長いｄｓＲＮＡの存在は、ダイサーと呼ばれるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性を賦活する。ダイサーは、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られるｄｓＲＮＡの小片へのｄｓＲＮＡのプロセッシングに含まれる。ダイサー活性に由来する短干渉ＲＮＡは、典型的には約２１〜約２３のヌクレオチド長であり、約１９塩基対の二本鎖を含む。また、ＲＮＡｉ応答は、ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介するＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と一般的に呼ばれるエンドヌクレアーゼ複合体を特色とする。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央で起こる。
したがって、本発明の幾つかの実施形態は、ｍＲＮＡからのタンパク質の発現を下方制御するためｄｓＲＮＡの使用を意図する。
或る１つの実施形態によれば、ｄｓＲＮＡは、３０ｂｐより大きい。長いｄｓＲＮＡ（すなわち、３０ｂｐより大きいｄｓＲＮＡ）の使用は、これらの二本鎖ＲＮＡの長い領域がインターフェロン及びＰＫＲ応答の誘導をもたらすと信じられていたため、非常に制限されていた。しかしながら、長いｄｓＲＮＡの使用は、細胞が最適なサイレンシング配列を選択できるという多数の利点を提供して、多数のｓｉＲＮＡを試験する必要性を軽減し、長いｄｓＲＮＡは、サイレンシングライブラリーがｓｉＲＮＡに必要とされ得るよりも複雑性を低くすることができ、おそらく最も重要なことには、長いｄｓＲＮＡは治療法として使用された場合にウイルスエスケープ変異を防止し得る。
様々な研究が、ストレス応答を誘導せず、著しいオフターゲット効果をもたらすことなく、遺伝子発現のサイレンシングに長いｄｓＲＮＡをできることを実証する。例えば、［Ｓｔｒａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．１３ ３８０３?３８１０、Ｂｈａｒｇａｖａ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００４；１３：１１５?１２５、Ｄｉａｌｌｏ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．２００３；１３：３８１−３９２、Ｐａｄｄｉｓｏｎ Ｐ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００２；９９：１４４３−１４４８、Ｔｒａｎ Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２００４；５７３：１２７−１３４］を参照されたい。
特に、本発明は、そのいくつかの実施形態によれば、インターフェロン経路が活性化されていない細胞（例えば、胚細胞及び卵母細胞）における遺伝子サイレンシングに対する長いｄｓＲＮＡ（３０塩基超の転写産物）の導入を意図する。例えば、Ｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ２００１，Ｖｏｌ ９８，ｐａｇｅｓ１４４２８−１４４３３、及びＤｉａｌｌｏ ｅｔ ａｌ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｏｃｔｏｂｅｒ １，２００３，１３（５）：３８１−３９２．ｄｏｉ：１０．１０８９／１５４５４５７０３３２２６１７０６９を参照されたい。
また、本発明は、その幾つかの実施形態によれば、遺伝子発現の下方制御にインターフェロン及びＰＫＲ経路を誘導しないように特異的に設計された長いｄｓＲＮＡの誘導も意図する。例えば、Ｓｈｉｎａｇｗａ ａｎｄ Ｉｓｈｉｉ［Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．１７（１１）：１３４０−１３４５，２００３］は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＰｏｌＩＩ）プロモーターから長い二本鎖ＲＮＡを発現するためのｐＤＥＣＡＰという名前のベクターを開発した。ｐＤＥＣＡＰからの転写産物が、細胞質へのｄｓＲＮＡの核外輸送を促進する５’キャップ構造と３’−ｐｏｌｙ（Ａ）テイルを欠くことから、ｐＤＥＣＡＰ由来の長いｄｓＲＮＡはインターフェロン応答を誘導しない。
哺乳動物系におけるインターフェロン及びＰＫＲ経路を回避する別の方法は、トランスフェクション又は内因性発現のいずれかによる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の導入による。
「ｓｉＲＮＡ」の用語は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘導する低分子干渉ＲＮＡ二本鎖（一般的には１８塩基対〜３０塩基対）を指す。最近、２５塩基〜３０塩基の長さの化学合成されたＲＮＡ二本鎖は、同じ配置で２１ｍｅｒと比較すると１００倍もの有効性の増加を有し得ることが記載されているが、典型的には、ｓｉＲＮＡは、中央の１９ｂｐ二本鎖領域及び対称な末端の２塩基３’オーバーハングを有する２１ｍｅｒとして化学合成される。ＲＮＡｉの誘発においてより長いＲＮＡを使用することによって得られた観察された有効性の増加は、産物（２１ｍｅｒ）に代えて基質（２７ｍｅｒ）をダイサーに提供することに起因し、ｓｉＲＮＡ二本鎖のＲＩＳＣへの進入速度又は効率を改善することが理論上想定される。
３’オーバーハングの位置がｓｉＲＮＡの有効性に影響を及ぼし、アンチセンス鎖に対する３’オーバーハングを有する非対称の二本鎖は、一般的にはセンス鎖に対する３’オーバーハングを有するものよりも強力であることが分かった（Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００５）。これは、アンチセンス転写産物を標的とする場合に逆の効能パターンが観察されることから、ＲＩＳＣへの非対称鎖ローディング（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ ｓｔｒａｎｄ ｌｏａｄｉｎｇ）に帰する可能性がある。
二本鎖干渉ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）の鎖は接続されて、ヘアピン又はステムループ構造（例えばｓｈＲＮＡ）を形成してもよい。したがって、言及されるように、本発明の幾つかの実施形態のＲＮＡサイレンシング剤は、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であってもよい。
本明細書で使用される「ｓｈＲＮＡ」の用語は、相補配列の第１及び第２の領域を含む、ステムループ構造を有するＲＮＡ剤を指し、相補性の程度及び領域の配向が、その領域の間で塩基対合が起こるように十分であり、第１及び第２の領域がループ領域によって結合され、ループは、該ループ領域内のヌクレオチド間（又はヌクレオチオドアナログ）の塩基対合の欠損に起因する。ループ中のヌクレオチドの数は、３〜２３、又は５〜１５、又は７〜１３、又は４〜９、又は９〜１１の間又はそれらを含む数である。ループ中の幾つかのヌクレオチドは、該ループ中の他のヌクレオチドとの塩基対相互作用に含まれ得る。ループを形成するため使用され得るオリゴヌクレオチド配列の例として、５’−ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ−３’（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５５０）、及び５’−ＵＵＵＧＵＧＵＡＧ−３’（Ｃａｓｔａｎｏｔｔｏ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２００２）ＲＮＡ８：１４５４）が挙げられる。得られた単一鎖のオリゴヌクレオチドが、ＲＮＡｉの仕組みと相互作用することができる二本鎖領域を含むステムループ又はヘアピンの構造を形成することが、当業者によって認識される。
本発明の幾つかの実施形態による使用に適したＲＮＡサイレンシング剤の合成は、以下の通りなされ得る。最初に、腫瘍抑制ｍＲＮＡ配列を、ＡＡジヌクレオチド配列についてＡＵＧ開始コドンの下流においてスキャンする。ＡＡ、３’隣接１９ヌクレオチドの各々の発生を可能性のあるｓｉＲＮＡ標的部位として記録する。ｓｉＲＮＡ標的部位は、非翻訳領域（ＵＴＲ）が調節タンパク質結合部位より富んでいることから、オープンリーディングフレームから選択されることが好ましい。ＵＴＲ結合タンパク質及び／又は翻訳開始複合体は、ｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合を干渉する場合がある［Ｔｕｓｃｈｌ ＣｈｅｍＢｉｏｃｈｅｍ．２：２３９−２４５］。しかしながら、５’ＵＴＲに向けられたｓｉＲＮＡが細胞のＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの約９０％の減少及びタンパク質レベルの完全な消失を媒介するＧＡＰＤＨに対して実証されたように、非翻訳領域に向けられたｓｉＲＮＡもまた有効な場合もあることが解される（ａｍｂｉｏｎ（ｄｏｔ）ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｔｎ／９１／９１２（ｄｏｔ）ｈｔｍｌ）。
次に、可能性のある標的部位を、ＮＣＢＩサーバー（ｎｃｂｉ（ｄｏｔ）ｎｌｍ（ｄｏｔ）ｎｉｈ（ｄｏｔ）ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）から入手可能なＢＬＡＳＴソフトウェア等の任意の配列アラインメントソフトウェアを使用して、適切なゲノムデータベース（例えば、ヒト、マウス、ラット等）と比較する。他のコーディング配列に対して顕著な相同性を示す推定上の標的部位を除外する。
限定的な標的配列が、ｓｉＲＮＡ合成に対するテンプレートとして選択される。好ましい配列は、Ｇ／Ｃ含有量が５５％より高いものと比較して遺伝子サイレンシングの媒介により有効であることが証明されているため、低Ｇ／Ｃ含有量を含むものである。幾つかの標的部位は、評価のための標的遺伝子の長さに従って選択されることが好ましい。選択されたｓｉＲＮＡのより良好な評価について、陰性対照を併用することが好ましい。陰性対照ｓｉＲＮＡ同じヌクレオチド組成を含むがゲノムに対して顕著な相同性を欠くことが好ましい。したがって、任意の他の遺伝子に対していかなる顕著な相同性も示さない限り、ｓｉＲＮＡの組み換えられたヌクレオチド配列を使用することが好ましい。
本発明の幾つかの実施形態のＲＮＡサイレンシング剤は、ＲＮＡのみを含むそれらの分子に限定される必要はなく、更に化学的に修飾されたヌクレオチド及び非ヌクレオチドを包含する。
或る実施形態では、本明細書において提示されるＲＮＡサイレンシング剤は、細胞透過性ペプチドと機能的に関連し得る。本明細書で使用される「細胞浸透性ペプチド」は、短い（約１２残基〜３０残基）アミノ酸配列、又は細胞の原形質及び／又は核膜を横切る膜透過性複合体の輸送と関連するエネルギー依存性（すなわち、非エンドサイトーシスの）移行特性を与える機能性モチーフを含むペプチドを指す。本発明の幾つかの実施形態の膜透過性複合体に使用される細胞透過性ペプチドは、遊離しているか又は誘導体化されてスルフィド結合に対して修飾された二本鎖リボ核酸によるジスルフィド結合を形成している、いずれかの、少なくとも１つの非機能性システイン残基を含むことが好ましい。かかる特性を付与する代表的なアミノ酸モチーフは、参照により本明細書に明確に援用される、米国特許第６，３４８，１８５号に列挙される。本発明の幾つかの実施形態の細胞透過性ペプチドは、限定されないが、ペネトラチン、トランスポータン、ｐＩｓｌ、ＴＡＴ（４８−６０）、ｐＶＥＣ、ＭＴＳ、及びＭＡＰを含むことが好ましい。
別の実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング剤はｍｉＲＮＡであってもよい。
「マイクロＲＮＡ」、「ｍｉＲＮＡ」、及び「ｍｉＲ」の用語は同義語であって、遺伝子発現を調節する、長さ約１９〜２８のヌクレオチドの非コーディング一本鎖ＲＮＡ分子の集合を指す。ｍｉＲＮＡは、幅広い生物（ウイルスから（ｆｗｄａｒｗ）ヒト）で見られ、発生、ホメオスタシス、及び疾患病因において役割を果たす。
以下は、ｍｉＲＮＡ活性機構の簡単な説明である。
ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子は複写され、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡとして知られるｍｉＲＮＡ前駆体の産生をもたらす。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、典型的には複数のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡを含むポリシストロニックＲＮＡの一部である。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、ステム及びループを有するヘアピンを形成し得る。ステムは、ミスマッチ塩基を含む場合がある。
ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡのヘアピン構造は、ＲＮａｓｅＩＩＩエンドヌクレアーゼであるＤｒｏｓｈａによって認識される。Ｄｒｏｓｈａは、典型的にはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの末端ループを認識し、ステムのおよそ２ヘリックスターン中まで（ｉｎｔｏ）切断し、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡとして知られる６０〜７０のヌクレオチドの前駆体を産生する。Ｄｒｏｓｈａは、ＲＮａｓｅＩＩＩエンドヌクレアーゼに典型的なスタガードカット（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｃｕｔ）によってｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを切断して５’リン酸塩及び約２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡステムループを生じる。Ｄｒｏｓｈａ切断部位を超えて伸びるステムのおよそ１つのヘリックスターン（約１０ヌクレオチド）は効率的なプロセッシングに必須であると推定される。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、その後、Ｒａｎ−ＧＴＰ及び輸送受容体であるＥｘ−ｐｏｒｔｉｎ−５によって積極的に核から細胞質へと輸送される。
ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの二本鎖ステムは、その後、ＲＮａｓｅＩＩＩエンドヌクレアーゼでもあるダイサーによって認識される。また、ダイサーは、ステムループの付け根の５’リン酸塩及び３’オーバーハングを認識する場合がある。その後、ダイサーは、ステムループの根元から２ヘリックスターン離れた末端ループを切り離し、追加の５’リン酸塩及び約２ヌクレオチドの３’オーバーハングを残す。ミスマッチを含み得る、得られたｓｉＲＮＡ様二本鎖は、成熟ｍｉＲＮＡ、及びｍｉＲＮＡ＊として知られる同様のサイズのフラグメントを含む。ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ＊は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡとｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの反対のアームに由来し得る。ｍｉＲＮＡ＊配列は、クローニングされたｍｉＲＮＡのライブラリに見られ得るが、典型的にはｍｉＲＮＡより頻度が低い。
ｍｉＲＮＡ＊との二本鎖種として最初に存在するが、ｍｉＲＮＡは、最終的には一本鎖ＲＮＡとして、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られるリボヌクレオタンパク質複合体に組込まれる。様々なタンパク質がＲＩＳＣを形成することができ、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊二本鎖に対する特異性の変化、標的遺伝子の結合部位、ｍｉＲＮＡの活性（抑制及び活性化）、及びｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊二本鎖のどの鎖がＲＩＳＣに積み込まれるかを導くことができる。
ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊二本鎖のｍｉＲＮＡ鎖がＲＩＳＣに積み込まれる場合、ｍｉＲＮＡ＊は除去され分解される。ＲＩＳＣに積み込まれるｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊二本鎖の鎖は、その５’末端は密接に対合されていない鎖である。ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊の両方の末端がほぼ等しい５’対合を有する場合、ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ＊の両方が遺伝子サイレンシング活性を有する。
ＲＩＳＣは、ｍｉＲＮＡとｍＲＮＡ、特にヌクレオチド２〜７のｍｉＲＮＡの間の高い相補性レベルに基づいて標的核酸を識別する。
幾つかの研究は、ｍｉＲＮＡと翻訳の効率的な阻害を達成するためのそのｍｉＲＮＡ標的の間の塩基対合の要求に着目してきた（Ｂａｒｔｅｌ ２００４，Ｃｅｌｌ １１６−２８１によって論評される）。哺乳動物細胞では、ｍｉＲＮＡの最初の８個のヌクレオチドが重要な可能性がある（Ｄｏｅｎｃｈ＆Ｓｈａｒｐ ２００４ ＧｅｎｅｓＤｅｖ ２００４−５０４）。しかしながら、マイクロＲＮＡの他の部分もまたｍＲＮＡ結合に参加し得る。さらに、３’における十分な塩基都合は、５’における不十分な対合を補填し得る（Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ，２００５ ＰＬｏＳ ３−ｅ８５）。全ゲノムに対するｍｉＲＮＡ結合を分析するコンピューターによる研究は、ターゲット結合におけるｍｉＲＮＡの５’の２塩基〜７塩基に特異的な役割を示唆したが、通常「Ａ」であることがわかった最初のヌクレオチドもまた認識される（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｔ ２００５ Ｃｅｌｌ １２０−１５）。同様に、Ｋｒｅｋ ｅｔ ａｌによって、標的を同定及び検証するため、ヌクレオチド１〜７、又は２〜８が使用された（２００５，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３７−４９５）。
ｍＲＮＡ中の標的部位は、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、又はコーディング領域にあってもよい。興味深いことには、複数のｍｉＲＮＡが、同じ又は複数の部位を認識することによって同じＲＮＡ標的を調節し得る。ほとんどの遺伝学的に同定された標的における複数のｍｉＲＮＡ結合部位の存在は、複数のＲＩＳＣの協同的な作用が最も効率的な翻訳阻害を提供することを示す可能性がある。
ｍｉＲＮＡは、２つの機構、すなわちｍＲＮＡ切断又は翻訳抑制のいずれかによって遺伝子発現を下方制御するようにＲＩＳＣを制御し得る。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡがｍｉＲＮＡに対して所定の程度の相補性を有する場合、ｍＲＮＡの切断を指定し得る。ｍｉＲＮＡが切断を先導する場合、切込みは典型的にはｍｉＲＮＡの１０残基〜１１残基のヌクレオチド対合の間である。代替的には、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡに対して必要な程度の相補性を有しない場合、翻訳を抑制し得る。翻訳抑制は、動物がｍｉＲＮＡと結合部位との間により低い相補性を有する場合があることから、動物においてより一般的に行われる。
ｍｉＲＮＡとｍｉＲＮＡ＊の任意の対の５’及び３’の末端に可変性が存在し得ることに留意されたい。この可変性は、Ｄｒｏｓｈａによる酵素的なプロセッシング、及び切断の部位に関するダイサーにおける可変性に起因する可能性がある。また、ｍｉＲＮＡとｍｉＲＮＡ＊の５’及び３’の末端の可変性は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ及びｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのステム構造におけるミスマッチに起因する可能性がある。ステム鎖のミスマッチは、異なるヘアピン構造の集団をもたらす場合がある。ステム構造における可変性もまた、Ｄｒｏｓｈａ及びダイサーによる切断産物における可変性をもたらす可能性がある。
「マイクロＲＮＡ模倣物」の用語は、ＲＮＡｉ経路に進入することができ、遺伝子発現を調節することができる合成非コーディングＲＮＡを指す。ｍｉＲＮＡ模倣物は、内因性マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の機能を模倣し、成熟した、二本鎖分子又は模倣前駆体（又は、例えばｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）として設計され得る。ｍｉＲＮＡ模倣物は、修飾又は非修飾のＲＮＡ，ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド、又は選択的核酸化学（例えば、ＬＮＡ、又は２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン−架橋核酸（ＥＮＡ））に含まれ得る。成熟した二本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物について、二本鎖領域の長さは１３個〜３３個、１８個〜２４個、又は２１個〜２３個のヌクレオチドで変化し得る。また、ｍｉＲＮＡは、合計で少なくとも５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９、又は４０個のヌクレオチドを含んでもよい。ｍｉＲＮＡの配列は、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの最初の１３個〜３３個のヌクレオチドであってもよい。また、ｍｉＲＮＡの配列は、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの最後の１３個〜３３個のヌクレオチドであってもよい。
多能性幹細胞をｍｉＲＮＡと接触させることは、幾つかの方法によって影響を受け得ることが、本明細書において上に提示される説明からわかる。
１．成熟した二本鎖ｍｉＲＮＡを用いて多能性幹細胞を一過性にトランスフェクトすること。
２．成熟ｍｉＲＮＡをコードする発現ベクターを用いて多能性幹細胞を安定的に又は一過性にトランスフェクトすること。
３．ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡをコードする発現ベクターを用いて多能性幹細胞を安定的に又は一過性にトランスフェクトすること。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列は、４５個〜９０個、６０個〜８０個、又は６０個〜７０個のヌクレオチドを含んでもよい。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの配列は、本明細書に示されるｍｉＲＮＡ、及びｍｉＲＮＡ＊を含んでもよい。また、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの配列は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの５’末端及び３’末端から０個〜１６０個のヌクレオチドを排除したｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの配列であってもよい。
４．ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡをコードする発現ベクターを用いて多能性幹細胞を安定的に又は一過性にトランスフェクトすること。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ配列は、４５個〜３００００個、５０個〜２５０００個、１００個〜２００００個、１０００個〜１５００個、又は８０個〜１００個のヌクレオチドを含んでもよい。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの配列は、本明細書に示されるｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ＊の配列、又はそれらのバリアントを含んでもよい。
ｍｉＲＮＡ模倣物の作製は、化学合成法により、又は組換え法によりなされ得る。
本発明の幾つかの実施形態の腫瘍抑制タンパク質（例えば、Ｐ５３及び／又はＮＦカッパーＢ阻害剤アルファ）を下方制御することができる別の薬剤は、ｍＲＮＡ転写産物又は腫瘍抑制タンパク質のＤＮＡ配列を特異的に切断することができるＤＮＡザイム分子である。ＤＮＡザイムは、一本鎖及び二本鎖の両方の標的配列を切断することができる一本鎖ポリヌクレオチドである（Ｂｒｅａｋｅｒ，Ｒ．Ｒ．ａｎｄ Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９５；２：６５５；Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｓ．Ｗ．＆Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９７；９４３：４２６２）。ＤＮＡザイムに対して一般的なモデル（「１０〜２３」モデル）が提案されてきた。「１０〜２３」のＤＮＡザイムは、各々７個〜９個のデオキシリボヌクレオチドの２つの基質認識ドメインによって挟まれた１５個のデオキシリボヌクレオチドの触媒ドメインを有する。この種のＤＮＡザイムはその基質であるＲＮＡをプリン：ピリミジン接合で効果的に切断することができる（Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｓ．Ｗ．＆Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９；ｆｏｒ ｒｅｖ ｏｆ ＤＮＡｚｙｍｅｓ ｓｅｅ Ｋｈａｃｈｉｇｉａｎ，ＬＭ［Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ４：１１９−２１（２００２）］。
一本鎖及び二本鎖の標的切断部位を認識する合成の、操作されたＤＮＡザイムの構築及び増幅の例は、Ｊｏｙｃｅ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第６，３２６，１７４号に開示される。ヒトウロキナーゼ受容体に対する同様のデザインのＤＮＡザイムは、最近、ウロキナーゼ受容体発現を阻害し、ｉｎ ｖｉｖｏで大腸がんの転移の阻害に成功したことが観察された（（Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ，２００２，Ａｂｓｔｒａｃｔ ４０９，Ａｎｎ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ａｍ Ｓｏｃ Ｇｅｎ Ｔｈｅｒ ｗｗｗ．ａｓｇｔ．ｏｒｇ）。別の用途では、ｂｃｒ−ａｂｌ発がん遺伝子に相補的なＤＮＡザイムは、白血病細胞において発がん遺伝子発現の阻害に成功し、ＣＭＬ及びＡＬＬの場合の自己骨髄移植における再発率を減少した。
本発明の幾つかの実施形態の腫瘍抑制遺伝子（例えば、Ｐ５３及び／又はＮＦカッパーＢ阻害剤アルファ）の下方制御もまた、腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ転写産物と特異的にハイブリダイズすることができるアンチセンスポリヌクレオチドを使用して成され得る。
腫瘍抑制タンパク質を効率的に下方制御させるために使用され得るアンチセンス分子の設計は、アンチセンスアプローチに重要な２つの態様を考慮しながらなされなければならない。第１の態様は、適切な細胞の細胞質へのオリゴヌクレオチドの送達であり、また第２の態様はｍＲＮＡの翻訳を阻害する方法で細胞内の指定のｍＲＮＡに特異的に結合するオリゴヌクレオチドの設計である。
従来技術は、多様な細胞型へのオリゴヌクレオチドの効率的な送達に使用され得るいくつかの送達戦略を教示する［例えば、Ｌｕｆｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ７６：７５−６（１９９８）、Ｋｒｏｎｅｎｗｅｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ９１：８５２−６２（１９９８）、Ｒａｊｕｒ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ８：９３５−４０（１９９７）、Ｌａｖｉｇｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２３７：５６６−７１（１９９７）、及びＡｏｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２３１：５４０−５（１９９７）を参照されたい］。
さらに、標的ｍＲＮＡ及びオリゴヌクレオチドの両方における構造の変更のエネルギー論を説明する熱力学サイクルに基づくそれらの標的ｍＲＮＡに対する最も高い予測結合親和性を有するそれらの配列を同定するためのアルゴリズムもまた、利用可能である［例えば、Ｗａｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ６５：１−９（１９９９）を参照されたい］。
かかるアルゴリズムは、細胞においてアンチセンスアプローチを実行するための使用に成功している。例えば、Ｗａｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．によって開発されたアルゴリズムは、科学者がウサギベータグロビン（ＲＢＧ）及びマウス腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）の転写産物に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計することを成功させた。同じ研究グループが、更に最近、動的ＰＣＲによって評価される細胞培養物における３つのモデル標的ｍＲＮＡ（ヒト乳酸脱水素酵素Ａ及びＢ、並びにラットｇｐ１３０）に対して合理的に選択されたオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性が、ホスホジエステル及びホスホロチオエートオリゴヌクレオチド化学を用いる、２つの細胞型における３つの異なる標的に対する試験を含むほぼ全ての場合に有効であることを証明した。
さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系を使用する特定のオリゴヌクレオチドの設計及び効率の予測に対する幾つかのアプローチも公開された（Ｍａｔｖｅｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：１３７４−１３７５（１９９８））。
幾つかの臨床治験が、アンチセンスオリゴヌクレオチドの安全性、実現可能性、及び活性を実証した。例えば、がんの治療に適したアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用に成功しており［Ｈｏｌｍｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ１：３７２−８５（１９９９）］、一方、ｃ−ｍｙｂ遺伝子、ｐ５３及びＢｃｌ−２を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる血液悪性腫瘍の治療が臨床治験に入り、患者に許容されることが示された［Ｇｅｒｗｉｔｚ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ１：２９７−３０６（１９９９）］。
より最近では、ヒトへパラナーゼ遺伝子発現のアンチセンス媒介抑制がマウスモデルにおけるヒトがん細胞の胸膜播種を阻害することが報告された［Ｕｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６１：７８５５−６０（２００１）］。
したがって、現在のコンセンサスは、上に記載されるような、高精度のアンチセンス設計アルゴリズムの作製、及び多様なオリゴヌクレオチド送達システムをもたらしたアンチセンス技術の分野における最近の発展は、当業者が、過度の試行錯誤に頼ることなく、既知の配列の発現を下方制御するのに適したアンチセンスアプローチの設計及び実行を可能とするということである。
本発明の幾つかの実施形態の腫瘍抑制タンパク質（例えば、Ｐ５３及び／又はＮＦカッパーＢ阻害剤アルファ）の下方制御が可能な別の薬剤は、腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ転写産物を特異的に切断することができるリボザイム分子である。リボザイムは、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡの切断によって遺伝子発現を配列特異的に抑制するため益々使用されている［Ｗｅｌｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：４８６−９６（１９９８）］。任意の特定の標的ＲＮＡを切断するリボザイムを設計する可能性は、それらを基礎研究及び治療用途の両方における貴重な手段とした。治療分野では、リボザイムは、感染性疾患、がんにおける優性がん遺伝子、及び遺伝的障害における特定の体細胞突然変異において標的ウイルスＲＮＡに対して利用されている［Ｗｅｌｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｖｉｒｏｌ．１０：１６３−７１（１９９８）］。特に、ＨＩＶ患者に対する幾つかのリボザイム遺伝子療法のプロトコルが既に治験のフェーズＩにある。より最近では、リボザイムは、トランスジェニック動物研究、遺伝子ターゲッティングの検証、及び経路の解明に使用されている。幾つかのリボザイムが様々な臨床治験の段階にある。アンギオザイム（ＡＮＧＩＯＺＹＭＥ）は、ヒト臨床治験において試験するため最初に化学合成されたリボザイムであった。アンギオザイムは、血管新生経路における主要な成分であるＶＥＧＦ−ｒ（血管内皮細胞増殖因子受容体）の形成を特異的に阻害する。Ｒｉｂｏｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．及び他の会社は、動物モデルにおける抗血管新生両方の重要性を実証した。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡを選択的に破壊するように設計されたリボザイムであるヘパタザイム（ＨＥＰＴＡＺＹＭＥ）は、細胞培養アッセイにおいてＣ型肝炎ウイルスＲＮＡの減少に有効であることがわかった（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ−ＷＥＢホームページ）。
細胞において本発明の幾つかの実施形態の腫瘍抑制タンパク質（例えば、Ｐ５３及び／又はＮＦカッパーＢ阻害剤アルファ）の発現を制御する追加の方法は、トリプレックス形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）による。最近の研究は、配列特異的な方式で二本鎖螺旋ＤＮＡにおけるポリプリン／ポリピリミジン領域を認識して結合することができるＴＦＯを設計可能であることを示した。これらの認識法則は、Ｍａｈｅｒ ＩＩＩ，Ｌ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９；２４５：７２５−７３０、Ｍｏｓｅｒ，Ｈ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７；２３８：６４５−６３０、Ｂｅａｌ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２；２５１：１３６０−１３６３、Ｃｏｏｎｅｙ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８；２４１：４５６−４５９、及びＨｏｇａｎ，Ｍ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，ＥＰ公開第３７５４０８号によって概説されている。インターカレーターの導入及び骨格置換等のオリゴヌクレオチドの修飾、並びに結合条件の最適化（ｐＨ及び陽イオン濃度）は、電荷の反発及び不安定性等のＴＦＯ活性に対する本来の障害の克服を補助し、最近では、合成オリゴヌクレオチドを特定の配列に対して標的化できることが示された（最近の論評についてはＳｅｉｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｌａｚｅｒ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００３；１１２：４８７−９４を参照されたい）。
一般的には、トリプレックス形成オリゴヌクレオチドは配列対応を有する。
オリゴ ３’−−Ａ Ｇ Ｇ Ｔ
二本鎖 ５’−−Ａ Ｇ Ｃ Ｔ
二本鎖 ３’−−Ｔ Ｃ Ｇ Ａ
しかしながら、Ａ−ＡＴ及びＧ−ＧＣトリプレットは最も大きい三重螺旋安定性を有することが示されている（Ｒｅｉｔｈｅｒ ａｎｄ Ｊｅｌｔｓｃｈ，ＢＭＣ Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００２，Ｓｅｐｔ１２，Ｅｐｕｂ）。同じ著者が、Ａ−ＡＴ及びＧ−ＧＣの法則に従って設計されたＴＦＯが非特異的なトリプレックスを形成しないことを実証し、トリプレックス形成が実際に配列特異的であることを示した。
したがって、腫瘍抑制遺伝子制御領域における任意の所与の配列について、トリプレックス形成配列を工夫してもよい。トリプレックス形成オリゴヌクレオチドは、少なくとも１５、より好ましくは２５、更に好ましくは３０以上のヌクレオチド長であって、最大５０ｂｐ又は１００ｂｐであることが好ましい。
ＴＦＯによる細胞のトランスフェクション（例えば、陽イオン性リポソームによる）、及び標的ＤＮＡによる三重螺旋構造の形成は、立体的及び機能的な変化を誘導し、転写の開始及び伸長を遮断し、内因性のＤＮＡにおける所望の配列変化の導入を可能とし、その結果遺伝子発現の特異的な下方制御をもたらす。ＴＦＯによって処理された細胞におけるかかる遺伝子発現の抑制の例として、哺乳動物細胞におけるエピソームｓｕｐＦＧ１遺伝子及び内因性ＨＰＲＴ遺伝子のノックアウト（Ｖａｓｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９９；２７：１１７６−８１，ａｎｄ Ｐｕｒｉ，ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００１；２７６：２８９９１−９８）、及び前立腺がんの病因学に重要でありＥｔｓ２転写因子（Ｃａｒｂｏｎｅ，ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２００３；３１：８３３−４３）及び炎症促進性のＩＣＡＭ−１遺伝子（Ｂｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００２；２７７：３２４７３−７９）の発現の配列特異的及び標的特異的な下方制御が挙げられる。さらに、Ｖｕｙｉｓｉｃｈ及びＢｅａｌは、最近、配列特異的ＴＦＯはｄｓＲＮＡに結合してＲＮＡ依存性キナーゼ等のｄｓＲＮＡ依存性酵素の活性を阻害し得ることを示した（Ｖｕｙｉｓｉｃｈ ａｎｄ Ｂｅａｌ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２０００；２８：２３６９−７４）。
さらに、上述の原理に従って設計されたＴＦＯは、ＤＮＡ修復を成し遂げることができる低方向突然変異誘発を誘導することができることから、内因性遺伝子の下方制御及び発現増加の両方を提供する（Ｓｅｉｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｌａｚｅｒ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００３；１１２：４８７−９４）。有効なＴＦＯの設計、合成、及び投与の詳細な説明は、Ｆｒｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ，に対する米国特許出願番号第２００３ ０１７０６８号及び第２００３ ００９６９８０号、並びにＥｍａｎｕｅｌｅ ｅｔ ａｌ，に対する米国特許出願番号第２００２ ０１２３４７６号、並びにＬａｗｎに対する米国特許第５，７２１，１３８号に見ることができる。
本明細書で使用される「約」は±１０％を指す。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」及びそれらの活用は、「含むが、限定されない」を意味する。
「からなる」の用語は、「含み、限定される」を意味する。
「から本質的になる」の用語は、その組成物、方法、又は構造が、追加の原料、工程、及び／又は部品を含み得るが、その追加の原料、工程及び／又は部品が特許請求の範囲の組成物、方法、又は構造の基本的で新規な特性を実質的に変更しない場合に限る。
本明細書で使用される単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈による明確な別段の指示がない限り、複数の参照を含む。例えば、「化合物」又は「少なくとも１つの化合物」の用語は、それらの化合物の混合物を含む、複数の化合物を含む場合がある。
本出願を通して、本発明の様々な実施形態が範囲フォーマットで提示され得る。範囲フォーマットによる記載は、利便性及び簡潔性のために過ぎず、本発明の範囲の変更不可能な限定として解釈されるべきではないことが理解される。したがって、範囲の記載は、具体的に開示された可能性のある全ての部分範囲、また同様にその範囲に含まれる個々の数値を有するとされるべきである。例えば、１〜６等の範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６等の具体的に開示される部分範囲、また同様に、その範囲に含まれる個々の数値、例えば、１、２、３、４、５、及び６を有するとされるべきである。これは、範囲の広さに関わらず適用される。
本明細書に数値範囲が示される場合、その範囲は指示される範囲内の任意の言及される数字（分数又は整数）を含むことを意味する。第１に示される数字と第２に示される数字間「の範囲／の範囲（ｒａｎｇｉｎｇ／ｒａｎｇｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ）」、及び第１に示される数字から第２に示される数字まで「の範囲／の範囲（ｒａｎｇｉｎｇ／ｒａｎｇｅｓ ｆｒｏｍ）」の文言は、本明細書において同じ意味で使用され、第１と第２の示される数字、並びにその間の分数及び整数の全てを含むことを意味する。
本明細書で使用される「方法」の用語は、限定されないが、化学、薬学、生物学、生化学、及び医学等の実施者に既知の、又はそれらによって既知の手法、手段、技術及び手順から容易に開発されたいずれかの、手法、手段、技術、及び手順を含む、所与の課題を成し遂げるための手法、手段、技術、及び手順を指す。
本明細書で使用される「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」の用語は、状態の進行を抑制すること、実質的に阻害すること、遅延すること、又は逆転すること、状態の臨床若しくは審美的な症状を実質的に改善すること、又は状態の臨床若しくは審美的な症状の出現を実質的に防止することを含む。
明確にするため、別々の実施形態の内容において記載される本発明の特定の特徴もまた、単一の実施形態において組み合わせて提供され得ることが理解される。逆に、簡潔のため、単一の実施形態の内容において記載される本発明の様々な特徴もまた、別々に、又は任意の好適な部分的な組み合わせで、若しくは任意の他の記載される本発明の実施形態において好適なものとして、提供され得る。様々な実施形態の内容において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なくして実施されない場合を除き、それらの実施形態の必須の特徴とされるものではない。
上に描写され、以下の特許請求の範囲の欄に記載される本発明の様々な実施形態及び態様は、以下の実施例において実験的なサポートを見出す。
上の記載と共に非限定的な様式で本発明の幾つかの実施形態を説明する、以下の実施例が参照される。
一般的には、本明細書で使用される命名法及び本発明で利用される実験手順は、分子、生化学、微生物学、及び組換えＤＮＡの技術を含む。かかる技術は、文献に十分説明されている。例えば、以下を参照されたい。“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）、Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８）、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）“Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ”，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）、米国特許第４，６６６，８２８号、第４，６８３，２０２号、第４，８０１，５３１号、第５，１９２，６５９号、及び第５，２７２，０５７号に述べられる方法、“Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）、“Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ?Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”ｂｙ Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）、Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）、Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）、“Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）、Ｍｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），“Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）、利用可能な免疫アッセイは特許及び科学文献に広く記載されており、例えば、米国特許第３，７９１，９３２号、第３，８３９，１５３号、第３，８５０，７５２号、第３，８５０，５７８号、第３，８５３，９８７号、第３，８６７，５１７号、第３，８７９，２６２号、第３，９０１，６５４号、第３，９３５，０７４号、第３，９８４，５３３号、第３，９９６，３４５号、第４，０３４，０７４号、第４，０９８，８７６号、第４，８７９，２１９号、第５，０１１，７７１号、及び第５，２８１，５２１号、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．，ｅｄ．（１９８４）、“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ” Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８５）、“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８４）、“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ” Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，ｅｄ．（１９８６）、“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ”ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）、“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）、並びに“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌ．１−３１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；“ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）、Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ?Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ”ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照されたい。これらはいずれも、それらが本明細書に完全に記載されているかのように参照により援用される。他の一般的な参照は本書を通して提供される。それらにおける手順は、当該技術分野においてよく知られており、読者の利便性のため提供される。それらに含まれる全ての情報は、参照により本明細書に援用される。
実施例１
材料及び方法
基本培地
Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ２１１０３−０４９）及びＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０６−１１７０−５０−１Ａ）の１：１のミックス、すなわち、合計４７５ｍｌ、ペニシリン−ストレプトマイシン５ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０３−０３３−１Ｂ）、Ｌ−グルタミン２００ｍＭ溶液を５ｍｌ（最終濃度２ｍＭ）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ−０２−０２２−１Ｂ）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）?５ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０１−３４０−１Ｂ）、５０μｌの５０ｍＭストックベータ−メルカプトエタノール（１バイル）、Ｂ２７補足物５ｍｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １７５０４−０４４）、インスリン（Ｓｉｇｍａ Ｉ−１８８２；最終濃度１２．５〜２５μｇ／ｍｌ）、アポトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ Ｔ−１１４７；最終濃度１００μｇ／ｍｌ）、プロゲステロン（Ｓｉｇｍａ Ｐ８７８３）最終濃度０．０２μｇ／ｍｌ、プトレシン（ＳｉｇｍａＰ５７８０、最終濃度１６μｇ／ｍｌ、亜セレン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ｓ５２６１；最終濃度３ｎＭ）、Ｌ−アスコルビン酸二リン酸（Ｓｉｇｍａ Ａ８９６０；最終濃度５０μｇ／ｍｌ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（１００×画分Ｖ ７．５％溶液Ｇｉｂｃｏ １５２６０−０３７。インスリン、アポトランスフェリン、プロゲステロン、プトレシン、及びセレン酸ナトリウムはＮ２ミックスの成分であることに留意されたい。
補足物
培養培地 1: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), FGF2 (8 ng/ml), TGFβ1 (2 ng/ml), ROCKi (Y27632 10 μM), AXINs (IWR1, 2 μM) and SRCi (CGP77675, 1.5 μM).
培養培地2: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), FGF2 (8 ng/ml), TGFβ1 (2 ng/ml), ROCKi (Y27632 10 μM), AXINs (IWR1, 2 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM), BMPi (LDN-193189 0.2 μM).
培養培地3: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), FGF2 (8 ng/ml), TGFβ1 (2 ng/ml), ROCKi (Y27632 10 μM), AXINs (IWR1, 2 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM) and PKCi (Go6983 0.5 μM).
培養培地4: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), FGF2 (8 ng/ml), TGFβ1 (2 ng/ml), ROCKi (Y27632 10 μM), AXINs (IWR1, 2 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM), BMPi (LDN-193189 0.2 μM) and PKCi (Go6983 0.5 μM).
培養培地5: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), FGF2 (8 ng/ml), TGFβ1 (2 ng/ml), ROCKi (Y27632 10 μM), AXINs (IWR1, 2 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM).
培養培地6: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), FGF2 (8 ng/ml), TGFβ1 (2 ng/ml), ROCKi (Y27632 10 μM), AXINs (IWR1, 2 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM), BMPi (LDN-193189 0.2 μM).
培養培地7: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), FGF2 (8 ng/ml), TGFβ1 (2 ng/ml), ROCKi (Y27632 10 μM), AXINs (IWR1, 2 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM) and PKCi (Go6983 0.5 μM).
培養培地8: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), FGF2 (8 ng/ml), TGFβ1 (2 ng/ml), ROCKi (Y27632 10 μM), AXINs (IWR1, 2 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM), BMPi (LDN-193189 0.2 μM) and PKCi (Go6983 0.5 μM).
培養培地9: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), TGFβ1 (2 ng/ml), ROCKi (Y27632 10 μM), AXINs (IWR1, 2 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM).
培養培地10: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), TGFβ1 (2 ng/ml), ROCKi (Y27632 10 μM), AXINs (IWR1, 2 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM), BMPi (LDN-193189 0.2 μM).
培養培地11: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), TGFβ1 (2 ng/ml), ROCKi (Y27632 10 μM), AXINs (IWR1, 2 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM) and PKCi (Go6983 0.5 μM).
培養培地12: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), TGFβ1 (2 ng/ml), ROCKi (Y27632 10 μM), AXINs (IWR1, 2 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM), BMPi (LDN-193189 0.2 μM) and PKCi (Go6983 0.5 μM).
培養培地13: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), FGF2 (8 ng/ml), TGFβ1 (2 ng/ml), ROCKi (Y27632 10 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM).
培養培地14: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), FGF2 (8 ng/ml), TGFβ1 (2 ng/ml), ROCKi (Y27632 10 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM), BMPi (LDN-193189 0.2 μM).
培養培地15: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), FGF2 (8 ng/ml), TGFβ1 (2 ng/ml), ROCKi (Y27632 10 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM) and PKCi (Go6983 0.5 μM).
培養培地16: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), FGF2 (8 ng/ml), TGFβ1 (2 ng/ml), ROCKi (Y27632 10 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM), BMPi (LDN-193189 0.2 μM) and PKCi (Go6983 0.5 μM).
培養培地17: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), TGFβ1 (2 ng/ml), ROCKi (Y27632 10 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM).
培養培地18: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), TGFβ1 (2 ng/ml), ROCKi (Y27632 10 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM), BMPi (LDN-193189 0.2 μM).
培養培地19: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), TGFβ1 (2 ng/ml), ROCKi (Y27632 10 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM) and PKCi (Go6983 0.5 μM).
培養培地20: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), TGFβ1 (2 ng/ml), ROCKi (Y27632 10 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM), BMPi (LDN-193189 0.2 μM) and PKCi (Go6983 0.5 μM).
培養培地21: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), ROCKi (Y27632 10 μM), AXINs (IWR1, 2 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM).
培養培地22: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), ROCKi (Y27632 10 μM), AXINs (IWR1, 2 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM), BMPi (LDN-193189 0.2 μM).
培養培地23: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), ROCKi (Y27632 10 μM), AXINs (IWR1, 2 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM) and PKCi (Go6983 0.5 μM).
培養培地24: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), ROCKi (Y27632 10 μM), AXINs (IWR1, 2 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM), BMPi (LDN-193189 0.2 μM) and PKCi (Go6983 0.5 μM).
培養培地25: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), TGFβ1 (2 ng/ml), ROCKi (Y27632 10 μM), AXINs (IWR1, 2 μM).
培養培地26: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), TGFβ1 (2 ng/ml), ROCKi (Y27632 10 μM), AXINs (IWR1, 2 μM), BMPi (LDN-193189 0.2 μM).
培養培地27: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), TGFβ1 (2 ng/ml), ROCKi (Y27632 10 μM), AXINs (IWR1, 2 μM) and PKCi (Go6983 0.5 μM).
培養培地28: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), TGFβ1 (2 ng/ml), ROCKi (Y27632 10 μM), AXINs (IWR1, 2 μM), BMPi (LDN-193189 0.2 μM) and PKCi (Go6983 0.5 μM).
培養培地29: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), TGFβ1 (2 ng/ml), ROCKi (Y27632 10 μM), AXINs (IWR1, 2 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM), FGFRi (PD173074 0.1 μM).
培養培地30: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), TGFβ1 (2 ng/ml), ROCKi (Y27632 10 μM), AXINs (IWR1, 2 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM), FGFRi (PD173074 0.1 μM), BMPi (LDN-193189 0.2 μM).
培養培地31: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), TGFβ1 (2 ng/ml), ROCKi (Y27632 10 μM), AXINs (IWR1, 2 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM), FGFRi (PD173074 0.1 μM) and PKCi (Go6983 0.5 μM).
培養培地32: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), TGFβ1 (2 ng/ml), ROCKi (Y27632 10 μM), AXINs (IWR1, 2 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM), FGFRi (PD173074 0.1 μM), BMPi (LDN-193189 0.2 μM) and PKCi (Go6983 0.5 μM).
培養培地33: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), TGFβ1 (2 ng/ml), ROCKi (Y27632 10 μM), AXINs (IWR1, 2 μM), FGFRi (PD173074 0.1 μM).
培養培地34: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), TGFβ1 (2 ng/ml), ROCKi (Y27632 10 μM), AXINs (IWR1, 2 μM), FGFRi (PD173074 0.1 μM), BMPi (LDN-193189 0.2 μM).
培養培地35: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), TGFβ1 (2 ng/ml), ROCKi (Y27632 10 μM), AXINs (IWR1, 2 μM), FGFRi (PD173074 0.1 μM) and PKCi (Go6983 0.5 μM).
培養培地36: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), ROCKi (Y27632 10 μM), AXINs (IWR1, 2 μM), FGFRi (PD173074 0.1 μM), BMPi (LDN-193189 0.2 μM) and PKCi (Go6983 0.5 μM).
培養培地37: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), TGFβ1 (2 ng/ml), ROCKi (Y27632 10 μM), AXINs (IWR1, 2 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM), TGFRi (SB431542 2 μM).
培養培地38: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), ROCKi (Y27632 10 μM), AXINs (IWR1, 2 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM), TGFRi (SB431542 2 μM), BMPi (LDN-193189 0.2 μM).
培養培地39: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), ROCKi (Y27632 10 μM), AXINs (IWR1, 2 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM), TGFRi (SB431542 2 μM) and PKCi (Go6983 0.5 μM).
培養培地40: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), ROCKi (Y27632 10 μM), AXINs (IWR1, 2 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM), TGFRi (SB431542 2 μM), BMPi (LDN-193189 0.2 μM) and PKCi (Go6983 0.5 μM).
細胞：Ｏｃｔ４−ＧＦＰを有するＷＩＢＲ３ ｈＥＳＣ株（Ｇａｆｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２０１３；Ｄｅｃ １２；５０４（７４７９）：２８２−６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２７４５．Ｅｐｕｂ ２０１３ Ｏｃｔ ３０に記載される）。
デルタＰＥＯｃｔ４−ＧＦＰレポーターを有するＷＩＢＲ３ ｈＥＳＣ株（Ｇａｆｎｉ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ２０１３；Ｄｅｃ １２；５０４（７４７９）：２８２−６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２７４５．Ｅｐｕｂ ２０１３ Ｏｃｔ ３０に記載される）。
上記細胞をゼラチン／ＤＲ４被覆プレート上、５％Ｏ２で最大２１継代まで拡大した。
分析：上記細胞をＯＣＴ−ＧＦＰ＋レポーター又はデルタＰＥＯｃｔ４−ＧＦＰレポーターについてＦＡＣＳ分析により評価した。
結果
図１は、Ｏｃｔ４−ＧＦＰを有するＷＩＢＲ３ ｈＥＳＣ株のＦＡＣＳ分析を説明するグラフである。結果は、上記細胞が記載される条件において多能性を維持することを示す。
図２は、デルタＰＥＯｃｔ４−ＧＦＰレポーターを有するＷＩＢＲ３ ｈＥＳＣ株のＦＡＣＳ分析を説明するグラフである。結果は、上記細胞が記載される条件において多能性を維持することを示す。
実施例２
材料及び方法
基本培地
Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ２１１０３−０４９）及びＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０６−１１７０−５０−１Ａ）の１：１ミックス、すなわち、合計４７５ｍｌ、ペニシリン−ストレプトマイシン５ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ０３−０３３−１Ｂ）、Ｌ−グルタミン５ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ−０２−０２２−１Ｂ）、ＮＥＡＡ−５ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ０１−３４０−１Ｂ）、５０μｌの５０ｍＭストックベータ−メルカプトエタノール（１バイル）、Ｂ２７補足物５ｍｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １７５０４−０４４）、インスリン（ＳｉｇｍａＩ−１８８２；最終濃度−１２．５μｇ／ｍｌ）、アポトランスフェリン（ＳｉｇｍａＴ−１１４７；最終濃度１００μｇ／ｍｌ）、プロゲステロン（Ｓｉｇｍａ Ｐ８７８３）最終濃度０．０２μｇ／ｍｌ、プトレシン（ＳｉｇｍａＰ５７８０；最終濃度１６μｇ／ｍｌ、亜セレン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ｓ５２６１）、培地５００ｍｌ当たり５μｌの３ｍＭストック溶液を添加、Ｌ−アスコルビン酸二リン酸（Ｓｉｇｍａ Ａ８９６０）（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（１００×画分Ｖ ７．５％溶液Ｇｉｂｃｏ１５２６０−０３７。
補足物
実施例１の通り。
細胞：ＷＩＳ２ ｈＥＳＣ株
該細胞をビトロネクチン被覆プレート上、５％Ｏ２で１２継代及び２０継代拡大した。
分析：上記細胞を顕微鏡により評価した。
結果
図３Ａ〜図３Ｆは、示される選択された条件でのＰ１２の多能性細胞コロニーの代表的な画像である。図３Ａ−条件１、図３Ｂ−条件２、図３Ｃ−条件３、図３Ｄ−条件４、図３Ｅ−条件９、図３Ｆ−条件１１。
図４Ａ〜図４Ｄは、示される選択された条件でのＰ２０の多能性細胞コロニーの代表的な画像である。図４Ａ−条件９、図４Ｂ−条件１０、図４Ｃ−条件１１、図４Ｄ−条件４。
実施例３
材料及び方法
基本培地
Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ２１１０３−０４９）及びＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０６−１１７０−５０−１Ａ）の１：１ミックス、すなわち、合計４７５ｍｌ、ペニシリン−ストレプトマイシン５ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０３−０３３−１Ｂ）、Ｌ−グルタミン５ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ−０２−０２２−１Ｂ）、ＮＥＡＡ−５ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０１−３４０−１Ｂ）、５０μｌの５０ｍＭストックベータ−メルカプトエタノール（１バイル）、Ｂ２７補足物５ｍｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ１７５０４−０４４）、インスリン（Ｓｉｇｍａ Ｉ−１８８２；最終濃度−１２．５μｇ／ｍｌ）、アポトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ Ｔ−１１４７）最終濃度１００μｇ／ｍｌ、プロゲステロン（Ｓｉｇｍａ Ｐ８７８３）最終濃度０．０２μｇ／ｍｌ、プトレシン（ＳｉｇｍａＰ５７８０）最終濃度１６μｇ／ｍｌ、亜セレン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ｓ５２６１）培地５００ｍｌ当たり３ｍＭストック溶液５μｌを添加、Ｌ−アスコルビン酸二リン酸（Ｓｉｇｍａ Ａ８９６０）（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）、ＢＳＡ（１００×画分Ｖ ７．５％溶液Ｇｉｂｃｏ １５２６０−０３７−５００ｍｌ培地ボトル当たり０．１６ｍｌ。
補足物
実施例１の通り。
細胞：ＷＩＳ２ ｈＥＳＣ株
上記細胞をゼラチン／ＤＲ４被覆プレート上、５％Ｏ２で１８継代〜２０継代に亘って拡大した。
分析：上記細胞をアルカリホスファターゼ幹細胞マーカー（ＡＰ）に対して染色し、顕微鏡により評価した。
結果
図５Ａ〜図５Ｃは、示される選択された条件でのＰ１８〜Ｐ２０の多能性細胞コロニーの代表的な画像である。図５Ａ−条件９、図５Ｂ−条件１０、図５Ｃ−条件４。
実施例４
材料及び方法
基本培地
Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ２１１０３−０４９）及びＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０６−１１７０−５０−１Ａ）の１：１ミックス、すなわち、合計４７５ｍｌ、ペニシリン−ストレプトマイシン５ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０３−０３３−１Ｂ）、ＮＥＡＡ−５ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０１−３４０−１Ｂ）、５０μｌの５０ｍＭストックベータ−メルカプトエタノール（１バイル）、Ｂ２７補足物５ｍｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １７５０４−０４４）、インスリン（Ｓｉｇｍａ Ｉ−１８８２）−１２．５マイクロｇ／ｍｌインスリン）、アポトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ Ｔ−１１４７）最終濃度１００μｇ／ｍｌ、プロゲステロン（Ｓｉｇｍａ Ｐ８７８３）最終濃度０．０２μｇ／ｍｌ、プトレシン（ＳｉｇｍａＰ５７８０）最終濃度１６μｇ／ｍｌ、亜セレン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ｓ５２６１）培地５００ｍｌ当たり３ｍＭストック溶液５μｌを添加、Ｌ−アスコルビン酸二リン酸（Ｓｉｇｍａ Ａ８９６０）（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）、ＢＳＡ（１００×画分Ｖ ７．５％溶液Ｇｉｂｃｏ １５２６０−０３７−５００ｍｌ培地ボトル当たり０．１６ｍｌ。
補足物
実施例１の通り。
細胞：ＦＸ７１ヒトｉＰＣ株をゼラチン／ＤＲ４フィーダー細胞被覆プレート上、５％Ｏ２で拡大した。
分析：上記細胞をアルカリホスファターゼ幹細胞マーカー（ＡＰ）に対して染色し、顕微鏡により評価した。
結果
図６Ａ〜図６Ｆは、Ｌ−グルタミンを含まない特定の条件下で拡大されたヒト無感作ＥＳｃ／ｉＰＳＣの画像である。図６Ａ−条件１、図６Ｂ−条件２、図６Ｃ−条件３、図６Ｄ−条件４、図６Ｅ−条件９、図６Ｆ−条件１１。これらの条件において外因性Ｌ−グルタミン補足を伴わないコロニーの拡大を示す、種々のＷＩＳ−ＮＨＳＭ条件における細胞の代表的な画像を示す。
実施例５
材料及び方法
基本培地
Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ２１１０３−０４９）及びＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０６−１１７０−５０−１Ａ）の１：１ミックス、すなわち、合計４７５ｍｌ。代替的には、４７５ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＨＥＰＥＳを含まないＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０６−１１７０−５０−１Ａ）。上記培地を以下で補足する、すなわち、ペニシリン−ストレプトマイシン５ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０３−０３３−１Ｂ）、２００ｍＭ溶液のＬ−グルタミン５ｍｌ（最終濃度２ｍＭ）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ−０２−０２２−１Ｂ）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０１−３４０−１Ｂ）−５ｍｌの×１００溶液を培地に添加し合計５００ｍｌとする［×１００溶液の組成、Ｌ−アラニン０．８９グラム／リットル、Ｌ−アスパラギン・Ｈ２Ｏ １．５０グラム／リットル、Ｌ−アスパラギン酸１．３３グラム／リットル、Ｌ−グルタミン酸１．４７グラム／リットル、グリシン０．７５グラム／リットル、Ｌ−プロリン１．１５グラム／リットル、及びＬ−セリン１．０５グラム／リットル］、５０μｌの５０ｍＭストックベータ−メルカプトエタノール（１バイル）、Ｂ２７補足物１０ｍｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １７５０４−０４４）又は異物不含Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ１４８６７−０１）、インスリン（Ｓｉｇｍａ Ｉ−１８８２；最終濃度１２．５〜２５μｇ／ｍｌ）、アポトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ Ｔ−１１４７；最終濃度１００μｇ／ｍｌ）、プロゲステロン（Ｓｉｇｍａ Ｐ８７８３、最終濃度０．０２μｇ／ｍｌ）、プトレシン（ＳｉｇｍａＰ５７８０；最終濃度１６μｇ／ｍｌ）、亜セレン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ｓ５２６１；培地５００ｍｌ当たり３ｍＭストック溶液５μｌで最終濃度３ｎＭを生じる）、ヒト血清アルブミン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０５−７２０−１Ｂによる１０％溶液、５００ｍｌの培地ボトル当たり２ｍｌを添加し最終濃度０．４％のヒト血清アルブミンを生じる）又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（１００×画分Ｖ ７．５％溶液Ｇｉｂｃｏ １５２６０−０３７、５００ｍｌの培地ボトル当たり０．１６ｍｌを添加し最終濃度０．００２４％ＢＳＡを生じる）。
本発明の幾つかの実施例による基本培地はアスコルビン酸を含まず、アスコルビン酸は以下に示される幾つかの培地において補足され得ることに留意されたい。
図７は、本発明の幾つかの培地の組成を概略的に説明する。
図８〜図１２は、上に（実施例５において）記載される基本培地に添加される培養培地補足物（条件４１−１３１）の非限定的な例を提供する。
補足物
培地 41: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), and PKCi (Go6983 2 μM).
培地 42: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983 2 μM), and Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml).
培地 43: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983 2 μM), and GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM).
培地 44: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), and Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml).
培地 45: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), and ROCKi (Y27632 2 μM).
培地 46: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632 2 μM), and SRCi (CGP77675, 1.5 μM).
培地 47: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), and P38i (BIRB796, 1 μM).
培地 48: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632 2 μM), and P38i (BIRB796, 1 μM).
培地 49: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), and SRCi (CGP77675, 1.5 μM).
培地 50: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632 2 μM), and RAFi (SB590885, 0.5 μM).
培地 51: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 2.5 μM), PKCi (Go6983 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), and RAFi (SB590885, 0.5 μM).
培地 52: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 2.5 μM), PKCi (Go6983 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632 2 μM), and P38i (BIRB796, 0.1 μM).
培地 53: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 2.5 μM), PKCi (Go6983 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), SRCi (CGP77675, 1.5 μM), and RAFi (SB590885, 0.5 μM).
培地 54: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 2.5 μM), PKCi (Go6983 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632 2 μM), RAFi (SB590885, 0.5 μM), and SRCi (CGP77675, 1.5 μM).
培地 55: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), RAFi- SB590885, 0.5 μM, and P38i (BIRB796, 0.1 μM).
培地 56: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632 2 μM), P38i (BIRB796, 0.1 μM), and SRCi (CGP77675, 1.5 μM).
培地 57: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), SRCi (CGP77675, 1.5 μM), RAFi (SB590885, 0.5 μM), and BMPi (LDN-193189, 0.2 μM).
培地 58: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632 2 μM), RAFi (SB590885, 0.5 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM), and BMPi (LDN-193189 0.2 μM).
培地 59: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), RAFi (SB590885, 0.5 μM), P38i (BIRB796, 0.1 μM), and BMPi (LDN-193189 0.2 μM).
培地 60: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632 2 μM), P38i (BIRB796, 0.1 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM), and BMPi (LDN-193189 0.2 μM).
培地 61: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), SRCi (CGP77675, 1.5 μM), and BMP4 (5 ng/ml).
培地 62: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632, 2 μM), RAFi (SB590885, 0.5 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM), and BMP4 (5 ng/ml).
培地 63: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), RAFi (SB590885, 0.5 μM), P38i (BIRB796, 0.1 μM), and BMP4 (5 ng/ml).
培地 64: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632, 2 μM), P38i (BIRB796, 0.1 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM), and BMP4 (5 ng/ml).
培地 65: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632, 2 μM), and BMP4 (5 ng/ml).
培地 66: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), and BMP4 (5 ng/ml).
培地 67: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632, 2 μM), and BMP4 (5 ng/ml).
培地 68: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), P38i (BIRB796, 0.1 μM), ROCKi (Y27632, 2 μM), and BMP4 (5 ng/ml).
培地 69: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632, 2 μM), and BMPi (LDN-193189, 0.2 μM).
培地 70: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), and BMPi (LDN-193189, 0.2 μM).
培地 71: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632, 2 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM), and BMPi (LDN-193189, 0.2 μM).
培地 72: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632, 2 μM), P38i (BIRB796, 0.1 μM), and BMPi (LDN-193189, 0.2 μM).
培地 73: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632, 2 μM), and FGFRi (PD173074, 0.1 μM).
培地 74: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), and FGFRi (PD173074, 0.1 μM).
培地 75: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632, 2 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM), and FGFRi (PD173074, 0.1 μM).
培地 76: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632, 2 μM), P38i (BIRB796, 0.1 μM), and FGFRi (PD173074, 0.1 μM).
培地 77: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), SRCi (CGP77675, 1.5 μM), and FGFRi (PD173074, 0.1 μM).
培地 78: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632, 2 μM), P38i (BIRB796, 0.1 μM), and FGFRi (PD173074, 0.1 μM).
培地 79: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), P38i (BIRB796, 0.1 μM), and FGFRi (PD173074, 0.1 μM).
培地 80: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), SRCi (CGP77675, 1.5 μM), FGFRi (PD173074, 0.1 μM), and P38i (BIRB796, 1 μM).
培地 81: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), SRCi (CGP77675, 1.5 μM), RAFi (SB590885, 0.5 μM), and Activin A (20 ng/ml).
培地 82: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632, 2 μM), RAFi (SB590885, 0.5 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM), and Activin A (20 ng/ml).
培地 83: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), RAFi- SB590885, 0.5 μM, P38i (BIRB796, 0.1 μM), and Activin A (20 ng/ml).
培地 84: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632, 2 μM), P38i (BIRB796, 0.1 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM), and Activin A (20 ng/ml).
培地 85: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901 1 μM), AXINs (IWR1 2.5 μM), PKCi (Go6983 2 μM), GSK3βi (CHIR99021 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632 2 μM), and Activin A (20 ng/ml).
培地 86: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), and Activin A (20 ng/ml).
培地 87: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632, 2 μM), and Activin A (20 ng/ml).
培地 88: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), P38i (BIRB796, 0.1 μM), ROCKi (Y27632, 2 μM), and Activin A (20 ng/ml).
培地 89: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632, 2 μM), and TGFRi (SB431542, 2 μM).
培地 90: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), and TGFRi (SB431542, 2 μM).
培地 91: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632, 2 μM), SRCi (CGP77675, 1.5 μM), TGFRi (SB431542, 2 μM).
培地 92: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632, 2 μM), P38i (BIRB796, 0.1 μM), and TGFRi (SB431542, 2 μM).
培地 93: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632, 2 μM), FGFRi (PD173074, 0.1 μM), and TGFRi (SB431542, 2 μM).
培地 94: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), FGFRi (PD173074, 0.1 μM) and TGFRi (SB431542, 2 μM).
培地 95: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632, 2 μM), FGFRi (PD173074, 0.1 μM), TGFRi (SB431542, 2 μM), and SRCi (CGP77675, 1.5 μM).
培地 96: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632, 2 μM), P38i (BIRB796, 0.1 μM), FGFRi (PD173074, 0.1 μM), and TGFRi (SB431542, 2 μM).
培地 97: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), SRCi (CGP77675, 1.5 μM), FGFRi (PD173074, 0.1 μM), and TGFRi (SB431542, 2 μM).
培地 98: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632, 2 μM), RAFi (SB590885, 0.5 μM), FGFRi (PD173074, 0.1 μM), and TGFRi (SB431542, 2 μM).
培地 99: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), SRCi (CGP77675, 1.5 μM), FGFRi (PD173074, 0.1 μM), TGFRi (SB431542, 2 μM) and P38i (BIRB796, 0.1 μM).
培地 100: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 4 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), and Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml).
培地 101: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 4 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml) and ROCKi (Y27632, 2 μM).
培地 102: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 4 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml) and P38i (BIRB796, 2 μM).
培地 103: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 4 μM), GSK3βi (CHIR99021 3 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632, 2 μM) and P38i (BIRB796, 2 μM).
培地 104: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 4 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), P38i (BIRB796, 2 μM) and JNKi (SP600125, 5 μM).
培地 105: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 4 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632, 2 μM), P38i (BIRB796, 2 μM) and JNKi (SP600125, 5 μM).
培地 106: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 4 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), P38i (BIRB796, 2 μM), and ERK5i (BIX02189, 5 μM).
培地 107: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 4 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632, 2 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), and ERK5i (BIX02189, 5 μM).
培地 108: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 4 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml) and TGFRi (SB431542, 2 μM).
培地 109: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 4 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632, 2 μM), and TGFRi (SB431542, 2 μM).
培地 110: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 4 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), Ｌ−アスコルビン酸L-ascorbic acid (50 μg/ml), and FGFRi (PD173074, 0.1 μM).
培地 111: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 4 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632, 2 μM), and FGFRi (PD173074, 0.1 μM).
培地 112: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 4 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), P38i (BIRB796, 2 μM), and TGFRi (SB431542, 2 μM).
培地 113: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 4 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632, 2 μM), P38i (BIRB796, 2 μM) and TGFRi (SB431542, 2 μM).
培地 114: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 4 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), P38i (BIRB796, 2 μM) and FGFRi (PD173074, 0.1 μM).
培地 115: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 4 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632, 2 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), and FGFRi (PD173074, 0.1 μM).
培地 116: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 4 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), and LSDi (TCP, 5 μM).
培地 117: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 4 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632, 2 μM) and LSDi (TCP, 5 μM).
培地 118: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 4 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), P38i (BIRB796, 2 μM) and LSDi (TCP, 5 μM).
培地 119: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 4 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), P38i (BIRB796, 2 μM) and LSDi (TCP, 5 μM).
培地 120: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 4 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml) and Forskolin (5 μM).
培地 121: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 4 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632, 2 μM) and Forskolin (5 μM).
培地 122: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 4 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), P38i (BIRB796, 2 μM), and Forskolin (5 μM).
培地 123: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 4 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632 2, μM), P38i (BIRB796, 2 μM), and Forskolin (5 μM).
培地 124: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 4 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), and DOT1Li (SGC0946, 5 μM).
培地 125: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 4 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632, 2 μM), and DOT1Li (SGC0946, 5 μM).
培地 126: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 4 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), P38i (BIRB796, 2 μM) and DOT1Li (SGC0946, 5 μM).
培地 127: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 4 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632, 2 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), and DOT1Li (SGC0946, 5 μM).
培地 128: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 4 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), P38i (BIRB796, 2 μM), JNKi (SP600125 5 μM), and ERK5i (BIX02189, 5 μM).
培地 129: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 4 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632, 2 μM), P38i (BIRB796, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), and ERK5i (BIX02189, 5 μM).
培地 130: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 4 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), and ERK5i (BIX02189, 5 μM).
培地 131: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 4 μM), GSK3βi (CHIR99021, 3 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), ROCKi (Y27632, 2 μM) and ERK5i (BIX02189, 5 μM).
言及されるように、本発明の幾つかの実施形態の培養培地は、無感作状態で無感作ＰＳＣを維持することができ、
（ｉ）上記無感作ＰＳＣが雌性ＰＳＣである場合、該無感作雌性ＰＳＣはＸ不活性特異的転写産物（ＸＩＳＴ）遺伝子のプロモーターの２つの非メチル化アレルを有する、及び
（ｉｉ）上記無感作ＰＳＣが雄性ＰＳＣである場合、該無感作雄性ＰＳＣはＸＩＳＴ遺伝子の１つの非メチル化アレルを有する、
及び／又は
前記無感作ＰＳＣにおける転写因子Ｅ３（ＴＦＥ３）の発現レベルが、免疫染色アッセイによって特定される１以上である細胞質に対する核の発現比率を特徴とする。
図１７Ａ〜図１７Ｅは、結果的には、ＸＩＳＴプロモーター中（配列番号７０に示されるアンプリコン中）に特定されるかかる非メチル化アレルの例を示す。これらの結果は、試験した全ての培養培地で培養される雄性及び雌性の無感作ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣが様々なＷＩＳ−ＮＨＳＭ条件下で独特の前Ｘ不活性化（ｐｒｅ−Ｘ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）状態を保持することを実証する。
対照的に、図１７Ｆは、雄性細胞においてＸＩＳＴアレルが完全にメチル化された（すなわち、ＸＩＳＴプロモーターの大半のＣｐＧ部位がメチル化されている）、及び雌性細胞においてＸＩＳＴ遺伝子のプロモーターの１つのアレルがメチル化されている、感作細胞の例を示す。
さらに、本明細書の下記表１は、本発明のいくつかの実施形態の培養培地において培養された無感作ＰＳＣにおける相対核／細胞質ＴＦＥ３富化（平均値）を要約する。
表１：無感作ＰＳＣを、ＤＲ４放射線照射ＭＥＦ細胞上、及び０．２％ゼラチン被覆プレート上、３７℃の５％Ｏ２条件で１４日間に亘り指示される培養培地中で拡大した。培養培地はいずれもＬ−アスコルビン酸を含んだ（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）。小分子の略語の対訳：ＬＩＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＲＫ１／２ｉ（ＰＤ０３２５９０１ １μＭ）、ＡＸＩＮｓ（ＩＷＲ１ ５μＭ）、ＰＫＣｉ（Ｇｏ６９８３ ４μＭ）、ＧＳＫ３βｉ（ＣＨＩＲ９９０２１ １．５μＭ）、Ｐ３８ｉ（ＢＩＲＢ７９６ ２μＭ）、ＪＮＫｉ（ＳＰ６００１２５ ５μＭ）、ＳＲＣｉ（ＣＧＰ７７６７５ １μＭ）。
上の表１に示されるように、試験した全ての培養培地は、核と細胞質の間のＴＦＥ３富化が１以上の比率を特徴とする、無感作状態で無感作ＰＳＣを維持可能であった。
実施例６
材料及び方法
基本培地
Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ２１１０３−０４９）及びＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０６−１１７０−５０−１Ａ）の１：１ミックス、すなわち、合計４７５ｍｌ。代替的には、４７５ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＨＥＰＥＳを含まないＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０６−１１７０−５０−１Ａ）。上記培地を以下で補足する、すなわち、ペニシリン−ストレプトマイシン５ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ０３−０３３−１Ｂ）、２００ｍＭ溶液のＬ−グルタミン５ｍｌ（最終濃度２ｍＭ）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ−０２−０２２−１Ｂ）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０１−３４０−１Ｂ）−５ｍｌの×１００溶液を培地に添加し合計５００ｍｌとする［×１００溶液の組成、Ｌ−アラニン０．８９グラム／リットル、Ｌ−アスパラギン・Ｈ２Ｏ １．５０グラム／リットル、Ｌ−アスパラギン酸１．３３グラム／リットル、Ｌ−グルタミン酸１．４７グラム／リットル、グリシン０．７５グラム／リットル、Ｌ−プロリン１．１５グラム／リットル、及びＬ−セリン１．０５グラム／リットル］、５０μｌの５０ｍＭストックベータ−メルカプトエタノール （１バイル）、Ｂ２７補足物１０ｍｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １７５０４−０４４）又は異物不含Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ１４８６７−０１）、インスリン（Ｓｉｇｍａ Ｉ−１８８２；最終濃度１２．５μｇ／ｍｌ）、アポトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ Ｔ−１１４７；最終濃度１００μｇ／ｍｌ）、プロゲステロン（Ｓｉｇｍａ Ｐ８７８３、最終濃度０．０２μｇ／ｍｌ）、プトレシン（ＳｉｇｍａＰ５７８０；最終濃度１６μｇ／ｍｌ）、亜セレン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ｓ５２６１；培地５００ｍｌ当たり３ｍＭストック溶液５μｌで最終濃度３ｎＭを生じる）、ヒト血清アルブミン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０５−７２０−１Ｂによる１０％溶液、５００ｍｌの培地ボトル当たり２ｍｌを添加し最終濃度０．４％のヒト血清アルブミンを生じる）又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（１００×画分Ｖ ７．５％溶液Ｇｉｂｃｏ １５２６０−０３７、５００ｍｌの培地ボトル当たり０．１６ｍｌを添加し最終濃度０．００２４％ＢＳＡを生じる）。
本発明の幾つかの実施形態による基本培地はアスコルビン酸を含まず、アスコルビン酸は以下に示される幾つかの培地において補足され得ることに留意されたい。
図１８は、本発明の幾つかの実施形態の培地の組成を概略的に説明する。
図１９は、上に（実施例６において）記載される基本培地に以下の通り添加される培養培地補足物の非限定的な例（図１９の条件１３２〜１４７）を提供する。
補足物
培地132: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), SRCi (CGP77675, 0.5 μM), P38i (BIRB796, 0.25 μM), G9ai (BIX01294, 0.5 μM), and ROCKi (Y27632, 2 μM).
培地133: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), SRCi (CGP77675, 0.5 μM), P38i (BIRB796, 0.25 μM), and G9ai (BIX01294, 0.5 μM).
培地134: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), SRCi (CGP77675, 0.5 μM), P38i (BIRB796, 0.25 μM), G9ai (BIX01294, 0.5 μM), and ROCKi (Y27632, 2 μM).
培地135: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), SRCi (CGP77675, 0.5 μM), P38i (BIRB796, 0.25 μM), and ROCKi (Y27632, 2 μM).
培地136: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), SRCi (CGP77675, 0.5 μM), G9ai (BIX01294, 0.5 μM), and ROCKi (Y27632, 2 μM)
培地137: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), SRCi (CGP77675, 0.5 μM), and G9ai (BIX01294, 0.5 μM).
培地138: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), SRCi (CGP77675, 0.5 μM), G9ai (BIX01294, 0.5 μM), and ROCKi (Y27632, 2 μM).
培地139: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), SRCi (CGP77675, 0.5 μM), and ROCKi (Y27632, 2 μM).
培地140: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), SRCi (CGP77675, 0.5 μM), P38i (BIRB796, 0.25 μM), G9ai (BIX01294, 0.5 μM), ROCKi (Y27632, 2 μM), and RAFi (SB590885, 0.25 μM).
培地141: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), SRCi (CGP77675, 0.5 μM), P38i (BIRB796, 0.25 μM), G9ai (BIX01294, 0.5 μM), and RAFi (SB590885, 0.25 μM),
培地142: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), SRCi (CGP77675, 0.5 μM), P38i (BIRB796, 0.25 μM), G9ai (BIX01294, 0.5 μM), ROCKi (Y27632, 2 μM), and RAFi (SB590885, 0.25 μM)
培地143: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), SRCi (CGP77675, 0.5 μM), P38i (BIRB796, 0.25 μM), ROCKi (Y27632, 2 μM), and RAFi (SB590885, 0.25 μM.
培地144: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), SRCi (CGP77675, 0.5 μM), P38i (BIRB796, 0.25 μM), G9ai (BIX01294, 0.5 μM), ROCKi (Y27632, 2 μM), and SCF (20 ng/ml)
培地145: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), SRCi (CGP77675, 0.5 μM), P38i (BIRB796, 0.25 μM), G9ai (BIX01294, 0.5 μM), and SCF (10 ng/ml),
培地146: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), SRCi (CGP77675, 0.5 μM), P38i (BIRB796, 0.25 μM), G9ai (BIX01294, 0.5 μM), ROCKi (Y27632, 2 μM), and SCF (10 ng/ml).
培地147: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901, 1 μM), AXINs (IWR1, 5 μM), PKCi (Go6983, 2 μM), JNKi (SP600125, 5 μM), GSK3βi (CHIR99021, 1.5 μM), Ｌ−アスコルビン酸 (50 μg/ml), SRCi (CGP77675, 0.5 μM), P38i (BIRB796, 0.25 μM), ROCKi (Y27632, 2 μM), and SCF (10 ng/ml).
実験結果
図２０〜２１は、上に記載される培養培地（培地１３２〜１４７）いずれもが無感作未分化状態及び多能性状態にヒト多能性幹細胞を維持することを実証する。
図２２Ａ〜図２２Ｃは、結論的には、無感作及びプライム多能性幹細胞に対するＸＩＳＴプロモーター（配列番号７０に示されるアンプリコン）のメチル化アッセイの例を示す。図２２Ａ〜図２２Ｂのこれらの結果は、試験した全ての培養培地上で培養された雄性及び雌性の無感作ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣが様々なＷＩＳ−ＮＨＳＭ条件下で独特の前Ｘ不活性化状態を維持することを実証する。
対照的に、図２２Ｃは、雄性細胞においてＸＩＳＴアレルが完全にメチル化された（すなわち、ＸＩＳＴプロモーターの大半のＣｐＧ部位がメチル化されている）、及び雌性細胞においてＸＩＳＴ遺伝子のプロモーターの１つのアレルがメチル化されている、感作細胞の例を示す。
本発明の幾つかの実施形態の培養培地の無感作ＰＳＣ状態を維持する能力を試験するため、ＴＦＥ３のレベルを細胞の核及び細胞質で測定し、相対比率を特定した。ＷＩＢＲ３ ｈＥＳＣを、３７℃の５％Ｏ２条件においてマトリゲル被覆プレート上、指示される条件で１４日間拡大した。培養培地はいずれもＬ−アスコルビン酸を含んだ（５０μｇ／ｍｌ）。
本明細書中以下の表２は、本発明の幾つかの実施形態の培養培地中で培養された無感作ＰＳＣにおける相対核／細胞質ＴＦＥ３比率を要約する。
表２：無感作ＰＳＣを３７℃の５％Ｏ２条件でＤＲ４放射線照射ＭＥＦ細胞及び０．２％ゼラチン被覆プレート上で１４日間に亘って指示された培養培地で拡大した。培養培地はいずれもＬ−アスコルビン酸（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）を含んだ。小分子の略語の対訳：ＬＩＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＲＫ１／２ｉ（ＰＤ０３２５９０１ １μＭ）、ＡＸＩＮｓ （ＩＷＲ１ ５μＭ）、ＰＫＣｉ（Ｇｏ６９８３ ２μＭ）、ＧＳＫ３βｉ（ＣＨＩＲ９９０２１ １．５μＭ）、Ｐ３８ｉ（ＢＩＲＢ７９６ ０．２５μＭ）、ＪＮＫｉ（ＳＰ６００１２５ ５μＭ）、ＳＲＣｉ（ＣＧＰ７７６７５ ０．５μＭ）、及びＧ９ａｉ（ＢＩＸ０１２９４ ０．５μＭ）。
上の表２に示されるように、無感作ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣは、優先的なＴＦＥ３核局在を保持する。したがって、無感作条件に対して試験された全ての培地は、核と細胞質との間のＴＦＥ３富化比率１以上を特徴とする無感作状態に無感作ＰＳＣを維持することができる。対照的に、プライムＰＳＣに対する条件を使用した場合（例えば、ｍＴＥＳＲ（商標）（ＦＧＦ２／ＴＧＦベータ１）条件（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによる））、細胞質に対する核のＴＦＥ３比率（ｒａｔｉｏｎ）は１より低かった。
実施例７
Ｔｅｔ−Ｏｆｆプロモーター下で内因性ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）アレルを欠き、外因性ＤＮＭＴアレルを保持する先に記載されるＨＵＥＳ６４細胞株（Ｌｉａｏ Ｊ，ｅｔ ａｌ．２０１５．“Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＭＴ１，ＤＮＭＴ３Ａ ａｎｄ ＤＮＭＴ３Ｂ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ”．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２０１５ Ｍａｙ；４７（５）：４６９−７８．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｇ．３２５８．Ｅｐｕｂ ２０１５ Ｍａｒ ３０、参照として本明細書に十分に援用される）を以下の実験に使用した。指示された条件（以下の表３）において、ゼラチン／ＤＲ４被覆プレート上で１０継代（Ｐ１０）に亘ってドキシサイクリンと共に又はそれを伴わずに細胞を拡大し、生存細胞中のＯＣＴ４多能性マーカーに対して培養物を免疫染色した。ｍＴＥＳＲ（商標）で拡大されたプライム細胞は、これらの操作された細胞に対するＤＯＸの添加によって誘導されるＤＮＭＴ１の発現喪失を許容しない。本発明の幾つかの実施形態の培養培地（培地番号１３８及び１３６で拡大された細胞は、この操作されたシステム（上の２つの実施例）におけるＤＮＭＴ１の発現喪失にもかかわらず、高い割合のＯＣＴ４陽性細胞（９３％及び９７％）によって示されるように、それらの多能性を保持する。これらの結果は、プライム多能性細胞ではなく、ヒト無感作細胞がＤＮＭＴ１の発現喪失にも拘わらずそれらの多能性を如何にして維持し得るのかを示す。
表３：小分子の略語の対訳：ＬＩＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＲＫ１／２ｉ（ＰＤ０３２５９０１ １μＭ）、ＡＸＩＮｓ（ＩＷＲ１ ５μＭ）、ＰＫＣｉ（Ｇｏ６９８３ ２μＭ）、ＧＳＫ３βｉ（ＣＨＩＲ９９０２１ １．５μＭ）、Ｐ３８ｉ（ＢＩＲＢ７９６ ０．２５μＭ）、ＪＮＫｉ（ＳＰ６００１２５ ５μＭ）、ＳＲＣｉ（ＣＧＰ７７６７５ ０．５μＭ）、Ｇ９ａｉ（ＢＩＸ０１２９４ ０．５μＭ）、ＲＯＣＫｉ（Ｙ２７６３２ ２μＭ）
実施例８
本発明の無感作ＰＳＣを同一種の又は異種間のキメラの生成に使用することができる。
或る１つの種に由来する無感作ＰＳＣの別の種の初期胚への注入は、細胞サイクルの進行における相違、宿主の形態形成に対する反応性の減少、妊娠のタイミングの相違等を含む様々な理由により打ち負かされる可能性がある。宿主動物におけるキメラ化の効率を増すため、本発明者らは、「細胞チーティング（Ｃｅｌｌ Ｃｈｅａｔｉｎｇ）」又は「細胞競合」の原理を異種間キメラアッセイにおいて採用できることを明らかにした。この目的のため、本発明者らは、「無感作状態」を維持する単離された無感作ヒトＰＳＣを採用し、Ｐ５３レベルの減少を呈するようにそれらを遺伝子操作した。Ｐ５３発現の減少を伴う単離された遺伝子操作された無感作ＰＳＣを、宿主マウス胚に更に注入し、その発生している胚をキメラ化レベルについて分析した。以下に示されるように、野生型（ＷＴ）無感作ＰＳＣはマウス胚の発生に寄与し得ることを示したが、「チーター（ｃｈｅａｔｅｒ）」Ｐ５３枯渇無感作ＰＳＣはキメラ化レベルにおいて著しく高い寄与効率を生じた。
実験方法：
ＬＩＳ３８ ｔｇ−ｐＴｒｉｐ ｌｃｋ ＥＧＦＰ ｐ５３ ｃｒｉｓｐｒ Ｃ２クローンの生成
本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９技術を適用して、Ｐ５３タンパク質を枯渇した変異体を生成した。ヒトＰ５３のＥＸＯＮ３を標的とするｓｇＲＮＡ（一本鎖ガイドＲＮＡ）配列を設計し、この領域に欠失を有する無感作ＰＳＣを樹立し、ｐ５３タンパク質レベルにおける枯渇を検証した。これらの細胞株は、Ｅ２．５マウス胚に注入され、発生するマウス胚においてヒト（ＧＦＰ＋）細胞検出について更に試験するため発生され得ることから、異種間キメラ化アッセイにおける「超競合者（ｓｕｐｅｒ−ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）」として使用した。
実験結果
ＬＩＳ ３８ ＥＧＦＰ ｈＴＰ５３ Ｃ２無感作ヒトｉＰＳ細胞のマウス桑実胚へのマイクロインジェクションは異種間キメラヒト化マウスを生成する
図２３Ａ〜図２３Ｄは、ＬＩＳ３８ ｔｇ−ｐＴｒｉｐ ｌｃｋ ＥＧＦＰ ｐ５３ ｃｒｉｓｐｒ Ｃ２クローンの生成及びこのクローンのＰＳＣ細胞におけるｐ５３発現の不在を表す。
図２４Ａ〜図２４Ｂに示されるように、マウス桑実胚にＬＩＳ ３８ ＥＧＦＰ ｈＴＰ５３ Ｃ２無感作ヒトｉＰＳ細胞が注入された胚は、異種間キメラヒト化マウスを生成する。ＧＦＰ標識化ヒト無感作ｉＰＳ由来細胞のＥ９．５マウス胚の異なる位置への広範囲にわたる統合を実証する代表的な画像を示す。対比染色にはＨｏｅｃｈｓｔ及びＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒを使用した。
これらの結果は、結論的にはＰ５３に対して枯渇された及び／又はドミナントネガティブＰ５３変異、ｃ−ＭＹＣ、ｎ−ＭＹＣ、Ｌ−ＭＹＣ、ＥＤＡＲ若しくはＥＲＡＳを過剰発現する無感作ヒト又は非ヒト霊長類ｉＰＳＣ／ＥＳＣ（Ｄｅｊｏｓｅｚ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｓｅｅ ｃｏｍｍｅｎｔ ｉｎ ＰｕｂＭｅｄ Ｃｏｍｍｏｎｓ ｂｅｌｏｗ Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２０１３ Ｓｅｐ ２７；３４１（６１５３）：１５１１−４、及びＣｌａｖｅｒｉａ Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｓｅｅ ｃｏｍｍｅｎｔ ｉｎ ＰｕｂＭｅｄ Ｃｏｍｍｏｎｓ ｂｅｌｏｗ Ｎａｔｕｒｅ．５００（７４６０）：３９−４４）を、同種又は異種の宿主の着床前胚（胚盤胞、桑実胚）に注入された場合に、同種又は異種間のキメラを生成するための競合細胞として使用できることを示す。
本発明は、その具体的な実施形態と併せて記載されているが、多くの代替物、修飾、及び変化が当業者に明らかであることが明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨及び幅広い範囲に含まれるかかる代替物、修飾、及び変化の全てを包含することが意図される。
本明細書で言及された出版物、特許、及び特許出願はいずれも、各々個別の出版物、特許、又は特許文献が具体的且つ個別に参照により本明細書に援用されると指示されるのと同じ程度に、明細書中への参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。さらに、本出願における任意の参照文献の引用又は特定は、かかる参照文献が本発明に対する従来技術として利用可能であるという自認として解釈されるものではない。項目の見出しが使用される程度まで、それらが必ずしも限定として解釈されるものではない。
参考文献

Claims (50)

  1. ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、Ａｘｉｎ安定化剤とを含む培養培地。
  2. ＰＫＣ阻害剤を更に含む、請求項１に記載の培養培地。
  3. ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、Ａｘｉｎ安定化剤と、ＰＫＣ阻害剤とを含む培養培地。
  4. ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＲＣ阻害剤、アスコルビン酸、ＰＫＡアゴニスト、ＹＡＰ／ＴＡＺ阻害剤、ＮＯＴＣＨ阻害剤、ＳＨＨ阻害剤、ＴＧＦβＲ阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、ＦＧＦＲ阻害剤、ＪＮＫ阻害剤、ＥＲＫ５阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤、ＡＲＡＦｉ、ＣＲＡＦｉ、ｐ３８阻害剤、ＧＳＫ３ｂ阻害剤、ＬＳＤ１阻害剤、ＰＩ３Ｋ活性化剤、ＳＭＡＤ活性化剤、及びＤＯＴ１Ｌ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤を更に含む、請求項１、２、又は３に記載の培養培地。
  5. 前記ＳＭＡＤ活性化剤が、アクチビンＡ、ＴＧＦβ１、及びＢＭＰ４からなる群から選択される、請求項４に記載の培養培地。
  6. ＧＳＫ３ｂ阻害剤を更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の培養培地。
  7. ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、Ａｘｉｎ安定化剤と、ＰＫＣ阻害剤と、ＧＳＫ３ｂ阻害剤とを含む、培養培地。
  8. 塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子受容体（ＴＧＦＲ）阻害剤、ＧＳＫ３ｂ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、Ｐ３８阻害剤、ＪＮＫ阻害剤、ＮＯＴＣＨ阻害剤、ＳＲＣ阻害剤、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）、インスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦＩＩ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達阻害剤、ソニックヘッジホッグ経路（ＳＨＨ）阻害剤、ＥＲＫ５阻害剤、フォルスコリン、ケンパウロン、ＢａｙＫ８６４４、Ｇ９ａの阻害剤、Ｇｌｐの阻害剤、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＹＡＰ／ＴＡＺ阻害剤、Ｌ−アスコルビン酸、ＬＳＤ１阻害剤、及びＤＯＴ１Ｌ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤を更に含む、請求項１〜７のいずれかに記載の培養培地。
  9. ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＳＲＣ阻害剤とを含む培養培地。
  10. ＡＸＩＮ複合安定化剤（ＡＸＩＮｓ）を更に含む、請求項９に記載の培養培地。
  11. ＧＳＫ３β阻害剤を更に含む、請求項９又は１０に記載の培養培地。
  12. ｐ３８阻害剤を更に含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の培養培地。
  13. ＥＲＫ１／２阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、ｐ３８阻害剤、ＳＴＡＴ３活性化剤、並びにＳＲＣ阻害剤、及びＡＸＩＮ複合安定化剤（ＡＸＩＮｓ）からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤を含む培養培地。
  14. ＲＯＣＫ阻害剤を更に含む、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の培養培地。
  15. ＪＮＫ阻害剤を更に含む、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の培養培地。
  16. ＴＧＦ誘導因子を更に含み、前記ＴＧＦ誘導因子がトランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦβ１）、トランスフォーミング増殖因子ベータ２（ＴＧＦβ２）、及びアクチビンからなる群から選択される、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の培養培地。
  17. タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤、及び／又はＢＭＰ阻害剤を更に含む、請求項９〜１６のいずれか一項に記載の培養培地。
  18. インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）、インスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦＩＩ）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、ソニックヘッジホッグ経路（ＳＨＨ）阻害剤、ＥＲＫ５阻害剤、フォルスコリン、ケンパウロン、ＢａｙＫ８６４４、Ｇ９ａの阻害剤、Ｇｌｐの阻害剤、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）からなる群から選択される少なくとも１つの追加の薬剤を更に含む、請求項９〜１７のいずれか一項に記載の培養培地。
  19. ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ｂＦＧＦと、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤とを含む、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の培養培地。
  20. ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤とを含む、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の培養培地。
  21. ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤とを含む、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の培養培地。
  22. ＳＴＡＴ３活性化剤と、ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤と、ＴＧＦβ１と、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＡＸＩＮ安定化剤と、ＳＲＣファミリーキナーゼ阻害剤と、ＦＧＦ受容体阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤とを含む、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の培養培地。
  23. ＥＲＫ１／２阻害剤と、ＧＳＫ３β阻害剤と、Ｐ３８阻害剤と、ＪＮＫ阻害剤、ＳＴＡＴ３活性化剤と、トランスフォーミング増殖因子ベータ受容体（ＴＧＦβＲ）阻害剤と、ＰＫＣ阻害剤と、ｐ３８阻害剤と、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）とを含む培養培地。
  24. ＢＭＰ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＲＣ阻害剤、及びＡＸＩＮ複合安定化剤（ＡＸＩＮｓ）からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤を更に含む、請求項２３に記載の培養培地。
  25. 細胞と、請求項１〜２４のいずれかに記載の培養培地を含む、細胞培養物。
  26. 無感作多能性幹細胞（ＰＳＣ）を生成する方法であって、
    感作ＰＳＣから無感作ＰＳＣの生成を可能とする請求項１〜２４のいずれか一項に記載の培養培地において感作ＰＳＣ細胞をインキュベートすることを含み、ここで、
    （ｉ）前記無感作ＰＳＣが雌性ＰＳＣである場合、前記無感作雌性ＰＳＣがＸ不活性特異的転写産物（ＸＩＳＴ）遺伝子のプロモーターの２つの非メチル化アレルを有し、及び
    （ｉｉ）前記無感作ＰＳＣが雄性ＰＳＣである場合、前記無感作雄性ＰＳＣが前記ＸＩＳＴ遺伝子の前記プロモーターの１つの非メチル化アレルを有し、
    及び／又は
    前記無感作ＰＳＣにおける転写因子Ｅ３（ＴＦＥ３）の発現レベルが、免疫染色アッセイによって特定される１以上である細胞質に対する核の発現比率を特徴とし、
    及び／又は
    前記無感作ＰＳＣがその細胞表面上のＣ−ＫＩＴ（ＣＤ１１７）の陽性発現を特徴とし、
    それによって無感作ＰＳＣを生成するものである、
    無感作多能性幹細胞（ＰＳＣ）を生成する方法。
  27. 前記細胞培地がＭＢＤ３阻害剤を更に含む、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記培養培地が、クロモドメインヘリカーゼＤＮＡ結合タンパク質４（ＣＨＤ４）阻害剤を更に含む、請求項２６〜２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記培養培地が、Ｐ６６アルファコイルドコイルドメイン、又はｐ６６アルファ阻害剤を更に含む、請求項２６〜２８のいずれかに記載の方法。
  30. 体細胞から誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の生成を改善する方法であって、
    （ａ）前記体細胞内でＮａｎｏｇ、ＥＳＲＲＢ、ＫＬＦ２、ＴＢＸ３、ＥＲＡＳ、及びＫＬＦ１７からなる群から選択される第１の因子、並びにＮａｎｏｇ、ＥＳＲＲＢ、ＫＬＦ２、ＴＢＸ３、ＥＲＡＳ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、及びＫＬＦ１７からなる群から選択される第２の因子を発現し、前記第１及び第２の因子が同一ではない、並びに
    （ｂ）前記体細胞においてＭｂｄ３及び／又はＧａｔａｄ２ａ発現及び／又は活性を阻害し、
    それによって体細胞からの前記ｉＰＳＣの生成を改善すること
    を含む、体細胞から誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の生成を改善する方法。
  31. 前記Ｍｂｄ３活性の前記阻害が、前記ヌクレオソーム再構築デアセチラーゼ（ＮｕＲＤ）複合体への前記Ｍｂｄ３の結合を阻害することによって行われ、前記ＮｕＲＤ複合体への前記Ｍｂｄ３の前記結合の前記阻害がＰ６６アルファコイルドコイルドメインを使用して行われる、請求項３０に記載の方法。
  32. ＥＳ細胞発現Ｒａｓ（ＥＲＡＳ）をコードする配列を外因的に発現するか、又は前記体細胞において前記ＥＲＡＳの内因性発現を活性化することを更に含む、請求項３０に記載の方法。
  33. 前記Ｍｂｄ３の前記阻害が、前記発現に先立って前記Ｍｂｄ３のレベルの１０％〜３０％とするように、少なくとも４８時間に亘って前記発現がなされる、請求項３０に記載の方法。
  34. 前記ｉＰＳＣがネズミ科ｉＰＳＣである場合、前記方法が、ＬＩＦ、ＥＲＫ１／２阻害剤、ＧＳＫ３ｂ阻害剤を含む培地中で前記ネズミ科ｉＰＳＣを培養することを含む、請求項３０〜３３のいずれかに記載の方法。
  35. 前記培地が、ＳＲＣ阻害剤、及びＡＸＩＮ複合安定化剤（ＡＸＩＮｓ）からなる群から選択される薬剤を更に含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記ｉＰＳＣがヒトｉＰＳＣである場合、前記方法が、
    （ｃ）ＬＩＦ、ＥＲＫ１／２阻害剤、ＧＳＫ３ｂ阻害剤、Ｐ３８阻害剤、ＪＮＫ阻害剤、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、及びトランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ１）を含む培養培地において前記ヒトｉＰＳＣを培養すること、
    を更に含む、請求項３０〜３３のいずれかに記載の方法。
  37. 前記培地がＲＯＣＫ阻害剤を更に含む、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記培地が、ＳＲＣ阻害剤及びＡＸＩＮ複合安定化剤（ＡＸＩＮｓ）を更に含む、請求項３６又は３７のいずれかに記載の方法。
  39. 工程（ｃ）が、工程（ａ）の前記発現から約４８時間後に行われる、請求項３６又は３７に記載の方法。
  40. 前記Ｇ９ａの阻害剤及び／又は前記Ｇｌｐの阻害剤がＢＩＸ０１２９４及びＵＮＣ０６３８からなる群から選択される、請求項８及び１８のいずれか一項に記載の培養培地、請求項２５に記載の細胞培養物、又は請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の方法。
  41. Ｃ−ＭＹＣ、Ｎ−ＭＹＣ、Ｌ−ＭＹＣ、ＥＤＡＲ（エクトジスプラシンＡ受容体）、ＭＤＭ２、及びＥＲＡＳからなる群から選択される発がんタンパク質を過剰発現するように、及び／又は、Ｐ５３及びＮＦカッパーＢ阻害剤アルファからなる群から選択される腫瘍抑制タンパク質を下方制御させるように遺伝子改変された、単離された無感作多能性幹細胞。
  42. 前記腫瘍抑制遺伝子の下方制御が前記腫瘍抑制タンパク質のドミナントネガティブ変異体を前記細胞に導入することによって行われる、請求項４１に記載の単離された無感作多能性幹細胞。
  43. 前記腫瘍抑制タンパク質の前記ドミナントネガティブが、配列番号１５０で表されるＮＦカッパーＢ阻害剤アルファタンパク質中に、ＮＦカッパーＢ阻害剤アルファのＳ３２Ｄ及びＳ３６Ｄの突然変異、Ｓ３２Ｅ及びＳ３６Ｅの突然変異、Ｓ３２Ｄ及びＳ３６Ｅの突然変異、及び／又はＳ３２Ｅ及びＳ３６Ｄの突然変異を含む、請求項４２に記載の単離された無感作多能性幹細胞。
  44. 請求項４１に記載の前記単離された無感作多能性幹細胞であって、
    （ｉ）前記無感作ＰＳＣが雌性ＰＳＣである場合、前記無感作雌性ＰＳＣはＸ不活性特異的転写産物（ＸＩＳＴ）遺伝子のプロモーターの２つの非メチル化アレルを有し、
    （ｉｉ）前記無感作ＰＳＣが雄性ＰＳＣである場合、前記無感作雄性ＰＳＣは前記ＸＩＳＴ遺伝子の前記プロモーターの１つの非メチル化アレルを有し、及び／又は
    前記無感作ＰＳＣにおける転写因子Ｅ３（ＴＦＥ３）の発現レベルが、免疫染色アッセイによって特定される１以上である、細胞質に対する核の発現比率を特徴とし、及び／又は
    前記無感作ＰＳＣがその前記細胞表面上のＣ−ＫＩＴ（ＣＤ１１７）の陽性発現を特徴とする、請求項４１に記載の前記単離された無感作多能性幹細胞。
  45. キメラ動物を生成する方法であって、請求項４１〜４４のいずれかに記載の前記単離された無感作多能性幹細胞を宿主動物の胚へと導入することにより、前記キメラ動物を生成することを含む、方法。
  46. 前記胚が着床前の胚である、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記キメラ動物におけるキメラ性のレベルを検査することを更に含む、請求項４５に記載の方法。
  48. 請求項４１〜４４のいずれかに記載の前記単離された無感作多能性幹細胞及び培養培地を含む、細胞培養物。
  49. 前記培養培地が前記多能性幹細胞を少なくとも５継代に亘って無感作状態で維持可能である、請求項４８に記載の細胞培養物。
  50. 前記培養培地が請求項１〜２４のいずれか一項に記載の培養培地である、請求項４８又は４９に記載の細胞培養物。
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