JP7474520B2

JP7474520B2 - 哺乳類の拡大ポテンシャル幹細胞のための培地、その組成物および方法

Info

Publication number: JP7474520B2
Application number: JP2021558867A
Authority: JP
Inventors: リウ，ペンタオ; ガオ，シュエフェイ; ルアン，デゴン
Original assignee: University of Hong Kong HKU
Current assignee: University of Hong Kong HKU
Priority date: 2019-04-05
Filing date: 2020-03-27
Publication date: 2024-04-25
Anticipated expiration: 2040-03-27
Also published as: EP3947642A4; EP3947642A1; CN113966393A; JP2022529589A; WO2020200071A1; US20220145264A1

Description

１．分野
哺乳類についての拡大ポテンシャル幹細胞（ＥＰＳＣ）株を確立するための培地が、提供される。多能性幹細胞のＥＰＳＣへの転換を含む、細胞のインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）転換および維持のための培地を使用する方法が、提供される。

２．背景
哺乳類の胚発生は、精子と卵子が融合して、接合子を形成するときに始まり、これは、決まった数の分裂を経る。８細胞（８Ｃ）期まで、胚は、胚体中の全ての系統および胚体外組織に分化する能力を有し、全能性とみなされる（Ishiuchi et al 2013）。続く細胞分裂は、初期系統のうちの２つ：栄養膜系統に限定され、胎盤の形成に必須である栄養外胚葉上皮（ＴＥ）細胞、ならびに多能性であり、胚体の全ての細胞タイプ、ならびに胚体外の内胚葉および中胚葉を生じる内部細胞塊（ＩＣＭ）、ならびに胚幹（ＥＳ）細胞を生成する（Gardner 1985、Rossant et al 2009、Yamanaka et al 2006）。

ＥＳ細胞は、胚盤胞環境に戻された場合、胚の全ての生殖細胞層に分化することができるが、これらは、栄養膜系統に寄与することは一般的にできない。逆に、栄養外胚葉からもたらされる栄養膜幹細胞は、インビトロおよびインビボ（ｉｎｖｉｖｏ）で栄養膜に効率的に分化することができる。しかしながら、これらは、胚の全ての生殖細胞層に分化することができない。

ヒト胚幹細胞は、ある特定の条件下で、インビトロで栄養膜に分化することが報告されているが、これらのインビトロで分化した栄養膜が、真の栄養膜であるかどうかについての議論が存在する（Roberts R M et al 2014を参照のこと）。インビトロで培養されたとき、ヒト胚幹細胞は、系列の胚幹細胞と異なる、別個の分子および生物学的特徴を示す。用語「ナイーブ型」（または「基底状態」）および「プライム型」は、観察された相違を記載するために導入された。

最近、何人かの研究者が、例えば、インヒビターの混合物中で培養することにより、従来のヒト胚幹細胞におけるよりも「ナイーブ型」である多能性状態を導入するための代替の条件を報告した（Theunissen et al 2014において概説される）。しかしながら、これらの方法により生成された細胞は、ナイーブ型細胞に匹敵するいくつかの特徴を呈するが、有意な相違も存在する。

これらの知見に関わらず、重要な哺乳動物種、特に、大きな家畜由来の真の多能性幹細胞を実験的に生じ、維持することが可能かどうかは明らかになっていない。ヒト発生、生物学、および再生医学を研究するための改良されたヒト多能性幹細胞が依然として必要である。

３．概要
ナイーブ型または基底状態の胚幹細胞に似ているが、胎盤栄養膜および胚体に分化することもできる、拡大ポテンシャル幹細胞（ＥＰＳＣ）株を確立するための培地が、本明細書において提供される。

本開示の一実施形態は、ＳＲＣインヒビター、ビタミンＣ栄養補助剤、ＬＩＦタンパク質、およびアクチビンタンパク質を含む基本培地を含むブタ幹細胞培地である。ある特定の実施形態では、基本培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２である。ある特定の実施形態では、基本培地は、ＤＭＥＭである。ある特定の実施形態では、ＳＲＣインヒビターは、ＷＨ－４－０２３およびＸＡＶ９３９である。ある特定の実施形態では、培地は、Ｎ２栄養補助剤、Ｂ２７栄養補助剤、グルタミンペニシリン－ストレプトマイシン、ＮＥＡＡ、２－メルカプトエタノール、ＣＨＩＲ９９０２１、およびＦＢＳをさらに含む。

本開示の一実施形態は、ＳＲＣインヒビター、ビタミンＣ栄養補助剤、およびＬＩＦタンパク質を含む基本培地を含むブタ幹細胞培地である。ある特定の実施形態では、基本培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２である。ある特定の実施形態では、基本培地は、ＤＭＥＭである。ある特定の実施形態では、ＳＲＣインヒビターは、Ａ－４１９２５９およびＸＡＶ９３９である。ある特定の実施形態では、培地は、Ｎ２栄養補助剤、Ｂ２７栄養補助剤、グルタミンペニシリン－ストレプトマイシン、ＮＥＡＡ、２－メルカプトエタノール、およびＣＨＩＲ９９０２１をさらに含む。

本開示の一実施形態は、ＩＴＳ－Ｘ２００、ビタミンＣ栄養補助剤、ウシアルブミンフラクションＶ、微量元素Ｂ、微量元素Ｃ、還元型グルタチオン、規定された脂質、ＳＲＣインヒビター、エンド－ＩＷＲ－１、ＳＲＫインヒビター、およびカイロン９９０２１を含む基本培地を含むブタ幹細胞培地である。ある特定の実施形態では、基本培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２である。ある特定の実施形態では、基本培地は、ＤＭＥＭである。ある特定の実施形態では、ＳＲＣインヒビターは、ＸＡＶ９３９である。ある特定の実施形態では、ＳＲＫインヒビターは、Ａ－４１９２５９である。ある特定の実施形態では、培地は、神経基本培地、ペニシリン－ストレプトマイシン－グルタミン、ＮＥＡＡ、ピルビン酸ナトリウム、２－メルカプトエタノール、Ｎ２、Ｂ２７、ヒトＬｉｆタンパク質をさらに含む。

本開示の一実施形態は、ＩＴＳ－Ｘ２００、ビタミンＣ栄養補助剤、ウシアルブミンフラクションＶ、微量元素Ｂ、微量元素Ｃ、還元型グルタチオン、ＳＲＣインヒビター、エンド－ＩＷＲ－１、カイロン９９０２１、ヒトＬｉｆタンパク質、およびアクチビンＡを含む基本培地を含むブタ幹細胞培地である。ある特定の実施形態では、基本培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２である。ある特定の実施形態では、基本培地は、ＤＭＥＭである。ある特定の実施形態では、ＳＲＣインヒビターは、ＷＨ－４－０２３およびＸＡＶ９３９である。ある特定の実施形態では、培地は、神経基本培地、ペニシリン－ストレプトマイシン－グルタミン、ＮＥＡＡ、ピルビン酸ナトリウム、２－メルカプトエタノール、Ｎ２、およびＢ２７をさらに含む。

本開示の一実施形態は、（ｉ）多能性幹細胞の集団を用意する工程、および（ｉｉ）本明細書において開示される幹細胞における集団を培養する工程を含む、ブタの拡大ポテンシャル幹細胞（ＥＰＳＣ）の集団を生成する方法である。

４．図面の簡単な説明
ブタＥＰＳＣの誘導および特徴決定。ａ．左：ドイツ在来種ＰＦＦおよび中国ＴＡＩＨＵＯＣＴ４－Ｔｄｔｏｍａｔｏノックインレポーター（ＰＯＴ）ＰＦＦをリプログラミングすることによる、ｐＥＰＳＣＭにおけるＳＴＯフィーダー細胞上のドイツ在来種の５日目のインビボ（ｉｎｖｉｖｏ）でもたらされた胚盤胞由来のブタ（イノシシ（ＳｕｓＳｃｒｏｆａ））ＥＰＳＣ^Ｅｍｂ株、およびｐＥＰＳＣ^ｉＰＳ株の確立の模式図。右パネル：確立したＥＰＳＣ株の画像、およびＰＯＴ－ｐＥＰＳＣ^ｉＰＳにおけるＴｄ－ｔｏｍａｔｏ発現の蛍光画像。３つのＥＰＳＣ^Ｅｍｂ株（オス：Ｋ３およびＫ５；メスＫ１）ならびに３つのｐＥＰＳＣ^ｉＰＳ株（１０番、１１番）を、本研究において大規模に試験した。これらのＥＰＳＣ株は、遺伝子発現および分化において同様に挙動する。ｂ．ＰＦＦ、ｐＥＰＳＣ^ｉＰＳおよびｐＥＰＳＣ^Ｅｍｂ中のＯＣＴ４およびＮＡＮＯＧプロモーター領域におけるＣｐＧ部位の亜硫酸水素塩配列解析。ｃ．ｐＥＰＳＣ^Ｅｍｂの胚様体（ＥＢ、７日目）における遺伝子発現。胚細胞系統と胚体外細胞系統の両方の遺伝子を、ＲＴ－ｑＰＣＲにおいて調べた。ＧＡＰＤＨに対して標準化した相対的発現レベルを示す。データは、平均±ｓ．ｄ．である（ｎ＝３）。^＊ｐ＜０．０１、ｐＥＰＳＣ^Ｅｍｂと比較。ｄ．ｐＥＰＳＣ^Ｅｍｂテラトーマ切片の組織組成（Ｈ＆Ｅ染色）：内胚葉からもたらされた腺上皮の例（ｉ）、中胚葉からもたらされた軟骨の例（ｉｉ）、はっきりした神経管を形成する、外胚葉からもたらされた未熟神経組織の例（ｉｉｉ）、および栄養膜を思い出させる、巨大な多核細胞の例（ｉｖにおける矢印）。ｅ．免疫染色により明らかにされた、ｐＥＰＳＣ^Ｅｍｂテラトーマ切片におけるＰＬ－１およびＫＲＴ７陽性細胞。ｆ．２５～２７日目のブタキメラ受胎産物の模式図。円は、ｇ．における免疫蛍光染色のための凍結切片を採取した範囲を印す：ｉ、中枢神経系；ｉｉ、胎児肝臓。ｇ．キメラ１６番での脳（Ｈ２ＢｍＣｈｅｒｒｙ^＋ＳＯＸ２^＋）および肝臓（Ｈ２ＢｍＣｈｅｒｒｙ^＋ＡＦＰ^＋）におけるｐＥＰＳＣ子孫の検出。Ｈ２Ｂ－ｍＣｈｅｒｒｙおよびＳＯＸ２は、核に局在化し、一方、ＡＦＰは、細胞質タンパク質である。四角で囲んだ範囲を、より高い拡大率で示す。矢印は、ドナー細胞子孫（ｍＣｈｅｒｒｙ^＋）である代表的な細胞を示す。ＤＡＰＩは、核を染色する。追加のキメラ解析を、拡張データ図５ｅ～５ｆに提示する。ｐＥＰＳＣ^ＥｍｂからのＰＧＣ様細胞のインビトロ生成。ａ．ＮＡＮＯＳ３－Ｈ２ＢｍＣｈｅｒｒｙレポーターｐＥＰＳＣにおいてＳＯＸ１７を一過性に発現させることによる、ｐＰＧＣＬＣの導入。胚様体（ＥＢ）におけるＨ２ＢｍＣｈｅｒｒｙ^＋ＴＮＡＰ^＋細胞の存在を、ＦＡＣＳにより解析した。ｂ．ｐＰＧＣＬＣ導入後の３日目のＥＢにおけるＰＧＣ遺伝子のＲＴ－ｑＰＣＲ解析。ＧＡＰＤＨに対して標準化した相対的発現レベルを示す。データは、平均±ｓ．ｄ．である（ｎ＝３）。^＊ｐ＜０．０１、遺伝子導入していないＥＢと比較。ｃ．ｐＰＧＣＬＣ導入の３～４日目のＥＢの切片におけるＰＧＣファクターの免疫蛍光解析。Ｈ２ＢｍＣｈｅｒｒｙ^＋細胞は、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＢＬＩＭＰ１、ＴＦＡＰ２ＣおよびＳＯＸ１７を共発現した。ＤＡＰＩは、核を染める。実験を、少なくとも３回行った。ｄ．ｐＰＧＣＬＣ導入の選別したＨ２ＢｍＣｈｅｒｒｙ^＋のＲＮＡｓｅｑ解析（ヒートマップ）は、ＰＧＣ、多能性または体細胞系統（中胚葉、内胚葉、および性腺体細胞）と関連する遺伝子の発現を示す。ｅ．ｐＥＰＳＣ^ＥｍｂとｐＰＧＣＬＣ間での対遺伝子発現比較。鍵となるアップレギュレーションした（赤色）およびダウンレギュレーションした（青色）遺伝子を、強調する。ｆ．バープロットは、ｐＰＧＣＬＣおよび親ｐＥＰＳＣ^ＥｍｂにおけるＤＮＡメチル化と関連する遺伝子の発現を示す。データは、ｐＰＧＣＬＣ導入の選別したＨ２ＢｍＣｈｅｒｒｙ^＋のＲＮＡｓｅｑ由来である。それぞれの試料は、２つの生物学的複製物を有し、バープロットは、２つの複製物の平均発現を示す。ヒトＥＰＳＣの確立。ａ．確立したＨ１－ＥＰＳＣまたはＭ１－ＥＰＳＣ（２５継代）の画像。ｂ．ヒト、ブタおよびマウスＥＰＳＣ、ヒトプライム型およびナイーブ型ＥＳＣ、ＰＦＦの大量のＲＮＡ－ｓｅｑ遺伝子発現データの主成分分析（ＰＣＡ）。ｐＥＰＳＣ^Ｐａｒ：単為生殖胚由来のＥＰＳＣ株；Ｅ１４およびＡＢ２－ＥＰＳＣは、マウスＥＰＳＣである。ｃ．ｈＥＰＳＣ（計７６、赤色の点）において高発現した遺伝子（＞８倍）および代表的なヒストン遺伝子（青色の点）を示す、Ｈ１－ＥＳＣとＨ１－ＥＰＳＣの間の遺伝子発現の対比較。ｄ．Ｈ１－ＥＳＣ、Ｈ１－ＥＰＳＣ、ｉＰＳＣ－ＥＰＳＣおよびヒトナイーブ型（５ｉ）ＥＳＣ、ならびにヒト着床前の胚における選択したヒストン遺伝子の発現を示す、ヒートマップ。ヒトプライム型およびナイーブ型ＥＳＣのＲＮＡｓｅｑデータを、参照４２から得て、一方、胚細胞データは、参照４４由来であった。ｅ．３つの条件：ＦＧＦ（プライム型）、５ｉ（ナイーブ型）およびＥＰＳＣＭ（ＥＰＳＣ）で培養した７つのヒトＥＳＣまたはｉＰＳＣ株における４つのヒストン１クラスター遺伝子の発現のＲＴ－ｑＰＣＲ解析。ＨｉｐｓｃｉｉＰＳＣ株を、ＷｅｌｌｃｏｍｅＴｒｕｓｔＳａｎｇｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅにおけるＨｉｐｓｃプロジェクト（http://www.hipsci.org）から得た：１番、ＨＰＳＩ１１１３ｉ－ｂｉｍａ＿１；２番、ＨＰＳＩ１１１３ｉ－ｑｏｌｇ＿３；３番、ＨＰＳＩ１１１３ｉ－ｏａａｚ＿２；４番、ＨＰＳＩ１１１３ｉ－ｕｏｆｖ＿１。ＧＡＰＤＨに対して標準化した相対的発現レベルを示す。データは、平均±ｓ．ｄ．である（ｎ＝３）。^＊ｐ＜０．０１、ＦＧＦ条件で培養した細胞と比較。^＃ｐ＜０．０１、５ｉ条件で培養した細胞と比較。実験を、少なくとも３回行った。ｆ．バイオリン図は、ｐＥＰＳＣ^Ｅｍｂ（上のパネル）およびヒトＨ１－ＥＰＳＣ（下のパネル）における多能性遺伝子のｓｃＲＮＡｓｅｑ発現を示す。ｇ．ｐＥＰＳＣ^Ｅｍｂ（左のパネル）およびＨ１－ＥＰＳＣ（右のパネル）の網羅的遺伝子発現パターン（ｓｃＲＮＡｓｅｑによる）のＰＣＡ。ｈ．ヒトＨ１－ＥＰＳＣおよびヒト着床前の胚（参照４６、詳細については方法を参照のこと）のｓｃＲＮＡｓｅｑからの遺伝子発現のＰＣＡおよび比較。ｉ．Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３およびＨ３Ｋ４ｍｅ３のＣｈＩＰ－ｓｅｑ解析は、ｐＥＰＳＣ^ＥｍｂおよびヒトＨ１－ＥＰＳＣにおける多能性遺伝子座位を印す。ヒトＥＰＳＣの栄養膜分化ポテンシャル。ａ．左のパネル：ＴＧＦβ阻害下での栄養膜へのｈＥＰＳＣの図。詳細については、方法を参照のこと。右パネル：ＣＤＸ２－Ｈ２Ｂ－ＶｅｎｕｓレポーターＥＰＳＣの栄養膜への分化のフローサイトメトリー解析。ＣＤＸ２－Ｈ２Ｂ－ＶｅｎｕｓレポーターＥＰＳＣをまた、従来のＦＧＦ含有ｈＥＳＣ培地または５ｉ－ナイーブ型培地において培養し、その後、同じ分化条件の対象にし、フローサイトメトリーにおいて調べた。細胞を、ＴＧＦβ阻害の４日後に収集した。ｂ．いくつかの時間点でのｈＥＰＳＣ分化中の栄養膜遺伝子の発現における動的変化を、ＲＴ－ｑＰＣＲによりアッセイした。ＧＡＰＤＨに対して標準化した相対的発現レベルを示す。データは、平均±ｓ．ｄ．である（ｎ＝３）。^＊ｐ＜０．０１、Ｈ１－ＥＳＣ細胞と比較。^＃ｐ＜０．０１、Ｈ１－５ｉ細胞と比較。実験を、少なくとも３回行った。ｃ．ＴＧＦβインヒビターＳＢ４３１５４２で処理したＨ１－ＥＳＣ、Ｈ１－ＥＰＳＣ、またはｉＰＳＣ－ＥＰＳＣから分化した細胞のＲＮＡ－ｓｅｑデータのｔＳＮＥ解析。ＲＮＡを、分化中の０～１２日目に試料採取した。Ｈ１－ＥＰＳＣおよびｈｉＰＳＣ－ＥＰＳＣの分化トラジェクトリーは、Ｈ１－ＥＳＣのものと異なる。ｄ．個々のｈＥＰＳＣから形成された初代ＴＳＣコロニー（左）および７継代でのＴＳＣ（右）の位相差画像。ｅ．免疫染色により検出した、ＥＰＳＣ－ＴＳＣにおける栄養膜転写因子ＧＡＴＡ３およびＴＦＡＰ２Ｃ、ならびにＫＲＴ７の発現。核を、ＤＡＰＩで染色した。同様の結果を、４つの独立したＥＰＳＣ－ＴＳＣ株で得た。ｆ．免疫蛍光により検出した、ＥＰＳＣ－ＴＳＣから分化した合胞体栄養細胞におけるＳＤＣ１の発現。ＤＡＰＩは、核を染める。ｇ．本研究において生成されたｈＥＳＣ、ｈＥＰＳＣ、ｈＴＳＣにおけるＨＬＡ－Ｇ、およびＥＶＴプロトコール後のｈＴＳＣから分化した細胞（参照５３）のフローサイトメトリー検出。絨毛外栄養膜の代表であり、ＨＬＡ－Ｇを発現する絨毛癌細胞ＪＥＧ－３、および絨毛栄養膜細胞の代表であり、ＨＬＡ分子を発現しないＪＡＲ（Apps, R., et al. Immunology 2009）を、それぞれ、正および負の対照として使用した。ｈ．免疫不全マウスにおいて注射したｈＴＳＣから形成された病変におけるＳＤＣ１－またはＫＲＴ７－陽性細胞についての免疫染色の共焦点画像。ＤＡＰＩは、核を染める。実験を、少なくとも３回行った。（原文に記載なし。）

４．１拡張データ図
拡張データ図１。スクリーニング培養条件についての新規Ｄｏｘ－依存性ブタｉＰＳＣ株の確立。ａ．野生型ドイツ在来種ＰＦＦにおけるＬＩＮ２８、ＮＡＮＯＧ、ＬＲＨ１およびＲＡＲＧと共に、山中ファクターＯＣＴ４、ＭＹＣ、ＳＯＸ２およびＫＬＦ４のドキシサイクリン（Ｄｏｘ）誘導性発現。ｃＤＮＡを、ｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）ベクターにクローニングし、ブタゲノムへの発現カセットの安定な組込みのため、ＰＢトランスポサーゼを発現するプラスミドでＰＦＦに遺伝子導入した。ｐＯＭＳＫ：ブタ起源の４つの山中ファクターＯＣＴ４、ＭＹＣ、ＳＯＸ２およびＫＬＦ４；ｐＮ＋ｈＬＩＮ：ブタＮＡＮＯＧおよびヒトＬＩＮ２８；ｈＲＬ：ヒトＲＡＲＧおよびＬＲＨ１。Ｄｏｘ導入の８～１０日後に、初代コロニーが出現した。これらのコロニーを、Ｍ１５（１５％ウシ胎児血清）においてＤｏｘの存在下で単一細胞継代した。ｂ．ＬＩＮ２８、ＮＡＮＯＧ、ＬＲＨ１およびＲＡＲＧの共発現は、リプログラミングされたコロニーの数を実質的に増大させた。^＊ｐ＜０．０１。データは、平均±ｓ．ｄ．であり（ｎ＝４）：４つの山中ファクターを使用したものと比較した、８つのファクターで、２５０，０００ＰＦＦから誘導されたコロニー。ｃ．ブタＯＣＴ４－ｔｄＴｏｍａｔｏノックインレポーター（ＰＯＴ）ＴＡＩＨＵＰＦＦのｉＰＳＣへのリプログラミング。Ｄｏｘ導入の８日後、蛍光顕微鏡下でｔｄＴｏｍａｔｏ^＋であった、初代コロニーが出現した。初代コロニーを拾い、Ｄｏｘの存在下で拡大させた。明視野および蛍光の３継代の細胞を、画像に示す。ｄ．ｉＰＳＣ株は、ＲＴ－ｑＰＣＲ解析において鍵となる多能性遺伝子を発現した。ｉＰＳＣ株１番および２番、ならびにｉＰＳＣ３番および４番は、それぞれ、野生型ドイツ在来種およびＴＡＩＨＵＰＯＴＰＦＦ由来であった。ブタ胚盤胞における遺伝子発現を、対照として使用した。ｅ．Ｄｏｘの存在下またはその除去後３日目のいずれかのｉＰＳＣにおける外因性リプログラミングファクターの発現のＲＴ－ｑＰＣＲ解析。ｆ．Ｄｏｘを培地から除去した後の、ｉＰＳＣ細胞の分化。画像は、Ｄｏｘ除去の３日後の細胞を示す。ＰＯＴｉＰＳＣは、Ｔｄ－ｔｏｍａｔｏ陰性になった。ｇ．Ｄｏｘありまたはなしで培養したｉＰＳＣにおける内因性多能性遺伝子の発現のＲＴ－ｑＰＣＲ解析。ｈ．ＤＯＸ除去の５～６日後のブタｉＰＳＣにおける系統遺伝子の発現。遺伝子発現を、ＲＴ－ｑＰＣＲにより測定した。ＧＡＰＤＨに対して標準化した相対的発現レベルを示す。データは、平均±ｓ．ｄ．である（ｎ＝３）。実験を、少なくとも３回行った。拡張データ図２。ブタＥＰＳＣのための培養条件の同定。ａ．ドイツ在来種株のＤｏｘ－依存性ｉＰＳＣクローン１番を、スクリーニングにおいて使用した。小分子インヒビターおよびサイトカインを、様々な組み合わせのため選択した。内因性ＯＣＴ４およびＮＡＮＯＧの細胞生存、細胞形態、および発現を、読み取りとして利用した。ｂ～ｈ．インヒビターおよびサイトカインの組み合わせを添加した異なる基本培地における培養の６日後に生存した細胞における内因性ＯＣＴ４およびＮＡＮＯＧの相対的発現レベル：ｂ．Ｄｏｘを含まないＭ１５培地；ｃ．Ｄｏｘを含まないＮ２Ｂ２７基本培地；ｄ．Ｄｏｘを含まない２０％ＫＯＳＲ培地；ｅ．Ｄｏｘを含まないＡｌｂｕｍＭａｘＩＩ基本培地；ｆ．Ｄｏｘを含むＮ２Ｂ２７基本培地；ｇ．４つの個々のＤｏｘを含む基本培地（Ｍ１５：４１１～４３１；Ｎ２Ｂ２７：４３２～４５３；ＫＯＳＲ：４５４～４７５；ＡｌｂｕｍＭａｘＩＩ：４７６～４９７）；ｈ．Ｄｏｘ．２ｉ：ＧＳＫ３ｉおよびＭＥＫｉ；ｔ２ｉ：ＧＳＫ３ｉ、ＭＥＫｉおよびＰＫＣｉ（Takashima, Y., et al. 2014 Cell）；４ｉ：ＧＳＫ３ｉ、ＭＥＫｉ、ＪＮＫｉおよびｐ３８ｉ（Irie, N., et al 2015 Cell）；５ｉ：ＧＳＫ３ｉ、ＭＥＫｉ、ＲＯＣＫｉ、ＢＲＡＦｉおよびＳＲＣｉ（Theunissen, T. W., et al. 2014 Cell Stem Cell）；ｍＥＰＳＣＭ：ＧＳＫ３ｉ、ＭＥＫｉ、ＪＮＫｉ、ＸＡＶ９３９、ＳＲＣｉおよびｐ３８ｉ（Yang J., et al. 2017 Nature）を含まないＮ２Ｂ２７基本培地；インヒビターの組み合わせの詳細を、補足表１に提示する。ＧＡＰＤＨに対して標準化した相対的発現レベルを示す。拡張データ図３。ＰＦＦをリプログラミングすることによる、または着床前の胚からのブタＥＰＳＣの確立。ａ．Ｍ１５およびＤｏｘにおけるブタｉＰＳＣに対するＭＥＫｉ、ＰＫＣｉおよびｐ３８ｉの毒性を示す画像。ｂ．ｐＥＰＳＣＭにおけるＤｏｘの非存在下でのブタｉＰＳＣにおける内因性多能性遺伝子発現（５１７番の最小条件、拡張データ図２ｈ）。遺伝子発現を、ブタ胚盤胞におけるものと比較した。データは、平均±ｓ．ｄ．である（ｎ＝３）。ｃ．Ｄｏｘを含まないｐＥＰＳＣＭにおける野生型およびＯＣＴ４－ＴｄｔｏｍａｔｏレポーターｉＰＳＣの画像。遺伝子発現を、ブタ胚盤胞におけるものと比較した。ｄ．ＲＴ－ＰＣＲによる外因性リプログラミングファクターのリーキーな発現の検出。ｉＰＳＣ株の約半分は、検出可能なリーキーな発現を有さなかった。ｅ．ｐＥＰＳＣＭにおいてＥＰＳＣ株を確立するためのＰＦＦのリプログラミングの模式図。ｆ．２つの新たに確立したＷＴｐＥＰＳＣ^ｉＰＳ株（１０番および１１番）を、内因性多能性遺伝子および外因性リプログラミングファクターの発現について調べた。データは、平均±ｓ．ｄ．である（ｎ＝３）。ｇ．ＲＯＣＫインヒビターを添加したｐＥＰＳＣＭにおけるブタ早期胚盤胞からの１０日目の成長物。成長物を、分離および再播種のため１０～１２日目に拾い、安定な株を確立した。ｈ．ブタのインビボでもたらされた胚から確立したｐＥＰＳＣ^Ｅｍｂ（Ｋ３系統）の代表的な画像。実験を、少なくとも３回行った。ＧＡＰＤＨに対して標準化した相対的発現レベルを示す。拡張データ図４。ｐＥＰＳＣの特徴決定。ａ．ｐＥＰＳＣ^Ｅｍｂ（Ｋ３系統）は、２５継代後に正常な核型を保持した（調べた１０／１０の分裂中期伝播は正常であった）。調べた２つの追加の系統は、２５より多い継代後にも正常な核型を有していた。ｂ．ｐＥＰＳＣ^ＥｍｂおよびｐＥＰＳＣ^ｉＰＳにおける多能性ファクターならびにマーカーであるＳＳＥＡ－１およびＳＳＥＡ－４の免疫染色検出。ｃ～ｅ．ｐＥＰＳＣを、既に報告された、ブタＥＳＣのための７つの条件（参照９～１５）下で７日間培養し、細胞形態および遺伝子発現を調べた。ｃ．ＯＣＴ４発現についての免疫蛍光染色。ｄ～ｅ．それぞれの条件下でのｐＥＰＳＣにおけるＯＣＴ４およびＮＡＮＯＧのＲＴ－ｑＰＣＲ検出。ＧＡＰＤＨに対して標準化した相対的発現レベルを示す。ｆ．ブタＥＰＳＣ^ＥｍｂおよびＥＰＳＣ^ｉＰＳにおける活性なＯｃｔ４遠位性エンハンサー。マウスＯｃｔ４遠位性および近位性エンハンサーコンストラクトを、ルシフェラーゼアッセイにおいて使用した。データは、平均±ｓ．ｄ．である（ｎ＝４）。ｇ．ｐＥＰＳＣ^Ｅｍｂにおけるゲノム編集。ブタＲＯＳＡ２６座位へのＨ２Ｂ－ｍＣｈｅｒｒｙ発現カセットのノックインを、Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９システムにより促進した。遺伝子型同定のため拾った２０個のコロニーのうち、５個を、適切に標的化した。重要なことに、標的化したｐＥＰＳＣは、正常の核型を保持した。ｈ．ＲＯＳＡ２６座位に適切に標的化したＨ２Ｂ－ｍＣｈｅｒｒｙを有するｐＥＰＳＣ^Ｅｍｂコロニーの明視野および蛍光画像。ｉ．ｐＥＰＳＣ^Ｅｍｂの、３つの体細胞生殖層および栄養外胚葉系統（ＫＲＴ７^＋）の細胞へのインビトロでの分化。ｊ．ｐＥＰＳＣ^Ｅｍｂテラトーマ切片におけるＳＤＣ１発現細胞の免疫染色の共焦点画像。ＤＡＰＩは、核を染める。拡張データ図５。ｐＥＰＳＣのインビボでの分化ポテンシャル。ａ．着床前の胚発生におけるｐＥＰＳＣの関与。Ｈ２Ｂ－ｍＣｈｅｒｒｙｈ発現ドナーｐＥＰＳＣ^ｉＰＳを、胚盤胞になる、５日目の宿主ブタ単為生殖胚に注射した。Ｈ２ＢｍＣｈｅｒｒｙ^＋ドナー細胞を、内部細胞塊と栄養外胚葉（矢印で示した）の両方で見出した。ｂ．キメラ２１番におけるｍＣｈｅｒｒｙ^＋細胞の存在を示す、Ｈ２ＢｍＣｈｅｒｒｙ^＋ｐＥＰＳＣ^Ｅｍｂを注射した着床前の胚からもたらされた２６日目のブタの受胎産物の全組織標本蛍光および明視野画像。ｃ．キメラを、２つの一般的な目的のため処理した：キメラの半分を、免疫蛍光解析のため固定し、他の半分を、ＦＡＣＳおよびＤＮＡ遺伝子型同定のため固定した。ＦＡＣＳ解析のため細胞を調製するために、それぞれの胚の組織を、頭部（ａ）、胴体（ｂ）および尾部（ｃ）から、ならびに胎盤（ｄ）から単離し、単一の細胞に分離し、ドナーＨ２ＢｍＣｈｅｒｒｙ^＋細胞を検出した。分離した細胞を、ＰＣＲ解析のためのゲノムＤＮＡ試料を作製するためにも使用した。ｄ．上記のゲノムＤＮＡ試料を使用した、ｍＣｈｅｒｒｙＤＮＡについてのＰＣＲ遺伝子型同定。ｍＣｈｅｒｒｙＤＮＡを、フローサイトメトリー解析により、ｍＣｈｅｒｒｙ^＋であった胚においてのみ検出した。ｅ．２５～２７日目のブタのキメラ受胎産物の模式図。円は、組織切片を、以下に示す免疫染色および画像化のため採取した組織範囲を印す。ｆ．異なる組織におけるＨ２ＢｍＣｈｅｒｒｙ^＋細胞の局在化についての、２６～２８日目のｍＣｈｅｒｒｙ^＋受胎産物またはキメラ胚および胎盤の凍結切片の免疫蛍光解析。解析において使用した抗体は、ニューロンについてのＴＵＪ１（キメラ１６番）；内胚葉派生物についてのＳＯＸ１７およびＧＡＴＡ４（キメラ２１番）；中胚葉派生物についてのａ－ＳＭＡ（キメラ２１番）；栄養膜についてのＰＬ－１およびＫＲＴ７（キメラ６番の胎盤）を含み、使用した。Ｈ２ＢｍＣｈｅｒｒｙ、ＧＡＴＡ４およびＳＯＸ１７は、核において見出され、一方、ＴＵＪ、Ａ－ＳＭＡ、ＫＲＴ７およびＰＬ－１は、核に局在化しない。拡張データ図６。ｐＥＰＳＣのｐＰＧＣＬＣへの分化。ａ．Ｈ２Ｂ－ｍＣｈｅｒｒｙカセットをＮＡＮＯＳ３座位に標的化することによる、ＮＡＮＯＳ３－Ｈ２ＢｍＣｈｅｒｒｙレポーターＥＰＳＣ^Ｅｍｂの生成。標的化された対立遺伝子において、Ｔ２Ａ－Ｈ２Ｂ－ｍＣｈｅｒｒｙ配列は、欠損されている終止コドンＴＡＡと共に、ブタＮＡＮＯＳ３座位の最終コードエクソンとインフレームであった。本発明者らは、ＮＡＮＯＳ３終止コドンをカバーする領域を特異的に標的化するｇＲＮＡプラスミドを生成し、遺伝子型同定のため、１５個のコロニーを拾った。４個を適切に標的化した。拡大後、これらの標的化されたｐＥＰＳＣは、正常な核型を保持していた。ｂ．ｐＰＧＣＬＣ特異化および分化のため、ｐＥＰＳＣ^Ｅｍｂにおいて外因性遺伝子を発現させるストラテジーを説明する、図（さらなる詳細については、方法を参照のこと）。ｃ．ＥＢにおけるＮＡＮＯＳ３－Ｈ２ＢｍＣｈｅｒｒｙレポーターＥＰＳＣ^ＥｍｂのｐＰＧＣＬＣ（Ｈ２ＢｍＣｈｅｒｒｙ^＋）への分化における、ＮＡＮＯＧ、ＢＬＩＭＰ１およびＴＦＡＰ２Ｃの個別、またはＳＯＸ１７と組み合わせた発現。ｄ．上記（ｃ）実験におけるＮＡＮＯＳ３－Ｈ２ＢｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の定量。ｅ．ＰＧＣ遺伝子のＲＴ－ｑＰＣＲ解析。ＲＮＡ試料を、ｂにおけるｐＰＧＣＬＣ導入プロトコール後に、導入遺伝子を個別または組み合わせて発現したｐＥＰＳＣの３日目のＥＢから調製した。ＧＡＰＤＨに対して標準化した相対的発現レベルを示す。データは、平均±ｓ．ｄ．である（ｎ＝３）。実験を、少なくとも３回行った。拡張データ図７。ヒトＥＰＳＣの確立および特徴決定。ａ．ｐＥＰＳＣＭまたはｐＥＰＳＣＭマイナスアクチビンＡにおけるＨ１、Ｈ９、Ｍ１およびＭ１０ヒトＥＳＣコロニーの画像。ＯＣＴ４の発現を、免疫染色により検出した。ｂ．ｈＥＰＳＣＭにおける２５継代後のＨ１－ＥＰＳＣおよびＭ１－ＥＰＳＣにおける正常な核型（１０／１０スコア化分裂中期は、正常であった）。ｃ．外因性ＯＣＴ４、ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＬＲＨ１およびＲＡＲＧのＤｏｘ誘導性発現による、ヒト皮膚線維芽細胞からリプログラミングされたｈＥＰＳＣＭにおける初代ｉＰＳＣコロニー（上）およびｉＰＳＣの確立した培養物（下）。ｄ．Ｈ１－ＥＳＣ、Ｈ１－ナイーブ型ＥＳＣ（５ｉ）、Ｈ１－ＥＰＳＣおよびｉＰＳＣ－ＥＰＳＣにおける多能性遺伝子（ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＲＥＸ１およびＳＡＬＬ４）の相対的発現レベル。^＊ｐ＜０．０５、Ｈ１－ナイーブ型ＥＳＣ（５ｉ）、Ｈ１－ＥＰＳＣおよびｉＰＳＣ－ＥＰＳＣと比較。データは、平均±ｓ．ｄ．である（ｎ＝３）。ｅ．ＲＴ－ｑＰＣＲによる外因性リプログラミングファクターの潜在的発現リーキーさの検出。４つの確立したｉＰＳＣ株において、明らかなリーキーさは見出されなかった。ｆ．Ｈ１－ＥＳＣ、Ｈ１－ナイーブ型ＥＳＣ（５ｉ）、Ｈ１－ＥＰＳＣおよびｉＰＳＣ－ＥＰＳＣの相対的倍加時間。データは、平均±ｓ．ｄ．である（ｎ＝３）。^＊ｐ＜０．０５、Ｈ１－５ｉＥＳＣ、Ｈ１－ＥＰＳＣおよびｉＰＳＣ－ＥＰＳＣと比較。ｇ．Ｈ１－ＥＳＣ、Ｈ１－ナイーブ型ＥＳＣ（５ｉ）、Ｈ１－ＥＰＳＣおよびｉＰＳＣ－ＥＰＳＣにおける系統マーカー（ＥＯＭＥＳ、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、Ｔ、ＳＯＸ１７およびＲＵＮＸ１）の発現。プライム型Ｈ１－ＥＳＣは、遥かに高レベルのこれらの系統遺伝子を有していた。データは、平均±ｓ．ｄ．である（ｎ＝３）。^＊ｐ＜０．０１、Ｈ１－５ｉ、Ｈ１－ＥＰＳＣおよびｉＰＳＣ－ＥＰＳＣと比較した、Ｈ１－ＥＳＣにおける遺伝子発現。ｈ．多能性ファクターおよび細胞表面マーカーについてのＨ１－ＥＰＳＣおよびｉＰＳＣ－ＥＰＳＣの免疫染色。ｉ．Ｈ１－ＥＰＳＣの３つの体細胞系統へのインビボ分化。ｊ．免疫不全マウスにおけるｈＥＰＳＣ由来のテラトーマにおけるＨ＆Ｅ染色による、軟骨（中胚葉Ｉ）、腺上皮（内胚葉ＩＩ）ならびに成熟神経組織（グリアおよびニューロン、外胚葉ＩＩＩ）の存在。ｋ．ＳＯＸ１７、ＢＬＩＭＰ１およびＯＣＴ４について免疫染色したＨ１－ＥＰＳＣ～ＰＧＣＬＣのＥＢ。ｌ．Ｈ１－ＥＰＳＣのＰＧＣＬＣ上でのＣＤ３８およびＴＮＡＰの発現についてのＦＡＣＳ解析。ＰＧＣＬＣの導入を、少なくとも２つの独立したヒトＥＰＳＣ株で行い、実験を、少なくとも３回行った。ＧＡＰＤＨに対して標準化した相対的発現レベルを示す。拡張データ図８。ヒトおよびブタＥＰＳＣトランスクリプトームのＲＮＡｓｅｑ解析。ａ．ヒトプライム型およびナイーブ型ＥＳＣ、ヒトの拡大した多能性幹（ＥＰＳ）細胞（Yang, Y., et al, Cell, 2018）、ならびにヒト、ブタおよびマウスのＥＰＳＣの網羅的遺伝子発現データ（大量ＲＮＡｓｅｑ）の階層的クラスタリング。相関マトリックスを、スピアマン相関および完全連結を使用して、クラスタリングした。ｐＥＰＳＣ^Ｐａｒ：ブタ単為生殖胚由来のＥＰＳＣ株。Ｅ１４およびＡＢ２－ＥＰＳＣは、マウスＥＰＳＣであり、これらのＲＮＡ－ｓｅｑデータは、本発明者らの従前の刊行物（Yang, J., et al., Nature, 2017）（参照１）からであった。ヒトプライム型ＥＳＣ（ＷＩＢＲ１、ｉＰＳ＿ＮＰＣ＿４およびｉＰＳ＿ＮＰＣ＿１３）ならびにナイーブ型ＥＳＣ（ＷＩＢＲ２、ＷＩＢＲ３＿ｃｌ＿１２、ＷＩＢＲ３＿ｃｌ＿１６、ＷＩＮ１＿１およびＷＩＮ１＿２）でのデータは、Theunissen et al, Cell Stem Cell, 2014および2016（参照２９、および４２）からであった。ヒトプライム型Ｈ１ＥＳ細胞（Ｈ１－ｒｅｐ１およびＨ１－ｒｅｐ２）ならびに拡大した多能性幹（ＥＰＳ）細胞（Ｈ１＿ＥＰＳ＿ｒｅｐ１、Ｈ１＿ＥＰＳ＿ｒｅｐ２、ＥＳ１＿ＥＰＳ＿ｒｅｐ１およびＥＳ１＿ＥＰＳ＿ｒｅｐ２）のデータは、Yang, Y., et al, Cell, 2018（参照４３）からであった。ｂ～ｃ．ブタ（ｂ）またはヒト（ｃ）ＥＰＳＣにおける多能性および系統遺伝子の発現。ｄ～ｅ．ブタ（ｄ）またはヒト（ｅ）ＥＰＳＣにおける栄養膜関連遺伝子の発現。拡張データ図９。ブタおよびヒトＥＰＳＣのエピジェネティック特性。ａ．ブタおよびヒトＥＰＳＣにおける網羅的ＤＮＡメチル化レベル。Ｈ１－５ｉヒトナイーブ型ＥＳＣを、解析に含めた。データは、平均±ｓ．ｄ．である（ｎ＝３）。^＊ｐ＜０．０１、Ｈ１－５ｉヒトナイーブ型ＥＳＣのＨ１－ＥＳＣおよびＨ１－ＥＰＳＣとの比較。ｂ～ｃ．ブタ（ｂ）およびヒト（ｃ）ＥＰＳＣにおけるＤＮＡメチル化または脱メチル化における酵素をコードする遺伝子の発現のＲＮＡｓｅｑ解析。ｄ．ヒトＨ１－ＥＰＳＣのｓｃＲＮＡｓｅｑデータおよびヒト着床前の胚のｓｃＲＮＡｓｅｑデータのＰＣＡ（Dang Y. et al 2016. Genome Biology.由来のデータ、さらなる詳細については、方法を参照のこと）。ｅ．ヒトＥＰＳＣ（本研究）および示した期でのヒト着床前の胚における示したヒストン遺伝子の発現レベルを示す、バイオリン図（Dang Y. ら 2016. Genome Biology）。遺伝子発現（ＴＰＭ）を、ｓａｌｍｏｎおよびｌｏｇ１０（ＴＰＭ＋１）の値により定量した。バイオリン図の上部に、個々の細胞における発現（点により表す）をプロットして、個々の細胞に渡る発現の全分布を示した。ｆ．ＤＮＡメチル化および脱メチル化に含まれる酵素をコードする遺伝子および細胞系統遺伝子についての座位でのヒストン修飾（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３）。拡張データ図１０。ｐＥＰＳＣおよびｈＥＰＳＣのための培養条件における個々の成分の要件。ａ～ｂ．ＲＴ－ｑＰＣＲにより解析したｐＥＰＳＣ^Ｅｍｂ（ａ）およびＨ１－ＥＰＳＣ（ｂ）における遺伝子発現に対する、個々のインヒビター除去または付加の効果。「－ＳＲＣｉ、－ＸＡＶ９３９、－アクチビン、－Ｖｃ、－ＣＨＩＲ９９」：これらを、個々にｐＥＰＳＣＭまたはｈＥＰＳＣＭから除去し；「＋ＴＧＦβｉ、＋Ｌ－ＣＨＩＲ９９、＋Ｈ－ＣＨＩＲ９９、＋ＰＤ０３」：ＴＧＦβインヒビターＳＢ４３１５４２、より低濃度のＣＨＩＲ９９０２１（ｐＥＰＳＣＭにおいて使用される濃度である、０．２μＭ）、より高濃度のＣＨＩＲ９９０２１（３．０μＭ）、または３種の濃度のＭＥＫ１／２インヒビターＰＤ０３２５９０１を付加する。ＷＨ０４／Ａ４１９は、ヒトＥＰＳＣにおいてＡ４１９２５９を別のＳＲＣインヒビターであるＷＨ－４－２３で置換する効果を示す。赤色の三角形は、形成されたコロニーがないことを示す。ブタおよびヒトＥＰＳＣ培地は、それぞれ、０．２μＭおよび１．０μＭＣＨＩＲ９９０２１を含有する。培地成分の情報については、方法を参照のこと。ｃ．Ｈ１－ＥＰＳＣにおけるＯＣＴ４－Ｈ２Ｂ－ＶｅｎｕｓカセットのＯＣＴ４座位への標的化。標的化された対立遺伝子において、Ｔ２Ａ－Ｈ２Ｂ－Ｖｅｎｕｓ配列は、ＯＣＴ４遺伝子の最終コードエクソンとインフレームであった。終止コドンＴＧＡを欠損させた。本発明者らは、１９のコロニーの遺伝子型を同定し、これらの５つを、適切に標的化した。ｄ．Ｖｅｎｕｓ^＋細胞により測定した、７日間のＳＲＣインヒビターＷＨ－４－０２３またはＸＡＶ９３９のｈＥＰＳＣＭからの除去の効果。ＯＣＴ４－Ｈ２Ｂ－ＶｅｎｕｓレポーターＥＰＳＣを、示した条件下で培養し、蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーにより、Ｖｅｎｕｓ発現について解析した。ｅ．ブタおよびヒトＥＰＳＣにおけるＡＸＩＮ１およびＳＭＡＤ２／３のリン酸化のウエスタンブロット解析。ｐＥＰＳＣ^ＥｍｂとＨ１－ＥＰＳＣの両方は、遥かに高いレベルのＡＸＩＮ１を有していた。分化した（Ｄ）ＥＰＳＣ^Ｅｍｂまたはプライム型Ｈ１－ＥＳＣにおけるものより高いｐＳＭＡＤ２／３により証明した通り、ｐＥＰＳＣ^Ｅｍｂ、Ｈ１－ＥＰＳＣおよびＨ１－ナイーブ型ＥＳＣ（５ｉ）は、より高いレベルのＴＧＦβシグナル伝達を有していた。ｆ．ブタおよびヒトＥＰＳＣにおける古典的Ｗｎｔシグナル伝達活性のＴＯＰｆｌａｓｈ解析。５日間のｐＥＰＳＣＭ（ｐＥＰＳＣＭ－Ｘ）またはｈＥＰＳＣＭ（ｈＥＰＳＣＭ－Ｘ）からのＸＡＶ９３９の除去は、ＴＯＰｆｌａｓｈ活性を実質的に増大させた。^＊ｐ＜０．０１。データは、平均±ｓ．ｄ．である（ｎ＝４）。実験を、少なくとも４回行った。ｇ．その成分における示した変化と共に、ｐＥＰＳＣＭまたはｐＥＰＳＣＭにおいて培養したｐＥＰＳＣ^Ｅｍｂを示す、明視野および免疫蛍光画像。細胞を、ＯＣＴ４およびＤＡＰＩについて染色した。ｈ～ｉ．培地成分を除去するか、または小分子インヒビターを付加することによる、６ウェルプレートにおけるＳＴＯフィーダー上で２，０００個のｐＥＰＳＣ^Ｅｍｂ（ｈ）またはＨ１－ＥＰＳＣ（ｉ）から形成されたＡＰ^＋コロニーの定量。コロニーを、５連続継代の間スコア化して、ＸＡＶ９３９、ビタミンＣもしくはＣＨＩＲ９９０２１の除去、またはより低い濃度のＣＨＩＲ９９０２１（ｐＥＰＳＣＭにおいて使用される、０．２μＭ）、高濃度のＣＨＩＲ９９０２１（３．０μＭ）、ＪＮＫインヒビター、ＢＲＡＦインヒビター、またはＭｅｋ１／２インヒビター（ＰＤ０３）の使用の効果を決定した。本発明者らはまた、ＲＯＣＫインヒビターＹ２７６３２（－ＲＯＣＫｉ）なしでＥＰＳＣを継代する効果を定量した。データは、平均±ｓ．ｄ．であり（ｎ＝４）、実験を３回行った。ｊ～ｋ．ＸＡＶ９３９またはアクチビンＡを、ｐＥＰＳＣＭおよびｈＥＰＳＣＭから除去したとき、またはＴＧＦβシグナル伝達を、ＳＢ４３１５４２により阻害したとき、ｐＥＰＳＣ^Ｅｍｂ（ｊ）またはｈＥＰＳＣ（ｋ）における系統遺伝子の発現のＲＴ－ｑＰＣＲ解析。３．０μＭＣＨＩＲ９９０２１の効果も解析した。ｌ．Ｈ１－ＥＰＳＣから形成されたＥＢにおける系統遺伝子の発現に対する、ｈＥＰＳＣＭにおいて５．０ｎｇ／ｍｌアクチビンＡを添加する効果。中内胚葉系統の遺伝子の発現は、実質的に増大された。^＊ｐ＜０．０５、アクチビンＡを添加して培養したヒトＥＰＳＣとの比較。ｍ～ｎ．５．０ｎｇ／ｍｌアクチビンＡあり、またはなしかのいずれかで、ＥＰＳＣＭにおいて培養したＮＡＮＯＳ３－ＴｄｔｏｍａｔｏレポーターＥＰＳＣからＰＧＣＬＣへの分化。アクチビンＡの添加は、ＦＡＣＳ（Ｔｄｔｏｍａｔｏ^＋）で測定したＰＣＧＬＣを実質的に増加させた。ＰＧＣＬＣ遺伝子のＲＴ－ｑＰＣＲ解析により、ＰＣＧＬＣの増加を確認した。^＊ｐ＜０．０５、アクチビンＡを添加したｈＥＰＳＣＭとの比較。ＲＴ－ｑＰＣＲデータは、平均±ｓ．ｄ．である（ｎ＝３）。実験を、少なくとも３回行った。ＧＡＰＤＨに対して標準化した相対的発現レベルを示す。拡張データ図１１。ｈＥＰＳＣ栄養膜分化ポテンシャルの特徴決定。ａ．ＣＤＸ２－Ｈ２ＢＶｅｎｕｓレポーターＥＰＳＣ株の生成。標的化された対立遺伝子において、Ｔ２Ａ－Ｈ２ＢＶｅｎｕｓ配列は、ヒトＣＤＸ２遺伝子の最終コードエクソンとインフレームであった。ＴＧＡ終止コドンは、標的化対立遺伝子において欠失させた。レポーターＥＰＳＣを、続く解析のため、ｈＥＰＳＣＭ、標準的ＦＧＦ含有ヒトＥＳＣ培地またはヒトナイーブ型ＥＳＣのための５ｉ条件下で、その後培養した。ｂ．４日間のＢＭＰ４処理により栄養膜に分化するよう誘導した細胞におけるＲＴ－ｑＰＣＲにより測定した栄養膜遺伝子発現。実験を、少なくとも３回行った。データは、平均±ｓ．ｄ．である（ｎ＝３）。^＊ｐ＜０．０１、Ｈ１－ＥＳＣおよびＨ１－５ｉナイーブ型細胞と比較。ｃ．ＳＢ４３１５４２＋ＰＤ１７３０７４＋ＢＭＰ４により栄養膜に分化するよう誘導したｈＥＰＳＣにおけるＲＴ－ｑＰＣＲにより測定した栄養膜遺伝子発現。細胞を、解析のため、いくつかの時間点で収集した。ｑＲＴ－ＰＣＲデータは、平均±ｓ．ｄ．である（ｎ＝３）。ＧＡＰＤＨに対して標準化した相対的発現レベルを示す。ｄ．ヒートマップは、Ｈ１－ＥＳＣ（緑色）、Ｈ１－ＥＰＳＣ（赤色）またはｉＰＳＣ－ＥＰＳＣ（青色）から分化した細胞における栄養膜遺伝子の発現変化を示す（ＲＮＡｓｅｑデータは、補足表６にある）。細胞を、ＲＮＡｓｅｑ解析のため、いくつかの分化時間点で収集した。ｅ．ＰＨＴｕおよびＰＨＴｄ（それぞれ、分化していないヒト初代栄養膜および分化したヒト初代栄養膜）の公開データおよびヒト組織と共に、Ｈ１－ＥＳＣ、Ｈ１－ＥＰＳＣおよびｉＰＳＣ－ＥＰＳＣ（補足表６中のＲＮＡｓｅｑデータ）から分化した細胞における遺伝子発現のピアソン相関係数。これらの解析の詳細を、方法に示す。ｆ．Ｈ１－ＥＰＳＣ、Ｈ１－ＥＳＣ、Ｈ１－ナイーブ型ＥＳＣ（５ｉ）から分化した細胞および６日間ＳＢ４３１５４２で処理したｉＰＳＣ－ＥＰＳＣにおける４つのＣ１９ＭＣｍｉＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－５２５－３ｐ、－５２６ｂ－３ｐ、－５１７－５ｐ、および－５１７ｂ－３ｐ）の検出。絨毛外栄養膜の代表である絨毛癌細胞ＪＥＧ－３、および絨毛栄養膜細胞の代表であるＪＡＲを、対照として使用した。ｇ．ＢＭＰ４（４日間）で処理したヒトＥＰＳＣおよびヒトＥＳＣにおいて上で提示したものと同じ４つのｍｉＲＮＡの発現。データは、平均±ｓ．ｄ．である（ｎ＝３）。^＊ｐ＜０．０５、Ｈ１－ＥＳＣとの比較。相対的ｍｉＲＮＡ発現レベルを、ｍｉＲ－１０３ａに対して標準化して示す。ｈ．Ｈ１－ＥＰＳＣおよび他の細胞から分化した細胞（ＳＢ４３１５４２処理の６日目）におけるＥＬＦ５座位のプロモーター領域におけるＤＮＡ脱メチル化。Ｈ１－ＥＳＣ、Ｈ１－ナイーブ型ＥＳＣ（５ｉ）からの細胞は、ＥＬＦ５プロモーターでの実質的なＤＮＡ脱メチル化を有さなかった。ｉ．ＴＧＦβ阻害（ＳＢ４３１５４２）により誘導したＨ１－ＥＰＳＣからもたらされた栄養膜から分泌されたホルモン。ＶＥＧＦ、ＰＬＧＦ、ｓＦｌｔ－１ａｎｄｓＥｎｇを、１６日目まで４８時間の間隔でのＳＢ４３１５４２処理の際にＥＰＳＣまたはＥＳＣ培養物から分化した細胞の条件培地において測定した。ｊ．ＥＰＳＣまたはＥＳＣ由来の栄養膜から分泌されたｈＣＧ。１０日間分化させた（ＳＢ４３１５４２処理）ＥＰＳＣおよびＥＳＣから分泌されたｈＣＧを、ＥＬＩＳＡにより測定した。データは、平均±ｓ．ｄ．である（ｎ＝４）。^＊ｐ＜０．０１、Ｈ１－ＥＳＣとの比較。拡張データ図１２。ヒトＥＰＳＣから栄養膜幹細胞様細胞（ｈＴＳＣ）の誘導および特徴決定。ａ．４つのＥＰＳＣ由来ＴＳＣ株およびこれらの親ｈＥＰＳＣにおける多能性および栄養膜幹細胞遺伝子のＲＴ－ｑＰＣＲ解析。データは、平均±ｓ．ｄ．である（ｎ＝３）。^＊ｐ＜０．０１、ＴＳＣと比較。ｂ．ＥＰＳＣからもたらされたｈＴＳＣおよびいくつかの時間点で、ＴＧＦβインヒビターＳＢ４３１５４２で処理したＨ１－ＥＰＳＣから分化した細胞の遺伝子発現のＰＣＡ。ｈＴＳＣは、４日目の分化したＥＰＳＣの強化トランスクリプトーム特性を有すると思われる。ｃ．ＴＳＣから分化した多核性合胞体栄養細胞の位相差およびヘキスト染色画像。ｄ．ｈＥＳＰＣからもたらされたＴＳＣから分化した合胞体栄養細胞におけるＣＧＢの免疫蛍光検出。ｅ．ｈＴＳＣからの合胞体栄養細胞形成の効率。融合指数を、合胞体における核の数／核の総数として計算する。データを、平均±ＳＤとして示す（ｎ＝４）。^＊ｐ＜０．０１、ＴＳＣと比較。ｆ．３つのＴＳＣ株ならびにこれらの誘導合胞体栄養細胞（ＳＴ）および絨毛外栄養膜（ＥＶＴ）における栄養膜遺伝子のＲＴ－ｑＰＣＲ解析。ＧＡＰＤＨに対して標準化した相対的発現レベルを示す。ｇ．分化していないｈＥＳＣ、ｈＥＰＳＣ、ｈＴＳＣ、およびｈＴＳＣから分化したｈＥＶＴにおける単一クローン抗体Ｗ６／３２による、ＨＬＡクラスＩの検出。ｈＥＳＣ、ｈＥＰＳＣおよびｈＴＳＣと比較し、実質的により低いレベルのＨＬＡクラスＩ分子を発現した。ＥＶＴは、ＨＬＡ－Ｃを発現することが知られている。絨毛癌細胞ＪＥＧ－３およびＪＡＲは、それぞれ、絨毛外および絨毛栄養膜細胞の代表である。ＪＥＧ－３は、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－ＣおよびＨＬＡ－Ｅを発現し、一方、ＪＡＲ細胞は、ＨＬＡ分子を発現しない（Apps, R., et al. Immunology 2009）。これらを、それぞれ、正および負の対照として使用した。ｈ．図４ｇと関連するＨＬＡ－Ｇフローサイトメトリー解析のためのアイソタイプ対照。ｉ．ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスにおいて皮下注射したｈＴＳＣから形成された病変のＨ＆Ｅ染色。ｊ．マウスに、ｈＴＳＣ（ｎ＝３）またはビークル対照（ｎ＝３）を皮下注射した７日後の、６匹のＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスにおける血清ｈＣＧレベル。拡張データ図１３。ブタＥＰＳＣから栄養膜幹細胞様細胞（ｐＴＳＣ）の誘導および特徴決定。ａ．Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３およびＨ３Ｋ４ｍｅ３は、ｐＥＰＳＣ^ＥｍｂおよびヒトＨ１－ＥＰＳＣにおける胎盤発生と関連するファクターをコードする座位をマーキングしる。ｂ．ヒトＴＳＣ条件において７日間培養した個々のｐＥＰＳＣ^Ｅｍｂから形成された初代ＴＳＣコロニー（上）、および７継代の確立したｐＴＳＣ（下）の画像。波線は、安定なｐＴＳＣ株を確立するために拾った、推定栄養膜の範囲を印す。ｃ．４つのｐＴＳＣ株およびこれらの親ｐＥＰＳＣ^Ｅｍｂにおける多能性および栄養膜遺伝子のＲＴ－ｑＰＣＲ解析。データは、平均±ｓ．ｄ．である（ｎ＝３）。^＊ｐ＜０．０１、ｐＥＰＳＣからｐＴＳＣの間の比較。ＧＡＰＤＨに対して標準化した相対的発現レベルを示す。ｄ．免疫染色により検出したｐＥＰＳＣ^Ｅｍｂ－ＴＳＣにおける栄養膜ファクターＧＡＴＡ３およびＫＲＴ７の発現。核を、ＤＡＰＩで染色した。ｅ．ＳＤＣ１およびＫＲＴ７発現細胞についての、ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスにおいてｐＴＳＣから形成された病変の切片の免疫染色の共焦点画像。ｆ．ｐＴＳＣを、免疫不全マウスに皮下注射したとき形成された病変の切片のＨ＆Ｅ染色。ｇ．ｐＴＳＣの注射の１～２日後のブタ胚盤胞の免疫染色の共焦点画像。Ｈ２Ｂ－ｍＣｈｅｒｒｙ発現ｐＴＳＣを、ブタ単為生殖桑実胚および早期胚盤胞に注射した（２回の注射においてｎ＝５０の胚盤胞）。矢印は、ブタ栄養外胚葉転写因子ＣＤＸ２およびＧＡＴＡ３を発現したＴＥにおけるＨ２Ｂ－ｍＣｈｅｒｒｙ^＋細胞を示す。拡張データ図１４。栄養膜分化ポテンシャルに対するヒトＥＰＳＣにおけるＰＡＲＧの不活性化の効果。ａ．ＣＤＸ２－Ｈ２ＢＶｅｎｕｓレポーターｈＥＰＳＣにおけるＰＡＲＧ遺伝子のエクソン４の約３５０ｂｐのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在性欠失。２つのｇＲＮＡ（ｇ１、ｇ２）を、最大のコードエクソンを標的化するよう設計した。遺伝子導入および選別後、４８のクローンのうち６つのクローンを、ＰＣＲ遺伝子型同定により、二重対立遺伝子変異と同定し、配列決定により確認した。ｂ．ＰＡＲＧ欠失を有するか、または有さないＣＤＸ２－レポーターＥＰＳＣ細胞を、栄養膜分化のため４日間ＴＧＦβインヒビターＳＢ４３１５４２で処理した。細胞を、フローサイトメトリーにより解析した。ｃ．Ｖｅｎｕｓ^＋細胞の割合は、親細胞の栄養膜分化の程度を示す。引き起こしたＰＡＲＰの不活性化は、Ｖｅｎｕｓ^＋細胞を減少した。データは、平均±ｓ．ｄ．である（ｎ＝３）。^＊ｐ＜０．０５、広範なタイプとＰＡＲＧ^－／－Ｈ１－ＥＰＳＣの間の比較。同様の結果を、２つの独立したＰＡＲＰ欠損ヒトＥＰＳＣ株を使用した実験において得た。ｄ．ＳＢ４３１５４２処理の６日後の、対照（野生型）またはＰＡＲＧ欠損ＣＤＸ２－Ｈ２ＢＶｅｎｕｓＨ１－ＥＰＳＣのいずれかから分化した細胞における栄養膜遺伝子の発現のＲＴ－ｑＰＣＲ解析。有意には、より低い栄養膜遺伝子発現を、ＰＡＲＧ欠損細胞において見出した。^＊ｐ＜０．０５。データは、平均±ｓ．ｄ．である（ｎ＝３）。ＧＡＰＤＨに対して標準化した相対的発現レベルを示す。実験を、少なくとも３回行った。

４．２定義
別段特定されない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、本開示が属する当該技術分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものと類似または均等な任意の方法および物質を、本開示の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および物質が記載される。本開示の目的のため、次の用語が、以下で定義される。

「ｉＰＳＣ」は、非多能性の分化した祖先細胞からもたらされる多能性幹細胞である。適当な祖先細胞は、成人線維芽細胞および末梢血液細胞などの体細胞を含む。これらの祖先細胞は、典型的には、多能性遺伝子（もしくはそれをコードするＲＮＡ）またはこれらの対応するタンパク質の細胞への導入により、または内因性多能性遺伝子を再活性化することにより、リプログラミングされる。導入技術は、プラスミドもしくはウイルス遺伝子導入、またはある特定の実施形態では、直接タンパク質デリバリーを含む。

「フィーダー細胞」または「フィーダー」は、他方のタイプの細胞と共培養される一方のタイプの細胞を記載するため、第二のタイプの細胞が成長することができる環境をもたらすために使用される用語である。フィーダーのない培養は、約５％未満のフィーダーを含有する。１％、０．２％、０．０５％、または０．０１％未満のフィーダー（培養液における総細胞の％として表される）を含有する組成物が、ますます、より好ましい。

「成長環境」は、目的の細胞がインビトロで増殖する環境である。環境の特性は、細胞が培養される培地、および存在する場合、支持構造（固体表面上の基材など）を含む。

「栄養培地」は、等調生理食塩水、緩衝液、アミノ酸、血清または血清代替物、および他の外因性に添加されたファクターを含む、増殖を促進する栄養を含有する細胞を培養するための培地である。

「条件培地」は、細胞の第一の集団を培地において培養し、次いで、培地を回収することにより、調製される。次いで、条件培地を、細胞により培地に分泌される任意のものと共に使用して、細胞の第二の集団の成長を支持し得る。特定の成分またはファクターが、培地に添加されたと記載される場合、ファクターは、計画的な操作により培地に混合されている。

本開示において使用される場合、用語「抗体」は、任意の種のポリクローナルとモノクローナル抗体の両方を指す。用語の範囲は、インタクトな免疫グロブリン分子だけでなく、免疫グロブリン分子のフラグメントおよび遺伝子操作された誘導体、ならびに所望の結合特異性を保持する同等な抗原結合分子を包含する。

用語「単離された」または「精製された」は、その天然の状態で見出される、正常にそれに伴う成分から実質的または本質的に離れた物質を指す。純度および均一性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの解析化学技術を使用して決定される。

本明細書において使用される、用語「血清」は、血液細胞およびフィブリノーゲン／フィブリンが除去された後に残る血液の液体部分を意味する。用語「血清を含まない培地」は、血清または動物の血清から抽出された産物および特に、哺乳類、鳥類、魚類または甲殻類を起源とするものを含有しない培地を意味する。

用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「成ること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、排他的にＸからなり得るか、またはさらなる何か、例えば、Ｘ＋Ｙを含み得る。

用語「正確に（ｅｘａｃｔｌｙ）」、「正確に（ｐｒｅｃｉｓｅｌｙ）」、または別の同等な用語により別段示されない限り、本明細書において使用される、成分の量、分子量などの特性、反応条件などを表す全ての数は、用語「約」により、全ての場合で修飾されていると理解されるべきであり、従って、指定される実際の数より最大１０％大きいかまたは小さい変動を本質的に含むべきである。従って、本明細書における数パラメーターは、本開示により得られると考えられる所望の特性に依存する近似値である。最低限、それぞれの数パラメーターは、通常の切り上げ技術を適用することにより、少なくとも、報告された有意なアラビア数字の数が与えられると解釈されるべきである。数範囲および広範囲の開示を記載するパラメーターが近似値であるにも関わらず、数値は、特定の実施例では、出来るだけ正確に報告される。しかしながら、任意の数値は、数値検査測定において見出される誤差から必然的に生じる標準偏差を本質的に含有する。

５．詳細な説明
多能性幹細胞の集団からの拡大ポテンシャル幹細胞（ＥＰＳＣ）の生成が、本明細書において記載される。ＥＰＳＣは、「ナイーブ型」または基底状態特性を有し、胚体外細胞株（栄養膜および卵黄嚢における胚体外内胚葉）ならびに胚体の細胞に分化する拡大したポテンシャルを有する。ＥＰＳＣは、異なる多能性幹細胞株から生成され、拡大ポテンシャル幹細胞培地（ＥＰＳＣＭ）において培養される。ＥＰＳＣは、体細胞および栄養膜細胞を含む、広範な細胞タイプに首尾よく分化させられてきた。ＥＰＳＣは、ＥＰＳＣまたはそれから分化した細胞の発生の機序を研究するのに有用であり得る。これは、再生医学における研究およびＲ＆Ｄと共に、例えば、疾患モデリング、治療剤のスクリーニング、毒性試験、遺伝子疾患の研究および生殖生物学の研究において特に助けとなる。

拡大ポテンシャル幹細胞（ＥＰＳＣ）の集団は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）の集団を拡大ポテンシャル幹細胞培地（ＥＰＳＣＭ）において培養して、ＥＰＳＣの集団を生成することにより、生成され得る。着床前の胚から直接、またはブタ胎児線維芽細胞をリプログラミングすることのいずれかによる、ブタＥＰＳＣ（ｐＥＰＳＣ）株の誘導が、本明細書において記載される。多能性細胞は、胚幹細胞（ＥＳＣ）および非胚幹細胞、例えば、胎児および成人の幹細胞、ならびに誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含み得る。

５．１新規ブタｉＰＳＣの生成
ブタｉＰＳＣが利用可能である一方、スクリーニングのためのこれらの細胞の使用は、リプログラミング後のトランスジェニックリプログラミングファクターのリーキーな発現により、または内因性多能性遺伝子の低レベルの発現により、区別されない［１１～１９］。この課題を克服するために、新規ブタｉＰＳＣを生成して、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）誘導性ＬＩＮ２８、ＮＡＮＯＧ、ＬＲＨ１およびＲＡＲＧなどの多能性遺伝子を、４つの山中ファクターと共同して、発現させる。

多能性遺伝子またはタンパク質は、ＬＩＮファミリーメンバー、ＮＡＮＯＧファミリーメンバー、ＬＲＨファミリーメンバー、ＲＡＲファミリーメンバーの１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つを含んでもよい。

Ｌｒｈファミリーメンバーは、ＬＲＨ１であってもよい。

Ｒａｒファミリーメンバーは、Ｒａｒ－ｇであってもよい。

一実施形態では、多能性遺伝子またはタンパク質は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃ（山中ファクター）を含んでもよい。

ｉＰＳＣの生成技術は、当該技術分野において周知である（Yamanaka et al Nature 2007; 448:313-7; Yamanaka 6 2007 Jun. 7; 1(1):39-49; Kim et alら Nature. 2008 Jul. 31; 454(7204):646-50; Takahashi Cell. 2007 Nov. 30; 131(5):861-72. Park et al Nature. 2008 Jan. 10; 451(7175):141-6; Kimet et al Cell Stem Cell. 2009 Jun. 5; 4(6):472-6; Vallier, L.,et al. Stem Cells, 2009. 999(999A), Wang W, et al. PNAS. (2011) 108; 45; 18283-8）。しかしながら、本明細書において提供されるストラテジーは、ｔｄＴｏｍａｔｏカセットが、ブタＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１）座位（ＰＯＴＰＦＦ）の３’ＵＴＲに挿入されている［２０］、野生型ドイツ在来種ブタ胎児線維芽細胞（ＰＦＦ）およびトランスジェニックＰＦＦの推定ｉＰＳＣコロニー（拡張データ図１ａ～ｃ）へのリプログラミング効率を実質的に改善する。ＰＯＴＰＦＦからリプログラミングされた初代コロニーは、ＯＣＴ４－ｔｄＴｏｍａｔｏ^＋であり、これは、ＯＣＴ４座位の再活性化を示す（拡張データ図１ｃ）。実際、ＲＴ－ｑＰＣＲにより、ｉＰＳＣが、高レベルの内因性多能性ファクターを発現し（拡張データ図１ｄ）、血清含有培地（Ｍ１５）プラスＤｏｘにおいて２０継代より多く、ＳＴＯフィーダー上で単一細胞として継代され得ることが明らかになった。

Ｄｏｘ除去の際、ｉＰＳＣは、外因性リプログラミングファクターおよび内因性多能性遺伝子の迅速なダウンレギュレーション、ならびに胚と胚体外細胞系統遺伝子の両方の増大した発現に付随して、４～５日内に分化した（拡張データ図１ｅ～ｈ）。強い内因性多能性遺伝子発現を有するこれらのＤｏｘ依存性ブタｉＰＳＣは、化学スクリーニングのための材料を提供した。

従って、多能性幹細胞の集団は、当該技術分野において公知であり、本明細書において考察される技術を使用して、多能性遺伝子またはこれらの対応するタンパク質を導入することにより、または内因性多能性遺伝子を不活性化することにより、体細胞などの非多能性幹細胞を誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）にリプログラミングすることにより得られ得る。

ｉＰＳＣは、哺乳類個体から得られてもよい。哺乳類は、イヌ、ネコ、げっ歯類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、および霊長類を含む。鳥類は、家禽、鳴禽類、および猛禽類を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ｉＰＳＣは、体細胞または個体から得られる他の前駆細胞からもたらされてもよい。ｉＰＳＣを使用して、その個々の遺伝子型同定を共有するＥＰＳＣの集団を生成してもよい。一部の実施形態では、ＥＰＳＣまたは個体からインビトロで生成された、それから分化した細胞は、その個体と関連する疾患状態の機序を研究するのに有用であり得る。

５．２培養液
多能性幹細胞のための適当な培養液は、当該技術分野において周知であり、２０％血清代替物、１％非必須アミノ酸、１ｍＭＬ－グルタミン、０．１ｍＭ β－メルカプトエタノールおよび４ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌＦＧＦ２を添加したノックアウトダルベッコ変法イーグル培地（ＫＯ－ＤＭＥＭ）；または４ｎｇ／ｍｌＦＧＦ２を添加したノックアウト（ＫＳ）培地；または２０％血清代替物、１％非必須アミノ酸、１ｍＭＬ－グルタミン、０．１ｍＭ３－メルカプトエタノールおよび４ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌヒトＦＧＦ２を添加したＫＯ－ＤＭＥＭ；または２０％ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）、６ｎｇ／ｍｌＦＧＦ２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、１ｍＭＬ－Ｇｌｎ、１００μｍ非必須アミノ酸、１００μＭ２－メルカプトエタノール、５０Ｕ／ｍｌペニシリンおよび５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む。

ある特定の実施形態では、本方法において使用するための多能性幹細胞の集団は、１つまたは複数の追加の成分、例えば、ビタミンＣ（Ｖｃ）、アクチビンＡおよびＬＩＦ（拡張データ図２ａ、２ｈおよび補足表１）も添加した、ＧＳＫ３（ＣＨＩＲ９９０２１）、ＳＲＣ（ＷＨ－４－０２３）およびタンキラーゼ（ＸＡＶ９３９）についてのインヒビター（最後の２つは、マウスＥＰＳＣ［１］にとって重要なインヒビターであった）を含む化学的に規定された基本培地を含む化学的に規定された培地（ＣＤＭ）（５１７番、ブタＥＰＳＣ培地：ｐＥＰＳＣＭ）（拡張データ図２ｈ）において培養されてもよい。これらの条件下で、Ｄｏｘ依存性ｉＰＳＣ（ｐＥＰＳＣ^ｉＰＳ）は、３０継代で分化しないままであり、ブタ胚盤胞に匹敵するレベルで内因性多能性ファクターを発現し、外因性リプログラミングファクターのリーキーな発現を示さなかった（拡張データ図３ｂ～ｄ）。

分化しない状態でＤｏｘ依存性ブタｉＰＳＣを維持するために（拡張データ図２ａ；補足表１）、Ｍｅｋ１、ｐ３８およびＰＫＣのインヒビターは、推定ブタｉＰＳＣを維持するそれらの能力について２０の小分子インヒビターとサイトカインの４００種を超える組み合わせをスクリーニング後に排除される。マウスモデルを使用した従前の報告との差異が報告された；ナイーブ型マウスＥＳＣ培地２ｉ／ＬＩＦは、推定ブタｉＰＳＣを維持することができた［１５、１７、２１］が、ブタｉＰＳＣは、Ｄｏｘが存在するかどうかに関係なく、１．０μＭのＭｅｋ１インヒビターＰＤ－０３２５９０１の存在下で迅速に失われた（拡張データ図２ｂ～ｈ）。これは、ブタ多能性幹細胞およびマウスＥＳＣが、Ｍｅｋ－ＥＲＫシグナル伝達の要件が異なることを示す。［２６～２８］ｐ３８およびＰＫＣの阻害は、ブタｉＰＳＣの助けとならなかった（拡張データ図２ｂ～ｈおよび拡張データ図３ａ）。これらの知見は、マウスまたはヒトナイーブ型ＥＳＣ条件［２２～２４］からの推定を、ブタ多能性幹細胞に直接的に適用することはできないという結論を導いた。それ故、Ｍｅｋ１／２、ｐ３８およびＰＫＣについてのこれらの３つのインヒビターは、スクリーニングから除外された。

細胞培養に適当な技術は、当該技術分野において周知である（例えば、Basic Cell Culture Protocols, C. Helgason, Humana Press Inc. U.S. (15 Oct. 2004) ISBN: 1588295451; Human Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Medicine S.) Humana Press Inc., U.S. (9 Dec. 2004) ISBN: 1588292223; Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, R. Freshney, John Wiley & Sons Inc (2 Aug. 2005) ISBN: 0471453293, Ho W Y et al J Immunol Methods. (2006) 310:40-52, Handbook of Stem Cells (ed. R. Lanza) ISBN: 0124366430) Basic Cell Culture Protocols' by J. Pollard and J. M. Walker (1997), 'Mammalian Cell Culture: Essential Techniques' by A. Doyle and J. B. Griffiths (1997), 'Human Embryonic Stem Cells' by A. Chiu and M. Rao (2003), Stem Cells: From Bench to Bedside' by A. Bongso (2005), Peterson & Loring (2012) Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide Academic Press and 'Human Embryonic Stem Cell Protocols' by K. Turksen (2006)）。それ故、培地および成分は、市販の供給源（例えば、Ｇｉｂｃｏ、Ｒｏｃｈｅ、Ｓｉｇｍａ、Ｅｕｒｏｐａｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）から得られ得る。標準的な哺乳類細胞培養条件、例えば、３７℃、５％二酸化炭素が、上記培養工程のため利用されてもよい。

使用のための多能性幹細胞の集団を、本明細書に記載される本拡大ポテンシャル幹細胞培地（ＥＰＳＣＭ）において培養して、ＥＰＣＳの集団を生成してもよい。一度変換されると、ＥＰＳＣは、ＥＰＳＣ維持培地（ＥＰＳＣＭＭ）において培養され得る。維持培地は、本明細書に記載される組成、例えば、細胞を変換するために使用されたＥＰＳＣＭに匹敵するわずかなインヒビター／モジュレーターを有してもよい。一度変換されると、ＥＰＳＣは、培地においてそれらを維持するためのインヒビター／モジュレーターをＥＰＳＣほど多くは必要としない。

適当なブタＥＰＳＣＭ５００ｍｌは、１つまたは複数の：
０．３μＭＷＨ－４－０２３（ＳＲＣインヒビター、ＴＯＣＲＩＳ、カタログ番号５４１３），
２．５μＭＸＡＶ９３９（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｘ３００４）または２．０μＭＩＷＲ－１（ＴＯＣＲＩＳ、カタログ番号３５３２）、
５０μｇ／ｍｌビタミンＣ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号４９７５２－１００Ｇ）、
１０ｎｇ／ｍｌＬＩＦ（ＳｔｅｍＣｅｌｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣａｍｂｒｉｄｇｅ．ＳＣＩ）、
２０ｎｇ／ｍｌアクチビン（ＳＣＩ）
を含む。

適宜、ＥＰＳＣＭはまた、ＬＩＦを含有してもよい。ＥＰＳＣＭは、栄養培地を含有してもよい。

適当なＥＰＳＣＭまたはＥＰＳＣＭＭは、栄養培地およびＧＳＫ３インヒビターを含む。

適当なＥＰＳＣＭまたはＥＰＳＣＭＭは、以下の成分：ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２１３３１－０２０）４８２．５ｍｌ、Ｎ２栄養補助剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１７５０２０４８）２．５ｍｌ、Ｂ２７栄養補助剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１７５０４０４４）５ｍｌ、１×グルタミンペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１１４０－０５０）５ｍｌ、１×ＮＥＡＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１０３７８－０１６）５ｍｌ、１１０μＭ２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ６２５０）、および０．２μＭＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ３ｉ、ＴＯＣＲＩＳ、カタログ番号４４２３）、０．３％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０２７０）の１つまたは複数を含有してもよい。

適当なブタＥＰＳＣＭ５００ｍｌは、以下の成分：
ＩＴＳ－Ｘ２００×（ｔｈｅｒｍｏｓ、５１５０００５６）、２．５ｍｌ添加；
ビタミンＣ（Ｓｉｇｍａ、４９７５２－１００Ｇ）、作用濃度６４μｇ／ｍｌ；
ウシアルブミンフラクションＶ（７．５％溶液）（Ｔｈｅｒｍｏ、１５２６００３７）、３ｍｌ；
１０００×微量元素Ｂ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＭＴ９９１７５ＣＩ）
１０００×微量元素Ｃ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＭＴ９９１７６ＣＩ）
１０ｍｇ／ｍｌ還元型グルタチオン（ｓｉｇｍａ、Ｇ６０１３－５Ｇ）、１６５μｌ添加
ＸＡＶ９３９（ＳｉｇｍａＸ３００４）、作用濃度２．５μＭ；
エンド－ＩＷＲ－１（Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号３５３２）、作用濃度１μＭ
ＷＨ－４－０２３（Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号５４１３）、作用濃度０．１６μＭ；
カイロン９９０２１（ＴｏｃｒｉｓＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、４４２３）、作用濃度０．２μＭ；
ヒトＬｉｆ、作用濃度１０ｎｇ／ｍｌ；および
２０ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（ＳＴＥＭＣＥＬＬＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、カタログ番号７８００１．１）
の１つまたは複数を含む。

適当なＥＰＳＣＭまたはＥＰＳＣＭＭは、以下の成分：Ｆ１２ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、２１３３１－０２０）、２４０ｍｌ添加；神経基本培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、２１１０３－０４９）２４０ｍｌ；ペニシリン－ストレプトマイシン－グルタミン（１００×）（Ｇｉｂｃｏ、１０３７８０１６）、５ｍｌ添加；１００×ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ、１１１４００５０）、５ｍｌ添加；１００×ピルビン酸ナトリウム（ｇｉｂｃｏ、１１３６００７０）、５ｍｌ添加；１４．３Ｍ２－メルカプトエタノール（Ｍ６２５０Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｉｇｍａ）、３．８μｌ添加（作用濃度１１０μＭ）；２００×Ｎ２（Ｔｈｅｒｍｏ１７５０２０４８）、２．５ｍｌ添加；および１００×Ｂ２７（Ｔｈｅｒｍｏ１７５０４０４４）、５ｍｌ添加
の１つまたは複数を含有してもよい。

適当なヒトＥＰＳＣＭ５００ｍｌは、以下の成分：
０．１μＭＡ－４１９２５９（ＳＲＣインヒビター、ＴＯＣＲＩＳ、カタログ番号３９１４），
２．５μＭＸＡＶ９３９（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｘ３００４）または２．５μＭＩＷＲ－１（ＴＯＣＲＩＳ、カタログ番号３５３２）、
５０μｇ／ｍｌビタミンＣ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号４９７５２－１００Ｇ）、
１０ｎｇ／ｍｌＬＩＦ（ＳＣＩ）
の１つまたは複数を含む。

適当なＥＰＳＣＭまたはＥＰＳＣＭＭは、栄養培地をＧＳＫ３インヒビターと一緒に含む。

適当なＥＰＳＣＭまたはＥＰＳＣＭＭは、以下の成分：ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２１３３１－０２０）４８２．５ｍｌ、Ｎ２栄養補助剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１７５０２０４８）２．５ｍｌ、Ｂ２７栄養補助剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１７５０４０４４）５ｍｌ、１×グルタミンペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１１４０－０５０）５ｍｌ、１×ＮＥＡＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１０３７８－０１６）５ｍｌ、１１０μＭ２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ６２５０）、および１．０μＭＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ３インヒビター、ＴＯＣＲＩＳ、カタログ番号４４２３）の１つまたは複数を含有してもよい。

適当なヒトＥＰＳＣＭ５００ｍｌは、以下の成分：
ＩＴＳ－Ｘ２００×（ｔｈｅｒｍｏｓ、５１５０００５６）、２．５ｍｌ添加
ビタミンＣ（Ｓｉｇｍａ、４９７５２－１００Ｇ）、作用濃度６４μｇ／ｍｌ；
ウシアルブミンフラクションＶ（７．５％溶液）（Ｔｈｅｒｍｏ、１５２６００３７）、３ｍｌ；
１０００×微量元素Ｂ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＭＴ９９１７５ＣＩ）
１０００×微量元素Ｃ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＭＴ９９１７６ＣＩ）
１０ｍｇ／ｍｌ還元型グルタチオン（ｓｉｇｍａ、Ｇ６０１３－５Ｇ）、１６５μｌ添加
５００×規定された脂質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１１９０５０３１）
ＸＡＶ９３９（ＳｉｇｍａＸ３００４）、作用濃度２．５μＭ；
エンド－ＩＷＲ－１（Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号３５３２）、作用濃度２．５μＭ
Ａ４１９２５９（ＴｏｃｒｉｓＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、３７４８）、作用濃度０．１μＭ；
カイロン９９０２１（ＴｏｃｒｉｓＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、４４２３）、作用濃度１．０μＭ
の１つまたは複数を含んでもよい。

適当なＥＰＳＣＭまたはＥＰＳＣＭＭは、以下の成分：Ｆ１２ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、２１３３１－０２０）、２４０ｍｌ添加；神経基本培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、２１１０３－０４９）２４０ｍｌ；ペニシリン－ストレプトマイシン－グルタミン（１００×）（Ｇｉｂｃｏ、１０３７８０１６）、５ｍｌ添加；１００×ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ、１１１４００５０）、５ｍｌ添加；１００×ピルビン酸ナトリウム（ｇｉｂｃｏ、１１３６００７０）、５ｍｌ添加；１４．３Ｍ２－メルカプトエタノール（Ｍ６２５０Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｉｇｍａ）、３．８μｌ添加（作用濃度１１０μＭ）；２００×Ｎ２（Ｔｈｅｒｍｏ１７５０２０４８）、２．５ｍｌ添加；１００×Ｂ２７（Ｔｈｅｒｍｏ１７５０４０４４）、５ｍｌ添加；およびヒトＬｉｆ、作用濃度１０ｎｇ／ｍｌの１つまたは複数を含有してもよい。

一実施形態では、ブタＥＰＳＣ培地は、
ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２１３３１－０２０）、またはノックアウトＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０８２９－０１８）、基本培地、９８％；
Ｎ２栄養補助剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１７５０２０４８）、０．１～１％、０．２５～０．７５％、０．４～０．６％の範囲；
Ｂ２７栄養補助剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１７５０４０４４）、０．１～２％、０．５～１．５％、０．８～１．０％の範囲；
グルタミンペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１１４０－０５０）、基本栄養補助剤、１％；
ＮＥＡＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１０３７８－０１６）、基本栄養補助剤、１％；
２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ６２５０）、基本栄養補助剤、１１０μＭ；
ＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ３ｉ、ＴＯＣＲＩＳ、カタログ番号４４２３）、０．０５～０．５μＭ、０．１～０．５μＭ、０．２～０．３μＭの範囲；
ＷＨ－４－０２３（ＳＲＣインヒビター、ＴＯＣＲＩＳ、カタログ番号５４１３）、０．１～１．０μＭ、０．２～０．８μＭ、０．３～０．５μＭの範囲；
ＸＡＶ９３９（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｘ３００４）、１～１０μＭ、２～５μＭ、さらに２．５～４．５μＭの範囲；またはＩＷＲ－１（ＴＯＣＲＩＳ、カタログ番号３５３２）、１～１０μＭ、２～５μＭ、２．５～４．５μＭの範囲；
ビタミンＣ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号４９７５２－１００Ｇ）、１０～１００μｇ／ｍｌ、２０～８０μｇ／ｍｌ、５０～７０μｇ／ｍｌの範囲；
ＬＩＦ（ＳｔｅｍＣｅｌｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣａｍｂｒｉｄｇｅ．ＳＣＩ）、１～２０ｎｇ／ｍｌ、５～１５ｎｇ／ｍｌ、８～１２ｎｇ／ｍｌの範囲；
アクチビン（ＳＣＩ）、１０～５０ｎｇ／ｍｌ、１５～３０ｎｇ／ｍｌ、さらに２０～２５ｎｇ／ｍｌの範囲；
ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０２７０）、０．１～０．５％、好ましくは、０．２～０．４％、０．２５～０．３５％の範囲、および
ＩＴＳ－Ｘ（ｔｈｅｒｍｏｓ、５１５０００５６）、０．１～２％、好ましくは、０．２～０．８％、０．４～０．６％の範囲
を含む。

別の実施形態では、ヒトＥＰＳＣ培地は、
ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２１３３１－０２０）、またはノックアウトＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０８２９－０１８）、基本培地、９８％；
Ｎ２栄養補助剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１７５０２０４８）、０．１～１％、０．２５～０．７５％、０．４～０．６％の範囲；
Ｂ２７栄養補助剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１７５０４０４４）、０．１～２％、０．５～１．５％、０．８～１．０％の範囲；
グルタミンペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１１４０－０５０）、基本栄養補助剤、１％；
ＮＥＡＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１０３７８－０１６）、基本栄養補助剤、１％；
２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ６２５０）、基本栄養補助剤、１１０μＭ；
ＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ３インヒビター、ＴＯＣＲＩＳ、カタログ番号４４２３）、０．２～２μＭ、０．５～１．５μＭ、０．８～１．２μＭの範囲；
Ａ－４１９２５９（ＳＲＣインヒビター、ＴＯＣＲＩＳ、カタログ番号３９１４）、０．０５～０．５μＭ、０．１～０．５μＭ、０．１５～０．３μの範囲、μＭＸＡＶ９３９（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｘ３００４）、１～１０μＭ、２～５μＭ、２．５～４．５μＭの範囲、またはＩＷＲ－１（ＴＯＣＲＩＳ、カタログ番号３５３２）、１～１０μＭ、２～５μＭ、２．５～４．５μＭの範囲；
ビタミンＣ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号４９７５２－１００Ｇ）、１０～１００μｇ／ｍｌ、２０～８０μｇ／ｍｌ、５０～７０μｇ／ｍｌの範囲；
ＬＩＦ（ＳＣＩ）、１～２０ｎｇ／ｍｌ、５～１５ｎｇ／ｍｌ、８～１２ｎｇ／ｍｌの範囲
を含む。

別の実施形態では、ヒトＥＰＳＣ培地は、
Ｆ１２ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、２１３３１－０２０）、基本培地、４８％
神経基本培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、２１１０３－０４９）、基本培地、４８％
ペニシリン－ストレプトマイシン－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、１０３７８０１６）、基本栄養補助剤、１％
ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ、１１１４００５０）、基本栄養補助剤、１％
ピルビン酸ナトリウム（ｇｉｂｃｏ、１１３６００７０）、基本栄養補助剤、１％
２－メルカプトエタノール（Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｉｇｍａ）、基本栄養補助剤、１１０μＭ
Ｎ２（Ｔｈｅｒｍｏ１７５０２０４８）、０．１～１％、０．２５～０．７５％、０．４～０．６％の範囲
Ｂ２７（Ｔｈｅｒｍｏ１７５０４０４４）、０．１～２％、０．５～１．５％、０．８～１．０％の範囲
ＩＴＳ－Ｘ（ｔｈｅｒｍｏｓ、５１５０００５６）、０．１～１％、０．２５～０．７５％、０．４～０．６％の範囲
ビタミンＣ（Ｓｉｇｍａ、４９７５２－１００Ｇ）、１０～１００μｇ／ｍｌ、２０～１００μｇ／ｍｌ、５０～７０μｇ／ｍｌの範囲
ウシアルブミンフラクションＶ（７．５％溶液）（Ｔｈｅｒｍｏ、１５２６００３７）、０．１％～１％、０．２～０．８％、０．４～０．６％の範囲
微量元素Ｂ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＭＴ９９１７５ＣＩ）基本栄養補助剤、０．１％
微量元素Ｃ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＭＴ９９１７６ＣＩ）基本栄養補助剤、０．１％
還元型グルタチオン（ｓｉｇｍａ、Ｇ６０１３－５Ｇ）、１～２０μｇ／ｍｌ、１～１０μｇ／ｍｌ、２～５μｇ／ｍｌの範囲
規定された脂質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１１９０５０３１）基本栄養補助剤、０．２％
ＸＡＶ９３９（ＳｉｇｍａＸ３００４）、１～１０μＭ、２～５μＭ、２．５～４．５μＭの範囲
エンド－ＩＷＲ－１（Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号３５３２）、１～１０μＭ、２～５μＭ、２．５～４．５μＭの範囲
Ａ４１９２５９（ＴｏｃｒｉｓＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、３７４８）、０．０５～０．５μＭ、０．１～０．５μＭ、０．１５～０．３μＭの範囲
カイロン９９０２１（ＴｏｃｒｉｓＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、４４２３）、０．２～２μＭ、０．５～１．５μＭ、０．８～１．２μＭの範囲
ヒトＬｉｆ（ＳｔｅｍＣｅｌｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣａｍｂｒｉｄｇｅ．ＳＣＩ）、１～２０ｎｇ／ｍｌ、５～１５ｎｇ／ｍｌ、８～１２ｎｇ／ｍｌの範囲
を含む。

一実施形態では、ブタＥＰＳＣ培地は、
Ｆ１２ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、２１３３１－０２０）、基本培地、４８％
神経基本培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、２１１０３－０４９）、基本培地、４８％
ペニシリン－ストレプトマイシン－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、１０３７８０１６）、基本栄養補助剤、１％
ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ、１１１４００５０）、基本栄養補助剤、１％
ピルビン酸ナトリウム（ｇｉｂｃｏ、１１３６００７０）、基本栄養補助剤、１％
２－メルカプトエタノール（Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｉｇｍａ）、基本栄養補助剤、１１０μＭ
Ｎ２（Ｔｈｅｒｍｏ１７５０２０４８）、０．１～１％、０．２５～０．７５％、０．４～０．６％の範囲
Ｂ２７（Ｔｈｅｒｍｏ１７５０４０４４）、０．１～２％、０．５～１．５％、０．８～１．０％の範囲
ＩＴＳ－Ｘ（ｔｈｅｒｍｏｓ、５１５０００５６）、０．１～１％、０．２５～０．７５％、０．４～０．６％の範囲
ビタミンＣ（Ｓｉｇｍａ、４９７５２－１００Ｇ）、１０～１００μｇ／ｍｌ、２０～１００μｇ／ｍｌ、５０～７０μｇ／ｍｌの範囲
ウシアルブミンフラクションＶ（７．５％溶液）（Ｔｈｅｒｍｏ、１５２６００３７）、０．１％～１％、０．２～０．８％、０．４～０．６％の範囲
微量元素Ｂ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＭＴ９９１７５ＣＩ）基本栄養補助剤、０．１％
微量元素Ｃ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＭＴ９９１７６ＣＩ）基本栄養補助剤、０．１％
還元型グルタチオン（ｓｉｇｍａ、Ｇ６０１３－５Ｇ）、１～２０μｇ／ｍｌ、１～１０μｇ／ｍｌ、２～５μｇ／ｍｌの範囲
ＸＡＶ９３９（ＳｉｇｍａＸ３００４）、１～１０μＭ、２～５μＭ、２．５～４．５μＭの範囲
エンド－ＩＷＲ－１（Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号３５３２）、１～１０μＭ、１～５μＭ、１～２μＭの範囲
ＷＨ－４－０２３（Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号５４１３）、０．１～１．０μＭ、０．１～０．５μＭ、０．１～０．２μＭの範囲
カイロン９９０２１（ＴｏｃｒｉｓＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、４４２３）、０．０５～０．５μＭ、０．１～０．５μＭ、０．２～０．３μＭの範囲
ヒトＬｉｆ（ＳｔｅｍＣｅｌｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣａｍｂｒｉｄｇｅ．ＳＣＩ）、１～２０ｎｇ／ｍｌ、５～１５ｎｇ／ｍｌ、８～１２ｎｇ／ｍｌの範囲
アクチビンＡ（ＳＴＥＭＣＥＬＬＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、カタログ番号７８００１．１）、１０～５０ｎｇ／ｍｌ、１５～３０ｎｇ／ｍｌ、２０～２５ｎｇ／ｍｌの範囲
を含む。

一実施形態では、ブタＥＰＳＣ培地５００ｍｌは、
ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２１３３１－０２０）４８２．５ｍｌ、
Ｎ２栄養補助剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１７５０２０４８）２．５ｍｌ、
Ｂ２７栄養補助剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１７５０４０４４）５ｍｌ、
１×グルタミンペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１１４０－０５０）５ｍｌ、
１×ＮＥＡＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１０３７８－０１６）５ｍｌ、
１１０μＭ２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ６２５０）、
０．２μＭＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ３ｉ、ＴＯＣＲＩＳ、カタログ番号４４２３）、
０．３μＭＷＨ－４－０２３（ＳＲＣインヒビター、ＴＯＣＲＩＳ、カタログ番号５４１３）、
２．５μＭＸＡＶ９３９（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｘ３００４）または２．０μＭＩＷＲ－１（ＴＯＣＲＩＳ、カタログ番号３５３２）、
５０μｇ／ｍｌビタミンＣ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号４９７５２－１００Ｇ）、
１０ｎｇ／ｍｌＬＩＦ（ＳｔｅｍＣｅｌｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣａｍｂｒｉｄｇｅ．ＳＣＩ）、
２０ｎｇ／ｍｌアクチビン（ＳＣＩ）、
ＩＴＳ－Ｘ２００×（ｔｈｅｒｍｏｓ、５１５０００５６）１ｍｌ、および
０．３％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０２７０）
を含む。

別の実施形態では、ヒトＥＰＳＣ培地５００ｍｌは、
ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２１３３１－０２０）４８２．５ｍｌ、
Ｎ２栄養補助剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１７５０２０４８）２．５ｍｌ、
Ｂ２７栄養補助剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１７５０４０４４）５ｍｌ、
１×グルタミンペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１１４０－０５０）５ｍｌ、
１×ＮＥＡＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１０３７８－０１６）５ｍｌ、
１１０μＭ２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ６２５０）、
１．０μＭＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ３インヒビター、ＴＯＣＲＩＳ、カタログ番号４４２３）、
０．１μＭＡ－４１９２５９（ＳＲＣインヒビター、ＴＯＣＲＩＳ、カタログ番号３９１４）、
２．５μＭＸＡＶ９３９（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｘ３００４）または２．５μＭＩＷＲ－１（ＴＯＣＲＩＳ、カタログ番号３５３２）、
５０μｇ／ｍｌビタミンＣ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号４９７５２－１００Ｇ）、および
１０ｎｇ／ｍｌＬＩＦ（ＳＣＩ）
を含む。

別の実施形態では、ヒトＥＰＳＣ培地５００ｍｌは、
Ｆ１２ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、２１３３１－０２０）、２４０ｍｌ添加、
神経基本培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，２１１０３－０４９）２４０ｍｌ、
ペニシリン－ストレプトマイシン－グルタミン（１００×）（Ｇｉｂｃｏ、１０３７８０１６）、５ｍｌ添加、
１００×ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ、１１１４００５０）、５ｍｌ添加、
１００×ピルビン酸ナトリウム（ｇｉｂｃｏ、１１３６００７０）、５ｍｌ添加、
１４．３Ｍ２－メルカプトエタノール（Ｍ６２５０Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｉｇｍａ）、３．８μｌ添加（作用濃度１１０μＭ）、
２００×Ｎ２（Ｔｈｅｒｍｏ１７５０２０４８）、２．５ｍｌ添加、
１００×Ｂ２７（Ｔｈｅｒｍｏ１７５０４０４４）、５ｍｌ添加、
ＩＴＳ－Ｘ２００×（ｔｈｅｒｍｏｓ、５１５０００５６）、２．５ｍｌ添加、
ビタミンＣ（Ｓｉｇｍａ、４９７５２－１００Ｇ）、作用濃度６４μｇ／ｍｌ、
ウシアルブミンフラクションＶ（７．５％溶液）（Ｔｈｅｒｍｏ、１５２６００３７）、３ｍｌ、
１０００×微量元素Ｂ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＭＴ９９１７５ＣＩ）
１０００×微量元素Ｃ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＭＴ９９１７６ＣＩ）
１０ｍｇ／ｍｌ還元型グルタチオン（ｓｉｇｍａ、Ｇ６０１３－５Ｇ）、１６５μｌ添加、
５００×規定された脂質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１９０５０３１）
ＸＡＶ９３９（ＳｉｇｍａＸ３００４）、作用濃度２．５μＭ、
エンド－ＩＷＲ－１（Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号３５３２）、作用濃度２．５μＭ、
Ａ４１９２５９（ＴｏｃｒｉｓＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、３７４８）、作用濃度０．１μＭ、
カイロン９９０２１（ＴｏｃｒｉｓＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、４４２３）、作用濃度１．０μＭ、および
ヒトＬｉｆ、作用濃度１０ｎｇ／ｍｌ
を含む。

一実施形態では、ブタＥＰＳＣ培地５００ｍｌは、
Ｆ１２ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、２１３３１－０２０）、２４０ｍｌ添加、
神経基本培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、２１１０３－０４９）２４０ｍｌ、
ペニシリン－ストレプトマイシン－グルタミン（１００×）（Ｇｉｂｃｏ、１０３７８０１６）、５ｍｌ添加、
１００×ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ、１１１４００５０）、５ｍｌ添加、
１００×ピルビン酸ナトリウム（ｇｉｂｃｏ、１１３６００７０）、５ｍｌ添加、
１４．３Ｍ２－メルカプトエタノール（Ｍ６２５０Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｉｇｍａ）、３．８μｌ添加（作用濃度１１０μＭ）、
２００×Ｎ２（Ｔｈｅｒｍｏ１７５０２０４８）、２．５ｍｌ添加、
１００×Ｂ２７（Ｔｈｅｒｍｏ１７５０４０４４）、５ｍｌ添加、
ＩＴＳ－Ｘ２００×（ｔｈｅｒｍｏｓ、５１５０００５６）、２．５ｍｌ添加、
ビタミンＣ（Ｓｉｇｍａ、４９７５２－１００Ｇ）、作用濃度６４μｇ／ｍｌ、
ウシアルブミンフラクションＶ（７．５％溶液）（Ｔｈｅｒｍｏ、１５２６００３７）、３ｍｌ、
１０００×微量元素Ｂ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＭＴ９９１７５ＣＩ）
１０００×微量元素Ｃ、（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＭＴ９９１７６ＣＩ）
１０ｍｇ／ｍｌ還元型グルタチオン（ｓｉｇｍａ、Ｇ６０１３－５Ｇ）、１６５μｌ添加、
ＸＡＶ９３９（ＳｉｇｍａＸ３００４）、作用濃度２．５μＭ、
エンド－ＩＷＲ－１（Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号３５３２）、作用濃度１μＭ、
ＷＨ－４－０２３（Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号５４１３）、作用濃度０．１６μＭ、
カイロン９９０２１（ＴｏｃｒｉｓＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、４４２３）、作用濃度０．２μＭ、
ヒトＬｉｆ、作用濃度１０ｎｇ／ｍｌ、および
２０ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（ＳＴＥＭＣＥＬＬＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、カタログ番号７８００１．１）を含む。適当な化学的に規定された基本培地は、上で記載され、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ハム’ｓＦ１２、アドバンスドダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）（Price et al Focus (2003), 25 3-6), RPMI-1640(Moore, G. E.およびWoods L. K., (1976) Tissue Culture Association Manual. 3, 503-508）を含む。好ましい化学的に規定された基本培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２である。

基本培地は、血清を含有する、もしくは血清を含有しない培地栄養補助剤および／または追加の成分を添加されてもよい。適当な栄養補助剤および追加の成分は、上で記載され、Ｌ－グルタミンまたはＧｌｕｔａＭＡＸ－１（商標）などの代替物、化学的に規定された脂質、アルブミン、１－チオールグリセロール、ポリビニルアルコール、インスリン、ビタミンＣなどのビタミン、ペニシリンおよび／またはストレプトマイシンなどの抗生物質ならびにトランスフェリンを含んでもよい。

インヒビターまたはモジュレーターのそれぞれは、ＥＰＳＣＭに、０．１μＭ～１５０μＭの範囲にある量まで加えられてもよく、ある特定の実施形態では、０．１μＭ、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、０．６μＭ、０．７μＭ、０．８μＭ、０．９μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、５．５μＭ、６μＭ、６．５μＭ、７μＭ、７．５μＭ、８μＭ、８．５μＭ、９μＭ、９．５μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１７μＭ、１８μＭ、１９μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、１００μＭ、１１０μＭ、１２０μＭ、１３０μＭ、１４０μＭ、または１５０μＭの量で加えられてもよい。

インヒビターまたはモジュレーターのそれぞれは、ＥＰＳＣＭに、０．０５μＭ～０．１μＭ、０．１μＭ～１μＭ、１μＭ～２μＭ、２μＭ～３μＭ、３μＭ～４μＭ、４μＭ～５μＭ、５μＭ～６μＭ、６μＭ～７μＭ、７μＭ～８μＭ、８μＭ～９μＭ、９μＭ～１０μＭ、１０μＭ～１５μＭ、１５μＭ～２０μＭ、２０μＭ～３０μＭ、３０μＭ～４０μＭ、４０μＭ～５０μＭ、５０μＭ～６０μＭ、６０μＭ～７０μＭ、７０μＭ～８０μＭ、８０μＭ～９０μＭ、９０μＭ～１００μＭ、１００μＭ～１１０μＭ、１１０μＭ～１２０μＭ、１２０μＭ～１３０μＭ、１３０μＭ～１４０μＭ、１４０μＭ～１５０μＭ、または１５０μＭ～１６０μＭの範囲にある量まで加えられてもよい。

適当なインヒビターまたはモジュレーターは、天然および合成小分子インヒビターまたは抗体を含む。適当なＭｅｋ－ＥＲＫ、ＪＮＫ、ｐ３８、Ｓｒｃ、ＧＳＫ３およびＷｎｔ経路インヒビターは、当該技術分野において公知であり、市販されている。Ｍｅｋ－ＥＲＫ経路は、細胞表面の受容体からのシグナルを細胞の核内のＤＮＡに伝達する、細胞におけるタンパク質の連鎖である。この経路における主要なタンパク質は、ＭＥＫおよびＥＲＫである。これらのタンパク質の阻害は、この経路におけるシグナル伝達を中断する。従って、インヒビターは、この経路におけるシグナル伝達が中断されるように、ＭＥＫまたはＥＲＫを直接または間接的に阻害し得る。例えば、インヒビターは、ＭＥＫインヒビターまたはＥＲＫインヒビターであってもよい。

適当なＪｕｎ－Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）インヒビターは、www.scbt.comのＪＮＫインヒビターＶＩＩＩ（カタログ番号ｓｃ－２０２６７３）、ＲＷＪ６７６５７（カタログ番号ｓｃ－２０４２５１）、抗生物質ＬＬＺ１６４０－２（カタログ番号ｓｃ－２０２０５５）、ＳＸ０１１（ｓｃ－３５８８４１）、ベンタマピモド（ｓｃ－３９４３１２）、ＡＥＧ３４８２（ｓｃ－２０２９１１）、またはwww.invivogen.comのＳＰ６００１２５ＪＮＫインヒビターを含む。一実施形態では、ＪＮＫインヒビターは、ＳＰ６００１２５である。

適当なｐ３８インヒビターは、www.invivogen.comから入手可能なｐ３８ＭＡＰＫのａとＲアイソフォームの両方を阻害するｓＢ２０３５８０、www.scbt.comから入手可能なｐ３８ＭＡＰキナーゼインヒビターＩＶ（カタログ番号ｓｃ－２０４１５９）、ＬＹ２２２８８２０（カタログ番号ｓｃ－３６４５２５）、ＰＨ－７９７８０４（カタログ番号ｓｃ－３６４５７９）、ｐ３８ＭＡＰキナーゼインヒビター（カタログ番号ｓｃ－２０４１５７）、ＳＸ０１１（ｓｃ－３５８８４１）および２－（４－クロロフェニル）－４－（フルオロフェニル）－５－ピリジン－４－イル－１，２－ジヒドロピラゾール－３－オン（ｓｃ－２２０６６５）を含む。一実施形態では、ｐ３８インヒビターは、ｓＢ２０３５８０である。

Ｓｒｃファミリーキナーゼ（ＳＦＫ）は、９つの高度に関連するメンバーを含む非受容体チロシンキナーゼのファミリーである。複数のｓｒｃファミリーメンバーを阻害する広範なスペクトルＳｒｃキナーゼファミリーインヒビターが利用可能であり、当該技術分野において公知である。適当なＳｒｃキナーゼファミリーインヒビターは、後半なスペクトルＳｒｃファミリーキナーゼインヒビターであるＡ－４１９２５９（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）を含む。他の適当なＳＲＫインヒビターは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（www.sigmaaldrich.com）から入手可能でもあるＰＰ１、ＰＰ２およびＣＧＰ７７６７５、ならびにＴｏｃｈｒｉｓＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（www.tochris.com）から入手可能なＡ４１９２５９トリヒドロクロリドまたはＫＢＳＲＣ４を含む。一実施形態では、Ｓｒｃキナーゼファミリーインヒビターは、ＷＨ－４－０２３またはＡ－４１９２５９である。

適当なＧＳＫ３インヒビターは、ＴｏｃｒｉｓＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能な選択的かつ強力なＧＳＫ３インヒビターであるＣＨＩＲ９９０２１（カタログ４４２３）、またはＴｏｃｒｉｓＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（www.tochris.com）から入手可能でもあるＢＩＯ（カタログ３１９４）、Ａ１０７０７２２（カタログ４４３１）、３Ｆ８（カタログ４０８３）、ＡＲ－Ａ０１４４１８（カタログ３９６６）、Ｌ８０３－ｍｔｓ（カタログ２２５６）およびＳＢ２１６７６３（カタログ１６１６）を含む。他の適当なＧＳＫインヒビターは、ＧＳＫ－３インヒビターＩＸ（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｓｃ－２０２６３４から入手可能）を含む。一実施形態では、ＧＳＫ－３インヒビターは、ＣＨＩＲ９９０２１である。

加えて、Ｗｎｔインヒビターは、現在開示される組成物に加えられてもよい。Ｗｎｔインヒビターは、Ｗｎｔ／１３－カテニンシグナル伝達経路のアンタゴニストである。

Ｗｎｔ／１３－カテニンシグナル伝達経路は、細胞質におけるβ－カテニンの蓄積および核へのその最終的な移行を引き起こす、Ｗｎｔ経路である。ｗｎｔシグナル伝達の非存在下で、β－カテニンは、タンパク質アキシン、大腸腺腫症（ＡＰＣ）、タンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ３）およびカゼインキナーゼＩｎ（ＣＫ１α）を含む破壊複合体により分解される。

ｗｎｔインヒビターは、タンキラーゼインヒビターであってもよい。タンキラーゼ阻害は、アキシンユビキチン化を阻害し、アキシンタンパク質を安定化し（Huang et al 2009）、それ故、ｗｎｔシグナル伝達を阻害する。

適当なタンキラーゼインヒビターは、ＸＡＶ９３９（www.sigmaaldrich.com）である。追加の公開されたタンキラーゼインヒビターは、ＷＩＫＩ４、ＴＣ－Ｅ５００１およびＪＷ５５を含み、全て、Ｔｏｃｒｉｓ（www.tocris.com）から市販されている。

有効量のインヒビターは、現在開示される組成物に加えられてもよい。有効量は、経路における、または標的化されるタンパク質により、シグナル伝達を阻害するのに十分な量である。

拡大ポテンシャル幹細胞培地（ＥＰＳＯＭ）は、化学的に規定された培地（ＣＤＭ）であってもよい。

化学的に規定された培地（ＣＤＭ）は、特定の成分、ある特定の実施形態では、公知の化学構造の成分のみを含有する細胞を培養するための栄養溶液である。それ故、ＣＤＭは、フィーダー、間質細胞、血清、マトリゲル、血清アルブミンおよび複合細胞外マトリックスなどの規定されていない成分を含む、規定されていない成分または構成物を欠く。アドバンスドダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはＤＭＥＭ／Ｆ１２（Price et al Focus (2003) 25 3-6）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）およびＲＰＭＩ－１６４０（Moore, G. E. and Woods L. K., (1976) Tissue Culture Association Manual. 3, 503-508；表１を参照のこと）、ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）などの適当な化学的に規定された基本培地は、当該技術分野において公知であり、市販の供給源から入手可能である（例えば、Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈＭＩＵＳＡ；ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＵＳＡ）。

一実施形態では、基本培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２である。基本培地は、市販されているＢＳＡまたはノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）である、ＡｌｂｕＭＡＸＩＩを含むか、または添加されていてもよい。基本培地はまた、全てが市販されている（例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから）、Ｎ２、Ｂ２７、Ｌ－グルタミン、抗生物質（ある特定の実施形態では、ペニシリンおよびストレプトマイシン）；非必須アミノ酸；ビタミン（ある特定の実施形態では、ビタミンＣ）ならびにイーグル基本培地（ｂＭＥ）のいずれか、または全てを添加されてもよい。他の適当な栄養補助剤は、当該技術分野において公知であり、本明細書において記載される。

ある特定の実施形態では、以下の添加物が、以下で記載される組成物に存在してもよい。

グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのペニシリン－グルタミン－ストレプトマイシン混合物（カタログ番号１１１４０－０５０）として市販されている。

ＥＰＳＣＭの例は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地を含み、ＡｌｂｕＭＡＸＩＩまたはノックアウト血清代替物、ならびに本明細書に記載されるインヒビターおよびモジュレーターが添加される。ＥＰＳＣＭはまた、ヒトインスリン；Ｎ２、Ｂ２７；グルタミン－ペニシリン－ストレプトマイシン；非必須アミノ酸；ビタミンＣおよびイーグル基本培地（ｂＭＥ）、ならびにＬＩＦのいずれかを含んでもよい。

一部の実施形態では、ＥＰＳＣの集団は、多能性幹細胞の集団を、ＥＰＳＣＭにおいて１つまたは複数（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上）の繰り返し「継代」の間培養して、ＥＰＳＣの子孫集団を生成する。継代はまた、サブ培養として言及されてもよく、細胞の、先の培養液から新鮮な成長培地への移行である。培養液中の細胞は、誘導期、対数期および静止期の特徴的成長パターンが続く。これらの期のタイミングは、使用される細胞（例えば、哺乳類細胞対非哺乳類細胞）に依存して変動し得る。細胞成長の期を決定する方法は、当該技術分野において周知である。一般的に、細胞は、対数期に継代される。一部の実施形態では、多能性幹細胞を、ＥＰＳＣＭにおいて１～１０回、３～１０回、３～５回継代（すなわち、サブ培養）して、ＥＰＳＣの集団を生成してもよい。一実施形態では、集団を、少なくとも３回継代して、ＥＰＳＣの集団を生成する。

本明細書において記載されるＥＰＳＣＭは、販売用のキットに配合されてもよい。

キットにおける１つまたは複数の培養液は、脱イオン蒸留水に配合されてもよい。１つまたは複数培地を、典型的には、例えば、紫外線、加熱、照射または濾過により、使用前に滅菌して、汚染を防ぐ。１つまたは複数の培地は、保存または輸送のため凍結（例えば、－２０℃または－８０℃で）されてもよい。１つまたは複数の培地は、汚染を防ぐための１つまたは複数の抗生物質を含有してもよい。

１つまたは複数の培地は、１×配合またはそれ以上の濃縮された配合、例えば、２×～２５０×濃縮培地配合であってもよい。１×配合において、培地中のそれぞれの成分は、細胞培養のため意図される濃度、例えば、上で説明された濃度である。濃縮配合において、成分の１つまたは複数は、細胞培養のため意図されるより高い濃度で存在する。塩沈殿または選択的濾過などの、濃縮培養液が、当該技術分野において周知である。濃縮培地は、使用のため、水（ある特定の実施形態では、脱イオンおよび蒸留されている）または任意の適当な溶液、例えば、生理食塩水溶液、水性バッファーまたは培地で希釈されてもよい。

キットにおける１つまたは複数の培地は、汚染を防ぐ、気密的に密封された容器に含有されてもよい。気密的に密封された容器は、培養液の輸送または保存に好ましい。容器は、フラスコ、プレート、ボトル、ジャー、バイアルまたはバッグなどの任意の適当な容器であってもよい。

キットはまた、使用について、例えば、ＥＰＳＣを得るためのＥＰＳＣＭの使用についての指示書を含んでもよい。

５．３ＰＦＦリプログラミング
１６の初代コロニーから１１の安定なｐＥＰＳＣ^ｉＰＳ株を生成した（７０％効率）、初代コロニーをｐＥＰＳＣＭにおいて直接培養することによる繰り返しＰＦＦリプログラミング実験が本明細書において提供される（拡張データ図３ｅ）。すべての株は、高レベルの内因性多能性遺伝子を発現し、その６つが、８つの外因性リプログラミングファクターのいずれかの検出可能な発現を有さなかった（拡張データ図３ｆ）。このｐＥＰＳＣＭ条件を続いて利用して、ブタ着床前の胚から直接、幹細胞株をもたらす。計２６株（ｐＥＰＳＣ^Ｅｍｂ、オス１４匹およびメス１２匹）を、２５２の単為生殖胚盤胞由来の７６の早期胚盤胞（５．０ｄｐｃ）、および１２の細胞株（ｐＥＰＳＣ^ｐａｒ）から確立した（図１ａ、表１および拡張データ図３ｇ）。ｐＥＰＳＣ^ｉＰＳと同様に、ｐＥＰＳＣ^Ｅｍｂは、高い核／細胞質比を有し、滑らかなコロニー端を有する小型のコロニーを形成した（図１ａ、拡張データ図３ｈ）。ｐＥＰＳＣ^Ｅｍｂは、３～４日毎に１：１０の比で単一細胞として継代され、明確な分化なしに、ＳＴＯフィーダー上で＞４０継代の間維持することができた。サブクローニング効率は、低い細胞密度（６ウェルプレートにおいて１ウェル当たり２，０００個の細胞）で約１０％であったが、高い細胞密度が、慣習的な継代で使用された。ｐＥＰＳＣ^Ｅｍｂは、２５継代後、正常な核型であった（拡張データ図４ａ）。

ｐＥＰＳＣ^ＥｍｂおよびｐＥＰＳＣ^ｉＰＳは、胚盤胞に匹敵するレベルで多能性遺伝子を発現し（拡張データ図３ｆ）、これは、免疫染色により証明された（拡張データ図４ｂ）。ｐＥＰＳＣが、７つの従前に報告されたブタＥＳＣ培地［９～１５］の１つで培養されたとき、多能性遺伝子発現は、大幅に低減されるか、または失われた（拡張データ図４ｃ～ｅ）。ｐＥＰＳＣは、ＯＣＴ４およびＮＡＮＯＧプロモーター領域で広範なＤＮＡ脱メチル化を示し（図１ｂ）、ＯＣＴ４遠位性エンハンサー活性を有した（拡張データ図４ｆ）。ＥＰＳＣには、Ｈ２Ｂ－ｍＣｈｅｒｒｙ発現カセットのＲＯＳＡ２６座位へのＣｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９介在性挿入を適用可能だった（拡張データ図４ｇおよび４ｈ）。インビトロで、ｐＥＰＳＣは、３つの胚葉：ＳＯＸ７、ＡＦＰ、Ｔ、ＤＥＳ、ＣＲＡＢＰ２、ＳＭＡ、β－チューブリンおよびＰＡＸ６ならびに、独特に、栄養膜遺伝子ＨＡＮＤ１、ＧＡＴＡ３、ＰＧＦ、ＫＲＴ７、ＥＬＦ４、ＫＲＴ８、ＩＴＧＢ４、ＴＥＡＤ３、ＴＥＡＤ４、ＳＤＣ１およびＰＬＥＴ１のうち代表的な遺伝子を発現する組織に分化した（図１ｃ、拡張データ図４ｉ）。免疫不全マウスにおいて、ｐＥＰＳＣ^Ｅｍｂは、胎盤ラクトゲン－１（ＰＬ１）、ＫＲＴ７－およびＳＤＣ１－陽性栄養膜様細胞さえ含む、３つの胚葉の派生物を有する成熟テラトーマを形成した（図１ｄ～１ｅおよび拡張図４ｊ）。これらの結果は、ｐＥＰＳＣ^ＥｍｂおよびｐＥＰＳＣ^ｉＰＳが、ｍＥＰＳＣ［１］同様、胚細胞系統と胚体外栄養膜系統の両方についての拡大した発生ポテンシャルを有し得ることを示す。ｐＥＰＳＣは、キメラにおける胚盤胞細胞系統へのそれらの寄与について試験された。ｐＥＰＳＣの着床前の胚への取り込み後、かつ４８時間の培養後、ｐＥＰＳＣ（ＥＦ１ａ－Ｈ２Ｂ－ｍＣｈｅｒｒｙによりマーキングされた）は、胚盤胞の栄養外胚葉と内部細胞塊の両方に定着した（拡張データ図５ａ）。キメラ胚の同調されたレシピエントのメスのブタへの移植後、計４５の受胎産物が、妊娠期の２６～２８日目に３リットルから回収された（補足表２、拡張データ図５ｂ）。キメラの胚および胚体外組織から分離した細胞のフローサイトメトリーにより、７つの受胎産物におけるｍＣｈｅｒｒｙ^＋細胞の存在（拡張データ図５ｃ、補足表３および表４）：キメラ２匹（８番および１６番）における胎盤と胚組織の両方におけるｍＣｈｅｒｒｙ^＋細胞の存在；キメラ３匹（４番、２１番および３４番）における胚組織のみにおけるｍＣｈｅｒｒｙ^＋細胞の存在；ならびにキメラ２匹（３番および６番）の胎盤における排他的なｍＣｈｅｒｒｙ^＋細胞の存在が明らかになった。ゲノムＤＮＡＰＣＲアッセイは、これらのｍＣｈｅｒｒｙ^＋キメラ７匹ばかりでなく、任意の他の受胎産物においてｍＣｈｅｒｒｙＤＮＡを検出した（拡張データ図５ｄ、補足表３および４）。ドナーｍＣｈｅｒｒｙ^＋細胞由来の全体的に低い寄与にも関わらず、これらは、複数の宿主胚組織および以下の組織系統マーカー：ＳＯＸ２、ＴＵＪ１、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、ＡＦＰ、α－ＳＭＡ、ＰＬ－１およびＫＲＴ７により同定された器官において見出された（図１ｆ～ｇおよび拡張データ図５ｅ～ｆ）。

５．４ＰＧＣ試験
ｐＥＰＳＣは、これらが、マウスおよびヒト多能性幹細胞と同様、インビトロでＰＧＣ様細胞（ＰＧＣＬＣ）を生成するポテンシャルを有するかどうかを見るために試験される［２５～２７］。早期の原条（ＰＳ）期のブタ胚（Ｅ１１．５～Ｅ１２）において、ブタＰＧＣの第一のクラスターは、発生期の原条の後期の終わりにＳＯＸ１７^＋細胞として検出することができ、これらの細胞は、後に、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＢＬＩＭＰ１およびＴＦＡＰ２Ｃを共発現する［２６］。ＮＡＮＯＳ３は、進化的に保存されたＰＧＣ特異的ファクターであり［２８、２９］、ヒトＮＡＮＯＳ３レポーター細胞は、ＰＧＣＬＣの多能性幹細胞からの誘導を研究するために使用された［２６、２７］。推定ブタＰＧＣＬＣの同定を促進するために、Ｈ２ＢｍＣｈｅｒｒｙレポーターカセットは、ｐＥＰＳＣ^Ｅｍｂ（Ｋ３系統、オス）におけるＮＡＮＯＳ３座位の３’ＵＴＲに標的化される（拡張データ図６ａ）。ＳＯＸ１７導入遺伝子を一過性に１２時間発現させた後、ＮＡＮＯＳ３レポーターを有するｐＥＰＳＣ^Ｅｍｂに、胚様体（ＥＢ）を形成させ（拡張データ図６ｂ）、これは、３～４日以内にＮＡＮＯＳ３（ｍＣｈｅｒｒｙ^＋）および組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＰ、ＰＧＣマーカー）を共発現する細胞クラスターを含有した（図２ａ）。

ＢＭＰ２のＥＢ培養物からの除去またはインヒビターＬＤＮ－１９３１８９によるＢＭＰ２／４シグナル伝達の阻害は、ｍＣｈｅｒｒｙ^＋／ＴＮＡＰ^＋細胞クラスターの形成を抑止したので、推定ブタＰＧＣＬＣの誘導は、ＢＭＰ２／４依存性であった（図２ａ）。個々または組み合わせのいずれかでの、ｐＥＰＳＣにおけるＮＡＮＯＧ、ＢＬＩＭＰ１またはＴＦＡＰ２Ｃ導入遺伝子の発現は、ＮＡＮＯＳ３^＋細胞の優勢に対する効果を有さず（拡張データ図６ｃ）、これは、ヒトＰＧＣＬＣの報告された誘導と異なった［２６］。しかしながら、ＳＯＸ１７の、ＮＡＮＯＧまたはＴＦＡＰ２Ｃではなく、ＢＬＩＭＰ１との共発現は、ＮＡＮＯＳ３^＋細胞の集団を増加させると思われる（拡張データ図６ｃおよび６ｃ）。

ＥＢ内でのｍＣｈｅｒｒｙ^＋（ＮＡＮＯＳ３^＋）推定ＰＧＣＬＣは、ＰＧＣ特異的遺伝子ＮＡＮＯＳ３、ＢＬＩＭＰ１、ＴＦＡＰ２Ｃ、ＣＤ３８、ＤＮＤ１、ＫＩＴおよびＯＣＴ４を発現し［３３］、これらは、ＲＴ－ｑＰＣＲにおいて検出され、単一細胞分析での免疫蛍光により確認された（図２ｂ～ｃ、および拡張データ図６ｅ）。ｍＣｈｅｒｒｙ^＋／ＮＡＮＯＳ３^＋細胞の特異的ＲＮＡ－ｓｅｑ解析により、早期ＰＧＣ遺伝子（ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８Ａ、ＴＦＡＰ２Ｃ、ＣＤ３８、ＤＮＤ１、ＮＡＮＯＳ３、ＩＴＧＢ３、ＳＯＸ１５およびＫＩＴ）の発現、ならびに低減したＳＯＸ２発現が明らかになった（図２ｄ～ｅ、補足表５）［２７］。ヒトＥＳＣからのＰＧＣＬＣ誘導中、細胞では、ＴＥＴのアップレギュレーションおよびＤＮＭＴ３Ａ／Ｂのダウンレギュレーションにより成し遂げられる、網羅的ＤＮＡ脱メチル化が起きる［２７］。同様に、親ｐＥＰＳＣ^Ｅｍｂと比較して、ＤＮＭＴ３Ｂは、ブタｍＣｈｅｒｒｙ^＋／ＮＡＮＯＳ３^＋細胞においてダウンレギュレーションされ、一方、ＴＥＴ１／２は、アップレギュレーションされた（図２ｅ～ｆ、補足表５）。

５．５ヒトＥＳ細胞のインビトロ培養
ヒトＥＳＣは、インビトロでのヒト胚発生の研究において広く使用され、再生医学の多大なポテンシャルを保持する［３６～３７］。ＳＲＣおよびタンキラーゼの阻害が、マウスＥＳＣをｍＥＰＳＣに変換するのに十分であるという知見［１］およびこれらの２つのインヒビターが、ｐＥＰＳＣの生成に必要とされるという知見から、同様のインビトロでの培養条件がまた、他の哺乳類種のため働き得る可能性がある。この可能性を探求するために、４つの確立したヒトＥＳ細胞（ｈＥＳＣ）株（Ｈ１、Ｈ９、Ｍａｎ１またはＭ１、およびＭａｎ１０またはＭ１０細胞）［３０～３２］が、ｐＥＰＳＣＭにおいて培養され、これらは、最大３回継代された。細胞は、ＯＣＴ４の多様な形態および異種性発現を呈した（拡張データ図７ａ）。アクチビンＡ（２０ｎｇ／ｍｌ）のｐＥＰＳＣＭからの除去は、Ｈ１（＜１．０％）およびＭ１（５．０％）ＥＳＣ培養物から形成された、かなり少ない細胞コロニーを導き、一方、Ｈ９またはＭ１０からは細胞コロニーは導かれず（拡張データ図７ａ）、これは、ヒトＥＳＣの固有の株間不均一性と一致する［３３、３４］。培養条件をさらに緻密化し（例えば、ｈＥＰＳＣＭにおいてＷＨ－４－０２３を別のＳＲＣインヒビターＡ４１９２５９で置き換えること、方法を参照のこと）、形態学的に均質で安定な細胞株が、単一細胞サブクローニングされたＨ１（Ｈ１－ＥＰＳＣ）およびＭ１細胞（Ｍ１－ＥＰＳＣ）から確立された（図３ａ）。ＳＴＯフィーダー上でｈＥＰＳＣＭにおいて成長させたＨ１およびＭ１細胞の核型解析により、遺伝子安定性が明らかになった（親ｈＥＳＣからの転換後２５継代にて、拡張データ図７ｂ）。

皮膚線維芽細胞からリプログラミングされたヒト初代ｉＰＳＣコロニーが、ｈＥＰＳＣＭにおいて直接培養されたとき、拾い上げたコロニーのおよそ７０％は、安定なｉＰＳＣ株（ｉＰＳＣ－ＥＰＳＣ）として確立することができた（拡張データ図７ｃ）。これらのｉＰＳＣは、外因性リプログラミングファクターの明らかなリーキーさを有さない多能性マーカーを発現した（拡張データ図７ｄ～ｅ）。Ｈ１－ＥＰＳＣは、標準的ＦＧＦ含有培地（Ｈ１－ＥＳＣ、プライム型）において、またはナイーブ型５ｉ／Ｌ／Ａ条件下（Ｈ１－ナイーブ型ＥＳＣ）で培養されたＨ１ＥＳＣより強く増殖し［２２］（拡張データ図７ｆ）、ＲＯＣＫｉの一過性存在において、約１０％の単一細胞サブクローニング効率を有する単一細胞継代に寛容であった。継代での細胞生存は、５．０ｎｇ／ｍｌアクチビンＡの存在下で、または細胞をより高密度で分裂させることにより、実質的に改善された。ヒトＥＰＳＣは、多能性遺伝子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＲＥＸ１およびＳＡＬＬ４）をＨ１－ＥＳＣより高いレベルで発現し（拡張データ図７ｄ）、最低レベルの系統マーカー（ＥＯＭＥＳ、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、Ｔ、ＳＯＸ１７およびＲＵＮＸ１）（拡張データ図７ｇ）を発現した。ヒトＥＰＳＣにおける中心多能性ファクターおよび表面マーカーの発現が、免疫染色により確認された（拡張データ図７ｈ）。Ｈ１ＥＰＳＣは、インビトロおよびインビボで、３つの胚葉の派生物に分化した（拡張データ図７ｉ～ｊ）。さらに、Ｈ１－ＥＰＳＣは、生殖細胞コンピテントｈＥＳＣまたはｉＰＳＣのため開発されたインビトロ条件を使用して、ＰＧＣＬＣに首尾よく分化した［２６、２７］（拡張データ図７ｋ～ｌ）。

これらの結果は、ヒトおよびブタＥＰＳＣが、小分子インヒビターの同様のセットを使用して、もたらされ、維持され得ることを示す。網羅的な遺伝子発現プロファイリングにより、ｐＥＰＳＣおよびｈＥＰＳＣが、一緒に培養され、ＰＦＦまたは他のヒト多能性幹細胞と異なることが明らかになった［１、４２、４３］（図３ｂ、拡張データ図８ａおよび補足表６～７）。ブタとヒトＥＰＳＣの両方が、高レベルの鍵となる多能性遺伝子、低レベルの体細胞系統遺伝子、ＰＡＸ６、Ｔ、ＧＡＴＡ４およびＳＯＸ７、またはＰＧＦ、ＴＦＡＰ２Ｃ、ＥＧＦＲ、ＳＤＣ１およびＩＴＧＡ５などの胎盤関連遺伝子を発現した（拡張データ図８ｂ～ｅ）。ｐＥＰＳＣおよびｈＥＰＳＣの高レベルの網羅的ＤＮＡメチル化と一致し（拡張データ図９ａ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子ＤＮＭＴ１およびＤＮＭＴ３ＡおよびＤＮＭＴ３Ｂが、高度に発現され、一方、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２およびＴＥＴ３は、低レベルで発現された（拡張データ図９ｂ～ｃ）。Ｈ１－ＥＳＣと比較して、Ｈ１－ＥＰＳＣにおいて高度に発現された７６の遺伝子（＞８倍の増加）のうち、１７の遺伝子は、ヒストンクラスター１に属する１５のヒストンバリアントを含む、ヒストンバリアントをコードする（図３ｃおよび補足表８）。興味深いことに、これらのヒストン遺伝子は、５ｉおよびプライム型ヒトＥＳＣにおいて低レベルで発現されるが、ヒト８細胞および桑実期の胚において高度に発現された（図３ｄ）。これらのヒストン遺伝子の有意により高い発現は、さらに、従来のヒトＥＳＣ培地（ＦＧＦ）または５ｉ（ナイーブ型）培地（図３ｅ）において培養された同じ細胞と比較したとき、さらにｈＥＰＳＣ株において確認された。

ｈＥＰＳＣおよびヒト８細胞および桑実期の胚における高いヒストン遺伝子発現の生物学的有意が、依然としてさらに調べられている。ブタおよびヒトＥＰＳＣの単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ（ｓｃＲＮＡｓｅｑ）により、中心多能性ファクター：ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧおよびＳＡＬＬ４（図３ｆ）の均一の発現、ならびに実質的に均質な細胞培養物が明らかになった（図３ｇ）。単一細胞レベルにて、マウスＥＰＳＣは、４細胞期～８細胞卵割球の強化トランスクリプトーム特性を有していた［１］。ｈＥＰＳＣのｓｃＲＮＡｓｅｑ解析は、これらが、他の期のヒト着床前の胚と比較して、ヒト８細胞期～桑実期の胚［４４、４５］と転写的により類似し（図３ｈ、および拡張データ図８ｆ）、ＲＴ－ｑＰＣＲ、大量ＲＮＡｓｅｑおよびｓｃＲＮＡｓｅｑにおけるヒストン遺伝子発現特性と一致する（図３ｄおよび拡張データ図９ｅ）ことを示した。興味深いことに、トランスクリプトーム解析はまた、ヒト早期着床前の胚においては発現されない、ＥＰＳＣにおけるＫＬＦ２などのナイーブ型多能性ファクターの低発現が明らかになった（図３ｆおよび拡張データ図８ｂ～ｃ）［４６］。ＫＬＦ２、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２およびＴＥＴ３は、ｐＥＰＳＣとｈＥＰＳＣの両方において弱く発現されたが（拡張データ図８ｂおよび拡張データ図９ｂ、９ｃ）、これらのプロモーター領域は、活性なＨ３Ｋ４ｍ３ヒストンマークにより特徴付けられた（拡張データ図９ｆ）。多能性遺伝子と対照的に、細胞系統遺伝子座位（例えば、ＣＤＸ２、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ７およびＰＤＸ１）は、ブタとヒトＥＰＳＣの両方において、それぞれ、高いＨ３Ｋ２７ｍｅ３および低いＨ３Ｋ４ｍｅ３マークを有していた（拡張データ図９ｆ）。

５．６シグナル伝達経路
ｈＥＰＳＣおよびｐＥＰＳＣは、培地からの個々の成分の除去後の影響により明らかにされた、同様のシグナル伝達要件を共有した。ＳＲＣインヒビターＷＨ－４－０２３またはＡ４１９２５９の除去は、両方のＥＰＳＣにおける多能性ファクターの発現を低減した（拡張データ図１０ａ～ｄ）。特に、ヒトＥＰＳＣにおいて、Ａ４１９２５９の代わりに、ＳＲＣインヒビターＷＨ－４－０２３を使用することは、より低い多能性遺伝子発現を導いた（拡張データ図１０ｂ）。ｍＥＰＳＣと同様に、［１］ＸＡＶ９３９は、ＡＸＩＮ１タンパク質含有量を増強し（拡張データ図１０ｅ）、両方のＥＰＳＣにおける古典的ＷＮＴ活性を低減した（拡張データ図１０ｆ）。ＸＡＶ９３９の中止は、これらのＥＰＳＣの崩壊および分化を引き起こした（拡張データ図１０ａ～ｂ、１０ｄ、および１０ｇ～ｋ）。ＳＭＡＤ２／３は、ＥＰＳＣにおいてリン酸化された（拡張データ図１０ｅ）。アクチビンＡをｐＥＰＳＣＭから除去すること、またはＴＧＦβインヒビターＳＢ４３１５４２を添加することのいずれかは、ｐＥＰＳＣにおける大量の細胞喪失および多能性ファクターのダウンレギュレーションをもたらし（拡張データ図１０ａ、１０ｇ、１０ｈおよび１０ｊ）、一方、ヒトＥＰＳＣにおいて、ＴＧＦβインヒビターＳＢ４３１５４２は、栄養膜系統転写因子遺伝子ＣＤＸ２、ＥＬＦ５およびＧＡＴＡ２の優先発現を有する迅速な細胞分化を誘導した（拡張データ図１０ｂ、１０ｉおよび１０ｋ）。比較的低い濃度の外因性アクチビンＡ（５．０ｎｇ／ｍｌ）では、ｈＥＰＳＣは、胚の中内胚葉系統分化へのより強い傾向を示し（拡張データ図１０ｌ）、さらなるＮＡＮＯＳ３－ｔｄＴｏｍａｔｏ^＋ＰＧＣＬＣを生成した（拡張データ図１０ｍ～ｎ）。ＣＨＩＲ９９０２１およびビタミンＣをｐＥＰＳＣＭから除去することは、多能性遺伝子発現に影響しなかったが、単一細胞由来のコロニーの数を低減し（拡張データ図１０ａおよび１０ｈ）、一方、高いＣＨＩＲ９９０２１濃度（３．０μＭ）は、ヒトまたはナイーブ細胞におけるものに類似して、ブタとヒトＥＰＳＣの両方の分化を誘導した（拡張データ図１０ａ、１０ｈおよび１０ｊ）。［３０、４７］ＪＮＫおよびＢＲＡＦ阻害は、培養効率を改善し得るが、必須ではなかった（拡張データ図１０ｈ～ｉ）。ｈＥＰＳＣにおいて、ＣＨＩＲ９９０２１およびＶｃについての要件は、ｐＥＰＳＣと類似した（拡張データ図１０ａ～ｂおよび１０ｈ～Ｉ）。マウスナイーブ型ＥＳＣの誘導は、１．０□ＭＭｅｋ１／２インヒビターＰＤ０３２５９０１を低減したが［２６］、この濃度のＰＤ０３２５９０１は、ｐＥＰＳＣ培養条件についてのスクリーニングにおいてブタ細胞に有害であった（拡張データ図２ｂ～２ｆ）。この知見と一致して、０．１μＭＰＤ０３２５９０１でさえ、連続継代におけるコロニー形成により測定された、ｐＥＰＳＣ生存を減少した（拡張データ１０ｈ）。ブタおよびヒトＥＰＳＣ培養条件の全詳細は、方法に含まれる。

５．７分化
ｈＥＰＳＣの栄養膜細胞への分化は、ＣＤＸ２－Ｖｅｎｕｓレポーター（ＣＤＸ２座位の３’ＵＴＲに挿入されたＴ２Ａ－Ｖｅｎｕｓ）の発現により追跡された（拡張データ図１１ａ）。ＳＢ４３１５４２によるＴＧＦβの阻害は、ＣＤＸ２－Ｖｅｎｕｓ^＋であるＣＤＸ２レポーター細胞の約７０％を生じ（図４ａ）、一方、レポーター細胞は、ＦＧＦにおいて、または５ｉナイーブ型ＥＳＣ条件下で培養された場合、本質的に、ＣＤＸ２－Ｖｅｎｕｓ^＋細胞は検出されなかった。ＣＤＸ２、ＧＡＴＡ３、ＥＬＦ５、ＫＲＴ７、ＴＦＡＰ２Ｃ、ＰＧＦ、ＨＡＮＤ１およびＣＧＡなどの栄養膜関連遺伝子の発現は、Ｈ１－ＥＰＳＣおよびｉＰＳＣ－ＥＰＳＣの分化を迅速に増大させたが、Ｈ１－ＥＳＣまたはＨ１－５ｉナイーブ型細胞の分化を増大させなかった（図４ｂ）。ヒトＥＳＣの推定栄養膜への分化を促進する、ＢＭＰ４の添加は、［４８］Ｈ１－ＥＳＣまたはＨ１－５ｉナイーブ型ＥＳＣにおけるものより、Ｈ１－ＥＰＳＣおよびｉＰＳＣ－ＥＰＳＣにおいてずっと高いレベルで栄養膜遺伝子の発現を誘導した（拡張データ図１１ｂ）。並行してＢＭＰ４を活性化しながら、ＦＧＦおよびＴＧＦβシグナル伝達を阻害することは、ＦＧＦ－培養した（プライム型）ヒトＥＳＣにおいて栄養膜分化を有効に誘導することが報告された。［４９～５０］これらの条件下で、栄養膜遺伝子、特に、後期栄養膜遺伝子ＧＣＭ１、ＣＧＡおよびＣＧＢの発現は、Ｈ１－ＥＳＣにおいてより、Ｈ１－ＥＰＳＣにおいて依然としてずっと高く、一方、ナイーブ型５ｉｈＥＳＣは、栄養膜分化を示さなかった（拡張データ図１１ｃ）。網羅的遺伝子発現解析は、ＴＧＦβシグナル伝達阻害下で、Ｈ１－ＥＰＳＣおよびｉＰＳＣ－ＥＰＳＣは、Ｈ１－ＥＳＣと異なる分化トラジェクトリーが続き（図４ｃ）、ＥＰＳＣから分化した細胞において、（１）分化の２～４日目のＢＭＰ４；（２）合胞体栄養細胞への栄養膜細胞層融合を促進する、ヒト内因性レトロウイルスによりコードされる殻タンパク質シンシチン－１（ＥＲＶＷ－１）およびシンシチン－２（ＥＲＶＦＲＤ－１）の遺伝子；（３）栄養膜細胞において発現され、正常な胎盤発生に必須である、母性発現された遺伝子ｐ５７（ＣＤＫＮ１Ｃによりコードされる）［５１～５２］；（４）免疫細胞活性を調節するＣＤ２７４（ＰＤ－Ｌ１またはＢ７－Ｈ１をコードする）；ならびに（５）ヒト栄養膜幹細胞（ｈＴＳＣ）^５３において重要である、ＥＧＦＲを含む、重要な栄養膜発生または機能遺伝子は、高度に発現されたが、Ｈ１－ＥＳＣから分化した細胞ではこれらの遺伝子は高度に発現されていなかったことを示した（拡張データ図１１ｄおよび補足表６）。

ＴＧＦβ阻害による分化したｈＥＰＳＣの同定をさらに推測するために、本発明者らは、初代ヒト栄養膜（ＰＨＴ）およびヒト胎盤組織を含む、外部参照データを用いた、Ｈ１－ＥＰＳＣ、ｉＰＳＣ－ＥＰＳＣまたはＨ１－ＥＳＣから分化した細胞のトランスクリプトームのピアソン相関係数解析を行い［５０］、ｈＥＰＳＣおよびＰＨＴから分化した細胞と胎盤の間の類似性を再度明らかにした（拡張データ図１１ｅ）。ＴＧＦβ阻害によるＨ１－ＥＰＳＣから分化した細胞は、ヒト栄養膜特異的ｍｉＲＮＡ（Ｃ１９ＭＣｍｉＲＮＡ：ｈｓａ－ｍｉＲ－５２５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２６ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１７－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－５１７ｂ－３ｐ）を発現し［５４］（拡張データ図１１ｆ～ｇ）、ＥＬＦ５座位でのＤＮＡ脱メチル化を示し［５５、５６］（拡張データ図１１ｈ）、多量の胎盤ホルモンを生成した（拡張データ図１１ｉ～ｊ）。

ｈＥＰＳＣ（ＥＳＣで変換されたＥＰＳＣおよびｉＰＳＣ－ＥＰＳＣ）が、ヒト栄養膜幹細胞（ｈＴＳＣ）条件［５３］下で、低い細胞密度（２，０００個の細胞／３．５ｃｍのディッシュ）で培養されたとき、ＴＳＣ形態を有するコロニーが、７～９日後に形成した（図４ｄ）。これらのコロニーが、拾い上げられ、安定な細胞に、ｈＴＳＣ条件下で最大３０％の株の確立効率で拡大された（図４ｄ）。他方、ｈＴＳＣ株は、これらが、プライム型またはナイーブ型ＥＳＣ条件下で培養されたかどうかに関わらず、ヒトＨ１またはＭ１ＥＳＣから確立されなかった。ｈＥＰＳＣからもたらされたＴＳＣ様細胞（本研究において、ｈＴＳＣとして言及される）は、栄養膜転写制御因子：ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ３およびＴＦＡＰ２Ｃを発現したが、多能性遺伝子をダウンレギュレーションした（図４ｅおよび拡張データ図１２ａ）。栄養膜へのヒトＥＰＳＣ分化中の遺伝子発現変化と比較して、ｈＥＰＳＣからもたらされたｈＴＳＣは、ＴＧＦβ阻害下で４～６日目の分化したヒトＥＰＳＣの強化トランスクリプトーム特性を有していた（拡張データ図１２ｂ）。公開されたプロトコールに従い、［５３］ｈＴＳＣは、多核合胞体栄養細胞（ＳＴ）とＨＬＡ－Ｇ^＋絨毛外栄養膜（ＥＶＴ）の両方に分化した（図４ｆ～４ｇ、および拡張データ図１２ｃ～１２ｈ）。一度免疫不全マウスに注入されると、ｈＴＳＣは、病変を形成し、これは、栄養膜マーカーＳＤＣ１およびＫＲＴ７について陽性に染色された細胞を含有した（図４ｈ、および拡張データ図１２ｉ）。加えて、高レベルのｈＣＧ（ヒト絨毛性ゴナドトロピン）は、注射したｈＴＳＣから病変を形成しているマウスの血液において検出されたが、ビークル対照を注射したマウスにおいて検出されなかった（拡張データ図１２ｊ）。ブタとヒトＥＰＳＣの両方が、ＰＧＦ、ＴＦＡＰ２Ｃ、ＥＧＦＲ、ＳＤＣ１およびＩＴＧＡ５などの高レベルの胎盤発生関連遺伝子を発現しなかった（拡張データ図８ｄ～ｅ）が、両方の細胞が、これらの座位で高いＨ３Ｋ４ｍｅ３を有し（拡張データ図１３ａ）、これは、ＥＰＳＣの栄養膜効力を明確に支持する。ヒトとブタＥＰＳＣの間での分子類似性と一致し、ヒトＴＳＣ条件下で、安定なＴＳＣ様株はまた、ブタＥＰＳＣ^Ｅｍｂ（本明細書においてｐＴＳＣとして言及される、拡張データ図１３ｂ）からもたらされ得る。ｐＴＳＣは、栄養膜遺伝子を発現し、病変を形成し、これは、免疫不全マウスにおいてＳＤＣ１およびＫＲＴ７について陽性に染色された細胞を含有した（拡張データ図１３ｃ～１３ｆ）。ブタ着床前の胚に導入されたとき、ｐＴＳＣの子孫は、栄養外胚葉に局在化され、ＧＡＴＡ３を発現した（拡張データ図１３ｇ）。それ故、これらの結果は、ヒトおよびブタＥＰＳＣが、栄養膜系統を包含する拡大した分化ポテンシャルを有するという説得力のある証拠をもたらす。

マウス、ブタおよびヒトのＥＰＳＣの誘導および維持の鍵となる機序の１つは、ＸＡＶ９３９などの小分子インヒビターを使用した、ＰＡＲＰファミリーメンバーＴＮＫＳ１／２のポリ（ＡＤＰ－リボシル）化活性を阻害することである。［５７、５８］ヒト細胞において、タンパク質におけるポリ（ＡＤＰ－リボース）は、ポリ（ＡＤＰ－リボース）糖加水分解酵素（ＰＡＲＧ）およびＡＤＰ－リボシル加水分解酵素３（ＡＲＨ３）により除去される。［５９］マウスにおけるＰａｒｐ１／２およびＴＮＫＳ１／２の遺伝子不活性化は、栄養膜表現型を生じ、［６０］一方、Ｐａｒｇの不活性化は、機能的栄養外胚葉およびＴＳＣの消失を導いた。［６１］ＰＡＲＧは、これが、栄養膜をもたらすためのｈＥＰＳＣ発生ポテンシャルと何らかの関連があるかどうかを試験される。ｈＥＰＳＣにおいて、ＰＡＲＧ欠乏は、ＥＰＳＣ培養物において注目すべき変化を引き起こさないように思われたが、栄養膜分化に不利に影響し（拡張データ図１４ａ～ｄ）、これは、マウスからヒトへのＥＰＳＣおよび栄養膜発生についての進化的に保存された機序を示し得る。

本明細書に記載される本主題は、以下の非限定的実施例により、より具体的に説明され、変更およびバリエーションが、本明細書の後に請求される本開示の範囲および精神から逸脱することなく、そこになされ得ることは理解される。本開示がなぜうまくいくのかについての様々な理論が、限定を意図したものではないことも理解される。

６．実施例
６．１ヒトＥＳＣを用いた実施の倫理規定
ヒトＥＳＣおよびヒト細胞を使用する実験は、ＷｅｌｌｃｏｍｅＴｒｕｓｔＳａｎｇｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＣａｍｂｒｉｄｇｅＵＫのＨＭＤＭＣにより承認された。ブタ胚を使用した実験は、ＮｉｅｄｅｒｓａｅｃｈｓｉｓｃｈｅｓＬａｎｄｅｓａｍｔｆｕｅｒＶｅｒｂｒａｕｃｈｅｒｓｃｈｕｔｚｕｎｄＬｅｂｅｎｓｍｉｔｔｅｌｓｉｃｈｅｒｈｅｉｔ、ＬＡＶＥＳ、Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ、ドイツにより承認された。マウステラトーマ実験は、英国内務省の規則およびＡｎｉｍａｌｓ（ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）Ａｃｔ１９８６（ライセンス番号８０／２５５２）に従い行い、ＡｎｉｍａｌＷｅｌｆａｒｅａｎｄＥｔｈｉｃａｌＲｅｖｉｅｗＢｏｄｙｏｆｔｈｅＷｅｌｌｃｏｍｅＧｅｎｏｍｅＣａｍｐｕｓ、およびＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｎｔｈｅＵｓｅｏｆＬｉｖｅＡｎｉｍａｌｓｉｎＴｅａｃｈｉｎｇａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈ、ＴｈｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＨｏｎｇＫｏｎｇ（ＣＵＬＡＴＲ、ＨＫＵ）により承認された。本研究の終わりに、マウスを、指定される英国内務省の規則に従い、頸部の脱臼により安楽死させた。

６．２ブタおよびヒトＥＰＳＣの培養
ブタおよびヒトＥＰＳＣ培養物を、ＳＴＯフィーダー上で日常的に維持した。ＳＴＯ細胞を解凍し、マイトマイシンＣにより不活性化したＳＴＯ細胞を０．１％ゼラチン化プレートに密度約１．１×１０^４個の細胞／ｃｍ^２で蒔くことにより、ＳＴＯフィーダープレートを継代の３～４日前に調製した。ブタ／ヒトＥＰＳＣ細胞を、ＳＴＯフィーダー層上で維持し、簡単なＰＢＳ洗浄、続いて、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２５５００－０５４）を用いた３～５分間の処置により、３～５日毎に酵素的に継代した。細胞を分離させ、Ｍ１０培地中で遠心分離した（３００ｇ×５分間）。Ｍ１０：ノックアウトＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０８２９－０１８）、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０２７０）、１×グルタミンペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１１４００５０）および１× ＮＥＡＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１０３７８－０１６）。上清を除去後、ブタ／ヒトＥＰＳＣを、５μＭＲＯＣＫインヒビターＹ－２７６３２（Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号１２５４）を添加したｐＥＰＳＣＭ／ｈＥＰＳＣＭにおいて再懸濁し、播種した。５％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０２７０）および１０％ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０８２８０２８）を、それぞれ、ｐＥＰＳＣＭおよびｈＥＰＳＣＭに加えて、細胞生存を改善させた。１２～２４時間後、培地をｐＥＰＳＣＭ／ｈＥＰＳＣＭのみに切り替えた。ｐＥＰＳＣＭとｈＥＰＳＣＭの両方が、Ｎ２Ｂ２７ベースの培地であった。Ｎ２Ｂ２７基本培地（５００ｍｌ）を、以下の成分：ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２１３３１－０２０）４８２．５ｍｌ、Ｎ２栄養補助剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１７５０２０４８）２．５ｍｌ、Ｂ２７栄養補助剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１７５０４０４４）５ｍｌ、１×グルタミンペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１１４０－０５０）５ｍｌ、および１×ＮＥＡＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１０３７８－０１６）５ｍｌ、０．１ｍＭ２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ６２５０）の包含により、調製した。ｐＥＰＳＣＭ（５００ｍｌ）を、以下の小分子およびサイトカイン：０．２μＭＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ３ｉ、ＴＯＣＲＩＳ、カタログ番号４４２３）、１μＭＷＨ－４－０２３（ＳＲＣインヒビター、ＴＯＣＲＩＳ、カタログ番号５４１３）、２．５μＭＸＡＶ９３９（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｘ３００４）または２．５μＭＩＷＲ－１（ＴＯＣＲＩＳ、カタログ番号３５３２）、５０μｇ／ｍｌビタミンＣ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号４９７５２－１００Ｇ）、１０ｎｇ／ｍｌＬＩＦ（ＳｔｅｍＣｅｌｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣａｍｂｒｉｄｇｅ．ＳＣＩ）および２０ｎｇ／ｍｌアクチビン（ＳＣＩ）をＮ２Ｂ２７基本培地５００ｍｌに加えることにより、生成した。ｈＥＰＳＣＭ（５００ｍｌ）を、以下の成分：１．０μＭＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ３インヒビター、ＴＯＣＲＩＳ、カタログ番号４４２３）、０．５μＭＡ－４１９２５９（ＳＲＣインヒビター、ＴＯＣＲＩＳ、カタログ番号３９１４）、２．５μＭＸＡＶ９３９（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｘ３００４）、５０μｇ／ｍｌビタミンＣ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号４９７５２－１００Ｇ）、１０ｎｇ／ｍｌＬＩＦ（ＳＣＩ）をＮ２Ｂ２７基本培地５００ｍｌに加えることにより、生成した。ＷＨ－４－０２３およびＡ４１９２５９両方が、ＳＲＣファミリーキナーゼ（ＳＦＫ）を標的化するが、ＷＨ－４－０２３およびＡ４１９２５９は、それぞれ、ブタおよびヒトＥＰＳＣにとって好ましかった。ブタとヒトＥＰＳＣの両方が、改善した増殖のためＣＨＩＲ９９０２１を必要とする。マウスＥＳ細胞培養のため使用した高濃度のＣＨＩＲ９９０２１（例えば、３．０μＭ）は、ブタおよびヒトＥＰＳＣ分化を誘導する。ブタおよびヒトＥＰＳＣ培養のためのＣＨＩＲ９９０２１の濃度は、それぞれ、０．２μＭおよび１．０μＭである。ヒトＥＰＳＣ培養条件は、０．３％ＦＢＳを含有しない。０．２５μＭＳＢ５９０８８５（ＢＲＡＦインヒビター、Ｒ＆Ｄ、カタログ番号２６５０）および２．０μＭＳＰ６００１２５（ＪＮＫインヒビター、ＴＯＣＲＩＳ、カタログ番号１４９６）を含めて、ブタおよびヒトＥＰＳＣ培養を改善したが、これらは、ブタおよびヒトＥＰＳＣの日常的維持に必須ではなかった。本明細書における全ての細胞培養を、別段指定されない限り、３７℃および５％ＣＯ_２の条件下で行った。

６．３ＰＦＦ（ブタ胎児線維芽細胞）のｉＰＳＣへのリプログラミング
ドイツ在来種［１］および中国ＴＡＩＨＵＯＣＴ４－ＴＤ－ｔｏｍａｔｏ［２］ブタ胎児線維芽細胞（ＰＦＦ）を、ゼラチン化１５ｃｍ組織培養プレートに蒔き、Ｍ２０培地において培養した。これらを、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２５５００－０５４）を用いてトリプシン処理し、エレクトロポレーションのため、８０％コンフルエンスで回収した。Ｍ２０：ノックアウトＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０８２９－０１８）、２０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０２７０）、１×グルタミンペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１１４０－０５０）および１×ＮＥＡＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１０３７８－０１６）。製造元のプロトコール（ＮＨＤＦＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）キット、カタログ番号ＶＰＤ－１００１、プログラムＵ－２０）に従い、ＡｍａｘａＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒｍａｃｈｉｎｅ（Ｌｏｎｚａ）を使用して、遺伝子導入を行った。ｐｉｇｇｙＢａｃ転位を使用して、リプログラミングファクターの安定な組込みを達成した。リプログラミングファクターの発現は、ｔｅｔＯ２テトラサイクリン／ドキシサイクリン誘導性プロモーターの転写制御下であった。ＰＦＦ１５０００００００個およびＤＮＡ６．０μｇ（ＰＢ－ＴＲＥ－ｐＯＳＣＫ、ブタＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃＭＹＣおよびＫＬＦ４２．０μｇ；ＰＢ－ＴＲＥ－ｐＮｈＬ１．０μｇ、ＰＢ－ＴＲＥ－ｈＲＬ：ヒトＲＡＲＧおよびＬＲＨ１、ＰＢ－ＥＦ１ａ－トランスポサーゼ１．０μｇならびにＰＢ－ＥＦ１ａ－ｒＴＴＡ１．０μｇ）を、それぞれのエレクトロポレーション反応において使用した。ＰＢ－ＴＲＥ－ｐＯＳＣＫ：２Ａ配列により連結したブタＯＣＴ４のｃＤＮＡ、ＳＯＸ２、ｃＭＹＣおよびＫＬＦ４を、ｔｅｔＯ２プロモーターからの単一転写物［３］として発現させた。ＰＢ－ＴＲＥ－ｐＮｈＬは、２Ａ配列を用いて連結した、ブタＮＡＮＯＧおよびヒトＬＩＮ２８のｃＤＮＡを含有する［３］。ＰＢ－ＴＲＥ－ＲＬは、２Ａにより連結したヒトＲＡＲＧおよびＬＲＨ１ｃＤＮＡを有する［４］。ＥＦ１ａプロモーターを利用して、ＰＢトランスポサーゼ発現をもたらした。リバーステトラサイクリンにより調整したトランス活性化因子（ｒｔＴＡ）を発現させて、Ｄｏｘ添加の際にリプログラミングファクターの発現を誘導した。遺伝子導入後、ＰＦＦ２０００００個を、マイトマイシンにより不活性化したＳＴＯフィーダー上、ＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＩ）およびビタミンＣ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号４９７５２－１００Ｇ）を添加したＭ１５中、１０ｃｍディッシュにおいて播種した。Ｍ１５：ノックアウトＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０８２９－０１８）、１５％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０２７０）、１×グルタミンペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１１４０－０５０）、１×ＮＥＡＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１０３７８－０１６）および０．１ｍＭ２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ６２５０）。ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）（１．０μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ９８９１）を、リプログラミングファクター発現の導入のため加えた。培養液を、１日置きに交換した。導入遺伝子依存性ｉＰＳＣ生成のため、コロニーを、１２日目にＤｏｘ、５０μｇ／ｍｌビタミンＣおよび１０ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦ（ＳＣＩ）を添加したＭ１５に拾い上げ、同じ培地において維持した。ｐＥＰＳＣＭにおいて導入遺伝子非依存性ｉＰＳＣ株を直接確立するため、Ｄｏｘを、９日目に除去し、培地を、ｐＥＰＳＣＭに直ちに切り替えた。Ｄｏｘ非依存性ｉＰＳＣコロニーを、１４～１５日目に、５μＭＲＯＣＫインヒビターＹ２７６３２（Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号１２５４）を添加したｐＥＰＳＣＭに拾い上げた。Ｙ２６５３７を、培養液から２４時間後に除去し、ｐＥＰＳＣＭを、その後毎日、新たにした。

６．４ブタＥＰＳＣ培養条件のスクリーニング
Ｄｏｘ依存性ブタｉＰＳＣを、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２５５００－０５４）において分離させ、２４ウェルのＳＴＯフィーダープレートにおいて、密度１ウェル当たり細胞１×１０^４個で播種した。細胞を、Ｄｏｘ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ９８９１）、ビタミンＣ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号４９７５２－１００Ｇ）および１０ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦ（ＳＣＩ）を添加したＭ１５において２日間培養し、その後、培養液を、示した小分子およびサイトカイン（補足表１）を添加した培地に切り替えた。Ｍ１５およびＮ２Ｂ２７培地：上記を参照。ＡｌｂｕｍＭａｘ培地：ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２１３３１－０２０）、２０％ＡｌｂｕｍＭａｘＩＩ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１０２１－０３７）、２５ｍｇ／ｍＬヒトインスリン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号９１０７７Ｃ）、２×Ｂ２７栄養補助剤、１００μｇ／ｍＬＩＧＦＩＩ（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号２９２－Ｇ２－２５０）、１×グルタミンペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１１４０－０５０）、１×ＮＥＡＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１０３７８－０１６）および０．１ｍＭ２メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ６２５０）。２０％ＫＳＲ培地：ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２１３３１－０２０）、２０％ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０８２８－０２８）、１×グルタミンペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１１４０－０５０）、１×ＮＥＡＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１０３７８－０１６）および０．１ｍＭ２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ６２５０）。以下の終濃度：ＣＨＩＲ９９０２１（０．２または３μＭ、ＴＯＣＲＩＳ、カタログ番号４４２３）、ＰＤ０３２５９０１（０．１μＭおよび１μＭ、ＴＯＣＲＩＳ、カタログ番号２２８５４１９２）；ＷＨ－４－０２３（４μＭ、ＴＯＣＲＩＳ、カタログ番号５４１３）、ＰＫＣインヒビターＧｏ６９８３（５μＭＴＯＣＲＩＳ、カタログ番号２２８５）；ＳＢ２０３５８０（ｐ３８インヒビター、１０μＭＴＯＣＲＩＳ、カタログ番号１２０２）；ＳＰ６００１２５（ＪＮＫインヒビター、４μＭＴＯＣＲＩＳ、カタログ番号１４９６）；ビタミンＣ（５０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号４９７５２－１００Ｇ）、ＳＢ５９０８８５（ＢＲＡＦインヒビター、０．２５μＭ、Ｒ＆Ｄ、カタログ番号２６５０）、ＸＡＶ９３９（２．５μＭ、カタログ番号Ｘ３００４）、ＲＯ４９２９０９７（Ｎｏｔｃｈシグナル伝達インヒビター、１０μＭ、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ、カタログ番号Ｓ１５７５）、ＬＤＮ１９３１８９（ＢＭＰインヒビター、０．１μＭ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＳＭＬ０５５９）、Ｙ２７６３２（ＲＯＣＫｉ、５μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号１２５４）、ベルテポルフィン（ＹＡＰインヒビター、１０μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号５３０５）、ＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＩ）、ＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ、カタログ番号５０２０－ＢＰ）、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ、カタログ番号２５５－ＳＣ－０１０）、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ、カタログ番号２３６－ＥＧ－２００）、ＴＧＦβ（１０ｎｇ／ｍｌ、カタログ番号７７５４－ＢＨ－００５）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＩ）、アクチビン（２０ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＩ）で示す通り、小分子およびサイトカインを添加した。培地を毎日新たにし、生き残った細胞を、６日目に継代した。継代の最初の２４時間において、５μＭＲＯＣＫｉＹ２７６３２（Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号１２５４）を、培地に添加し、２４時間後に除去した。４日間の成長後、生存したコロニーを、内因性ブタＯＣＴ４およびＮＡＮＯＧ発現を調べるためのＲＴ－ｑＰＣＲ解析のため集めた。

６．５メスのブタの過排卵
思春期前後のドイツ在来種の若いメスのブタ（月齢およそ７～９、体重９０～１２０ｋｇ）が、胚ドナーとして役立った。若いメスのブタを、５ｍｌ／日／若いメスのブタのアルトレノゲスト（Ｒｅｇｕｍａｔｅ（登録商標）、４ｍｇ／ｍｌ、ＭＳＤＡｎｉｍａｌＨｅａｌｔｈ、ドイツ）を１３日間与えることにより同調させた。続いて、アルトレノゲスト給餌の最終日に、ＰＭＳＧ（Ｉｎｔｅｒｇｏｎａｎ（登録商標）２４０Ｉ．Ｅ．／ｍｌ、ＭＳＤＡｎｉｍａｌＨｅａｌｔｈ、ドイツ）１５００ＩＵを注射した［５］。７６時間後のｈＣＧ（Ｏｖｏｇｅｓｔ（登録商標）３００Ｉ．Ｅ．／ｍｌ、ＭＳＤＡｎｉｍａｌＨｅａｌｔｈ、ドイツ）５００ＩＵの筋内注射により、排卵を誘発した。

６．６メスのブタの精子注入および胚回収
ドイツの在来種の成熟オスから、ファントムを使用して、［１］手袋を用いた手法を介して、精液を集め、直ちにＡｎｄｒｏｈｅｐ□Ｐｌｕｓ溶液（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ、Ｔｉｅｆｅｎｂａｃｈ、ドイツ）において希釈した。ｈＣＧ投与の４０時間および４８時間後に、メスのブタを、２回人工受精させた。第二の精子注入の５日後、メスのブタを屠殺し、子宮を切除し、１％ウシ新生児血清（ＮＢＣＳ、Ｇｉｂｃｏ（商標）、カタログ番号１６０１０１５９）を添加したダルベッコＰＢＳ培地（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、カタログ番号Ａ０９６４）を流した。集めた桑実胚を、注射実験のため直接使用するか、または胚盤胞期までＰＺＭ－３培地において一晩培養し、ＩＣＭ単離のため使用した（ＰＺＭ－３培地：１０８ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ５８８６）、１０ｍＭ塩化カリウム（ＫＣｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ－５４０５）、０．３５ｍＭリン酸二水素カリウム（ＫＨ_２ＰＯ_４、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｐ５６５５）、０．４０ｍＭ硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ_４×７Ｈ_２Ｏ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｍ５９２１）、２５．０７ｍＭ重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓ４０１９）、２ｍＭＬ（＋）乳酸カルシウム塩ペンタ水和物（Ｃ_６Ｈ_１０ＣａＯ_６×５Ｈ_２Ｏ、Ｒｏｔｈ、カタログ番号４０７１）、０．２ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｐ２２５６）、１ｍＭＬ－グルタミン（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、カタログ番号Ａ３７０４）、０．０５ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン硫酸塩（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｇ３６３２）、０．５５ｍｇ／ｍｌヒポタウリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｈ１３８４）、２０μｌ／ｍｌＢＭＥアミノ酸溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｂ６７６６）、１０μｌ／ｍｌＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｍ７１４５）および３ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ７０３０））。

６．７卵母細胞収集、インビトロでの成熟（ＩＶＭ）および単為生殖胚の生成
思春期前の若いメスのブタ由来のブタ卵巣を、３０℃で地元の畜殺場から輸送し、０．０６ｍｇ／ｍｌペニシリンＧカリウム塩（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、カタログ番号Ａ１８３７）および０．１３１ｍｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、カタログ番号Ａ１８５２）を含有する０．９％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ５８８６）を用いて３回洗浄した。直径２～６ｍｍの卵胞から１８ゲージのニードルを用いて卵母細胞を吸引し、０．３３ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｐ２２５６）、５．５６ｍＭＤ（＋）－グルコース一水和物（Ｒｏｔｈ、カタログ番号６８８７）、０．９ｍＭ塩化カルシウム二水和物（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、カタログ番号Ａ３５８７）、５０ｍｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、カタログ番号Ａ１８５２）、６ｍｇ／ｍｌペニシリンＧカリウム塩（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、カタログ番号Ａ１８３７）および１％ウシ新生児血清（ＮＢＣＳ、Ｇｉｂｃｏ（商標）、カタログ番号１６０１０１５９）を添加したダルベッコＰＢＳ培地（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、カタログ番号Ａ０９６４）において洗浄した。複数の層のコンパクトになった卵丘を有する卵丘卵母細胞複合体を、６０μｇ／ｍｌペニシリンＧカリウム塩（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、カタログ番号Ａ１８３７）、５０μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、カタログ番号Ａ１８５２）、２．５ｍＭＬ－グルタミン（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、カタログ番号Ａ３７０４）、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、ロット４２Ｑ０１５４Ｋ、カタログ番号１０２７０－１０６）、５０ｎｇ／ｍｌマウス上皮成長因子（ＥＧＦ、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｅ４１２７）、１０Ｉ．Ｅ．／ｍｌ妊馬血清性ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ、Ｉｎｔｅｒｇｏｎａｎ（登録商標）２４０Ｉ．Ｅ．／ｍｌ、ＭＳＤＡｎｉｍａｌＨｅａｌｔｈ、ドイツ）、１０Ｉ．Ｅ．／ｍｌヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ、Ｏｖｏｇｅｓｔ（登録商標）３００Ｉ．Ｅ．／ｍｌ、ＭＳＤＡｎｉｍａｌＨｅａｌｔｈ、ドイツ）、１００ｎｇ／ｍｌヒト組み換えインスリン様成長因子１（ＩＧＦ１、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２９１－Ｇ１）、５ｎｇ／ｍｌ組み換えヒトＦＧＦ－ｂａｓｉｃ（ｂＦＧＦ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号１００－１８Ｂ）を添加した１：１のＤＭＥＭ高グルコース（Ｂｉｏｗｅｓｔ、カタログ番号Ｌ０１０１－５００）およびハムＦ－１２培地（Ｍｅｒｃｋ、カタログ番号Ｆ０８１５）において、４０時間、５％ＣＯ_２を含む加湿空気中、３８．５℃でインビトロで成熟させた。

６．８単為生殖胚発生の活性化
成熟後、卵母細胞から、１１４ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ５８８６）、３．２ｍＭ塩化カリウム（ＫＣｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ－５４０５）、２ｍＭ塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ_２×２Ｈ_２Ｏ；ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、カタログ番号Ａ３５８７）、０．４ｍＭナトリウム二水素一水和物（ＮａＨ_２ＰＯ_４×Ｈ_２Ｏ、Ｍｅｒｃｋ、カタログ番号１０６３４６）、０．５ｍＭ塩化マグネシウムヘキサ水和物（ＭｇＣｌ_２×６Ｈ_２Ｏ、Ｒｏｔｈ、カタログ番号ＨＮ０３．２）、２ｍＭ炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３、Ｒｏｔｈ、カタログ番号ＨＮ０１．２）、１０ｍＭＨＥＰＥＳ（Ｒｏｔｈ、カタログ番号９１０５．３）、１０ｍＭナトリウムＤＬ－乳酸溶液（６０％）（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｌ１３７５）、１００Ｕ／ＬペニシリンＧカリウム塩（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、カタログ番号Ａ１８３７）、５０ｍｇ／Ｌ硫酸ストレプトマイシン（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、カタログ番号Ａ１８５２）、０．２５ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｐ２２５６）、５７ｍＭスクロース（Ｍｅｒｃｋ、カタログ番号１０７６５３）および０．４％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ９６４７）を含むＴＬ－Ｈｅｐｅｓ３２１＋Ｃａ^２＋培地中の０．１％ヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｈ３５０６）との５分間のインキュベーションにより、卵丘を取り除いた。ＴＬ－Ｈｅｐｅｓ３２１＋Ｃａ^２＋培地で洗浄後、目に見える第一の極体を有する卵母細胞を、ＳＯＲ活性化培地［１８２．２ｇ／ｍｏｌソルビトール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ１８７６）、１５８．２ｇ／ｍｏｌ酢酸カルシウム水和物（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｃ４７０５）、２１４．５ｇ／ｍｏｌ酢酸マグネシウムテトラ水和物（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｍ５６６１）、０．１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ９６４７）］において、４５μ秒間の１回パルスに曝露した。その後、卵母細胞を、３時間、ＰＺＭ－３培地中の２ｍＭ６ジメチルアミノプリン（６－ＤＭＡＰ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｄ２６２９）においてインキュベーションした。

６．９ブタ着床前の胚のインビトロでの培養
活性化後、卵母細胞を、ＰＺＭ－３培地において、３９℃、５％ＣＯ_２および５％Ｏ_２中で６日間培養した。ＩＣＭの単離のため、６日目のブタ胚盤胞を、１０００Ｕ／ｍｌＥＳＧＲＯ（登録商標）組み換えマウスＬＩＦタンパク質（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＥＳＧ１１０７）を添加したＤＭＥＭ高グルコース（Ｂｉｏｗｅｓｔ、カタログ番号Ｌ０１０１－５００）、および２ｍＭＬ－グルタミン（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、カタログ番号Ａ３７０４）、１５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、ロット４２Ｑ０１５４Ｋ、カタログ番号１０２７０－１０６）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号ＰＳ－Ｂ）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号ＮＥＡＡ－Ｂ）、０．１ｍＭ２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｍ７５２２）含有Ｄ１５培地において、さらに２４時間培養した。

６．１０ＩＣＭのブタ単為生殖およびインビボで集めた胚盤胞からの単離
７日目のブタ単為生殖胚盤胞および５日目のインビボでもたらした胚盤胞を、ブタＰＳＣ株の確立のため使用した。胚盤胞を、１１４ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ５８８６）、３．２ｍＭ塩化カリウム（ＫＣｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｐ－５４０５）、２ｍＭ塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ_２×２Ｈ_２Ｏ、ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、カタログ番号Ａ３５８７）、０．４ｍＭナトリウム二リン酸水素一水和物（ＮａＨ_２ＰＯ_４×Ｈ_２Ｏ、Ｍｅｒｃｋ、カタログ番号１０６３４６）、０．５ｍＭ塩化マグネシウムヘキサ水和物（ＭｇＣｌ_２×６Ｈ_２Ｏ、Ｒｏｔｈ、カタログ番号ＨＮ０３．２）、２ｍＭ重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ４０１９）、１０ｍＭＨＥＰＥＳ（Ｒｏｔｈ、カタログ番号９１０５．３）、１０ｍＭナトリウムＤＬ－乳酸溶液（６０％）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｌ１３７５）、１００Ｕ／ＬペニシリンＧカリウム塩ＢｉｏＣｈｅｍｉｃａ（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、カタログ番号Ａ１８３７）、５０ｍｇ／Ｌ硫酸ストレプトマイシンＢｉｏＣｈｅｍｉｃａ（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、カタログ番号Ａ１８５２）、０．２５ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｐ２２５６）、３２ｍＭスクロース（Ｍｅｒｃｋ、カタログ番号１０７６５３）および０．４％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ９６４７）を含むＴＬＨｅｐｅｓ２９６＋Ｃａ^２＋培地において、２回洗浄した。ＩＣＭを、ＴＬ－Ｈｅｐｅｓ２９６＋Ｃａ^２培地の滴１００μｌにおいて、眼科用ハサミ（Ｂａｕｓｃｈ＆ＬｏｍｂＧｍｂＨ、ドイツ）を使用して、栄養外胚葉から分離した。最初の成長を観察することができるまで、単離したＩＣＭを、マイトマイシンＣで処理したＳＴＯ細胞の単層上で、１０μＭＹ２７６３２（ＲＯＣＫｉ、Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号１２５４）を添加したｐＥＰＳＣＭ培地において７日間培養した。続いて、ＲＯＣＫｉを含まないｐＥＰＳＣＭ培地を、さらなる培養のため使用した。培地を、毎日交換した。蒔いて１２～１４日後、ＩＣＭコロニーを、細く引いたガラスキャピラリーピペットを使用して、ＳＴＯフィーダーから機械的に取り出し、新鮮なフィーダー上に再播種した。コロニーの成長を毎日評価し、およそ３日後の細胞が、明確なブタＥＰＳＣ^Ｅｍｂコロニーを形成し始めた。これらの細胞を、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号Ｌ１１－００３）を使用し、３～４日毎にサブ培養した。

６．１１インビトロキメラアッセイ
もたらされた細胞株の発生能を調べるために、ｍＣｈｅｒｒｙ発現で標識したブタＥＰＳＣ^ＥｍｂおよびＥＰＳＣ^ｉＰＳを、単為生殖胚盤胞に注入し、キメラ化の発生率を評価した。幹細胞を、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号Ｌ１１－００３）を用いてフィーダーから剥離し、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、ロット４２Ｑ０１５４Ｋ、カタログ番号１０２７０－１０６）において再懸濁した。遠心分離後、幹細胞を再懸濁し、室温で、１０００Ｕ／ｍｌＥＳＧＲＯ（登録商標）組み換えマウスＬＩＦタンパク質（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＥＳＧ１１０７）および１０μＭＹ２７６３２（ＲＯＣＫｉ、Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号１２５４）を添加したＤ１５培地において保存した。６～８細胞を含有する小凝集塊を、４日齢または６日齢のブタ単為生殖胚に、圧力駆動のマイクロマニピュレーター（Ｚｅｉｓｓ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、ロット４２Ｑ０１５４Ｋ、カタログ番号１０２７０－１０６）を添加したＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）Ｉ（１×）＋ＧｌｕｔａｍＭＡＸ（商標）－Ｉ減少血清培地（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、カタログ番号５１９８５－０２６）において注入した。注入後、胚を、１０００Ｕ／ｍｌＥＳＧＲＯ（登録商標）組み換えマウスＬＩＦタンパク質（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＥＳＧ１１０７）および１０μＭＹ２７６３２（ＲＯＣＫｉ、Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号１２５４）を添加したＤ１５培地において、３９℃、５％ＣＯ_２および５％Ｏ_２において２４時間（６日目の胚盤胞のため）または４８時間（４日目の胚のため）培養した。上記の培地において培養した４日目または６日目の注入していないブタ単為生殖胚を、胚発生の対照として使用した。

６．１２インビボキメラアッセイ
過排卵、精子注入および胚収集の手法を、上で記載した。若いメスのブタ８匹から収集した５日目のブタ桑実胚を、注射前、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、ロット４２Ｑ０１５４Ｋ、カタログ番号１０２７０－１０６）を添加したＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）Ｉ（１×）＋ＧｌｕｔａｍＭＡＸ（商標）－Ｉ減少血清培地（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、カタログ番号５１９８５－０２６）において、サーモスタットで調整したインキュベーターにおいて３７℃で保存した。ｍＣｈｅｒｒｙ^＋コロニーを拾い上げた後２～８継代のブタＥＰＳＣ株を、胚注入のため使用した。ブタＥＰＳＣを、ｐＥＰＳＣＭ培地において、有糸分裂的に不活性化したＳＴＯフィーダーまたはＭＥＦ細胞上のいずれかで培養した。注入の２日前、培地を、ＷＨ－４－０２３（ＳＲＣｉ、ＴＯＣＲＩＳ、カタログ番号５４１３）を含まないｐＥＰＳＣＭ培地に切り替えた。注入の前日、培地を、ＷＨ－４－０２３を含まず、ヘパリン（５ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ、カタログ番号９０４１－０８－１）および１０ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦ（ＳＣＩ）を追加で添加したｐＥＰＳＣＭ培地で置き換えた。注入の４時間前に、培地を、ＷＨ－４－０２３を含まない、５ｎｇ／ｍｌヘパリン、１０ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦ（ＳＣＩ－ＳｔｅｍＣｅｌｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、ｔｈｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣａｍｂｒｉｄｇｅ）、１０ｎｇ／ｍｌＬｉｆ（ＳＣＩ）、５μＭＹ２７６３２（ＲＯＣＫｉ、Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号１２５４）、２０ｎｇ／ｍｌヒト組み換えアクチビンＡ（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号７８００１）および１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、ロット４２Ｑ０１５４Ｋ、カタログ番号１０２７０－１０６）を添加したｐＥＰＳＣＭ培地で置き換えた。注入のため、ＥＰＳＣを、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号Ｌ１１－００３）を用いて培養ディッシュから剥離し、注意深く再懸濁し、５０μｇ／ｍｌビタミンＣ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号４９７５２）、０．１μＭＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ３ｉ、ＴＯＣＲＩＳ、カタログ番号４４２３）、２０ｎｇ／ｍｌヒト組み換えアクチビンＡ（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号７８００１）、１０ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦ（ＳＣＩ）、１０ｎｇ／ｍｌＬｉｆ（ＳＣＩ）、５ｎｇ／ｍｌヘパリンおよび５μＭＹ２７６３２（ＲＯＣＫｉ、Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号１２５４）を添加したＭ１５培地の滴５００μｌに蒔いた。ブタの胚を１回洗浄し、２０ｎｇ／ｍｌヒト組み換えアクチビンＡ（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号７８００１）、１０ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦ（ＳＣＩ）、５μＭＹ２７６３２（ＲＯＣＫｉ、Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号１２５４）および１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、ロット４２Ｑ０１５４Ｋ、カタログ番号１０２７０－１０６）を添加したＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）Ｉ（１×）＋ＧｌｕｔａｍＭＡＸ（商標）－Ｉ減少血清培地（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、カタログ番号５１９８５０２６）の滴５００μｌに蒔いた。注入滴を、マイクロインジェクションシステム（ＴｒａｎｓｆｅｒｍａｎａｎｄＣｅｌｌＴｒａｍＶａｒｉｏマイクロマニピュレーター、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を備えた位相差倒立顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ３５Ｍ、ＣａｒｌＺｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、ドイツ）下で注入プレートに蒔き、鉱油でカバーした。およそ６～８細胞を含有する幹細胞凝集塊を、ブタ桑実胚の卵割球間に注入した。その後、胚を、５０μｇ／ｍｌビタミンＣ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号４９７５２）、０．１μＭＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ３ｉ、ＴＯＣＲＩＳ、カタログ番号４４２３）、２０ｎｇ／ｍｌヒト組み換えアクチビンＡ（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号７８００１）、１０ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦ（ＳＣＩ）、１０ｎｇ／ｍｌＬｉｆ（ＳＣＩ）、５ｎｇ／ｍｌヘパリンおよび５μＭＹ２７６３２（ＲＯＣＫｉ、Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号１２５４）を添加したＭ１５培地において２回洗浄し、胚移入まで４時間インキュベートするか、または一晩培養し、次いで、共焦点顕微鏡解析のため固定した。

６．１３インビトロで培養したブタ胚盤胞のキメラ化の評価
ブタキメラ胚盤胞を、３．７％ホルムアルデヒド溶液（ＨｏｎｅｙｗｅｌｌＲｉｅｄｅｌ－ｄｅＨａａｅｎ（商標）、カタログ番号１６３５）において、１５分間、室温で固定した。その後、胚を、０．２μＭＳｉＲ－ＤＮＡ（Ｓｐｉｒｏｃｈｒｏｍｅ、スイス）と３０分間、３７℃でインキュベーションして、核を視覚化した。胚盤胞におけるブタ幹細胞の局在化および増殖を、共焦点スクリーニング顕微鏡（ＬＳＭ５１０、Ｚｅｉｓｓ）を使用して解析した。残っている胚を、０．５％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、ロット４２Ｑ０１５４Ｋ、カタログ番号１０２７０－１０６）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号ＰＳ－Ｂ）を添加したＤＰＢＳにおいて、４℃でさらなる解析のため保存した。

６．１４凍結切片および免疫蛍光染色
２５～２７日目のブタ胎児を、妊娠したメスのブタから取り出し、頭と尾の軸に沿って二分割した。第一の半分の胎児を、４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ６１４８）において、４℃で一晩固定し、その後、凍結保存のため、３０％スクロース溶液（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号０３８９）に移した。第二の半分を、ＦＡＣＳおよび遺伝子型同定解析の対象にした。固定した半分の胎児を、ＯＣＴ化合物（ＣｅｌｌＰａｔｈ、カタログ番号１５２１２７７６）で包埋し、ドライアイス上で凍結した。切片（厚さ１０μｍ）を、Ｌｅｉｃａクリオスタット上で切断した。切片を、０．１％トリトン－１００（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ８７８７）で３０分間透過処理し、次いで、３０分間、５％ロバ血清（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ９６６３）および１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ２１５３）でブロッキングした。ｍＣｈｅｒｒｙおよび他の抗体の共免疫蛍光を行い、ｍＣｈｅｒｒｙおよび宿主系統マーカーを発現している注入したドナーブタＥＰＳＣの共局在化を調べた。ＰＧＣＬＣＥＢの凍結切片の免疫蛍光染色のため、ＥＢを、４％ＰＦＡにおいて約４時間または一晩、４℃で固定し、凍結切片のためＯＣＴ化合物において包埋した。それぞれの切片の厚さは、１０μｍであった。切片を、まず、０．１％トリトンで透過処理し、５％ロバ血清プラス１％ＢＳＡを用いてブロッキングし、続いて、１次抗体と１～２時間、室温で、または一晩冷却室でインキュベーションした。蛍光コンジュゲート２次抗体を使用して、スライドを室温で１時間インキュベーションした。抗体処理後、試料を、１０μｇ／ｍｌＤＡＰＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号６２２４８）で１０分間、対比染色して、核をマーキングし、蛍光顕微鏡下で観察した。抗体を、補足表９に列挙する。

６．１５切開したブタキメラ組織およびＰＧＣＬＣのためのＥＢのフローサイトメトリー
２５～２７日目のキメラにおけるドナーｍＣｈｅｒｒｙ^＋ブタＥＰＳＣの寄与を解析するために、半分の胎児を、いくつかの身体の部分（頭部、胴体および尾部）を表す小片に切開した。切開した組織および胎盤を、１．０ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１７１０４０１９）で１～３時間、３７℃、シェーカー上で消化した。ピペットを使用して、組織ブロックに打撃を与え、これらを単一細胞に分離させた。分離した細胞を、３５μｍのナイロンメッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５２２３５）を用いて濾過して、組織凝集塊を除去した。遠心分離後、細胞を、製造元のマニュアル（ＢＤＣｙｔｏｆｉｘ、カタログ番号５５４６５５）に従い固定培地を使用して固定し、洗浄した細胞を、フローサイトメトリーを用いて解析する前、４℃で、０．１％ＮａＮ３（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号１９９９３１）および５％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０２７０）を添加したＰＢＳにおいて保存した。全ての試料を、ＢＤＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ血球計算器を使用し、解析した。５６１ｎｍ（６１０／２０バンドパスフィルター）および４８８ｎｍ（５２５／５０バンドパスフィルター）チャンネルを使用して、ｍＣｈｅｒｒｙを検出し、自己蛍光を除外した。ＰＧＣＥＢを、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２５５００－０５４）を用いて、３７℃で１５分間、トリプシン処理し、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５コンジュゲート抗ＴＮＡＰ抗体を用いて染色した。５６１ｎｍ（６１０／２０馬ンドパスフィルター））および４８８ｎｍ（７１０／５０バンドパスフィルター）チャンネルを使用して、ＮＡＮＯＳ３－Ｈ２ＢｍＣｈｅｒｒｙ^＋／ＴＮＡＰ^＋細胞を検出した。ＦＡＣＳデータを、Ｆｌｏｗｊｏソフトウエアにより解析した。これらの実験において使用した抗体を、補足表９に列挙する。

６．１６ブタキメラ胚の遺伝子型同定
ブタ胎児のゲノムＤＮＡを、上記の切開した身体の部分およびＤＮＡＲｅｌｅａｓｙキット（Ａｎａｃｈｅｍ、カタログ番号ＬＳ０２）を使用し、ＦＡＣＳのため調製した胎盤の分離させた細胞から抽出した。Ｈ２ＢｍＣｈｅｒｒｙのゲノムＤＮＡＰＣＲを利用して、ドナー細胞の存在を検出した。ブタＰＲＤＭ１座位における領域の増幅は、ゲノムＤＮＡの品質およびＰＣＲ対照として役立った。全てのＰＣＲプライマーを、補足表１０に列挙する。

６．１７ブタＥＰＳＣのＰＧＣＬＣへの分化
転写因子介在性ブタＰＧＣＬＣ導入実験のため、ｐｉｇｇｙＢａｃベースのＰＢ－ＴＲＥ－ＮＡＮＯＧ、ＰＢ－ＴＲＥ－ＢＬＩＭＰ１、ＰＢ－ＴＲＥ－ＴＦＡＰ２ＣおよびＰＢ－ＣＡＧ－ＳＯＸ１７－ＧＲ発現コンストラクトを、ブタＮＡＮＯＳ３－２Ａ－Ｈ２ＢｍＣｈｅｒｒｙレポーターＥＰＳＣ^ｅｍｂ（Ｋ３系統、オス）に、ＰＢ－ＣＡＧＧ－ｒｔＴＡ－ＩＲＥＳ－ピューロマイシンおよびトランスポサーゼ発現プラスミドと共に共エレクトロポレーションした。プラスミドを有するｐＥＰＳＣ^Ｅｍｂを、０．３μｇ／ｍｌピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ８８３３）を加え２日間おくことにより、選択した。その後、トランスジェニックＮＡＮＯＧ、ＢＬＩＭＰ１およびＴＦＡＰ２Ｃの発現を、１．０μｇ／ｍｌＤｏｘ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ９８９１）により、示した期間誘導した。ＳＯＸ１７発現プラスミドは、ハイグロマイシン選択カセットを有するので、１５０μｇ／ｍｌハイグロマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０６８７０１０）を使用して、ＰＢ－ＣＡＧ－ＳＯＸ１７－ＧＲを遺伝子導入した細胞を選択した。ＳＯＸ１７タンパク質を、ＧＲ（ヒトグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメイン）と融合させた。このシステムにより、２μｇ／ｍｌデキサメタゾン（Ｄｅｘ）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ２９１５）の添加による、ＳＯＸ１７の核移行の誘導が可能になる。前誘導のため、ｐＥＰＳＣ^Ｅｍｂを、分離することなく０．１％２型コラゲナーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１７１０１０１５）により、ＳＴＯフィーダー層から検出し、ゼラチン化プレート上、５μＭＲＯＣＫｉＹ－２７６３２（Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号１２５４）、２０μｇ／ｍｌアクチビンＡ（ＳＣＩ）および１．０μｇ／ｍｌＤｏｘまたは１．０ｍｇ／ｍｌＤｅｘを添加したＭ１５培地に播種した。導入および前分化の１２時間後、細胞を、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２５５００－０５４）を使用して集め、ＰＧＣＬＣ培地１００ｍｌ中密度５，０００～６，０００個の細胞／ウェルで、超低接着Ｕ底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号７００７）に蒔いた。３～４日後、ＥＢを、解析のため集めた。ＰＧＣＬＣ培地は、アドバンスドＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１２６３３－１２）、１％Ｂ２７栄養補助剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１７５０４０４４）、１×グルタミンペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１１４０－０５０）、１×ＮＥＡＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１０３７８－０１６）、０．１ｍＭ２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ６２５０）ならびに以下のサイトカイン：５００ｎｇ／ｍｌＢＭＰ２（ＳＣＩ）、１０ｎｇ／ｍｌヒトＬＩＦ（ＳＣＩ）、１００ｎｇ／ｍｌＳＣＦ（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号２５５－ＳＣ－０１０）、５０ｎｇ／ｍｌＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号２３６－ＥＧ－２００）および１０μＭＲＯＣＫインヒビター（Ｙ－２７６３２、Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号１２５４）からなる。

ヒトＰＧＣＬＣについて、２つのｈＥＰＳＣ株のＰＧＣ分化ポテンシャルを、系列導入法を用いて試験する［６］。ヒト前中胚葉（前ＭＥ）を、まず、前ＭＥ培地（１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（ＳＣＩ）、３μＭＣＨＩＲ９９０２１および１０μＭＲＯＣＫｉＹ－２７６３２を添加した、アドバンスドＲＰＭＩ１６４０培地、１％Ｂ２７栄養補助剤、１×ＮＥＡＡおよび１×グルタミンペニシリン－ストレプトマイシン）において１２時間誘導した。前ＭＥを、単一細胞にトリプシン処理し、ＣｏｒｎｉｎｇＣｏｓｔａｒ超低接着複数ウェル９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号７００７）に、１ウェル当たり４，０００～５，０００個の細胞を、ブタＰＧＣＬＣ導入のため使用したＰＧＣＬＣ培地１００μｌに播種した。細胞凝集を改善するために、全てのＰＧＣＬＣ導入実験において、０．２５％（ｖ／ｖ）ポリ－ビニルアルコール（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号３４１５８４）を、基本培地において加えた。

６．１８ブタおよびヒトＥＰＳＣのテラトーマアッセイ
ブタおよびヒトＥＰＳＣを、３０％マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５４２３０）および５μＭＲｏｃｋインヒビターＹ－２７６３２（Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号１２５４）を添加したＰＢＳにおいて再懸濁した。５×１０^６個のブタまたはヒトＥＰＳＣを、８週齢のオスのＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ、ＴｈｅＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）の両方の背側側腹部に皮下注射した（１回の注射当たり１００μｌ）。ヒトおよびブタＥＰＳＣは、８および１０週以内に、目に見えるテラトーマを形成した。テラトーマのサイズが、１．２ｃｍ^２に達したとき、これらを切開し、一晩、１０％リン酸緩衝化ホルマリンにおいて固定し、切片化の前にパラフィンにおいて包埋した。

６．１９ブタおよびヒトＥＰＳＣのＥＢ形成アッセイ
ブタおよびヒトＥＰＳＣを、トリプシン処理し、ゼラチン化６ウェルプレートにおいて、密度４×１０^６個の細胞／ウェルで、前分化のため播種した。２０ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（ＳＣＩ）および５μＭＲｏｃｋインヒビターＹ－２７６３２を添加したＭ１５培地を使用して、再度蒔いた細胞を培養した。翌日、細胞を、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２５５００－０５４）を使用してはがし、超低細胞接着Ｕ底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号７００７）に、Ｍ１０培地２００μｌ中の密度５，０００～６，０００個の細胞／ウェルで蒔いた。７～８日間の成長後、ＥＢを、解析のため集めた。０．２５％（ｖ／ｖ）ポリ－ビニルアルコール（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号３４１５８４）を、細胞凝集を助けるために培地に加えた。

６．２０ブタおよびヒトＥＰＳＣの遺伝子導入
ＳＲＣインヒビターＷＨ－４－０２３（ｐＥＰＳＣＭ－ＳＲＣｉ）を含まないｐＥＰＳＣＭは、ｐＥＰＳＣ遺伝子導入前に調製する必要がある。ｐＥＰＳＣが、４０～５０％コンフルエンスに達すると、培地を、ｐＥＰＳＣＭ－ＳＲＣｉに切り替え、さらに１日（－２日目）間、細胞を培養した。翌日（－１日目）、５％ＦＢＳを、ｐＥＰＳＣＭ－ＳＲＣｉ培地に加え、細胞を一晩培養した。遺伝子導入の日（０日目）に、ブタＥＰＳＣを、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２５５００－０５４）を用いてトリプシン処理し、Ｍ１０培地を用いた単一細胞に分離した。遠心分離後、１～１．５×１０^６個の細胞を、プラスミドＤＮＡ５～６μｇを含有するＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号３１９８５０６２）１００μｌにおいて再懸濁した。ＡｍａｘａＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒマシーン（Ｌｏｎｚａ）を使用して、プログラムＡ－０２３を用いてエレクトロポレーションを行った。遺伝子導入後、遺伝子導入した細胞の半分を、薬物耐性ＳＴＯフィーダー上、１０ｃｍディッシュに播種し、５μＭＲＯＣＫｉＹ－２７６３２（Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号１２５４）および５％ＦＢＳを添加したｐＥＰＳＣＭを使用して、遺伝子導入した細胞を培養した。Ｙ－２７６３２およびＦＢＳを、１日目に培地から除去した。薬物を、２日目からｐＥＰＳＣＭ培地に加えて、遺伝子導入したコロニーを選択した。選択のため使用した薬物濃度は、ピューロマイシン（０．３μ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ８８３３）；Ｇ４１８（１５０μｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０１３１０２７）；ハイグロマイシン（１５０μｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０６８７０１０）である。３日間の選択後（５日目）、培地を、継続的選択のための薬物を添加したｐＥＰＳＣＭ－ＳＲＣｉに変えた。生存したコロニーを、７～８日目に拾い上げた。遺伝子導入および選択中、培養液は、毎日取り換えるべきである。ヒトＥＰＳＣ遺伝子導入のため、１０％ＫＳＲおよび５％ＦＢＳをｈＥＰＳＣＭに加えて、翌日の０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡを用いた収集前に、ｈＥＰＳＣ（７０％～８０％コンフルエンス）を一晩培養した。Ｍ１０培地をまた使用して、細胞を分離し、トリプシンを中和した。一旦遠心分離し、プラスミドＤＮＡを含有するＰＢＳ溶液３００～４００μｌを使用して、細胞を、密度１ｍｌ当たり１０００００００個の細胞で再懸濁した。細胞／ＤＮＡ混合物３００～４００μｌを取り、エレクトロポレーション用の０．４ｃｍのエレクトロポレーションキュベット（ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＸｃｅｌｌＳｙｓｔｅｍ；Ｂｉｏ－Ｒａｄ；３２０Ｖ、５００μＦ、０．４ｃｍキュベット）に加えた。５×１０^５個の遺伝子導入した細胞を、薬物耐性ＳＴＯフィーダー上、５μＭＲＯＣＫｉＹ－２７６３２（Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号１２５４）および１０％ＫＳＲを添加したｈＥＰＳＣＭを含有する１０ｃｍディッシュにおいて蒔いた。Ｙ－２７６３２およびＫＳＲを、１日目の培養物から除去し、ピューロマイシンを、２日目からの選択のため加えた。コロニーを、７～８日目辺りに拾い上げた。上記の方法に従い、選択したブタおよびヒトＥＰＳＣコロニーを拡大させた。

６．２１ブタおよびヒトＥＰＳＣ細胞におけるＣｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９介在性ゲノム編集
ＥＦ１ａ－Ｈ２ＢｍＣｈｅｒｒｙ－ｉＲＥＳ－ＰｕｒｏカセットをブタＲＯＳＡ２６座位に標的化するために、Ｒｏｓａ５’および３’相同性アームが隣接するカセットを有する標的化ベクターを、構築した。５’および３’相同性アームを、ＩＤＴ会社（６５０ｂｐの５’アーム、Ｃｈｒ１３：６５７５６２７２－６５７５６９２３；６４８ｂｐの３’アーム、Ｃｈｒ１３：６５７５５６２０－６５７５６２６７）から合成した。配列５’ＣＡＡＴＧＣＴＡＧＴＧＣＡＧＣＣＣＴＣＡＴＧＧ－３’を、ｇＲＮＡ／ＣＡＳ９の標的として設計した。エレクトロポレーション後、ピューロマイシン（０．３μ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ８８３３）を使用して、標的化した細胞を選択した。拾い上げたコロニーの遺伝子型同定解析により、標的化効率が、約２５％～３０％であることが明らかになった。ｐＥＰＳＣからのｐＰＧＣＬＣ分化を調べるために、Ｔ２Ａ－Ｈ２ＢｍＣｈｅｒｒｙ発現カセットを、ブタＮＡＮＯＳ３のコード配列のすぐ下流にインフレームでノックインした。相同性アームをまた、ＩＤＴ会社（６９９ｂｐの５’アーム、ｃｈｒ２：６５２７５４５６－６５２７６１４８；６９９ｂｐの３’アームｃｈｒ２：６５２７４７４９－６５２７５４４７）から合成した。終止コドン前の２０ｂｐ（５’－ＴＣＣＡＣＴＴＣＴＧＣＣＴＡＡＧＡＧＧＣＴＧＧ－３’）配列を、ｇＲＮＡ／ＣＡＳ９により標的化して、切断を導入し、相同組み換えを仲介した。Ｇ４１８（１５０μｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０１３１０２７）を用いた選択後、ゲノムＤＮＡを、拾い上げたコロニーから抽出し、遺伝子型同定ＰＣＲの対象にし、これにより、約２５％～３０％の比較可能な標的化効率が明らかになった。正しく標的化したクローンの核型解析を行い、使用したクローンにおける正常な核型を確認した。同じストラテジーを利用して、ヒトＯＣＴ４－Ｔ２Ａ－Ｈ２Ｂ－ＶｅｎｕｓおよびＣＤＸ２－Ｔ２Ａ－Ｈ２Ｂ－ＶｅｎｕｓレポーターＥＰＳＣ株を作製した。ヒトＯＣＴ４座位について、相同性アームは、６１９ｂｐの５’アーム（ｃｈｒ６：３１１６４６０４－３１１６５２２２）および６３６ｂｐの３’アーム（ｃｈｒ６：３１１６３９６５－３１１６４６００）である。ｇＲＮＡ／ＣＡＳ９標的化配列は、５’ＴＣＴＣＣＣＡＴＧＣＡＴＴＣＡＡＡＣＴＧＡＧＧ－３’である。ＣＤＸ２相同性アームは、４７８ｂｐの５’アーム（ｃｈｒ１３：２７９６３１１８－２７９６３５９５）および５５７ｂｐの３’アーム（ｃｈｒ１３：２７９６２５５８－２７９６３１１４）である。ｇＲＮＡ／ＣＡＳ９標的化配列は、５’－ＣＣＧＴＣＡＣＣＣＡＧＴＧＡＣＣＣＡＣＣＧＧＧ－３’である。それぞれのエレクトロポレーションのため、プラスミドＤＮＡ約５μｇ：ＣＡＳ９１．５μｇ、ｇＲＮＡ１．５μｇおよびドナーベクター２μｇを使用した。

６．２２ルシフェラーゼアッセイ
ＴＯＰｆｌａｓｈアッセイのため、２．０×１０^６個の細胞を、ＴＯＰｆｌａｓｈプラスミド１０μｇを用いて、遺伝子導入した。ｐＲＬ－ＴＫ（ウミシイタケ）ベクター５μｇをまた、標準化のため遺伝子導入した。細胞を、ＸＡＶ９３９（ＷＮＴｉ、２．５μＭ、カタログ番号Ｘ３００４）を含むか、または含まないｐＥＰＳＣＭおよびｈＥＰＳＣＭにおいて、４８時間、２４ウェルプレートに１：９で分けた。細胞溶解物を、ルシフェラーゼアッセイのため集めた。ブタＥＰＳＣにおけるＯｃｔ４発現の制御パターンを決定するため、レポーターコンストラクト１０μｇを、ｐＲＬ－ＴＫ５μｇと共に、１．５×１０^６個のｐＥＰＳＣにエレクトロポレーションした。アッセイを、４８時間後に行った。全てのルシフェラーゼアッセイを、Ｄｕａｌ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ２９２０）を使用して行った。

６．２３定量的リアルタイムＰＣＲ解析
トータルＲＮＡを、培養した細胞のためＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７４１０６）、または選別したＮＡＮＯＳ３－ｍＣｈｅｒｒｙ^＋細胞のためＲＮｅａｓｙＭｉｃｒｏＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７４０３４）を使用して単離した。ＲＮＡを続いて定量し、ｇＤＮＡＷｉｐｅＯｕｔを用い処理して、ゲノムＤＮＡを除去した。相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２０５３１１）を使用して調製した。ＲＴ－ｑＰＣＲプライマーまたはＴａｑＭａｎＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｓｓａｙｓ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、補足表１０および１１において列挙する。ＡＢｓｏｌｕｔｅＢｌｕｅｑＰＣＲＲＯＸＭｉｘ（ＡＢｇｅｎｅ、カタログ番号ＡＢ４１３８Ｂ）を、プローブベースのｑＰＣＲアッセイのため使用し、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＲＯＸｑＰＣＲＭａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号３３０５２３）を、プライマーベースのｑＰＣＲアッセイのため使用した。全てのｑＰＣＲ反応を、ＡＢＩ７９００ＨＴＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で行った。ｑＰＣＲ解析のため使用した全てのプライマーおよびプローブについての情報を、補足表１０および１１に提供する。遺伝子発現を、ΔＣｔ法を使用して、ＧＡＰＤＨと比較して決定した。データを、平均およびｓ．ｄ．として示す。

６．２４ＤＭＲ解析
バイサルファイト処理を、製造元の推奨に従い、ＥｐｉＴｅｃｔＢｉｓｕｌｆｉｔｅＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号５９１２４）を使用して行った。ヒトＥＬＦ５およびブタＯＣＴ４ならびにＮＡＮＯＧプロモーター領域のためのゲノムＤＮＡＰＣＲを、以前に記載されたプライマー対［７～９］を使用して行った。ＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ－ＴＥａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ａ１３６０）にクローニングし、両方の末端から配列決定した。無作為に選択したクローンを、それぞれのプロモーターについてのＭ１３フォワードおよびＭ１３リバースプライマーを用いて配列決定した。この解析において使用したプライマーを、補足表１０において提供する。

６．２５培養した細胞についての免疫染色
ＫＲＴ７のＴＦＡＰ２ＣおよびＧＡＴＡ３を用いた二重染色のため、分化したｈＥＰＳＣを、４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ６１４８）溶液において固定し、３％ヤギ血清および１％ＢＳＡでブロッキングし、マウス抗ＫＲＴ７抗体と共に、４℃で一晩、インキュベーションした。次いで、細胞を、ＰＢＳ溶液で洗い、Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ２次抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ＡＢ１５０１０９）と共に、１時間室温でインキュベーションした。ＰＢＳＴ（０．３％トリトンを含むＰＢＳ溶液）を用いた透過処理後、細胞を、ウサギ抗ＴＦＡＰ２ＣおよびＧＡＴＡ３抗体と共に、４℃で一晩、インキュベーションした。３日目に、細胞をＰＢＳＴで洗い、Ａｌｅｘａ５９４コンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ２１２０７）と共に、１時間、室温でインキュベーションし、ＤＡＰＩを用いて対比染色した。分化したブタおよびヒトＥＰＳＣにおけるＴｕｊ１、α－ＳＭＡ、ＡＦＰおよびＫＲＴ７免疫染色のため、細胞を固定し、それぞれ、マウス抗ＴＵＪ１、α－ＳＭＡ、ＡＦＰおよびＫＲＴ７抗体と共に、４℃で一晩、インキュベーションした。細胞を、ＰＢＳ溶液で洗い、Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ＡＢ１５０１０９）および５９４ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ２１２０７）と共にインキュベーションした。抗体処理後、試料を、１０μｇ／ｍｌＤＡＰＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号６２２４８）を用いて染色して、核をマーキングした。ブタおよびヒト多能性マーカー免疫染色のため、ブタおよびヒトＥＰＳＣを、４％ＰＦＡ／ＰＢＳ溶液において固定し、３％ヤギ血清（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ９０２３－１０ＭＬ）および１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ２１５３）を有するＰＢＳ溶液（細胞表面マーカーのため）または３％ヤギ血清、１％ＢＳＡおよび０．１％トリトン（Ｓｉｇａｍ、カタログ番号Ｔ８７８７）を有するＰＢＳ溶液（細胞内マーカーのため）においてブロッキングし、細胞表面抗体、ＳＳＥＡ－１、ＳＳＥＡ－４、Ｔｒａ－１－６０、Ｔｒａ－１－８１または細胞内抗体、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧおよびＳＯＸ２と共に、４℃で一晩、インキュベーションした。細胞を洗い、Ａｌｅｘａ４８８または５９４コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ、マウスＩｇＭ、ウサギＩｇＧと共にインキュベーションし、ＤＡＰＩを用いて対比染色した。これらの実験において使用した抗体を、補足表９において提供する。

６．２６ウエスタンブロット
細胞全体の抽出物を、５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１５ＭＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、１％トリトンＸ－１００、１％デオキシコール酸ナトリウムおよび完全ミニＥＤＴＡフリータンパク質分解酵素インヒビターカクテル（ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１１８３６１７０００１）を含む溶解バッファーにおいて示した処理を用いて細胞から調製した。培養物が、７０～８０％コンフルエンスに達したとき、実験のための細胞を、同じバッチの培養物から集めた。生物学的複製物を含めて、意味ある結論を可能にした。タンパク質１０μｇを、電気泳動のため使用し、ニトロセルロースメンブレンに移した。メンブレンを、５％ミルクを用いてブロッキングし、抗体を用いて処理した。マウスまたはウサギ抗ＡＸＩＮ１、ＳＭＡＤ２／３、ｐ－ＳＭＡＤ２／３およびＡＬＰＨＡ－チューブリンの１次抗体を使用した。ウサギまたはマウスＩｇＧに対する西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート２次抗体を加えた。抗体処理後、ブロットを、ＥＣＬウエスタンブロット検出システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３２１０６）を使用して発展させた。これらの実験において使用した抗体を、補足表９において提供する。

６．２７ヒトＥＳＣ／ｉＰＳＣのＥＰＳＣへの転換
プライム型ヒトＥＳＣ株の転換のため、５×１０^４個のトリプシン処理した単一細胞を、５μＭＲＯＣＫインヒビターＹ－２７６３２（Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号１２５４）を添加したｂＦＧＦ含有標準培地において、１０ｃｍのＳＴＯフィーダープレート上に播種した。標準ヒトＥＳＣ培地：ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２１３３１－０２０）、２０％ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０８２８０２８）、１×グルタミンペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１１４０－０５０）、１×ＮＥＡＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１０３７８－０１６）、ならびに０．１ｍＭ２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ６２５０）および１０ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦ（ＳＣＩ）。１日後、培地を、ｈＥＰＳＣＭに切り替え、次いで、毎日、新たにした。大半の細胞の最初の分化後、ドーム形のｈＥＰＳＣコロニーが、約５～６日で出現し、これを、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２５５００－０５４）を用いた３～５分間の処理を使用し、ＳＴＯフィーダー層上、密度５×１０^４個の細胞／１０ｃｍディッシュで大量に拡大することができた。５～６日後、安定なドーム形の単一コロニーを拾い上げ、上記の方法に従い、拡大することができた。

６．２８ヒト線維芽細胞のＥＰＳＣへのリプログラミング
Ｍ２０培地を使用して、ヒト成人線維芽細胞ＧＭ０００１３を培養した。細胞を、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡにより、約８０％コンフルエントなＴ７５フラスコから集め、ＰＢＳ溶液を用いて１回洗浄した。遺伝子導入を、製造元のプロトコール（ＮＨＤＦＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）キット、カタログ番号ＶＰＤ－１００１）に従い、ＡｍａｘａＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒマシン（Ｌｏｎｚａ）を使用し、行った。ＤＮＡ５．０μｇを、遺伝子導入緩衝液１００μｌと予め混合した。ＤＮＡ混合物は、ＰＢ－ＴＲＥ－ｈＯＣＫＳ２．０μｇ、ＰＢ－ＴＲＥ－ＲＬ１．０μｇ、ＰＢ－ＥＦ１ａ－トランスポサーゼ１．０μｇおよびＰＢ－ＥＦ１ａ－ｒｔＴＡ１．０μｇからなる。これらのうち、ｈＯＣＫＳを、２Ａペプチドにより連結したＯＣＴ４、ｃＭＹＣ、ＫＬＦ４およびＳＯＸ２のヒトｃＤＮＡを用いて作製した。１×１０^６個の洗浄したヒト成人線維芽細胞を、溶液／ＤＮＡ混合物１００μｌにおいて再懸濁し、プログラムＵ－２０を使用してエレクトロポレーションした。０．２×１０^６個の遺伝子導入した細胞を、ＳＴＯフィーダー層上（１０ｃｍディッシュ）、５０μｇ／ｍｌビタミンＣ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号４９７５２－１００Ｇ）を添加したＭ１５培地において播種した。Ｄｏｘ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ９８９１）を、培地中１．０μｇ／ｍｌの終濃度まで加えて、リプログラミングファクター発現を誘導した。導入の１２～１４日後、Ｄｏｘを除去し、培地を、Ｄｏｘ非依存性ヒトｉＰＳＣコロニーを選択するためのｈＥＰＳＣＭに切り替えた。生存したコロニーを、ｈＥＰＳＣＭに、約２１日目に拾い上げ、安定なｉＥＰＳＣ株を拡大させた。

６．２９ヒトＥＰＳＣの栄養膜系統への分化
ｈＥＰＳＣを、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを用いて分離し、ゼラチン化６ウェルプレートにおいて、密度０．１×１０^６個の細胞／ウェルで播種した。細胞を、５μＭＲＯＣＫインヒビターＹ－２７６３２を添加した２０％ＫＳＲ培地において、１日間培養した。２０％ＫＳＲ培地：ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２１３３１－０２０）、２０％ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０８２８－０２８）、１×グルタミンペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１１４０－０５０）、１×ＮＥＡＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１０３７８－０１６）および０．１ｍＭ２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ６２５０）。２日目から、異なる組み合わせのＴＧＦβインヒビターＳＢ４３１５４２（１０μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号１５１４）、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ、カタログ番号５０２０－ＢＰ）およびＦＧＦ受容体インヒビターＰＤ１７３０７４（０．１μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号３０４４）を、２０％ＫＳＲ培地に加えて、栄養膜分化を開始させた。細胞を、解析のため、示した時間点で集めた。

６．３０安定なＴＳＣ細胞株のＥＰＳＣからの誘導
単一の分離したｈＥＰＳＣおよびｐＥＰＳＣ^Ｅｍｂを、１ｍｇ／ｍｌＣｏｌＩＶ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５４２３３）を用いて予めコーティングした６ウェルプレート上に、密度１ウェル当たり２，０００個の細胞で蒔き、マイナー変更を有する記載された［１０］ｈＴＳＣ培地において培養した。ｈＴＳＣ培地：０．１ｍＭ２－メルカプトエタノール、０．２％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０２７０）、０．５％ペニシリン－ストレプトマイシン、０．３％ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５２６００３７）、１％ＩＴＳＸ栄養補助剤（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号５１５０００５６）、５０μｇ／ｍｌＶｃ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号４９７５２－１００Ｇ）、５０ｎｇ／ｍｌＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号２３６－ＥＧ－２００）、２μＭＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ３ｉ、ＴＯＣＲＩＳ、カタログ番号４４２３）、０．５μＭＡ８３－０１（ＴＯＣＲＩＳ、カタログ番号２９３９）、１μＭＳＢ４３１５４２（Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号１５１４）、０．８μＭＶＰＡ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ、カタログ番号７２２９２）および５μＭＹ２７６３２（Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号１２５４）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２１３３１－０２０）。約７～９日の培養後、ＴＳＣ様形態を有するコロニーを拾い上げ、ＴｒｙｐＬＥ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１２６０５０３６）において分離し、１ｍｇ／ｍｌＣｏｌＩＶを用いて予めコーティングしたプレート上に再度蒔いた。４～５継代後、細胞を、記載される方法［１０］を用いた合胞体栄養細胞（ＳＴ）および絨毛外栄養膜（ＥＶＴ）分化試験のため集めた。

６．３１ブタＴＳＣ胚注入
Ｈ２ＢｍＣｈｅｒｒｙ（ＥＦ１ａ－Ｈ２ＢｍＣｈｅｒｒｙおよびＣＡＧＧ－Ｈ２ＢｍＣｈｅｒｒｙ）を遺伝子導入した２つのブタＴＳＣ株（ｐＫ３－ＴＳＣ－＃１およびｐＫ３－ＴＳＣ－＃３）を、胚注入実験のため使用した。２０継代での細胞を、ＴｒｙｐＬＥ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１２６０５０３６）を用いて簡単に処理し、培養ディッシュから優しく叩いて落とし、ヒトＴＳＣ培地において再懸濁した。遠心分離後、ＴＳＣを、１１４ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ５８８６）、３．２ｍＭ塩化カリウム（ＫＣｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｐ－５４０５）、０．４ｍＭナトリウム二リン酸水素一水和物（ＮａＨ_２ＰＯ_４×Ｈ_２Ｏ、Ｍｅｒｃｋ、カタログ番号１０６３４６）、０．５ｍＭ塩化マグネシウムヘキサ水和物（ＭｇＣｌ_２×６Ｈ_２Ｏ、Ｒｏｔｈ、カタログ番号ＨＮ０３．２）、２ｍＭ重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ４０１９）、１０ｍＭＨＥＰＥＳ（Ｒｏｔｈ、カタログ番号９１０５．３）、１０ｍＭナトリウムＤＬ－乳酸溶液（６０％）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｌ１３７５）、１００Ｕ／ＬペニシリンＧカリウム塩ＢｉｏＣｈｅｍｉｃａ（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、カタログ番号Ａ１８３７）、５０ｍｇ／Ｌ硫酸ストレプトマイシンＢｉｏＣｈｅｍｉｃａ（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、カタログ番号Ａ１８５２）、０．２５ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｐ２２５６）、３２ｍＭスクロース（Ｍｅｒｃｋ、カタログ番号１０７６５３）、０．４％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ９６４７）および１０μＭＹ２７６３２（ＲＯＣＫｉ、Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号１２５４）からなるＴＬ－Ｈｅｐｅｓ２９６Ｃａフリー培地において再懸濁した。注射のため、ＴＳＣを、１０μＭＹ２７６３２（ＲＯＣＫｉ、Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号１２５４）を添加したＴＬ－Ｈｅｐｅｓ２９６Ｃａフリー培地の滴４００μｌにおいてインキュベーションした。その後、８～１０個の単一ＴＳＣを、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、ロット４２Ｑ０１５４Ｋ、カタログ番号１０２７０－１０６））および１０μＭＹ２７６３２（ＲＯＣＫｉ、Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号１２５４）を添加したＯｐｔｉ－ＭＥＭＩ（１×）＋ＧｌｕｔａｍＭＡＸ（商標）－Ｉ減少血清培地（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、カタログ番号５１９８５－０２６）において、圧力駆動のマイクロマニピュレーター（Ｚｅｉｓｓ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて、６日目のブタ単為生殖またはＩＶＦ胚に注入した。注入後、胚を２回洗浄し、１０００Ｕ／ｍｌＥＳＧＲＯ（登録商標）組み換えマウスＬＩＦタンパク質（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＥＳＧ１１０７）および１０μＭＹ２７６３２（ＲＯＣＫｉ、Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号１２５４）を添加したＤ１５培地において、１～２日間、３９℃、５％ＣＯ_２および５％Ｏ_２において培養した。その後、胚を、３．８％パラホルムアルデヒドを用いて、１５分間、室温で固定し、０．５％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、ロット４２Ｑ０１５４Ｋ、カタログ番号１０２７０－１０６）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号ＰＳ－Ｂ）を添加したＤＰＢＳにおいて、４℃で保存した。

６．３２ＴＳＣを注入したブタ単為生殖胚の免疫蛍光染色
固定した単為生殖胚盤胞を、０．５％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、ロット４２Ｑ０１５４Ｋ、カタログ番号１０２７０－１０６）を添加したＤＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ５６５２－１０Ｘ１Ｌ）において３回洗浄し、０．５％トリトン（登録商標）Ｘ－１００（Ｍｅｒｃｋ、カタログ番号１０８６０３）および０．５％ＦＣＳを添加したＤＰＢＳにおいて、１時間透過処理した。その後、胚を、ＤＰＢＳにおいて３回洗浄し、１時間、室温で、ブロッキング溶液（共染色ＧＡＴＡ３／ＣＤＸ２／ｍＣｈｅｒｒｙ：ＰＢＳ中の５％ウマ血清（Ｓｉｇｍａ、ロット１４Ｍ１７５、カタログ番号Ｈ１２７０）および０．２％トリトン（登録商標）Ｘ－１００）においてブロッキングした。ブロッキング後、胚を、ＤＰＢＳおよび０．５％ＦＣＳにおいて希釈した１次抗体と共に、一晩、４℃でインキュベーションした。翌日、胚を、ＧＡＴＡ３／ＣＤＸ２／ｍＣｈｅｒｒｙのためいずれかの０．５％ウマ血清を添加したＤＰＢＳにおける数回の洗浄を通じて移した。２次抗体（ｍＣｈｅｒｒｙ：ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒＰｌｕｓ５５５、Ａ３２７９４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＧＡＴＡ３／ＣＤＸ２：ロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒＰｌｕｓ４８８、Ａ３２８１４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、１：１０００で０．５％ウマ血清を添加したＰＢＳにおいて希釈し、インキュベーションを、室温で１時間行い、続いて、上記の通り洗浄した。核を視覚化するために、胚を、ＳｉＲ－Ｈｏｅｃｈｓｔ（Ｓｐｉｒｏｃｈｒｏｍｅ、ＳｉＲ－ＤＮＡｋｉｔ、カタログ番号ＳＣ００７）において、ＤＰＢＳ中の１：５００希釈で、１時間、３７℃でインキュベーションし、共焦点画像化システムＬＳＭ５１０（ＣａｒｌＺｅｉｓｓＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇＧｍｂＨ、ドイツ）を使用して直ちに調べた。

６．３３ブタおよびヒトＴＳＣ病変アッセイ
ブタおよびヒトＴＳ細胞を、ＴｒｙｐＬＥ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１２６０５０３６）を用いて分離し、３０％マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５４２３０）および１０μＭＲｏｃｋインヒビターＹ－２７６３２（Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号１２５４）を添加したＰＢＳにおいて再懸濁した。５×１０^６個のブタまたはヒトＴＳＣを、８週齢のオスのＳＣＩＤマウスの両背側側腹部に皮下注射した（１回の注射当たり１００μｌ）。ヒトおよびブタＴＳＣは、７～１０日以内に目に見える病変を形成した。病変を切開し、４％リン酸緩衝化ホルマリンにおいて一晩固定し、切片化のため、ＯＣＴ化合物（ＣｅｌｌＰａｔｈ、カタログ番号１５２１２７７６）およびパラフィンにおいて包埋した。

６．３４ＥＬＩＳＡ
ヒトＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、ｓＦｌｔ－１、ＣＧＡおよびｓＥｎｇについての酵素結合免疫吸着アッセイキットを、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓから得て、ヒト絨毛性ゴナドトロピンＥＬＩＳＡアッセイキットは、ＡＬＰＣＯＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓからであり、製造元の説明に従い行った。

６．３５ＥＰＳＣおよびｈＴＳＣにおける網羅的遺伝子発現のＲＮＡ－ｓｅｑ解析
培養物が、７０～８０％コンフルエンスに達したとき、ＲＮＡ調製のための細胞を、同じバッチの培養物から集めた。生物学的複製物を含めて、意味ある結論を可能にした。ヒトデータについては、ＧＥＮＣＯＤＥｖ２７からのタンパク質コード転写物を使用し、ＰＡＲ＿Ｙ領域からの転写物を、参照から取り除き、マウスデータについては、ＧＥＮＣＯＤＥｖＭ１６からのタンパク質コード転写物を使用し、ブタデータについては、ＥｎｓｅｍｂｌｂｕｉｌｄＳｓｃｒｏｆａ１１．１を使用した。転写物ｆａｓｔａファイルを、ＧＥＮＣＯＤＥまたはＥｎｓｅｍｂｌからダウンロードし、ＥＲＣＣ配列を、それぞれのビルドに加えた。次いで、転写物プラスＥＲＣＣｆａｓｔａファイルを、デフォルトパラメーターを使用したｓａｌｍｏｎ（バージョン０．９．１）［１１］を使用して、インデックスをつけた。ＧＥＮＣＯＤＥ転写参照を使用した際、「－－遺伝子コード」フラッグを、インデックスをつけている間に含めて、ｓａｌｍｏｎが転写物ｉｄを正しく処理することを確実にした。ヒトナイーブ型およびプライム型ＥＳＣＲＮＡ－ｓｅｑ［１２］について、ｆａｓｔｑファイルを、ＥＮＡ（研究受託ＰＲＪＮＡ３２６９４４）からダウンロードし、ヒト胚の単一細胞データについて、ｆａｓｔｑファイルを、ＥＮＡ（研究受託ＰＲＪＥＢ８９９４）［１３、１４］からダウンロードした。マウスＥＰＳＣデータについて、従前の研究［１５］のｆａｓｔｑファイルを使用した。全てのリードを、フラッグ「－－ｕｓｅＶＢＯｐｔ－－ｎｕｍＢｏｏｔｓｔｒａｐｓ１００－－ｐｏｓＢｉａｓ－－ｓｅｑＢｉａｓ－－ｇｃＢｉａｓ－ｌＩＳＲ－ｇ遺伝子＿ｍａｐ．ｔｓｖ」（ｇｅｎｅ＿ｍａｐ．ｔｓｖは、遺伝子レベル発現値を得るために、転写物ｉｄを遺伝子ｉｄにマッピングするタブで区切ったファイルであった）を用いたｓａｌｍｏｎ（バージョン０．９．１）を使用して、対応する種のトランスクリプトームに対して直接定量した。異なるタイプのヒト細胞および早期胚におけるそれぞれの選択したヒストン遺伝子の発現レベルを、発現マトリックスから抽出し、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７．０４（https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/）により生成したヒートマップとして視覚化した。遺伝子発現値を、色（それぞれのマトリックス未満の色説明文により示す）に直線的に変換し、ここで、青色が、低い遺伝子発現を表し、赤色が、より高い遺伝子発現を表し、無色は、発現した最高レベルの遺伝子と同等である。単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑのため、余分な品質調整工程を加え、ここで、１０，０００未満の総リード、または４，０００種未満の検出した遺伝子（少なくとも１回のリード）、または８０％より多くの、ＥＲＣＣにマッピングしたリード、または６０％より多くの、マッピング不可能なリードを有する細胞を、下流の解析前に、除去した。

６．３６バッチ補正、主成分分析（ＰＣＡ）および交差種比較
それぞれの試料の遺伝子カウントを、一緒に集め、ｌｏｇ１０変換した。次いで、バッチ効果（バッチは、ここで、異なる研究を意味する）および配列決定の深度（１つの試料当たりのリードの総数）を、ＮａｉｖｅＤＥパッケージ（https://github.com/Teichlab/NaiveDE/tree/master/NaiveDE）からの「ｒｅｇｒｅｓｓ＿ｏｕｔ」関数を使用して、回帰により除去した（ｒｅｇｒｅｓｓｅｄｏｕｔ）。主成分分析を、ｓｃｉｋｉｔ－ｌｅａｒｎ（Scikit-learn:Machine Learning in Python, Pedregosa et al., JMLR 12, pp. 2825-2830, 2011）を使用して、回帰を行ったマトリックス上で行った。交差種比較のため、１対１のオルソロガス遺伝子のみを使用した。

６．３７栄養膜へのヒトＥＰＳＣ分化のＲＮＡ－Ｓｅｑ解析
遺伝子発現マトリックス：参照インデックスを、ＧＥＮＣＯＤＥデータベース［１６］のｈｇ３８に基づき作製した。Ｈ１－ＥＳＣ、Ｈ１－ＥＰＳＣ、ｈｉＰＳＣ－ＥＰＳＣ、ＰＨＴｕおよびＰＨＴｄについての遺伝子発現マトリックスを、以下のパラメーター：ｓａｌｍｏｎｑｕａｎｔ－－ｎｏｖｅｒｓｉｏｎ－ｃｈｅｃｋ－ｑ－ｐ６－－ｕｓｅＶＢＯｐｔ－－ｎｕｍＢｏｏｔｓｔｒａｐｓ１００－－ｐｏｓＢｉａｓ－－ｓｅｑＢｉａｓ－ｇｃＢｉａｓを用いてＳａｌｍｏｎ［１１］を使用し、作製した。ｔ－ＳＮＥ（ｔ－ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄｓｔｏｃｈａｓｔｉｃｎｅｉｇｈｂｏｒｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）解析：Ｒパッケージ「Ｒｔｓｎｅ」を、遺伝子発現マトリックス（最大ＴＰＭ＜＝１を有する遺伝子を繰り出した）の次元削減のため使用し、対応する結果を、カスタムＲスクリプトを使用して、視覚化した。ピアソン相関：参照組織についてのＲＮＡ－ｓｅｑデータを、Chang et al.の文献［１７］からダウンロードし、参照細胞（ｕＥＳＣ、ｕＰＨＴ、ｄＥＳＣ、ｄＰＨＴ）についてのデータを、Yabe et al.の文献［１８］からダウンロードした。Chang et al.が定義した組織特異的遺伝子のリスト（ｎ＝２２９３）を、ピアソン相関係数解析のため選択した。ペアワイズ計算を、提供データ（Ｈ１－ＥＳＣ、Ｈ１－ＥＰＳＣおよびｈｉＰＳＣ－ＥＰＳＣ）と外部参照の間で行った。結果を、高い類似性を赤色で、一方、低い類似性を青色で、ヒートマップとして視覚化した。３７種の栄養膜マーカー遺伝子の発現動態を解析した。それぞれのマーカー遺伝子の発現レベルを、発現マトリックスから抽出し、以下の方法を使用して標準化した。所定の遺伝子のＴＰＭを、列中のその遺伝子の最高遺伝子発現レベルにより割った（Ｈ１－ＥＳＣ、Ｈ１－ＥＰＳＣおよびｈｉＰＳＣ－ＥＰＳＣについての計３６の値における、それぞれの細胞株についての１２のデータポイント）。この方法を通じて、それぞれのＴＰＭを、０～１の間の値に変換した。全体的な遺伝子特性を、青色（低く発現した遺伝子）から赤色（高く発現した遺伝子）の範囲にあるカラーキーを使用して、ヒートマップとしてプロットした。培養物が、７０～８０％コンフルエンスに達したとき、ＲＮＡ調製のための細胞を、同じバッチの培養物から集めた。生物学的複製物を含めて、意味ある結論を可能にした。

６．３８ヒトＴＳＣＲＮＡｓｅｑのＰＣＡ解析
「Ｆａｃｔｏｅｘｔｒａ」Ｒパッケージを、ＰＣＡ解析に適用し、「ｌｉｍｍａ」Ｒパッケージを、バッチ作用除去に適用した。ＴＰＭ値が、全ての試料において１より低い遺伝子を、ＴＰＭ発現マトリックスから除去した。

６．３９単一細胞ＲＮＡｓｅｑライブラリーの構築
単一細胞ｍＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーを、記載されるＳＭＡＲＴ－ｓｅｑ２プロトコール［１９］に従い、生成した。簡単に言うと、単一のブタおよびヒトＥＰＳＣを、溶解バッファーおよび外部ＲＮＡｓｐｉｋｅ－ｉｎｓ（Ａｍｂｉｏｎ）（１：５００，０００）を予め充填した９６ウェルプレートに選別した。次いで、第一の鎖合成およびテンプレート切り替えを行い、続いて、２５サイクルの前増幅を行った。相補性ＤＮＡを、自動化ロボットワークステーション（Ｚｅｐｈｙｒ）を使用して、ＡＭＰｕｒｅＸＰ磁気ビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）により精製した。ｃＤＮＡの質を、高感度ＤＮＡチップを使用してＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて調べた。マルチプレックス（９６プレックス）ライブラリーを構築し、ＮｅｘｔｅｒａＸＴライブラリー調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して増幅した。次いで、ライブラリーをプールし、ＡＭＰｕｒｅＸＰ磁気ビーズを用いて精製した。次いで、ライブラリーの質を、ＷｅｌｌｃｏｍｅＴｒｕｓｔＳａｎｇｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＤＮＡ配列決定パイプラインに提出する前に、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）により評価した。対の端の７５ｂｐのリードを、ＨｉＳｅｑ２０００シーケンサーにより生成した。ブタおよびヒトｓｃＲＮＡｓｅｑデータは、ftp://ngs.sanger.ac.uk/production/teichmann/xi/xuefei_epsc/single_cell_expr_matrix
全ての遺伝子についての発現バイオリン図は、ｓｃＲＮＡｓｅｑ：ブタＥＰＳＣ：ftp://ngs.sanger.ac.uk/production/teichmann/xi/xuefei_epsc/porcine_sc_vplot/index.html
ヒトＥＰＳＣ：ftp://ngs.sanger.ac.uk/production/teichmann/xi/xuefei_epsc/human_sc_vplot/index.html
からダウンロードできる。

６．４０ＥＰＳＣにおけるヒストン修飾特性のＣｈＩＰ－ｓｅｑ解析
ブタおよびヒトＥＰＳＣのＨ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ａｃおよびインプットＣｈＩＰライブラリーを、Lee et al［２０］の改変ＣｈＩＰプロトコールに基づき調製した。簡単に言うと、約２０００００００個の細胞を、１％ホルムアルデヒドにおいて、１０分間、室温で架橋させた。次いで、架橋を、０．１２５Ｍグリシンを用いて、５分間、室温でクエンチした。細胞ペレットを、ＰＢＳを用いて洗浄し、液体窒素により瞬間凍結し、さらなる処理まで、－８０℃において保存した。クロマチンを、５～７サイクル：３０秒間の不定期サイクルの間、ＢｉｏｒｕｐｔｏｒＰｉｃｏ（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）により切断した。免疫沈殿を、予め洗浄し、タンパク質ＡＤｙｎａｅｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０００２Ｄ）に予め接着させた抗体１μｇを用いて、一晩、４℃で行った。抗体：Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ａｃを、補足表９に列挙した。次いで、ビーズを洗浄し、溶出緩衝液を用いて、６５℃で、４時間、架橋を元に戻した。免疫沈殿したＤＮＡを、タンパク質分解酵素Ｋ切断およびＱｉａｇｅｎｍｉｎＥｌｕｔｅＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８００４）を用いて精製した。マルチプレックス配列決定ライブラリーを、製造元の指示に従い、ミクロプレックスライブラリー構築キット（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ、カタログ番号Ｃ０５０１００１４）を用いて調製した。ＤＮＡを、１１サイクルの間増幅し、ライブラリーの質を、高感度ＤＮＡキットを使用して、バイオアナライザー（Ａｉｌｇｅｎｔ）で調べた。ライブラリー濃度を、ＫＡＰＡライブラリー定量キット（ＫＫ４８２４）を使用したｑＰＣＲにより調べ、等モルの異なるライブラリーをプールし、２レーンのＨｉＳｅｑ２５００で配列決定した。５０塩基対の単一末端のリードを、デフォルト設定を有するｂｏｗｔｉｅ２（バージョン２．３．４）［２１］を使用して、ＵＣＳＣ参照ゲノム（ブタについてｓｕｓＳｃｒ１１、およびヒトについてｈｇ３８を構築する）にマッピングした。ヒト参照ｈｇ３８について、全ての代替座位を、マッピング前に、取り除いた（ｃｈｒ＊＿ａｌｔ）。ミトコンドリアゲノムにマッピングしたリードを除去し、核ゲノムにマッピングしたリードを、比較的低いマッピングの質（３０未満のＭＡＰＱ）を有するリードをフィルター処理するためのフラッグ「－ｑ３０」を用いたｓａｍｔｏｏｌｓ［２２］により、フィルター処理した。ヒトナイーブ型およびプライム型ＥＳＣ由来のＣｈＩＰ－ｓｅｑデータについて［１２］、未処理のリードを、ＥＮＡ（研究受託ＰＲＪＮＡ２５５３０８）からダウンロードし、同じ方法で処理した。ピークコールを、ＭＡＣＳ２（２．１．１．２０１６０３０９）［２３］を使用して行った。ブタ試料由来の点状マーク（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ａｃ）の強化領域の同定のため、ピークコールを、フラッグ「－ｔｃｈｉｐ．ｂａｍ－ｃｉｎｐｕｔ．ｂａｍ－ｇ２．７ｅ９－ｑ０．０１－ｆＢＡＭ－－ｎｏｍｏｄｅｌ－ｅｘｔｓｉｚｅ２００－Ｂ－－ＳＰＭＲ」を用いて行った。広範なマーク（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）の強化領域の同定のため、ピークコールを、フラッグ「－ｔｃｈｉｐ．ｂａｍ－ｃｉｎｐｕｔ．ｂａｍ－ｇ２．７ｅ９－ｑ０．０１－ｆＢＡＭ－ｎｏｍｏｄｅｌ－－ｅｘｔｓｉｚｅ２００－Ｂ－－ＳＰＭＲ－－ｂｒｏａｄ」を用いて行った。ヒトデータのため、ピークコール中にゲノムサイズの変化「－ｇｈｓ」を有するピークコールを、同じ方法で行った。得られたｂｅｄＧｒａｐｈファイルを、スクリプトｂｄｇ２ｂｗ（https://gist.github.com/jl32587/34370c995460f9d5ad65）を使用して、ｂｉｇＷｉｇファイルに変換した。ｂｉｇＷｉｇファイルを、ＵＣＳＣゲノムブラウザ［２４］を使用して視覚化した。ナイーブ型およびプライム型遺伝子周囲のＨ３Ｋ４ｍｅ３シグナルを比較するために、ヒトナイーブ型とプライム型ＥＳＣの間で異なって発現した遺伝子のリストを、Theunissen et al.［１２］の補足表からダウンロードした。遺伝子を、ｌｏｇ２倍加変化により選別し、次いで、上位１０００のナイーブ型またはプライム型遺伝子を選択した。ヒトＥＰＳＣのＨ３Ｋ４ｍｅ３シグナルを、ＨＯＭＥＲ（ｖ４．９）［２５］を使用した、これら２０００の遺伝子の転写開始部位辺りで直接定量した。ブタのデータについて、これら２０００の遺伝子の１対１のオルソログを、まず、集合ゲノムブラウザ［２６］から抽出し、次いで、ブタＨ３Ｋ４ｍｅ３シグナルを、ヒトにおけるのと同じ方法で定量した。培養物が、７０～８０％コンフルエンスに達したとき、ヒストン修飾特性のための細胞を、同じバッチの培養物から集めた。生物学的複製物を含めて、意味ある結論を可能にした。

６．４１全ゲノムＤＮＡメチル化解析
ＤＮＡメチル化レベルを、全ゲノムバイサルファイトシーケンス［２７］により測定した。ＤＮＡを精製し（ＱｉａｇｅｎＢｌｏｏｄＤＮＡ抽出キット）、共変動超音波処理装置を使用して、超音波処理した。１試料当たりＤＮＡおよそ５００ｎｇを、メチル化アダプター（ＮＥＢまたはＩｌｌｕｍｉｎａ）を使用したＮＥＢＮｅｘｔＵｌｔｒａＤＮＡライブラリー調製キット（ＮＥＢＥ７３７０）を使用して処理した。バイサルファイト転換を、最終のＰＣＲ増幅前に、ＥＺＤＮＡメチル化Ｇｏｌｄキット（Ｚｙｍｏ）を使用して行った。ライブラリーを、ＩｌｌｕｍｉｎａＭｉＳｅｑプラットフォームを使用して配列決定して、１００ｂｐの対形成した末端リードを得た。未処理の配列リードをトリミングして、ＴｒｉｍＧａｌｏｒｅ（ｖ０．４．１、ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｔｒｉｍ＿ｇａｌｏｒｅ／、Ｃｕｔａｄａｐｔｖｅｒｓｉｏｎ１．８．１，ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ：－－ｐａｉｒｅｄ）を使用して、品質の低いコールとアダプター両方を取り除き、Ｂｉｓｍａｒｋｖ０．１８．２（ＫｒｕｅｇｅｒａｎｄＡｎｄｒｅｗｓ，２０１１）を使用して、ヒトまたはブタゲノムに整列させた。データを、５００ＣｐＧ実行ウィンドウおよび１ウィンドウ当たり１００ＣｐＧの最小カバー度を使用したＳｅｑＭｏｎｋ（www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/seqmonk/）を使用して定量した。培養物が、７０～８０％コンフルエンスに達したとき、本解析における細胞を、同じバッチの培養物から集めた。

６．４２統計的解析
標本サイズを予め決定するために使用した統計方法はなかった。実験を無作為化しなかった。調査者を、実験および評価結果の間、盲検で割り当てなかった。統計的解析を、ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌまたはＰｒｉｓｍ７．０４（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて行った。Ｐ値を、両側スチューデントｔ検定を使用して計算した。

６．４３データ有効性
配列決定データを、ＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓに寄託し、受託番号は、Ｅ－ＭＴＡＢ－７２５２（ＣｈＩＰ－ｓｅｑ）、Ｅ－ＭＴＡＢ－７２５３（大量ＲＮＡ－ｓｅｑ）およびＥ－ＭＴＡＢ－７２５４（単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ）である。ヒト細胞配列決定未処理データ（ＣｈＩＰ－ｓｅｑおよび大量／単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑを含む）ファイルは、ftp://ngs.sanger.ac.uk/production/teichmann/xi/xuefei_epsc/human_fastq/を介してアクセスすることができ、ブタ細胞配列決定未処理データ（ＣｈＩＰ－ｓｅｑおよび大量／単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ）ファイルを、ftp://ngs.sanger.ac.uk/production/teichmann/xi/xuefei_epsc/pig_fastq/を介して評価することができる。全ての他の関連するデータが、担当する著者から要求に応じて入手可能である。
参考文献

特定の実施形態の前述の説明は、他の者が、過度の実験を行うことなく、本開示の一般的な概念から逸脱することなく、関連する技術分野（複数可）の当業者の知識（本明細書において参照により引用され、取り込まれる文書の内容を含む）を適用することにより、かかる特定の実施形態の様々な適用を容易に改変し、および／または適合し得るという、本開示の一般的な性質を完全に明らかにする。それ故、かかる適合および改変は、本明細書において提示される教示およびガイダンスに基づき、開示される実施形態の均等な意味および範囲内であることが意図される。本明細書の用語または専門用語は、説明の目的のためのものであり、限定するためのものではなく、したがって、本明細書における専門用語または用語は、関連する技術分野（複数可）の当業者の知識と組み合わせて、本明細書において提示される教示およびガイダンスに照らして、当業者に意図されるべきであることは、理解されるべきである。

本開示の様々な実施形態が、上で記載された一方、これらが、例示の目的であり、限定するためではないことは、理解されるべきである。形態および細部における様々な変更が、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、ここで成され得ることは、当業者に明らかである。従って、本開示は、上記の例示の実施形態のいずれかにより限定されるべきではなく、以下の請求項およびその均等物に従ってのみ定義されるべきである。

Claims

基本培地、
ＳＲＣインヒビター、
タンキラーゼインヒビター、
ビタミンＣ栄養補助剤、
ＬＩＦタンパク質、および
アクチビンタンパク質
を含む、ブタの拡大ポテンシャル幹細胞（ＥＰＳＣ）培地であって、ＳＲＣインヒビターが、ＷＨ－４－０２３であり、タンキラーゼインヒビターが、エンド－ＩＷＲ－１、ＸＡＶ９３９、ＷＩＫＩ４、ＴＣ－Ｅ５００１またはＪＷ５５である、培地。
前記基本培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２またはＤＭＥＭである、請求項１に記載の培地。
Ｎ２栄養補助剤、Ｂ２７栄養補助剤、グルタミンペニシリン－ストレプトマイシン、ＮＥＡＡ、２－メルカプトエタノール、ＣＨＩＲ９９０２１、ＦＢＳ、またはその組み合わせをさらに含む、請求項１に記載の培地。
（ｉ）ブタ多能性幹細胞の集団を用意すること、
（ｉｉ）前記集団を請求項１に記載の幹細胞培地において培養すること
を含む、ブタの拡大ポテンシャル幹細胞（ＥＰＳＣ）の集団を生成する方法。
ＳＲＣインヒビター；
タンキラーゼインヒビター；
ビタミンＣ栄養補助剤；および
ＬＩＦタンパク質
を含む基本培地を含む、ヒトＥＰＳＣ培地であって、ＳＲＣインヒビターがＡ－４１９２５９であり、タンキラーゼインヒビターが、エンド－ＩＷＲ－１、ＸＡＶ９３９、ＷＩＫＩ４、ＴＣ－Ｅ５００１またはＪＷ５５である、培地。
前記基本培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２またはＤＭＥＭである、請求項５に記載の培地。
Ｎ２栄養補助剤、Ｂ２７栄養補助剤、グルタミンペニシリン－ストレプトマイシン、ＮＥＡＡ、２－メルカプトエタノール、ＣＨＩＲ９９０２１、またはその組み合わせをさらに含む、請求項５に記載の培地。
（ｉ）ヒト多能性幹細胞の集団を用意すること、
（ｉｉ）前記集団を、請求項５に記載の幹細胞培地において培養すること
を含む、ヒトの拡大ポテンシャル幹細胞（ＥＰＳＣ）の集団を生成する方法。
ＩＴＳ－Ｘ；
ビタミンＣ栄養補助剤；
ウシアルブミンフラクションＶ；
微量元素Ｂ；
微量元素Ｃ；
還元型グルタチオン；
規定された脂質；
ＳＲＣインヒビター；
タンキラーゼインヒビター；および
カイロン９９０２１
を含む基本培地を含む、ヒトＥＰＳＣ培地であって、ＳＲＣインヒビターがＡ－４１９２５９であり、タンキラーゼインヒビターがＸＡＶ９３９またはエンド－ＩＷＲ－１である、培地。
前記基本培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２またはＤＭＥＭである、請求項９に記載の培地。
神経基本培地、ペニシリン－ストレプトマイシン－グルタミン、ＮＥＡＡ、ピルビン酸ナトリウム、２－メルカプトエタノール、Ｎ２、Ｂ２７、ヒトＬｉｆタンパク質、またはその組み合わせをさらに含む、請求項９に記載の培地。
（ｉ）ヒト多能性幹細胞の集団を用意すること、
（ｉｉ）前記集団を、請求項９に記載の幹細胞培地において培養すること
を含む、ヒトの拡大ポテンシャル幹細胞（ＥＰＳＣ）の集団を生成する方法。
ＩＴＳ－Ｘ；
ビタミンＣ栄養補助剤；
ウシアルブミンフラクションＶ；
微量元素Ｂ；
微量元素Ｃ；
還元型グルタチオン；
ＳＲＣインヒビター；
タンキラーゼインヒビター；
カイロン９９０２１；
ＬＩＦタンパク質；および
アクチビンＡ
を含む基本培地を含む、ブタＥＰＳＣ培地であって、ＳＲＣインヒビターがＷＨ－４－０２３であり、タンキラーゼインヒビターがエンド－ＩＷＲ－１、ＸＡＶ９３９、ＷＩＫＩ４、ＴＣ－Ｅ５００１またはＪＷ５５である、培地。
前記基本培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２またはＤＭＥＭである、請求項１３に記載の培地。
神経基本培地、ペニシリン－ストレプトマイシン－グルタミン、ＮＥＡＡ、ピルビン酸ナトリウム、２－メルカプトエタノール、Ｎ２、Ｂ２７、またはその組み合わせをさらに含む、請求項１３に記載の培地。
（ｉ）ブタ多能性幹細胞の集団を用意すること、
（ｉｉ）前記集団を、請求項１３に記載の幹細胞培地において培養すること
を含む、ブタの拡大ポテンシャル幹細胞（ＥＰＳＣ）の集団を生成する方法。
ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、またはノックアウトＤＭＥＭ、基本培地、９８％
Ｎ２栄養補助剤、０．１～１％の範囲、
Ｂ２７栄養補助剤、０．１～２％の範囲、
グルタミンペニシリン－ストレプトマイシン、基本栄養補助剤、１％
ＮＥＡＡ、基本栄養補助剤、１％
２－メルカプトエタノール、基本栄養補助剤、１１０μＭ
ＣＨＩＲ９９０２１、０．０５～０．５μＭの範囲；
ＷＨ－４－０２３、０．１～１．０μＭの範囲；
ＸＡＶ９３９、１～１０μＭの範囲；またはエンド－ＩＷＲ－１、１～１０μＭの範囲；
ビタミンＣ、１０～１００μｇ／ｍｌの範囲、
ＬＩＦ、１～２０ｎｇ／ｍｌの範囲
アクチビンＡ、１０～５０ｎｇ／ｍｌの範囲
ＦＢＳ、０．１～０．５％の範囲、および
ＩＴＳ－Ｘ、０．１～２％の範囲、
を含むブタＥＰＳＣ培地。
ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、またはノックアウトＤＭＥＭ、基本培地、９８％
Ｎ２栄養補助剤、０．１～１％の範囲
Ｂ２７栄養補助剤、０．１～２％の範囲
グルタミンペニシリン－ストレプトマイシン、基本栄養補助剤、１％
ＮＥＡＡ、基本栄養補助剤、１％
２－メルカプトエタノール、基本栄養補助剤、１１０μＭ
ＣＨＩＲ９９０２１、０．２～２μＭの範囲
Ａ－４１９２５９、０．０５～０．５μＭの範囲
ＸＡＶ９３９、１～１０μＭの範囲、またはＩＷＲ－１、１～１０μＭの範囲；
ビタミンＣ、１０～１００μｇ／ｍｌの範囲
ＬＩＦ、１～２０ｎｇ／ｍｌの範囲
を含むヒトＥＰＳＣ培地。
ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、４８％
神経基本培地、基本培地、４８％
ペニシリン－ストレプトマイシン－グルタミン、基本栄養補助剤、１％
ＮＥＡＡ、１％
ピルビン酸ナトリウム、１％
２－メルカプトエタノール、基本栄養補助剤、１１０μＭ
Ｎ２、０．１～１％の範囲
Ｂ２７、０．１～２％の範囲
ＩＴＳ－Ｘ、０．１～１％の範囲
ビタミンＣ、１０～１００μｇ／ｍｌの範囲
ウシアルブミンフラクションＶ（７．５％溶液）、０．１％～１％の範囲
微量元素Ｂ基本栄養補助剤、０．１％
微量元素Ｃ基本栄養補助剤、０．１％
還元型グルタチオン、１～２０μｇ／ｍｌの範囲
規定された脂質基本栄養補助剤、０．２％
ＸＡＶ９３９、１～１０μＭの範囲
エンド－ＩＷＲ－１、１～１０μＭの範囲
Ａ４１９２５９、０．０５～０．５μＭの範囲
カイロン９９０２１、０．２～２μＭの範囲、および
ヒトＬｉｆ、１～２０ｎｇ／ｍｌの範囲
を含むヒトＥＰＳＣ培地。
ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、４８％
神経基本培地、４８％
ペニシリン－ストレプトマイシン－グルタミン、１％
ＮＥＡＡ、１％
ピルビン酸ナトリウム、１％
２－メルカプトエタノール、基本栄養補助剤、１１０μＭ
Ｎ２、０．１～１％の範囲
Ｂ２７、０．１～２％の範囲
ＩＴＳ－Ｘ、０．１～１％の範囲
ビタミンＣ、１０～１００μｇ／ｍｌの範囲
ウシアルブミンフラクションＶ、０．１％～１％の範囲
微量元素Ｂ基本栄養補助剤、０．１％
微量元素Ｃ基本栄養補助剤、０．１％
還元型グルタチオン、１～２０μｇ／ｍｌの範囲
ＸＡＶ９３９、１～１０μＭの範囲
エンド－ＩＷＲ－１、１～１０μＭの範囲
ＷＨ－４－０２３、０．１～１．０μＭの範囲
カイロン９９０２１、０．０５～０．５μＭの範囲
ヒトＬｉｆ、１～２０ｎｇ／ｍｌの範囲、および
アクチビンＡ、１０～５０ｎｇ／ｍｌの範囲
を含むブタＥＰＳＣ培地。
ＤＭＥＭ／Ｆ－１２４８２．５ｍｌ、
Ｎ２栄養補助剤２．５ｍｌ、
Ｂ２７栄養補助剤５ｍｌ、
１×グルタミンペニシリン－ストレプトマイシン５ｍｌ、
１×ＮＥＡＡ５ｍｌ、
１１０μＭ２－メルカプトエタノール、
０．２μＭＣＨＩＲ９９０２１、
０．３μＭＷＨ－４－０２３、
２．５μＭＸＡＶ９３９または２．０μＭＩＷＲ－１、
５０μｇ／ｍｌビタミンＣ、
１０ｎｇ／ｍｌＬＩＦ、
２０ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ、
ＩＴＳ－Ｘ１ｍｌおよび
０．３％ＦＢＳ
を含むブタＥＰＳＣ培地５００ｍｌ。
ＤＭＥＭ／Ｆ－１２４８２．５ｍｌ、
Ｎ２栄養補助剤２．５ｍｌ、
Ｂ２７栄養補助剤５ｍｌ、
１×グルタミンペニシリン－ストレプトマイシン５ｍｌ、
１×ＮＥＡＡ５ｍｌ、
１１０μＭ２－メルカプトエタノール、
１．０μＭＣＨＩＲ９９０２１、
０．１μＭＡ－４１９２５９、
２．５μＭＸＡＶ９３９または２．５μＭＩＷＲ－１、
５０μｇ／ｍｌビタミンＣ、および
１０ｎｇ／ｍｌＬＩＦ
を含むヒトＥＰＳＣ培地５００ｍｌ。
Ｆ１２ＤＭＥＭ２４０ｍｌ、
神経基本培地２４０ｍｌ、
ペニシリン－ストレプトマイシン－グルタミン（１００×）５ｍｌ、
１００×ＮＥＡＡ５ｍｌ、
１００×ピルビン酸ナトリウム５ｍｌ、
１１０μＭ２－メルカプトエタノール、
２００×Ｎ２２．５ｍｌ、
１００×Ｂ２７５ｍｌ、
ＩＴＳ－Ｘ２．５ｍｌ、
６４μｇ／ｍｌビタミンＣ、
３ｍｌウシアルブミンフラクションＶ（７．５％溶液）、
１０００×微量元素Ｂ、
１０００×微量元素Ｃ、
還元型グルタチオン１６５μｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、
５００×規定された脂質、
２．５μＭＸＡＶ９３９、
２．５μＭエンド－ＩＷＲ－１、
０．１μＭＡ４１９２５９、
１．０μＭカイロン９９０２１、および
１０ｎｇ／ｍｌヒトＬｉｆ
を含むヒトＥＰＳＣ培地５００ｍｌ。
Ｆ１２ＤＭＥＭ２４０ｍｌ、
神経基本培地２４０ｍｌ、
ペニシリン－ストレプトマイシン－グルタミン（１００×）５ｍｌ、
１００×ＮＥＡＡ５ｍｌ、
１００×ピルビン酸ナトリウム５ｍｌ、
１１０μＭ２－メルカプトエタノール、
２００×Ｎ２２．５ｍｌ、
１００×Ｂ２７５ｍｌ、
ＩＴＳ－Ｘ２．５ｍｌ、
６４μｇ／ｍｌビタミンＣ、
ウシアルブミンフラクションＶ（７．５％溶液）３ｍｌ、
１０００×微量元素Ｂ、
１０００×微量元素Ｃ、
還元型グルタチオン１６５μｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、
２．５μＭＸＡＶ９３９、
１μＭエンド－ＩＷＲ－１、
０．１６μＭＷＨ－４－０２３、
０．２μＭカイロン９９０２１、
１０ｎｇ／ｍｌヒトＬｉｆ、および
２０ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ
を含むブタＥＰＳＣ培地５００ｍｌ。