CN113767167A - 从诱导多能干细胞体内产生功能性和患者特异性胸腺组织 - Google Patents

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Abstract

所公开的技术包括用于产生患者特异性功能性胸腺上皮祖(TEP)细胞的方法、系统和装置。在一些实施方案中，一种方法可包括从HSC产生iPSC；使所述iPSC分化成胸腺上皮祖(TEP)细胞；通过将所述TEP细胞移植到宿主中产生胸腺上皮细胞，其中所述TEP细胞可分化成成熟的功能性胸腺上皮细胞(TEC)。在一些实施方案中，一种系统可包括患者特异性细胞的细胞群、iPSC群、用于将所述iPSC分化成患者特异性TEP细胞群以转移至宿主或所述患者体内的培养系统，以允许所述TEP细胞分化成成熟的功能性TEC。

Description

从诱导多能干细胞体内产生功能性和患者特异性胸腺组织
技术领域
所公开的过程、方法和系统涉及从诱导多能干细胞体外产生人胸腺上皮祖细胞，所述人胸腺上皮祖细胞可进一步分化为患者特异性胸腺上皮细胞。
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2019年4月26日提交的名称为“GENERATION OFFUNCTIONAL THYMIC EPITHELIAL PROGENITOR CELLS”的美国临时专利申请号62/839,107的优先权权益，该美国临时专利申请以引用其全文的方式并入本文中。
政府许可权
这项发明是在国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的批准号CA213102和CA149456的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
背景技术
胸腺是一种腺器官，其对于T细胞库的发育是必要的。胸腺作用于T细胞的阳性和阴性选择以建立适应性、自我耐受的免疫系统。胸腺发育和功能的缺陷可能导致免疫缺陷和自身免疫性疾病的发作。传统上，对胸腺发育和自身免疫的研究主要局限于小鼠模型。这主要是由于缺乏发育中的人类胸腺的可用性，并且缺乏可靠的体外人类胸腺模型。
需要方法来调节自身免疫患者(例如那些患有1型糖尿病(T1D)的患者)的免疫系统，以(重新)诱导对自身抗原的耐受性。此外，已经因化疗和/或造血干细胞治疗而经历淋巴细胞减少的患者，由于作为成年人时缺乏有能力的胸腺上皮，所以会遭受缓慢或无能力的T细胞重建。这种缓慢并且无能力的T细胞重建可能会使患者易患大量传染病、复发和移植物抗宿主疾病。此外，由于胸腺经历与年龄相关的萎缩，所以老年个体的免疫能力不如较年轻的个体。接受与实体器官或干细胞来源的细胞/组织移植相关的治疗的患者也易受潜在的免疫调节影响，因此需要用于减少或消除移植后进行免疫抑制的需求的方法。先前在小鼠中的研究已表明，向老年小鼠提供年轻的胸腺可延长老年小鼠的寿命，并且在老年小鼠的胸腺中强制表达FOXN1可以再生和恢复胸腺功能。因此，老年个体中的功能性胸腺的再生可以用作一种对抗衰老对人类的影响的有吸引力的疗法，从而有可能导致延长人类的预期寿命。然而，目前对人类胸腺发育和功能的理解存在重大差异。
发明内容
所公开的技术涉及用于产生患者特异性胸腺上皮细胞(TEC)的方法，所述方法包括：从患者分离细胞，向所述细胞施用一种或多种因子以对所述细胞重新编程并产生诱导多能干细胞(iPSC)；在分化培养基中培养所述患者特异性iPSC 9-14天以产生胸腺上皮祖(TEP)细胞；以及将至少一种TEP转移到接受者体内，并使得所述TEP细胞分化成TEC。在许多实施方式中，iPSC可来源于造血干细胞(HSC)或外周血单核细胞(PBMC)，并且所得的TEC可以是成熟的、功能性的、患者特异性的胸腺上皮细胞(TEC)。在一些实施方式中，所述方法可包括使患者来源的T细胞与TEC接触以产生功能性T细胞的步骤，或者使患者来源的T细胞与TEP接触以产生功能性T细胞和/或功能性TEC的步骤。在一些实施方式中，成熟的T细胞表达CD69、CD25、CD5、CD7、CD4、CD8、CD3、CD45、RAG1和RAG2中的一者或多者。在许多实施方式中，外周T细胞的数量大于未接受患者特异性TEP的接受者中的外周T细胞的数量。在许多实施方式中，分化培养基包含一种或多种通路激活剂和/或通路抑制剂，例如激活素、WNT、BMP、RA、TGFβ、SHH和FGFβ中的一者或多者，所述一种或多种通路激活剂和/或通路抑制剂可能受到激活素A、WNT3a、BMP4、SAG、TTNPB、FGF8b、Ly-364947、和Sant1中的至少一者的影响。在一些方法中，可以存在共培养步骤，其中TEP细胞与造血干细胞和祖细胞(HPSC)或HSC共培养约7天产生了TEC。在这些方法中的许多方法中，TEC可表达一种或多种选自FOXN1、AIRE、CK5、CK8、CXCL12、CCL25、DLL4、TP63、CBX4和HLA-DR的遗传标记物，例如通常由皮层TEC和髓质TEC表达的标记物，例如KRT5、KRT8、AIRE、PSMB11和PRSS16。
还公开了分化的成熟胸腺上皮细胞的群体，所述群体包括一种或多种胸腺上皮细胞(TEC)，所述一种或多种胸腺上皮细胞表达KRT5、KRT8、AIRE、PSMB11和PRSS16中的一者或多者，其中所述一种或多种TEC来源于胸腺上皮祖(TEP)细胞，所述TEP细胞来源于在激活素A、Wnt3a、TTNPB、BMP4、LY364947、FGF8b、FGF8a、SAG和SANT-1中的一者或多者存在下体外生长的诱导多能干细胞(iPSC)，并且其中所述TEP在移植到接受者体内后在体内分化成TEC。在许多实施方案中，分化的成熟胸腺上皮细胞的群体，即iPSC，可以在体外生长达介于12天与14天之间，并且可以来源于接受者的一种或多种细胞。所得的TEC可以表达一种或多种选自FOXN1、AIRE、CK5、CK8、CXCL12、CCL25、DLL4和HLA-DR的标记物。
还公开了用于产生成熟的功能性胸腺上皮细胞的系统，所述系统包括：用于从受试者的细胞诱导多能干细胞的方法；培养装置，所述培养装置用于使诱导多能干细胞在激活素A、Wnt3a、TTNPB、BMP4、LY364947、FGF8b、FGF8a、SAG和SAT-1中的一者或多者存在和不存在的情况下生长12-14天以产生分化的胸腺上皮祖细胞；用于将一种或多种胸腺上皮祖细胞植入受试者体内的装置。
还描述了如上文和本文所述的细胞群体在用于制备治疗免疫病症或疾患的药物中的用途，其中所述疾患或病症选自不存在胸腺、受损的胸腺、功能障碍的胸腺、患病的胸腺、老化的胸腺、1型糖尿病、自身免疫、同种异体排斥、癌症、以及它们的组合。
还公开了治疗患有免疫病症或疾患或有免疫病症或疾患风险的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求19-22中任一项所述的TEP细胞，或通过根据权利要求1-18中任一项所述的方法产生的细胞；其中所述疾患或病症选自不存在胸腺、受损的胸腺、功能障碍的胸腺、患病的胸腺、老化的胸腺、1型糖尿病、自身免疫、同种异体排斥、癌症、以及它们的组合。
还公开了治疗患有胸腺疾患的患者的方法，所述方法包括施用一种或多种胸腺上皮祖(TEP)细胞，所述一种或多种TEP细胞来源于在激活素A、Wnt3a、TTNPB、BMP4、LY364947、FGF8b、FGF8a、SAG和SANT-1中的一者或多者存在下体外生长的患者特异性诱导多能干细胞(iPSC)，并且其中所述TEP细胞在施用于所述患者后体内分化成胸腺上皮细胞(TEC)，其中所述iPSC在体外生长介于12天与14天之间，并且其中所述成熟TEC表达一种或多种选自FOXN1、AIRE、CK5、CK8、CXCL12、CCL25、DLL4和HLA-DR的标记物。在一些实施方案中，iPSC来源于患者的皮肤、子宫组织、肾脏、肝脏、肌肉、肾上腺、血液中的一者或多者，和/或相对于所述施用的TEP细胞或iPSC，所述选择的标记物在成熟的iPSC来源的TEC中的表达介于0.5倍与1000倍之间。
附图说明
图1A是从iPSC生成TEP的直接分化方法的示意图。指示了每个阶段的标记基因。
图1B是所测试的分化条件和因素的表格。将所有6种测试的条件与第0天的iPSC和新生儿人类胸腺样本(Thy)进行比较。
图1C和图1D示出了关于在第9天(图1C)和第14天(图1D)对第三咽囊标记物HOXA3和EYA1以及TEP标记物FOXN1的基因表达分析的数据。示出的值是与第0天的iPSC相比的相对定量(RQ)，并且被归一化成ACTB(n＝3，两条iPSC线，n＝2原代人类胸腺)。数据显示为平均值，其中误差线表示平均值的标准误差(SEM)。如使用ddCt值，通过使用Tukey多重比较检验的单因素方差分析确定的p值：(图1C)HOXA3：****＝p<0.0001，EYA1：***＝p<0.0007，**＝p<0.0016。(图1D)HOXA3：
Figure BDA0003319143550000041
并且
Figure BDA0003319143550000042
表示原代胸腺与所有6种条件之间的显著性，其中p＝<0.0001。****表示第0天的iPSC与所有6个样本之间的显著性，其中p＝<0.0001。EYA1：***＝p<0.001，**＝p<0.002。FOXN1：p＝0.0024。
图1E是在使用条件4进行TEP分化的第9天FOXA2(红色)和HOXA3(绿色)蛋白表达的免疫荧光染色的代表性显微照片。用DAPI对细胞核进行复染。比例尺＝20μm。
图1F是在使用条件4进行TEP分化的第9天HOXA3阳性细胞的定量的图表。所述图表被绘制为HOXA3阳性细胞占总DAPI+细胞的平均百分比，其中误差线指示SEM(n＝3，3条iPSC线)。
图1G是在使用多个iPSC系(n＝3，3个iPSC系)以条件4(加上补充物)进行TEP分化的第14天的第三咽囊标记物HOXA3和EYA1以及TEP标记物FOXN1的基因表达分析的图表。数据被绘制成平均相对表达，其中误差线指示SEM。如使用ddCt值通过非配对t检验确定p值：HOXA3＝0.0003，EYA1＝0.0064。
图2A是iPSC来源的TEP体内成熟为TEC的实验设计的示意图。
图2B示出了来自对在移植后第20天使用条件4产生的iPSC来源的TEP(n＝2，两个iPSC系)和在移植后14-17周从裸小鼠接受者回收的移植物(n＝8)的基因表达分析的数据。示出了相对定量(RQ)值的图表。数据示出为平均值，其中误差线显示了归一化为ACTB，并且相对于实验上匹配的第0天iPSC设置的SEM。如使用ddCt值，通过使用Tukey多重比较检验的单因素方差分析确定p值：FOXN1：****p＝<0.0001，***p＝0.0001。KRT5：p＝<0.0001。DLL4：p＝0.041。
图2C是分别针对mTEC和cTEC标记物细胞角蛋白5(绿色)和细胞角蛋白8(红色)以及DAPI染色以标记细胞核的TEP移植物的代表性显微照片免疫荧光图像。黄色双阳性细胞指示发育中的TEC。比例尺＝20μm。
图2D是分别针对小鼠T细胞标记物Cd4(绿色)和Cd8(红色)以及DAPI染色以标记细胞核的TEP移植物的代表性显微照片免疫荧光图像。黄色双阳性细胞指示发育中的T细胞。
图3A是呈现大量RNA-seq样本的主分量分析(PC)的图表，示出了第20天的TEP、体内产生的TEC移植物和原代新生儿人胸腺的聚类(TEP n＝2，移植物n＝4，原代胸腺n＝2)。
图3B是示出大量RNA-seq样本的全基因组分层聚类的系统树图。
图3C至图3E呈现差异基因表达的显著性分析的数据，展示为关于对原代新生儿胸腺、TEC移植物和第20天的TEP的火山图，其中标注了第三咽囊和关键胸腺标记物。显著P值<0.01，最小变化倍数(FC)是0.5log。(图3C)移植物对比第20天的TEP。(图3D)原代新生儿胸腺对比第20天的TEP。(图3E)原代新生儿胸腺对比移植物。
图3F是示出针对对照和TEP移植的小鼠脾脏(n＝2个假手术，4个移植)上的小鼠Cd3(棕色)和小鼠Cd45(红色)的免疫组织化学染色的代表性显微照片。
图3G示出了对照和经TEP移植的裸小鼠(n＝3个假手术，7个移植)中的总脾细胞计数的条形图。
图3H是从对照和经TEP移植的裸小鼠的脾脏和淋巴结分离的体外模拟T细胞的激活标记物Cd25和Cd69的代表性流程曲线(CD25：n＝5个假手术，9个移植；CD69：n＝4个假手术，9个移植)。
图4A至图4C示出了TEP移植物和原代人类新生儿胸腺样本的单细胞mRNA测序数据(scRNAseq)的t-分布式随机邻域嵌入(tSNE)可视化。(移植物n＝2(17周)，通过两种不同方法制备的原代胸腺n＝1)。(图4A)聚类分析揭示了样本内的不同的细胞群。(B)聚类的逐物种可视化对应于4A中的聚类标记。(图4C)scRNAseq数据的逐样本可视化显示出移植物来源的和原代胸腺来源的TEP/TEC的重叠。
图4D是常见免疫相关基因的精选热图。
图4E是示出关键胸腺标记物的聚类特异性基因表达的小提琴图。
图4F是示出T细胞标记物的聚类特异性基因表达的小提琴图。
图4G是示出关键树突和抗原呈递细胞标记物的聚类特异性基因表达的小提琴图。
图5A是原始聚类亚群体的tSNE可视化，其中划分出了TEP聚类和TEC聚类。
图5B是在TEP/TEC群体的亚聚类分析之后的tSNE可视化。
图5C是亚聚类的TEC群体的逐样本tSNE可视化。
图5D是速度分析，示出了TEC群体的预测发育方向性。
图5E是TEP亚群的伪时间分析，示出了样本特定的发育轨迹。
图5F是分支点热图，示出了在伪时间分析的分支点处差异表达的基因。
图5G是小提琴图，示出了关键胸腺标记物在TEP/TEC群体中的基因表达分布。
图6A是原始聚类的tSNE可视化，其中划分出了小鼠T细胞。
图6B是示出小鼠来源的T细胞的亚聚类的tSNE分析。
图6C是小鼠来源的T细胞的伪时间分析。
图6D是分支点热图，示出了在伪时间分析的分支点处差异表达的基因。
图6E示出了发育中的T细胞的关键标记物的基因特异性伪时间轨迹。
图6F是小提琴图，示出了发育中的T细胞的关键转录因子和细胞表面标记物的基因表达分布。小图A至B是在6周后T细胞作为STOC的示例性存在的图表。
图7A是将外周血单核细胞(PBMC)重编程为患者特异性诱导多能干细胞(iPSC)的工作流程的示意图。
图7B是FOXN1基因和用于插入HA、P2A和Clover序列的策略的示意图。
图7C是来自图7B中概述的实验的结果。
图7D示出了多能性标记蛋白OCT4(绿色)、SOX2(红色)和NANOG(品红色)的免疫荧光分析。
图7E是iPSC中多能性标记基因OCT4、SOX2和NANOG的qPCR分析。数据显示为技术重复的平均值。值是相对于ACTB进行归一化和设置的。人类胚胎干细胞用作阳性对照。
图7F示出了已建立的iPSC系的核型分析。
图8A是iPSC到TEP的直接分化方法的示意图。
图8B是所测试的分化条件和所使用的因子的表格。
图8C示出了在分化的第16天，第三咽囊标记物HOXA3和EYA1以及TEP标记物FOXN1的基因表达分析。数据被归一化为ACTB并且显示为平均值，其中误差线指示平均值的标准误差(SEM)，并且是相对于实验上匹配的第0天iPSC设置的(n＝5，T-6n＝1)。如使用ddCt值，通过使用Tukey多重比较检验的单因素方差分析确定p值：HOXA3＝<0.0001；EYA1****＝<0.0001，**＝0.0047；FOXN1****＝<0.0001，***＝<0.0004。
图9A是在初级聚类中的每个初级聚类中表达的前10个基因的热图分析。
图9B是T细胞发育的关键标记基因的精选热图。
图9C至图9E是与图4中基因特异性小提琴图对应的基因特异性tSNE。
图10A是每个聚类的前10个差异表达的基因的热图。
图10B是人和小鼠细胞的关键T细胞标记物的精选热图。
图10C和图10D是对应于图5中的基因特异性小提琴图的关键胸腺标记物的基因特异性tSNE可视化。
图11是胸腺基因的基因特异性tSNE可视化。
图12A是同一性组0至9中的上调和下调多的基因的热图。
图12B是图12A中的标记物的基因特异性tSNE可视化。
图12C是接受iPSC来源的移植TEP细胞(移植)的无胸腺小鼠与对照小鼠中增强的T细胞受体序列异质性的示意图。
具体实施方式
本文描述了用于通用直接分化方案的组合物、方法和系统，所述通用直接分化方案从各种不同的iPSC(患者特异性诱导多能干细胞)系产生胸腺上皮祖细胞(TEP)。iPSC可以来自各种来源，包括来自人外周血单核细胞。在移植入接受者(例如哺乳动物，例如需要此类治疗的人，或无胸腺的裸小鼠)后，所公开的TEP进一步分化成胸腺上皮细胞(TEC)。所移植的TEC是功能性的，并且可以促进对发育中小鼠T细胞的培养。
目前公开的方法和系统产生了iPSC来源的、患者特异性的TEC，所述TEC是与存在于人类原代新生儿胸腺组织中的TEC不可区分的。单细胞RNA测序分析表明，移植iPSC来源的TEP导致了在原代胸腺中发现的所有成熟TEC表型的产生。
申请人表明，本发明的方法、系统和组合物提供了一种通用的直接分化方案，所述方案从各种iPSC系产生TEP(在图1A中示意性描述)。目前公开的细胞、方法和系统还可用于在受试者中产生成熟的、功能性的胸腺上皮。在一些实施方式中，所公开的方法和系统可用于在遭受不存在胸腺、受损的胸腺、功能障碍的胸腺、患病的胸腺、或老化的胸腺的受试者中产生功能性的自生胸腺。
胸腺
胸腺是一种腺器官，其对于通过提供发育中的T细胞的阳性和阴性选择来产生功能性的适应性免疫系统至关重要。胸腺是内胚层来源的组织，并且起源于胚胎发育期间的第三咽囊(TPP)。TPP中的胸腺上皮祖细胞(TEP)可以通过标记胸腺原基的主转录因子FOXN1的表达来鉴定，所述胸腺原基被支持的间充质细胞包围。FOXN1，对于TEP以及随后的功能性胸腺的发育是必要的。在小鼠和人类两者中，破坏FOXN1导致了先天无胸腺。成年人胸腺中Foxn1的丢失导致胸腺萎缩，类似于在老年个体中观察到的情况。虽然TEP的规格与Foxn1表达无关，但是Foxn1是从TEC分化功能性胸腺上皮细胞(TEC)所必需的。此外，TEP分化成功能性胸腺上皮细胞(TEC)依赖于与发育中的T细胞的相互作用。功能性TEC可基于其位置和功能分为两个不同的亚型：皮层TEC和髓质TEC(分别是cTEC和mTEC)，并且可分别通过细胞角蛋白8和细胞角蛋白5的表达来鉴定。两种TEC亚型都起源于以两种角蛋白的共表达为标志的共同TEC祖先。首先阳性选择以CD4和CD8的共表达为标志的发育中的T细胞，以便在作为单个阳性CD4 T细胞或CD8 T细胞迁移到胸腺髓质中之前成功地与cTEC上携带人白细胞抗原(HLA)复合蛋白的自身肽相互作用。这一过程被称为阳性选择，并且只有与HLA/肽强烈相互作用的T细胞才能接收到存活信号，而大多数发育中的T细胞会因忽视而经历死亡。在胸腺髓质中，mTEC在经由通过向经阳性选择的T细胞呈递自身抗原进行阴性选择的过程建立中枢免疫耐受中至关重要。过强地与自身抗原相互作用的自体反应性T细胞被清除，而非反应性的功能性T细胞迁移到外周中。没有或改变的阴性选择导致了自体免疫性疾病，包括1型糖尿病(T1D)的发展。虽然胸腺在年轻个体中非常有活性，但是该器官在青春期年龄左右开始退化，并且原初T细胞输出迅速下降。某些临床治疗，包括化疗，加速了胸腺退化。生成患者特异性人类胸腺的能力将为研究人类胸腺生物学提供有吸引力的平台，并刺激用于多种方法的新颖模型系统和治疗方式的开发。事实上，我们目前关于胸腺发育和功能的知识中的大部分是基于动物模型研究，并且需要在人类环境中进行翻译和扩展以便实现更好的理解，所述更好的理解将允许开发新颖的治疗。
胸腺上皮祖细胞(TEP)可以通过人胚胎干细胞的定向分化产生。从不同iPSC系有效分化患者特异性TEP的能力还有待详细证明。本文公开了关键信号传导通路操纵的系统评估在开发用于从患者特异性iPSC定向分化TEP的通用方案中的用途。患者特异性TEP进一步分化为功能性TEC。这些功能性TEC被证明具有在无胸腺裸小鼠中时培养发育中的T细胞的能力。单细胞RNA测序(scRNAseq)分析显示，这些功能性的、iPSC来源的TEC是与存在于原代新生儿胸腺组织中的TEC无法区分的，表明所公开的TEC具有成熟的表型。所公开的细胞、方法、方案和系统为开发以患者特异性方式研究和模型化胸腺功能的创新技术和能力提供了关键平台。所公开的细胞、方法和系统将提供新颖的治疗方式的开发。
本文公开了用于从诱导多能干细胞(包括所有测试的细胞系)产生胸腺上皮祖(TEP)细胞的通用方案、方法和系统。例如，本文公开了从来源于各种体细胞来源的iPSC并通过不同的重编程方式产生的TEP的结果。当移植到无胸腺裸小鼠体内时，所公开的TEP产生了具有培养发育中的小鼠T细胞的能力的功能性胸腺上皮细胞(TEC)。目前公开的iPSC来源的TEC是与存在于原代组织(例如新生儿人类供体胸腺)中的TEC无法区分的(通过scRNAseq分析)。这些结果提供了进一步的证据证明所公开的组合物、方法和系统能够产生相关的胸腺细胞，这将通过提供用于产生患者特异性胸腺细胞的构架来影响基础和翻译研究。
诱导多能细胞可以从各种来源获得。在大多数实施方式中，iPSC是患者特异性细胞，即从患者获得并通过本领域中众所周知的方法重编程的细胞。如下所述，被重编程的细胞的来源可以是各种组织、器官、系统等。在一些实施方式中，待重编程的细胞是造血细胞，例如造血干细胞或外周血单核细胞(PBMC)。在许多实施方式中，所公开的方法和系统可用于获得高产量的表达一种或多种第三咽标记物(例如HOXA3(例如HOXA3蛋白))和/或胸腺标记物FOXN1(例如FOXN1 mRNA)的细胞。在许多实施方式中，所公开的TEP细胞可表达标记物DLK1和/或INHBA中的一者或多者。在许多实施方式中，所公开的标记物中的一种或多种标记物的表达对于鉴定人TEP可为有用的和/或新颖的。在大多数实施方式中，所公开的用于产生TEP的方案和系统可用于TEC的进一步分化和产生。
所公开的细胞、方法和系统可用于通过使用具有已知胸腺表型的患者特异性和/或组特异性TEC来模拟和研究各种发育和功能性胸腺缺陷。此外，所公开的组合物、方法和系统可用于产生功能性人胸腺上皮以用于各种患者(例如具有先天性出生缺陷、与年龄或临床干预相关的胸腺退化的患者)的细胞/组织疗法，或者用于以患者特异性、同基因方式产生功能性T细胞。
所公开的分化的胸腺上皮细胞表达原代胸腺细胞(即来自具有起作用的胸腺的受试者的胸腺细胞，例如新生儿胸腺细胞)的各种典型基因和标记物。在许多实施方式中，所公开的TEC上调一种或多种髓质TEC标记物(例如KRT5)和一种或多种皮层TEC标记物(例如KRT8)。所公开的TEC还可表达和/或上调FOXN1、HLA-II类分子(例如HLA-DR4)和DLL4中的一者或多者。在许多实施方式中，所公开的TEC可以显示出与在原代人胸腺中发现的相似的各种标记物(例如标记物FOXN1、KRT5、KRT8、TP63、CBX4)的表达。在一些实施方式中，目前公开的iPSC来源的TEC可能无法通过单细胞RNA测序或其他方法来与原代人TEC区分开。
对在目前公开的用于体外产生胸腺细胞的直接分化过程期间操纵信号传导通路的效应的仔细评定表明，所公开的方法是稳健的。例如，申请人惊奇地发现，所公开的方法和系统可用于在第5天建立预先确定的内胚层细胞群，尽管对细胞进行了不同的操纵。具体地，如图1D所示，所公开的方法和系统导致细胞表达高水平的第三咽标记物(图1D)。TPP标记物HOXA3蛋白的定量显示，用所公开的方法分化的细胞中的约40％表达这种标记物。这些结果是双重的：第一，显示了靶组织的合理诱导，并且第二，突出了所公开的方法和系统的可能优化以在这个分化步骤处实现更高的效率(图1E和图1F)。
本文公开了将由两个独立的iPSC系产生的TEP移植到无胸腺裸小鼠体内的实验。将TEP沉积在小鼠的肾包膜下，然后通过不同的参数评估其成熟度。如本领域中众所周知的，裸小鼠由于缺乏功能性Foxn1蛋白而是无胸腺的，但是如果提供人或小鼠的功能性胸腺，则所述裸小鼠含有可产生T细胞的HSC。在各种实施方式中，所公开的细胞可以以各种方式施用于接受者。在一些实施方式中，TEP细胞可以植入接受者体内的不同位置。在一些实施方式中，TEP细胞可以肌内地(例如大腿)、皮下地、腹膜内地植入肾包膜、网膜、肝脏(例如通过灌注，例如通过门静脉)、在肝叶之间、和/或在胸的上前方、在胸骨下方。
分析含有iPSC来源的移植TEP的移植物中角蛋白5和角蛋白8的存在。这些研究揭示了移植物内的区域让人想起了发育中的人胸腺组织。具体而言，移植物具有特征性的双阳性、发育中的TEC，以及更成熟的单阳性TEC。在发育中的胸腺结构附近也发现了对小鼠CD4和CD8呈双阳性的发育中的T细胞，证明了TEC是功能性的并且能够培养小鼠T细胞。与对照裸小鼠相比，在承载移植物的小鼠的外缘发现了更多的单阳性T细胞，这与增加此类细胞的频率的功能性胸腺相一致。
所公开的细胞可表达成熟、分化的TEC细胞的各种典型标记物。在一些实施方式中，所表达的标记物可以是FOXN1、HOXA3、EYA1、AIRE、CK5、CK8、CXCL12、CCL25、DLL4和HLA-DR中的一者或多者。在各种实施方式中，在相似条件下，与参考细胞中的标记物相比，标记物可差异地表达(例如，体外培养的TEP细胞可与体内移植的TEC细胞相比)达大于约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、或500倍，以及小于约1000倍、500倍、400倍、300倍、200倍、100倍、90倍、80倍、70倍、60倍、50倍、40倍、30倍、20倍、10倍、9倍、8倍、7倍、6倍、5倍、4倍、3倍、或2倍。在一些实施方式中，参考细胞或所公开的细胞可以选自新生儿胸腺细胞、未移植的TEP细胞、和移植的TEC。例如，所述标记物可在TEP细胞中表达与在移植的TEC细胞中相比多10倍多，或者在移植的TEC细胞中表达与在TEP细胞中相比多10倍多。
对移植前体外产生的iPSC来源的TEP、来自两个不同iPSC系的4个TEC移植物和2个原代人胸腺的比较全局转录组学分析进一步证实移植的细胞分化成了功能性TEC。例如，特定的TEC标记物在iPSC来源的TEC中比在TEP中显著富集，而表达水平类似于原代人胸腺中的表达水平(图3C至图3E)。一个例外是胸腺基因AIRE，其对发育中的T细胞的阴性选择至关重要，但在移植物中不存在。不希望受到理论限制，申请人注意到这种不存在可能是由于人TEC与小鼠T细胞的异种移植相互作用。值得注意的是，采用hES来源的TEP进行移植的先前研究也未能检测到AIRE表达。虽然用于全转录组分析的批量RNA测序允许通过增加测序深度来检测甚至低表达的基因，但是它不能消除所测定的样本内的异质性。
对来自移植物的单独细胞采用scRNAseq，并将结果与原代新生儿胸腺进行比较。这允许鉴定数千个单独细胞的表达谱，从而允许以高置信度对样本内的不同细胞类型进行分类。使用无监督聚类分析来定义样本移植物内的特定亚群体，并使用标记物表达谱向聚类亚群体分配特定功能细胞。使用生物信息学分析进一步以高置信度在人类细胞与小鼠细胞之间进行区分。如所预期的，在来自异种移植的TEC移植物中发现了小鼠细胞和人细胞两者，但是在原代胸腺中没有发现小鼠细胞。大多数小鼠细胞存在类似于支持间充质细胞的转录组，但是还鉴定出了抗原呈递树突细胞，以及最重要的是发育中的T细胞。从原代胸腺测定出的大多数细胞是发育中的T细胞，特征性的TEC被鉴定出并聚类在一起。此外，还鉴定出了其他亚群体，包括已知存在于胸腺中的树突细胞和间充质细胞。这些结果表明，在iPSC来源的移植物中存在少量但可感知的TEC亚群体，并且这些细胞与原代TEC聚类在一起。(图5A和图5C)。重要的是，iPSC来源的TEC以类似于在原代胸腺组织中看到的水平表达成熟TEC的关键标记物，例如FOXN1、AIRE、EPCAM、KRT5、KRT8、DLK1、PRSS16、PSMB11、CXCL12和CCL25(图5G)。因此，目前公开的iPSC来源的TEC无法通过所采用的生物信息学分析与原代TEC区分开，证明了所公开的方法和系统可用于产生功能性TEC。
生成的数据集有助于验证iPSC来源的TEC和原代TEC均表达特征标记基因，并且可进一步分为亚类。这种分析表明激活素信号传导通路与TEP至TEC分化有关(图5G)。
所公开的细胞、方法和系统提供用于将患者特异性iPSC分化成TEP细胞的通用方案，所述TEP细胞可以在体外进一步分化成功能性和成熟的TEC。两个指标可用于促进产生目前公开的TEC；提供三维培养条件，所述三维培养条件可为胸腺发育和(随后)与发育中的T细胞的相互作用提供合适的结构。在一些实施方式中，如前所述，胸腺器官型培养物(thymic organotypic culture,RTOC)的再聚集可为有用的。在这种系统中，来自原代人胸腺的上皮和间充质隔室的生长可以由特定的培养基组合物支持。在扩增后，两种细胞类型都可以与从各种来源(例如脐带血)分离的CD34阳性细胞再聚集到一起，以产生RTOC。RTOC可用于支持T细胞的发育，并且因此代表了用于研究T细胞培养的各方面的卓越系统。然而，使用RTOC也有缺点。具体地，T细胞祖先的同种异体来源可能会阻碍某些实验，尤其是那些需要选择性、患者特异性环境的实验。
一种类似的3D策略最近被描述为人工胸腺器官(artificial thymic organoid,ATO)。ATO组合了iPSC来源的胚胎中胚层祖细胞，所述祖细胞随后当与过表达DLL4的鼠骨髓来源的基质细胞系(MS5-hDLL4)共培养时可产生经阳性选择的T细胞的各种库。申请人在本文中描述了使用目前公开的通用方案来产生可能有助于各种研究工作的TEP。在一些情况下，所公开的方案和系统可用于组合正在进行的研究项目的各方面，以建立可以提供发育中的T细胞的阳性和阴性选择两者的同基因培养系统。在其他方面中，所公开的细胞和方案可用于产生不同的患者特异性T细胞，包括调节细胞，以及促进功能性人胸腺细胞类型的发育。所公开的细胞、方案和系统可有助于加速各种细胞疗法的开发，并有助于用于理解胸腺和T细胞生物学的基础和翻译研究工作。
定义
术语“同种异体移植物”是指施用于接受者患者或受试者的来自供体的细胞。供体可符合某些标准，但是所施用的细胞并非来源于接受者。在这些情况下，所施用的细胞可以在施用于接受者之前从供体中提取、处理和/或扩增。在许多实施方式中，在施用前，移植细胞可接受外来生物物质，例如核酸和/或蛋白质。
术语“自体移植物”是指施用于接受者的来源于接受者的细胞。在这些情况下，可以从接受者中提取施用的细胞、进行处理和/或扩增，然后再施用回至患者。在许多实施方式中，自体移植细胞在被施用回至接受者之前可以接受外来生物物质，例如核酸和/或蛋白质。
术语“异种移植物”是指施用于受体的来源于另一物种的供体的细胞。
术语“胸腺上皮细胞”或“TEC”是指位于胸腺基质内的胸腺上皮中的具有高度解剖、表型和功能异质性的特化细胞。胸腺作为一级淋巴器官，介导T细胞的发育和成熟。TEC分别基于其在胸腺皮质或髓质内的定位而进一步分为皮层TEC和髓质TEC(cTEC和mTEC)。
术语“胸腺上皮祖细胞”或“TEP”细胞是指干细胞的早期后代，所述早期后代可以分化形成一种或多种类型的胸腺上皮细胞，但不能无限分裂和繁殖。
术语“造血干细胞”、“HPSC”或“HSC”是指形成血液和免疫细胞(例如，白血细胞、红血细胞、和血小板)的干细胞。
术语“多能干细胞”或“PSC”是指具有在适当条件下产生几种不同T细胞类型的子代的能力的细胞，所述几种不同T细胞类型是所有三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的衍生物。多能干细胞的示例是胚胎干(ES)细胞、胚胎生殖干(EG)细胞、iPSC、和成体干细胞。PSC可以来自任何感兴趣的生物体，包括灵长类动物，例如人、犬、猫、鼠、马、猪、禽类、骆驼、牛、绵羊等。
术语“人胚胎干细胞”或“hESC”是指这样的细胞，所述细胞a)能够自我更新，b)能够分化以在生物体中产生所有类型的细胞，以及c)来源于发育中的生物体或是来源于发育中的生物体的已建立的ES细胞系。ES细胞可来源于发育中的生物体的囊胚的内部细胞团块。ES细胞可来源于由单个卵裂球活检(single blastomere biopsy,SBB)产生的卵裂球，所述活检涉及从发育中的生物体的八个T细胞阶段取出单个卵裂球。总的来说，SBB提供了一种非破坏性的替代方案来进行内部细胞团块分离。ES细胞可以进行长时间段培养，与此同时保持分化成生物体中所有类型细胞的能力。在培养中，ES细胞通常生长为具有大核质比、明确的边界和突出的细胞核的扁平集落。此外，ES细胞表达SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81和碱性磷酸酶，但不表达SSEA-1。
术语“诱导多能干细胞”或“iPSC”是指这样的细胞，所述细胞a)能够自我更新，b)能够分化产生生物体中的所有类型的细胞，并且c)来源于体细胞。iPSC具有ES细胞样形态，生长为具有大核质比、明确的边界和突出的细胞核的扁平集落。此外，iPSC表达一种或多种本领域普通技术人员已知的关键多能性标记物。iPSC可以通过向细胞提供“重编程因子”，即一种或多种例如生物活性因子的混合物来产生，所述生物活性因子作用于细胞以改变转录，从而将细胞重编程为多能性，这是本领域技术人员众所周知的。
术语“细胞系”是指大体上或基本上相同的细胞的群体，所述群体通常来源于单个祖先细胞或来源于确定的和/或基本上相同的祖先细胞群体。细胞系可能已经或可能能够在培养物中维持延长的时间段(例如，数月、数年、无限的时间段)。
术语“内胚层”是指在动物胚胎发生期间形成的胚层，所述胚层产生胃肠道、呼吸道、内分泌腺和器官、听觉系统的某些结构、和泌尿系统的某些结构。
术语“转化生长因子β”、“TGF-β”和“TGFB”是指属于转化生长因子β(TGFβ)超家族的TGFB分泌蛋白。TGFB(TGFB1、TGFB2、TGFB3)是多功能肽，所述多功能肽调节增殖、分化、粘附和迁移并且存在于许多细胞类型中。成熟肽可以作为同二聚体或与其他TGFB家族成员的异二聚体存在。TGFB与细胞表面上的转化生长因子β受体(TGF-βR、或TGFBR)相互作用，这种结合激活MAP激酶引导的、Akt引导的、Rho引导的和Rac/cdc42引导的信号转导通路，细胞架构的重组和SMAD蛋白的核定位，以及靶基因转录的调节。本发明中特别感兴趣的是TGFB信号传导的抑制剂，所述抑制剂可由本领域普通技术人员通过本领域中众所周知的多种方法中的任何一种方法容易地鉴定出，所述多种方法是例如用于与TGFB或TGFB受体结合的竞争性结合测定、或功能测定，例如测量对下游信号传导蛋白例如MAPK、Akt、Rho、Rac和SMAD(例如AR-Smad)等的活性的抑制。
术语“WNT”是指在胚胎发生和成熟组织两者中起关键作用的分泌的高度保守信号传导分子家族。人类WNT基因家族具有至少19个成员(Wnt-1、Wnt-2、Wnt-2B/Wnt-13、Wnt-3、Wnt3a、Wnt-4、Wnt-5A、Wnt-5B、Wnt-6、Wnt-7A、Wnt-7B、Wnt-8A、Wnt-8B、Wnt-9A/Wnt-14、Wnt-9B/Wnt-15、Wnt-10A、Wnt-10B、Wnt-11、Wnt-16)。Wnt蛋白通过结合Wnt受体复合物来调节细胞活性，所述Wnt受体复合物包含来自Frizzled(Fz)蛋白家族的多肽和低密度脂蛋白受体(low-density lipoprotein receptor,LDLR)相关蛋白(low-density lipoproteinreceptor-related protein,LRP)蛋白质家族的多肽。一旦被Wnt结合激活，Wnt受体复合物就将激活一个或多个细胞内信号传导级联。这些细胞内信号传导级联包括规范的Wnt信号传导通路；Wnt/平面细胞极性(Wnt/PCP)通路；和Wnt-钙(Wnt/Ca2+)通路。
术语“治疗”等在本文中通常用于意谓获得所需的药理学和/或生理学效应。该效应在完全或部分预防疾病或其症状方面而言可以是预防性的和/或在部分或完全治愈疾病和/或可归因于所述疾病的不良影响方面而言可以是治疗性的。如本文所用的治疗涵盖对哺乳动物的疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防疾病在可能易患所述疾病但尚未被诊断为患有所述疾病的受试者中发生；(b)抑制疾病，即阻止疾病的发展；或(c)缓解疾病，即引起疾病的消退。治疗剂可以在疾病或损伤开始之前、期间或之后施用。持续疾病的治疗是特别令人感兴趣的，其中所述治疗稳定化或减少患者的非期望临床症状。此类治疗理想地在患病组织的功能完全丧失之前执行。主题疗法将理想地在疾病的症状阶段期间施用，并且在一些示例中在疾病的症状阶段之后施用。
术语“病症”、“疾患”和“疾病”可互换使用。在大多数情况下，这些术语是针对免疫病症的，所述免疫病症可包括与受损、耗竭、老化、功能障碍或缺失的胸腺组织有关的任何一种或多种病症，和/或与之相关的T细胞疾患，例如自身免疫疾患、和/或T细胞发育疾患。在一些情况下，所公开的免疫疾患可以是1型糖尿病，和/或可能受益于自身抗原耐受性的诱导或重新引入的其他病症。
术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用并且是指任何需要诊断、治疗或疗法的哺乳动物受试者，特别是哺乳动物，包括人类。
在细胞培养上下文中的术语“培养基”或短语“细胞培养基”是指适于培养各种细胞的细胞生长培养基，所述各种细胞包括所有上述细胞，例如PS细胞、DE细胞、AFE细胞、VPE细胞、TEP细胞。细胞培养基的示例包括最低必需培养基(Minimum Essential Medium,MEM)、伊格尔培养基、杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium,DMEM)、杜氏改良伊格尔培养基/营养混合物F-12(DMEM/F12)、F10营养混合物、Ham F10营养混合物、Ham F12营养混合物、培养基199、RPMI、RPMI 1640、减血清培养基、基础培养基(basal medium,BME)、DMEM/F12(1:1)等，以及它们的组合。培养基或细胞培养基可以通过添加一种或多种添加剂来改性。添加剂可包括血清，例如胎牛血清和/或血清替代剂，例如B27、N2、KSR以及它们的组合；以及分化因子，例如RA受体激活剂、nodal、Act-A、Act-B、Wnt家族成员、BMP信号传导激活剂、TGF-β信号传导抑制剂、FGF、刺猬信号传导(hedgehogsignaling)抑制剂等以及它们的组合。
如本文所用，“表达”及其语法等同物，在标记物(蛋白质、基因、转录物等)的上下文中是指标记物的生产以及标记物的水平或量。例如，在细胞中表达标记物、或存在标记物、或细胞是针对标记物呈阳性的，是指以与阳性对照水平相似的水平表达标记物。阳性对照水平可以通过由已知具有与标记物相关联的细胞命运的细胞所表达的标记物的水平来确定。类似地，没有标记物表达或细胞针对标记物呈阴性，是指标记物以与阴性对照水平相似的水平表达。阴性对照水平可以通过由已知不具有与标记物相关联的细胞命运的细胞表达的标记物的水平来确定。因此，不存在标记物并不仅仅意味着不可检测的标记物表达水平，在某些情况下，细胞可以表达所述标记物，但是表达与阳性对照相比可能较低，或者可能处于与阴性对照相似的水平。
如本文所用，“标记物”是指任何可以测量或检测的分子。例如，标记物可包括但不限于核酸，例如基因的转录物、基因的多肽产物、糖蛋白、碳水化合物、糖脂、脂质、脂蛋白、碳水化合物、或小分子(例如，分子量小于10kDa的分子)。
胸腺发育和功能的缺陷可能导致免疫缺陷和自身免疫性疾病的发作。因此，胸腺的适当发育对于确保个体天生具有识别和响应于外来抗原的能力，与此同时还耐受自身抗原至关重要。到目前为止，很少有研究询问参与人胸腺发育的机制。这主要是由于缺乏用于人胸腺发育的足够模型系统，并且由于缺乏可靠的研究工具(例如针对人类FOXN1的高质量抗体)而进一步恶化。传统上，对胸腺发育和自身免疫的研究主要局限于小鼠模型。这主要是由于缺乏发育中的人类胸腺的可用性，并且缺乏可靠的体外人类胸腺模型。本文描述了以人类和患者特异性方式研究胸腺发育所必需的工具和模型。
胸腺分为两个不同的隔室，即皮质和髓质，所述皮质和髓质分别由胸腺上皮细胞cTEC和mTEC的表型上和形态学上不同的子集构成。cTEC和mTEC在T细胞发育中执行不同的功能，其中cTEC在发育中的T细胞的阳性选择中发挥作用以表达CD3、CD4和CD8表面受体，并且mTEC在自体反应性T细胞的阴性选择过程中发挥作用。这些子集可以通过使用各种标记物，例如针对cTEC的DLL4和K8、和针对mTEC的AIRE和K5来区分。在一些示例中，可以在STOC中检测到这些TEC亚型特异性标记物的存在。
已经建立了定向分化系统来从hESC产生TEP细胞，所述TEP细胞可能能够进一步成熟为具有在体内移植后支持T细胞培养的能力的功能性TEC。然而，当应用于iPSC时，相同的方案并未有效将iPSC体外分化成TEP细胞。因此，目前公开的通用定向分化方案有效地区分了来自不同来源的各种iPSC系。
本公开描述了一种模型系统，所述模型系统从iPSC衍生TEP细胞并且有效区分所有测试的iPSC系。在一些实施方式中，TEP细胞可以来源于患者特异性人iPSC。还描述了一种FOXN1报道基因系，其中报道基因被附加至内源性FOXN1基因。在一些示例中，报道基因可以是由内源性FOXN1表达驱动的荧光报道基因。这种系统可以允许出于各种目进行FOXN1的可视化和/或免疫沉淀。在一些实施方式中，可以标记FOXN1以帮助分析发育中的TEP细胞中的染色质结合和/或分离FOXN1+细胞以用于基因表达分析。
所公开的分化方案和系统可用于赋予对同种异体移植物的供体特异性免疫耐受性。
如本文所用，除非另有明确规定的内容，否则单数形式“一”、“一个(种)”和“该”涵盖具有复数指代物的实施方式。如在本说明书和所附权利要求中所用的，除非另有明确规定的内容，否则术语“或”通常以其包括“和/或”的含义使用。
实施例
为了说明本公开，包括以下实施例。然而，应当理解的是，这些实施例并不限制本公开，并且仅意味着建议实践本公开的示例性方法。
结果-生成了用于从患者特异性iPSC定向分化胸腺上皮祖细胞的通用方案
使用如所述的非整合游离载体从脐带血来源的外周血单核细胞(PBMC)在实验室产生产生几个iPSC系CB3、CB5和CB74(图7A，实施例1的材料和方法)。细胞系NHDF2.1是利用基于RNA的重编程从人新生儿皮肤成纤维细胞产生的并且如先前所述。使用同源重组结合CRISPR/Cas9技术将由P2A自切割肽分离的HA表位标签和核定位信号拴系Clover荧光报道基因靶向至NHDF2.1中紧接在终止密码子之前的内源性FOXN1基因座，以产生子细胞系NHDF2.2(图7B)。然而，尽管转基因被正确地靶向至该位点(图7C)，但是荧光报道基因对于监测内源性FOXN1表达并不可靠。不希望受到理论的限制，这可能是由于选定的靶向策略导致的蛋白质合成减少。因此，在此没有分析这种转基因。替代地，细胞系NHDF2.1和NHDF2.2可互换使用。
所公开的组合物、方法和系统可用于将iPSC体外分化成功能性TEP细胞。在许多实施方式中，所公开的iPSC可以从各种来源，包括细胞系、自体来源和同种异体来源获得或得到。在许多实施方式中，可以使用各种方法创建iPSC。
通过qPCR和免疫荧光染色，本研究中的克隆iPSC系分别以与对照Mel1hESC相当的水平表达多能性标记转录物和蛋白质OCT4、SOX2、NANOG(图7D、图7E)。除一个外，所有被测定的iPSC系都显示出正常的核型(图7F)。具体地，细胞系NHDF2.2在通过g带核型分析进行分析的所有细胞中都包含14号染色体的三体(iPSC中的常见异常)(图7F)。
已报道了通过定向分化产生hESC来源的TEP。除了这些发现之外，还分析了终末内胚层(definitive endoderm,DE)和/或第三咽囊(third pharyngeal pouch,TPP)阶段的不同变化对TEP阶段的FOXN1表达的影响。发现在分化方案的第9天，各种测试条件导致了TPP标记物HOXA3和EYA1的稳健转录表达(图1A至图1C)。此外，在所有分化方案的第14天，HOXA3和EYA1表达增加并保持高(图1D)。
在所测试(并列于图1B中)的条件中，条件4被鉴定为在第9天和第14天均诱导最高水平的FOXN1转录物(图1C、图1D)。用条件4分化的第9天培养物的免疫荧光分析和定量显示有约45％的HOXA3+细胞，表明了有效的TPP生成(图1E、图1F)。
与本文所公开的其它条件一样，条件4分化是在iPSC铺板后24小时开始的。具体地，在X-VIVO10培养基(Lonza 04-743Q)中进行分化，其中以指定浓度添加以下因子：100ng/ml的激活素A(第0天至第4天)；50ng/ml的Wnt3a(第0天和第9天至第13天)；6nM的TTNPB(RAR激动剂)(第4天至第13天)；20ng/ml的BMP4(第5天至第13天)；5μM的LY364947(第5天至第13天)；50ng/ml的FGF8b或FGF8a(第9天至第13天)；100ng/ml的SAG(第5天至第8天)；0.25μM的SANT-1(第9天至第13天)；1:5000(第0天)或1:2000(第1天至第4天)的胰岛素-转铁蛋白-硒。在许多实施方式中，各种补充剂和/或因子可用于改善和/或稳定化产生的细胞表型。在各种实施方式中，补充剂可选自0.1mM的Trolox；10μg/ml的肝素；50μg/ml的2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐；0.5μg/ml的氢化可的松；1:2000的胰岛素-转铁蛋白-硒；1倍的非必需氨基酸；20ng/ml的EGF。补充剂和因子可以从各种来源获得，例如StemcellTechnologies(激活素A，SAG,TTNPB)、R&D Systems(BMP4和FGF8)、Novus Biologicals(Wnt3a)、PeproTech(FGF8a和FGF8b)、VWR(TTNPB和LY364947)、Selleck Chemicals(SANT-1)、Gibco(ITS和NEAA)、Sigma-Aldrich(2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐、肝素、氢化可的松)、Millipore-Sigma(Trolox)。
用另外2个iPSC系测试条件4的改良TEP分化方案，总共有三个独立的iPSC细胞系(NHDF2.2、CB3、CB5)。第14天培养物的qPCR分析显示对第三咽囊(TPP)标记物HOXA3和EYA1以及TEP标记物FOXN1的稳健诱导(图1G)。总之，这些结果表明建立了用于从各种人类iPSC有效产生TEP的定向分化方案—一种通用的分化方案。在这些实验中，通过使用不同重编程技术对来源于多个供体的iPSC进行有效测试证明了通用性。
iPSC可以从各种来源获得。在一些实施方式中，来源可以是皮肤、子宫组织、肾脏、肝脏、肌肉、肾上腺、血液等，并且细胞可以是神经元细胞、成纤维细胞、肌细胞、角化细胞、肝细胞、B细胞等。
在先前，TGFβ与胸腺器官发生和功能期间有关。因此，执行实验以确定将TGFβ添加到TEP分化方案中是否将导致从iPSC更有效和稳健地产生TEP(图8A、图8B)。目前的数据表明，在前肠内胚层(anterior foregut endoderm,AFG)至TEP期间或在TPP至TEP阶段期间加入TGFβ对iPSC至TEP的分化效率具有很小的影响(图8B和8C)。此外，TGFβ的加入对TPP标记物HOXA3和EYA1的诱导没有影响(图8C)。
实施例1-材料和方法
细胞培养
根据制造说明，将未分化的iPSC维持在基质胶(Corning)上的mTeSR1(StemcellTechnologies)、NutriStem(Biological Industries)或mTeSR+(Stemcell Technologies)中。为了分化，将iPSC以3.15e5个细胞/cm2铺板在基质胶上。分化在铺板后24小时开始，并在X-VIVO10(来自Lonza的无血清造血细胞培养基；04-743Q)中进行。添加以下浓度的因子：100ng/ml的激活素A(第0天至第4天)；50ng/ml的Wnt3a(第0天和第9天至第13天)；6nM的TTNPB(RAR激动剂)(第4天至第13天)；20ng/ml的BMP4(第5天至第13天)；5μM的LY364947(第5天至第13天)；50ng/ml的FGF8b或FGF8a(第9天至第13天)；100ng/ml的SAG(第5天至第8天)；0.25μM的SANT-1(第9天至第13天)、1:5000(第0天)或1:2000(第1天至第4天)的胰岛素-转铁蛋白-硒。天数反映了条件4所用的时间，根据图1B，针对其他条件的因素的时序可能不同。
分化培养基中的因子的添加和时序可不同。在一些实施方式中，Wnt3a在第0天存在；激活素A在第0天、第1天、第2天、第3天、第4天和/或第5天存在；视黄酸(或其类似物)在第4天和/或第5天存在；BMP4、视黄酸、LY364947和/或SAG在第5天、第6天、第7天、第8天和第9天中的一天或多天存在；并且BMP4、视黄酸、LY364947、Wnt3a、FGF8、FGF8a和SANT-1中的一者或多者在第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天和第14天中的一天或多天存在。在许多实施方式中，培养基中激活素A的浓度可以是约50-200ng/ml，例如100ng/ml，培养基中Wnt3a的浓度可以是约10-100ng/ml，例如50ng/ml，培养基中TTNPB(RAR激动剂)的浓度可以是约2-10nM，例如6nM(第4天至第13天)，培养基中BMP4的浓度可以是约5-50ng/ml，例如20ng/ml，培养基中LY364947的浓度可以是约1-10μM，例如5μM，培养基中FGF8b或FGF8a的浓度可以是约10-200ng/ml，例如50ng/ml，培养基中SAG的浓度可以是约50-200ng/ml，例如100ng/ml，并且培养基中SANT-1的浓度可以是约0.05-0.5ng/ml，例如0.25μM。
所公开的分化培养基可包含一种或多种补充剂。在各种实施方式中，对于图1G中所用的分化，可以从第9天至第13天添加以下补充剂：0.1mM的Trolox；10μg/ml的肝素；50μg/ml的2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐；0.5μg/ml的氢化可的松；1:2000的胰岛素-转铁蛋白-硒；1倍的非必需氨基酸；20ng/ml的EGF。补充剂和因子来自Stemcell Technologies(激活素A，SAG,TTNPB)、R&DSystems(BMP4和FGF8)、Novus Biologicals(Wnt3a)、PeproTech(FGF8a和FGF8b)、VWR(TTNPB和LY364947)、Selleck Chemicals(SANT-1)、Gibco(ITS和NEAA)、Sigma-Aldrich(2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐、肝素、氢化可的松)、Millipore-Sigma(Trolox)。
将PBMC收集和重编程为iPSC并收集新生儿胸腺组织
从科罗拉多大学脐带血库(http://www.clinimmune.com/cordbloodbank/)获得去标识的脐带血。人体受试者的使用得到了科罗拉多州多机构审查委员会(ColoradoMultiple Institutional Review Board)(COMIRB编号14-0842；首席研究员AJ)的批准。将人外周血单核细胞(PBMC)分离出并在含有红系扩增补充剂(StemCell Technologies)的StemSpan SFEM II培养基中扩增6天。如前所述，使用P3原代细胞4D核转染子X试剂盒L(Lonza)，用Okita因子转导红系祖细胞。将转导的细胞铺板在包被有基质凝胶的六孔板上，并在ReproTeSR培养基(StemCell Technologies)中培养14天，每隔一天更换培养基。此后，用mTESR1(StemCell Technologies)喂养培养物，每天更换培养基。在如上所述的扩增和表型分析后，在第12天至第18天之间挑取个体iPSC集落。在科罗拉多州多机构审查委员会审查并批准为非人类受试者研究后，获得了去标识的人类新生儿胸腺组织(COMIRB编号18-0347；首席调查员HAR)。
定量实时PCR
按照制造商的使用说明，使用RNeasy微量试剂盒(QIAGEN)从hPSC和TEP培养物和解剖出的移植物中提取RNA。按照制造商的使用说明，使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad，1708891BUN)执行RNA的逆转录。使用如下所列的人类特异性Taqman探针(Bio-Rad或ThermoFisher)或人类特异性引物，在CFX96触摸式实时PCR检测系统(Bio-Rad)上执行实时定量PCR。将样本归一化为内源性对照基因ACTB，并相对于未分化的iPSC绘制成曲线。
探针靶标 供应商：测定ID SEQ ID NO
ACTB ThermoFisher：Hs01060665_g1
ACTB ThermoFisher：Hs99999903_m1
AIRE Bio-Rad：qHsaCIP0029272
CCL25 ThermoFisher：Hs00608373_m1
CCXL12 ThermoFisher：Hs00171022_m1
DLL4 Bio-Rad：qHsaCEP0051500
EYA1 ThermoFisher：Hs00166804_m1
FOXN1 ThermoFisher：Hs00919266_m1
HLA-DRA Bio-Rad：qHsaCEP0040019
HOXA3 ThermoFisher：Hs00601076_m1
KRT5 Bio-Rad：qHsaCEP0055058
KRT8 Bio-Rad：qHsaCEP0041467
NANOG Bio-Rad：qHsaCEP0050656
OCT4 Bio-Rad：qHsaCEP0041056
SOX2 Bio-Rad：qHsaCEP0039595
靶标 引物序列 SEQ ID NO
ACTB F CATGTACGTTGCTATCCAGGC
ACTB R CTCCTTAATGTCACGCACGAT
NANOG F CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA
NANOG R CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC
OCT4 F CCGAAAGAGAAAGCGAACCAG
OCT4 R ATGTGGCTGATCTGCTGCAGT
SOX2 F CCATGACCAGCTCGCAGAC
SOX2 R GGACTTGACCACCGAACCC
免疫荧光
将iPSC培养物在室温(RT)下在PBS+4％多聚甲醛(PFA)中固定15分钟，用PBS洗涤三次，并在CAS-block(Invitrogen)+0.2％Triton X-100中在RT下封闭/透化30分钟。将一抗(如下所列)在CAS-block+0.2％Triton X-100中稀释，并将样本在RT下染色1小时。将载玻片用PBS+0.1％吐温洗涤三次达5分钟，并在RT下与在PBS+0.1％吐温中以1:1000稀释的二抗(Alexa Fluor标记的二抗(Invitrogen))一起孵育并染色40分钟。将载玻片在PBS+0.1％吐温中洗涤三次并在PBS中洗涤一次，然后安装在具有DAPI(Invitrogen)的ProLongGold防伪试剂中。对于组织切片，使用显微镜用切片机(microtome)从石蜡包埋的组织块上切下4-10μm的切片，并放在显微镜载玻片上。通过将载玻片在二甲苯中洗涤3次达5分钟，在100％ETOH中洗涤2次达2分钟，在95％ETOH中洗涤2次达2分钟，在70％ETOH中洗涤2次达2分钟，在40％ETOH中洗涤1次达2分钟，在H2O(自来水)中洗涤1次达5分钟来执行脱蜡和抗原回收。抗原回收是在Tris-EDTA缓冲液(10mM Tris碱(Fisher BioReagents)、1mM EDTA(KDMedical)、0.05％吐温20，pH 9.0)中执行的。将Tris-EDTA缓冲液煮沸，并放入装有沸水的电饭煲中。将载玻片加入热的Tris-EDTA缓冲液中20分钟，然后在冷自来水中洗涤10分钟。然后如上所述将载玻片封闭并染色。Z-堆栈图像是用Zeiss LSM 800显微镜拍摄的。为了进行定量分析，随机对来自每个孔的1个视野进行成像，并使用ImageJ软件手工定量总HOXA3阳性细胞占总DAPI阳性细胞的百分比。抗体如下：1:100的KRT5 Abcam(ab52635)、1:100的KRT8 Santa Cruz(sc-8020)、1:100的HOXA3 Santa Cruz(sc-374237)、1:300的FOXA2Millipore(07-633)、1:100的OCT4 Santa Cruz(sc-5279)、1:500的SOX2 Abcam(ab97959)、1:300的NANOG Abcam(ab77000)。针对小鼠CD的移植物染色是由科罗拉多大学安舒茨医学院(University of Colorado Anschutz Medical Campus)的人类免疫学和免疫疗法倡议(Human Immunology and Immunotherapy Initiative,HI3)执行的。
流式细胞术
于37℃在含有1mg/mL胶原酶IV(Worthington,Lakewood,NJ；货物号LS004189)的DMEM中离解收集的小鼠组织1.5小时。将细胞过滤(40μm)并在ACK缓冲液(LifeTechnologies,Carlsbad,CA；货物号A1049201)中裂解红血细胞，然后重悬于含2％FBS的PBS中进行分析。通过ACK裂解和离心从全血中分离白血细胞。对细胞进行洗涤并用浓度为1:10的小鼠抗体CD3、CD45(Biolegend,San Diego,CA；货物号100235,103105)染色。在CyAnADP(Beckman Coulter,Fort Collins,CO)上进行细胞计数分析，并使用Summit V5.1(Beckman Coulter)软件进行分析。
免疫组织化学
将载玻片在分级浓度的醇中脱蜡和再水合，然后于50℃在pH为6的柠檬酸盐缓冲液(Dako,Carpinteria,CA；货物号S1699)中进行抗原回收10分钟，并在洗涤缓冲液(Dako；货物号K8007)中冲洗。所有染色都在Dako自动染色仪中进行。将载玻片在双内源酶块(Dako；货物号S2003)中孵育10分钟，在无蛋白封闭液(Dakocat；货物号X0909)中孵育20分钟，然后在一抗中孵育60分钟。一抗和稀释：1:400的小鼠CD45(Becton DickinsonBiosciences,San Jose,CA；货物号550539)；1:50的小鼠CD3(R&D Systems,Minneapolis,MN；货物号MAB4841)。染色进行如下：EnVision+双重连接系统HRP(Dako；货物号K4061)中染色30分钟，并在底物-色原(DAB+)溶液(Dako；货物号K3468)中染色5分钟。将载玻片用苏木精(Dako；货物号S3301)复染10分钟。通过在Zeiss Axio成像仪A2显微镜上的至少三个非重叠视野中进行计数染色来执行细胞定量。
T细胞激活测定
通过以下方式制备来自假手术和TEP移植小鼠的脾细胞/淋巴结细胞：裂解红血细胞，然后通过CD4和CD8阴性选择纯化它们(Pan T细胞分离试剂盒II小鼠，MACS编号130-095-130)。然后将这些细胞铺板并用平板结合的抗CD3(145-2C11，10ug/mL)和可溶性抗CD28(35.11，1ug/mL)刺激24小时。在24小时后，收获细胞并通过流式细胞术用针对以下细胞表面标记物(Thy1.2APC(BD 553007)、CD25 PE(BD 553075)、CD69 PE(BD 553237)、CD4FITC(BD 553729)、CD8a PacBlue(Biologend 100725))的抗体分析其激活状态。用Thy1.2对淋巴细胞进行门控，然后用CD4和CD8亚门控以分析激活标记物CD69和CD25的细胞表面表达水平。在假手术细胞与TEP移植细胞之间进行表达水平与作为对照的Thy1群体的比较。
用于单细胞RNA测序的细胞制备
将移植物从切除的肾脏上仔细解剖出，并置于4摄氏度(℃)的0.25％胰蛋白酶中2-2.5小时。然后将移植物和胰蛋白酶的混合物于37℃放置5分钟，涡旋并穿过35μm过滤器，使用血细胞计数器计数，并稀释至100-2000个细胞/μl的浓度。对于原代胸腺样本，解剖出一小片约1cm3的组织切片，用剃刀片切碎，并在0.25％胰蛋白酶中于4℃孵育1.5小时。解剖出第二片约1cm3的组织切片，并以35μm的过滤器磨碎。将组织切片在机械搅动下用PBS洗涤5次，试图耗竭样本中的胸腺细胞并富集上皮细胞隔室。然后用剃刀片将经胸腺细胞耗竭的切片切碎，并置于0.25％胰蛋白酶中于4℃达1.5小时。然后将组织和胰蛋白酶的混合物于37℃放置5分钟，涡旋并穿过35μm过滤器，使用血细胞计数器计数，并稀释至100-2000个细胞/μl的浓度。然后将细胞悬液带到科罗拉多大学安舒茨医学院的基因组学和微阵列核心(UC Anschutz Medical Campus Genomics and Microarray Core)以在10倍基因组学铬盒上进行单细胞测序。
用于批量测序的RNA制备
对于第20天的TEP，收集24孔板中的一个孔，并重悬于350μl Qiagen RLT裂解缓冲液中。对于移植物，从切除的肾脏上解剖出TEP移植物，并将一小部分放入350μl的QiagenRLT裂解缓冲液中。然后用电子捣碎棒(Kimble)将移植物均质化。对于原代胸腺，将一小片约1-2mm3的组织切片置于500μl的RLT裂解缓冲液中。按照制造商的使用说明，使用QIAGENRNeasy微型试剂盒分离RNA。
FOXN1靶向质粒产生和iPSC靶向
使用benchling.com设计sgRNA序列：5'-gCACAGCTCATGCCAGGGCCA-3'(SEQ IDNO:)和5'-GCTGGGCACAGCTCATGCCA-3'(SEQ ID NO:)。将sgRNA序列克隆到PX459质粒(Addgene，质粒编号62988)中以产生CRISPR靶向构建体。在PUC57(701032-1)中合成携带FOXN1同源臂(HA)的供体质粒(报道基因盒)5`HA-3xHA-P2A-mClover-3`HA。通过限制性消化和DNA桑格测序进一步证实了靶向构建体。使用TrypLE于37℃下将N2编号1的iPSC解离成单细胞7分钟。使用Bio-Rad基因脉冲发生器Xcell电穿孔系统对单细胞进行电穿孔。将800万个细胞与10uM ROCKi在mTSER1培养基中混合，向其中加入20ug CRISPR靶向构建体和40ug供体质粒两者。将细胞铺板在含有mTSER1和10uM ROCKi的包被有基质凝胶的10cm平板上。在24小时后，将细胞用嘌呤霉素(0.5ug/ml)处理两天。两周后，挑取克隆集落，扩增并制备gDNA。使用裂解缓冲液(100mM TrisHCl、5mM EDTA、2％SDS和蛋白酶K)分离gDNA，之后使用异丙醇沉淀。使用引物(参见下表)通过PCR对所有集落进行基因分型，以检测报道基因盒的整合。一个引物对1L和3R扩增了报道基因盒的5'HR和3'HR外部的区域(预期条带：WT：878bp，位点特异性整合：1706bp)。另一个引物集合1L和2R扩增了报道基因盒的5'HR外部的区域和报道基因盒的Clover序列内的区域(预期条带：WT：无条带，位点特异性整合：875bp)。通过对gDNA进行PCR并对PCR产物进行桑格测序，发现一个集落含有成功的转基因位点特异性整合，称为NHDF2.2。
引物名称 序列(5'-3') SEQ ID NO:
1L AATCTACCTTCCTTGGGAGACTGG
2R TAAACGGCCACAAGTTCAGC
3R CCTCTCACACATTTCTGCCA
统计
使用GraphPad Prism软件分析数据。对ΔΔCt值执行单因素方差分析。条形图中的误差线代表平均值的标准误差。
单细胞测序
制备了文库并在Illumina上运行，并且捕获了所有4个样本的250M读段。使用10倍基因组学、Cell Ranger管线对读段进行比对，以生成特征条形码矩阵。使用人和小鼠参考物(GRCH38-和-mm10)两者来比对个体异种移植物样本读段。在胸腺样本中捕获的细胞数量是8515个，之后在经胸腺耗竭的样本中有5500个细胞，在EEE1样本中有4042个细胞，并且在HM74样本有1602个细胞。样本中每个细胞的平均读段在51767个至50644个的范围中。每个样本的原始特征-条形码矩阵在R中合并，并使用Seurat(3.1.0)管线进行分析。
预处理：基于每个细胞中独特基因的数量和存在的线粒体的百分比过滤细胞。丢弃具有少于250个基因和多于5000个基因的细胞。不对具有大于5％的人类和小鼠线粒体含量的细胞进行进一步分析，因为较高的线粒体含量与低质量细胞或死亡细胞相关。使用对数归一化方法将数据归一化为10000的比例因子。对于特征选择，如Stuart等人所详述的应用变异稳定化变换，以返回5000个特征/数据集。接下来，在线性降维之前执行线性变换(缩放)。
将细胞基于其PCA评分进行聚类，首先基于PCA空间中的欧几里得距离构造K-最近邻(KNN)图，然后通过应用Louvain算法对细胞进行聚类。进行非线性降维以生成tSNE曲线。对细胞进行鉴定，并使用Wilcoxon秩和检验发现了差异表达的基因。为了找到与细胞中的其余细胞相比对于每个聚类的标记物，使用Seurat函数FindAllMarkers，将min.pct设置为0.1并且将logfc.threahold设置为0.25，这意味着特征必须由最少10％的细胞表达并且具有大于0.25的对数变化倍数。
伪时间分析
使用Monocle管线完成伪时间分析。从Seurat对象中提取表型数据和特征数据，并创建Monocle CelldataSet类别。首先过滤掉低质量细胞以去除平板中的死亡孔或空孔、以及双联体和三联体。这是通过将最小表达设置为0.1并且num_cells_expressed>＝10来实现的。在没有标记基因的情况下对细胞进行聚类，并找出差异表达的基因。Monocle使用算法来学习当细胞经历生物变化时基因表达的变化，并将所述细胞沿着轨迹放置。降维，并基于聚类以及原始样本沿着轨迹将细胞绘成曲线。针对mT-细胞和TEP加TEC单独找出假时间依赖性基因，并在热图上绘制成曲线。
速度曲线
速度曲线是使用Velocyto管线构建的。使用组合的参考基因组在Cell Ranger输出上运行管线，以生成具有剪接信息的loom文件。从R上负载的Seurat物体取得嵌入件，并估计细胞之间的距离。估计剪接和非剪接对象的基因相对速度，并在Seurat tSNE嵌入件上示出该速度。
批量RNA测序
从Illumina测序平台产生RNA-seq读段。使用FastQC v0.11.5检查测序质量和衔接子。使用STAR(版本2.6.0c)来将测序读段与人类参考基因组(智_人GRCh38.91)进行比较和比对。使用特征计数对读段进行计数，并生成RPKM(每千碱基的转录物的读段数、每百万个经映射的读段)值。使用R包EdgeR(3.14版)完成下游分析。使用负二项分布来计算生物和技术变异性。使用费希尔精确检验测定差异基因表达。使用Benjamini-Hochberg程序控制错误发现率(False discovery rate，FDR)，并且应用FDR<0.05的截止标准以鉴定差异表达的基因。基于倍数变化(>＝|2|)和FDR值(q<0.05)选择差异表达的基因。使用R中的ggplot2创建基于(-log p值)和(Log变化倍数)的PCA(主分量分析)曲线和火山图。使用Bioconductor的ComplexHeatmap v1.10.2包执行分层聚类并生成热图。
实施例2—iPSC来源的TEP的体内成熟
已知的是，TEP需要与造血干细胞和祖细胞(HSPC)相互作用才能成熟为功能性胸腺上皮细胞(TEC)。因此，为了评定iPSC来源的TEP成熟为功能性TEC的能力，如先前所述将上述使用条件4分化的第20天TEP移植到无胸腺裸小鼠的肾包膜下(图2A)。在移植后14周至16周对小鼠实施安乐死，并制备承载移植物的肾脏以供用于多重下游分析。对解剖出的胸腺移植物与体外TEP相比的qPCR分析指示了成熟TEC标记物FOXN1、AIRE、细胞角蛋白(KRT)5和8、细胞因子CXCl12和CCL25、HLA-DR(MHC-II)和δ样典型缺口配体4(DLL4)的稳健诱导(图2B)，从而提示了进一步体内分化。
所公开的方法和系统可用于诱导成熟TEC的标记物的表达。在一些实施方式中，FOXN1、AIRE、KRT5、KRT8、CXCl12、CCL25、MHC-II和DLL4中的一者或多者的表达。在许多实施方式中，所公开的标记物的表达可相对于第20天的TEP细胞或iPSC增强大致大于约1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、或更多倍并且小于约1000倍、600倍、500倍、400倍、300倍、200倍、100倍、50倍、40倍、30倍、20倍、10倍、9倍、8倍、7倍、6倍、5倍、4倍、3倍、2倍、1.5倍、或1倍。在许多情况下，表达倍数可以基于表达相同标记物的标准细胞来确定。在一些情况下，标准细胞可以是尚未分化为TEP细胞的iPSC细胞。
探测KRT5和KRT8的移植物切片的免疫荧光染色显示单阳性细胞和双阳性细胞，指示了发育中和成熟的TEC(图2C)。这些数据表明，iPSC来源的TEC具有当移植到体内环境中时进一步分化为患者特异性TEC的能力。此外，探测小鼠CD4和CD8 T细胞标记物的移植物切片的免疫荧光分析显示，在TEC样结构附近有单阳性细胞和双阳性细胞，指示了移植物内有发育中的小鼠T细胞(图2D)。在许多实施方式中，体内环境可以是异种移植物、同种异体移植物或自体移植物。
对来自从用于移植的两个不同iPSC系(CB74和NHDF2.2)分化的第20天TEP的两个不同样本获得的移植组织(移植物1至4)的四个分化样本、从自用于每个iPSC系的单独小鼠中取出的TEP移植物获得的两个TEP样本(TEP 1和TEP 2)、以及两个原代新生儿胸腺样本(Thy.1和Thy.2)执行批量RNA-seq，所述两个原代新生儿胸腺样本用作对照。基于差异表达的基因的主分量分析显示，样本定位于反映其相应起源的三个离散簇内(即胸腺样本聚类在一起，与TEP样本分开，TEP样本也聚类在一起)，其中TEP移植物样本中的一个TEP移植物样本(移植物1)定位于簇之间(图3A)。类似地，所有样本的全基因组表达数据的系统树图分层聚类显示了TEP样本、原代胸腺和移植物的聚类，其中一个移植物样本(移植物1)比其他三个移植物样本更接近起始TEP群体。
还执行了样本组之间的差异基因表达分析。比较移植物与第20天的TEP显示分别有1299个和1245个显著上调和下调。通过检查特定基因发现，TPP标记物HOXA3和EYA1在移植物中显著下调(图3C)。与第20天的TEP相比，成熟的TEC标记物FOXN1、KRT5、TP63和CBX4在移植物中显著上调，表明将iPSC来源的TEP移植到裸小鼠中导致进一步分化为患者特异性TEC(图3C)。反常识地，与TEP相比，皮层胸腺上皮细胞(cTEC)标记物KRT8的mRNA转录物水平在移植物中下调。然而，KRT8主要在cTEC中表达，先前的研究表明TEP表现出cTEC样表型。与这一观察一致，当与第20天的TEP相比时，KRT8也在原代胸腺中显著更少地表达，表明该结果可能反映了人TEP至TEC分化时的正常表达变化(图3D)。探测原代人新生儿胸腺和第20天的TEP的全局差异基因表达显露分别有932个和656个基因显著上调和下调(图3C、图3D)。如图所示，特异性TEC标记物FOXN1、KRT5、TP63、CBX4和AIRE，在原代胸腺中表现出更高的表达。与第20天的TEP相比，TEP标记物HOXA3和EYA1以及KRT8在原代胸腺中以更低水平表达。胸腺与移植物的表达水平的直接比较显示，分别有2435个和1737个基因显著上调和下调(图3E)。然而，关键的TEC标记物FOXN1、KRT5、TP63和CBX4在两个组中都以相似的水平存在(图3E)。另一个TEC标记物基因AIRE是一种在髓质中进行阴性T细胞选择的重要调节因子，在移植物中以较低水平表达。考虑到发育中的小鼠T细胞对采用异种裸小鼠模型系统的分化中人胸腺组织的TCR-HLA错配相互作用，这一结果可能反映了先前未被认识到的对阴性选择的损伤。
实施例3—iPSC来源的TEC是功能性的并且可支持体内发育中的小鼠T细胞
为了研究iPSC来源的胸腺移植物是否是功能性的并能够支持小鼠T细胞的发育，在移植物取出时收获来自移植小鼠和假手术对照小鼠的脾脏以用于进一步分析。使用抗CD3或CD45的小鼠特异性抗体对两片对照小鼠脾脏切片和四片承载移植物的小鼠脾脏切片进行的免疫组织化学染色显示在承载胸腺移植物的小鼠中存在更高比率的T细胞(图3F)。通过荧光激活细胞分选术(FACS)获得的在来自三只对照小鼠和七只承载移植物的小鼠的分离脾细胞内的CD3/CD45双阳性T细胞证实了这些结果(图3G)。值得注意的是，先前的报告已显示，尽管没有功能性胸腺，但无胸腺裸小鼠的脾脏和淋巴结中存在成熟的T细胞。通过iPSC来源的TEP培养的小鼠T细胞是功能性的，如通过激活标记物CD69和CD25响应于体外刺激的上调所指示的(图3H)。总之，这些数据表明，当体内移植时，iPSC来源的TEC能够发育成功能性的、患者特异性的TEC，所述TEC在转录上与原代人新生儿胸腺相似。此外，iPSC来源的TEC能够支持无胸腺裸小鼠中的T细胞发育。
实施例4—单细胞RNA测序解析移植物和人原代新生儿胸腺中的胸腺细胞类型
除了进行批量RNA测序之外，还使用10xGenomics技术使移植物和人类原代新生儿胸腺接受单细胞RNA测序分析。称为Thy7.1和Thy7.2的原代人类新生儿胸腺样本来源于同一个体；然而，通过两种不同的方法制备单细胞悬浮液以缩短可能潜在地混淆基因表达水平的消化时间，与此同时在Thy7.2中富集TEC级分(参见材料和方法)。虽然这种方法确实将通过单细胞RNA测序检测到的TEC的百分比从Thy7.1中的2.50％略微增加到Thy7.2中的4.58％，但是T细胞仍占Thy7.2单细胞级分的79.24％，与Thy7.1中的87.27％相比略有减少(数据未显示)。为了解析TEP移植物和人类原代新生儿胸腺样本中的不同细胞类型，采用了无监督机器学习，包括t-随机邻域嵌入(tSNE)。这种方法有效地按组织类型和种类分离了单独细胞(图4A、图4B)，其中基于Louvain算法变体有13种不同的聚类(数据未显示)。使用全面的、带注释的标记基因列表，我们进一步将13种原始聚类组合成了6种细胞类型特异性聚类，所述6种细胞类型特异性聚类由人T细胞、树突细胞、TEC和TEP以及小鼠T细胞和其他宿主细胞组成(图4A、图4D)。使用针对人类和小鼠数据集的Cell Ranger(10X Genomics)管线可以成功地鉴定出单独的人类和小鼠细胞，从而基于它们的物种来验证所述6种细胞类型特异性集群(图4B)。正如预期的那样，按物种进行的tSNE分析显示小鼠来源的细胞仅存在于TEP移植物样本中，而在人原代新生儿胸腺样本中未鉴定出小鼠细胞(图4B、图4C)。值得注意的是，TEP移植物来源的细胞与原代胸腺细胞一起聚类在TEP/TEC聚类中，表明体内移植iPSC来源的TEC导致产生类似于真实的原代TEC的患者特异性TEC(图4C)。
接下来，使用小提琴图来可视化我们的单细胞数据集中的单独基因的表达模式，并验证细胞类型特异性聚类的有效性。与所有其他细胞类型相比，胸腺特异性标记物FOXN1、EPCAM、KRT5和KRT8在TEP聚类和TEC聚类中最高表达(图4E)。关键皮层TEC(cTEC)标记物PRSS16和PSMB11也在TEC聚类中特异性表达(图4E)。已知LY75(CD205)存在于TEP和TEC中，但是以水平较低在TEP聚类和TEC聚类中表达(图4G)。此外，已知由胸腺细胞表达以吸引造血干细胞的关键细胞因子CXCL12和CCl25由TEC聚类的细胞表达(图4E)。激活素A最近被认为与诱导TEP朝向TEC分化有关。事实上，抑制素βA(INHBA)是激活素A的亚单位，在TEP聚类中特异表达，但是水平较低(图4E)，表明激活素A也可在人类TEC发育中发挥作用。NOTCH信号传导对T细胞定型和发育至关重要；根据这一概念，发现δ样非典型Notch配体1(DLK1)仅在TEP群体中高度表达(图4E)。
在T细胞隔室内，检测到了发育中的T细胞的关键标记物，例如祖细胞和发育中的T细胞的标记物CD5和CD7、RAG1和RAG2、以及CD3、CD4和CD8(图4F)。最后，树突细胞标记物(所述树突细胞标记物中的一些树突细胞标记物已知也由TEC表达)，在T细胞、DC隔室和TEC隔室中强烈表达(图4G)。目前的分析提供了对表达模式及其在不同人类胸腺细胞类型(包括干细胞来源的和新生的)中的变化的新颖见解。所有scRNAseq数据都已使用UCSC细胞浏览器(cellbrowser.readthedocs.io)托管在Russ实验室服务器(www.russlab.com/scRNA)上
实施例5—具有原代新生儿人胸腺TEC的iPSC来源的TEC聚类
为了进一步解析TEP/TEC聚类内的细胞类型，我们对TEP聚类和TEC聚类一起进行了子集化和重新分析(图5A、图5B)。tSNE分析在组合的TEP和TEC细胞群中鉴定出了9个聚类(图5B)。样本特异性tSNE分析显示了TEP/TEC细胞在新生成的聚类中的分布(图5C)。重要的是，iPSC来源的TEC与原代胸腺TEC一起聚类在聚类0和聚类4中，而聚类1、聚类3、聚类7和聚类8仅由iPSC来源的TEC或TEC组成，这表明这些聚类可能包含在出生后的原代胸腺样本中不易存在的发育中的胸腺细胞(图5B、图5C)。在聚类3中的大量细胞中，关键标记物FOXN1、KRT5、KRT8和DLK1的共表达表明大多数TEP包含在该子集中(图5F)。TEC标记物PSMB11、PRSS16和CCL25，以及KRT5或KRT8的个体表达以中等至高水平存在于聚类5的细胞中，表明有成熟的TEC群体(图5G)。KRT5由更多的细胞表达，并且在聚类5中的水平略高于聚类7中的水平，然而，聚类5中非常少量的细胞也表达自身免疫调节物(AIRE)(图5G)。由于髓质TEC(mTEC)由KRT5和AIRE11两者的表达来标记，所以数据表明聚类5可代表mTEC。然而，cTEC标记物PSMB11和PRSS16也主要在聚类5中表达，其中区别KRT8的cTEC主要在聚类7中表达(图5G)。通过区分单细胞RNA-seq数据中未剪接和剪接的mRNA，RNA速度可用于预测数据集中任何单独细胞的可能未来状态。RNA速度分析预测了TEP移植物来源的细胞从聚类1和聚类8朝向聚类3和聚类7移动的方向性(图5B、图5D)。将Monocle的伪时间分析应用于重新聚类的TEP/TEC聚类，并且鉴定出了一个分支点(图5E、图5F)。我们的详细分析表明，一些iPSC来源的TEC和原代TEC表现出重叠的表达谱，使得它们无法通过所采用的生物信息学方法区分，表明存在真实的TEC表型。然而，仍然正在分化为TEC的iPSC来源的TEP似乎遵循两种不同的发育轨迹，所述发育轨迹中只有一种发育轨迹导致朝向原代TEC。不希望受到理论的限制，这可能是iPSC来源的TEP与发育中的小鼠T细胞进行异种移植相互作用的结果。
实施例6—小鼠T细胞在iPSC来源的胸腺组织内发育
为了如由我们的先前分析(图3F至图3H)所建议的确定是否确实在iPSC来源的胸腺移植物中存在新生T细胞发育，我们对小鼠T细胞聚类(mT细胞)进行了单独的子集化和重新分析(图6A、图6B)。tSNE分析鉴定出了mT细胞群内的10个聚类(图6B)。事实上，参与小鼠T细胞发育的关键转录因子存在于许多T细胞亚聚类中，表明了接受TEP移植物的裸小鼠中小鼠T细胞的发育进程(图6F、图12B)。RNA速度分析显示许多细胞朝向聚类3移动，所述聚类3包含最高数量的表达T细胞分化的后期标记物例如Cd3、Cd4和Cd8的细胞(图12A、图6F、图12B)，表明了移植组织中小鼠T细胞发育的方向性。伪时间分析仅显示一个分支点，其中细胞朝向两个细胞命运发育(图6C、图6D)。基因特异性伪时间分析显示了3种发育状态(图6E)。关键的T细胞标记物Cd3e、Cd3g、Cd4、Cd8a和Ptprc(Cd45)在状态1和状态2期间显示低表达，但在状态3期间表达增加，表明了小鼠来源的T细胞在TEP移植物中的发育进程(图6E)。此外，我们在阶段1期间观察到了增殖标记物Mki67的突变(bump)，表明细胞增殖与T细胞发育相关联(图6E)。在发育过程期间，细胞基于其发育谱系而以不同的轨迹分支。分支点热图是使用Monocle制作的，其示出了在分支点处以及在每个细胞命运处富集的基因。在细胞命运2中，我们观察到了先天免疫细胞标记物的富集(图6D)。此外，细胞命运1显示了T细胞发育标记物(例如Aif1和Tyrobp)的富集(图6D)。有趣的是，聚类4细胞命运2显示了B细胞标记物的富集，因为B细胞也被显示存在于胸腺中(图6D)。
承载移植物的小鼠中的T细胞显示出了明显增强的T细胞受体(TCR)序列多样性。图12C示出了对照小鼠对比移植小鼠中的TCR序列的聚类。对CD45和CD3双阳性T细胞进行TCR测序，所述T细胞是从对照裸小鼠或承载移植物的裸小鼠的血液分离出的FACS。使用iRepertoir技术执行TCR测序和分析。图12C中所示的每个彩色气泡对应于所辨识的单独TCR序列，而每个气泡的大小指示该特定序列相对于所有读段的丰度。因此，许多小的TCR气泡指示更高的多样性/异质性。
以上说明书、示例和数据提供了对申请人发明主题的一些示例性实施方案的特征和用途的描述。在不脱离发明主题的精神和范围的情况下，可以实现申请人的主题的许多实施方案。此外，在不脱离所述权利要求书的情况下，不同实施方案的其他特征可以组合在另外的实施方案中。

Claims (28)

1.一种用于产生患者特异性胸腺上皮细胞(TEC)的方法，所述方法包括：从所述患者中分离细胞；
向所述细胞施用一种或多种因子以对所述细胞重新编程并产生诱导多能干细胞(iPSC)；
在分化培养基中培养所述患者特异性iPSC 9-14天，以产生胸腺上皮祖(TEP)细胞；以及
将至少一个TEP转移到接受者中；以及
使得所述TEP细胞分化成TEC。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述iPSC来源于造血干细胞(HSC)或外周血单核细胞(PBMC)。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述胸腺上皮细胞是成熟的、功能性的、患者特异性的胸腺上皮细胞(TEC)。
4.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括使患者来源的T细胞与所述TEC接触以产生功能性T细胞的步骤。
5.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括使患者来源的T细胞与所述TEP接触以产生功能性T细胞和/或功能性TEC的步骤。
6.根据权利要求4-5中任一项所述的方法，其中所述成熟T细胞表达CD69、CD25、CD5、CD7、CD4、CD8、CD3、CD45、RAG1和RAG2中的一者或多者。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的方法，其中外周T细胞的数量大于未接受患者特异性TEP的接受者中的外周T细胞的数量。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述分化培养基包含一种或多种途径激活剂和/或途径抑制剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其中经激活和/或抑制的途径是激活素、WNT、BMP、RA、TGFβ、SHH和FGFβ中的一者或多者。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述经抑制的途径包括SHH和TGFβ中的一者或多者。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述一种或多种经激活的途径由激活素A、WNT3a、BMP4、SAG、TTNPB和FGF8b中的至少一者激活。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述一种或多种经抑制的途径由Ly-364947和Sant1中的至少一者抑制。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述TEC细胞表达一种或多种选自FOXN1、AIRE、CK5、CK8、CXCL12、CCL25、DLL4和HLA-DR的标记物。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述分化培养基在第0天至第13天包含激活素A、Wnt3a、TTNPB、BMP4、LY364947、FGF8b、FGF8a、SAG和SANT-1中的一者或多者。
15.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括：
将所述TEP细胞与造血干细胞和祖细胞(HPSC)或HSC共培养约7天以产生TEC。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述TEC表达一种或多种选自FOXN1、AIRE、CK5、CK8、CXCL12、CCL25、DLL4、TP63、CBX4和HLA-DR的遗传标记物。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述TEC表达通常由皮层TEC和髓质TEC表达的标记物。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述标记物选自KRT5、KRT8、AIRE、PSMB11和PRSS16。
19.一种分化的成熟胸腺上皮细胞的群体，所述群体包括：
一种或多种胸腺上皮细胞(TEC)，所述一种或多种胸腺上皮细胞表达KRT5、KRT8、AIRE、PSMB11和PRSS16中的一者或多者，其中所述一种或多种TEC来源于胸腺上皮祖(TEP)细胞，所述TEP细胞来源于在激活素A、Wnt3a、TTNPB、BMP4、LY364947、FGF8b、FGF8a、SAG和SANT-1中的一者或多者存在下体外生长的诱导多能干细胞(iPSC)，并且其中所述TEP在移植到接受者体内后在体内分化成TEC。
20.根据权利要求19所述的分化的成熟胸腺上皮细胞的群体，其中所述iPSC在体外生长达介于12天与14天之间。
21.根据权利要求19或权利要求20所述的分化的成熟胸腺上皮细胞的群体，其中所述iPSC来源于所述接受者的一种或多种细胞。
22.根据权利要求19-21中任一项所述的分化的成熟胸腺上皮细胞的群体，其中所述TEC表达一种或多种选自FOXN1、AIRE、CK5、CK8、CXCL12、CCL25、DLL4和HLA-DR的标记物。
23.一种用于产生成熟的功能性胸腺上皮细胞的系统，所述系统包括：
从受试者的细胞诱导多能干细胞的方法；
培养装置，所述培养装置用于使所述诱导多能干细胞在激活素A、Wnt3a、TTNPB、BMP4、LY364947、FGF8b、FGF8a、SAG和SANT-1中的一者或多者存在和不存在的情况下生长12-14天，以产生分化的胸腺上皮祖细胞；
用于将一种或多种胸腺上皮祖细胞植入受试者体内的装置。
24.根据权利要求19-22中任一项所述的细胞群或通过根据权利要求1-18中任一项所述的方法产生的细胞在制备用于治疗免疫病症或疾患的药物中的用途，其中所述病症或疾患选自不存在胸腺、受损的胸腺、功能障碍的胸腺、患病的胸腺、老化的胸腺、1型糖尿病、自身免疫、同种异体排斥、癌症、以及它们的组合。
25.一种治疗患有免疫病症或疾患或有患免疫病症或疾患的风险的受试者的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用根据权利要求19-22中任一项所述的TEP细胞或通过根据权利要求1-18中任一项所述的方法产生的细胞；其中所述疾患或病症选自不存在胸腺、受损的胸腺、功能障碍的胸腺、患病的胸腺、老化的胸腺、1型糖尿病、自身免疫、同种异体排斥、癌症、以及它们的组合。
26.一种治疗患有胸腺疾患的患者的方法，所述方法包括：
施用一种或多种胸腺上皮祖(TEP)细胞，所述一种或多种TEP细胞来源于在激活素A、Wnt3a、TTNPB、BMP4、LY364947、FGF8b、FGF8a、SAG和SANT-1中的一者或多者存在下体外生长的患者特异性诱导多能干细胞(iPSC)，并且其中所述TEP细胞在施用于所述患者后体内分化成胸腺上皮细胞(TEC)，其中所述iPSC在体外生长介于12天与14天之间，并且其中所述成熟TEC表达一种或多种选自FOXN1、AIRE、CK5、CK8、CXCL12、CCL25、DLL4和HLA-DR的标记物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述iPSC来源于所述患者的皮肤、子宫组织、肾脏、肝脏、肌肉、肾上腺、血液中的一者或多者。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其中相对于所述施用的TEP细胞或iPSC，所述选择的标记物在成熟的iPSC来源的TEC中的表达介于0.5倍与1000倍之间。
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