CN116970552A - 哺乳动物早期胚胎样细胞的诱导方法及其应用 - Google Patents

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李欢欢
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吴金怡
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Abstract

本发明提供了哺乳动物早期胚胎样细胞的诱导方法及其应用，所述方法包括在激发磷酸化STAT3高表达的条件下培养胚胎干细胞(ESC)。

Description

哺乳动物早期胚胎样细胞的诱导方法及其应用
技术领域
本发明属于哺乳动物生殖领域，具体地涉及哺乳动物早期胚胎样细胞的体外培养。
背景技术
哺乳动物体内早期胚胎发育是从合子到二细胞、四细胞、桑椹胚、着床前囊胚和着床后胚胎的过程，是细胞增殖和大规模表观遗传重塑同时发生的过程，这一过程直接决定了胚胎基因组激活和细胞命运的决定。而哺乳动物合子基因组激活(ZGA)是胚胎发生的关键步骤，发生在小鼠的1-2细胞期和人类的4-8细胞期，这一阶段对于哺乳动物早期胚胎发育和全能性的形成具有重要意义。
在小鼠胚胎干细胞中含有部分(小于1％)异质性细胞，即类似2-细胞期胚胎样细胞(2C-like细胞)。2C-like细胞不仅可以表达zga转录本，而且具有与2细胞胚胎相似的表观遗传特征。此外，小鼠ESCs中的2C-like细胞在体内发育状态下可同时发育为胚胎和胚外组织中。所以这部分2C-like细胞是体外进行全能性干细胞研究的珍贵模型。因此，如何将多能干细胞转化成发育更早阶段的全能性细胞具有重大意义，对理解生命发育以及个体化器官体外再生的研究至关重要。
然而，到目前为止，诸多研究得到的2C-like状态细胞，如EPSC(扩展型多能干细胞，Expanded(or extended)pluripotent stem cell)，TBLC(totipotent blastomere-like cells)，TLSC(全能样干细胞)，2CLC等细胞无论在转录组还是表观遗传组等方面都更接近ESC(胚胎干细胞)，而非早期胚胎。如何将多能干细胞转化成发育更早阶段(桑葚胚或更早期细胞)，获得全能性是本领域亟需解决的技术问题，无论是在理论研究和实际应用中都具有重大意义。
发明内容
本发明提供了体外诱导得到早期胚胎样细胞的方法。所述方法将胚胎干细胞重编程为早期胚胎样细胞，所述胚胎干细胞具有分化成为多种成体细胞的能力，但不具备发育为胎盘、卵黄囊等胚外组织的能力，即不具备全能性；所述早期胚胎样细胞是桑葚胚或更早期细胞，是具有全能型的细胞。本发明的体外诱导方法简单易行。
第一方面，本发明提供了早期胚胎样细胞的体外诱导方法，所述方法包括在激发磷酸化STAT3(p-STAT3)高表达的条件下培养胚胎干细胞(ESC)。
在一些实施方案中，所述方法包括利用添加GSK3β信号通路抑制剂和白血病抑制因子LIF的培养基培养胚胎干细胞的步骤。
在一些实施方案中，所述方法包括利用添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基培养胚胎干细胞的步骤。
在一些实施方案中，所述方法包括利用添加GSK3β信号通路抑制剂和白血病抑制因子LIF的培养基培养胚胎干细胞的步骤，以及利用添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基培养胚胎干细胞的步骤。
在一些实施方案中，所述方法还包括在利用添加GSK3β信号通路抑制剂和白血病抑制因子LIF的培养基培养胚胎干细胞的步骤，以及利用添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基培养胚胎干细胞的步骤前，用添加MEK/ERK信号通路抑制剂，GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基培养胚胎干细胞的步骤。
优选地，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基中添加了溶解在牛血清白蛋白或海藻糖中的GCSF。
更优选地，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基中添加了溶解在0.05％-0.15％牛血清白蛋白或3％-7％海藻糖中的GCSF。
更优选地，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基中添加了溶解在0.1％牛血清白蛋白或5％海藻糖中的GCSF。
在一些实施方案中，所述方法还包括将胚胎干细胞解离的步骤。优选地，利用酶将胚胎干细胞解离。优选地，所述酶为Accutase、分散酶或胰蛋白酶。
在一些实施方案中，所述胚胎干细胞是从早期哺乳动物胚胎-胚泡的内细胞团得到的。
在一些实施方案中，所述胚胎干细胞包括分离的胚胎干细胞、原代胚胎干细胞或其群或细胞系建立的细胞系。其包括处于非分化形式或处于分化形式的胚胎干细胞，也含胚胎干细胞的祖先，其细胞系或包含该未分化的或分化的胚胎干细胞的细胞群。任选地，所述胚胎干细胞被遗传修饰，例如被突变。
在一些实施方案中，所述胚胎干细胞是Gata6报告基因敲入的胚胎干细胞。
在一些实施方案中，所述胚胎干细胞是表达Gata6::Venus报告分子的胚胎干细胞。
在一些实施方案中，所述胚胎干细胞是转染了GY118F基因的胚胎干细胞，可以维持STAT3的高表达。所述GY118F基因是可被粒细胞集落刺激因子(GCSF)诱导的GP130受体嵌合转基因。
在一些实施方案中，所述胚胎干细胞是转染了GY118F基因，并且表达Gata6::Venus报告分子的胚胎干细胞。
在一些实施方案中，所述添加GSK3β信号通路抑制剂和白血病抑制因子LIF的培养基是在胚胎干细胞培养基中添加了GSK3β信号通路抑制剂和白血病抑制因子LIF的培养基。
在一些实施方案中，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基是在胚胎干细胞培养基中添加了GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基。
优选地，所述白血病抑制因子LIF的浓度在10-30ng/mL的范围内，优选地，所述白血病抑制因子LIF的浓度为20ng/mL。
优选地，所述MEK/ERK信号通路抑制剂为PD0325901，优选地，所述PD0325901的浓度在0.1-1.5μM的范围内，更优选地，所述PD0325901的浓度为1μM。
优选地，所述GSK3β信号通路抑制剂为CHIR99021，优选地，所述CHIR99021的浓度在2-4μM的范围内，更优选地，所述CHIR99021的浓度为3μM。
优选地，所述粒细胞集落刺激因子GCSF的浓度在20-40ng/mL的范围内，更优选地，所述GCSF的浓度为30ng/mL。
优选地，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基中添加了溶解在牛血清白蛋白或海藻糖中的GCSF。
更优选地，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基中添加了溶解在0.05％-0.15％牛血清白蛋白或3％-7％海藻糖中的GCSF。
更优选地，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基中添加了溶解在0.1％牛血清白蛋白或5％海藻糖中的GCSF。
在一些实施方案中，所述添加GSK3β信号通路抑制剂和白血病抑制因子LIF的培养基不添加MEK/ERK信号通路抑制剂。
在一些实施方案中，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基不添加MEK/ERK信号通路抑制剂。
所述胚胎干细胞培养基是本领域已知的。在一些实施方案中，所述胚胎干细胞培养基是无血清的。在一些实施方案中，所述胚胎干细胞培养基以DMEM/F-12和Neurobasal作为基础培养基，另外添加了N2和B27，以及选自GlutaMAX，非必需氨基酸，微量元素，2-巯基乙醇的一种或多种成分。更优选地，所述胚胎干细胞培养基不添加bFgf。
优选的胚胎干细胞培养基的实例包括KnockoutTM D-MEM，NeurobasalTM培养基和TeSRTM2。某些成分也可用于将干细胞分化，例如B27、和N2通常用于上胚层诱导。这些成分的组合还可以用于下胚层的诱导。
在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：
(1)用添加MEK/ERK信号通路抑制剂，GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基培养胚胎干细胞；
(2)利用添加GSK3β信号通路抑制剂和白血病抑制因子LIF的培养基培养胚胎干细胞；
(3)利用添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基培养胚胎干细胞；以及
(4)利用酶将胚胎干细胞解离，
优选地所述MEK/ERK信号通路抑制剂为PD0325901，优选地，所述GSK3β信号通路抑制剂为CHIR99021，
更优选地，所述白血病抑制因子LIF的浓度在10-30ng/mL的范围内，优选地，所述白血病抑制因子LIF的浓度为20ng/mL，
更优选地，所述PD0325901的浓度在0.1-1.5μM的范围内，更优选地，所述PD0325901的浓度为1μM，
更优选地，所述CHIR99021的浓度在2-4μM的范围内，更优选地，所述CHIR99021的浓度为3μM，
更优选地，所述粒细胞集落刺激因子GCSF的浓度在20-40ng/mL的范围内，更优选地，所述GCSF的浓度为30ng/mL。
优选地，所述酶为Accutase。
优选地，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基中添加了溶解在牛血清白蛋白或海藻糖中的GCSF。
更优选地，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基中添加了溶解在0.05％-0.15％牛血清白蛋白或3％-7％海藻糖中的GCSF。
更优选地，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基中添加了溶解在0.1％牛血清白蛋白或5％海藻糖中的GCSF。
在一些实施方案中，所述胚胎干细胞优选为Gata6+/H2BVenus细胞或转染有质粒PB.CAG.GY118F.IRES.bsd的Gata6+/H2BVenus细胞。
在一些实施方案中，所述胚胎干细胞优选表达GY118F。
在一些实施方案中，所述步骤(1)使用2iL培养基培养，每天换液，每三天传代，优选地，培养条件为5％CO2，36-38℃，优选37℃。
在一些实施方案中，所述步骤(2)包括解离步骤(1)获得的细胞，以及用CL培养基培养0.5-2.5天，优选培养1天。
在一些实施方案中，所述步骤(3)包括用CLG培养基培养步骤(2)获得的细胞1.5-3.5天，优选培养2天。
在一些实施方案中，所述早期胚胎样细胞是胚胎发生起始细胞(EFC)。
在一些实施方案中，所述EFC具有Gata6的转录本表达以及Socs3的上调表达。
在一些实施方案中，所述EFC具有Nanog与Gata6的表达。
在一些实施方案中，所述EFC表现出Pou5f1/Oct4基因的高表达。
在一些实施方案中，所述EFC表现出Fgf4，Trh与Klf2基因表达的显著下降。
在一些实施方案中，所述EFC表现出早期胚胎标记基因Krt8(从四细胞期开始表达)与Krt18(从八细胞期开始表达)的激活，但却没有观测到从32细胞期胚胎内开始表达的早期标记基因(Lrp2,Dab2)。
在一些实施方案中，所述EFC具有8-16细胞期的下胚层(hypoblast)特异表达的标记基因，如Pdgfra与Sox17的表达，然而成熟的下胚层标记基因，如Srgn与Cubn则保持沉默。
在一些实施方案中，所述EFC与16细胞期的细胞聚集。
在一些实施方案中，所述EFC具有显著的GATA6基序的开放基因位点。
在一些实施方案中，所述EFC具有STAT3的目标基因Tfcp2l1在开放基因位点内的高聚集基序。
在一些实施方案中，所述EFC不具有2细胞标记基因Zscan4d，Mervl和Mt-2的开放基因位点。
在一些实施方案中，所述EFC为16细胞期样细胞或桑葚样细胞。
在一些实施方案中，所述EFC为类球状体，所述类球状体具有下胚层细胞群，上胚层细胞群以及滋养层细胞群。优选地，所述类球状体分离成鲜明独立的三种细胞群，即类上胚层群，类下胚层及类滋养层细胞群。
在一些实施方案中，所述类球状体表现出下胚层决定因子Gata6，Pdgfra，Sox17和/或Gata4，和/或成熟下胚层标记基因Dab2，Lrp2，Srgn和/或Cubn的表达上调；和/或滋养层标记基因Krt8，Krt18，Cldn4及Lgals3的表达上调。
在一些实施方案中，所述类球状体具有GATA6，SOX2和KRT18的表达。
在一些实施方案中，所述EFC具有稳定且无偏向的全潜能性。
在一些实施方案中，所述EFC具有全能性并具有无偏向囊胚嵌合性。
在一些实施方案中，所述EFC能够成功发育为胚外组织和/或成年动物。
第二方面，本发明提供了由第一方面的体外诱导方法获得的早期胚胎样细胞。
在一些实施方案中，所述早期胚胎样细胞是胚胎发生起始细胞(EFC)。
在一些实施方案中，所述EFC具有Gata6的转录本表达以及Socs3的上调表达。
在一些实施方案中，所述EFC具有Nanog与Gata6的表达。
在一些实施方案中，所述EFC表现出Pou5f1/Oct4基因的高表达。
在一些实施方案中，所述EFC表现出Fgf4，Trh与Klf2基因表达的显著下降。
在一些实施方案中，所述EFC表现出早期胚胎标记基因Krt8(从四细胞期开始表达)与Krt18(从八细胞期开始表达)的激活，但却没有观测到从32细胞期胚胎内开始表达的早期标记基因(Lrp2,Dab2)。
在一些实施方案中，所述EFC具有8-16细胞期的下胚层(hypoblast)特异表达的标记基因，如Pdgfra与Sox17的表达，然而成熟的下胚层标记基因，如Srgn与Cubn则保持沉默。
在一些实施方案中，所述EFC与16细胞期细胞聚集。
在一些实施方案中，所述EFC具有显著的GATA6基序的开放基因位点。
在一些实施方案中，所述EFC具有STAT3的目标基因Tfcp2l1在开放基因位点内的高聚集基序。
在一些实施方案中，所述EFC不具有2细胞标记基因Zscan4d，Mervl和Mt-2的开放基因位点。
在一些实施方案中，所述EFC为类球状体，所述类球状体具有下胚层细胞群，上胚层细胞群以及滋养层细胞群。优选地，所述类球状体分离成鲜明独立的三种细胞群，即类上胚层群，类下胚层及类滋养层细胞群。
在一些实施方案中，所述类球状体表现出下胚层决定因子Gata6，Pdgfra，Sox17和/或Gata4，和/或成熟下胚层标记基因Dab2，Lrp2，Srgn和/或Cubn的表达上调；和/或滋养层标记基因Krt8，Krt18，Cldn4及Lgals3的表达上调。
在一些实施方案中，所述类球状体具有GATA6，SOX2和KRT18的表达。
在一些实施方案中，所述EFC具有稳定且无偏向的全潜能性。
在一些实施方案中，所述EFC具有全能性并具有无偏向囊胚嵌合性。
在一些实施方案中，所述EFC能够成功发育为胚内组织和胚外组织和/或成年动物。
第三方面，本发明提供了用于从胚胎干细胞获得早期胚胎样细胞的培养基，所述培养基是添加GSK3β信号通路抑制剂和白血病抑制因子LIF的培养基；或是添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基。
所述添加GSK3β信号通路抑制剂和白血病抑制因子LIF的培养基是在胚胎干细胞培养基中添加了GSK3β信号通路抑制剂和白血病抑制因子LIF的培养基。
在一些实施方案中，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基是在胚胎干细胞培养基中添加了GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基。
优选地，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基中添加了溶解在牛血清白蛋白或海藻糖中的GCSF。
更优选地，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基中添加了溶解在0.05％-0.15％牛血清白蛋白或3％-7％海藻糖中的GCSF。
更优选地，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基中添加了溶解在0.1％牛血清白蛋白或5％海藻糖中的GCSF。
在一些实施方案中，所述添加GSK3β信号通路抑制剂和白血病抑制因子LIF的培养基不添加MEK/ERK信号通路抑制剂。
在一些实施方案中，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基不添加MEK/ERK信号通路抑制剂。
优选地，所述白血病抑制因子LIF的浓度在10-30ng/mL的范围内，优选地，所述白血病抑制因子LIF的浓度为20ng/mL。
优选地，所述GSK3β信号通路抑制剂为PD0325901，所述PD0325901的浓度在0.1-1.5μM的范围内，更优选地，所述PD0325901的浓度为1μM。
优选地，所述粒细胞集落刺激因子GCSF的浓度在20-40ng/mL的范围内，更优选地，所述GCSF的浓度为30ng/mL。
所述胚胎干细胞培养基是本领域已知的。在一些实施方案中，所述胚胎干细胞培养基是无血清的。在一些实施方案中，所述胚胎干细胞培养基以DMEM/F-12和Neurobasal作为基础培养基，另外添加了N2和B27，以及选自GlutaMAX，非必需氨基酸，微量元素，2-巯基乙醇的一种或多种成分。优选的胚胎干细胞培养基的实例包括KnockoutTM D-MEM，NeurobasalTM培养基和TeSRTM2。某些成分也可用于将干细胞分化，例如B27和N2通常用于上胚层诱导。优选地，所述胚胎干细胞培养基不添加bFgf。这些成分的组合还可以用于下胚层的诱导。
在一些实施方案中，所述添加GSK3β信号通路抑制剂和白血病抑制因子LIF的培养基是CL培养基。
在一些实施方案中，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基是CLG培养基。
第四方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括添加GSK3β信号通路抑制剂和白血病抑制因子LIF的培养基；和/或添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基。
所述添加GSK3β信号通路抑制剂和白血病抑制因子LIF的培养基是在胚胎干细胞培养基中添加了GSK3β信号通路抑制剂和白血病抑制因子LIF的培养基。
在一些实施方案中，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基是在胚胎干细胞培养基中添加了GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基。
优选地，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基中添加了溶解在牛血清白蛋白或海藻糖中的GCSF。
优选地，所述白血病抑制因子LIF的浓度在10-30ng/mL的范围内，优选地，所述白血病抑制因子LIF的浓度为20ng/mL。
优选地，所述GSK3β信号通路抑制剂为PD0325901，所述PD0325901的浓度在0.1-1.5μM的范围内，更优选地，所述PD0325901的浓度为1μM。
优选地，所述粒细胞集落刺激因子GCSF的浓度在20-40ng/mL的范围内，更优选地，所述GCSF的浓度为30ng/mL。
更优选地，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基中添加了溶解在0.05％-0.15％牛血清白蛋白或3％-7％海藻糖中的GCSF。
更优选地，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基中添加了溶解在0.1％牛血清白蛋白或5％海藻糖中的GCSF。
在一些实施方案中，所述添加GSK3β信号通路抑制剂和白血病抑制因子LIF的培养基不添加MEK/ERK信号通路抑制剂。
在一些实施方案中，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基不添加MEK/ERK信号通路抑制剂。
所述胚胎干细胞培养基是本领域已知的。在一些实施方案中，所述胚胎干细胞培养基是无血清的。在一些实施方案中，所述胚胎干细胞培养基以DMEM/F-12和Neurobasal作为基础培养基，另外添加了N2和B27，以及选自GlutaMAX，非必需氨基酸，微量元素，2-巯基乙醇的一种或多种成分。优选的胚胎干细胞培养基的实例包括KnockoutTM D-MEM，NeurobasalTM培养基和TeSRTM2。优选地，所述胚胎干细胞培养基不添加bFgf。某些成分也可用于将干细胞分化，例如B27和N2通常用于上胚层诱导。这些成分的组合还可以用于下胚层的诱导。
在一些实施方案中，所述添加GSK3β信号通路抑制剂和白血病抑制因子LIF的培养基是CL培养基。
在一些实施方案中，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基是CLG培养基。
第五方面，本发明提供了第三方面的培养基或第四方面的试剂盒在体外诱导早期胚胎样细胞中的用途。
第六方面，本发明提供了第一方面的方法，第二方面的早期胚胎样细胞，第三方面的培养基，或第四方面的试剂盒在将胚胎干细胞向早期胚胎样细胞重置，或在构建拟胚体、类囊胚、嵌合体囊胚及嵌合体动物，或在制备用于细胞治疗的药物中的用途。
本申请的验证结果阐明本发明的EFC能够响应发育中胚胎的各种信号，并且具有全潜能性。
本领域在建立能够模拟正常体内胚胎发展模型的方向上有着惊人的发展。所述模型的建立必将直接改革人们看待发育生物学的视角，同时，更可能改变人们获得目标细胞种类的方法，并可应用于再生医学。但是，现存研究中存在的主要阻碍在于如何生成下胚层细胞系细胞。本研究展示了一种简单的，稳定的，且可重复的构建能够发育成为无偏向无歧义的三种早期胚胎细胞系的方法，本方法能够为解码胚胎发育学的复杂性提供强有力的辅助工具。
名词解释：
所述哺乳动物可以为任何哺乳动物，包括和不限于啮齿目(如小鼠和大鼠)，兔形目(兔子)、食肉目(猫科动物和犬科动物)、偶蹄目(牛科动物和猪科动物)、奇蹄目(马科动物)，或为灵长目和猿猴亚目(人或猴)。所述哺乳动物优选为人或小鼠。
在本发明中，胚胎包括前胚胎阶段，其涵盖从卵母细胞受精，桑椹胚、胚泡阶段、孵化和植入的所有发育阶段。术语“胚胎”可包括在子宫中植入后受精的卵母细胞，直至受精后8周，在该阶段其成为例如人类胎儿。受精的卵母细胞通常称为前胚胎，直到植入发生。
胚胎为近似球形，并且由称为透明带的无细胞基质包围的一个或多个细胞(卵裂球)组成。胚胎发育期间，卵裂球数量以几何方式(1-2-4-8-16-等)增加。在人类胚胎中，同步细胞分裂通常保持到8-细胞阶段。此后，细胞分裂变得异步并且最后个体细胞拥有自己的细胞周期。
胚胎的发育一般包括以下阶段：受精的卵母细胞、合子、2-细胞期细胞、4-细胞期细胞、8-细胞期细胞、16-细胞期细胞、桑椹胚、胚泡、扩张的胚泡和孵化胚泡，以及之间的阶段(如3-细胞或5-细胞)。
桑椹胚阶段以及桑椹胚阶段前的细胞都具有发育成完整胚胎的潜能，属于全能细胞，桑椹胚进一步发育，细胞开始出现分化。桑葚胚一般是指受精卵经过多次分裂，发育96小时(即受精后第四天)后，胚胎内卵裂球数目到达一定数量，形成一种类似桑葚的致密的细胞团。其上一个发展阶段为卵裂期胚胎，桑葚胚进一步发育即形成为囊胚(即受精后第五天和第六天)。
受精是卵母细胞和精子结合产生能够形成复杂生物体的全能性胚胎的过程。受精后，转录不活跃的卵母细胞完成第二次减数分裂，形成一个包含单倍体雌原核和雄原核的单细胞胚胎(合子)。伴随着DNA复制与原核融合，全能性的合子经历一系列分裂，最终形成含有多能性细胞的囊胚。从配子到胚胎控制的转变过程称为MZT。MZT包括母源RNA的降解与合子基因组的转录激活。合子基因组激活(ZGA，也称作胚胎基因组激活)是一个高度协调的过程，在此过程中最初静止的合子基因组转变为具有转录活性状态。此后，胚胎内的细胞第一次出现命运分化的差异。ZGA是一个新个体产生的重要标志之一，不同哺乳动物发生ZGA事件的时间并不相同，如小鼠在2细胞胚胎后期；人类在4细胞期到8细胞期；牛和羊在8细胞期到16细胞期。不管是绝对时间点还是细胞周期数，合子基因激活的第一个转录本被检测到的时间均具有物种特异性。此外，不同基因之间的转录激活时间也存在差异性。
小鼠2细胞期胚胎和人类8细胞期胚胎中的ZGA对发育至关重要。体外培养的小鼠胚胎干细胞(ESCs)具有异质性，有极低(0.1％-1％)的细胞在基因表达与染色质调控等方面与2-细胞期胚胎相似，这群细胞具有更高的发育潜能，它们既能分化成胚胎组织，又能够分化成胚外组织，因而被称作2-细胞样细胞(2-Cell Like Cell，2CLC)。2CLC的发现是干细胞和发育生物学领域的一个里程碑，为研究全能性和多能性之间的转变，提供了一个体外模型。然而，2CLC状态是极度不稳定的，在体外培养过程中大部分2CLC会自发转换回原来的多能状态。
鼠胚胎干细胞来源于小鼠胚胎发育第3.5天着床前囊胚的内细胞团，具有分化成为多种成体细胞的能力，但不具备发育为胎盘等胚外组织的能力，即不具备全能性。
本文所用的术语“胚胎干细胞”包含分离的胚胎干细胞、原代胚胎干细胞或其群或细胞系建立的细胞系。其包括处于非分化形式或处于分化形式的胚胎干细胞，也含胚胎干细胞的祖先，其细胞系或包含该未分化的或分化的胚胎干细胞的细胞群。任选地，所述胚胎干细胞被遗传修饰，例如被突变。
在本申请中，所述Gata6+H是指高pSTAT3激发的高表达Gata6的细胞，也称作Gata6::Venus+H；类似的，所述Gata6+M是指高pSTAT3激发的中表达Gata6的细胞，也称作Gata6::Venus+M。
在本发明中，我们将该无偏向全潜能Gata6+H细胞命名为胚胎发生起始细胞(Embryogenesis Founder Cells(EFCs))，在本发明中Gata6+H和/或Gata6+M细胞与EFC互换使用。优选地，所述EFC为Gata6+H。
本发明的Gata6+H和/或Gata6+M细胞或EFC具有全能性并有无偏向囊胚嵌合性。
在本申请中，所述2iL培养基是指在常用的胚胎干细胞培养基中补充了MEK/ERK信号通路和GSK3β信号通路的两种抑制剂(2i)，白血病抑制因子LIF(L)的培养基。所述常用的胚胎干细胞培养基例如为N2B27培养基。所述MEK/ERK信号通路抑制剂“MEK/ERK抑制剂”包括但不限于BIX02189、10Z-Hymenialdisine、PD0325901、PD184352、PD198306、PD334581、PD98059、SL327、U0126、司美替尼(AZD6244)、曲美替尼(Trametinib)(GSK1120212)、PD184352(CI-1040)、PD98059、Pimasertib(AS-703026)、BIX 02188、TAK-733、AZD8330、比尼替尼(Binimetinib)(MEK162、ARRY-162、ARRY-438162)、PD318088、来法替尼(Refametinib)(RDEA119、Bay 86-9766)、BI-847325、卡比替尼(Cobimetinib)(GDC-0973、RG7420)、GDC-0623和APS-2-79。优选地，可以为PD0325901，是一种选择性的MEK抑制剂，抑制MAPK/ERK的激活和磷酸化。所述GSK3β信号通路抑制剂包括但不限于：CHIR99021、BIO、IM-12、TWS119、1-Azakenpaullone、CHIR98014、Tideglusib、AR-A014418、LY2090314、SB216763、AZD1080。优选为CHIR99021，是肝糖原合成激酶(GSK3β)受体的选择性抑制剂。
在本申请中2iLG培养基是指在常用的胚胎干细胞培养基中补充了MEK/ERK信号通路抑制剂和GSK3β信号通路抑制剂(2i)，白血病抑制因子LIF(L)，和GCSF(G)的培养基。所述常用的胚胎干细胞培养基例如为N2B27培养基。所述MEK/ERK信号通路抑制剂可以为PD0325901，是一种选择性的MEK抑制剂，抑制MAPK/ERK的激活和磷酸化。所述GSK3β信号通路抑制剂包括但不限于：CHIR99021、BIO、IM-12、TWS119、1-Azakenpaullone、CHIR98014、Tideglusib、AR-A014418、LY2090314、SB216763、AZD1080。优选为CHIR99021，是肝糖原合成激酶(GSK3β)受体的选择性抑制剂。
在本申请中，CL培养基是指在常用的胚胎干细胞培养基中补充了白血病抑制因子LIF(L)和GSK3β信号通路抑制剂的培养基。所述常用的胚胎干细胞培养基例如为N2B27培养基。所述GSK3β信号通路抑制剂包括但不限于：CHIR99021、BIO、IM-12、TWS119、1-Azakenpaullone、CHIR98014、Tideglusib、AR-A014418、LY2090314、SB216763、AZD1080。优选为CHIR99021，是肝糖原合成激酶(GSK3β)受体的选择性抑制剂。
在本申请中，CLG培养基是指在常用的胚胎干细胞培养基中补充了白血病抑制因子LIF(L)，GSK3β信号通路抑制剂和GCSF(G)的培养基。所述常用的胚胎干细胞培养基例如为N2B27培养基。所述GSK3β信号通路抑制剂包括但不限于：CHIR99021、BIO、IM-12、TWS119、1-Azakenpaullone、CHIR98014、Tideglusib、AR-A014418、LY2090314、SB216763、AZD1080。优选为CHIR99021，是肝糖原合成激酶(GSK3β)受体的选择性抑制剂。
优选地，所述CLG培养基中添加了溶解在牛血清白蛋白或海藻糖中的GCSF。
更优选地，所述CLG培养基中添加了溶解在0.05％-0.15％牛血清白蛋白或3％-7％海藻糖中的GCSF，更优选地，所述CLG培养基中添加了溶解在0.1％牛血清白蛋白或5％海藻糖中的GCSF。
所述N2B27培养基是以DMEM/F-12作为基础培养基，另外添加了N2和B27，以及其他成分，例如GlutaMAX，非必需氨基酸，2-巯基乙醇等成分。
在本申请中“解离”，是指使细胞的聚集体或团解散成为更小的聚集体或单细胞悬液。细胞聚集体的解离可以通过常规方法实现，包括但不限于，酶学、化学或机械方法。用酶学方法解离例如可以用Accutase、分散酶、胰蛋白酶进行解离。
以下所述的是本发明的优选实施方式，本发明所保护的不限于以下优选实施方式。应当指出，对于本领域的技术人员来说在此发明创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本发明的保护范围。所用试剂未注明生产商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
附图说明
图1显示了磷酸化STAT3及由去除MEK/ERK抑制促进ESC重编程至桑葚样期：
a.本发明目的简图：提高ESCs内STAT3激活(ip-STAT3)是否会形成更广泛的发展潜能？ICM：内细胞团；EPI：上胚层；HYP：下胚层；TE：滋养层/滋养外胚层；
b.在Gata6::Venus ESCs内诱导由GCSC-GY118F调控的STAT3激活的实验设计。实验所用细胞均在无血清且补充了GSK3β信号抑制剂CHIR99021和LIF(CL)的培养基内培育了24小时，紧接着在另外补充了GCSF的CL(CLG)培养基中培育48小时；
c.在CLG培养基内培育48小时后，经过GCSF-GY118F调控的STAT3激活的Gata6::Venus ESCs代表性阶段及其免疫荧光图片，比例尺：50μm；
d.Gata6::Venus ESC在2iL(MEK/ERK与GSK3β信号通路抑制剂(2i)及LIF(L)培养基内或在CL培养基内培育48小时后的流式分析结果；由GCSF-GY118F调控的STAT3而激发的Gata6::Venus ESCs细胞依据GATA6报告分子的活性如前述被单细胞分选，阴性(N)，低(L)，中(M)及高(H)细胞群；
e.展示了培育于2iL培养基或在CLG培养基培育48小时，经GCSC-GY118F调控后上调的STAT3激活(经过ip-STAT3处理的N，L，M或H细胞)的Gata6::Venus ESC内的细胞谱系标记基因的表达情况的小提琴图，数据由Smart-seq2 scRNA-seq分析而得；表达水平：对数转换的归一化值；中位数以小提琴图中的圆点表示；
f.2iL培养基培育的Gata6::Venus ESCs、Gata6+H(H)和Gata6+M(M)细胞的Gata6与Nanog基因表达对比情况；
g.2iL以及CL培养基培育的Gata6::Venus ESCs(在图中标记为“ESC(2iL)”和“ESC(CL)”)、Gata6+H细胞(在图中标记为“Gata6+H”)的单细胞转录组测序数据以及合子到E6.5时期的早期胚胎公共数据的联合UMAP分析图；
h.小鼠胚胎(2C、4C、8C、ICM)、ESC(2iL)以及Gata6+H细胞的ATAC-Seq测序信号峰值显示图；数据来源于早期胚胎；图中的二进制序列代表不同细胞类型的信号模式，其中1表示出现峰值，否则记为0。“011110”基序出现在4C、8C、ICM和Gata6+H细胞中，而“001110”基序出现在8C、ICM和Gata6+H细胞中；
i.在Gata6结合区域中富集的基序的序列；
j.在不同基序中，对上述细胞以及小鼠胚胎进行层次聚类。
图2显示了磷酸化STAT3及由去除MEK/ERK抑制得到的Gata6阳性细胞在转录组和表观组接近早期胚胎8细胞期和内细胞团E3.5时期：
a.Gata6::Venus GY118F ESCs在2iL(MEK/ERK与GSK3β信号抑制剂(2i)与LIF(L)培养基或2iL加GCSF(2iLG)培养基内培育48小时后的流式分析；
b.相关性热图展示了Gata6+高表达(Gata6+H)和Gata6+中表达(Gata6+M)细胞、胚胎细胞以及TBLCs、TLSCs、2CLCs和EPSCs；
c.基因组浏览器显示早期2C、2C、4C、8C、ICM、ESC(2iL)、ESC(CHIR99021和LIF、CL)、Gata6+H、2C::GFP、2C::GFPSGC和2C::GFPSGC/SA细胞、TBLCs和TLSCs的Zscan4d基因座的ATAC-seq信号。数据来源于公共数据库中的早期胚胎、TLSCs和TBLCs；
d.小鼠胚胎(2C、4C、8C、ICM)、Gata6+H细胞、2C::GFP细胞、TBLCs和TLSCs的MERVL-内含子和MT-2_Mn的ATAC-Seq测序信号峰值显示图。它们分别代表了开放和封闭染色质。数据来源于公共数据库中的早期胚胎、TLSCs和TBLCs。
图3显示了JAK I抑制剂损伤磷酸化STAT3诱导获得Gata6阳性细胞；另一个Gata6报告细胞系可以通过磷酸化STAT3同样获得单细胞转录组水平相似的Gata6阳性细胞：
a.Gata6::Venus GY118F ESC在CL，CLG(CL加GCSF)，CL加JAK I抑制剂(JAKi-1:Calbiochem,1μm；JAKi-2:Pyridone,1μm)或CLG加JAK I抑制剂(JAKi-1或JAKi-2)培养基内培育48小时后流式分析；
b.CLG内培育0.5，12，24及48小时后的GCSF-GY118F调控的STAT3激活(磷酸化(p)-STAT3)分别与0小时的样品比较的随时间的蛋白印迹分析。在2iL内培育的细胞在此处作为增加的对照组；
c.pSTAT3在上述培养条件下及所对应时间内的蛋白印迹分析；
d.在CLG培养基内培育48小时的Gata6::GFP细胞经过GCSF-GY118F调控的STAT3激活的代表性时期及其荧光图片；
e.在2iL培养条件下培育48小时的及在CLG培养条件下经过GCSF-GY118F调控STAT3激活的培育48小时的Gata6::GFP细胞的流式分析；
f.Gata6::GFP细胞与Gata6::Venus细胞经过48小时的CLG诱导得到的阴性(N)及高(H)细胞群与2iL培养条件下的细胞的单细胞转录组数据的UMAP分析图；
g.显示了培育于2iL培养基或在CLG培养基培育48小时，经GCSC-GY118F调控后上调的STAT3激活(经过ip-STAT3处理的N或H细胞)的Gata6::GFP ESCs内的细胞谱系标记基因的表达情况的小提琴图，数据由Smart-seq2 scRNA-seq分析而得。
图4显示了在无转基因GY118F的Gata6报告基因细胞系中，通过磷酸化STAT3同样获得单细胞转录组水平相似的Gata6阳性细胞：
a.在2iL培养基培育的转染了及未转染GY118F转基因并通过CL培养基诱导了48小时的Gata6::Venus细胞的流式分析，M显示Gata6::Venus报告基因表达中水平的单细胞级分；H显示Gata6::Venus报告基因表达高水平的单细胞级分；
b.在CLG培养基中培育了48小时的去除GY118F的Gata6::Venus细胞的代表性时期及其荧光图片，比例尺，50μm；
c.显示了在有GY118F转基因的Gata6::Venus细胞(Venus_2iL,Venus_N和Venus_H细胞)内及没有GY118F转基因的Gata6::Venus细胞(Venus H&M(w/o GY)细胞)内的细胞谱系标记基因的表达水平的小提琴图。中位数以小提琴图中的圆点表示。
图5显示了桑葚样细胞能够形成含有所有早期胚胎细胞谱系的球状体：
a.Gata6+H细胞在去除GCSF-GY118F调控的STAT3激活后的表征示意图；
b.培育48小时后球状体结构的代表性时期及其荧光图片，比例尺，50μm；
c.由Gata6+H细胞形成的球状体的Gata6::Venus与SOX2的共免疫荧光染色的代表性图片，比例尺，10μm；
d.由Gata6+H细胞在第3天生成的球状体的单细胞转录组的UMAP分析图；图中细胞的颜色体现了无监督聚类分析所得的隶属关系。数据产生于Smart-seq2 scRNA-seq；
e.显示了Gata6+H细胞和图2d显示的3细胞群(推断为EPI、TE和HYP)的Nanog、Socs3、Pou5f1/Oct4、Esrrb基因，晚期上胚层(EPI)标记基因(Fgf4、Klf2、Trh、Sox2)，下胚层(HYP)标记基因(Gata6、Pdgfra、Sox17、Gata4、Dab2、Lrp2、Srgn、Cubn)以及滋养层/滋养外胚层(TE)标记基因(Krt8、Krt18、Cldn4、Lgals3)表达情况的小提琴图；
f.球状体细胞群与Gata6+H细胞的联合UMAP分析；
g.由Gata6+H细胞在第3天生成的球状体的10×Genomics单细胞转录组数据的UMAP分析图，所示集群分别被推断为1-EPI、2-TE和3-HYP；
h.对参照囊胚(根据对应文章作者的注释，分别标记为EPI、HYP、TE和过渡态)和由Gata6+H细胞第3天生成的球状体的单细胞转录组数据(所示集群分别被推断为1-EPI、2-TE和3-HYP)；
i.由Gata6+H细胞形成的球状体的KRT18与SOX2的免疫荧光共染色的代表性图片，比例尺，10μm。
图6显示了桑葚样细胞形成球状体具有三个早期胚胎细胞谱系的标记基因表达：
a.显示了由Gata6+H细胞第3天生成的球状体内所述细胞谱系特异性标记基因表达的10xGenomics单细胞转录组数据的UMAP分析图。EPI：上胚层；TE：滋养层/滋养外胚层；HYP：下胚层。
b.参照囊胚以及由Gata6+H细胞第3天生成的球状体的细胞谱系特异标记基因的表达情况。细胞水平的转录组测序数据产生于Smart-seq2 scRNA-seq。
图7显示了EFC能够稳定且无偏向性地发育成为上胚层，下胚层及滋养层细胞：
a.验证有mCherry标记的Gata6+H的囊胚是否能够在注射进8细胞期胚胎内形成囊胚嵌合体的实验设计；
b.源于Gata6+H细胞的嵌合体囊胚(mCherry+Venus±)的代表性时期及其荧光图片，比例尺，50μm；
c.源于mCherry标记的Gata6+H细胞的嵌合体囊胚的流式分析；
d.嵌合囊胚细胞(n＝206)的转录组测序数据的UMAP分析图；数据产生于Smart-seq2scRNA-seq，图中细胞的颜色体现了无监督聚类分析所得的隶属关系；
e.UMAP(d)中定义的集群1、2和3的前30差异表达基因的表达热图，其中使用的数据囊括了所有分选细胞，并且mCherry阳性细胞的分选是随机的；少量的随机分选的mCherry阴性细胞(野生型的宿主囊胚细胞)也被引入分析。这说明Gata6+H细胞(mCherry+细胞)具有无偏差的全能性。表达水平：z-score；
f.各囊胚谱系(TE、EPI和HYP)的标记基因的表达水平；
g.从合子到E6.5时期的小鼠胚胎发育过程的UMAP展示图，该分析使用的数据包含了胚胎和胚胎外谱系(HYP和TE)以及上胚层(EPI)。嵌合囊胚细胞被显示为红色(mCherry+，n＝198)和蓝色(mCherry-，即野生型的宿主囊胚细胞，n＝8)。
图8显示了EFCs形成的囊胚发育成为上胚层，下胚层及滋养层外胚层细胞：
mCherry+和mCherry-(野生型宿主囊胚)细胞以及处于不同发育阶段(64-细胞、E3.5(ICM和TE)和E4.5(EPI、HYP和TE))的对照囊胚的分层聚类。细胞对儿之间的距离的计算基于前1000个高变异基因，使用皮尔森相关性(Pearson’s correlation)作为差异度量。
图9显示了EFC能够产生胎盘及卵黄囊组织并能够发育成嵌合体成鼠：
a.验证EFC的胚胎及胚胎外组织发育潜能的实验设计。mCherry标记的EFCs被注射入8细胞期的胚胎并在E10.5-E11.5转植到受体母鼠体内；
b.嵌合囊胚在总胎儿数中发育成胚胎，卵黄囊及胎盘的数量统计；
c.E10.5时期表明EFC能够发育成胚胎，卵黄囊及胎盘的代表性图片；每张图的左侧样品均为源于EFC的嵌合体，右侧均为未注射细胞的对照组，比例尺，1mm；
d.E10.5的胎盘及附着卵黄囊细胞(n＝4033)的主要集群在UMAP分析图上的展示；数据产生于10×genomic scRNA-seq，无监督聚类分析所得的隶属关系由颜色体现，而对各集群的注释取决于组织特异性标记基因的表达情况；
e.E10.5的胎盘及附着卵黄囊细胞(n＝4033)的mCherry+细胞在UMAP分析图上的展示。根据scRNA-seq数据分析定义的mCherry阳性细胞被标记为红色，mCherry+位于上图层(n＝1717)而宿主细胞位于下图层(n＝2316)；
f.显示了图9d中各集群的选择的差异表达基因的平均表达水平，表达水平：z-score；
g.源于EFCs的成体嵌合体的代表性图片。
图10显示了EFCs能够发育为胎盘及卵黄囊组织：
a.存在于E10.5的胎盘及其附着卵黄囊细胞内的mCherry+及宿主细胞在各注释集群内的百分比占比，n＝4033；
b.热图显示了mCherry+细胞的各分群的部分差异表达基因的平均表达水平，n＝1717，表达水平：z-score；
c.热图显示了E10.5时期，附着卵黄囊组织的胎盘中的宿主细胞中每个经注释的分群里，部分差异表达基因的平均表达水平，n＝2316，表达水平：z-score。
图11显示了在CLG(trehalose)和CLG(BSA)培养基中培育Gata6::Venus GY118FESC 48小时后的流式分析结果。
图12显示了不同的CHIR99021(2-4μM)、mLif(10-30ng/ml)、GCSF 20-40ng/ml)的浓度梯度的CLG组合配方培育Gata6::Venus GY118F ESC获得的Gata6阳性细胞的流式分析结果。
实施例
方法：
1.细胞系及GY118F和mCherry的转染
在本研究中共使用了两株Gata6报告分子鼠细胞系：由Christian 慷慨提供的Gata6+/H2BVenus(Gata6::Venus)及由Xiang-xi Xu组慷慨提供的Gata6H2BGFP/+小鼠胚胎干细胞。在转基因转染实验中，2μg piggyBac(PB)承载GY118F的构成型表达载体±2μgpiggyBac(PB)承载mCherry的构成型表达载体及2μg piggyBac(PB)承载非整合型的转位酶表达载体(CAGPBase)被转染入2×105有Gata6报告分子mESC,实验如Neon转染系统(ThermoFisher)操作手册所述。共使用了3组脉冲波，每组1200V，持续10ms，经过处理的mESCs即刻在2iL培养基中孵育直至两天后。紧接着进行细胞筛选，条件如下：20μg/mLblasticidin-S-HCl(ThermoFisher,A1113903)针对PB.CAG.GY118F.IRES.bsd,及100μg/mLzeocin(ThermoFisher,R25001)针对PB.CAG.mCherry.IRES.zeo。Gata6::Venus/GFP-GY118F ES细胞系被用于EFCs诱导合成，Gata6::Venus-GY118F-mCherry ES细胞系被用于活细胞成像及嵌合体成鼠测试的EFCs诱导。
2.mESC细胞培养，EFCs诱导及球状体的生成
鼠ES细胞系(Gata6::Venus报告分子ESCs与Gata6::GFP报告分子ESCs)在每日更换培养基的0.1％明胶铺板的无血清N2B27-2iL培养基内培育，培养条件为20％O2，5％CO2，37℃。N2B27的组分为1：1的DMEM/F-12(Gibco,C11330500CP)与Neurobasal(Gibco,21103049)，1×GlutaMAX(Gibco,35050061),1×MEM Non-Essential Amino Acids(Gibco,11140050),0.1mM 2-巯基乙醇(Gibco,21985023),1×B27(Gibco,17504044)与1×N2(Gibco,17502048)。如前所述，N2B27由2iL所补充:20ng/mL鼠LIF(qKine,Qk018),3μMCHIR99021(Selleck,S2924)及1μM PD0325901(Selleck,S1036)。制得的N2B27培养基至多在4℃冰箱内存放7天，LIF与GCSF两种抑制剂仅在使用当天加入N2B27培养基中。
为了生成EFCs(Embryogenesis Founder Cells)，鼠ESC被Accutase(Stem Cell,7920)消化传代，并在N2B27+CHIR99021+LIF(CL培养基)中培育24-36小时，紧接着将转换为在N2B27+CHIR99021+LIF+GCSF(CLG培养基)中培育48-60小时。N2B27培养基由CL补充：20ng/mL鼠LIF(qKine,Qk018),3μM CHIR99021(Selleck,S2924)±30ng/mL人GCSF(Peprotech,300-23-10)。诱导后，细胞将被收集并由流式分选出Gata6+细胞(在medium&high level)EFCs，用于未来的实验需求。
为了生成源于EFC的球状体，分选收集的Gata6+H细胞在96孔U型底板(Greiner,650185)内以2×103每孔的细胞密度于CL培养基内培育。两天内小的球状体已形成，并在第3-5天收集，用于未来实验需求。
3.流式细胞术和流式细胞分选
使用Accutase将细胞解离成单细胞，并在合适的培养基中重悬。然后使用40微米细胞过滤器(BD，352340)过滤细胞悬液，并在BD LSRFortessa X-20装置上进行分析。数据分析通过FlowJo软件进行。
4.蛋白质印迹
用含有cOmplete蛋白酶抑制剂混合液(Roche,04693132001)和磷酸酶抑制剂混合液(EpiZyme,GRF102)的RIPA缓冲液(EpiZyme,PC102)裂解细胞，并用超声波破碎仪Bioruptor PICO(Diagenode)通过交替30秒开/30秒关的方式高频超声处理细胞4分钟。使用BCA蛋白浓度检测试剂盒(Thermo Scientific)对全细胞蛋白进行定量。在10％聚丙烯酰胺凝胶(EpiZyme)中分离总蛋白(40μg)，电印迹到PVDF膜上，并用GAPDH(Abcam,ab9485)和Phospho-Stat3(Cell Signaling,9145s)抗体检测蛋白表达。
5.免疫荧光染色
在室温下用含有的4％多聚甲醛(PFA，Beyotime，P0099)的PBS将球状体或囊胚固定30分钟。用PBS漂洗样品后，用含有0.5％Triton X-100(Sigma)的PBS通透1小时，接着在室温下用封闭缓冲液(含有5％FBS、2％BSA、0.05％Tween-20的PBS)封闭1小时，并与在封闭缓冲液中稀释的一抗在4℃下孵育过夜。样品用含有0.05％Tween-20的PBS(PBS-T)洗涤三次，与Alexa Fluor标记的针对适当物种的第二抗体以1∶1000(Invitrogen)的比例在室温下孵育1小时。在经过第二抗体孵育后，细胞核用DAPI(Sigma，D9542)染色，并在荧光显微镜下观察。用PBS-T洗涤样品三次。补充表2提供了抗体及其稀释液的详细信息。
6.小鼠嵌合胚胎
所有的小鼠胚胎显微注射和移植实验均在中国科学院广州生物医药与健康研究所进行。在注射前，用如上所述的CL-CLG培养基诱导Gata6::Venus-GY118F-mCherry细胞。Gata6::Venus+mCherry+双阳性的EFC细胞在BD FACSAria III细胞分选仪中用流式细胞术进行分选，并收集在N2B27培养基中。
在注射细胞前，将分选出的EFC在4℃孵育。使用M2培养基(Millipore，MR-015-D)冲出CD-1(ICR)小鼠堵塞的子宫/输卵管中的鼠8-细胞期/囊胚期的胚胎，并在37℃，5％CO2，覆盖有矿物油(Sigma，M8410)的KSOM-AA(Millipore,MR-106-D)中培养。使用FemtoJet(Eppendorf)进行显微注射。
为了获得嵌合囊胚，将7至9个健康细胞注射到每个8-细胞期胚胎的卵黄周隙中。将注射后的胚胎在KSOM-AA液滴中再培养60小时。然后将嵌合胚胎成像、消化，随后用流式细胞术分选，用于单细胞RNA测序。
为了获得E10.5-11.5的嵌合体，将15个细胞注射到每个囊胚腔中。注射后，将胚胎移至KSOM-AA培养基的微滴中，并置于37℃、含5％CO2的加湿的培养箱中。孵育2小时后，将约15个嵌合体胚胎通过子宫移植转移至每个代孕小鼠，并在发育阶段E10.5/11.5解剖孕体。对产后20天的小鼠进行成像得到关于成年嵌合体的信息。
7.单细胞悬液的制备
用Accutase消化分离诱导得到的EFCs。第3-5天聚集的EFCs衍生的球状体经200g离心5分钟后使用accutase进行解离。用N2B27培养基使解聚的细胞沉淀重悬，并用40微米无菌细胞过滤器(BD，352340)进行过滤。为了准备Smart-seq2单细胞RNA测序，采用流式细胞术将细胞分选到含有Smart-seq2裂解缓冲液的96孔板或384孔板中，分选后的细胞立即用于文库制备。为了准备10×genomic单细胞RNA测序，将1×104个细胞分选到含有N2B27培养基的1.5mL EP管中。细胞在4℃下离心，并重悬于1×PBS+0.04％BSA中，随后立即制备10×genomic文库。
使用嵌合囊胚进行实验。通过口吸管(Sigma，A5177)将Gata6::Venus-mCherry衍生的胚胎移出微滴，并用1×PBS洗涤。在96孔板中，用100μL 10U/ml木瓜蛋白酶(Worthington Biochemicals，LS003126)在37℃消化胚胎30分钟，并用200μL吸头吸取15次，直到解离得到单细胞。随后加入100μL 10％FBS来中和酶。细胞在4℃下以200g离心，在N2B27培养基中重悬，并使用40-微米无菌细胞过滤器进行过滤。将mCherry±单细胞分选到含有Smart-seq2裂解缓冲液的96孔板或384孔板中，然后立即制备文库。
使用E10.5-11.5的嵌合体进行实验。将妊娠小鼠的卵黄囊和胎盘从母体蜕膜和脐带中解剖和分离。消化卵黄囊和胎盘的方案如下。在PBS中洗涤卵黄囊和胎盘。在冰上将组织用PBS洗涤两次，并转移到含有0.1g/mL胶原酶(Sigma，C2674)和100μg/mL DNase I(Sigma，DN25-100MG)经预热的消化培养基中，然后使用20G和25G针进行机械解剖。将组织涡旋30秒，并在37℃下进一步孵育30分钟，期间每5分钟摇动一次，以确保完全消化。接下来通过离心收集组织，在PBS中洗涤，在37℃下在500μL Accutase中孵育6-8分钟。在每个样品中加入500μL 2％FBS/DMEM以停止消化，然后离心并弃去上清液。向每个样品中加入1mL(1×)RBC裂解缓冲液(Thermo，00-4333-57)，并在室温下孵育5-10分钟。然后将样品离心并在1mL 2％FBS/DMEM中重悬，并使用40微米的细胞过滤器(BD Falcon)过滤细胞悬液。取单个的E10.5的卵黄囊细胞和E10.5-11.5胎盘细胞。通过流式细胞术将mCherry±单细胞分选到含有1×PBS+0.04％BSA的1.5mL EP管中。细胞在4℃下离心，重悬于1×PBS+0.04％BSA中，然后立即制备10×genomic文库。
8.预处理单细胞RNA测序数据
对于在这项研究中产生的单细胞RNA测序数据预处理如下。本研究中的所有单细胞RNA序列数据均使用根据10×Genomics网站(https://support.10x Genomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/tutori al_Mr)的说明构建的定制参考基因组进行分析：我们从Ensembl官网下载GRCm39的104版本基因组序列和基因注释，将其作为预先构建的范本，并将mCherry序列作为标记基因添加到该范本中，以此构成我们的定制参考基因组。使用Trim Galore(v.0.6.4，http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/Trim_Galore/)的默认参数对来自原始的FASTQ文件的序列进行剪切和过滤。随后参照STARsolo流程(https://github.com/alexdobin/STAR/blob/master/docs/STAR solo.MD)，使用STAR(v.2.7.9a)对数据进行比对、注释、PCR重复去除和基因表达定量。对于Smart-seq2数据，将调整后的读序与定制参考基因组进行比对，并采用参数‘--soloType SmartSeq’对唯一映射的序列进行量化。使用参数‘--soloUMIdedupExact’进行了PCR重复删除。10×genomics数据使用相同流程进行处理，该过程使用参数‘--soloType Droplet’。若一个细胞带有能被特异比对到mCherry基因的序列，则该细胞被定义为mcherry阳性细胞。细胞分类完毕后，我们将mCherry基因表达值从表达矩阵中移除，以避免对后续分析造成影响。
9.scRNA-seq数据的下游分析
使用R 4.1.0软件的Seurat(v.4.0.4)工具包进行进一步的分析。
实施例1：调控STAT3通路将ESC重编程至更早期的胚胎发育状态
本实施例目的在于研究通过调控STAT3通路是否能将ESC重编程至更早期的胚胎发育状态(参见图1a)。在先的研究发现，GATA6蛋白在全能性细胞8-16细胞期胚胎内均有表达，因此将敲入Gata6报告基因(knock-in)的ESC细胞系被用于本实施例的研究。与此同时，将用粒细胞集落刺激因子(GCSF)诱导的GP130受体嵌合转基因GY118F用于维持STAT3的高表达。基于此，用2iLG培养基诱导转染了GY118F基因的Gata6::Venus ESCs细胞系，从而激发磷酸化STAT3(p-STAT3)高表达。2iLG培养基中补充了MEK/ERK信号通路抑制剂和GSK3β信号通路抑制剂(2i)及白血病抑制因子LIF(L)，并添加了GCSF(G)。然而，只有少量的Gata6::Venus+报告基因被激活(参见图2a)。在本实施例中，尝试将MEK/ERK信号通路抑制剂从上述培养基中去除。意外发现，在48小时内能够观察到Gata6::Venus+细胞的高效诱导(参见图1b-d)。随后，研究了高pSTAT3激发的具有高、中、低、无水平的Gata6::Venus+细胞(Gata::Venus-high(H),medium(M),Low(L)and negative(N))的转录组表达模式。Smart-seq2单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析结果显示，分选的Gata6::Venus-H与Gata6::Venus-M细胞群均有Gata6转录本表达及pSTAT3的目标基因Socs3的上调表达(参见图1e)。更重要的是，Gata6::Venus+H与Gata6::Venus+M细胞群均为Nanog与Gata6双阳性(图1e，1f)，该分子表达模式只发生在4-16细胞期至早期囊胚期间。在Gata6::Venus+H与Gata6::Venus+M细胞中，Pou5f1/Oct4基因保持高表达，与此同时，上胚层标记基因Fgf4，Trh与Klf2的表达显著下降(参见图1e)。在Gata6::Venus+细胞群中还观测到了早期胚胎标记基因Krt8(从四细胞期开始表达)与Krt18(从八细胞期开始表达)的激活，但却没有观测到从32细胞期胚胎内开始表达的早期标记基因(Lrp2,Dab2)。其他在8-16细胞期的下胚层(hypoblast)特异表达的标记基因，如Pdgfra与Sox17在Gata6::Venus+H细胞群中也有表达，然而成熟的下胚层标记基因，如Srgn与Cubn则保持沉默(参见图1e)。综上，所述的Gata6::Venus阳性细胞并不具有上胚层或ESC分子表达模型，却获得了更早期的胚胎样分子表达模型。
为了更进一步了解所述的Gata6::Venus+(M和H)细胞，利用扩展型多能干细胞(EPSCs)，2细胞样细胞(2CLCs)，TBLCs与TLSCs(与2-4细胞期卵裂球相近)这些已发现具有胚胎与胚外组织分化潜能的细胞，与Gata6::Venus+(M和H)细胞进行了比较。聚类分析表明，与前述细胞不同的是，所述的Gata6::Venus+(M和H)细胞并未与对照组ESCs聚集(参见图2b)。值得探讨的是，所述的GATA6+H与GATA6+M细胞反而与早期胚胎E3.5的ICM细胞更接近(参见图2b)。
利用来自于早期胚胎的scRNA-seq数据进行非线性降维算法UMAP分析后，发现Gata6::Venus+H细胞群与16细胞期细胞聚集，未诱导的ESCs则与E4.5上胚层细胞紧密聚集(参见图1g)。综上所述，所述的Gata6::Venus+H细胞群是一种具有似16细胞期胚胎细胞的分子模型的新颖且独特的体外细胞类型。
为了探究Gata6::Venus+H细胞的表观遗传特征，对这些细胞与在2iL培养基内未诱导的ESCs进行了染色质开放性测序分析(ATAC-seq)。产生的数据后续又与对照胚胎细胞2C,4C,8C和E3.5 ICM细胞，以及体外2细胞样细胞(2C::GFP,2C::GFPSGC and 2C::GFPSGC/SA cells,TBLCs and TLSCs)进行了比对(参见图1h)。聚类分析表明所述的Gata6::Venus+H细胞有显著的GATA6基序的开放基因位点，该基序的开放基因位点同样与对照组8C与E3.5ICM细胞内高度相似，但却在ESCs内缺失(参见图1h-1j)。同样值得注意的是，STAT3的目标基因Tfcp2l1是一个在我们的细胞中的开放基因位点内的高聚集基序(参见图1j)。针对2细胞标记基因Zscan4d，Mervl和Mt-2的分析揭示这些基序的基因位点并未在Gata6::Venus+H细胞染色质中开放(参见图2c，2d)，进一步证实Gata6::Venus+H细胞并不具有2细胞样的分子模型。通过以上数据可证明本发明保护的细胞是一种与已有体外产生细胞截然不同的细胞，同时，还具有和早期胚胎细胞一致的转录与分子特征。
随后，通过JAK I抑制剂特异性抑制STAT3的激活，以探究GCSF-GY118F诱导的STAT3激活产生Gata6::Venus+细胞的特异性(参见图3a-3c)。值得关注的是，在两组使用JAK I抑制剂的实验中，pSTAT3的合成被抑制了，Gata6::Venus报告分子的激活也被完全抑制了。综上可得，GCSF-GY118F调控的Gata6报告蛋白激活是通过pSTAT3蛋白的刺激。
为了验证结果的可重复性，另一株敲入Gata6报告基因的ESC细胞系Gata6::GFP中转染GY118F仍能够诱导STAT3的高表达。与Gata6::Venus ESCs细胞所得数据一致，GCSF-GY118F激发了在培养环境中Gata6::GFP+细胞群(～15％)的诱导表达(参见图3d，3f)。除此之外，Gata6::GFP+H细胞群具有与Gata6::Venus+H细胞群相似的转录组特征，并与Gata6::Venus+H细胞群聚集(参见图3f，3g)。
尽管生成效率较低(～3％)，无转基因的Gata6::Venus+细胞同样可以仅仅用STAT3激活细胞因子生成(参见图4a-4c)。值得注意的是，上述生成的细胞的高密度细胞群同样具有与GCSF-GY118F诱导的Gata6::Venus+H细胞相似的分子特征。该实验表明由稳定的转基因调控的STAT3激活系统能够有效提升Gata6+细胞生成，所生成的细胞具有16细胞期样/桑葚样细胞的分子特征，然而，该系统并非不可替代的，因为STAT3激活细胞因子同样能够生成16细胞期样/桑葚样细胞。
实施例2：Gata6+H细胞具有体外细胞全能性特征
为了进一步完善对诱导生成的Gata6+H细胞的认知，希望探究STAT3表达激活被去除后将会对Gata6+H细胞造成何种影响(参见图5a)。将分选出的Gata6+H细胞在除GCSF-GY118F调控的STAT3激活外，与前述一致培养基中(补充了MEK/ERK信号通路抑制剂和GSK3β信号通路抑制剂及LIF)中培养3日。出人意料地，以Gata6+H为来源的细胞在培养环境内聚集成球状体，形成了由外层Gata6-Venus阳性细胞群，包裹着内层Gata6阴性细胞群为特征的类球形结构(参见图5b)。该模式与晚期囊胚ICM结构非常相似，即具有Gata6+的下胚层细胞包裹着初始上胚层细胞。类球体细胞群与上胚层特异性标记分子SOX2，以及下胚层特异性标记分子Gata6标记分子共同孵育，得到的结果也验证了上述发现(参见图5c)。为了更清晰地描画前述形成的类球体内各细胞群的细胞命运，借助Smart-seq2 scRNA-seq进行详尽分析。结果表明所述的类球体内细胞有着三种鲜明的细胞群(参见图5d)。转录组分析结果揭示Gata6基因只在其中一种细胞群内表达，我们推测其为类下胚层细胞；而Nanog标记另一鲜明且独立的细胞群，我们推测其为类上胚层细胞(参见图5e)。此外，Gata6+细胞群表现出下胚层决定因子Pdgfra，Sox17，Gata4及成熟下胚层标记基因Dab2，Lrp2，Srgn，Cubn表达的上调(参见图5e)。引人关注的是，滋养层标记基因Krt8，Krt18，Cldn4及Lgals3在除前述所提的细胞群外的独立细胞群中显示了表达上调，表明该细胞群极为可能是滋养外胚层细胞(参见图5e)。更值得令人深思的是，聚类分析结果阐明未经诱导的Gata6+H细胞映射在前文中所推测的类下胚层，类上胚层及类滋养层细胞群的交界处，该结果与未诱导的Gata6+H细胞作为三种被指认出的细胞群的共同先祖细胞的推断结果一致(参见图5f)。与上文中提到的Smart-seq2单细胞测序分析结果一致，10×单细胞测序分析结果证实了来源于Gata6+H的细胞将分离成为鲜明独立的三种细胞群，即类上胚层细胞群，类下胚层细胞群及类滋养层细胞群(参见图5g与图6a)。紧接着，将所述三种截然不同的细胞群与体内发育的囊胚的各对应细胞群进行了对比(参见图5h与图6b)。结果显示，在类球体内认定的三种细胞群与体内发育的三种细胞系一一对应，即上胚层，下胚层与滋养外层。经过早期胚胎细胞系标记分子，即GATA6(下胚层)，SOX2(上胚层)，KRT18(滋养层/滋养外胚层)，免疫染色的球状体确认了三种相对独立的类早期胚胎细胞群在球状体内的存在(参见图5i)。如前所述，该体外实验数据证明所述的Gata6+H细胞的确有着与细胞全能性一致的分子及功能性特征。
实施例3:Gata6+H细胞具有全能性并有无偏向囊胚嵌合性
为了阐明所述的Gata6+H细胞在胚胎内是否具有发育全潜能性，将所述的Gata6+H细胞注射入8细胞期胚胎(参见图7a)。各胚胎引入6-9个被mCherry标记过的Gata6+H细胞，然后培育胚胎60h，目的在于保证实验体能够发育进入晚期囊胚期。在82个处理后的囊胚中，有67个(81.7％)囊胚发育成嵌合体。能够在推定为ICM的细胞内观测到mCherry+细胞，Gata6报告分子标记的下胚层及滋养外胚层均能被进一步观测到(参见图7b，7c)。从嵌合成功的囊胚分选出mCherry呈阳性的细胞及一小部分呈阴性的细胞作为宿主胚胎对照组并进行了Smart-seq2 scRNA-seq分析(参见图7d，7e)。针对各细胞系标记分子的表达分析结果揭示，mCherry阳性细胞呈现为三种完整的早期胚胎细胞系，即Nanog，Sox2，Fgf4及Esrrb在推断为上胚层细胞群中表达；Gata6，Gata4，Sox17及Cubn在推断为下胚层细胞群中表达；Gata3，Krt18，Cdx2及Gata2在推断为滋养层细胞群中表达(参见图7e，7f)。重要的是，mCherry+细胞与mCherry呈阴性的细胞在分子层面是相互交融的，而非分别聚集在一起，表明所述的mCherry+细胞无法与宿主胚胎细胞在转录层面相互辨别(参见图7e)。除此之外，观测到的mCherry呈阳性细胞在各早期胚胎细胞系成比例分布表明我们的细胞具有无偏向全潜能性。UMAP分析结果阐明了mCherry+细胞分别于对照组上胚层，下胚层及滋养层细胞的一致性，更进一步证实诱导而得的Gata6+H细胞在分子及功能层面有着稳定且无偏向全潜能性(参见图7g与图8)。在本申请中，将所述无偏向全潜能Gata6+H细胞命名为EFC(胚胎发育起始细胞，Embryogenesis Founder Cell)。
实施例4：EFC能够成功发育为胚外组织及成年动物
在发育中，囊胚的下胚层及滋养外胚层细胞能够分别发育成卵黄囊及胎盘。为了探究EFC是否能够发育形成胚外组织，分析了E10.5嵌合体胚体，卵黄囊及胎盘(参见图9a)。结果发现，来源于EFC的mCherry+细胞在胚胎内(8/27)及胚外组织(卵黄囊(9/27)；胎盘(21/27))内广泛分布(参见图9b，9c)。为了验证其分子及功能嵌合性，分离了EFC分化而成的E10.5-E11的呈mCherry+嵌合胎盘及邻近的卵黄囊细胞并进行了10×scRNA-seq分析(参见图9d)。9种相互区别的细胞群/组织集群能够被指认，包括典型的滋养层及下胚层细胞分化而成的腔壁内胚层卵黄囊及脏壁内胚层分化而成的卵黄囊细胞(参见图9d)。EFC分化而成的mCherry+细胞呈现于上述所有组织内，并成比例地在源于胚胎内及胚外组织内存在(参见图9e，9f与图10a)，包括腔壁内胚层卵黄囊(由Pga5，Srgn，Gata6及Fabp3标记的集群7)，滋养层(由Rohx6，Rhox9，Krt8，Krt18，Krt19标记的集群8)及脏壁内胚层卵黄囊(由Apoa2，Ttr，S100g，Lgals2标记的集群9)。引人注意的是，存在于源自滋养层及下胚层细胞系的mCherry+细胞在转录层面呈现了稳定的分子特性，该结果与对照组的宿主胚外组织结果非常类似(参见图10b，10c)。在最后，证明了EFCs能够发育成胎生嵌合体，且这些嵌合体均能够发育成健康的成体(参见图9g)。该结果证实，本发明的EFC能够稳健地发育成嵌合体胚胎及成鼠的胚胎内及胚外组织。
实施例5：CLG(trehalose)和CLG(BSA)培养基内的培育
参见图11，显示了在分别添加了溶解在BSA的人GCSF的CLG培养基(CLG(BSA))和海藻糖中的人GCSF(Peprotech，300-23-10)的CLG培养基(CLG(trehalose))中培育Gata6::Venus GY118F ESC 48小时后的流式分析结果。其中，CLG培养基中添加了20ng/mL鼠LIF(qKine,Qk018),3μM CHIR99021(Selleck，S2924)和30ng/mL的人GCSF(Peprotech，300-23-10)。
人GCSF(Peprotech,300-23-10)溶解在0.1％牛血清白蛋白BSA中或溶解在5％海藻糖Trehalose中，诱导的效果有很大的差别。具体来说，溶解在5％海藻糖Trehalose的GCSF，比溶解在0.1％牛血清白蛋白BSA的GCSF的诱导效率高很多：CLG(trehalose)在诱导48小时后得到25％的Gata6阳性细胞，而CLG(BSA)得到15％的Gata6阳性细胞。
实施例6：添加不同浓度的GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的影响
Gata6::Venus GY118F ESC在5种不同的GSKβ抑制剂CHIR99021(2-4μM)、mLif(10-30ng/ml)、GCSF(20-40ng/ml)的浓度梯度的CLG组合配方，分别为：配方A(C:2μM；L:10ng/mL；G:20ng/mL)；配方B(C:3μM；L:10ng/mL；G:20ng/mL)；配方C(C:3μM；L:20ng/mL；G:30ng/mL)；配方D(C:4μM；L:20ng/mL；G:40ng/mL)；配方E(C:3μM；L:30ng/mL；G:40ng/mL)；诱导得到的Gata6阳性细胞的比例分析。具体参见下表1：
表1：
A B C D E
GSKβ抑制剂CHIR99021 2μM 3μM 3μM 4μM 3μM
白血病抑制因子鼠LIF 10ng/mL 10ng/mL 20ng/mL 20ng/mL 30ng/mL
粒细胞集落刺激因子GCSF 20ng/mL 20ng/mL 30ng/mL 40ng/mL 40ng/mL
参见图12所示的结果，这五种CLG浓度梯度配方的诱导对比结果发现，GSKβ抑制剂CHIR99021在浓度范围2-4μM内、mLif在浓度范围10-30ng/ml内、GCSF在浓度范围20-40ng/m内，均可诱导出较高效率的Gata6阳性细胞，其中，配方C的结果更为显著。

Claims (17)

1.早期胚胎样细胞的体外诱导方法，所述方法包括在激发磷酸化STAT3高表达的条件下培养胚胎干细胞(ESC)。
2.根据权利要求1的方法，所述方法包括：
利用添加GSK3β信号通路抑制剂和白血病抑制因子LIF的培养基培养胚胎干细胞的步骤；和/或
利用添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基培养胚胎干细胞的步骤。
3.根据权利要求1的方法，所述方法还包括在利用添加GSK3β信号通路抑制剂和白血病抑制因子LIF的培养基培养胚胎干细胞的步骤，以及利用添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基培养胚胎干细胞的步骤前，用添加MEK/ERK信号通路抑制剂，GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基培养胚胎干细胞的步骤。
4.根据权利要求1的方法，所述方法还包括将胚胎干细胞解离的步骤，优选地，利用酶将胚胎干细胞解离，更优选地，所述酶为Accutase、分散酶或胰蛋白酶。
5.根据权利要求1的方法，所述胚胎干细胞是从早期哺乳动物胚胎-胚泡的内细胞团得到的。
6.根据权利要求1的方法，所述胚胎干细胞包括分离的胚胎干细胞、原代胚胎干细胞或其群或细胞系建立的细胞系，或者，所述胚胎干细胞被遗传修饰。
7.根据权利要求1的方法，所述胚胎干细胞是Gata6报告基因敲入的胚胎干细胞，优选地，所述胚胎干细胞是表达Gata6::Venus报告分子的胚胎干细胞；和/或
所述胚胎干细胞是转染了GY118F基因的胚胎干细胞。
8.根据权利要求1的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)用添加MEK/ERK信号通路抑制剂，GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基培养胚胎干细胞；
(2)利用添加GSK3β信号通路抑制剂和白血病抑制因子LIF的培养基培养胚胎干细胞；
(3)利用添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基培养胚胎干细胞；以及
(4)利用酶将胚胎干细胞解离，
优选地，所述步骤(1)使用2iL培养基培养，每天换液，每三天传代，更优选地，培养条件为5％CO2，36-38℃，优选37℃；
优选地，所述步骤(2)包括解离步骤(1)获得的细胞，以及用CL培养基培养0.5-1.5天，优选培养1天；
优选地，所述步骤(3)包括用CLG培养基培养步骤(2)获得的细胞1.5-3.5天，优选培养2天，
优选地，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基中添加了溶解在牛血清白蛋白或海藻糖中的GCSF，
更优选地，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基中添加了溶解在0.05％-0.15％牛血清白蛋白或3％-7％海藻糖中的GCSF，更优选地，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基中添加了溶解在0.1％牛血清白蛋白或5％海藻糖中的GCSF。
9.根据权利要求2的方法，所述方法中添加GSK3β信号通路抑制剂和白血病抑制因子LIF的培养基是在胚胎干细胞培养基中添加了GSK3β信号通路抑制剂和白血病抑制因子LIF的培养基；
所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基是在胚胎干细胞培养基中添加了GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基，
优选地，所述添加GSK3β信号通路抑制剂和白血病抑制因子LIF的培养基不添加MEK/ERK信号通路抑制剂，
优选地，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基不添加MEK/ERK信号通路抑制剂，
优选地，所述胚胎干细胞培养基是无血清的，
更优选地，所述胚胎干细胞培养基以DMEM/F-12和Neurobasal作为基础培养基，另外添加了N2和B27，以及选自GlutaMAX，非必需氨基酸，微量元素，2-巯基乙醇的一种或多种成分，
更优选地，所述胚胎干细胞培养基不添加bFgf，
更优选地，所述白血病抑制因子LIF的浓度在10-30ng/mL的范围内，优选地，所述白血病抑制因子LIF的浓度为20ng/mL，
更优选地，所述MEK/ERK信号通路抑制剂为PD0325901，优选地，所述PD0325901的浓度在0.1-1.5μM的范围内，更优选地，所述PD0325901的浓度为1μM，
更优选地，所述GSK3β信号通路抑制剂为CHIR99021，优选地，所述CHIR99021的浓度在2-4μM的范围内，更优选地，所述CHIR99021的浓度为3μM，
更优选地，所述酶为Accutase，
优选地，所述粒细胞集落刺激因子GCSF的浓度在20-40ng/mL的范围内，更优选地，所述GCSF的浓度为30ng/mL，
优选地，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基中添加了溶解在牛血清白蛋白或海藻糖中的GCSF，
更优选地，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基中添加了溶解在0.05％-0.15％牛血清白蛋白或3％-7％海藻糖中的GCSF，更优选地，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基中添加了溶解在0.1％牛血清白蛋白或5％海藻糖中的GCSF。
10.根据权利要求1的方法，所述早期胚胎样细胞是胚胎发生起始细胞EFC。
11.根据权利要求1的方法，所述EFC具有Gata6的转录本表达以及Socs3的上调表达；和/或，
所述EFC具有Nanog与Gata6的表达；和/或，所述EFC表现出Pou5f1/Oct4基因的高表达；和/或，
所述EFC表现出Fgf4，Trh与Klf2基因表达的显著下降；和/或，
所述EFC表现出早期胚胎标记基因Krt8(从四细胞期开始表达)与Krt18(从八细胞期开始表达)的激活，不表达从32细胞期胚胎内开始表达的早期标记基因：Lrp2和Dab2；和/或，
所述EFC具有Pdgfra和Sox17的表达，不表达Srgn与Cubn。
12.根据权利要求1的方法，所述EFC与16细胞期细胞聚集；和/或,
所述EFC具有显著的GATA6基序的开放基因位点；和/或，
所述EFC具有Tfcp2l1在开放基因位点内的高聚集基序；和/或，
所述EFC不具有Zscan4d，Mervl和Mt-2的开放基因位点；和/或，
所述EFC为16细胞期细胞或桑葚样细胞。
13.根据权利要求1的方法，所述EFC为类球状体，所述类球状体具有下胚层细胞群，上胚层细胞群以及滋养层细胞群，
优选地，所述类球状体表现下胚层决定因子Gata6，Pdgfra，Sox17和/或Gata4，和/或成熟下胚层标记基因Dab2，Lrp2，Srgn和/或Cubn的表达上调；和/或滋养层标记基因Krt8，Krt18，Cldn4及Lgals3的表达上调；
优选地，所述类球状体具有GATA6，SOX2和KRT18的表达；
优选地，所述EFC具有稳定且无偏向的全潜能性，
优选地，所述EFC具有全能性并具有无偏向囊胚嵌合性，
优选地，所述EFC能发育为胚内组织和胚外组织和/或成年嵌合动物。
14.由权利要求1-13任一项所述的方法获得的早期胚胎样细胞。
15.用于从胚胎干细胞获得早期胚胎样细胞的培养基，所述培养基是：
添加GSK3β信号通路抑制剂和白血病抑制因子LIF的培养基；和/或
添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基；
优选地，添加GSK3β信号通路抑制剂和白血病抑制因子LIF的培养基是在胚胎干细胞培养基中添加了GSK3β信号通路抑制剂和白血病抑制因子LIF的培养基；
优选地，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基是在胚胎干细胞培养基中添加了GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基，
优选地，所述添加GSK3β信号通路抑制剂和白血病抑制因子LIF的培养基不添加MEK/ERK信号通路抑制剂，
优选地，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基不添加MEK/ERK信号通路抑制剂，
优选地，所述胚胎干细胞培养基是无血清的，
更优选地，所述胚胎干细胞培养基以DMEM/F-12和Neurobasal作为基础培养基，另外添加了N2和B27，以及选自GlutaMAX，非必需氨基酸，微量元素，2-巯基乙醇的一种或多种成分，
更优选地，所述胚胎干细胞培养基不添加bFgf，
更优选地，所述MEK/ERK信号通路抑制剂为PD0325901，
更优选地，所述GSK3β信号通路抑制剂为CHIR99021，
优选地，所述早期胚胎样细胞是权利要求14所述的早期胚胎样细胞，
优选地，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基中添加了溶解在牛血清白蛋白或海藻糖中的GCSF，
更优选地，所述白血病抑制因子LIF的浓度在10-30ng/mL的范围内，优选地，所述白血病抑制因子LIF的浓度为20ng/mL，
更优选地，所述MEK/ERK信号通路抑制剂为PD0325901，优选地，所述PD0325901的浓度在0.1-1.5μM的范围内，更优选地，所述PD0325901的浓度为1μM，
更优选地，所述GSK3β信号通路抑制剂CHIR99021的浓度在2-4μM的范围内，更优选地，所述CHIR99021的浓度为3μM，
优选地，所述粒细胞集落刺激因子GCSF的浓度在20-40ng/mL的范围内，更优选地，所述GCSF的浓度为30ng/mL，
更优选地，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基中添加了溶解在0.05％-0.15％牛血清白蛋白或3％-7％海藻糖中的GCSF，更优选地，所述添加GSK3β信号通路抑制剂，白血病抑制因子LIF和粒细胞集落刺激因子GCSF的培养基中添加了溶解在0.1％牛血清白蛋白或5％海藻糖中的GCSF。
16.权利要求15的培养基在体外诱导早期胚胎样细胞中的用途。
17.权利要求1-13任一项的方法，权利要求14的早期胚胎样细胞，权利要求15的培养基在将胚胎干细胞向早期胚胎样细胞重置，或在构建拟胚体、类囊胚、嵌合体囊胚及嵌合体动物，或在制备用于细胞治疗的药物中的用途。
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