CN108463548A - 由干细胞产生t细胞的方法及使用所述t细胞的免疫治疗方法 - Google Patents

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Abstract

提供了用于产生T细胞的方法和组合物。还提供了使用经改造T细胞的治疗方法。例如，在某些方面，方法包括在无血清培养基中制备包含基质细胞和造血干细胞或祖细胞的三维细胞培养物组合物以用于产生T细胞。

Description

由干细胞产生T细胞的方法及使用所述T细胞的免疫治疗方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年10月30日提交的美国临时专利申请No.62/248,931、于2015年12月9日提交的美国临时专利申请No.62/265,204和于2016年7月7日提交的美国临时专利申请No.62/359,456的优先权权益。上述公开内容中每一个的全部内容特别地无声明放弃地通过引用并入本文。
发明背景
本发明是在由国家卫生研究院(National Institutes of Health)授予的资助号HL066992的政府支持下完成的。政府在本发明中享有一定权利。
1.技术领域
本发明总体上涉及细胞培养和发育领域。更特别地，本发明涉及由干细胞或祖细胞产生T细胞。
2.相关技术说明
目前的经改造T细胞治疗(包括TCR改造和CAR-T方法)依赖于对自体(autologous)外周血T细胞进行遗传修饰(即用于修饰的T细胞从将接受它们的同一患者分离)。由于当移植到同种异体(非自身)接受者中时供体T细胞的同种异体反应性(alloreactivity)可能在接受者中导致称为移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)的组织损伤综合征，因此需要自体方法。然而，尽管目前在晚期临床试验中快速推进将自体细胞治疗商业化，但是患者特异性自体经改造T细胞治疗的使用是非常劳动和成本密集型的，并且具有不确定的可扩展性。此外，在正常T细胞不能被充分收集的患者(例如淋巴细胞减少患者)或T细胞在功能上受损的那些(例如HIV/AIDS患者；由于年龄相关免疫功能障碍的年长患者)中，自体经改造T细胞治疗的使用被排除或具有降低的效力。考虑到这众多问题，产生非同种异体反应性的现成的(off-the-shelf)经改造T细胞治疗的方法在过继性细胞治疗领域中具有很大尚未满足的商业需求。
发明内容
本文描述了用于产生经改造T细胞和所得T细胞的组合物的方法。在一些实施方案中，T细胞是非同种异体反应性的并且表达外源性TCR和/或CAR。这些T细胞可用于“现成”T细胞治疗，并且不需要使用患者自身的T细胞。因此，当前的方法提供了更具成本效益、劳动较不密集的T细胞免疫治疗。还描述了使用这些T细胞的免疫治疗方法。
本公开内容的一些方面涉及由分化较低的细胞例如胚胎干细胞、多能干细胞、造血干细胞或祖细胞、或本文所述和本领域已知的干细胞或祖细胞产生T细胞的新三维细胞培养系统。在一些具体实施方案中，该系统涉及使用无血清培养基。在某些方面，该新系统使用适合于神经细胞发育的无血清培养基来培养包含基质细胞和干细胞或祖细胞的三维细胞聚集体，其产生T细胞，或更特别地抗原特异性T细胞或已经历体外正或负选择的T细胞。在本公开内容的一些实施方案中，将3D细胞聚集体在包含胰岛素的无血清培养基中培养足以使干细胞或祖细胞体外分化成T细胞的时间段。在一些实施方案中，T细胞经历正选择，其提供对特定抗原具有高亲和力的T细胞。
因此，本公开内容的一些方面涉及细胞培养组合物，其包含三维(3D)细胞聚集体和培养基。在一些实施方案中，3D细胞聚集体包含：a)选定的基质细胞群；和/或b)选定的干细胞或祖细胞群。特别设想的是，在一些具体实施方案中，a)或b)可以被排除或基本上排除。在某些实施方案中，一种或更多种细胞、特别是基质细胞可以表达Notch配体。在一些实施方案中，Notch配体是外源性的。在一些实施方案中，Notch配体是内源性的。在另一些实施方案中，培养基可以包含外部添加的Notch配体。在另一些实施方案中，外部添加的Notch配体可以与固体支持物连接或被固定化。例如，在一些实施方案中，基质细胞具有编码Notch配体的外源性核苷酸序列，其可以通过转染或转导引入(或先前已经引入)细胞中。在某些实施方案中，培养组合物可以不包含Notch配体，或可以不包含外部添加的Notch配体。
如本文所用，术语“notch配体”包括完整的(全长)、部分的(截短形式)或经修饰的(包含一个或更多个突变，例如保守性突变)notch配体以及来自任何物种的Notch配体或其保留全长Notch配体的至少一种活性或功能的片段。还包括模拟notch配体的肽。Notch配体可以是“典型notch配体”或“非典型notch配体”。典型notch配体的特征在于胞外结构域，其通常包含N端(NT)结构域，接着是δ/Serrate/LAG-2(DSL)结构域和多个串联布置的表皮生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)样重复。典型配体与Notch结合通常需要DSL结构域以及侧翼NT结构域和前两个包含δ和OSM-11样蛋白(DOS)基序的EGF重复。一些典型配体的胞内结构域包含羧基末端PSD-95/Dlg/ZO-1-配体(PDZL)基序，其独立于Notch信号转导而发挥作用。秀丽隐杆线虫(C.elegans)DSL配体缺乏DOS基序，但已被提出与仅含DOS的配体协作以激活Notch信号转导。举例说明性的典型notch配体包括但不限于δ样配体4(DLL4)、δ样配体1(DLL1)、Jagged 1(JAG1)、Jagged 2(JAG2)、δ样配体3(DLL3)、和X-δ2；在另一些实施方案中设想了另一些类似的举例说明性典型配体。
非典型notch配体缺乏DSL结构域(δ/Serrate/LAG-2)，结构多样化并且包括整合和GPI连接的膜蛋白以及多种分泌蛋白。在本文中引用“notch配体片段”或“典型notch配体片段”时，设想该片段是与notch结合的片段。非典型notch配体的一些实例包括但不限于接触蛋白(Contactin)-1、NOV/CCN3、接触蛋白-6、骨膜蛋白(Periostin)/OSF-2、DLK2/EGFL9、Pref-1/DLK1/FA1、DNER、血小板反应蛋白-2、MAGP-1/MFAP2、血小板反应蛋白-3、MAGP-2/MFAP5、血小板反应蛋白-4和Netrin-1。
在一些实施方案中，培养基还包含维生素。在一些实施方案中，培养基包含以下1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13种(和可从其中来源的任何范围)：生物素、DLα生育酚乙酸酯、DLα-生育酚、维生素A、氯化胆碱、泛酸钙、泛酸、叶酸烟酰胺、吡哆醇、核黄素、硫胺、肌醇、维生素B12，或者培养基包含其组合或其盐。在一些实施方案中，培养基包含生物素、DLα生育酚乙酸酯、DLα-生育酚、维生素A、氯化胆碱、泛酸钙、泛酸、叶酸烟酰胺、吡哆醇、核黄素、硫胺、肌醇和维生素B12，或基本上由其组成。在一些实施方案中，维生素包括以下或基本上由以下组成：生物素、DLα生育酚乙酸酯、DLα-生育酚、维生素A、或其组合或盐。在一些实施方案中，培养基还包含蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质包括白蛋白或牛血清白蛋白、BSA的级分、过氧化氢酶、胰岛素、转铁蛋白、超氧化物歧化酶、或其组合。在一些实施方案中，培养基还包含以下一种或更多种：皮质酮、D-半乳糖、乙醇胺、谷胱甘肽、L-肉毒碱、亚油酸、亚麻酸、孕酮、腐胺、亚硒酸钠或三碘-I-甲腺原氨酸(triodo-I-thyronine)、或其组合。在一些实施方案中，培养基包含以下一种或更多种：补充剂，无异源(xeno-free)补充剂，GS21TM补充剂、或其组合。在一些实施方案中，培养基包含或还包含氨基酸、单糖、无机离子。在一些实施方案中，氨基酸包括精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸或缬氨酸、或其组合。在一些实施方案中，无机离子包括钠、钾、钙、镁、氮或磷、或其组合或盐。在一些实施方案中，培养基还包含以下一种或更多种：钼、钒、铁、锌、硒、铜或锰、或其组合。在某些实施方案中，培养基包含一种或更多种本文讨论的维生素和/或一种或更多种本文讨论的蛋白质和/或以下一种或更多种，或者基本上由其组成：皮质酮、D-半乳糖、乙醇胺、谷胱甘肽、L-肉毒碱、亚油酸、亚麻酸、孕酮、腐胺、亚硒酸钠或三碘-I-甲腺原氨酸、补充剂、无异源补充剂、GS21TM补充剂、氨基酸(例如精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸或缬氨酸)、单糖、无机离子(例如钠、钾、钙、镁、氮和/或磷)或其盐、和/或钼、钒、铁、锌、硒、铜或锰。
在某些方面，培养基可以使用用于培养动物细胞的培养基作为其基础培养基来制备，例如以下中的任一种：AIM V、X-VIVO-15、NeuroBasal、EGM2、TeSR、BME、BGJb、CMRL1066、Glasgow MEM、经改良MEM锌选择(Improved MEM Zinc Option)、IMDM、199培养基、Eagle MEM、αMEM、DMEM、Ham、RPMI-1640和Fischer培养基，及其任意组合，但是培养基可以不特别限于此，只要其可以用于培养动物细胞即可。特别地，该培养基可以是不含异源的或是化学限定的。
培养基可以是含血清培养基或无血清培养基或无异源培养基。从防止异源动物来源组分污染的角度来看，血清可以与干细胞来源于同一动物。无血清培养基是指不具有未经加工或未经纯化血清的培养基，并且因此可以包括具有经纯化血液来源组分或动物组织来源组分(例如生长因子)的的培养基。
培养基可以包含或可以不包含血清的任何替代品。血清的替代品可以包括适当地包含以下的材料：白蛋白(例如富含脂质的白蛋白、牛白蛋白、白蛋白替代物如重组白蛋白或人源化白蛋白、植物淀粉、右旋糖酐和蛋白质水解物)、转铁蛋白(或其他铁转运蛋白)、脂肪酸、胰岛素、胶原前体、微量元素、2-巯基乙醇、3′-硫代甘油(3′-thiolgiycerol)、或其等同物。血清的替代品可以通过例如国际公开No.98/30679中公开的方法制备(其整体并入本文)。或者，可以使用任何可商购获得的材料以获得更多便利。可商购获得材料包括敲除血清替代品(KSR)、化学限定脂质浓缩物(Gibco)和Glutamax(Gibco)。
在另一些实施方案中，培养基可以是适于细胞发育的无血清培养基。例如，培养基可以包含有效地由3D细胞聚集体产生T细胞的浓度的补充剂、无异源补充剂(可在万维网thermofisher.com/us/en/home/technical-resources/media-formulation.250.html获得)、NS21补充剂(Chen等，J Neurosci Methods，2008年6月30日；171(2)：239-247，整体并入本文)、GS21TM补充剂(可在万维网amsbio.com/B-27.aspx获得)、或其组合。
在某些实施方案中，培养基可以包含以下1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20种或更多种：维生素例如生物素；DLα生育酚乙酸酯；DLα-生育酚；维生素A(乙酸酯)；蛋白质例如BSA(牛血清白蛋白)或人白蛋白、无脂肪酸级分V；过氧化氢酶；人重组胰岛素；人转铁蛋白；超氧化物歧化酶；其他组分如皮质酮、D-半乳糖、乙醇胺HCl、谷胱甘肽(还原的)、L-肉毒碱HCl、亚油酸、亚麻酸、孕酮、腐胺2HC1、亚硒酸钠、和/或T3(三碘-I-甲腺原氨酸)。
在另一些实施方案中，培养基可以包含外部添加的抗坏血酸。培养基还可以包含一种或更多种外部添加的脂肪酸或脂质、氨基酸(例如非必需氨基酸)、维生素、生长因子、细胞因子、抗氧化剂物质、2-巯基乙醇、丙酮酸、缓冲剂、和/或无机盐。
一种或更多种培养基组分可以以以下浓度添加：至少、至多或约0.1、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、180、200、250ng/L、ng/ml、μg/ml、mg/ml，或可从其中来源的任何范围。
所使用培养基可以补充有至少一种以下浓度的外部添加的细胞因子：约0.1ng/mL至约500ng/mL，更特别地1ng/mL至100ng/mL，或至少、至多或约0.1、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、180、200、250ng/L、ng/ml、μg/ml、mg/ml，或可从其中来源的任何范围。合适的细胞因子包括但不限于FLT3配体(FLT3L)、白介素7(IL-7)、干细胞因子(SCF)、促血小板生成素(TPO)、IL-2、IL-4、IL-6、IL-15、IL-21、TNF-α、TGF-β、干扰素γ、干扰素-λ、TSLP、胸腺五肽、多效营养因子(pleotrophin)和/或中期因子。特别地、培养基可以包含FLT3L和IL-7中的至少一种。更特别地、培养物可以包含FLT3L和IL-7二者。
在某些实施方案中，3D细胞聚集体可以包含确定或不确定的外源性细胞外基质，例如胶原、明胶、多聚-L-赖氨酸、多聚-D-赖氨酸、层黏连蛋白和纤连蛋白及其混合物，例如MatrigelTM；以及裂解的细胞膜制备物。在另一些实施方案中，3D细胞聚集体不包含外源性基质或支架。
另一些培养条件可以适当地确定。例如，培养温度可以为约20℃至40℃，例如至少、至多或约20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃(或可从其中来源的任何范围)，但是温度可以高于或低于这些值。CO2浓度可以为约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％(或可从其中来源的任何范围)，例如约2％至10％，例如约2％至5％，或可从其中来源的任何范围。氧张力可以为至少或约1％、5％、8％、10％、20％，或可从其中来源的任何范围。
基质细胞和干细胞或祖细胞可以以任何比例存在，例如约100∶1、80∶1、40∶1、20∶1、10∶1、5∶1、1∶1、1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80和/或1∶100，或可从其中来源的任何范围。
在一些实施方案中，基质细胞可以是鼠基质细胞系、人基质细胞系、选定的原代基质细胞群、由多能干细胞体外分化的选定基质细胞群，或其组合。在一些实施方案中，基质细胞由与用作本文所述方法中起始材料的干细胞或祖细胞群相同的干细胞或祖细胞群分化。在一些实施方案中，基质细胞由人细胞分化。在一些实施方案中，基质细胞由人多能干细胞分化。在一些实施方案中，基质细胞由人或非人HSPC或PSC细胞分化。
在另一些实施方案中，基质细胞或其祖细胞可以是经遗传修饰的。例如，基质细胞可以表达外源性人主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)。在另一些实施方案中，基质细胞可以表达外源性抗原特异性共刺激分子、细胞因子、抗原或细胞外基质蛋白、或任何T细胞调节剂，例如调节T细胞分化、增殖或功能的任何生物活性分子或基因。在一些实施方案中，基质细胞(或祖细胞)被改造成表达抗原或HLA分子。
在一些实施方案中，细胞聚集体包含或还包含肿瘤细胞或肿瘤抗原。在一些实施方案中，细胞聚集体包含外源性主要组织相容性复合体(MHC)。在一些实施方案中，MHC是人MHC。在一些实施方案中，细胞聚集体包含外源性抗原特异性共刺激分子、细胞因子、抗原或细胞外基质蛋白、或任何T细胞调节剂，例如调节T细胞分化、增殖或功能的任何生物活性分子或基因。在一些实施方案中，基质细胞(或祖细胞)被改造成表达抗原或HLA分子。
在某些实施方案中，干细胞或祖细胞可以选自胚胎干细胞，造血干细胞或祖细胞，从骨髓、脐带血、外周血、胸腺分离的细胞，或者干细胞或祖细胞可以已由胚胎干细胞(ESC)或诱导多能干细胞(iPSC)体外分化。来自原代组织或ESC或iPSC的干细胞或祖细胞的来源可以来自人或非人动物(例如小鼠)。
在另一些实施方案中，干细胞或祖细胞可以是经遗传修饰的。例如，干细胞或祖细胞可以表达外源性T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)或二者。在另一些实施方案中，干细胞或祖细胞可以表达外源性不变自然杀伤T细胞(invariant natural killer T cell，iNKT)相关TCR。在另一个实施方案中，干细胞或祖细胞表达外源性抗原特异性TCR或具有调节T细胞分化、扩增或功能的基因的外源性遗传修饰。
在一些实施方案中，用于本文所述的培养组合物和方法的干细胞或祖细胞或基质细胞是已预先冷冻的细胞。在一些实施方案中，细胞从未被冷冻。在一些实施方案中，细胞已经传代至少、至多或精确地0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50次(或可从其中来源的任何范围)。
在某些实施方案中，任何细胞群(例如基质细胞、干细胞或祖细胞或其中产生的T细胞)可以包含至少、约或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、1×103、2×103、3×103、4×103、5×103、6×103、7×103、8×103、9×103、1×104、2×104、3×104、4×103、5×104、6×104、7×104、8×104、9×104、1×105、2×105、3×105、4×105、5×105、6×105、7×105、8×105、9×105、1×106或2×106个细胞(或可从其中来源的任何范围)。在一些具体实施方案中，干细胞或祖细胞为1至200,000个。
本公开内容的一些方面还涉及用于由干细胞或祖细胞制备T细胞组合物的方法，所述方法包括培养三维(3D)细胞聚集体，所述三维(3D)细胞聚集体包含：a)表达Notch配体的选定基质细胞群；b)选定的干细胞或祖细胞群；其中将所述3D细胞聚集体在包含胰岛素的无血清培养基中培养足以使干细胞或祖细胞体外分化成T细胞的时间段。培养组合物可以包含本文描述为培养组合物和培养基的组分的任何实施方案。此外，在本公开内容的方法方面使用的细胞可以是本文描述为适合用于培养组合物的任何干细胞或祖细胞或基质细胞。
可以对本文所述的组合物和方法进行改进使得所述方法用于制备具有特定表型的T细胞。在一些实施方案中，所述方法用于制备具有以下表型的T细胞：CD4+CD8-T细胞、CD4-CD8+T细胞、CD34+CD7+CDla+细胞、CD3+TCRab+、CD3+TCRgd+、CD3+TCRab+CD4+CD8-、CD3+TCRab+CD8+CD4-、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+CCR7+、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+CCR7+、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+CD27+、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+CD27+、CD34+CD7+CD1a+细胞、CD34+CD5+CD7+、CD34+CD5+CD7-、自然杀伤T细胞、调节性T细胞、抗原特异性T细胞、上皮内淋巴细胞T细胞，或是CD45+、CD1 1b+、CD11 b-、CD1 5+、CD15-、CD24+、CD24-、CD114+、CD114-、CD1 82+、CD182-、CD4+、CD4-、CD14+、CD14-、CD11a+、CD11a-、CD91+、CD91-、CD16+、CD1 6-、CD3+、CD3-、CD25+、CD25-、Foxp3+、Fox3p-、CD8+、CD8-、CD19+、CD19-、CD20+、CD20-、CD24+、CD24、CD38+、CD38-、CD22+、CD22-、CD61+、CD61-、CD16+、CD16-、CD56+、CD56-、CD31+、CD31-、CD30+、CD30-、CD38+和/或CD38-的细胞，或其组合。例如，上皮内淋巴细胞(IEL)可以通过在基质细胞中表达同源(cognate)抗原来制备。
在一些实施方案中，所述方法还包括对干细胞或祖细胞和基质细胞进行离心以形成3D细胞聚集体。所述方法可以包括培养三维(3D)细胞聚集体。3D细胞聚集体包含表达外源性Notch配体的选定基质细胞群；和选定的干细胞或祖细胞群。培养基成分的任何替选可以如上所述。
在另一些实施方案中，培养可以包括使用离心来形成3D细胞聚集体。培养可以进行任何时长，例如至少、至多或精确地约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48个小时、天或周，或者可从其中来源的任何范围。在另一些实施方案中，培养可以或可以不涉及细胞传代。
在一些实施方案中，所述方法还包括来自体外分化T细胞的内源表达的TCR。在一些实施方案中，所述方法还包括使T细胞致敏。在一些实施方案中，T细胞用抗原呈递细胞致敏。在一些实施方案中，抗原呈递细胞呈递肿瘤抗原。
在另一些实施方案中，可以提供包括将来自3D细胞聚集体的T细胞施用于有此需要的对象或使来自3D细胞聚集体的T细胞进一步分化的方法或步骤。
在一些实施方案中，来自3D细胞聚集体的T细胞通过等位基因排斥而不表达内源性TCR。在另一些实施方案中，来自3D细胞聚集体的T细胞表达外源性TCR或CAR。
可以提供用于产生T细胞的方法，其包括如上所述培养细胞培养组合物，从而产生T细胞。还可以提供如上所述的方法，其还可以限定为用于产生抗原特异性T细胞的方法，其中祖细胞表达外源性抗原特异性TCR或CAR。
可以提供用于产生T细胞的方法，或者任何培养方法都可以由3D细胞聚集体产生T细胞。在某些方面，方法还可以包括检测以下细胞的数目、选择以下细胞或针对以下细胞进行选择、或提高以下细胞的数目：CD4+CD8-T细胞、CD4-CD8-T细胞、CD34+CD7+CD1a-细胞、CD3+TCRab+、CD3+TCRgd+、CD3+TCRab+CD4+CD8-、CD3+TCRab+CD8+CD4-、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+CCR7+、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+CCR7+、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+CD27+、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+CD27+、CD34+CD7+CD1a-细胞、CD34+CD5+CD7+、CD34+CD5+CD7-、自然杀伤T细胞、调节性T细胞、使用四聚体或抗TCR抗体的抗原特异性T细胞、使用经修饰抗原的CART细胞、使用荧光标志物的转导T细胞、或其组合。在一些实施方案中，上皮内淋巴细胞是CD4-CD8+、CD4+CD8-、CD4+CD8+、CD4-CD8-、TCRab+、TCRgd+、CD5+CD7+、CD5+CD7+CD3-CD4-CD8-、CD5+CD7+CD3-CD4-CD8aa、或其组合。在一些实施方案中，不包括例如以下的上皮内淋巴细胞：CD4-CD8+、CD4+CD8-、CD4+CD8+、CD4-CD8-、TCRab+、TCRgd+、CD5+CD7+、CD5+CD7+CD3-CD4-CD8-和/或CD5+CD7+CD3-CD4-CD8aa。
可以提供用于提高对象中T细胞的数目或用于在对象中治疗疾病或病症的方法，所述方法包括向对象施用有效量如本文所述制备的T细胞或抗原特异性T细胞或本公开内容的任何T细胞，例如包含外源性TCR的T细胞。在一些实施方案中，T细胞具有本文所述的细胞表面标志物。
对象可以是任何动物，特别是小鼠、非人灵长类或人。在另一些方面，对象可以已经被确定患有自身免疫病、癌症、感染、免疫缺陷、或其组合，或者处于其风险之中。
在另一些实施方案中，可以提供用于产生不与自身抗原反应的T细胞的方法，其包括以有效地由3D细胞聚集体产生T细胞的浓度用无血清培养基培养三维(3D)细胞聚集体。在某些方面，3D细胞聚集体包含：a)表达外源性Notch配体的选定基质细胞群和b)选定的干细胞或祖细胞群，其中a)或b)中的一种或更多种细胞表达外源性自身抗原；由此3D细胞聚集体产生不与自身抗原反应的T细胞。在另一些方面，其中a)或b)中的一种或更多种细胞表达或不表达外源性自身MHC。
本公开内容的一些方面涉及通过本文所述的方法制备的T细胞。在一些实施方案中，T细胞具有特定的表型、细胞表面标志物或在本公开内容通篇所述的特征。
因此，本公开内容的一些方面涉及包含嵌合抗原受体(CAR)的分离的T细胞或T细胞群，其中所述T细胞具有上皮内淋巴细胞表型。在一些实施方案中，T细胞是TCR-。在一些实施方案中，T细胞是CD4-CD8+、CD4+CD8-、CD4+CD8+、CD4-CD8-、TCRab+、TCRgd+、CD5+CD7+、CD5+CD7+CD3-CD4-CD8-、CD5+CD7+CD3-CD4-CD8aa、或其组合。在一些实施方案中，T细胞是CD5+CD7+CD3-CD4-CD8-。在一些实施方案中，T细胞是CD5+CD7+CD3-CD4-CD8aa。在一些实施方案中，CAR包括CD19CAR。在一些实施方案中，T细胞还包含外源性TCR。在一些实施方案中，T细胞是CD3+。在一些实施方案中，T细胞是CD4+CD8-T细胞、CD4-CD8+T细胞、CD34-CD7+CDla+细胞、CD3+TCRab+、CD3+TCRgd+、CD3+TCRab+CD4+CD8-、CD3+TCRab+CD8+CD4-、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+CCR7+、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+CCR7+、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+CD27+、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+CD27+、CD34+CD7+CD1a+细胞、CD34+CD5+CD7+、CD34+CD5+CD7-、自然杀伤T细胞、调节性T细胞、抗原特异性T细胞、上皮内淋巴细胞T细胞，或是CD45+、CDllb+、CDllb-、CD15+、CD15-、CD24+、CD24-、CD114+、CD114-、CD182+、CD182-、CD4+、CD4-、CD14+、CD14-、CD11a+、CD11a-、CD91+、CD91-、CD16+、CD16-、CD3+、CD3-、CD25+、CD25-、Foxp3+、Fox3p-、CD8+、CD8-、CD19+、CD19-、CD20+、CD20-、CD24+、CD24、CD38+、CD38-、CD22+、CD22-、CD61+、CD61-、CD16+、CD16-、CD56+、CD56-、CD31+、CD31-、CD30+、CD30-、CD38+或CD38-的细胞，或其组合。另一些方面涉及分离的T细胞或T细胞群，其中所述T细胞表达外源性TCR或CAR，并且其中所述T细胞是CD4+CD8-T细胞、CD4-CD8-T细胞、CD34+CD7-CD1a+细胞、CD3+TCRab+、CD3+TCRgd+、CD3+TCRab+CD4+CD8-、CD3+TCRab+CD8+CD4-、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+CCR7+、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+CCR7+、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+CD27+、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+CD27+、CD34+CD7+CD1a+细胞、CD34+CD5+CD7+、CD34+CD5+CD7-、自然杀伤T细胞、调节性T细胞、抗原特异性T细胞、上皮内淋巴细胞T细胞，是CD45+、CD11b+、CD11b-、CD15+、CD15-、CD24+、CD24-、CD114+、CD114-、CD182+、CD182-、CD4+、CD4-、CD14+、CD14-、CD11a+、CD11a-、CD91+、CD91-、CD16+、CD16-、CD3+、CD3-、CD25+、CD25-、Foxp3+、Fox3p-、CD8+、CD8-、CD19+、CD19-、CD20+、CD20-、CD24+、CD24、CD38+、CD38-、CD22+、CD22-、CD61+、CD61-、CD16+、CD16-、CD56+、CD56-、CD31+、CD31-、CD30+、CD30-、CD38+或CD38-的细胞，或其组合。在一些实施方案中，T细胞是T细胞群，并且其中T细胞群包含至少50％的是成熟初始()CD8或CD4单阳性细胞的细胞。在一些实施方案中，T细胞包含至少、至多或精确地5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的成熟初始CD8单阳性细胞和/或CD4单阳性细胞(或可从其中来源的任何范围)。在一些实施方案中，细胞表达外源性不变自然杀伤T细胞(iNKT)相关TCR。在一些实施方案中，细胞已由干细胞或祖细胞体外分化。在一些实施方案中，干细胞或祖细胞选自胚胎干细胞、诱导多能干细胞、人中胚层祖细胞、中胚层祖细胞、人胚胎中胚层祖细胞、造血干细胞或祖细胞、从骨髓分离的细胞、从脐带血分离的细胞、从外周血分离的细胞、从胸腺分离的细胞或已由胚胎干细胞(ESC)或诱导多能干细胞(iPSC)体外分化的细胞。在一些实施方案中，内源性TCR已通过等位基因排斥而被抑制。
在另一些实施方案中，可以使用任何遗传修饰组合物或方法来将外源性核酸引入细胞中或对基因组DNA进行编辑，例如基因编辑、同源重组或非同源重组、RNA介导的遗传递送或任何常规核酸递送方法。遗传修饰方法的非限制性实例可以包括例如通过CRISPR/CAS9、锌指核酸酶或TALEN技术的基因编辑方法。
遗传修饰还可以包括引入有助于体外或体内选择或筛选或成像的可选择标志物或可筛选标志物。特别地，可以外源表达或向起始细胞或子代细胞中添加体内成像剂或自杀基因。在另一些方面，所述方法可以涉及图像引导的过继性细胞治疗。
本公开内容的一些方面涉及用于治疗患者的方法，其包括向该患者施用包含外源性TCR和/或CAR的体外分化T细胞或T细胞前体。在一些实施方案中，考虑使用包含外源性TCR和/或CAR的体外分化T细胞或T细胞前体。外源性TCR可以具有任何确定的抗原特异性。在一些实施方案中，将基于对期望接受者的同种异体反应性的不存在或降低来对其进行选择(一些实例包括某些病毒特异性TCR、异种特异性TCR或癌症-睾丸抗原特异性TCR)。在外源性TCR不具有同种异体反应性的实例中，在T细胞分化期间，外源性TCR通过称为等位基因排斥的发育过程抑制内源性TCR基因座的重排和/或表达，产生仅表达非同种异体反应性外源性TCR并且因此具有非同种异体反应性的T细胞。在一些实施方案中，外源性TCR的选择可以不必然基于同种异体反应性的缺乏来限定。在一些实施方案中，内源性TCR基因已通过基因组编辑进行修饰，使得其不表达蛋白质。基因编辑方法如使用CRISPR/Cas9系统的方法在本领域中是已知的并且在本文中描述。
在一些实施方案中，本文所述的方法涉及表达外源性TCR的干细胞和祖细胞，并且其中所述方法、组合物或细胞还包含本文公开的实施方案。在这种情况下，干细胞或祖细胞可以在体外分化。在一些实施方案中，干细胞或祖细胞是CD34+细胞。
在一些实施方案中，T细胞包含外源性TCR和另外的抗原或配体识别受体。在一些实施方案中，另外的抗原识别受体是基于CDR(互补性决定区)的抗原识别受体。在一些实施方案中，外源性TCR包含由TCR-α和TCR-β基因表达的蛋白质。在一些实施方案中，外源性TCR包含由TCR-γ和TCR-δ基因表达的蛋白质。在一些实施方案中，外源性TCR包含由TCR-α和TCR-β基因表达的蛋白质，并且抗原识别受体包含由TCR-γ和TCR-δ基因表达的蛋白质。在一些实施方案中，外源性TCR包含由TCR-γ和TCR-δ基因表达的蛋白质，并且抗原识别受体包含由TCR-α和TCR-β基因表达的蛋白质。
在一些实施方案中，另外的抗原识别受体不是TCR分子。在一些实施方案中，另外的抗原识别受体是嵌合抗原受体分子(CAR)。在一些实施方案中，CAR是肿瘤抗原特异性CAR(即识别肿瘤抗原的CAR)。在一些实施方案中，CAR是病毒抗原特异性CAR(即识别病毒抗原的CAR)。在这些实施方案中，外源性TCR介导T细胞发育期间的等位基因排斥，但在移植到患者中后，期望的抗肿瘤或抗病毒反应性由CAR介导，并且外源性TCR是惰性“过客(passenger)”。
在一些实施方案中，外源性TCR对第一抗原具有特异性，并且另外的抗原识别受体对第二抗原具有特异性。这产生具有双重(duel)特异性的T细胞：一种特异性由另外的抗原受体赋予，一种特异性由外源性TCR赋予。在一些实施方案中，第一抗原和第二抗原是由患者的癌细胞表达的癌细胞抗原。例如，患者可以患有已知的癌症或患者癌症的抗原可以通过实验确定。在一些实施方案中，本领域中已知抗原与癌症相关。在一些实施方案中，抗原通过实验确定。例如，可以分离患者的癌细胞并分析细胞表面蛋白或免疫原性新抗原的表达。当第一抗原和第二抗原是由患者的癌细胞表达的癌抗原时，T细胞对相同癌细胞显示出双重特异性。这样的有利之处在于，其在一种抗原由于抗原下调(或其他机制)而丧失时限制癌症的免疫逃避。用于诱导等位基因排斥的外源性TCR因此赋予功能性抗肿瘤或抗病毒特异性，使得产生具有双重靶标特异性的T细胞。一个实例是经改造的非同种异体反应性CAR-T细胞，其中CAR介导针对肿瘤抗原A的特异性，并且非同种异体反应性TCR介导针对肿瘤抗原B的特异性(后者以MHC限制性方式)。靶向由靶细胞群表达的多于一种抗原可以提高效力并降低抗性克隆的逃脱。
在一些实施方案中，外源性TCR是病毒特异性TCR、异种特异性TCR、癌细胞特异性TCR、细菌特异性TCR或癌症-睾丸抗原特异性TCR。与外源性TCR结合的抗原可以是本领域已知的，或者通过分析表达这样的抗原的细胞的T细胞响应来实验确定。
在一些实施方案中，T细胞相对于接受者是同种异体的(allogeneic)。
在一些实施方案中，患者患有癌症。在一些实施方案中，所述方法用于在对象中治疗癌症。在一些实施方案中，癌症选自肺癌、前列腺癌、卵巢癌、睾丸癌、脑癌、皮肤癌、黑素瘤、结肠癌、直肠癌、胃癌、食管癌、气管癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、包括淋巴瘤和多发性骨髓瘤的淋巴样癌症、白血病、骨肉瘤或软组织肉瘤、宫颈癌和外阴癌。
在一些实施方案中，所述方法还包括施用抗原，所述抗原可以是经纯化的、与其他分子缀合的或由细胞或细胞样载剂呈递的，其中所述抗原被外源性TCR识别。这可以进行以引起所施用经改造T细胞的体内扩增。
在一些实施方案中，所述方法还包括在施用于患者之前使T细胞与活化组合物接触。例如，T细胞可以根据以下活化：
用于活化T细胞的试剂盒也可商购获得。示例性的试剂盒包括抗生物素颗粒(例如MACSiBead或)和针对人CD2、CD3和CD28的生物素化抗体。装载有生物素化抗体的抗生物素颗粒用于模拟抗原呈递细胞并活化来自PBMC以及经纯化T细胞的静息T细胞。T细胞扩增通过培养并在培养的第14天再活化来实现。另一些试剂盒可以包括直接缀合的抗CD3/28微珠；多聚抗体复合物；或使用靶向可替选T细胞蛋白如CD2的抗体。例如，T细胞还可以被有丝分裂原如ConA、PHA和PWM活化。
在一些实施方案中，外源性TCR是非同种异体反应性的。术语“非同种异体反应性的”是指当移植到接受者中时不引起免疫反应性的蛋白质。在一些实施方案中，外源性TCR是惰性的，意味着其不引起临床上显著的毒性。
在一些实施方案中，患者患有微生物感染或处于患有微生物感染的风险之中。在某些实施方案中，患者已经被测试微生物感染。在一些实施方案中，第一抗原和第二抗原是由相同病毒类型表达或由被所述病毒类型感染的细胞表达的病毒抗原。在一些实施方案中，第一抗原和第二抗原是由相同细菌表达或在被所述细菌感染的细胞中表达的细菌细胞抗原。在一些实施方案中，第一抗原和第二抗原是由相同微生物的细胞表达或被所述微生物感染的细胞表达的微生物细胞抗原。
在一些实施方案中，外源性TCR是NY-ESO-1特异性TCR。
在一些实施方案中，所述方法还包括向患者施用抗原呈递细胞。在一些实施方案中，抗原呈递细胞是树突细胞。在一些实施方案中，抗原呈递细胞是人工抗原呈递细胞。在一些实施方案中，抗原呈递细胞装载有被外源性TCR识别的抗原。向抗原呈递细胞装载抗原的方法在本领域中是已知的。在一些实施方案中，抗原呈递细胞是自体的。通常用熟化剂(maturation agent)如IL-4和/或GM-CSF处理分离的抗原呈递细胞(其可以从所治疗患者中分离)。然后，可以用抗原(例如对外源性TCR具有特异性的抗原)脉冲抗原呈递细胞以产生装载抗原的APC。在一些实施方案中，用促炎细胞因子培养装载抗原的APC(或使其与促炎细胞因子接触)，所述促炎细胞因子例如LPS、干扰素γ、TNF-α、IL-1β、IL-6和/或PGE2。所述方法还可以包括冷冻装载抗原的APC、解冻装载抗原的APC，并将装载抗原的APC施用于患者。
外源性TCR还可以用于指导等位基因排斥和/或赋予由干细胞和祖细胞产生的经改造调节性/抑制性T细胞以抗原特异性或另外功能，而不考虑另外抗原或配体受体的转导。
在一些实施方案中，体外分化的T细胞被改造成T调节性细胞。在一些实施方案中，T细胞还包含FOXP3表达。在一些实施方案中，T细胞被改造或选择以表达FOXP3。在一些实施方案中，FOXP3表达是组成型的。FOXP3表达可以赋予T细胞以调节功能。因此，T细胞可以是可用于抑制患者中自身免疫或同种异体反应性的抑制性T细胞。这种方法的一些实例是将外源性TCR引入干细胞和祖细胞中，所述干细胞和祖细胞也被改造以产生等位基因排斥的FOXP3T调节性细胞；在这种情况下，外源性TCR可以不必然基于降低的同种异体反应性来选择。
在任何上文公开方法的一些实施方案中，对象患有自身免疫病、移植物抗宿主病(GVHD)或移植物排斥，或处于患有其的风险之中。对象可以是被诊断患有这样的疾病的对象，或是已经基于遗传史或家族史分析被确定易患这样的疾病的对象。对象还可以是准备进行移植或已经进行移植的对象。在一些实施方案中，所述方法用于治疗自身免疫病、GVHD或移植物排斥。
还在本公开内容的范围内的是经改造的T细胞，例如本文所述方法中描述的那些。因此，某些方面涉及包含外源性TCR的体外分化T细胞。在一些实施方案中，TCR是病毒特异性TCR、异种特异性TCR、癌细胞特异性TCR、细菌特异性TCR或癌症-睾丸抗原特异性TCR。在一些实施方案中，T细胞还包含另外的抗原或配体识别受体。在一些实施方案中，外源性TCR包含由TCR-α和TCR-β基因表达的蛋白质。在一些实施方案中，外源性TCR包含由TCR-γ和TCR-δ基因表达的蛋白质。在一些实施方案中，外源性TCR是模拟TCR信号转导的经改造分子。在一些实施方案中，外源性TCR包含由TCR-α和TCR-β基因表达的蛋白质，并且抗原识别受体包含由TCR-γ和TCR-δ基因表达的蛋白质。在一些实施方案中，外源性TCR包含由TCR-γ和TCR-δ基因表达的蛋白质，并且抗原识别受体包含由TCR-α和TCR-β基因表达的蛋白质。在一些实施方案中，另外的抗原识别受体不是TCR分子。在一些实施方案中，另外的抗原识别受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，CAR是肿瘤抗原特异性CAR。在一些实施方案中，CAR是病毒抗原特异性CAR。在一些实施方案中，外源性TCR对第一抗原具有特异性，并且另外的抗原识别受体对第二抗原具有特异性。在一些实施方案中，第一抗原和第二抗原是由癌症的细胞表达的癌细胞抗原。在一些实施方案中，第一抗原和第二抗原是由病毒表达或被所述病毒感染的细胞表达的病毒抗原。在一些实施方案中，第一抗原和第二抗原是由细菌细胞表达或被所述细菌感染的细胞表达的细菌细胞抗原。在一些实施方案中，外源性TCR是NY-ESO-1特异性TCR。在一些实施方案中，T细胞还包含FOXP3表达。在一些实施方案中，T细胞被改造或选择以表达FOXP3。在一些实施方案中，FOXP3表达是组成型的。
在一些实施方案中，所述细胞包括：CD4-CD8-T细胞、CD4-CD8+T细胞、CD34+CD7+CDla+细胞、CD3+TCRab+、CD3+TCRgd+、CD3+TCRab+CD4+CD8-、CD3+TCRab+CD8+CD4-、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+CCR7+、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+CCR7+、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+CD27+、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+CD27+、CD34+CD7+CD1a+细胞、CD34+CD5+CD7+、CD34+CD5+CD7-、自然杀伤T细胞或调节性T细胞、抗原特异性T细胞。在一些实施方案中，不包括CD4+CD8-T细胞、CD4-CD8-T细胞、CD34+CD7+CD1a-细胞、CD3+TCRab+、CD3+TCRgd+、CD3+TCRab+CD4+CD8-、CD3+TCRab+CD8+CD4-、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+CCR7+、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+CCR7+、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+CD27+、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+CD27+、CD34+CD7+CD1a-细胞、CD34+CD5+CD7+、CD34+CD5+CD7-、自然杀伤T细胞、调节性T细胞、抗原特异性T细胞。在一些实施方案中，所述细胞包含本文所述的细胞表面标志物或所述细胞不表达本文所述的细胞表面标志物。在一些实施方案中，所述细胞包括上皮内淋巴细胞(IEL)。在一些实施方案中，上皮内淋巴细胞是CD4-CD8+、CD4+CD8-、CD4+CD8+、CD4-CD8-、TCRab+、TCRgd+、CD5+CD7+、CD5+CD7+CD3-CD4-CD8-、CD5+CD7+CD3-CD4-CD8aa、或其组合。在一些实施方案中，不包括例如以下的上皮内淋巴细胞：CD4-CD8+、CD4+CD8-、CD4+CD8+、CD4-CD8-、TCRab+、TCRgd+、CD5+CD7+、CD5+CD7+CD3-CD4-CD8-和/或CD5+CD7+CD3-CD4-CD8aa。
另一些方面涉及用于向具有外源性TCR表达T细胞的患者中的所述外源性TCR表达T细胞递送药剂的方法，其包括向所述患者施用与抗原缀合的药剂，其中所述抗原被所述外源性TCR识别。在一些实施方案中，外源性TCR是惰性的。在一些实施方案中，所述药剂是消除剂。例如，所述药剂可以是在药剂-抗原与细胞表面上的TCR接触后消除细胞的细胞毒性剂。消除剂包括但不限于例如甲氨蝶呤、氨基喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪(decarbazine)；烷化剂；例如甲二氯二乙胺(mechlorethamine)、噻替派瘤可宁(thioepa chlorambucil)、美法仑、卡莫司汀(BSNU)、丝裂霉素C、洛莫司汀(CCNU)、1-甲基亚硝基脲、环磷酰胺(cyclothosphamide)、甲二氯二乙胺、白消安、二溴甘露醇、链脲菌素、丝裂霉素C、顺式-二氯二胺铂剂(II)(DDP)顺铂和卡铂(卡波铂(paraplatin))；蒽环类包括柔红霉素(原名道诺霉素)、多柔比星(阿霉素)、地托比星、洋红霉素、伊达比星、表柔比星、米托蒽醌和比生群(bisantrene)；抗生素包括更生霉素(放线菌素D)；博来霉素；卡里奇霉素；光神霉素和氨茴霉素(AMC)；抗真菌剂，例如长春花生物碱、长春新碱和长春花碱、紫杉醇(紫杉酚)、蓖麻毒素、假单胞菌外毒素、吉西他滨、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、秋水仙素、二羟基炭疽菌素二酮、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、丙卡巴肼、羟基脲、天冬酰胺酶、皮质类固醇、米托坦(mytotane)(O，p′-(DDD))、干扰素、以及这些消除剂的混合物。另一些消除剂包括但不限于化学治疗剂例如卡铂、顺铂、紫杉醇、吉西他滨、卡里奇霉素、多柔比星、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C、放线菌素D、环磷酰胺、长春新碱和博来霉素。
另一些方面涉及用于体外选择和分离本公开内容的经改造T细胞(即表达外源性TCR的体外分化T细胞)的方法。所述方法包括使包含T细胞的组合物与与外源性TCR特异性结合的药剂接触以制备药剂-TCR表达细胞复合物并从组合物纯化药剂-TCR表达细胞复合物。所述药剂可以是与外源性TCR特异性结合的抗体、肽-MHC多聚体或特异性识别外源性TCR的任何其他分子。在一些实施方案中，所述药剂与固体支持物连接。固体支持物可以是珠(例如磁性或琼脂糖)、板如组织培养皿、盖片、或阵列。固体支持物也可以是纯化柱。在一些实施方案中，所述方法还包括施用与药剂特异性结合的第二分子。第二分子可以是例如与一抗结合的二抗。在一些实施方案中，第二分子与固体支持物连接。在一些实施方案中，所述方法还包括使固体支持物和结合的分子与组合物分离。分离可以通过从固体支持物洗涤未结合的分子和/或其他分离技术如离心或柱分离来进行。在一些实施方案中，所述方法还包括洗涤固体支持物和缔合分子一次或更多次。在一些实施方案中，第一分子或第二分子可以与荧光分子方法缀合，并且分离可以通过流式细胞术/荧光激活细胞分选来进行。在一些实施方案中，所述方法还包括使药剂从药剂-TCR表达细胞复合物解离。在一些实施方案中，所述方法还包括基于其他T细胞标志物的包括或排除进一步纯化TCR表达细胞，所述其他T细胞标志物例如CD4、CD8、CD45RA、CD45RO、CCR7/CD197、CD62L、CD27、CD28和CD1a。在一些实施方案中，所述方法还包括培养所纯化的TCR表达细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括冷冻所纯化的TCR表达细胞。
另一些方面涉及制备本文所述的表达外源性TCR的体外分化T细胞的方法，所述方法包括将外源性TCR或TCR衍生物转移到干细胞或免疫祖细胞中；并使干细胞或免疫祖细胞分化成T细胞或T细胞前体。分化可以根据本领域已知的方法或根据本文所述的分化/培养方法进行。在一些实施方案中，使干细胞或免疫祖细胞在与分化剂接触之前、同时和/或之后与同源MHC和/或肽分子接触。
在一些实施方案中，使干细胞或免疫祖细胞分化成T细胞包括将干细胞或免疫祖细胞与异位(ectopically)表达Notch配体的基质细胞共培养。在一些实施方案中，基质细胞是OP9细胞。在一些实施方案中，Notch配体是δ样1(Dll1)。在一些实施方案中，Notch配体是本文或本领域中描述的，例如美国专利7,795,404中描述的Notch配体，其通过引用并入本文。在一些实施方案中，所述方法还包括使共培养的干细胞或免疫祖细胞和基质细胞与Flt-3配体和/或IL-7和/或干细胞因子/Kit配体和/或促血小板生成素接触。在一些实施方案中，使干细胞或免疫祖细胞分化成T细胞包括：用无血清培养基培养三维(3D)细胞聚集体，所述三维(3D)细胞聚集体包含：a)表达外源性Notch配体的选定基质细胞群、b)选定的干细胞或祖细胞群；所述无血清培养基包含有效地由3D细胞聚集体产生T细胞的浓度的补充剂、无异源补充剂、GS21TM补充剂、抗坏血酸、Flt-3配体、IL-7、或其组合，其中3D细胞聚集体产生T细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括下述一个或更多个实施方案。
在一些实施方案中，T细胞群或细胞组合物包含CD4+CD8-T细胞、CD4-CD8-T细胞、CD34+CD7+CD1a-细胞、CD3+TCRab+、CD3+TCRgd+、CD3+TCRab+CD4+CD8-、CD3+TCRab+CD8+CD4-、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+CCR7+、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+CCR7+、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+CD27+、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+CD27+、CD34+CD7+CD1a-细胞、CD34+CD5+CD7+、CD34+CD5+CD7-、自然杀伤T细胞或调节性T细胞，和/或抗原特异性T细胞。在一些实施方案中，不包括CD4+CD8-T细胞、CD4-CD8+T细胞、CD34+CD7+CD1a+细胞、CD3+TCRab+、CD3+TCRgd+、CD3+TCRab+CD4+CD8-、CD3+TCRab+CD8+CD4-、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+CCR7+、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+CCR7+、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+CD27+、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+CD27+、CD34+CD7+CD1a+细胞、CD34+CD5+CD7+、CD34+CD5+CD7-、自然杀伤T细胞、调节性T细胞和/或抗原特异性T细胞。在一些实施方案中，上皮内淋巴细胞是CD4-CD8+、CD4+CD8-、CD4+CD8+、CD4-CD8-、TCRab+、TCRgd+、CD5+CD7+、CD5+CD7+CD3-CD4-CD8-、CD5+CD7+CD3-CD4-CD8aa、或其组合。在一些实施方案中，不包括例如以下的上皮内淋巴细胞：CD4-CD8+、CD4+CD8-、CD4+CD8+、CD4-CD8-、TCRab+、TCRgd+、CD5+CD7+、CD5+CD7+CD3-CD4-CD8-、和/或CD5+CD7+CD3-CD4-CD8aa。
在一些实施方案中，T细胞群或细胞组合物包含至少或至多5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％(或可从其中来源的任何范围)的具有本文所述表型和/或细胞标志物的活细胞。所述细胞可以来自第1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16周(或可从其中来源的任何范围)ATO。
在一些实施方案中，T细胞群或细胞组合物包含的活细胞与具有本文所述表型和/或细胞标志物的细胞的比例或具有本文所述表型和/或细胞标志物的细胞与活细胞的比例为以下：至少或至多1∶0.1、1∶0.2、1∶0.3、1∶0.4、1∶0.5、1∶0.6、1∶0.7、1∶0.8、1∶0.9、1∶1、1∶1.1、1∶1.2、1∶1.3、1∶1.4、1∶1.5、1∶1.6、1∶1.7、1∶1.8、]∶1.9、1∶2、1∶2.1、1∶2.2、1∶2.3、1∶2.4、1∶2.5、1∶2.6、1∶2.7、1∶2.8、1∶2.9、1∶3、1∶3.1、1∶3.2、1∶3.3、1∶3.4、1∶3.5、1∶3.6、1∶3.7、1∶3.8、1∶3.9、1∶4、1∶4.1、1∶4.2、1∶4.3、1∶4.4、1∶4.5、1∶4.6、1∶4.7、1∶4.8、1∶4.9、1∶5、1∶5.1、1∶5.2、1∶5.3、1∶5.4、1∶5.5、1∶5.6、1∶5.7、1∶5.8、1∶5.9、1∶6、1∶6.1、1∶6.2、1∶6.3、1∶6.4、1∶6.5、1∶6.6、1∶6.7、1∶6.8、1∶6.9、1∶7、1∶7.1、1∶7.2、1∶7.3、1∶7-4、1∶7.5、1∶7.6、1∶7.7、1∶7.8、1∶7.9、1∶8、1∶8.1、1∶8.2、1∶8.3、1∶8.4、1∶8.5、1∶8.6、1∶8.7、1∶8.8、1∶8.9、1∶9、1∶9.1、1∶9.2、1∶9.3、1∶9.4、1∶9.5、1∶9.6、1∶9.7、1∶9.8、1∶9.9、1∶10、1∶10.5、1∶11、1∶11.5、1∶12、1∶12.5、1∶13、1∶13.5、1∶14、1∶14.5、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45或1∶50(或可从其中来源的任何范围)。
如本文在说明书中所用的，没有数量词修饰的名词可以意指一个/种或更多个/种。如在权利要求书中所用的，当与词语“包含/包括”联合使用时，没有数量词修饰的名词可以意指一个/种或多于一个/种。
除非明确指出仅指代替代方案或者替代方案是相互排斥的，否则术语“或”在权利要求书中的使用用于意指“和/或”，但是本公开内容支持指代仅替代方案和“和/或”的定义。如本文所用的，“另一个”可以意指至少第二或更多。可以设想，本文所讨论的一个或更多个实施方案可以在权利要求书中被明确排除。
在本申请通篇，术语“约”用于表示包括设备、用于确定该值的方法的固有误差变化、或在研究对象之间存在的变化的值。
在本文所讨论的任何实施方案中，术语“由......组成”或“基本上由...组成”可以代替术语“包含/包括”。
根据以下详细描述，本发明的其他目的、特征和优点将变得显而易见。然而，应理解的是，详细描述和具体实例尽管指出了本发明的一些优选实施方案但是仅以示例的方式给出，因为由该详细描述，在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员将变得显而易见。
附图简述
以下附图形成本说明书的一部分并且被包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过参照这些附图中的一个或更多个并结合对本文给出的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。
图1A至1B：在人工胸腺类器官(ATO)中由脐带血(CB)CD34+HSPC的人T细胞产生。使CB CD34+HSPC在ATO中分化7周。A)ATO的每周分析，其示出了CD3+TCRαβ+T细胞的进行性发育(对CD14-CD56-细胞设门以分别排除单核细胞和NK细胞)。B)对CD3+TCRαβ+细胞设门的ATO的每周分析，其示出了成熟CD8+和CD4+T细胞的发育。
图2A至2B：在ATO中由脐带血CD34+HSPC的抗原特异性经TCR改造T细胞的产生，以及通过在ATO中表达人MHC分子的正选择增强。在HLA-A*02：01背景下用编码对NY-ESO-1157-165具有特异性的TCR的慢病毒转导CB CD34+HSPC，并在ATO中分化6周。A)ATO中成熟的初始抗原特异性CD8+T细胞的产生，如通过TCR(使用HLA-A*02：01/NY-ESO-1157-165四聚体检测)、CD3、CD8、CD45RA、CD27和CCR7的表达所显示的。从最后一幅图，每附图代表顺序设门。B)ATO基质细胞隔室中被修饰以表达HLA-A*02：01的ATO中的正选择和成熟抗原特异性T细胞产生增强。
图3A至3G：ATO系统中人T细胞发育的效率和可重现性。(a)ATO模型的示意图。(b)在指定周由CB CD34+CD3-HSPC的T细胞分化的动力学(对CD14-CD56-细胞设门以分别排除髓样细胞和NK细胞)。(c)基于两种分类方案的ATO中早期CD34+胸腺T细胞祖细胞表型的维持(如(b)所示对CD34+细胞设门)。(d)用CB HSPC和MS-5细胞(左)或MS5-hDLL1细胞(即ATO)(右)产生的第4周类器官中CD3的免疫荧光染色。(e)以1∶10至1∶30HSPC：基质细胞比例用2-5x104个HSPC起始的生物学重复CB ATO(n＝18)中的总细胞扩增。(f)单核细胞(CD14+)、NK细胞(CD56+)或T谱系细胞(CD7+CD5+)频率(对总细胞设门)；以及(g)第6周生物学重复ATO(n＝18)中的T细胞和前体频率(对CD14-CD56-细胞设门)。
图4A至4C：ATO中胸腺生成(thymopoiesis)和初始T细胞发育的重现。对(a)总CD14-CD56-和(b)CD3+TCRαβ+细胞设门的第12周CB ATO与人出生后胸腺细胞之间的T细胞分化比较。(c)第12周ATO或胸腺中未成熟(CD45RA-CD45RO+)和成熟(CD45RA+CD45RO-)初始T细胞的产生(对CD3+TCRαβ+细胞设门，其中指出了CD8SP或CD4SP子门(subgate))。
图5A至5F：由多种HSPC来源和亚群的T细胞产生。用来自人脐带血(CB)、成体骨髓(BM)、G-CSF动员的外周血(MPB)或非动员外周血(PB)的CD34+CD3-HSPC起始的第6周ATO中的有效T细胞发育。对(a)总CD14-CD56-细胞和(b)CD14-CD56-CD3+TCRαβ+T细胞设门。(c)对CD14-CD56-细胞或(d)CD14-CD56-CD3+TCRαβ+T细胞设门的第6周ATO中由来自CB、BM和MPB的Lin-CD34+CD38-造血干细胞(HSC)富集级分的T细胞分化。(e)对CD14-CD56-细胞设门的用成体BM HSC和祖细胞亚群起始的第3周ATO中的T细胞分化，和(f)如(e)所示的CD34+细胞。
图6A至6E：ATO来源T细胞的TCR多样性和功能。(a)如通过TCR Vβ使用的流式细胞术分析所示的来自第7周ATO(n＝5)或人胸腺(n＝4)的CD8SP T细胞中生理TCR多样性的产生。(b)在用PMA/离子霉素处理12小时的经分选ATO来源DP、CD8SP和CD4SP细胞中干扰素γ和IL-4产生的细胞内染色。(c)响应于抗CD3/CD28和IL-2的ATO来源CD8SP细胞的增殖(CFSE稀释)和活化(CD25上调)。(d)从用来自脐带血(CB)、骨髓(BM)或动员的外周血(MPB)的HSPC起始的ATO分离的CD8SP细胞的可比较响应，如响应于PMA/离子霉素的干扰素γ产生所示的(相对于空分析通道示出)；以及(e)响应于抗CD3/CD28和IL-2的相对于输入细胞数的可比较体外扩增。
图7A至7G：ATO中经TCR改造T细胞的分化和等位基因排斥。(a)在用经TCR转导CBHSPC(顶行)或模拟转导CB HSPC(底行)起始的第7周ATO中HLA-A*0201/NY-ESO-1157-165特异性经TCR改造T细胞的有效产生。这些图用在每幅图上方所示的顺序子门对CD14-CD56-细胞设门。(b)以1∶20HSPC：基质细胞比例用3×104个CB HSPC产生的第6周经TCR转导ATO相对于模拟转导ATO中的增强的总细胞扩增。(c)通过降低HSPC和基质二者的数目的第5周经TCR转导ATO中细胞扩增的增强。ATO用3×104或7.5×103个经TCR转导CB HSPC以1∶20HSPC：基质细胞比例产生。(d)ATO来源的经TCR转导CD8SP T细胞的细胞毒性致敏。与K562细胞或表达CD80和同源肽-MHC的K562人工APC共培养后的干扰素γ产生和CD107a膜移动(对CD3+四聚体+CD8SP设门T细胞)。(e)响应于抗CD3/CD28和IL-2的来自经TCR转导ATO或模拟转导ATO的CD8SP T细胞的细胞扩增。(f)来自经TCR转导ATO(n＝3)或未经转导ATO(n＝5)的CD8SP细胞的TCR Vβ多样性。Vβ频率通过流式细胞术确定，对来自经TCR转导ATO(n＝3)的四聚体+CD3+CD8SP细胞或来自未经转导ATO(n＝5)的CD3+CD8SP细胞设门。(g)来自(f)的代表性流式细胞术图，其示出了来自经TCR转导ATO的四聚体+CD3+CD8SP细胞中转导的Vβ13.1链的富集。示出了来自未经转导ATO或人胸腺的CD3+CD8SP T细胞用于比较。
图8A至8C：经MHC修饰ATO中经TCR改造T细胞的增强正选择。(a)对ATO中造血和/或基质“自身”MHC表达建模的方法的示意图。通过使用HLA分型供体CB单元实现造血HLA-A*02：01表达，并通过用表达HLA-A*02：01的慢病毒转导MS4-hDLL1细胞实现基质表达。所有HSPC都用HLA-A*02：01限制性NY-ESO-1特异性TCR转导。(b)基质和造血“自身”MHC表达对ATO中四聚体+CD8SP T细胞的正选择的协同作用。细胞对CD14-CD56-设门，并且顺序子门示于图上方。(c)具有基质HLA-A*02：01表达的ATO中经TCR改造T细胞向成熟初始T细胞表型的增强成熟，如通过CD45RA、CD27和CCR7的上调以及CD45RO和CD1a的下调所示的。所有图都对四聚体+CD3+CD8SP T细胞设门。
图9A至9B：ATO细胞扩增和T细胞分化与输入HSPC数和HSPC：基质细胞比例相关。来自用(a)不同数目的CD34+CD3-CB HSPC和恒定基质细胞(MS5-hDLL1)数，或(b)不同数目的HSPC和基质细胞产生的第6周ATO的细胞扩增和T细胞频率数据。在最低输入HSPC数/ATO(7,500个细胞)和1∶20至1∶40的HSPC：基质细胞比例下观察到最佳的总T细胞扩增和成熟T细胞扩增。
图10A至10G：ATO中的T细胞分化是高度可重现的，并且不受B27批次、无异源B27或基质辐照影响。B27批次变化对由单一CB样品产生并用4个不同批次的B27补充剂(标记为A至D)培养的第6周ATO中的(a)总ATO细胞输出、(b)髓样细胞(CD14+)或NK细胞(CD56+)分化或(c)B细胞(CD19+)或T细胞分化无显著影响。对每个B27批次示出了技术ATO重复(n＝2至3)。所有ATO均用3×104个HSPC以1∶20的HSPC：基质细胞比例建立。用无异源B27替代B27对第6周ATO中的(d)细胞数目或(e)T细胞分化没有影响。(f)用以指定剂量辐照的MS5-hDLL1细胞产生的ATO显示出可比较的T细胞分化(对总CD14-CD56-细胞设门)，或(g)如(f)所示对CD3+TCRαβ+细胞设门。
图11A至11C：ATO相对于单层系统的增强的正选择。(a)与单层共培养物相比的ATO(即具有RB27的3D培养物中的MS5-hDLL1)中增强的T细胞正选择和成熟。将第6周单层培养物(左)与3D类器官培养物(右)进行比较，并且包括与OP9-DL1的交叉比较，如所示的。如方法中所述，用于OP9-DL1单层共培养物的标准培养基是MEMα/20％FCS，并且用于ATO的标准培养基是RB27。还示出了使用亲本MS-5细胞系(不用DLLl转导)的单层或类器官培养物。如图上方所示，所有图均对CD14-CD45-细胞或CD3+TCRαβ+子门设门。在第6周标准OP9-DL1单层培养物相对于ATO的相关细胞群的(b)百分比和(c)扩增倍数。使用相同的CB单元并行起始培养。ATO用3×104个HSPC以1∶20的HSPC：基质细胞比例建立。
图12A至12C：ATO中胸腺生成和初始T细胞表型的重现。(a)第6至10周的ATO中CD3+TCRαβ+CD8SP和CD4SP细胞的进行性分化。ATO由相同的供体CB HSPC并行培养并在指定周进行连续分析。细胞对CD14-CD56-TCRαβ+CD3+细胞设门，并且顺序子门(CD8SP或CD4SP)示于图上方。(b，c)与人胸腺中的对应群体相比表征第12周ATO来源初始CD8SP和CD4SP T细胞的另一些标志物。所有细胞均对CD14-CD56-CD3+TCRαβ+设门，并对(b)CD8SP或(c)CD4SP细胞进行子设门。
图13A至13F：由多种HSPC来源和亚群的T细胞产生。(a)来自不同人脐带血(CB)、成体骨髓(BM)、G-CSF动员的外周血(MPB)或非动员外周血(PB)HSPC的第6周ATO中CD34+细胞的维持。(b)如(a)所示对CD34+细胞设门的CD34+T细胞祖细胞亚群的表型。(c)如(a)所示使用HSPC来源的第6周ATO中总细胞和相关T细胞亚群的扩增倍数。扩增倍数相对于HSPC的起始数目。ATO使用3×104个CD34+CD3-HSPC/ATO以1∶20的HSPC：基质细胞比例建立。由来自不同HSPC来源的造血干细胞(HSC)富集(Lin-CD34+CD38-)级分起始的第6周ATO中的(d)CD34+细胞维持和(e)CD34+T细胞祖细胞表型。(f)用经纯化BM造血干细胞和祖细胞亚群起始的第3周ATO中总细胞的扩增倍数。ATO用每种群体的2×104至4×104个/ATO以1∶15-1∶40的HSPC：基质细胞比例起始。数据相对于HSPC的起始数目。
图14A至14B：ATO系统中人T细胞发育的效率和可重现性。(a)6周时ATO中细胞类型的频率。上图：单核细胞(CD14+)、NK细胞(CD56+)、B细胞(CD19+)、HSPC(CD34+)或T谱系细胞(CD7+CD5+)的频率(对总活细胞设门)。中间的图：T细胞前体和TCR+T细胞频率(对CD14-CD56-细胞设门)。下图：DP以及成熟CD8和CD4单阳性(SP)T细胞的频率(对CD3+TCRαβ+细胞设门)。(b)由7.5×103至22.5×103个CB HSPC/ATO在第6周每ATO产生的总细胞数和CD3+TCRαβ+CD8SP T细胞。示出了11个生物学重复的数据(误差条表示标准偏差)。
图15A至15D：由多种HSPC来源和亚群的T细胞产生。(a)由从CB、新生儿胸腺、BM或MPB分离的7500个CD34+CD3-细胞产生的ATO中在12周内的T细胞分化动力学。T细胞前体和成熟T细胞的频率的平均值和SD由三个技术重复/组织示出，并且数据代表两个不同的实验。(b)来自(a)中所示ATO的总细胞和CD3+TCRαβ+CD8SP T细胞的数目。(c)在第6周时ATO中成体BM HSPC(CD34+lin-)和祖细胞(LMPP和CLP)亚群的T细胞分化潜能(示出了门)。(d)来自(c)中所示ATO的总细胞和CD3+TCRαβ+CD8SP T细胞的数目。示出了技术性三个重复的平均值和SD，并且数据代表三个生物学重复。
图16A至16F：ATO来源T细胞的TCR多样性和功能。(a)来自第7周ATO(n＝5)或人胸腺(n＝4)的CD3+TCRαβ+CD8SP T细胞中TCR多样性的产生，如通过TCR Vβ家族表达频率的流式细胞术分析所示的。通过(b)TCR Vα和(c)TCR Vβ CDR3区的深度测序的来自ATO、胸腺和外周血(PB)初始T细胞的CD3+TCRαβ+CD8SP T细胞中的TCR克隆型多样性。示出了单独克隆型的频率。数据代表三个生物学重复。(d)通过用PMA/离子霉素处理6小时的ATO来源CD3+TCRαβ+CD8SP T细胞的多功能性细胞因子产生。数据代表三个不同的实验。(e)响应于抗CD3/CD28和IL-2的5天后ATO来源CD3+TCRαβ+CD8SP细胞的增殖(CFSE稀释)和活化(CD25和4-1BB上调)。数据代表两个独立的实验。(f)7和14天后响应于抗CD3/CD28和IL-2的相对于起始细胞数的ATO来源CD3+TCRαβ+CD8SP T细胞的ATO后扩增。示出了技术性三个重复的平均值和SD，并且数据代表三个生物学重复。
图17A至17F：ATO中经TCR改造T细胞的分化和等位基因排斥。(a)来自经TCR转导CBATO的CD3+TCRαβ+四聚体+T细胞上CD8α和CD8β的共表达以及CD56和CD16表达的缺乏，表明为常规T细胞发育。数据代表3个生物学重复。(b)在6或7周时经TCR转导ATO相对于模拟转导ATO中相对于HSPC的起始数目的提高的总细胞输出和细胞产率，所述ATO用7.5×103至18×103个起始CB HSPC产生。示出了生物学重复实验的平均值和SD(模拟n＝3，TCR n＝8，**p＝0.002)。(c)通过人工抗原呈递细胞(aAPC)的ATO来源经TCR改造T细胞的细胞毒性致敏。响应于K562细胞或K562aAPC的CD3+四聚体+CD8SP T细胞的细胞因子产生和CD107a膜移动，所述K562aAPC表达CD80和呈递不相关肽(MARTl26-35)或同源肽(NY-ESO1156-165)的HLA-A*02：01单链三聚体。数据代表三个生物学重复。(d)72小时内响应于不相关aAPC(MART1)或同源aAPC(NY-ESO-1)的ATO来源CD3+四聚体+CD8SPT细胞的增殖(CFSE稀释)和活化(CD25上调)。数据代表两个生物学重复。(e)7天和14天后响应于抗CD3/CD28和IL-2或IL-7/IL-15的相对于起始细胞数来自经TCR转导ATO的ATO来源CD3+TCRαβ+CD8SP T细胞的ATO后扩增。示出了技术性三个重复的平均值和SD，并且数据代表三个生物学重复。(f)与未经转导ATO(n＝5)相比来自经TCR转导ATO(n＝3)的CD3+TCRαβ+四聚体+CD8SP细胞中内源性TCR Vβ的等位基因排除，如通过流式细胞术分析所示的。错误条代表SD。
图18A至18F：ATO来源的经TCR改造T细胞的抗原特异性肿瘤细胞杀伤。(a，b)ATO来源的经TCR改造T细胞对抗原阳性肿瘤细胞的体外细胞毒性。将来自HLA-A*02：01/NY-ESO-1157-165特异性经TCR转导ATO的CD8SP T细胞用抗CD3/28+IL-2活化36小时，并与K562细胞、经呈递不相关肽(MART126-35)或同源肽(NY-ESO1156-165)的HLA-A*02：01单链三聚体转导的K562细胞(分别为K562-MART-1和K562-ESO)或HLA-A*02：01+NY-ESO-1+U266多发性骨髓瘤细胞系共孵育。(a)早期(膜联蛋白V+DAPI-)或晚期(膜联蛋白V+DAPI+)凋亡肿瘤细胞百分比通过流式细胞术在9小时时确定。效应物∶靶标(E∶T)比例基于共培养开始时的四聚体+T细胞百分比计算。数据代表两个生物学重复。(b)(a)中所示的细胞毒性测定的特异性细胞死亡。针对未接受T细胞的孔中的自发性(非特异性)细胞死亡调整总膜联蛋白V+细胞。(c)T细胞的长时间ATO后活化/扩增后保留的抗原特异性。将从经TCR转导ATO分离的CD8SP T细胞用抗CD3/28和IL-2扩增14天，并按照(a)中所述进行细胞毒性测定。示出了使用在相同条件下扩增14天的经TCR转导外周血CD8+供体T细胞的测定用于比较。(d至f)ATO来源的经TCR改造T细胞的体内肿瘤控制。如(c)中所述，将来自经TCR转导ATO的CD8SP T细胞活化/扩增14天。(d)将5.7×106个T细胞(包括通过四聚体染色的4.5×106个抗原特异性T细胞)或PBS静脉内(IV)注射到NSG小鼠中，所述NSG小鼠已提前三天皮下植入2.5×105个经萤光素酶转导K562-ESO或K562-MART肿瘤细胞。(e)K562-ESO相对于K562-MART1肿瘤细胞针对ATOCD8SP的响应。在指定的时间点记录生物发光。示出了每组2至3只小鼠的平均值和SD(PBS n＝2，经TCR转导ATO T细胞，其中K562-ESO n＝3或K562-MART1 n＝2)(**p＝0.00033，****p＝0.000066)。(f)来自(d)和(e)中所述测定的选定小鼠的生物发光成像。注意，中间行示出了经ATO CD8SP T细胞处理的三只总K562-ESO携带小鼠中唯一生长肿瘤的小鼠。
图19：ATO形成实体组织样结构。显示用CB HSPC和MS5-hDLL1(即ATO)(左)、亲本MS-5细胞(中央)或单独MS5-hDLL1细胞(右)产生的第6周3D培养物的组织构造的苏木精和伊红染色。放大倍数为100×(顶行)或400×(底行)。
图20A至20B：每ATO的起始HSPC数目影响每HSPC的细胞产率，但不影响总细胞输出或T细胞分化。(a)用不同数目的CD34+CD3-CBHSPC(0.3×103至30×103/ATO)和恒定数目的MS5-hDLL1基质细胞(1.5×105/ATO)产生的第6周ATO中的总细胞数目和产率/输入HSPC。在右侧示出了与较大ATO(使用30×103个HSPC和6×105个基质细胞，比例为1∶20)的比较。(b)如(a)所述的ATO中的T细胞前体和成熟T细胞频率。示出了三个重复ATO的平均值和SD。数据代表两个生物学重复。
图21A至21K：ATO中的T细胞分化是高度可重现的，并且不受B27批次变化、无异源B27或基质辐照影响。B27批次变化对第6周ATO中的(a)T谱系定型、(b至c)T细胞分化或(d)总细胞数目无显著影响，所述第6周ATO由单一CB(7.5×103个CD34+CD3-HSPC/ATO)产生并且使用4个不同批次的B27补充剂(标记为A至D)进行培养。对每个B27批次示出了重复ATO(n＝2至3)。用无异源B27替代B27对第6周ATO中的(e)T细胞分化或(f)总细胞数没有显著影响。在ATO产生之前用20至80Gy辐照MS5-hDLL1基质细胞对(g至i)T细胞分化或(j)总细胞和CD3+TCRαβ+CD8SP T细胞数几乎无影响。示出了三个重复ATO的平均值和SD。数据代表两个独立的实验。(h)中的流程图示出了来自(g)中所示的CD3+TCRαβ+门的细胞。(k)在6周时通过机械破碎从ATO收获细胞得到＞99％人工血CD45+细胞(顶部)和＜0.5％GFP+基质(底部)的悬液。示出了8个生物学重复ATO的人和鼠细胞的频率。
图22：ATO相对于单层培养系统的增强的正选择。在6周时OP9-DL1单层培养物相对于ATO中单核细胞(CD14+)、NK细胞(CD56+)、B细胞(CD19+)、HSPC(CD34+)或T谱系细胞(CD7+CD5+)的频率，以及T细胞前体和T频率细胞类型(在每个图上方示出了顺序门)。培养对单层培养物和ATO培养物使用相同的CB单元来起始。数据代表三个生物学重复。
图23A至23B：ATO中胸腺生成和初始T细胞表型的重现。(a)与出生后胸腺相比CBATO中HLA-DR+细胞的频率(对CD45+细胞设门)。(b)在第6周ATO中存在多个HLA-DR+抗原呈递细胞(APC)群。在每个图上方示出了顺序门。HLA-DR+群包括单核细胞(CD14+)、粒细胞(CD66b+)、B细胞(CD19+)、HSPC(CD34+)、浆细胞样DC(CD303+CD123+)、CLEC9A+DC(CD141+CLEC9A+)和CDlc+DC(CDlc+CLEC9A-)。示出了来自出生后胸腺的配对分析用于比较。(a)和(b)中的数据代表三个生物学重复。
图24A至24B：通过(a)DP的早期外观和(b)T细胞定型CD34+CD7+祖细胞揭示的第3周ATO中来自LMPP和CD24-CLP的T细胞定型的早期发生。b)中的数据对如a)所示的CD34+细胞设门。数据代表两个生物学重复。
图25A至25E：ATO来源T细胞的TCR多样性和功能验证。(a)与人胸腺细胞类似，RAG1和RAG2在ATO来源CD3+CD4+CD8+(DP)中表达，但在成熟CD3+CD8SP T细胞中不表达。相对于经FACS分选ATO来源和出生后胸腺来源T细胞群中B2M的表达示出了对RAG1和RAG2的定量RT-PCR。示出了三个重复反应的平均值和SD。(b)从第7周ATO(n＝5)或人胸腺(n＝4)分离的CD3+TCRαβ+CD4SP T细胞中TCR多样性的产生，如通过对TCR Vβ家族表达频率的流式细胞术分析所示的。(c)用PMA/离子霉素处理6小时的第12周ATO来源CD4SP T细胞的细胞因子产生。数据代表两个生物学重复。(d)响应于抗CD3/CD28和IL-2的5天后脐带血(CB)和ATO来源(第12周)CD4SP T细胞的增殖(CTV稀释)和活化(CD25上调)。数据代表两个独立的实验。(e)7和14天后响应于抗CD3/CD28和IL-2相对于起始细胞数的ATO来源CD4SP T细胞的ATO后扩增。示出了技术性三个重复的平均值和SD。
图26A至26D：ATO中经TCR改造T细胞的分化和等位基因排斥。(a)ATO来源的经TCR改造T细胞尽管扩增和再刺激但仍保留常规T细胞表型。将来自由经HLA-A*0201/NY-ESO-1157-165特异性TCR转导的CB HSPC产生的ATO的CD8SP T细胞用抗CD3/28珠+IL-2活化，在IL-2中扩增，并在第14天用抗CD3/28珠再刺激。通过流式细胞术确定CD8α和CD8β的保留表面共表达。数据代表两个生物学重复。(b)来自经TCR转导CB ATO的CD3+TCRαβ+四聚体+CD8SP T细胞的流式细胞术Vβ分析。数据代表5个生物学重复。(c)使用HLA-A*02：01/MART126-35特异性TCR在ATO中由经TCR转导CB HSPC的经TCR改造T细胞产生。示出了在第6周时的分化(对总CD14-CD56-ATO细胞设门，其中在每个图上方示出了顺序门)。数据代表两个生物学重复。(d)通过表达CD80和呈递MART126-35或NY-ESO1156-165肽的HLA-A*02：01单链三聚体的人工抗原呈递细胞(aAPC)对MART1特异性和NY-ESO-1特异性ATO来源经TCR改造T细胞的抗原特异性致敏。示出了在6小时时的CD107a膜移动和细胞内IFNγ染色。
图27A至27B：经MHC修饰ATO中经TCR改造T细胞的增强正选择。(a)用来自单个供体的经TCR转导CB HSPC和标准或经HLA-A*02：01转导MS5-hDLL1基质细胞产生的第6周ATO中经TCR改造CD3+TCRαβ+四聚体+CD8SP T细胞的增强产生。在每个图上方示出了顺序门。(b)如(a)所示经MHC修饰ATO中经TCR改造T细胞向成熟初始T细胞表型的正常成熟。细胞对CD3+Vβ13.1+四聚体+CD8SP T细胞设门。数据代表三个生物学重复。
图28A至28C：未经修饰的人基质细胞系HS27a不支持T细胞分化。在不具有载体介导的notch配体表达的ATO系统中使用人基质细胞系(HS27a)。测试了来自三个不同脐带血样品的CD34+HSPC：(a)E37、(b)E43、(c)E68。在第4周，在不存在Notch信号转导的情况下，脐带血供体均不能产生CD5+CD7+T细胞定型细胞。除非另外示出，否则所示数据都以CD45+CD56-CD14-设门。
图29A至29F：人基质系HS27a中的Notch配体表达可以支持ATO中的T细胞分化。示出了来自用通过慢病毒转导以表达hDLL1改造的HS27a制备的ATO的数据。图28中示出了来自三个相同脐带血样品的CD34+HSPC：(a，b)E37、(c，d)E43和(e，f)E68。将使用HS27a-hDLL1ATO的数据与使用MS5-hDLL1基质作为阳性对照获得的数据进行比较。在第4周，所有三个脐带血供体在HS27a-hDDL1和MS5-hDLL1 ATO二者中均产生CD5+CD7+T细胞定型细胞。除非另外示出，否则所示数据均以CD45+CD56-CD14-设门。
图30：在4周HS27a-DLL1 ATO中产生的大多数CD8+细胞不表达CD3或TCRab。示出了比较MS5-hDLL1 ATO和HS27a-DLL1 ATO的数据。
图31A至31C：HS27a-hDLL1 ATO可以支持成熟T细胞的分化。示出了使用以下三个不同脐带血群的MS5-hDLL1 ATO和HS27a-hDLL1ATO中的T细胞分化(在4周时)：(a)E37、(b)E43、(c)E68。数据以CD45+CD56-CD14-设门，其中另外的CD3+TCRab设门在右图中。
图32A至32B：在第5周时ATO中人胚胎中胚层祖细胞(hEMP)(由hESC产生)的T细胞分化。(a)中示出了对CD56-CD14-设门的T细胞群。(b)中示出了对CD56-CD14-设门的细胞，其中另外的设门如所示(底行)。
图33A至33B：ATO中hEMP的T细胞分化动力学。(a)中示出了如在3、5和7周时所示设门的群体。(b)中示出了对7周时分化的进一步分析，其显示CD3+TCRab细胞是CD8ab+。
图34A至34B：hES来源hEMP产生具有成熟初始表型的T细胞。示出了在第5周时对ATO的分析(a)。TCRab+CD3+群由CD4+和CD8+细胞以及DP细胞构成。对(b)CDSP8和(c)CDSP4细胞的进一步分析。
图35A至35B：hEMP来源T细胞中成熟标志物的表达。(a)中示出了在第5周时对CD8SP细胞的分析。(b)中示出了在第5周时对CD4SP细胞的分析。
图36：T细胞产生在多种hESC系之间是可重现的。由三种不同hESC系产生的hEMP在ATO系统中产生T细胞。
图37：使用ATO系统的由iPSC的T细胞产生。该图表明iPSC系(HLA.A02.02，来自健康供体的皮肤成纤维细胞)在ATO系统中产生T细胞。数据来自第6周。
图38A至38B：在ATO中直接聚集的未分化hESC可以产生T细胞。示出了来自第5周(a)和第7周(b)ATO的T细胞群。
图39：使用表达JAG1的基质细胞的ATO系统中由hEMP的成熟T细胞产生。
图40：由hEMP在ATO系统中产生的T细胞显示出多样化TCR Vb库。示出了对第5周时由hEMP在ATO中产生的T细胞(CD8SP)的TCR Vb家族使用的流式细胞术分析。结果与胸腺细胞中的TCR Vb家族使用进行比较。
图41A至41B：hESC来源T细胞表现出响应于抗CD3/CD28和IL2的增殖和CD25上调。在体外功能性测试由hESC在ATO中产生的CD8SPT细胞(第5周)。(a)将分离的细胞用CTV(细胞示踪剂Violet(Cell tracker Violet))染色并与CD3/CD28活化珠孵育5天。细胞进行多次细胞分裂，如CTV的稀释以及CD25的活化和表达所示的。(b)将分离的细胞用PMA/离子霉素处理6小时，并且细胞内染色显示细胞毒性细胞因子(IFNg、IL2、TNFa)的产生。
图42：在ATO系统中由hESC产生经改造T细胞的方案。用表达GFP的opt1 G4载体(NY-ESO TCR)转导H1hESC。H1NY-ESO TCR hESC系通过分离GFP+细胞并对其进行扩增来产生。然后，对细胞进行与上述相同的方案以诱导T细胞分化。
图43A至43B：经NY-ESO TCR改造T细胞的表征。示出了来自(a)第3周和(b)第5周的FACS数据。示出了来自未经转导hESC(H1)和经TCR转导hESC的数据。通过GFP的表达以及T细胞分化的四聚体和标志物表达(DP、CD3+/TCR+CD8SP)来鉴定由hESC在ATO中产生的经改造T细胞。
图44A至44B：发现，(a)经改造hESC来源CD8SP T细胞显示出成熟初始表型，并且(b)成熟标志物在经改造ES来源T细胞中表达。
图45显示，分离的NY-ESO TCR CD8SP细胞在ATO后5天CD3/28或aAPC刺激后经历活化(第5周)。
图46显示，分离的NY-ESO TCR CD8SP细胞响应于刺激而产生细胞毒性细胞因子(IFNg、IL2、TNFa)。
图47示出了响应于人工抗原呈递细胞(K562)的经改造hESC来源(hEMP)T细胞的特异性活化。分析显示，响应于表达同源肽(NY-ESO)而非不相关肽(MART-1)的aAPC产生细胞毒性细胞因子(IFNg、IL2、TNFa)和脱颗粒(CD107a)。
图48显示，经TCR转导ES来源T细胞响应于抗CD3/CD28显示出稳健扩增。
图49示出了与标准(完全)B27(Comp)相比使用单一组分(胰岛素、Vit A、抗氧化剂(AO))缺陷或不含异源生物质(无异源)的不同B27补充剂形式的数据。用CD34+CD3-脐带血HSPC起始ATO培养并在6周时进行分析。示出了总细胞数目和为CD5+CD7+T细胞前体的培养物的百分比。
图50示出了与完全B27(Comp)相比使用单一组分(胰岛素、Vit A、抗氧化剂(AO))缺陷或不含异源生物质(无异源)的不同B27补充剂形式的数据。数据显示，胰岛素对于T细胞定型是必不可少的，并且维生素A和抗氧化剂有利于细胞输出。
图51示出了在以下实验中使用的第二代CD19靶向CAR的设计。
图52示出了经CAR转导CB ATO的FACS分析，其显示ATO中的CAR表达(即GFP+)在很大程度上局限于是CD3-TCRab-和CD3-TCRgd-的T谱系细胞(CD5+和CD7+)。
图53示出了经CAR转导CB ATO的FACS分析，其显示ATO来源CAR-T细胞展现出非常规的T细胞分化，即CD5+CD7+CD3-TCRab-CD4-CD8-。示出了模拟转导ATO用于比较。
图54显示，CB ATO来源CAR-T细胞展现出天然T细胞表型(CD45RA+)并且在表型上是成熟的(CD27+CCR7+)。
图55显示，CB ATO来源CAR-T细胞表达CD2和细胞内CD3e。
图56A至56B：ATO来源CB CAR-T细胞是CD4-CD8-(DN)或表达CD8αα同二聚体(a)并表达与IEL(和NK细胞)相关的CD56和CD16(b)。
图57示出了ATO中CAR-T细胞激动剂选择的假设模型。
图58示出了通过TCR共转导的CB ATO CAR-T细胞中CD3/TCR复合物表达(而不是CD4或CD8表达)的恢复。
图59示出了CB ATO来源CAR+TCR+T细胞中的功能性TCR重建。ATO来源的CAR-T细胞。
图60示出了对CB ATO来源CD19 CAR-T细胞的功能分析。响应于CD19+细胞(用CD19载体转导的K562、Nalm6和Raji细胞)的CAR-T细胞的细胞因子释放和活化(在没有另外活化/共刺激的情况下进行分析)。
图61示出了对CB ATO来源CAR-T细胞的细胞毒性测定。CD19+靶标是Nalm6，并且CD19-对照是K562(未经转导)。
图62显示，在CB-ATO中，在CAR构建体的不同共活化和scFv结构域之间观察到IEL样CD8aa CAR-T细胞的产生(推测通过激动剂选择)。
图63显示，经CAR转导人ES细胞可以在ATO中产生CAR-T细胞。细胞对CD45+设门。示出了对来自由未经转导H1 hESC或经CAR转导hESC产生的hEMP的ATO的在第1至4周的分析。
图64显示，来自人ES细胞的ATO来源CAR-T细胞表现出非常规的T细胞分化。细胞对CD45+设门。示出了对来自由未经转导H1hESC或经CAR转导hESC产生的hEMP的ATO的在第1至4周的分析。
图65显示，来自人ES细胞的ATO来源CAR-T细胞不表达CD8β。示出了在所示时间点来自两个实验(657和659)的数据。细胞由由未经转导H1hESC或经CAR转导hESC产生的hEMP产生并且对CD45+设门。
图66A至66B显示，来自人ES细胞的ATO来源CAR-T细胞响应于PMA/离子霉素而产生细胞因子。活化通过对干扰素γ和TNFα((a)中)以及干扰素γ和IL-2((b)中)的细胞内染色显示。数据来自第5周的ATO。
图67显示，来自人ES细胞的ATO来源CAR-T细胞响应于CD19+靶细胞(Cd19+K562、Nalm6、RAJI细胞)而不是亲本(Cd19-)K562细胞产生细胞因子并脱颗粒。数据来自第5周的hESC-ATO，并且细胞对CD7+CD45RA+设门。
图68显示，ATO系统(MS5-DLL1)和单层系统(OP9-DLL1)二者都允许CD34+T细胞祖细胞的维持和定型于CD5+CD7+T细胞前体。示出了来源于三个不同CB样品(E37、E43、E68)的如所示设门的第4周CB-ATO。
图69显示，ATO和OP9-DLL1系统二者都允许细胞定型于T细胞谱系，如CD5和CD7的表达所示的。然而，ATO系统在CD4+CD8+双阳性细胞(DP)的产生方面高度优越。示出了来源于三个不同CB样品(E37、E43、E68)的如所示设门的第4周CB-ATO。
图70示出了稳健TCRab+CD3+细胞群的稳健产生，所述细胞在CB-ATO系统中是DP和CD8SP，而在OP9-DLL1单层系统中则不是。示出了来源于三个不同CB样品(E37、E43、E68)的如所示设门的第4周CB-ATO。
图71示出了图70中提供的数据的数值表示。
具体实施方式
1.引言
描述了用于产生相对于接受者患者为同种异体之非同种异体反应性T细胞的组合物和方法。这是本领域的重大改进，其提供了更具成本效益的、劳动较不密集的治疗和在不可能进行自体T细胞治疗的个体中的免疫治疗。此外，提供了用于产生经改造T细胞的新组合物和方法。这些组合物和方法已部分地基于包含人工胸腺类器官(artificial thymicorganoid，ATO)3D培养物的细胞培养组合物的发现来提供，其使用高度标准化的无血清组分和基质细胞系以有利于由人HSPC进行稳健且高度可重现的T细胞分化。在某些实施方案中，发现ATO中的T细胞分化密切模拟内源性胸腺生成，并且与单层共培养物相反，其支持具有多样化TCR库和抗原初始表型的功能性CD3+TCRαβ+CD8+和CD4+T细胞的有效正选择。
作为一个非限制性实例，细胞培养组合物可以至少用于产生由HSPC来源的初始的等位基因排斥的经TCR改造抗原特异性T细胞，所述HSPC经对抗原例如NY-ESO-1癌症相关抗原具有特异性的TCR转导。
在另一个实施方案中，这种转基因TCR系统证明，ATO中的正选择由自体造血细胞上的自身MHC驱动，但是也可以通过自身MHC的基质细胞表达来操作以建模或增强体外正筛选。
因此，3D细胞培养组合物例如ATO提供了一种简单的、现成的且高度标准化的端对端T细胞发育模型，并有可能发展涉及造血、免疫再生\宿主免疫和细胞免疫治疗的宽范围研究。
本文所述的方法和组合物代表显著的技术进步。人工胸腺类器官实施方案相对于来自HSPC的先前T细胞分化方法提供数个优点。益处包括但不限于以下一个或更多个：
·ATO由造血干细胞和祖细胞(HSPC)产生所有T细胞分化阶段，包括并且最重要的是成熟初始T细胞(CD4SP和CD8SP二者)
·在ATO中由HSPC产生成熟T细胞的能力允许通过在HSPC中表达基因(例如TCR或CAR)来修饰ATO系统以产生经改造T细胞
·ATO系统也可以通过在基质隔室(MS5)中表达基因进行修饰
·ATO培养物可以是无血清的，并且因此不具有胎牛血清(FCS)的批次间变化的限制或含FCS培养基的临床转换问题。
与人HSPC的体外T细胞分化的其他模型的比较说明了其差异并且证明了本文提供的方法和细胞的益处。例如，自2005年左右以来，OP9-DL1系统一直被认为是由人HSPC进行T细胞分化的金标准。该系统(由JuanCarlos Zuniga-Pflucker，Toronto，Canada的实验室开发)使用来自鼠基质细胞系(OP9)的单层，其经notch配体δ样配体1(DLL1 aka DL1)转导以诱导由鼠HSPC(Schmitt等，Immunity，2002)或人HSPC(La Motte-Mohs，BLOOD 2005)的T细胞定型。将HSPC在含有胎牛血清和细胞因子的培养基中在OP9-DL1单层上共培养。该系统的一个变化方案使用DLL4代替DLL1(OP9-DLL4)；使用DLL4的结果与DLL1没有显著不同。
然而，OP9-DL1系统存在问题。例如，成熟T细胞的产生可以忽略不计。尽管OP9-DL1(或OP9-DLL4)单层可以诱导来自脐带血(CB)HSPC的T细胞定型的早期阶段(CD7+CD5+/-细胞)，但超过CD4+CD8+(DP)阶段之外的分化的效率极低，具有很少(如果存在的话)CD8+或CD4+单阳性(SP)成熟T细胞(参见LaMotte Mohs，BLOOD 2005)。来自La Motte Mohs，BLOOD2005的图4显示了这一点。来自Zuniga-Pflucker团队(Awong等，BMC Immunol 2011)的最近出版物示出了来自60至70天的OP9-DL1/CB HSPC培养物的数据，其具有至多约2％至4％的成熟CD8+细胞，即CD8+CD3+CD1a-CD27+细胞(在来自Awong的图1中，在8％的CD8+中，40％是CD3+CD27+)。
针对OP9-DL1模型发表的另一些领导团队来自比利时(不同地来自Vandekerckhove，Plum，Taghon的文章)。与Zuniga-Pflucker团队类似，比利时团队在使用CBHSPC时显示至多5％的CD3+TCRab+细胞和非常稀少(如果存在的话)的SP8和SP4(deSmedt等Haematologica，2011)。值得注意的是，在该闭队的另一篇文章中，由干用从人胸腺中分离的HSPC起始培养，观察到更高频率的成熟T细胞。在胸腺中，CD34+HSPC主要包含前T细胞，其已经暴露于T细胞分化的胸腺信号，并且因此被致敏以产生T细胞。参见图2A，VanCoppernolle等，2009(来源于胸腺的HSPC)。
作为OP9-DL1系统中成熟T细胞分化差的另一些证据，Awong等，2011中的表1显示了这样的培养物中的产量：由每个单CD34+CD38-CBHSPC，仅产生0.27至1.16个TCRab+CD3+细胞(n＝6)。相比之下，ATO系统每个CB HSPC可以产生1,000至2,000个TCRab+CD3+细胞(Seet等，2016)。
另一些证据表明OP9-DL1使用HSPC的其他(非CB)临床来源表现得甚至更差。几乎所有使用OP9-DL1的文章都使用CB HSPC，因为与CB相比，其他来源(即骨髓、BM或动员的外周血(MPB))的效率甚至更低并且不可靠。
Plum团队直接在OP9-DL1基质上将CB与BM HSPC进行比较(DeSmedt等Hematologica 2011)。他们在其论文的图2中显示，与CB相比，BM HSPC起始的培养物具有约10％DP和TCRab+CD3+细胞的频率(分别来自BM相对于CB的1％至2％相对于12％DP和0.7％相对于5％CD3+TCRab+)。
相比之下，ATO系统是由所有HSPC来源(BM、MPB、静息PB、胸腺、CB)进行分化的高效方法(参见Seet等，2016)。
此外，OP9-DL1在无血清培养基中不存活。发明人已经不能在3D聚集体和RB27培养基中使用OP9DL-1由MS5-DL1重现ATO发现。显示，OP9-DL1不能在无血清条件下存活。
先前开发的胎儿胸腺器官培养物(Fetal Thymic Organ Culture，FTOC)是由人胎儿胸腺的完整片段组成的3D培养物，所述片段接种有人HSPC并使用空气流体界面在含有胎牛血清的培养基中培养。由于人胸腺上皮细胞(TEC)提供notch配体，因此不需要转导。关于FTOC系统的大多数文章都将这用于鼠T细胞分化(Anderson等，Annu Rev Immunol.1996)。
此外，由于保留在完整胸腺片段中的同种异体人T细胞的存在，FTOC不适用于临床转换；此外，该测定显示出很大的实验变化性和定量困难。人胎儿组织的有限可用性完全排除了临床转换，并且甚至使得FTOC的实验性使用非常困难。由于上述限制，FTOC已被OP9-DL1或OP9-DLL4替代。
出生后胸腺类器官由Crooks团队开发以研究胸腺微环境(Chung等，Stem Cells2014)。其由由单独地作为单层培养10至21天并随后与脐带血HSPC一起离心以形成3D聚集体的人TEC和来源于出生后胸腺的胸腺间充质形成的3D培养物组成。该模型在概念上与ATO类似，不同之处是：1.原代胸腺组织的使用；2.对血清的需求；3.依赖于来自TEC的内源性notch配体表达而不是通过转导。然而，出生后胸腺类器官存在以下问题：原代人胸腺组织由于其从心脏手术患者获取而非常难以获得并且因此很少使用且仅可从有限数目的机构获得。此外，胸腺基质的质量和数量高度可变，并且因此T细胞分化不一致且产率较差。由于胸腺组织与CB HSPC是同种异体的，该模型产生免疫学挑战。由于所有这些原因，该模型对于临床使用是不可行的，并且在定量和可重现性方面对于实验性使用存在问题。由于下文更详细讨论的原因，所提供的方法和组合物相对于先前开发的方法具有优点。
II.定义
术语“外源性TCR”是指在体外转移(即通过基因转移/转导/转染技术)到细胞中的TCR基因或TCR基因衍生物。将外源性TCR基因插入到接受者细胞的基因组中。在一些实施方案中，插入是随机插入。通过本领域已知的方法可容易实现TCR基因的随机插入。在一些实施方案中，将TCR基因插入到内源基因座(例如内源TCR基因基因座)。在一些实施方案中，细胞包含插入在非内源基因座的基因座的一个或更多个TCR基因。在一些实施方案中，细胞还包含异源序列，例如标志物或抗性基因。
术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指将任意特异性接枝到免疫效应细胞的经改造受体。这些受体用于将单克隆抗体的特异性接枝到T细胞；其中其编码序列的转移通过逆转录病毒或慢病毒载体促进。受体被称为嵌合体，因为其由来自不同来源的部分构成。这些分子的最常见形式是与CD3-ζ跨膜和内结构域、CD28或41BB细胞内结构域、或其组合融合的来源于单克隆抗体的单链可变片段(scFv)的融合体。这样的分子使得响应于scFv识别其靶标而传递信号。这样的构建体的一个实例是14g2a-ζ，其是来源于杂交瘤14g2a(其识别双唾液酸神经节苷脂GD2)的scFv的融合体。当T细胞表达该分子(通常通过致癌逆转录病毒载体转导实现)时，其识别并杀伤表达GD2的靶细胞(例如成神经细胞瘤细胞)。为了靶向恶性B细胞，研究人员使用对B谱系分子CD19具有特异性的嵌合免疫受体重定向T细胞的特异性。免疫球蛋白重链和轻链的可变部分通过柔性接头融合以形成scFv。在该scFv之前是信号肽以将新生蛋白引导至内质网并随后表面表达(这被切割)。柔性间隔区允许scFv在不同的方向上取向以实现抗原结合。跨膜结构域是典型的疏水性α螺旋，其通常来源于突出到细胞并传递期望信号的信号转导内结构域的原始分子。
术语“抗原”是指以下任何物质，其促使免疫系统产生针对其的抗体，或T细胞对其作出响应。在一些实施方案中，抗原是长度为5至50个氨基酸或具有至少、至多或精确地以下氨基酸的肽：5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、250或300个氨基酸，或可从其中来源的任何范围。
术语“相对于接受者是同种异体的”旨在是指不是从接受者分离的细胞。在一些实施方案中，细胞不是从患者分离的。在一些实施方案中，细胞不是从遗传匹配的个体(例如具有相容性基因型的亲属)分离的。
术语“惰性的”是指不会导致不期望临床毒性的一种。这可以是靶标毒性或脱靶毒性。“惰性”可以基于已知或预测的临床安全性数据。
当涉及培养基、细胞外基质或培养条件使用时，术语“无异源(XF)”或“无动物组分(ACF)”或“无动物”是指培养基、细胞外基质或培养条件基本上不含异源动物来源组分。对于培养人细胞，非人动物例如小鼠的任何蛋白质将是异源组分。在某些方面，无异源基质可以基本上不含任何非人动物来源组分，因此排除小鼠饲养细胞或MatrigelTM。MatrigelTM是从Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤提取的溶解的基底膜制备物，所述肉瘤是富含细胞外基质蛋白包括层黏连蛋白(主要组分)、IV胶原、硫酸肝素蛋白聚糖和触觉蛋白(entactin)/巢蛋白(nidogen)的肿瘤。
当涉及培养基、细胞外基质或培养条件使用时，术语“确定的”是指其中几乎所有组分的性质和量都已知的培养基、细胞外基质或培养条件。
“化学成分确定的培养基”是指其中几乎所有成分的化学性质及其量都已知的培养基。这些培养基也被称为合成培养基。化学成分确定培养基的一些实例包括TeSRTM。
如本文所用，当细胞具有少于10％的成分时，细胞“大体上不含”某些试剂或成分，例如血清、信号转导抑制剂、动物组分或饲养细胞、外源遗传元件或载体元件，并且当细胞具有少于1％成分时，其“基本上不含”某些试剂或成分。然而，甚至更期望的是其中总细胞群中的少于0.5％或少于0.1％包含外源遗传元件或载体元件的细胞群。
当使用本领域普通技术人员已知的常规检测方法的培养物、基质或培养基分别具有低于可检测水平的试剂水平或未向培养物、基质或培养基外在添加这些试剂时，培养物、基质或培养基“基本上不含”某些试剂或成分，例如血清、信号转导抑制剂、动物组分或饲养细胞。无血清培养基可以基本上不含血清。
“外周血细胞”是指血液的细胞组分，包括红细胞、白细胞和血小板，其见于血液的循环库中。
“造血干细胞和祖细胞”或“造血前体细胞”是指定型于造血谱系但能够进一步造血分化的细胞并且包括造血干细胞、多能造血干细胞(成血细胞)、骨髓祖细胞、巨核细胞祖细胞、红细胞祖细胞和淋巴祖细胞。“造血干细胞(HSC)”是产生所有血细胞类型的多能干细胞，所述血细胞类型包括骨髓谱系(单核细胞和巨噬细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突细胞)和淋巴样谱系(T细胞、B细胞、NK细胞)。
造血干细胞和祖细胞可以或可以不表达CD34。造血干细胞可以共表达CD133，并且对CD38表达呈阴性、对CD90呈阳性、对CD45RA呈阴性、对谱系标志物呈阴性、或其组合。造血祖细胞/前体细胞包括CD34(+)/CD38(+)细胞和CD34(+)/CD45RA(+)/lin(-)CD10+(常见的淋巴样祖细胞)、CD34(+)CD45RA(+)lin(-)CD10(-)CD62L(hi)(淋巴样致敏多能祖细胞)、CD34(+)CD45RA(+)lin(-)CD10(-)CD123+(粒细胞-单核细胞祖细胞)、CD34(+)CD45RA(-)lin(-)CD10(-)CD123+(常见的骨髓祖细胞)或CD34(+)CD45RA(-)lin(-)CD10(-)CD123-(巨核细胞-红细胞祖细胞)。
“载体”或“构建体”(有时称为基因递送或基因转移“载剂”)是指包含待体外或体内递送至宿主细胞的多核苷酸的大分子、分子复合物或病毒颗粒。多核苷酸可以是线性或环状分子。
“质粒”(一种常见类型的载体)是与染色体DNA分离的染色体外DNA分子，其能够独立于染色体DNA进行复制。在某些情况下，其是环状和双链的。
“表达构建体”或“表达盒”意指能够指导转录的核酸分子。表达构建体至少包含启动子或在功能上等同于启动子的结构。还可以包含另外的元件，例如增强子和/或转录终止信号。
术语“外源的”当涉及细胞或生物体中的蛋白质、基因、核酸或多核苷酸使用时是指已通过人工手段引入细胞或生物体中的蛋白质、基因、核酸或多核苷酸，或在涉及细胞时是指分离的并随后通过人工手段引入其他细胞或生物体的细胞。外源核酸可以来自不同的生物体或细胞，或者其可以是在生物体或细胞内天然存在的核酸的一个或更多个另外的拷贝。外源细胞可以来自不同的生物体，或者其可以来自相同生物体。作为非限制性实例，外源核酸位于与天然细胞的染色体位置不同的染色体位置，或者在其他情况下以不同于自然界中发现的核酸序列的核酸序列为侧翼。
术语“与...对应”在本文中用于意指多核苷酸序列与参考多核苷酸序列的全部或一部分同源(即相同，不严格地在进化上相关)，或者多肽序列与参考多肽序列相同。相比之下，术语“与....互补”在本文中用于意指互补序列与参考多核苷酸序列的全部或一部分同源。为了举例说明，核苷酸序列“TATAC”与参考序列“TATAC”对应并且与参考序列“GTATA”互补。
“编码”特定蛋白质的“基因”、“多核苷酸”、“编码区”、“序列”、“区段”、“片段”或“转基因”是当置于合适调控序列的控制下时在体外或体内被转录并且任选地还被翻译成基因产物例如多肽的核酸分子。编码区可以以cDNA、基因组DNA或RNA形式存在。当以DNA形式存在时，核酸分子可以是单链的(即有义链)或双链的。编码区的边界由5′(氨基)末端的起始密码子和3′(羧基)末端的翻译终止密码子决定。基因可以包括但不限于来自原核或真核mRNA的cDNA、来自原核或真核DNA的基因组DNA序列，和合成DNA序列。转录终止序列将通常位于基因序列的3′。
术语“细胞”在本文中以其在本领域中的最广泛含义使用，并且是指以下活体，其是多细胞生物体的组织的结构单元，被将其与外部隔离的膜结构包围，具有自我复制的能力，并且具有遗传信息和表达其的机制。本文使用的细胞可以是天然存在的细胞或人工修饰的细胞(例如融合细胞、经遗传修饰细胞等)。
如本文所用，术语“干细胞”是指能够自我复制并且具有多能性或多潜能性的细胞。通常来说，干细胞可以使受伤组织再生。本文中的干细胞可以是但不限于胚胎干(ES)细胞、诱导多能干细胞或组织干细胞(也称为组织特异性干细胞或体干细胞)。
“胚胎干(ES)细胞”是来源于早期胚胎的多能干细胞。ES细胞最初于1981年建立，其自1989年以来也应用于敲除小鼠的产生。在1998年，建立了人ES细胞，其目前正变得可用于再生医学。
与ES细胞不同，组织干细胞具有有限的分化潜能。组织干细胞存在于组织中的特定位置并且具有未分化的细胞内结构。因此，组织干细胞的多能性通常较低。组织干细胞具有较高的核/质比并具有较少的细胞内细胞器。大多数组织干细胞具有低多能性、长细胞周期和超过个体寿命的增殖能力。基于细胞来源于的部位例如皮肤系统、消化系统、骨髓系统、神经系统等，将组织干细胞分成几类。皮肤系统中的组织干细胞包括表皮干细胞、毛囊干细胞等。消化系统中的组织干细胞包括胰腺(常见)干细胞、肝干细胞等。骨髓系统中的组织干细胞包括造血干细胞、间充质干细胞等。神经系统中的组织干细胞包括神经干细胞、视网膜干细胞等。
“诱导多能干细胞”(通常缩写为iPS细胞或iPSC)是指通过引入某些称为重编程因子的因子由非多能细胞(通常体细胞)或终末分化细胞(例如成纤维细胞、造血细胞、肌细胞、神经元、表皮细胞等)人工制备的多能干细胞类型。
“多能性”是指具有分化成构成一个或更多个组织或器官或者特别地三个胚层中任一个的所有细胞的潜能的干细胞：内胚层(内胃衬、胃肠道、肺)、中胚层(肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖器)或外胚层(表皮组织和神经系统)。本文使用的“多能干细胞”是指可以分化成来源于三个胚层中的任一个的细胞的细胞，例如全能细胞或诱导多能细胞的直接后代。
关于核酸分子的“可操作连接”意指两个或更多个核酸分子(例如待转录的核酸分子、启动子和增强子元件)以该方式连接以允许核酸分子的转录。关于肽和/或多肽分子的“可操作连接”意指两个或更多个肽和/或多肽分子以该方式连接以产生具有融合体的每个肽和/或多肽组分的至少一种特性的单多肽链，即融合多肽。融合多肽特别地是嵌合的，即由异源分子构成。
III.T细胞受体(TCR)和用于产生外源性TCR的方法
T细胞受体或TCR是在T淋巴细胞(T细胞)的表面上发现的分子，其负责识别为与主要组织相容性复合体(MHC)分子结合的肽的抗原片段。TCR由两条不同的蛋白质链构成(即其是异二聚体)。在人中的95％T细胞中，TCR由α链(α，本文也称为“a”)和β(β，在本文中也称为“b”)链组成，而在5％的T细胞中，TCR由γ和δ(γ/δ)链组成。该比例在个体发育和在疾病状态以及在不同物种中改变。
当TCR与抗原性肽和MHC(肽/MHC)接合时，T淋巴细胞通过信号转导被活化，即由相关酶、共受体、特化衔接子分子和活化或释放的转录因子介导的一系列生物化学事件。TCR是二硫键连接的膜锚定异二聚体蛋白，其通常由作为与不变CD3链分子的复合物的一部分表达的高度可变α(α)和β(β)链组成。表达该受体的T细胞被称为α：β(或αβ或ab)T细胞，但是少数T细胞表达由可变γ链(γ，在本文中也称为“g”)和δ链(δ，在本文中也称为“d”)形成的替选受体，称为γδ(或gd)T细胞。
每条链由两个胞外结构域构成：可变(V)区和恒定(C)区，二者都是形成反平行β-折叠的免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域。恒定区靠近细胞膜，接着是跨膜区和短的胞质尾，而可变区与肽/MHC复合物结合。
TCR α链和β链二者的可变结构域各自具有三个高变区或互补性决定区(CDR)，而β链的可变区具有另外的高变区(HV4)，其通常不接触抗原，并且因此不被认为是CDR。
残基位于TCR的两个区域：在α链和β链的界面以及在被认为靠近CD3信号转导复合物的β链构架区中。CDR3是负责识别经加工抗原的主要CDR，但是α链的CDR1也已显示与抗原性肽的N端部分相互作用，而β链的CDR1与肽的C端部分相互作用。CDR2被认为识别MHC。β链的CDR4不被认为参与抗原识别，但已显示与超抗原相互作用。TCR结构域的恒定结构域由短的连接序列组成，其中半胱氨酸残基形成二硫键，其形成两条链之间的连接。
TCR是IgSF蛋白的成员意指其可以与抗体和BCR相比较。就相似性而言，TCR类似于具有重链和轻链的抗体的一半，不同之处在于重链不具有其可结晶部分(Fc)(注意：在个体发育方面TCRα经历VJ重组，因此其类似于轻链；TCRβ经历VDJ重组，因此其类似于重链)。因此TCR在本体发育方面类似于抗体的抗体结合片段之一。TCR的两个亚基扭在一起。鉴于抗体使用其Fc区与天然白细胞上的Fc受体结合，TCR已经停靠在细胞膜上。然而，由于其细胞质尾短，其不能够介导信号转导本身，因此TCR仍然需要CD3和ζ来在其位置进行信号转导，如同抗体需要与FcR结合以启动信号转导。以这样的方式，T细胞的MHC-TCR-CD3相互作用在功能上类似于髓样白细胞的Ag-Ig-FcR相互作用和B细胞的Ag-Ig-CD79相互作用。
产生抗原特异性TCR的方法是本领域已知的。方法可以包括例如：1)合成来源于目的蛋白(例如肿瘤抗原、来自测序数据的新抗原等)的已知或预测的HLA限制性肽表位；2)通过抗原呈递细胞(用于扩增)或四聚体(用于直接分选)将这些呈递给从中提取TCR序列的T细胞库(例如在肿瘤ag特异性T细胞的情况下，肿瘤浸润淋巴细胞)；3)选择或筛选抗原特异性T细胞(例如基于四聚体结合的FACS分选抗原特异性T细胞)；4)克隆(通过RT-PCR)和对TCR基因(即TCR的α和β链或γ和δ链)进行测序；克隆和测序可以在群体或单细胞水平进行；和5)通过例如通过用这些序列转导外周血T细胞并评估其对表达同源肽-MHC复合物的靶细胞的反应性测试TCR克隆的功能来确定和分析TCR特异性。反应性通常基于细胞因子产生(例如干扰素γ)来测量。
IV.细胞培养组合物和方法
3D培养组合物例如人工胸腺类器官(ATO)是用于由干细胞体外产生人T细胞的经优化、高效且高度可重现的现成解决方案。与用于T细胞分化的现有实验模型相比，3D培养组合物的某些方面使用无血清条件，避免使用人胸腺组织或专有支架材料，并且有利于来自干细胞的完全功能性成熟人T细胞的正选择和稳健产生。作为体外T细胞发育的潜在商业化平台，与竞争性技术相比，3D培养组合物提供了效率、可重复性、可扩展性以及降低的成本和劳动力。非限制性商业化应用可以包括人T细胞发育的体外实验建模和由多种干细胞来源体外产生经改造T细胞免疫治疗。
在某些实施方案中，可以提供用于由人干细胞和/或祖细胞(HSPC)体外产生功能性T细胞的经优化三维(3D)培养系统。所产生的细胞3D结构可以被称为人工胸腺类器官(ATO)。
在一些具体实施方案中，该系统可以包括在存在包含FLT3配体(FLT3L)、白介素7(IL-7)、B27和抗坏血酸的经优化培养基的情况下使人HSPC与表达Notch配体的基质细胞以3D结构聚集。也可以存在允许在气-液界面培养的条件。已经确定，与造血细胞与基质细胞之间的3D细胞-细胞相互作用一起的来自可溶性因子(细胞因子、抗坏血酸、B27组分和基质细胞衍生因子)的ATO内的组合信号转导有利于人T谱系定型、正选择和有效分化为功能性成熟T细胞。
在一些具体实施方案中，可以提供3D培养组合物的方法(例如ATO生产)，如所开发的，其涉及使经人DLL1转导的MS-5鼠基质细胞系(下文称为MS5-hDLL1)与从人脐带血、骨髓或G-CSF动员的外周血中分离CD34+HSPC聚集。将多至1×106个HSPC与MS5-hDLL1细胞以经优化的比例混合(通常为1∶10的HSPC：基质细胞)。
例如，聚集通过将混合的细胞悬液离心(“压实聚集”)，然后抽吸无细胞上清液来实现。在一些具体实施方案中，然后，可以将细胞沉淀物作为浆液抽吸在5至10ul的分化培养基中并作为液滴转移到0.4um尼龙transwell培养插入物上，所述插入物漂浮在分化培养基的孔中，允许插入物的底部与培养基接触，并且顶部与空气接触。
例如，分化培养基由RPMI-1640，5ng/ml人FLT3L、5ng/ml人IL-7、4％无血清B27补充剂和30μM L-抗坏血酸构成。从培养插入物周围可以每3至4天完全更换培养基。在培养的前两周期间，细胞聚集体可以自组织为ATO，并发生早期T细胞谱系定型和分化。在某些方面，ATO培养至少6周以允许最佳的T细胞分化。通过吸移使ATO聚来实现从ATO回收造血细胞。
方案的变化允许使用对效力具有不同影响的替代组分，具体地：
基础培养基RPMI可以替换成数种可商购获得的替代品(例如IMDM)。
所使用的基质细胞系是先前描述的鼠骨髓细胞系MS-5(Itoh等，1989)，然而MS-5可以替换成类似的鼠基质细胞系(例如OP9、S17)，人基质细胞系(例如HS-5、HS-27a)、原代人基质细胞或人多能干细胞来源的基质细胞。
基质细胞系用编码人DLLl cDNA的慢病毒转导；然而，基因递送的方法以及Notch配体基因可以变化。替选的Notch配体基因包括DLL4、JAG1、JAG2等。Notch配体还包括在美国专利7795404和8377886中描述的那些，其通过引用并入本文。Notch配体还包括δ1、3和4以及Jagged1、2。
HSPC的类型和来源可以包括骨髓、脐带血、外周血、胸腺或其他主要来源；或来源于人胚胎干细胞(ESC)或诱导多能干细胞(iPSC)的HPSC。
细胞因子条件可以变化：例如，可以改变FLT3L和IL-7的水平以改变T细胞分化动力学；可以添加其他造血细胞因子如干细胞因子(SCF/KIT配体)、促血小板生成素(TPO)、IL-2、IL-15。
也可以向某些组分引入遗传修饰以产生抗原特异性T细胞，以及对正选择和负选择进行建模。这些修饰的一些实例包括：用编码抗原特异性T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的慢病毒载体转导HSPC以产生抗原特异性的等位基因排斥的初始T细胞；用基因转导HSPC以指导谱系定型于特化的淋巴样细胞。例如，用不变天然杀伤T细胞(iNKT)相关的TCR转导HSPC以在ATO中产生功能性iNKT细胞；用人MHC基因转导ATO基质细胞系(例如MS5-hDLL1)以增强ATO中经TCR改造或未经改造T细胞的正选择和成熟；和/或用抗原加共刺激分子或细胞因子转导ATO基质细胞系以增强ATO中CAR T细胞的正选择。
V.细胞培养条件
可以提供细胞培养条件用于本文所述的3D细胞聚集体的培养以及用于T细胞的产生和/或其正/负选择。在某些方面，选定群体的起始细胞可以包含至少或约104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013个细胞，或可从其中来源的任何范围。起始细胞群的接种密度可以为至少或约10、101、102、103、104、105、106、107、108个细胞/ml，或可从其中来源的任何范围。
B.培养容器
用于培养3D细胞聚集体或其子代细胞的培养容器可以包括但特别地不限于：瓶、用于组织培养的瓶、皿、培养皿、用于组织培养的皿、多皿、微板、微孔板、多板、多孔板、微载片、室载片、管、托盘、室、培养袋和滚瓶，只要其能够在其中培养干细胞即可。干细胞可以以以下体积培养：至少或约0.2、0.5、1、2、5、10、20、30、40、50ml、100ml、150ml、200ml、250ml、300ml、350ml、400ml、450ml、500ml、550ml、600ml、800ml、1000ml、1500ml，或可从其中来源的任何范围，这取决于培养的需求。在某个实施方案中，培养容器可以是生物反应器，其可以是指支持生物活性环境的任何装置或系统。生物反应器的体积可以为至少或约2、4、5、6、8、10、15、20、25、50、75、100、150、200、500升，1、2、4、6、8、10、15立方米，或可从其中来源的任何范围。
培养容器可以具有细胞黏附性或不具有细胞黏附性，并且根据目的进行选择。细胞黏附性培养容器可以涂覆有任何用于细胞黏附的物质，例如细胞外基质(ECM)以改善血管表面与细胞的黏附性。用于细胞黏附的底物可以是意图用于附着干细胞或饲养细胞(如果使用的话)的任何材料。用于细胞黏附的底物包括胶原、明胶、多聚-L-赖氨酸、多聚-D-赖氨酸、层黏连蛋白和纤连蛋白及其混合物，例如MatrigelTM，以及裂解的细胞膜制备物。
C.基质组分
多种确定的基质组分可以用于培养方法或组合物中。例如，可以使用组合的重组胶原IV、纤连蛋白、层黏连蛋白和玻连蛋白来涂覆培养表面，作为向多能细胞生长提供固体支持物的一种手段，如Ludwig等(2006a；2006b)所述的，其通过引用整体并入。
基质组合物可以固定在表面上以提供对细胞的支持。基质组合物可以包含一种或更多种细胞外基质(ECM)蛋白和水性溶剂。术语“细胞外基质”在本领域中是公认的。其组分包括一种或更多种以下蛋白质：纤连蛋白、层黏连蛋白、玻连蛋白、腱生蛋白、触觉蛋白、血小板反应蛋白、弹性蛋白、明胶、胶原、原纤蛋白、分区蛋白、锚定蛋白、软骨黏连蛋白、连接蛋白、骨涎蛋白、骨钙蛋白、骨桥蛋白、epinectin、透明质黏连蛋白(hyaluronectin)、波动蛋白(undulin)、表皮整联配体蛋白和缰蛋白(kalinin)。另一些细胞外基质蛋白描述于Kleinman等，(1993)中，其通过引用并入本文。预期，术语“细胞外基质”涵盖将来可能发现的目前未知的细胞外基质，因为其作为细胞外基质的表征将容易地由本领域技术人员确定。
在一些方面，基质组合物中的总蛋白质浓度可以为约1ng/mL至约1mg/mL。在一些实施方案中，基质组合物中的总蛋白质浓度为约1μg/mL至约300μg/mL。在一些更优选实施方案中，基质组合物中的总蛋白质浓度为约5μg/mL至约200μg/mL。
细胞外基质(ECM)蛋白可以是天然来源的并且从人组织或动物组织中纯化。或者，ECM蛋白可以是经遗传改造的重组蛋白或是天然合成的。ECM蛋白可以是完全蛋白或者是天然或经改造的肽片段的形式。可用于细胞培养的基质的ECM蛋白的一些实例包括层黏连蛋白、胶原I、胶原IV、纤连蛋白和玻连蛋白。在一些实施方案中，基质组合物包含合成产生的纤连蛋白肽片段或重组纤连蛋白。
在另一些实施方案中，基质组合物包含至少纤连蛋白和玻连蛋白的混合物。在另一些实施方案中，基质组合物优选地包含层黏连蛋白。
基质组合物优选地包含单一类型的细胞外基质蛋白。在一些实施方案中，基质组合物包含纤连蛋白，特别地用于培养祖细胞。例如，合适的基质组合物可以通过将人纤连蛋白、例如由Becton，Dickinson&Co.(Franklin Lakes，N.J.)(BD)销售的人纤连蛋白(Cat#354008)在Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中稀释至蛋白浓度为5μg/mL至约200μg/mL来制备。在一个具体实例中，基质组合物包含纤连蛋白片段，例如 是一种约63kDa的蛋白质(574个氨基酸)，其包含中心细胞结合结构域(III型重复，8、9、10)、高亲和力肝素结合结构域II(III型重复，12、13、14)和人纤连蛋白的选择性剪接IIICS区内的CS1位点。
在另一些实施方案中，基质组合物可以包含层黏连蛋白。例如，合适的基质组合物可以通过将层黏连蛋白(Sigma-Aldrich(St.Louis，Mo.)；Cat#L6274和L2020)在Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中稀释至蛋白浓度为5μg/ml至约200μg/m1来制备。
在一些实施方案中，基质组合物是无异源的，即基质或其组分蛋白仅仅是人来源的。这对某些研究应用可能是期望的。例如，在培养人细胞的无异源基质中，可以使用人来源的基质组分，其中可以排除任何非人动物组分。在某些方面，MatrigelTM可以作为底物从培养组合物中排除。MatrigelTM是由小鼠肿瘤细胞分泌的凝胶状蛋白质混合物，并且可从BDBiosciences(New Jersey，USA)商购获得。该混合物类似于见于许多组织中的复杂细胞外环境，并且经常被细胞生物学家用作细胞培养的底物，但是其可能引入不期望的异源抗原或污染物。
VI.可选择标志物或可筛选标志物
在某些实施方案中，包含外源核酸的细胞可以通过在表达载体或外源核酸中包含标志物而被体外或体内鉴定。这样的标志物会赋予细胞以可鉴定变化，从而允许容易地鉴定包含表达载体的细胞。通常，选择标志物可以是赋予允许选择的特性的标志物。正选择标志物可以是其中标志物的存在允许其选择的标志物，而负选择标志物是其中其存在阻止其选择的标志物。正选择标志物的一个实例是抗药性标志物。
通常药物选择标志物的包含有助于转化体的克隆和鉴定，例如赋予针对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、博来霉素(zeocin)和组氨醇的抗性的基因是有用的选择标志物。除赋予允许基于条件的实施来区分转化体的表型的标志物之外，其他类型的标志物也在考虑之内，包括可筛选标志物，例如GFP，其基于比色分析。或者，可以使用可筛选酶作为负选择标志物，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员也知道如何使用免疫学标志物，可以与FACS分析联合使用。所使用的标志物不被认为是重要的，只要其能够与编码基因产物的核酸同时表达即可。选择标志物和可筛选标志物的另一些实例对于本领域技术人员而言是公知的。
可选择标志物可以包括实验室微生物学、分子生物学和基因工程中使用的报道基因类型，以指示转染或旨在将外来DNA引入细胞中的其他操作的成功。可选择标志物常常是抗生素抗性基因；使已进行引入外来DNA的操作的细胞在包含抗生素的培养基上生长，并且可以生长的这些细胞已经成功地吸收并表达引入的遗传物质。可选择标志物的一些实例包括：来自Tn5的Abicr基因或Neo基因，其赋予针对遗传霉素的抗生素抗性。
可筛选标志物可以包括报道基因，其允许研究者区别期望的细胞与不期望的细胞。本发明的某些实施方案利用报道基因来指示特定细胞谱系。例如，报道基因可以位于表达元件内并且置于通常与心室或心房选择性基因的编码区相关的心室或心房选择性调控元件的控制下以同时表达。报道子允许分离特定谱系的细胞而不将其置于药物或其他选择性压力下或以其他方式危害细胞生存力。
这样的报道子的一些实例包括编码细胞表面蛋白(例如CD4、HA表位)、荧光蛋白、抗原决定簇和酶(例如β-半乳糖苷酶)的基因。包含载体的细胞可以通过例如FACS使用针对细胞表面蛋白的带荧光标签抗体或可以通过载体编码的酶转化为荧光产物的底物来分离。
在一些具体实施方案中，报道基因是荧光蛋白。已经开发了宽范围的荧光蛋白遗传变体，其特征在于横跨几乎整个可见光谱的荧光发射光谱分布(对于非限制性实例，参见表1)。在原始维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)水母绿色荧光蛋白中的诱变努力已经产生新的荧光探针，其范围从蓝色到黄色，并且是生物研究中最广泛使用的体内报道分子中的一些。已经从海葵、Discosoma striata和属于珊瑚动物纲(Anthozoa)类别的珊瑚礁开发了波长更长的荧光蛋白，其在橙色和红色光谱区域内发射。还开发了其他物种来产生具有青色、绿色、黄色、橙色和深红色荧光发射的类似蛋白。目前正在进行开发性研究努力以提高荧光蛋白的亮度和稳定性，由此提高其整体有用性。
表1荧光蛋白特性
VII.外源基因编辑
在某些实施方案中，经改造核酸酶可用于引入用于本文使用的任何细胞的遗传修饰的外源核酸序列，特别是培养方法或组合物中的起始细胞，如基质细胞或干细胞或祖细胞。
基因组编辑或利用经改造核酸酶的基因组编辑(genome editing withengineered nuclease，GEEN)是一种遗传改造，其中使用人工改造的核酸酶或“分子剪刀”在基因组中进行DNA的插入、替换或移除。核酸酶在基因组的期望位置产生特定的双链断裂(double-stranded break，DSB)，并通过同源重组(homologous recombination，HR)和非同源末端连接(NHEJ)的自然过程阻止修复诱导的断裂的细胞内源机制。
非限制性的经改造核酸酶包括：锌指核酸酶(Zinc finger nuclease，ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nuclease，TALEN)、CRISPR/Cas9系统和经改造的大范围核酸酶重组归巢内切核酸酶(engineeredmeganuclease re-engineered homing endonuclease)。本领域已知的任何经改造核酸酶均可用于方法和组合物的某些方面。
遗传分析中的一般实践是，为了理解基因的功能或蛋白质功能，以序列特异性方式干扰基因或蛋白质功能并监测其对生物体的影响。然而，在一些生物体中，难以或不可能进行位点特异性诱变，因此必须使用更多间接方法，例如通过短RNA干扰(siRNA)使目的基因沉默。然而，siRNA的基因破坏可能是可变的和不完整的。用诸如ZFN的核酸酶进行基因组编辑与siRNA不同，因为经改造核酸酶能够改变DNA结合特异性，因此原则上可以切割基因组中的任何靶位置，并且为通过常规RNAi不可能特异性靶向的基因的内源序列引入修饰。此外，ZFN和TALEN的特异性增强，因为在其靶标部分的识别中需要两个ZFN并随后指向相邻序列。
通常在微生物物种中发现的大范围核酸酶具有具非常长的识别序列(＞14bp)的独特性质，因此使它们天然地非常特异。这可以被利用来在基因组编辑中进行位点特异性DSB；然而，挑战是没有足够的大范围核酸酶被已知或可能曾经已知覆盖所有可能的靶序列。为了克服这一挑战，已经使用诱变和高通量筛选方法来产生识别独特序列的大范围核酸酶变体。另一些人已经能够融合多种大范围核酸酶并产生识别新序列的杂合酶。还有一些人试图在被称为合理设计的大范围核酸酶(rationally designed meganuclease)的方法中改变大范围核酸酶的DNA相互作用氨基酸以设计序列特异性大范围核酸酶(美国专利8,021，867B2，通过引用并入本文)。
与诸如ZFN的方法相比，大范围核酸酶具有在细胞中引起较小毒性的益处，可能是因为更严格的DNA序列识别；然而，构建用于所有可能序列的序列特异性酶是昂贵且耗时的，因为不能从诸如ZFN和TALEN的方法利用的组合可能性中受益。因此，具有优点和缺点二者。
与大范围核酸酶相反，ZFN和TALEN背后的概念更多地基于非特异性DNA切割酶，所述酶然后与特异性DNA序列识别肽如锌指和转录激活物样效应子(transcriptionactivator-like effector，TALE)连接。一种方法是找到DNA识别位点和切割位点彼此分离的内切核酸酶，这是限制性酶中不常见的情况。一旦发现这种酶，可以分离其切割部分，这将是非常非特异性的，因为其不具有识别能力。然后可以将该部分与序列识别肽连接，这将导致非常高的特异性。具有这种性质的限制酶的实例是FokI。另外，FokI的优点是需要二聚化来具有核酸酶活性，这意味着特异性显著提高，因为每个核酸酶配偶体识别独特的DNA序列。为了增强这种效应，FokI核酸酶已被改造仅作为异二聚体作用并且具有提高的催化活性。异二聚体功能性核酸酶将避免不需要的同二聚体活性的可能性，因此提高了DSB的特异性。
虽然ZFN和TALEN两者的核酸酶部分具有类似的性质，但这些经改造核酸酶之间的差异在于它们的DNA识别肽。ZFN依赖于Cys2-His2锌指，TALEN依赖于TALE。这两种DNA识别肽结构域的特征在于它们在其蛋白质中以组合天然发生。Cys2-His2锌指通常以相距3bp的重复存在，并且在多种核酸相互作用蛋白中如转录因子中以不同组合存在。另一方面，TALE以氨基酸和识别的核苷酸对之间一对一识别比的重复存在。由于锌指和TALE两者以重复模式存在，因此可尝试不同的组合来产生多种序列特异性。锌指在这些术语和方法中已经更加成熟，例如模块化组装(其中与三联体序列相关的锌指连接成一排以覆盖期望序列)、OPEN(肽结构域与三联体核苷酸的低严格性选择，然后是肽组合与细菌系统中的最终靶标的高严格性选择)以及锌指文库的细菌单杂交筛选等方法已用于制备位点特异性核酸酶。
VIII.外源基因递送
在某些实施方案中，可以构建载体以包含用于本文使用的任何细胞的遗传修饰的外源核酸序列，特别是培养方法或组合物中的起始细胞，如基质细胞或干细胞或祖细胞。下面公开了这些载体的组分和递送方法的细节。
A.载体
本领域技术人员将能够通过标准重组技术构建载体(参见例如Maniatis等，1988和Ausubel等，1994，两者均通过引用并入本文)。
载体还可以包含进一步调节基因递送和/或基因表达或者以其他方式为靶细胞提供有益特性的其他组分或功能性。这样的其他组分包括例如影响细胞的结合或靶向的组分(包括介导细胞型或组织特异性结合的组分)；影响细胞对载体核酸的摄取的组分；影响摄取后多核苷酸在细胞内的定位的组分(例如介导核定位的试剂)；以及影响多核苷酸表达的组分。
这样的组分还可以包括标志物，例如可用于检测或选择已摄取并表达由载体递送的核酸的细胞的可检测标志物和/或选择标志物。这些组分可以作为载体的天然特征提供(例如使用具有介导结合和摄取的组分或功能性的某些病毒载体)，或可以修饰载体以提供这样的功能性。大量这样的载体是本领域已知的并且通常是可用的。当载体保持在宿主细胞中时，载体可以在有丝分裂过程中作为自主结构稳定地复制、并入宿主细胞的基因组中，或保持在宿主细胞的细胞核或细胞质中。
B.调控元件
包含在载体中的真核表达盒特别含有(以5′至3′方向)与蛋白质编码序列可操作地连接的真核转录启动子、包含插入序列的剪接信号和转录终止/聚腺苷酸化序列。
i.启动子/增强子
“启动子”是控制序列，其是控制转录的起始和速率的核酸序列的区域。其可含有调节蛋白和分子(例如RNA聚合酶和其他转录因子)可结合的遗传元件，以启动核酸序列的特异性转录。短语“可操作地定位”，“可操作地连接”、“在控制下”和“在转录控制下”是指启动子相对于核酸序列处于正确的功能位置和/或取向以控制该序列的转录起始和/或表达。
启动子通常包含用于定位RNA合成的起始位点的序列。其最为人知的实例是TATA盒，但在一些缺少TATA盒的启动子中(例如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子)覆盖起始位点的离散元件本身有助于确定起始位置。另一些启动子元件调节转录起始的频率。通常，这些位于起始位点上游30至110bp的区域，尽管已经显示许多启动子也包含在起始位点下游的功能元件。为了使编码序列在启动子的“控制下”，将转录阅读框的转录起始位点的5′末端定位于所选启动子的“下游”(即3′)。“上游”启动子刺激DNA的转录并促进编码的RNA的表达。
启动子元件之间的间距通常是灵活的，使得当元件相对于彼此倒转或移动时保持启动子功能。在tk启动子中，在活性开始下降之前启动子元件之间的间隔可以提高到50bp。根据启动子，似乎各个元件可以协作地或独立地发挥功能来激活转录。启动子可与或不与“增强子”结合使用，“增强子”指参与核酸序列的转录激活的顺式作用调控序列。
启动子可以与核酸序列天然相关，如可以通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5′非编码序列获得的。这样的启动子可以称为“内源”。类似地，增强子可以与核酸序列天然相关，位于该序列的下游或上游。或者，通过将编码核酸区段置于重组或异源启动子的控制下来获得某些优点，所述重组或异源启动子是指在其天然环境中通常不与核酸序列相缔合的启动子。重组或异源增强子也指在其天然环境中通常不与核酸序列相缔合的增强子。此类启动子或增强子可包括其他基因的启动子或增强子，以及从任何其他病毒或原核或真核细胞中分离的启动子或增强子，以及不是“天然存在”的启动子或增强子，即含有不同转录调控区的不同元件，和/或改变表达的突变。例如，在重组DNA构建中最常用的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖和色氨酸(trp)启动子系统。除了合成地产生启动子和增强子的核酸序列之外，可结合本文公开的组合物使用重组克隆和/或核酸扩增技术(包括PCRTM)产生序列(参见美国专利号4，683，202和5，928，906，各自通过引用并入本文)。此外，可以设想，也可以使用指导在非核细胞器如线粒体、叶绿体等内的序列转录和/或表达的控制序列。
当然，重要的是使用有效指导DNA区段在选择用于表达的细胞器、细胞类型、组织、器官或生物体中表达的启动子和/或增强子。分子生物学领域的技术人员通常知道启动子、增强子和细胞类型组合用于蛋白质表达的用途(参见例如Sambrook等，1989，通过引用并入本文)。所使用的启动子可以是组成型的、组织特异性的、诱导型的和/或在合适的条件下可用于指导导入的DNA区段的高水平表达，例如在大规模生产重组蛋白和/或肽中有利的。启动子可以是异源的或内源的。
此外，还可以使用任何启动子/增强子组合(根据例如真核启动子数据库EPDB，通过万维网epd.isb-sib.ch/)来驱动表达。使用T3、T7或SP6细胞质表达系统是另一个可能的实施方案。如果作为递送复合物的一部分或作为另外的遗传表达构建体提供合适的细菌聚合酶，真核细胞可以支持来自某些细菌启动子的细胞质转录。
启动子的非限制性实例包括早期或晚期病毒启动子，例如SV40早期或晚期启动子、巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus，RSV)早期启动子；真核细胞启动子，例如，β肌动蛋白启动子(Ng，1989；Quitsche等，1989)、GADPH启动子(Alexander等，1988，Ercolani等，1988)、金属硫蛋白启动子(Karin等，1989；Richards等，1984)；和级联响应元件启动子，例如环状AMP响应元件启动子(cre)、血清响应元件启动子(sre)、佛波酯启动子(TPA)和最小TATA盒附近的响应元件启动子(tre)。也可以使用人生长激素启动子序列(例如，Genbank登录号X05244，核苷酸283至341中描述的人生长激素最小启动子)或小鼠乳腺肿瘤启动子(可从ATCC，目录号ATCC 45007获得)。一个具体的实例可以是磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。
ii.蛋白酶切割位点/自切割肽和内部核糖体结合位点
合适的蛋白酶切割位点和自切割肽是技术人员已知的(参见例如Ryan等，1997；Scymczak等，2004中)。蛋白酶切割位点的实例是马铃薯Y病毒(potyvirus)Nla蛋白酶(例如烟草蚀纹病毒蛋白酶)、马铃薯Y病毒HC蛋白酶、马铃薯Y病毒P1(P35)蛋白酶、byovirus Nla蛋白酶、byovirus RNA-2编码的蛋白酶、口蹄疫病毒L蛋白酶、肠病毒2A蛋白酶、鼻病毒2A蛋白酶、细小核糖核酸病毒(picorna)3C蛋白酶、豇豆花叶病毒(comovirus)24K蛋白酶、线虫传多面体病毒(nepovirus)24K蛋白酶、RTSV(稻东格鲁球状病毒(rice tungro sphericalvirus))3C样蛋白酶、PY\IF(欧防风黄点病毒(parsnip yellow fleck virus))3C样蛋白酶、凝血酶、因子Xa和肠激酶。由于其高切割严格性，可以使用TEV(烟草蚀纹病毒)蛋白酶切割位点。
示例性的自切割肽(也称为“顺式作用水解元件”，CHYSEL；参见deFelipe(2002))来源于马铃薯Y病毒和心脏病毒2A肽。具体自切割肽可以选自来源于FMDV(口蹄疫病毒)、马鼻炎A病毒，Thoseà asigna病毒和猪捷申病毒(porcine teschovirus)的2A肽。
还可以使用特定的起始信号来有效翻译多顺反子信息中的编码序列。这些信号包括ATG起始密码子或相邻序列。可能需要提供外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域的普通技术人员将能够容易地确定这一点并提供必要的信号。众所周知，起始密码子必须与期望编码序列的阅读框“同框”，以确保整个插入片段的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。通过包含适当的转录增强子元件可以增强表达效率。
在某些实施方案中，使用内部核糖体进入位点(IRES)元件来产生多基因或多顺反子信息。IRES元件能够绕过5′甲基化Cap依赖性翻译的核糖体扫描模型并在内部位点开始翻译(Pelletier和Sonenberg，1988)。已经描述了来自细小核糖核酸病毒科的两个成员(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的IRES元件(Pelletier和Sonenberg，1988)，以及来自哺乳动物信息的IRES(Macejak和Sarnow，1991)。IRES元件可以与异源开放阅读框连接。多个开放阅读框架可以一起转录，每个由IRES分隔开，从而产生多顺反子信息。凭借IRES元件，每个开放阅读框可以利用核糖体赖进行高效翻译。使用单个启动子/增强子转录单个信息，多基因可以有效表达(参见美国专利号5,925,565和5,935,819，各自通过引用并入本文)。
iii.多克隆位点
载体可以包含多克隆位点(MCS)，多克隆位点是含有多个限制酶位点的核酸区域，其中的任何一个可以与标准重组技术结合用于消化载体(参见例如Carbonelli等，1999，Levenson等，1998，和Cocea，1997，通过引用并入本文)。“限制酶消化”指用仅在核酸分子中的特定位置发挥功能的酶对核酸分子的催化切割。这些限制酶中的许多是市售的。这样的酶的使用是本领域技术人员广泛理解的。通常，使用在MCS内切割的限制性酶将载体线性化或片段化，以使外源序列能够连接至载体。“连接”是指在两个核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程，所述两个核酸片段可以彼此连续或可以不连续。涉及限制酶和连接反应的技术是重组技术领域的技术人员众所周知的。
iv.剪接位点
大多数转录的真核RNA分子将经历RNA剪接以从初级转录物中去除内含子。含有基因组真核序列的载体可能需要供体和/或受体剪接位点以确保对转录物的正确加工用于蛋白质表达(参见例如Chandler等，1997，通过引用并入本文)。
V.终止信号
载体或构建体可以包含至少一个终止信号。“终止信号”或“终止子”由参与通过RNA聚合酶的RNA转录物的特异性终止的DNA序列构成。因此，在某些实施方案中，设想了终止RNA转录物的产生的终止信号。终止子可能是体内必要的以实现期望的信息水平。
在真核系统中，终止子区还可以包含允许新转录物的位点特异性切割以暴露聚腺苷酸化位点的特异性DNA序列。这表明特定的内源性聚合酶向转录物的3′末端添加约200个A残基(polyA)的延伸段。用这种polyA尾修饰的RNA分子似乎更稳定并且翻译效率更高。因此，在涉及真核生物的另一些实施方案中，终止子包含用于切割RNA的信号，并且终止子信号促进信息的聚腺苷酸化。终止子和/或聚腺苷酸化位点元件可用于增强信息水平并使从盒向其他序列的读通最小化。
设想终止子包括本文所述或本领域普通技术人员已知的任何已知的转录终止子，包括但不限于例如基因的终止序列，例如牛生长激素终止子或病毒终止序列，例如SV40终止子。在某些实施方案中，终止信号可能缺少可转录或可翻译的序列，例如由于序列截短。
vi.聚腺苷酸化信号
在表达中，特别是真核表达中，通常包含聚腺苷酸化信号以实现转录物的适当聚腺苷酸化。不认为聚腺苷酸化信号的性质对成功实践是关键的，并且可以使用任何这样的序列。示例性实施方案包括SV40聚腺苷酸化信号或牛生长激素聚腺苷酸化信号，方便且已知在多种靶细胞中良好起作用。聚腺苷酸化可以提高转录物的稳定性或可以促进细胞质运输。
vii.复制起点
为了在宿主细胞中增殖载体，其可以含有一个或更多个复制位点的起点(通常称为“ori”)，例如，对应于上述EBV的oriP的核酸序列或在分化编程中具有类似或提高的功能的遗传改造的oriP，其为起始复制的特定核酸序列。或者，可以使用上述其他染色体外复制病毒或自主复制序列(ARS)的复制起点。
C.载体递送
在培养组合物或方法的起始细胞中的遗传修饰或导入外源核酸可使用用于核酸递送以转化细胞的任何合适的方法，如本文所述或本领域技术人员已知的。这些方法包括但不限于直接递送DNA，例如通过离体转染(Wilson等，1989，Nabel等，1989)，通过注射(美国专利号5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466和5,580,859，各自通过引用并入本文)，包括显微注射(Harland和Weintraub，1985；美国专利号5,789,215，通过引用并入本文)；通过电穿孔(美国专利号5,384,253，通过引用并入本文；Tur-Kaspa等，1986；Potter等，1984)；通过磷酸钙沉淀(Graham和Van Der Eb，1973；Chen和Okayama，1987；Rippe等，1990)；通过使用DEAE-右旋糖酐然后聚乙二醇(Gopal，1985)；通过直接声波加载(Fechheimer等，1987)；通过脂质体介导的转染(Nicolau和Sene，1982；Fraley等，1979；Nicolau等，1987；Wong等，1980；Kaneda等，1989；Kato等.，1991)和受体介导的转染(Wu和Wu，1987；Wu和Wu，1988)；通过微粒轰击(PCT申请号WO 94/09699和95/06128；美国专利号5,610,042；5,322,783、5,563,055、5,550,318、5,538,877和5,538,880，并且各自通过引用并入本文)；通过用碳化硅纤维搅拌(Kaeppler等.，1990；美国专利号5,302,523和5,464,765，各自通过引用并入本文)；通过农杆菌介导的转化(美国专利号5,591,616和5,563,055，各自通过引用并入本文)；通过PEG介导的原生质体转化(Omirulleh等，1993；美国专利号4,684,611和4,952,500，各自通过引用并入本文)；通过干燥/抑制介导的DNA摄取(Potrykus等，1985)以及这些方法的任意组合。通过应用诸如这些的技术，细胞器、细胞、组织或生物体可以被稳定或瞬时转化。
i.脂质体介导的转染
在某个实施方案中，核酸可以包载在脂质复合物例如脂质体中。脂质体是以磷脂双层膜和内部水性介质为特征的囊泡结构。多层脂质体具有由水性介质分离的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们自发形成。在封闭结构形成之前脂质组分发生自身重排并在脂质双层之间包裹水和溶解的溶质(Ghosh和Bachhawat，1991)。还设想了与Lipofectamine(Gibco BRL)或Superfect(Qiagen)复合的核酸。所使用的脂质体的量可根据脂质体的性质以及使用的细胞而变化，例如，可设想每1至1，000万个细胞约5至约20μg载体DNA。
脂质体介导的核酸递送和外来DNA的体外表达已经非常成功(Nicolau和Sene，1982；Fraley等，1979；Nicolau等，1987)。还已经证明了培养的鸡胚、HeLa和肝癌细胞中外来DNA的脂质体介导的递送和表达的可行性(Wong等，1980)。
在某些实施方案中，脂质体可以与血凝素病毒(HVJ)复合。已显示这有助于与细胞膜融合并促进脂质体包封的DNA进入细胞(Kaneda等，1989)。在另一些实施方案中，脂质体可以与核非组蛋白染色体蛋白(HMG-1)复合或联合使用(Kato等，1991)。在又一些实施方案中，脂质体可以与HVJ和HMG1两者复合或联合使用。在另一些实施方案中，递送载体可以包含配体和脂质体。
ii.电穿孔
在某些实施方案中，通过电穿孔将核酸导入细胞中。电穿孔涉及将细胞和DNA的悬液暴露于高压放电。可以使接受者细胞更易受通过机械伤害的转化的影响。所用载体的量也可以根据使用的细胞的性质而变化，例如，可以设想每1至1，000万个细胞约5至约20μg载体DNA。
使用电穿孔转染真核细胞已经相当成功。已经以这种方式用人κ免疫球蛋白基因转染了小鼠前B淋巴细胞(Potter等，1984)，并且用氯霉素乙酰转移酶基因转染了大鼠肝细胞(Tur Kaspa等，1986)。
iii.磷酸钙
在另一些实施方案中，使用磷酸钙沉淀将核酸导入细胞。已经使用这种技术用腺病毒5DNA转染了人KB细胞(Graham和Van Der Eb，1973)。同样以这种方式，用新霉素标志物基因(Chen和Okayama，1987)转染了小鼠L(A9)、小鼠C127、CHO、CV1、BHK、NIH3T3和HeLa细胞，并用多种标志物基因转染了大鼠肝细胞(Rippe等，1990)。
iv.DEAE-右旋糖酐
在另一个实施方案中，使用DEAE-右旋糖酐，然后使用聚乙二醇将核酸递送到细胞中。以这种方式，将报告质粒导入了小鼠骨髓瘤和红白血病细胞(Gopal，1985)。
IX.细胞培养应用
本文所述的培养组合物可用于生产具有如以下所例举的商业或临床应用的T细胞。
可以提供用于从干细胞体外产生抗原特异性T细胞以用于免疫治疗的方法。使用经遗传改造以对特定抗原具有响应的T细胞是用于癌症和感染性疾病的过继性细胞治疗的有前景的研究方法。经改造T细胞策略包括用T细胞受体(TCR)和嵌合抗原受体(CAR)转导以传递抗原特异性；以及基因修饰以改善经转移T细胞的效力或安全性(例如通过下调抑制性信号转导、删除病毒共受体或引入所谓的自杀基因)。
迄今为止，经改造T细胞的研究治疗已使用外周血T细胞。这种方法已在多种恶性和感染性疾病的临床试验中证明有效，但由于以下原因仍然存在问题。首先，过继转移的T细胞在体内随着时间推移数量下降，导致最终丧失肿瘤或病毒特异性免疫力。其次，通常需要离体活化和扩增T细胞以促进有效的基因转导，并且可能导致T细胞耗尽和免疫潜能降低。第三，在经TCR改造的T细胞的情况下，转基因和内源TCR链的错配可能导致具有减弱的抗原识别或脱靶毒性/自身免疫力的杂合受体(或在CAR T细胞的情况下，高度活化的T细胞上内源TCR的残留表达也可能导致脱靶毒性)。
使用ATO从干细胞从头产生经改造T细胞具有以以下方式克服经改造T细胞治疗的这些局限性的潜力：1)向HSPC(其是前胸腺的)中引入TCR或CAR基因抑制了发育中的T细胞内的内源性TCR基因座的重排(等位基因排斥(alleleic exclusion))，导致仅表达转基因抗原受体的T细胞，因此减轻了来自TCR链错配或随从TCR(passenger TCR)表达的脱靶毒性的风险；以及2)HSPC具有产生具有天然的、未耗尽的表型的抗原特异性T细胞的潜能，从而提高可用于过继治疗的T细胞的质量和寿命。此外，等位基因排斥、抗原特异性T细胞的产生为开发现成抗原特异性T细胞文库提供了机会，其可用于同种异体供体而没有任何来自内源供体TCR表达的移植物抗宿主病(GVHD)的风险。尽管有这些优点，目前还没有用于从干细胞或祖细胞开发抗原特异性T细胞的商业方法。
可合理使用ATO系统的临床应用的具体实例包括：
从HSPC体外产生自体TCR-和/或CAR-改造的T细胞，用于过继性细胞抗肿瘤或抗病毒免疫治疗。自体HSPC来源包括脐带血、骨髓和动员的外周血。
从人多能干细胞(包括iPSC)体外产生自体TCR-和/或CAR-改造的T细胞。
从HSPC或多能干细胞产生体外产生同种异体(HLA-匹配的或HLA-修饰的)TCR-或CAR-改造的T细胞，作为用于过继性细胞治疗的商业可扩展的现成产品。如上所述，通过等位基因排斥，从TCR和/或CAR转导的前胸腺HSPC产生的T细胞不表达内源性TCR，并且在移植入同种异体接受者时不具有脱靶GVHD的风险。用于此目的的干细胞可进一步选择或遗传修饰以增强同种异体宿主中子代T细胞的植入(例如通过使用HLA匹配的HSPC，或通过HLA基因座或NK细胞配体的基因修饰以降低同种免疫识别)。
修饰引入或不引入TCR和/或CAR的干细胞中的非抗原受体基因，以增强ATO来源T细胞的体内功能。实例包括以下的遗传失活或敲低：共抑制性受体如PD-1、TIM-3或LAG-3；抑制性信号转导途径如TGFβ；或病毒进入共受体如CCR5。
使用3D培养物聚集体作为胸腺类器官来对药物或生物化合物对于T细胞发育和功能的影响建模，例如在药物毒性测定中。这可以扩展到使用具有自体患者细胞的ATO来对患者特异性药物基因组学或疾病特异性相互作用建模。
可以提供用于研究T细胞发育的研究工具的方法和组合物。如上所述，3D细胞聚集体如ATO是用于研究来自多种干细胞来源的人T细胞发育的有力工具，包括干细胞和祖细胞以及造血干细胞和祖细胞(HSPC)和人多能干细胞，包括胚胎干细胞(ESC)和诱导多能干细胞(iPSC)。
目前在实验室中实施以对T细胞发育建模的实验方法具有几个重要限制：
基于OP9-DL1和类似的基质细胞的单层系统使用用Notch配体(通常是鼠Dll1或Dll4)转导的永生化鼠骨髓细胞系作为HSPC的“饲养层”。人HSPC在OP9-DL1上的体外共培养导致对T细胞谱系的定型，然而T细胞的正选择在很大程度上受损，导致这些系统中成熟的功能性T细胞的显著缺陷。基质细胞共培养系统也是高度劳动密集型的，效率和再现性取决于多个变量，包括胎牛血清批次。
胎儿胸腺器官培养(FTOC)方法使用完整的或重新聚集的造血细胞缺失的鼠或人胎儿胸腺组织作为微环境，以研究来自HSPC的体外T细胞发育。这些方法是高度劳动密集型的，导致T细胞产生效率低，提供有限的定量测定能力，由于组织的年龄和质量而表现出高的实验变异性，并且受到原代胸腺组织可及性的限制。
基于支架的类器官通常使用接种到生物材料基质上的原代胸腺基质细胞或类似细胞类型(例如真皮成纤维细胞)。这些系统受效率和可扩展性低，重复性差以及专有支架材料可用性有限的限制。
体内人T细胞发育的异种(鼠)模型在T细胞分化效率方面高度可变并且定量差，并且许多方法还需要将人胎儿胸腺、肝脏和骨髓细胞或片段植入免疫缺陷小鼠中。
与这些方法相反，ATO使用“现成”组分和无血清条件来降低源自使用原代组织或胎牛血清的生物变异性；并避免使用专有支架材料。重要的是，ATO支持极大改善的正选择，允许在体外进行成熟T细胞的研究和T细胞正/负选择。因此，ATO可以作为研究体外T细胞发育的工具而被商业化。
本文所述的方法和组合物也可用作开发针对癌症或其他治疗相关抗原的新的抗原特异性TCR的工具。例如，可以使用公开的方法和使用公开的方法从这些响应性T细胞鉴定的抗原特异性TCR序列，基于对肿瘤相关抗原或新抗原的反应性来选择ATO来源的T细胞。由于我们假设ATO可以提供具有最小或无负选择的T细胞的产生，因此可以产生对自身抗原具有高亲和力的TCR，从而提供与内源性“胸腺训练的(thymus-educated)”T细胞池不同的新TCR库(repertoire)。第二种方法是在ATO中T细胞发育期间引入肿瘤相关抗原，其应随着ATO内反应性T细胞克隆的发育诱导反应性T细胞克隆的激动剂选择(和IEL样分化)；这些细胞及其TCR序列可以通过标准方法鉴定。分离的TCR序列也可用于本文所述的用于过继免疫治疗的下游应用和方法中。
本文所述的方法和组合物还可以包括用于扩增胚胎干细胞和/或祖细胞的方法和组合物。本领域已知的方法，例如US 20060205072、US 7344881、US 20060205071、US20020076747和US 20030044978(其通过引用并入本文)中描述的方法可以包括在本公开内容的组合物和方法中。
本文所述的方法和组合物还可以包括用于提高诸如ES细胞、HSPC/PSC和/或CD34+细胞的细胞的增殖能力的方法和组合物。示例性化合物包括HSC835(由Novartis商业化)，其实现CD34+细胞的离体扩增。另一些化合物描述于US 8,927,281中，其通过引用并入本文。
X.起始细胞的来源
诸如多能干细胞或造血干细胞或祖细胞的起始细胞可以用于沿着选择的T细胞谱系进行分化的某些组合物或方法中。基质细胞可用于与干细胞或祖细胞共培养。
A.基质细胞
基质细胞是任何器官(如骨髓、胸腺、子宫黏膜(子宫内膜)、前列腺和卵巢)中的结缔组织细胞。它们是支持该器官的实质细胞的功能的细胞。成纤维细胞(也称为间充质基质细胞/MSC)和周细胞是最常见类型的基质细胞。
已知基质细胞和肿瘤细胞之间的相互作用在癌症生长和进展中起主要作用。此外，通过调节局部细胞因子网络(例如M-CSF、LIF)，已经描述了骨髓基质细胞参与人类造血和炎症过程。
骨髓、胸腺和其他造血器官中的基质细胞通过细胞-细胞配体-受体相互作用和通过释放包括细胞因子和趋化因子的可溶性因子来调节造血和免疫细胞的发育。这些组织中的基质细胞形成调节干细胞维持、谱系特化和定型以及分化为效应细胞类型的小生境。
基质由非恶性宿主细胞构成。基质细胞还提供细胞外基质，组织特异性细胞类型以及在某些情况下肿瘤可以在其上生长。
B.造血干细胞和祖细胞
由于造血干细胞和祖细胞的显著的医学潜力，已经做了大量的工作来尝试改进从胚胎干细胞分化造血祖细胞的方法。在成年人中，主要存在于骨髓中的造血干细胞产生分化为血液系统的所有细胞的造血(CD34+)祖细胞的异质群体。在成年人中，造血祖细胞增殖和分化，导致每天产生数千亿成熟的血细胞。造血祖细胞也存在于脐带血中。在体外，人胚胎干细胞可以分化为造血祖细胞。如下所述，造血祖细胞也可以从外周血样品中扩增或富集。造血细胞可以是人源、鼠源或任何其他哺乳动物物种。
造血祖细胞的分离包括任何选择方法，包括细胞分选器、使用抗体包被的磁珠的磁性分离、填充柱；亲和色谱；与单克隆抗体连接或与单克隆抗体结合使用的细胞毒剂，包括但不限于补体和细胞毒素；以及用附着于固体基质例如平板的抗体或任何其他方便的技术的“淘选(panning)”。
分离或隔离技术的使用包括但不限于基于物理(密度梯度离心和逆流离心淘洗)、细胞表面(凝集素和抗体亲和力)和活体染色性质(线粒体结合染料rho123和DNA结合染料Hoechst 33342)中的差异的那些。提供精确分离的技术包括但不限于FACS(荧光激活细胞分选)或MACS(磁激活细胞分选)，其可以具有不同程度的复杂性，例如多个颜色通道、低角度和钝角光散射检测通道、阻抗通道等。
可以将前述技术或用于评估细胞类型纯度的技术(例如流式细胞术)中使用的抗体与可鉴定的试剂缀合，所述试剂包括但不限于酶、磁珠、胶体磁珠、半抗原、荧光染料、金属化合物、放射性化合物、药物或半抗原。可与抗体缀合的酶包括但不限于碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶和β-半乳糖苷酶。可以与抗体缀合的荧光染料包括但不限于异硫氰酸荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明、藻红蛋白、别藻蓝蛋白和德克萨斯红(Texas Red)。有关可以与抗体缀合的其他荧光染料，参见Haugland，Molecular Probes：Handbook of FluorescentProbes and Research Chemicals(1992-1994)。可以与抗体缀合的金属化合物包括但不限于铁蛋白、胶体金，特别是胶体超顺磁珠。可以与抗体缀合的半抗原包括但不限于生物素、地高辛、唑酮和硝基酚。可以与抗体缀合或并入到抗体中的放射性化合物是本领域已知的，并且包括但不限于锝99m(99TC)、125I和包含任何放射性核素(包括但不限于14C、3H和35S)的氨基酸。
可以采用允许准确分离的用于正选择的其他技术，例如亲和柱等。该方法应该允许去除至剩余量小于约20％，优选小于约5％的非靶细胞群体。
可以基于光散射性质以及它们的多种细胞表面抗原的表达来选择细胞。通过FACS分析，纯化的干细胞具有低侧向散射和低至中等前向散射谱。细胞离心涂片制备物显示富集的干细胞具有在成熟淋巴细胞和成熟粒细胞之间的大小。
也可以在培养之前富集CD34+细胞的接种群，例如使用Sutherland等(1992)以及在美国专利号4,714,680中描述的方法。例如，对细胞进行负选择以去除表达谱系特异性标志物的那些细胞。在一个示例性实施方案中，细胞群可以经历负选择以耗尽非CD34+造血细胞和/或特定造血细胞亚群。可以基于多种分子的细胞表面表达来进行负选择，所述分子包括T细胞标志物如CD2、CD4和CD8；B细胞标志物如CD10、CD19和CD20；单核细胞标志物CD14；NK细胞标志物CD2、CD16和CD56或任何谱系特异性标志物。可以基于多种分子的细胞表面表达来进行负选择，所述分子为例如可用于分离其他细胞类型(例如通过MACS或柱分离)的抗体(例如CD2、CD3、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD56、CD123和CD235a)的混合物。
如本文所用，谱系阴性(LIN-)是指缺少与谱系定型细胞相关的至少一种标志物的细胞，例如与以下相关的标志物：T细胞(如CD2、3、4和8)、B细胞(如CD10、19和20)、骨髓细胞(如CD14、15、16和33)、自然杀伤(“NK”)细胞(如CD2、16和56)、RBC(如血型糖蛋白A)、巨核细胞(CD41)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞或嗜碱性粒细胞，或其他标志物，如CD38、CD71和HLA-DR。优选地，谱系特异性标志物包括但不限于CD2、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD33、CD38、HLA-DR和CD71中的至少一种。更优选地，LIN-包括至少CD14和CD15。通过正选择例如c-kit+或Thy-1+可以实现进一步纯化。通过使用线粒体结合染料若丹明123并通过本领域已知的方法选择若丹明+细胞可以获得进一步的富集。高度富集的组合物可以通过选择性分离CD34+，优选CD34+LIN-，最优选CD34+Thy-1+LIN-的细胞来获得。干细胞中高度富集的群体和获得它们的方法是本领域技术人员熟知的，参见例如PCT/US94/09760、PCT/US94/08574和PCT/US94/10501中描述的方法。
可以采用多种技术通过首先去除专用谱系的细胞来分离细胞。单克隆抗体对鉴定与特定细胞谱系和/或分化阶段相关的标志物特别有用。抗体可以连接到固体支持物上以允许粗分离。采用的分离技术应该最大限度地保留待收集级分的活力。可以采用不同效力的多种技术来获得“相对较粗”的分离。这种分离是其中存在的总细胞的多至10％，通常不多于约5％，优选不多于约1％是与待保留细胞群一起保留的不期望的细胞。所采用的特定技术将取决于分离效率、相关的细胞毒性、操作的容易性和速度以及精密设备和/或技术技能的必要性。
祖细胞的选择不需要仅利用细胞特异性的标志物来实现。通过使用负选择和正选择的组合，可以获得富集的细胞群。
C.血细胞来源
造血干细胞(HSC)通常存在于骨髓中，但可以被迫进入血液，这是临床上用于在外周血中收获大量的HSC的被称为动员的过程。一种选择的动员剂是粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。
在外周血中循环的CD34+造血干细胞或祖细胞可以通过单采血液成分术技术在未干扰状态下或在在外部施用造血生长因子如G-CSF后动员后收集。动员后收集的干细胞或祖细胞的数目大于未干扰状态下的单采血液成分术后获得的数目。在本发明的一个特定方面，细胞群的来源是其细胞未被外在施用因子动员的对象，因为不需要在体内富集造血干细胞或祖细胞。
用于本文所述方法的细胞群可以是哺乳动物细胞，例如人细胞、非人灵长类动物细胞、啮齿类动物细胞(例如小鼠或大鼠)、牛细胞、羊细胞、猪细胞、马细胞、绵羊细胞、犬细胞和猫细胞或其混合物。非人灵长类动物细胞包括恒河猴细胞。细胞可以从动物如人患者获得，或者它们可以来自细胞系。如果细胞从动物获得，则它们可以原样使用，例如作为未分离的细胞(即混合群)；它们可以已经首先在培养中建立，例如通过转化；或者它们可以已经经过初步纯化方法。例如，细胞群可以如下操作：基于细胞表面标志物的表达通过正或负选择；在体外或体内用一种或更多种抗原进行刺激；在体外或体内用一种或更多种生物调节剂进行处理；或者这些的任何或全部组合。
细胞群包括外周血单核细胞(PBMC)、含有混合群的全血或其级分、脾细胞、骨髓细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、通过白细胞分离术获得的细胞、活检组织、淋巴结，例如从肿瘤中排出的淋巴结。合适的供体包括经免疫的供体、未经免疫的(初始(naive))供体、经处理或未经处理的供体。“经处理”的供体是已经暴露于一种或更多种生物调节剂的供体。未经处理的供体尚未暴露于一种或更多种生物调节剂。
例如，可根据本领域已知的方法所述获得外周血单核细胞(PBMC)。Kim等(1992)、Biswas等(1990)、Biswas等(1991)讨论了这些方法的实例。
从细胞群获得前体细胞的方法也是本领域中周知的。可以使用多种细胞因子如hSCF、hFLT3和/或IL-3(Akkina等，1996)扩增前体细胞，或者可以使用MACS或FACS富集CD34+细胞。如上所述，负选择技术也可用于富集CD34+细胞。
也可以从对象获得细胞样品，然后富集获得期望的细胞类型。例如，可以如本文所述从血液中分离PBMC和/或CD34+造血细胞。还可以使用多种技术将细胞与其他细胞分离，例如用与期望细胞类型的细胞表面上的表位结合的抗体分离和/或活化。可以使用的另一种方法包括使用针对细胞表面标志物的抗体进行负选择以选择性富集特定细胞类型，而不通过受体接合活化细胞。
骨髓细胞可以从髂嵴、股骨、胫骨、脊柱、肋骨或其他髓质空间获得。骨髓可以从患者中取出并通过多种分离和洗涤程序分离。用于分离骨髓细胞的示例性程序包括以下步骤：a)将骨髓悬液离心分离成三个级分，并收集中间级分或棕黄层(buffycoat)；b)将来自步骤(a)的棕黄层级分在分离液(通常为Ficoll(Pharmacia Fine Chemicals AB的商标))中再一次离心分离并收集含有骨髓细胞的中间级分；以及c)洗涤来自步骤(b)的收集的级分以回收可再输注的骨髓细胞。
D.多能干细胞
适用于本文所述的组合物和方法的细胞可以是造血干细胞，祖细胞也可以通过多能干细胞的体外分化来制备。在一些实施方案中，本文所述方法中使用的细胞是直接接种到ATO中的多能干细胞(胚胎干细胞或诱导多能干细胞)。在另一些实施方案中，本文所述的方法和组合物中使用的细胞是PSC的衍生物或后代，例如但不限于中胚层祖细胞、血内皮祖细胞或造血祖细胞。
术语“多能干细胞”是指能够产生所有三个胚层(即内胚层、中胚层和外胚层)的细胞。尽管理论上多能干细胞可以分化为身体的任何细胞，但多能性的实验测定通常基于多能细胞分化为每个胚层的几种细胞类型。在一些实施方案中，多能干细胞是来源于胚泡的内细胞团的胚胎干(ES)细胞。在另一些实施方案中，多能干细胞是通过重编程体细胞来源的诱导多能干细胞。在某些实施方案中，多能干细胞是通过体细胞核转移来源的胚胎干细胞。
胚胎干(ES)细胞是来源于胚泡的内细胞团的多能细胞。可以通过除去发育中的胚胎的滋养外胚层，然后在非生长细胞的饲养层上培养内团细胞来分离ES细胞。在适当条件下，产生增殖的、未分化ES细胞的集落。可以取出集落，解离成单细胞，然后重铺在新鲜的饲养层上。重铺的细胞可以继续增殖，产生新的未分化ES细胞集落。然后可以取出新的集落，解离，再次重铺并允许生长。这种“传代培养”或“传代”未分化ES细胞的过程可以重复多次以产生含有未分化ES细胞的细胞系(美国专利号5,843,780；6,200,806；7,029,913)。“原代细胞培养物”是从组织如胚泡的内细胞团直接获得的细胞的培养物。“传代培养物”是源自原代细胞培养物的任何培养物。
获得小鼠ES细胞的方法是众所周知的。在一种方法中，将来自129品系小鼠的植入前胚泡用小鼠抗血清处理以去除滋养外胚层，并将内细胞团在含有胎牛血清的培养基中的化学灭活的小鼠胚胎成纤维细胞的饲养细胞层上培养。将出现的未分化ES细胞的集落在胎牛血清的存在下在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上传代培养以产生ES细胞群。在一些方法中，可以通过向含血清培养基中加入细胞因子白血病抑制因子(LIF)来使小鼠ES细胞在没有饲养层的情况下生长(Smith，2000)。在另一些方法中，小鼠ES细胞可以在骨形态发生蛋白和LIF的存在下在无血清培养基中生长(Ying等，2003)。
可以使用先前描述的方法(Thomson等.，1995；Thomson等.，1998；Thomson andMarshall，1998；Reubinoff等，2000)从胚泡获得人ES细胞。在一种方法中，使第5天的人胚泡暴露于兔抗人脾细胞抗血清，然后暴露于豚鼠补体的1∶5稀释液以裂解滋养外胚层细胞。在从完整的内细胞团除去裂解的滋养外胚层细胞后，将内细胞团在γ-灭活的小鼠胚胎成纤维细胞的饲养层上并在胎牛血清的存在下培养。9至15天后，来源于内细胞团的细胞团可以化学地(即暴露于胰蛋白酶)或机械地解离并重铺在含有胎牛血清和小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的新鲜培养基中。在进一步增殖后，通过微量移液管选择具有未分化形态的集落，机械地解离成团块并重铺(参见美国专利号6,833,269)。ES样形态的特征是致密集落，具有明显高的细胞核比细胞质的比例，以及明显的核仁。可以通过简单的胰蛋白酶消化或通过微量移液管选择单个集落来使得到的ES细胞常规传代。在一些方法中，通过在存在碱性成纤维细胞生长因子的情况下在成纤维细胞的饲养层上培养ES细胞，可以在没有血清的情况下培养人ES细胞(Amit等，2000)。在另一些方法中，通过在含有碱性成纤维细胞生长因子的“调节(conditioned)”培养基的存在下将细胞在诸如MatrigelTM或层黏连蛋白的蛋白质基质上培养，可以在没有饲养细胞层的情况下培养人ES细胞(Xu等，2001)。该培养基预先通过与成纤维细胞共培养进行调节。
用于分离恒河猴和普通狨猴ES细胞的方法也是已知的(Thomson和Marshall，1998；Thomson等，1995；Thomson和Odorico，2000)。
ES细胞的另一来源是建立的ES细胞系。多种小鼠细胞系和人ES细胞系是已知的，并且已经确定了它们的生长和增殖条件。例如，从小鼠品系129胚胎的内细胞团建立小鼠CGR8细胞系，并且CGR8细胞的培养物可以在没有饲养层的LIF的存在下生长。作为另一个实例，Thompson等建立了人ES细胞系H1、H7、H9、H13和H14。另外，已经开发了H9系的亚克隆H9.1和H9.2。
ES细胞的来源可以是胚泡、来源于培养胚泡的内细胞团的细胞或从已建立的细胞系的培养物获得的细胞。因此，如本文所用，术语“ES细胞”可以指胚泡的内细胞团细胞、从内团细胞培养物获得的ES细胞和从ES细胞系的培养物获得的ES细胞。
诱导多能干(iPS)细胞是具有ES细胞的特征但是通过已分化体细胞的重编程获得的细胞。已经通过多种方法获得诱导多能干细胞。在一种方法中，使用逆转录病毒转导，用转录因子Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4转染成人皮肤成纤维细胞(Takahashi等，2007)。将转染的细胞铺在补充有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的培养基中的SNL饲养细胞(产生LIF的小鼠细胞成纤维细胞系)上。大约25天后，培养物中出现类似人ES细胞集落的集落。挑取ES细胞样集落并在bFGF的存在下在饲养细胞上扩增。
基于细胞特征，ES细胞样集落的细胞是诱导多能干细胞。诱导多能干细胞在形态上类似于人ES细胞，并表达多种人ES细胞标志物。而且，当在已知导致人ES细胞分化的条件下生长时，诱导多能干细胞相应地分化。例如，诱导多能干细胞可以分化成具有神经元结构和神经元标志物的细胞。
在另一种方法中，使用慢病毒转导，用四种基因Oct4、Sox2、Nanog和Lin28转染人胎儿或新生儿成纤维细胞(Yu等，2007)。在感染后第12至20天，具有人ES细胞形态的集落变得可见。挑取该集落并扩增。构成集落的诱导多能干细胞在形态上类似于人ES细胞，表达多种人ES细胞标志物，并且在注射到小鼠中后形成具有神经组织、软骨和肠上皮的畸胎瘤。
从小鼠制备诱导多能干细胞的方法也是已知的(Takahashi和Yamanaka，2006)。诱导iPS细胞通常需要表达或暴露于来自Sox家族的至少一个成员和来自Oct家族的至少一个成员。Sox和Oct被认为是指定ES细胞身份的转录调控层级的核心。例如，Sox可以是Sox-1、Sox-2、Sox-3、Sox-15或Sox-18；Oct可以是Oct-4。另一些因素可以提高重编程效率，如Nanog、Lin28、Klf4或c-Myc；特定的重编程因子组可以是包含Sox-2、Oct-4、Nanog和任选的Lin-28的组；或包含Sox-2、Oct4、Klf和任选的c-Myc的组。
如ES细胞一样，IPS细胞具有可使用SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4的抗体(Developmental Studies Hybridoma Bank，National Institute of Child Health andHuman Development，Bethesda Md.)和TRA-1-60和TRA-1-81的抗体(Andrews等，1987)通过免疫组织化学或流式细胞术鉴定或确认的典型抗原。胚胎干细胞的多能性可以通过将约0.5至10×106个细胞注入8至12周龄雄性SCID小鼠的后腿肌肉来确认。畸胎瘤发育证明三个胚层中的每一个的至少一种细胞类型。
XI.经分化细胞的遗传改变
某些实施方案中的细胞可以通过在分化之前或之后对细胞进行遗传改造而包含一个或更多个遗传改变(US 2002/0168766)。当通过任何合适的人工操作手段将外源核酸或多核苷酸转移到细胞中时，或当细胞是遗传了多核苷酸的最初经改变细胞的后代时，称细胞是“遗传改变的”，“遗传修饰的”或“转基因的”。例如，可以在细胞进展至受限的发育谱系细胞或终末分化细胞之前或之后通过遗传改变细胞以表达端粒酶逆转录酶来处理细胞以提高其复制潜能(US 2003/0022367)。
在某些实施方案中，含有外源核酸构建体的细胞可通过在表达载体中包含标志物(如可选择标志物或可筛选标志物)而被体外或体内鉴定。这样的标志物会赋予细胞可识别的变化，从而容易鉴定含有表达载体的细胞，或者通过使用组织特异性启动子来帮助富集或鉴定经分化的心脏细胞。例如，在心肌细胞分化方面，可以使用心脏特异性启动子，例如心肌肌钙蛋白I(cTnI)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)、肌节肌球蛋白重链(MHC)、GATA-4、Nkx2.5、N-钙黏蛋白、β1-肾上腺素受体、ANF、MEF-2转录因子家族、肌酸激酶MB(CK-MB)、肌红蛋白或心房利钠因子(ANF)的启动子。在神经元分化方面，可以使用神经元特异性启动子，包括但不限于TuJ-1、Map-2、Dcx或突触蛋白。在肝细胞分化方面，可使用定形内胚层和/或肝细胞特异性启动子，包括但不限于ATT、Cyp3a4、ASGPR、FoxA2、HNF4a或AFP。
通常，可选择标志物是赋予允许选择的特性的标志物。正选择标志物是其中标志物的存在允许其选择的标志物，而负选择标志物是其存在阻止其选择的标志物。正选择标志物的一个实例是抗药性标志物。
通常，包含药物选择标志物有助于转化体的克隆和鉴定，例如赋予对杀稻瘟菌素、新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、博来霉素和组氨醇醇的抗性的基因是有用的可选择标志物。除了赋予允许基于条件的实施区分转化体的表型的标志物之外，还设想了其他类型的标志物，包括基于比色分析的可筛选标志物，例如GFP。或者，可以使用可筛选酶如氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员也知道如何使用免疫学标志物，其可能与FACS分析结合。认为所使用的标志物不重要，只要其能够与编码基因产物的核酸同时表达即可。可选择和可筛选标志物的其他实例对于本领域技术人员来说是公知的。
XII.疾病和病症的治疗
可以关于对此类病症检测为阳性、具有病症的一种或更多种症状或被认为具有发生此类病症或相关病症的风险的个体使用所述方法。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法用于治疗本文列举的和/或本领域已知的病症的炎性或自身免疫组分。
本公开内容的某些方面涉及癌症的治疗和/或癌症抗原的使用。待治疗的癌症或抗原可以是与本领域已知的任何癌症相关的抗原，例如上皮癌(例如乳腺癌、胃肠癌、肺癌)、前列腺癌、膀胱癌、肺(例如小细胞肺)癌、结肠癌、卵巢癌、脑癌、胃癌、肾细胞癌、胰腺癌、肝癌、食管癌、头颈癌或结直肠癌。在一些实施方案中，待治疗的癌症或抗原来自以下癌症之一：腺皮质癌、原因不明的髓样化生、AIDS相关癌症(例如AIDS相关淋巴瘤)、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤(例如小脑和脑)、基底细胞癌、胆管癌(例如肝外)、膀胱癌、骨癌、(骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤)、脑瘤(例如神经胶质瘤、脑干神经胶质瘤、小脑或大脑星形细胞瘤(例如毛细胞性星形细胞瘤、弥漫性星形细胞瘤、间变性(恶性)星形细胞瘤)、恶性神经胶质瘤、室管膜瘤、少突神经胶质瘤(oligodenglioma)、脑脊膜瘤、脑脊膜肉瘤(meningiosarcoma)、颅咽管瘤、成血管细胞瘤(haemangioblastomas)、成神经管细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视觉通路和下丘脑胶质瘤和成胶质细胞瘤)、乳腺癌、支气管腺癌/类癌、类癌肿瘤(例如胃肠类癌肿瘤)、未知原发癌、中枢神经系统淋巴瘤、宫颈癌、结肠癌、结直肠癌、慢性骨髓增殖性疾病、子宫内膜癌(例如子宫癌)、室管膜瘤、食管癌、尤因家族肿瘤(Ewing′s family of tumor)、眼癌(例如眼内黑素瘤和视网膜母细胞瘤)、胆囊癌、胃(胃部)癌、胃肠类癌肿瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、生殖细胞瘤(例如颅外、性腺外、卵巢)、妊娠滋养细胞肿瘤、头颈癌、肝细胞(肝)癌(例如hepatic carcinoma和heptoma)、下咽癌、岛细胞癌(内分泌胰腺)、喉癌、喉癌、白血病、唇和口腔癌症、口腔癌、肝癌、肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌)、淋巴样赘生物(例如淋巴瘤)、成神经管细胞瘤、卵巢癌、间皮瘤、转移性鳞状颈癌、口癌、多发性内分泌瘤形成综合征、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增殖性疾病、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、神经内分泌癌、口咽癌、卵巢癌(例如卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞瘤、卵巢低度恶性潜在肿瘤)、胰腺癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、腹膜癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤、垂体瘤、胸膜肺母细胞瘤、淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤(小胶质细胞瘤)、肺淋巴管肌瘤病、直肠癌、肾癌、肾盂和输尿管癌(移行细胞癌)、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、皮肤癌(例如非黑素瘤(例如鳞状细胞癌)、黑素瘤和梅克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma))、小肠癌、鳞状细胞癌、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、结节性硬化症、尿道癌、阴道癌、外阴癌、维尔姆斯瘤(Wilms′tumor)和移植后淋巴增殖性疾病(PTLD)、与瘢痣病(phakomatoses)相关的异常血管增生、水肿(如与脑瘤相关)或梅格斯综合征(Meigs′syndrome)。
本公开内容的某些方面涉及治疗自身免疫病症和/或使用自身免疫相关抗原。待治疗的自身免疫疾病或抗原可以是与本领域已知的任何自身免疫病症相关的抗原，自身免疫病症为例如糖尿病、移植物排斥、GVHC、关节炎(类风湿性关节炎，如急性关节炎、慢性类风湿性关节炎、痛风或痛风性关节炎、急性痛风性关节炎、急性免疫性关节炎、慢性炎性关节炎、退行性关节炎、II型胶原诱导的关节炎、感染性关节炎、莱姆关节炎(Lymearthritis)、增生性关节炎、银屑病关节炎、斯蒂尔病(Still′s disease)、椎骨关节炎和青少年型类风湿性关节炎、骨关节炎、慢性进行性关节炎(arthritis chronicaprogrediente)、变形性关节炎、原发性慢性多发性关节炎(polyarthritis chronicaprimaria)、反应性关节炎和强直性脊柱炎)、炎性过度增殖性皮肤病，银屑病，如斑块状银屑病、滴状银屑病(gutatte psoriasis)、脓疱性银屑病和指甲银屑病，特应性，包括特应性疾病如枯草热和乔布综合征(Job′s syndrome)，皮炎，包括接触性皮炎、慢性接触性皮炎、剥脱性皮炎、过敏性皮炎、过敏性接触性皮炎、疱疹样皮炎、钱币状皮炎、脂溢性皮炎、非特异性皮炎、原发性刺激性接触性皮炎和特应性皮炎，x-连锁高IgM综合征，变应性眼内炎性疾病，荨麻疹，如慢性变应性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹，包括慢性自身免疫性荨麻疹，肌炎、多肌炎/皮肌炎、幼年型皮肌炎、中毒性表皮坏死松解症，硬皮病(包括系统性硬皮病)，硬化，例如系统性硬化、多发性硬化(MS)，如脊髓-眼MS、原发进行性MS(PPMS)和复发缓解MS(RRMS)、进行性系统性硬化、动脉粥样硬化、动脉硬化、散播性硬化、共济失调硬化(ataxicsclerosis)，视神经脊髓炎(NMO)，炎性肠病(IBD)(例如克罗恩病，自身免疫介导的胃肠疾病，结肠炎，如溃疡性结肠炎、结肠炎溃疡、微小性结肠炎、胶原性结肠炎、息肉性结肠炎、坏死性小肠结肠炎和透壁性结肠炎，以及自身免疫性炎症性肠病)，肠炎，坏疽性脓皮病，结节性红斑，原发性硬化性胆管炎，呼吸窘迫综合征，包括成人或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，脑膜炎，葡萄膜、虹膜、脉络膜中的全部或一部分的炎症，自身免疫性血液病症，类风湿性脊椎炎，类风湿性滑膜炎，遗传性血管性水肿，颅神经损伤如脑膜炎，妊娠疱疹，妊娠类天疱疮瘙，阴囊痒症，自身免疫性卵巢早衰，由于自身免疫病引起的突发性听力丧失，IgE介导的疾病如过敏症和变应性和特应性鼻炎，脑炎，如拉斯穆森脑炎(Rasmussen′s encephalitis)和边缘和/或脑干脑炎，葡萄膜炎，如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽肿葡萄膜炎、非肉芽肿葡萄膜炎、晶状体抗原性葡萄膜炎(phacoantigenic uveitis)、后葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎，具有和不具有肾病综合征的肾小球肾炎(GN)，例如慢性或急性肾小球肾炎，如原发性GN、免疫介导的GN、膜性GN(膜性肾病)、特发性膜性GN或特发性膜性肾病、膜或膜性增生性GN(MPGN)(包括I型和II型)和急进性GN，增殖性肾炎，自身免疫性多腺体内分泌障碍，龟头炎，包括浆细胞性局限性龟头炎(balanitis circumscripta plasmacellularis)、包皮龟头炎，离心性环状红斑(erythema annulare centrifugum)，持久性色素异常性红斑(erythema dyschromicum perstans)、多形性红斑(eythema multiform)，环状肉芽肿，光泽苔藓(lichen nitidus)，硬化性萎缩性苔藓(lichen sclerosus et atrophicus)，慢性单纯性苔藓，小棘苔藓(lichen spinulosus)，扁平苔癣，片层状鱼鳞病，表皮松解性角化过度，恶变前角化，坏疽性脓皮，过敏病症和响应，过敏反应，湿疹，包括变应性或特应性湿疹、干性湿疹、湿汗症和泡状掌跖湿疹，哮喘，如哮喘支气管，支气管哮喘和自身免疫性哮喘，涉及T细胞浸润和慢性炎症反应的病症，针对外来抗原的免疫反应，如妊娠期间胎儿A-B-O血型，慢性肺部炎性疾病，自身免疫性心肌炎，白细胞黏附不足，狼疮，包括狼疮性肾炎、狼疮性脑炎、小儿狼疮、非肾脏狼疮、肾外狼疮、盘状狼疮和盘状红斑狼疮、脱发性狼疮、系统性红斑狼疮(SLE)如皮肤SLE或亚急性皮肤SLE、新生儿狼疮综合征(NLE)和散播性红斑狼疮传染，青少年(I型)糖尿病，包括小儿胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)和成人糖尿病(II型糖尿病)和自身免疫性糖尿病。也包括与由细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏反应有关的免疫应答，结节病，肉芽肿病，包括淋巴瘤样肉芽肿病、韦格纳肉芽肿病(Wegener′sgranulomatosis)，粒细胞缺少症，脉管炎，包括血管炎、大血管血管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(giant cell)(Takayasu′s)动脉炎)、中血管血管炎(包括川崎病(Kawasaki′sdisease)和结节性多动脉炎/结节性动脉周围炎)，微小性多动脉炎，免疫血管炎，CNS血管炎，皮肤血管炎，超敏性血管炎，坏死性血管炎如全身性坏死性血管炎和ANCA相关性血管炎，如Churg-Strauss血管炎或综合征(CSS)以及ANCA相关小血管血管炎，颞动脉炎，再生障碍性贫血，自身免疫性再生障碍性贫血，库姆斯阳性贫血，Diamond Blackfan贫血，溶血性贫血或免疫性溶血性贫血，包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)，阿狄森病(Addison′sdisease)，自身免疫性中性粒细胞减少症，全血细胞减少症，白细胞减少症，涉及白细胞渗出的疾病，CNS系统炎症，阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease)，帕金森病(Parkinson′sdisease)，多器官损伤综合征，例如继发于败血症、创伤或出血的那些，抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基底膜病，抗磷脂抗体综合征，变应性神经炎，白塞(Behcet′s)病/综合征，Castleman综合征、Goodpasture综合征、Reynaud综合征、Sjogren综合征、Stevens-Johnson综合征，类天疱疮，例如大疱性类天疱疮和皮肤类天疱疮，天疱疮(包括寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、天疱疮黏膜膜类天疱疮和红斑性天疱疮)，自身免疫性多内分泌腺病，赖特尔病(Reiter′s disease)或综合征，热损伤，先兆子痫，免疫复合物病症，如免疫复合物肾炎，抗体介导的肾炎，多发性神经病，慢性神经病，如IgM多发性神经病或IgM介导的神经肽，自身免疫或免疫介导的血小板减少症，如特发性血小板减少性紫癜(ITP)，包括慢性或急性ITP，巩膜炎，如特发性cerato-巩膜炎，巩膜外层炎，睾和卵巢的丸自身免疫病，包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎，原发性甲状腺功能减退，甲状旁腺功能减退，自身免疫性内分泌疾病，包括甲状腺炎，如自身免疫性甲状腺炎，桥本病(Hashimoto′s disease)，慢性甲状腺炎(桥本氏甲状腺炎)或亚急性甲状腺炎，自身免疫性甲状腺疾病，特发性甲状腺功能减退，格雷夫斯病(Grave′s disease)，多腺综合征，如自身免疫性多腺综合征(或多腺内分泌病综合征)，副肿瘤综合征，包括神经副肿瘤综合征，如Lambert-Eaton肌无力综合征或Eaton-Lambert综合征、stiff-man或stiff-person综合征，脑脊髓炎，如变应性脑脊髓炎或脑脊髓炎过敏性和实验性变应性脑脊髓炎(EAE)、实验性自身免疫性脑脊髓炎，重症肌无力，如胸腺瘤相关性重症肌无力，小脑变性，神经性肌强直，斜视眼阵挛(opsoclonus)或斜视眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)，感觉神经病变，多灶性运动神经病变，希恩综合征，自身免疫性肝炎，慢性肝炎，狼疮样肝炎，巨细胞肝炎，慢性活动性肝炎或自身免疫性慢性活动性肝炎，淋巴样间质性肺炎(LIP)，梗阻性细支气管炎(非移植)vs NSIP，格-巴二氏综合征(Guillain-Barre syndrome)，贝格尔病(Berger′s disease)(IgA肾病)，特发性IgA肾病，线性IgA皮肤病，急性热性中性粒细胞性皮肤病，角膜下脓疱性皮肤病，短暂性棘层松解型皮肤病，肝硬化，如原发性胆汁性肝硬化和肺硬化，自身免疫性肠病综合征，Celiac或Coeliac病，乳糜泻(celiac sprue)(麸质肠病)，难治性口炎性腹泻，特发口炎性腹泻，冷球蛋白血症，肌萎缩性侧索硬化(ALS；卢伽雷病(Lou Gehrig′s disease))，冠状动脉病，自身免疫性耳病，如自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性听力丧失，多软骨炎，如顽固性或复发的或复发性多软骨炎，肺泡蛋白沉积症，科根综合征(Cogan′s syndrome)/nonsyphilitic间质性角膜炎，贝尔氏麻痹(Bell′s palsy)，Sweet病/综合征，自身免疫性红斑痤疮，带状疱疹相关疼痛，淀粉样变性，非癌性淋巴细胞增多症，原发性淋巴细胞增多症，包括单克隆B细胞淋巴细胞增多症(例如，良性单克隆丙种球蛋白病和意义未定的单克隆丙种球蛋白病，MGUS)，周围神经病，副肿瘤综合征，通道病(channelopathies)，如癫痫、偏头痛、心律失常、肌肉疾病、耳聋、失明、周期性瘫痪和CNS通道病，自闭症，炎性肌病，局灶或节段性或局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)，内分泌眼病，葡萄膜视网膜炎，脉络膜视网膜炎，自身免疫性肝病，纤维肌痛，多发性内分泌衰竭，施密特综合征(Schmidt′s syndrome)，肾上腺炎，胃萎缩，早老性痴呆，脱髓鞘病，如自身免疫性脱髓鞘病和慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病，Dressler综合征，斑秃(alopecia greata)，全秃，CREST综合征(钙质沉着，雷诺现象(Raynaud′s phenomenon)，食管动力障碍，sclerodactyl)和毛细血管扩张)，男性和女性自身免疫性不孕，如由于抗精子抗体，混合性结缔组织病，Chagas病，风湿热，反复流产，农民肺(farmer′s lung)，多形性红斑，心切开术后综合征，库欣综合征(Cushing′s syndrome)，养鸟人肺(bird-fancier′slung)，变应性肉芽肿脉管炎，良性淋巴细胞性脉管炎，Alport综合征，肺泡炎，如变应性肺泡炎和纤维化肺泡炎，间质性肺病，输血反应，麻风病，疟疾，寄生虫病，如利什曼病，kypanosomiasis，假性血吸虫病，血吸虫病，蛔虫病，曲霉病，桑普特综合征(Sampter′ssyndrome)，卡普兰综合征(Caplan′s syndrome)，登革热，心内膜炎，心内膜心肌纤维化，弥漫性肺间质纤维化，间质性肺纤维化，肺纤维化，特发性肺纤维化，囊性纤维化，眼内炎，持久隆起性红斑(erythema elevatum et diutinum)，胎儿成红细胞增多，嗜酸细胞性筋膜炎，舒尔曼氏综合征(Shulman′s syndrome)，费尔提氏综合征(Felty′s syndrome)，flariasis，睫状体炎，如慢性睫状体炎、异时性睫状体炎、虹膜睫状体炎(急性或慢性)，或Fuch睫状体炎，Henoch-Schonlein紫癜，人类免疫缺陷病毒(HIV)感染，SCID，获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，埃可病毒感染，败血症，内毒素血症，胰腺炎，thyroxicosis，细小病毒病，风疹病毒感染，接种后综合征，先天性风疹感染，Epstein-Barr病毒感染，腮腺炎，Evan综合征，自身免疫性腺衰竭，Sydenham舞蹈病(Sydenham′s chorea)，链球菌后肾炎，血管闭塞性脉管炎(thromboangitis ubiterans)，甲状腺毒症，脊髓痨，脉络膜炎(chorioiditis)，巨细胞多肌痛，慢性过敏性肺炎，干燥性角膜结膜炎，流行性角膜结膜、特发性肾炎综合征，微小病变肾病，良性家族性和缺血再灌注损伤，移植器官再灌注，自身免疫性视网膜，关节炎症，支气管炎，慢性阻塞性气道/肺部疾病，矽肺，口疮，口疮性口炎，动脉硬化症，asperniogenese，自身免疫性溶血，博克氏病(Boeck′s disease)，冷球蛋白血症，杜皮耶伦氏挛缩症(Dupuytren′s contracture)，endophthalmia phacoanaphylactica，变应性肠炎，麻风结节性红斑，特发性面瘫，慢性疲劳综合征，febris rheumatica，Hamman-Rich病，感觉神经性听力损失(sensoneural hearing loss)，阵发性血红蛋白尿(haemoglobinuriaparoxysmatica)，性腺机能减退，节段性结肠炎(ileitis regionalis)，白细胞减少症，传染性单核细胞增多症，横贯性脊髓炎(traverse myelitis)，原发性特发性黏液性水肿，肾病，交感性眼炎(ophthalmia symphatica)，睾丸炎肉芽肿(orchitis granulomatosa)，胰腺炎，急性多发性神经根炎(polyradiculitis acuta)，坏疽性脓皮病，Quervain甲状腺炎，获得性脾萎缩(acquired spenic atrophy)，非恶性胸腺瘤，白癜风，中毒性休克综合征，食物中毒，涉及T细胞浸润的病症，白细胞黏附缺陷，与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏反应有关的免疫应答，涉及白细胞渗出的疾病，多器官损伤综合征，抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基底膜病，变应性神经炎，自身免疫性多内分泌病，卵巢炎，原发性黏液性水肿，自身免疫性萎缩性胃炎，交感神经眼炎，风湿性疾病，混合性结缔组织病，肾病综合征，胰岛炎，多内分泌障碍，自身免疫性多腺体综合征I型，成人特发性甲状旁腺功能减退症(AOIH)，心肌病，如扩张型心肌病，大疱性表皮松解症(EBA)，血色素沉着症，心肌炎，肾病综合征，原发性硬化性胆管炎，化脓性或非脓性鼻窦炎，急性或慢性鼻窦炎，筛骨、额骨、上颌骨或蝶骨鼻窦炎，嗜酸性粒细胞相关病症，如嗜酸性粒细胞增多症，肺渗入嗜酸性粒细胞增多症，嗜酸性粒细胞增多症-肌痛综合征，洛夫勒综合征(Loffler′ssyndrome)，慢性嗜酸细胞性肺炎，热带肺嗜酸性粒细胞增多症，含有嗜酸性粒细胞的支气管肺炎性曲霉病、曲霉肿或肉芽肿，过敏症，血清阴性脊柱关节炎，多内分泌自身免疫病，硬化性胆管炎，巩膜，巩膜外层，慢性黏膜皮肤念珠菌病，布鲁顿综合征，婴儿期短暂性低丙种球蛋白血症，Wiskott-Aldrich综合征，共济失调毛细血管扩张综合征，血管紧张症，与胶原病有关的自身免疫病，风湿病，神经病，淋巴结炎，血压响应降低，血管功能障碍，组织损伤，心血管缺血，痛觉过敏，肾缺血，脑缺血和伴有血管形成的疾病，变应性超敏反应病症，肾小球性肾炎，再灌注损伤，缺血性再灌注障碍，心肌或其他组织的再灌注损伤，淋巴瘤性气管支气管炎，炎性皮肤病，伴随着急性炎性成分的皮肤病，多器官衰竭，大疱性疾病，肾皮质坏死，急性化脓性脑膜炎或其他中枢神经系统炎性病症，眼和眼眶炎性病症，粒细胞输血相关综合征，细胞因子诱导的毒性，发作性睡病，急性严重炎症，慢性难治性炎症，肾盂炎，动脉内增生，消化性溃疡，瓣膜炎，移植物抗宿主病，接触性超敏反应，哮喘性气道高反应和子宫内膜异位症。
另一些方面涉及治疗或预防微生物感染和/或使用微生物抗原。待治疗或预防的微生物感染或抗原可以是与本领域已知的任何微生物感染相关的抗原，例如炭疽、宫颈癌(人乳头瘤病毒)、白喉、甲型肝炎、乙型肝炎、b型流感嗜血杆菌(Hib)、人乳头瘤病毒(HPV)、流感(Flu)、日本脑炎(JE)、莱姆病(lyme disease)、麻疹、脑膜炎球菌、猴痘、腮腺炎、百日咳、肺炎球菌、脊髓灰质炎、狂犬病、轮状病毒、风疹、带状疱疹(herpes zoster)、天花、破伤风、伤寒、结核病(TB)、水痘(Chickenpox)和黄热病。
在一些实施方案中，所述方法和组合物可以用于接种个体以预防感染。
XIII.实施例
包括以下实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应该理解，以下实施例中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，并且因此可以认为构成其实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应该理解，可以在所公开的具体实施方案中做出许多改变，并且仍然获得相同或类似的结果，而不偏离本发明的精神和范围。
实施例1-开发用于产生T细胞的3D类器官系统
用于人T细胞发育的现成3D类器官系统的开发-目的是建立经Notch配体转导的基质细胞系(如OP9-DL1系统示例的)发育成标准化人工胸腺类器官系统的能力，用于研究3D相互作用在T细胞分化和选择中的作用。OP9-DL1细胞在长期培养中不稳定，然而，每隔几天需要细胞更换以维持T支持潜能并防止脂肪形成转化。由于3D培养需要稳定数周，因此需要确定允许延长的完整培养的培养物和细胞组分。此外，OP9-DL1系统的效力对胎牛血清(FCS)批次中的生物学变异高度敏感，因此我们还尝试确定可重复支持T细胞分化的无血清培养条件。
发现补充有无血清B27添加物、FLT3L、IL-7和抗坏血酸的RPMI(以下称为RB27)促进OP9-DL1系统内的T细胞分化，达到与标准血清条件类似的程度，但是基质细胞活力和造血细胞扩增低。相比之下，MS-5鼠骨髓基质细胞系在RB27中保持长期存活，然而如预期的不支持T细胞分化。因此，我们用全长人DLL1 cDNA转导MS-5细胞(以下称MS5-hDLL1)以产生在RB27中具有长期稳定性的T支持细胞系。相对于DLL1，选择DLL1是因为已经证明了其是人胸腺中表达的生理学相关的Notch配体。为了测试在这些条件下的T细胞分化，对脐带血(CB)CD34+HSPC进行CD3+细胞的FACS耗尽并接种到MS5-hDLL1单层上。无血清RB27中的MS5-hDLL1共培养物支持来自CB HSPC的T谱系定型和早期T细胞分化。与在标准培养条件下的OP9-DL1系统相比，MS5-hDLL1上的造血细胞扩增较低，但是系统之间T细胞分化的纯度和程度类似。MS5-hDLL1支持T细胞前体的β-选择，得到少量的CD3+TCRαβ+细胞，然而正如在OP9-DL1系统中那样，存在DP阶段中的大量停滞，表明受损的正选择)。
我们接下来使用MS5-hDLL1/无血清RB27来产生标准化3D人工胸腺类器官(ATO)系统。为了产生ATO，将MS5-hDLL1细胞与T细胞耗尽的人脐带血(CB)CD34+HSPC聚集。为了最大限度地提高可及性和可重复性，我们避免使用专有的支架材料或外源性ECM，而采用改编自鼠再聚集的胸腺器官培养物(RTOC)的离心再聚集方法。因为来自RTOC的数据已证明气液界面培养增强了T细胞发育，所以在市售0.4umtranswell插入物上部署ATO，其底部允许与培养基接触并且顶部与空气接触。与需要将造血细胞连续转移至新的基质层的单层共培养不同，ATO完整培养至多10周，唯一的干预是每周两次来自插入物周围的培养基和细胞因子更换。一旦部署，ATO就形成了聚集的(cohesive)3D结构。ATO到第2周时在光学显微镜下是高度细胞化的，并且在第10周时在外观上保持稳定。在一些实施方案中，结构被封装。
与OP9-DL1或MS5-hDLL1单层共培养物相比，用CB CD34+CD3-HSPC开始的ATO显示T谱系分化的加速动力学。第2周ATO中的T谱系定型以T定型CD34+CDla+CD7+早期胸腺祖细胞(ETP)表型以及重叠的pro-T1和pro-T2表型的明显出现为标志。如预期的，在用亲本MS-5细胞系产生的类器官中未观察到CD34+CD1a+CD7+ETP阶段以外的T细胞分化，其反而支持髓样细胞和B细胞发育。在ATO内，CD34-CD7+CD5+CD4-CD8-(“双阴性”，DN)T细胞前体代表了第2周的大多数细胞，但随后降低，相反地CD7+CD4+CD3-不成熟单阳性(ISP)和CD4+CD8+双阳性(DP)群体提高。综上所述，ATO中的早期T细胞分化是有序的并且非常类似于天然人胸腺的分化。
我们接下来检查了ATO内β-选择和正选择的效率。ATO DP前体早在第2周就表现出CD3和TCRαβ的表面表达，直到第6周其增加，表明成功运送通过β-选择。ATO中CD3+TCRαβ+DP细胞的频率与人胸腺相当，两者均高于OP9-DL1和MS5-hDLL1单层培养物。重要的是，到第4周时在ATO中出现成熟的CD3+TCRαβ+CD8+和CD4+单阳性(SP)T细胞，频率增加直到第7周，这与ATO中的功能性正选择一致。第7周ATO中CD3+TCRαβ+CD8+和CD4+SP细胞的频率分别高于样本匹配的OP9-DL1和MS5-hDLL1单层共培养物。虽然在ATO中观察到CD3+TCRαβ+CD8+和CD4+SP细胞两者，但CD8+细胞与CD4+细胞的比例高于人胸腺，表明ATO中正选择的CD8+细胞的相对优势。最后，很容易在ATO中鉴定出细胞，并且主要是CD8-CD4-，与胸腺类似。综上所述，这些数据表明，与单层共培养系统相比，ATO促进快速和稳健的T细胞分化，并极大改善了成熟人T细胞的正选择。
ATO中TCR多样性和功能性初始T细胞的产生-接下来我们测试了在ATO中产生的T细胞表达多种TCR并且是功能成熟的。在ATO中产生的CD3+CD8SP T细胞内，TCR Vβ链区段的流式细胞术分析的使用揭示了与从人胸腺分离的CD8SP细胞的分布相当的分布，这与多样化的多克隆TCR库相一致。基于CD45RO的下调和CD45RA、CD27和CCR7的上调，ATO来源的CD3+TCRαβ+SPT细胞也表现出成熟的初始表型。值得注意的是，CD3+TCRαβ+CD8和CD4SP细胞两者的一个子集是CD45RO+CD45RA-，然而这些被鉴定为从DP前体而不是记忆T细胞产生的未成熟T细胞，这是因为如CD45RO一样，它们的CD1α表达在胸腺内成熟期间和胸腺迁出(egress)之前下调。我们接下来测试了ATO来源的T细胞响应抗原刺激而经历活化和克隆扩增的能力。如所预期的，纯化的ATO来源的CD8SP T细胞响应于TCR信号转导模拟物PMA/离子霉素(ionomycin)表达干扰素γ(IFNg)，并且响应于CD3/28连接和IL-2而经历活化诱导的增殖，如通过CFSE稀释和CD25上调证明的。因此，ATO可以产生具有多种TCR库的功能性初始T细胞。
从多种造血组织的T细胞的产生-先前的报道显示，在OP9-DL1系统内，来自成人HSPC来源(包括动员的外周血)的T细胞发育非常低效。相反，分别由于淋巴定型和T细胞定型祖细胞的高频率，来自从CB和出生后的胸腺分离的CD34+HSPC的T细胞发育可能特别有效。因此，我们测试了ATO支持来自从外周血、G-CSF动员的外周血和稳态成人骨髓分离的纯化CD34+HSPC的T细胞细胞发育的能力。我们发现ATO中的T细胞发育从分析的所有来源进行，具有与脐带血类似的效率，并导致类似数目的成熟CD4+和CD8+T细胞。此外，从脐带血、骨髓和动员的外周血中高度富集造血干细胞的纯化的CD34+Lin-CD38-CD45RA-HSPC以类似的效率产生T细胞。因此，ATO允许从临床相关的HSPC来源发育，并且，并且也可以作为研究来自多种干细胞和祖细胞类型的T谱系潜能和T细胞分化的有价值的研究工具。
ATO的结构方面-我们接下来检查了ATO中T细胞分化的结构方面。第2至6周之间的ATO的系列苏木精和伊红(H&E)切片显示紧密和细胞组织样组织。CD3的免疫荧光染色表明CD3+细胞优先在ATO的外缘形成致密簇。因此，ATO中的T细胞发育发生在促进多个造血细胞之间的细胞-细胞接触的细胞结构内，类似于人胸腺内的条件。
ATO中经改造抗原特异性T细胞的分化和等位基因排斥-外周血T细胞中对癌症相关或病毒肽-MHC(pMHC)复合物具有特异性的TCR的强迫表达是抗肿瘤抗病毒免疫治疗的有前途的方式。与外周T细胞的TCR转导相比，由HSPC的从头产生抗原特异性T细胞可以提供在安全性和效力方面的显著优势。由于在ATO中产生了功能性T细胞，我们测试了系统从CD34+HSPC产生经TCR改造的抗原特异性T细胞的能力。
用先前表征的对由HLA-A*0201表示的癌症相关NY-ESO-1157-165肽具有特异性的慢病毒TCRαβ构建体转导来自健康供体的脐带血CD34+HSPC。使用HLA-A*0201/NY-ESO-1157-165四聚体和针对经转导的Vβ13.1区段的抗体监测ATO中抗原特异性细胞的分化。在ATO中，在第3周初始分析时有明显的四聚体阳性细胞分化，所有这些都是Vβ13.1和表面CD3阳性的。有趣的是，CD3和经转导的TCR的共表达首先在CD34-CD7+CD5+DN细胞以及CD4ISP样和DP样T细胞前体中看到，然而从第4至6周开始逐渐局限于DP和CD8SP群体。这与功能性TCR的存在下DN阶段β选择的旁路一致然后相对保留的分化和适当的MHC I类限制性正选择相一致。相比之下，来自对照ATO的模拟转导的细胞证明在DP阶段CD3和TCRαβ正常表达，随后是CD8+和CD4+T细胞的正选择。这些观察结果与通过转基因TCR的内源TCR α和β基因座的等位基因排斥一致。实际上，＞95％的四聚体+CD3+CD8SP细胞表达经转导的Vβ13.1区段以排除替代区段。
我们接下来证实了ATO来源的抗原特异性T细胞在功能上是成熟的。与来自模拟转导ATO的CD8SP T细胞一样，四聚体+CD8SP细胞表现出熟化为初始CD45RA+CD45RO-CD1a低CD27+CCR7+表型。如在对照ATO那样，残留的CD45RO+细胞是CD1a+，与最近从DP库中的出现相一致而不是活化/记忆表型。分选四聚体+CD8SP T细胞(或来自模拟转导的ATO的等同的TCRαβ+CD8SP细胞)并暴露于共表达HLA-A*0201、β-2-微球蛋白、CD80和NY-ESO-1157-165(ESO+)或来自MART-1的无关对照肽(MART1+)的基于K562的人工抗原呈递细胞(aAPC)。如预期的，抗原特异性T细胞响应于ESO+而不是MART1+aAPC产生干扰素γ并脱颗粒(如以LAMP1/CD107a的膜运输为标志)。来自模拟转导的ATO的T细胞不经历响应于任一aAPC的显著的活化。抗原特异性T细胞还响应ESO+aAPC而经历增殖。由aAPC介导的持续体外扩增可以维持超过14天。最后，当用NY-ESO-1而不是MART1肽脉冲的HLA-A*0201+K562靶细胞攻击时，aAPC致敏的抗原特异性T细胞表现出抗原特异性肿瘤细胞杀伤。综上所述，ATO为从头产生和操作功能性抗原特异性T细胞提供了一个稳健的系统。
已证明ATO可以被操纵来专门研究和增强正选择的过程。胸腺中的正选择通过发育中的胸腺细胞与皮质上皮细胞(cTEC)的相互作用而发生。在缺少cTEC的ATO中，假设正选择是通过与自体造血细胞上的自身MHC的相互作用介导的。为了测试这一点，将来自HLA-A*0201阳性和阴性供体的CB HSPC如上所述用HLA-A*0201/NY-ESO-1157-165特异性TCR转导，并在ATO中分化成T细胞。使用该模型，我们发现除了诱导与增强的正选择相关的定量变化(如CCR7上调)以外，供体HLA-A*0201还提高了CD8SP细胞的百分比。有趣的是，ATO中MS5-hDLL1基质细胞中HLA-A*02：01的异位表达适度地增强了HLA-A*02：01阴性供体ATO中的CD8SP的百分比，并极大增强了具有HLA-A*02：01+供体HSPC的ATO中的百分比。这表明可以通过用人HLA进行转导来操纵ATO以增强正选择的抗原特异性T细胞的产生，并且将ATO与同种异体TCR和经MHC转导的基质组合使用提供了用于人T细胞中正选择的机制研究的精确限定的系统。
实施例2-人工胸腺类器官诱导来自人工血干细胞的经TCR改造T细胞的正选择和等位基因排斥
经改造T细胞治疗为治疗癌症和慢性病毒感染提供了前所未有的机会。从造血干细胞和祖细胞(HSPC)直接产生经改造T细胞的能力具有克服与使用外周血T细胞有关的关键治疗限制(包括同种异体反应性)的潜能。在此描述的是临床相关的人工胸腺类器官(ATO)系统，其支持来自脐带血、骨髓和外周血HSPC的天然和经TCR改造人T细胞的高效体外分化和正选择。ATO来源的T细胞表现出初始表型、多样化TCR库和TCR依赖性活化和增殖。ATO来源的经TCR改造T细胞还熟化为初始表型，并且还表现出几乎完全缺少内源性TCR表达，这与等位基因排斥的诱导一致。因此，ATO提供了用于产生用于过继性细胞治疗的初始、非同种异体反应的经改造T细胞的简单和直接的方法。
使用经改造以表达抗原特异性T细胞受体(TCR)的T细胞的过继性细胞治疗为恶性肿瘤和慢性病毒感染提供了靶向且可能根治的治疗。目前的策略依赖于成熟循环T细胞的遗传修饰和离体扩增。这些方法具有关键的治疗局限性，包括再输注后有限的体内活性以及转导的和内源性TCR链之间的错配，具有降低的抗原特异性反应性或诱导自身免疫性的可能性。此外，内源性TCR表达所赋予的同种异体反应性限制了使用自体T细胞的大多数方法，这可能最终通过提高的成本、受限的生产能力和淋巴细胞减少症中患者不合格性来限制治疗的获得。来自造血干细胞和祖细胞(HSPC)的经改造T细胞的体外产生有可能通过同时允许从头产生初始抗原特异性T细胞和通过等位基因排斥抑制内源性TCR表达来解决这些问题。
由于胸腺中T细胞发育的时空复杂性，迄今为止体外T细胞分化方法不能完全重现人T细胞发育。这种方法的一个主要进展是发现用Notch配体转导的鼠基质细胞系可以支持来自鼠或人HSPC的体外T细胞分化，如在经典的OP9-DL1共培养系统中所证明的。在这种和类似的单层系统中，人HSPC经历T谱系定型和早期T细胞分化。然而，具有有效重排的TCR的T细胞前体的正选择受损，并且可以看到最小限度地成熟为CD8+或CD4+单阳性(SP)T细胞。发明人和其他人已经表明，使用鼠或人胸腺组织的三维(3D)类器官系统支持体外人T细胞的改善的正选择和成熟。然而，由于细胞输出低、实验变异性高以及对原代胸腺组织的依赖性，这些系统不适合用于治疗应用的T细胞的产生。发明人因此追求开发一种人工类器官系统，其能够支持来自HSPC的人T细胞的分化和正选择，同时保留关键的转移特性，例如标准化组分、再现性和可扩展性。
在本实施例中描述了基于经DLL1转导的基质细胞系和无血清现成组分的人工胸腺类器官(ATO)系统的开发。与单层系统相比，ATO支持来自人脐带血、骨髓和外周血CD34+HSPC的人CD3+TCRαβ+CD8SP和CD4SP T细胞的稳健体外分化、正选择和成熟。ATO来源的成熟T细胞表现出抗原初始表型、多样化TCR库和响应于抗原刺激的活化/增殖。ATO还支持来自用对肿瘤相关抗原NY-ESO-1具有特异性的HLA-A*02：01限制性TCR转导的HSPC的抗原特异性经TCR改造T细胞的高效分化。ATO来源的经改造T细胞表现出初始表型，并且经历了抗原特异性活化和细胞毒性致敏。在ATO基质细胞中，通过同源主要组织相容性复合物(MHC)的表达进一步增强了经TCR改造T细胞的正选择。最后，在ATO中产生的经TCR改造T细胞表现出几乎完全缺少内源性TCR表达，与发育期间等位基因排斥的诱导一致，并且暗示了产生用于过继性细胞治疗的非同种异体反应性经改造T细胞的直接和有效的方法。
A.结果
1.用于体外人T细胞分化的优化的人工胸腺类器官系统的开发
一个目标是开发可支持来自HSPC的人T细胞的体外正选择和熟化的临床可转移的类器官系统。为了避免使用原代胸腺组织，测试了经DLL1转导的基质细胞系在3D类器官培养物中支持人T细胞发育的能力。由于发明人和其他人已经观察到OP9-DL1系统中的T细胞分化取决于胎牛血清的特定批次和基质细胞的频繁更换而高度可变，所以本发明人还试图鉴定能够一致地支持类器官培养物中的T细胞分化的无血清条件。为了避免使用专有的支架材料，本发明人使用了显示在基于胸腺组织的类器官中有效的压实再聚集技术，其中基质细胞通过离心与HSPC聚集并且部署在空气-流体界面处的细胞培养插入物上(图3A)。在这些3D培养物中，本发明人鉴定了用人DLL1转导的MS-5鼠骨髓基质细胞系(以下称为MS5-hDLL1)稳健支持来自T细胞耗尽的CD34+脐带血(CB)HSPC的人T细胞分化。此外，本发明人鉴定了补充有B27(用于神经元和胚胎干细胞培养物中的多组分添加剂)以及FLT3L、IL-7和抗坏血酸的RPMI(下文称为“RB27”)为一致地支持MS5-hDLL1类器官培养物中的稳健人T细胞分化的新的无血清培养基。
这种优化的人工胸腺类器官(ATO)系统诱导来自CB CD34+CD3-HSPC的快速且稳健的T谱系定型，如通过到第2周时CD5+CD7+细胞的优势以及CD4ISP和CD4+CD8+(DP)细胞的出现所示的(图3B)。成熟的CD3+TCRαβ+细胞早在第2周出现，并且随时间增加，在第6周达到25％的平均值(图3B和G)。CD3+TCRαβ+细胞在早期时间点主要是DP，但逐渐成熟为CD8SP，以及较小程度的CD4SP T细胞，与ATO中的正选择一致。
即使在长期培养中，ATO也能从原代祖细胞持续进行T细胞分化。在6周时，存在胸腺T细胞祖细胞的所有三个表型阶段，包括多能CD34+CD7-CD1a-早期胸腺祖细胞(ETP)以及下游CD34+CD7+CD1a-和CD34+CD7+CD1a+T谱系祖细胞(FIG 3C)。基于另一种分类方案，在CD34+级分中还鉴定了原T1和原T2祖细胞表型(图3C)。CD19+B细胞频率随时间降低，NK和髓细胞频率始终很低(图3B、F-G)。ATO的组织学切片显示具有丰富的淋巴细胞的密集的组织样构造(数据未示出)，其簇集对CD3呈阳性(图3D)。在第6周时，ATO中细胞扩增相对于输入HSPC为平均80倍(图3E)，并且尽管在不同的生物学CB单位之间观察到扩增的变化，但从所有样品一致地产生了前体和成熟T细胞(n＝18)(图3G)。总细胞增殖也与起始细胞数目和HSPC与基质细胞的比例成反比，在一些组合中，相对于输入HSPC提高高达800倍(图9A、B)。在整个技术重复(n＝11)和不同批次的B27(n＝4)中观察到细胞扩增和T细胞分化的高再现性(图10A-C)。使用补充有无异源B27(含有人血清白蛋白)的培养基(图10D-E)或用经辐照的基质细胞制备的培养基(图10F-B)在ATO中观察到相当的T细胞分化，这对于临床转移具有重要意义。
当与使用相同供体CB HSPC的OP9-DL1单层培养系统比较时，ATO显示明显优良的CD3+TCRαβ+T细胞的产生(图11A-C)。与先前的报道一致，OP9-DL1单层支持有效的T谱系定型(CD7+CD5+)和通过ETP、pro-T和CD4ISP阶段的进展，但DP、CD3+TCRαβ+和成熟SP细胞的低效产生，而所有这些都很容易在ATO中发育(图11B-C)。事实上，最佳的正选择和成熟需要ATO系统的所有三个组分：3D结构、MS5-hDLL1基质细胞和RB27培养基(图11A)。与MS5-hDLL1相比，OP9-DL1在RB27中存活较差，并且在类器官培养物中显示对T细胞分化的支持较差。缺少DLL1表达的亲本MS-5细胞系不支持单层或3D培养物中的T细胞发育(图11A)。
总之，ATO提供了标准化的无血清类器官系统，其支持来自CD34+HSPC的稳健的和可再现的T细胞分化，允许人TCRαβ+和TCRγδ+T细胞的正选择和熟化。
2.ATO中胸腺初始T细胞发育的重演
接下来将长期ATO中的T细胞分化与出生后人胸腺中的进行比较。第12周，CB ATO显示与胸腺类似的频率的T谱系定型(CD5+CD7+)和CD34+T细胞祖细胞(图4A)，而DP和SP频率表明在第12周ATO中T细胞成熟比胸腺中更高级(图4A)。如在胸腺中一样，ATO中的大多数CD3+细胞是TCRαβ+，具有较小但一致的TCRγδ+群体(图4A)。在ATO来源的CD3+TCRαβ+细胞中，成熟CD8SP和CD4SP T细胞的产生在第6至12周之间增加(图4B和图12A)。与胸腺相反，ATO显示出相对于CD8SP T细胞明显较少比例的CD4SP T细胞，可能反映了CD4+T细胞发育的较慢的动力学；直到分析的最远时间点第12周，CD4+细胞的频率继续增加(图4B和图12A)。
如在胸腺中一样，ATO来源的CD3+TCRαβ+CD8SP和CD4SP T细胞从“未成熟初始”(CD45RA-CD45RO+CD27+CCR7-CD1Ahi)转变为“成熟初始”(CD45RA+CD45RO-CD27+CCR7+CD1alo)表型(图4C和图12A-C)。在ATO中，这发生在第6至12周之间，并且导致第12周ATO中成熟初始T细胞的频率高于胸腺中(图4C和图12B-C)。未成熟和成熟初始亚型共表达CD62L和CD28，亚型共表达CD127和CD31，后者与血液中最近的胸腺迁出T细胞相关(图12B-C)。活化标志物CD25在ATO来源的CD8SP T细胞上不表达，但在CD4SP T细胞亚群上观察到(图12B-C)。总之，这些数据显示，与人胸腺相比，ATO中T细胞分化的显著的保真度，最终出现类似于胸腺和血液中发现的真实初始T细胞。
3.来自多个HSPC来源和亚群的T细胞分化
从所有临床相关的HSPC来源，即成入骨髓(BM)、G-CSF动员的外周血(MPB)和未动员的外周血(PB)中观察到具有类似频率的前体和CD3+TCRαβ+T细胞的有效T细胞分化(图5A-B和图13A、B)。不同HSPC来源的总细胞扩增也相当(图13C)。来自CB、BM或MPB的高度富集的造血干细胞(HSC)级分(Lin-CD34+CD38)显示出类似的稳健T细胞分化(图5C-D和图13D-E)，表明来自这些来源的T细胞潜能不依赖于已存在的淋巴定型祖细胞。
ATO中的T细胞分化也从纯化的淋巴祖细胞启动。在三周时，与HSC或未分级的CD34+HSPC相比，成人BM淋巴致敏的多能祖细胞(LMPP)和CD24-共同淋巴祖细胞(CLP)更快且更有效地分化通过CD4ISP和DP阶段(图5E-F)。相比之下，主要具有B细胞和NK细胞潜能的CD24+CLP在ATO中生长不良并且具有低的细胞输出(图13F)。因此，ATO可以作为评估来自人干细胞和祖细胞群体的T谱系潜能的工具。
4.ATC来源的T细胞的TCR多样性和功能
本发明人接下来表征了ATO中产生的成熟T细胞的TCR多样性和功能。对于共同TCRVβ区段，ATO来源的CD3+TCRαβ+CD8SP T细胞的流式细胞术揭示了与来自人胸腺的相应CD8SP T细胞显著类似的多样性(图6A)。重要的是，既没有观察到偏斜的Vβ使用也没有观察到克隆选择，分别反对ATO中非常规T细胞亚群或克隆扩增的成熟T细胞的优势。
ATO来源的CD8SP T细胞响应于PMA/离子霉素而表现出强的IFNγ和低的IL-4产生，与细胞毒性表型一致(图6B)。CD4SP细胞产生IFNγ+和IL-4+细胞两者，分别与Th1和Th2极化一致；以及响应于刺激产生少量DP细胞，与其未成熟状态一致(图6B)。ATO来源的CD8SP细胞也响应于抗CD3/CD28抗体和IL-2而经历增殖和CD25的上调(图6C)。此外，由CB、BM或MPB ATO产生的CD8SP细胞表现出响应于PMA/离子霉素的IFNγ的类似产生(图6D)，以及使用抗CD3/CD28和IL-2的体外扩增(图6E)。总之，在ATO中产生的成熟T细胞表现出生理学TCR多样性和对抗原刺激的功能响应。
5.ATO中初始经TCR改造T细胞的产生
本发明人接下来将ATO调整用于从HSPC体外产生经TCR改造T细胞。用编码对NY-ESO-1157-165具有特异性的HLA-A*02：01限制性TCR的α和β链的慢病毒载体转导CB CD34+CD3-HSPC。在6周时，经TCR转导的ATO显示出与模拟转导的对照类似的CD5+CD7+T定型细胞频率，但显著增加的CD3+TCRαβ+T细胞，其中大多数表达经转导的TCR，如通过用针对经转导的Vβ13.1链的四聚体或抗体的染色看到的(图7A)。在来自模拟转导对照的四聚体+细胞和CD3+TCRαβ+细胞之间，CD8SP细胞的频率类似，然而四聚体+CD8SP细胞显示出加速成熟为成熟初始表型(即CD45RA+CD45RO-CD27+CCR7+CD1alo)(图7A)。与未转导的ATO一样，未观察到效应子/记忆表型的分化(图7A)。
TCR转导还导致ATO中的总细胞扩增增强(图7B)，其中大部分是四聚体+CD3+T细胞。在经TCR转导的ATO中，总细胞扩增相对于输入HSPC通常为150倍(图7A)，但通过限制每ATO的起始HSPC和基质细胞数目，可以进一步提高至超过700倍(图7C)。因此，用7,500个经TCR转导的HSPC起始的单个ATO可以产生约5×106个细胞，其中约7.5×105(15％)是四聚体+CD3+CD8SP成熟初始T细胞(图7A-C)。
响应于表达同源肽-MHC和CD80的人工抗原呈递细胞而非亲本K562细胞，来自经TCR转导的ATO的ATO来源的CD8SP细胞经历了抗原特异性活化和脱颗粒，如分别通过的IFNγ产生和CD107a膜移动测量的(图7D)。此外，与来自模拟转导的ATO的那些相比，来自TCR转导的ATO的CD8SPT细胞响应于抗CD3/CD28和IL-2而经历同等的体外扩增(图7E)。
对ATO来源的经TCR改造T细胞中Vβ多样性的分析显示超过98％的四聚体+CD8SPT细胞仅表达转导的Vβ13.1区段(图7F-G)，与经TCR改造T细胞分化期间内源性TCR表达的几乎完全的的等位基因排斥一致。因此，ATO支持来自HSPC的功能性经TCR改造T细胞的稳健分化，以及TCR增强的细胞扩增的引入，并促进缺少内源性TCR表达的成熟初始T细胞的分化。
6.经MHC修饰的ATO中经TCR改造T细胞的增强的正选择
胸腺中的正选择由T细胞前体上的TCR与胸腺基质和造血细胞上的自身MHC之间的相互作用介导。因此，研究了ATO中“自身”MHC的造血或基质表达是否可以增强经TCR改造T细胞的正选择。使用HLA-A*02：01阳性或阴性供体来测试自身MHC的造血表达对ATO内正选择的影响，并且通过使用用HLA-A*02：01转导的MS5-hDLL1细胞产生ATO来测试基质细胞MHC表达(图8A)。在所有情况下，用HLA-A*02：01限制性NY-ESO-1特异性TCR转导HSPC，并且使用四聚体+CD3+CD8SPT细胞的频率作为正选择的读数。HLA-A*02：01的造血表达对四聚体+CD8SP T细胞的正选择仅产生适度影响(图8B)。相比之下，ATO基质细胞中HLA-A*02：01的表达显著增强了四聚体+CD8SP T细胞的正选择，并且与供体造血HLA-02：01表达协同(图8B)。经MHC修饰的ATO中经TCR改造T细胞也表现出更多地成熟为成熟的初始表型，包括CCR7的上调(图8C)，与增强的正选择一致。总之，包含TCR转导的HSPC和MHC转导的基质细胞的ATO是体外人T细胞正选择的建模的通用系统，以及增强用于过继性细胞治疗的体外衍生经TCR改造T细胞的正选择和成熟的简单方法。
B.评论
在体外忠实地概括胸腺生成的能力为产生具有期望治疗特性(包括抗原初始状态和缺少内源性TCR表达)的经改造T细胞创造了独特的机会。如在此使用标准化的现成组分证明的，ATO系统忠实地概括了来自HSPC的胸腺生成，最终产生了与来自胸腺或外周血的初始T细胞非常类似的成熟CD3+TCRαβ+CD8SP和CD4SP T细胞。
与现有的体外T细胞分化方法如OP9-DL1系统相比，ATO提供了独特的生物学和转移优势。首先，ATO支持人T细胞的正选择和成熟，这两者在单层系统中都受到损害。ATO中增强的正选择依赖于3D结构，因为使用相同的ATO组分建立的单层培养物导致T细胞分化效率低下。这与使用胸腺组分的FTOC或重聚集3D培养物中支持正选择(尽管低效率)一致。可能的是，3D相互作用通过增加T细胞前体与发育配体如DLL1或选择性配体如自身MHC之间的接触的价和/或持续时间来支持T细胞发育。或者，3D构造可能通过机械力和/或代谢变化来促进基质细胞和造血细胞之间的串扰或在T细胞前体上施加发育信号，而这在2D中是不可能的。
ATO系统相对于现有方法的另一个主要进展是来自临床上相关的成人HSPC来源(包括骨髓和静息或动员的外周血)的高效T细胞分化。使用OP9-DL1系统的研究显示来自CB、BM或MPB16-19的TCRαβ+T细胞的低效发育，并且没有报道静息外周血HSPC的数据。出生后胸腺来源的CD34+细胞中报道了OP9-DL1上改善的T细胞发育，这与通过胸腺微环境致敏这些祖细胞群一致，然而人胸腺仍然是不现实的用于治疗性转移的HSPC来源。
ATO系统还提供了技术简单性、再现性和潜在的可扩展性。使用无血清培养基避免了单层系统中利用胎牛血清所观察到的显著变异性，并且在简单培养基更换的情况下在培养期间(长达12周)维持ATO完整的能力避免了如单层系统需要的那样将细胞频繁转移到新鲜基质细胞。使用现成组分，特别地避免原代基质细胞或专有支架材料，以及将ATO生产与无异源试剂和基质细胞辐照相结合的能力，将有助于ATO转移到用于产生用于过继性治疗的T细胞的临床级平台。该系统的简单性还允许直接采用对人T细胞发育和正选择建模具有兴趣的实验室方法。
如本文所证明的，ATO系统是用于从HSPC体外产生经TCR改造的初始T细胞的高效方法。已经在OP9-DL1系统中证实了来自人HSPC的经TCR改造T细胞的分化，然而在这些情况下，CD8SP细胞的成熟受损(通常仅占培养物的0至2％)，使用胸腺来源的CD34+细胞实现最高效率。相比之下，ATO支持来自CB HSPC的经TCR改造T细胞的稳健正选择，使用MPB HSPC观察到类似的结果(未示出)。基于显示过继转移的T细胞的改善的体内存活率和活性与较少活化的表型相关的研究，ATO中实现的成熟初始T细胞表型可能是ATO来源的经改造细胞相对于经修饰外周血T细胞的明显优势。通过在基质细胞中表达同源MHC增强ATO中经改造T细胞的正选择为提高ATO来源经改造T细胞的质量和产量提供了进一步的途径。
整个T细胞分化期间ATO中经转导TCR的存在介导了内源性TCR基因座的几乎完全的等位基因排斥，与用移植的鼠和人HSPC进行的体内研究一致。经改造外周血T细胞上潜在同种异体反应性的内源性TCR的表达是可扩展的现成过继性T细胞治疗发展的主要障碍，目前需要自体经改造T细胞的劳动密集的个体化生产。开发同种异体的经改造T细胞治疗的策略包括使用基因编辑工具或病毒特异性T细胞的TCR转导破坏内源性TCR/CD3表达；然而，这两种方法都需要对基因修饰的T细胞进行大量操作和扩增，这可能会影响体内功能。因此，使用ATO从头产生初始的、等位基因排斥的经改造T细胞提供了用于产生用于过继性细胞治疗的非同种异体反应性T细胞的高效替代策略。
C.方法
1.分离人CD34+CD3-HSPC
新生儿脐带血获自UCLA的正常分娩的废弃胎盘。骨髓(BM)通过来自UCLA的同种异体BM供体收获物的废弃材料从健康成人供体获得，或购自AllCells Inc.(Alameda，CA)。G-CSF动员的外周血获自在UCLA进行单采血液成分分离用于同种异体干细胞移植捐献的同意的健康的成年供体。未动员的外周血通过UCLA CFAR Virology Core获自健康的成年供体。所有组织样品在UCLA IRB批准的方案或豁免下获得。所有样品通过Ficoll-Paque(GEHealthcare Life Sciences，Pittsburgh，PA)梯度离心富集单核细胞，然后使用CD34MicroBead Kit UltraPure(Miltenyi，Auburn CA)通过磁性细胞分选(MACS)进行CD34+细胞的正选择。除非另有说明，否则将富含CD34+细胞的级分在MACS后冷冻保存。在使用之前，将细胞解冻并且通过分选CD34+CD3-细胞通过FACS排除残余T细胞，将其立即接种到ATO中或如下所述进行转导。在一些实验中，HSC在接种到ATO中之前通过FACS分选来富集Lin-CD34+CD38-细胞。HSPC的HLA分型由UCLA Immunogenetics Center使用高分辨率序列特异性寡核苷酸(SSO)珠进行。
2.分离人骨髓祖细胞亚群
如上所述从新鲜BM抽吸物中富集CD34+HSPC，并且立即通过FACS分选干/祖细胞群体，其基于与以下标志物的组合的CD45的阳性表达和缺少谱系标志物(CD3、CD14、CD19、CD56和CD235a；“Lin-“)的表达：总HSPC(CD34+)、HSC(CD34+CD38-CD45RA)、LMPP(CD34+CD38+CD45RA+CD10-CD62Lhi)、CD24-CLP(CD34+CD38+CD45RA+CD10+CD24-)和CD24+CLP(CD34+CD38+CD45RA+CD1O CD24+)。
3.分离人胸腺细胞
在IRB豁免下获得作为来自在洛杉矶儿童医院(Children’s Hospital LosAngeles，CHLA)经历心脏外科手术的患者的废弃物的出生后人胸腺。将胸腺碎片在RPMI中精细切碎，并通过吸取将胸腺细胞释放到悬液中，然后通过70μm尼龙过滤器。将细胞在同一天新鲜分析或第二天进行分析。胸腺和ATO来源的T细胞祖细胞的流式细胞术分析使用以下表面表型：早期胸腺祖细胞(ETP；CD34+CD7-CD1a-)、CD1a-pro-T(CD34+CD7+CD1 a-)和CD1a+原T(CD34+CD7+CD1a+)；或CD5-pro-T(pro-T1；CD34+CD7+CD5-)和CD5+pro-T(pro-T2；CD34+CD7+CD5+)。将胸腺和ATO来源的T细胞和前体定义为与以下表型组合的CD14-CD56-：总T谱系细胞(CD7+CD5+)、双阴性(DN；CD4-CD8-)、CD4未成熟单阳性(CD4ISP；CD5+CD4+CD3)、双阳性(DP；CD4+CD8+)、CD8SP(CD3+TCRαβ+CD8+CD4-)、CD4SP(CD3+TCRαβ+CD8-CD4+)、未成熟初始(为CD8SP或CD4SP的CD45RA-CD45RO+)、成熟初始(为CD8SP或CD4SP的CD45RA+CD45RO-)。通过CD1a、CD27、CD28和CCR7共染色证实未成熟和成熟的初始表型。
4.细胞系
MS-5鼠基质细胞系通过惠赠获得。为了产生MS5-hDLL1，用编码人DLL1和GFP的慢病毒载体转导MS-5细胞。通过FACS分选最高5％的GFP表达细胞并在DMEM/10％FCS中传代。在培养数周后，通过GFP表达的流式细胞术证实稳定表达。MS5-hDLL1-A2.1细胞通过用人HLA-A*02：01慢病毒载体(由Caltech的David Baltimore博士惠赠)转导MS5-hDLL1细胞，然后使用识别人HLA-A2的抗体(BB7.2)(Biolegend，San Diego，CA)对经转导细胞进行FACS分选来产生。OP9-DL1细胞系由Juan Carlos 博士(University ofToronto)惠赠，并在0.1％明胶包被的瓶中在MEMα(ThermoFisher Scientific，GrandIsland，NY)/20％FBS中传代。K562细胞系获自ATCC。K562-CD80/HLA-A*02：01/NY-ESO-1aAPC细胞系由Antoni Ribas博士(UCLA)惠赠。
5.人工胸腺类器官(ATO)培养物
通过胰蛋白酶消化收获MS5-hDLL1(或MS-5或OP9-DL1，如所述的)细胞，并将其重悬浮于无血清ATO培养基(“RB27”)中，所述培养基由RPMI 1640(Corning，Manassas，VA)、4％B27补充物(ThermoFisherScientific，Grand Island，NY)、30mM在PBS中重构的L-抗坏血酸2-磷酸倍半镁盐水合物(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、1％青霉素/链霉素(GeminiBio-Products，West Sacramento，CA)、1％Glutamax(ThermoFisher Scientific，GrandIsland，NY)、5ng/ml rhFLT3L和5ng/mlrhIL-7(Peprotech，Rocky Hill，NJ)构成。RB27每周更换。在指出的实验中用4％XenoFree B27代替B27。取决于实验，将每ATO的1.5至6×105MS5-hDLL1细胞与5×102至1×105纯化的CD34+CD3-细胞(或其他他HSPC群体，如所示)在1.5ml Eppendorf管中组合并在浮桶离心机(swinging bucket centrifuge)中在4℃下以300g离心5分钟。小心除去上清液，并通过短暂涡旋使细胞沉淀重悬。对于每个ATO，将0.4μmMillicell transwell插入物(EMD Millipore，Billerica，MA；Cat.PICM0RG50)置于每孔含有1ml RB27的6孔板中。为了铺ATO，将插入物取出并放在板的边缘以排出过量的培养基。将细胞浆液调整至每ATO 5-8μl，用20μl移液管尖端吸入，并通过在移液管尖的端部处形成液滴，将液滴轻轻放置在细胞插入物来铺板。将细胞插入物放回含有1mL RB27的孔中。通过从细胞插入物周围抽吸然后用1ml新鲜RB27/细胞因子替换，每3至4天彻底更换培养基。将ATO以这种方式培养长达12周。在指定的时间，通过向每个孔加入FACS缓冲液(PBS/0.5％牛血清白蛋白/2mM EDTA)，用1ml“P1000”移液管吸取来简单地解聚ATO，然后通过70μm尼龙过滤器来收获ATO细胞。在一些实验中，在用于ATO中之前，将MS5-hDLL1细胞的单细胞悬液以指定的剂量进行γ-辐照。
6.T细胞单层共培养物
如本领域先前所述建立OP9-DL1单层培养物。简单地说，在使用前1至2天将OP9-DL1接种到0.1％明胶包被的12孔板中以实现70至80％汇合。从单层抽吸培养基并且将1×104至1.5×104纯化的CD34+CD3-HSPC铺在基质单层上，在2ml由MEMα、20％FBS、30mM L-抗坏血酸、5ng/mlrhFLT3L和5ng/ml rhIL-7构成的培养基中。在一些实验中，用MS-5或MS5-hDLL1代替OP9-DL1，用RB27代替培养基。每4至5天通过收集细胞，通过70μm尼龙过滤器过滤并重铺在新鲜培养基中来将细胞转移至新的基质细胞单层。汇合时，将细胞分到多个含有新鲜基质层的孔中。培养物维持长达10周。
7.慢病毒载体和转导
通过RT-PCR将人DLL1的全长编码序列从人通用参考RNA集(AgilentTechnologies，Santa Clara，CA)克隆到第三代慢病毒载体pCCL-c-MNDU3-X-IRES-eGFP(由UCLA的Donald Kohn博士惠赠)中。HLA-A*02：01慢病毒载体pHAGE6-HGHSS-HLAA2.1-IRES-ZsGreen由David Baltimore博士(Caltech)惠赠。编码对HLA-A*02：01/NY-ESO-1157-165具有特异性的密码子优化的TCR的α和β链的第三代慢病毒载体先前已描述，并且由AntoniRibas博士(UCLA)惠赠。如前所述进行慢病毒颗粒的包装和浓缩。简单地说，使用TransIT293T(Mirus Bio，Madison，WI)，用慢病毒载体质粒pCMV-ΔR8.9和pCAGGS-VSVG共转染293T细胞(ATCC)17小时，随后用20mM丁酸钠处理8小时，随后在无血清UltraCulture中产生细胞上清液48小时。根据制造商的方案，使用AmiconUltra-15100K过滤器(EMD Millipore，Billerica，MA)通过切向流过滤浓缩上清液，并储存在-80℃。对于HSPC转导，将1×105至1×106FACS分选的CD34+CD3-HSPC铺在6孔未处理的板中12至18小时，所述板用补充有50ng/ml重组人SCF、FLT3L和TPO以及10ng/ml IL-3(Peprotech，Rocky Hill，NJ)的1ml X-VIVO-15(Lonza，Basel，Switzerland)中的20μg/ml Retronectin(Clontech，Mountain View，CA)包被，然后以100的感染复数(MOI)加入浓缩的慢病毒上清液。模拟转导的细胞在相同的条件下培养，但不添加载体。转导后24小时收集细胞、洗涤并接种到ATO中。除非指出，否则经TCR转导的HSPC来自HLA-A*02：01+CB单元。
8.免疫组织化学
对于苏木精和伊红(H&E)图像，将ATO包埋在Histogel(ThermoFisherScientific，Grand Island，NY)中并在10％中性缓冲福尔马林(ThermoFisherScientific，Grand Island，NY)中固定过夜。通过UCLA Translational Pathology CoreLaboratory(TPCL)进行5μm切片和H&E染色。对于免疫荧光成像，通过用解剖刀切割每个ATO周围的培养插入物，然后将膜和ATO包埋在Tissue-Tek OCT(VWR Radnor，PA)中并在干冰上冷冻来分离ATO。将5μm冷冻切片在10％中性缓冲的福尔马林中固定，并在4℃下以1∶50稀释度用抗CD3(克隆UCHT1；Biolegend，San Diego，CA)染色过夜，然后在室温下用AlexaFluor594缀合的抗小鼠IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)孵育。利用AxioCamMRM和AxioVision 软件(Zeiss，Jena，Germany)在Zeiss AzioImager M2上获取H&E和免疫荧光图像。
9.细胞内细胞因子染色
使用抗CD8和抗CD4抗体通过FACS分选来自ATO的CD8SP、CD4SP或DP细胞，并铺在具有5％热灭活的人AB血清(Gemini Bio-Products，West Sacramento，CA)的200μl AIM V(ThermoFisher Scientific，Grand Island，NY)中的96孔U底板中。将PMA/离子霉素/蛋白质转运抑制剂混合物或对照蛋白转运抑制剂混合物(均来自eBioscience，San Diego，CA)加入到每个孔中并孵育过夜。在用细胞内染色缓冲液试剂盒(eBioscience，San Diego，CA)固定和透化之前，对细胞的CD3、CD4和CD8(Biolegend，San Diego，CA)和UV455可固定存活染料(eBioscience，San Diego，CA)染色，并用抗IFNγ和IL-4的抗体(Biolegend，SanDiego，CA)进行细胞因子染色。
10.T细胞活化和增殖测定
对于CFSE增殖测定，通过FACS分选ATO来源的CD8SP T细胞，并根据制造商的方案用5μM CFSE(Biolegend，San Diego，CA)标记。将标记的细胞用补充有5％AB血清和20ng/mlrhIL-2(Peprotech，Rocky Hill，NJ)或单独IL-2的AIM V中的抗CD3/CD28珠(ThermoFisherScientific，Grand Island，NY)孵育，在第5天对CD25共染色(Biolegend，San Diego，CA)并通过流式细胞术进行分析。对于体外细胞扩增测定，将1×104FACS分选的ATO来源的CD8SPT细胞铺在补充有20ng/ml rhIL-2和1×抗CD3/CD28四聚体抗体复合物(Stem CellTechnologies，Vancouver，BC，Canada)的200μl Immunocult XF培养基(Stem CellTechnologies，Vancouver，BC，Canada)中的96孔U底板中。每2至3天添加新鲜培养基和细胞因子，根据需要重铺在更大的孔中。在第7天和第14天添加新鲜的抗CD3/CD28。每周用血细胞计数仪对细胞计数。
11.人工APC(aAPC)CTL致敏测定
从第6周的TCR转导的ATO中分选5×104个总ATO来源的CD8SP T细胞，并与表达CD80和HLA-A*02：01/B2M/NY-ESO-1157-165单链三聚体的基于K562的aAPC(由UCLA的AntoniRibas博士惠赠)或亲本K562细胞以5∶1T细胞：K562比例在200ul AIM V/5％人AB血清中的96孔U底板中共培养过夜。以1∶50的最终稀释度将CD170a-APC抗体(Biolegend，San Diego，CA)与蛋白质转运抑制剂混合物(eBioscience，San Diego，CA)一起添加到孔中，用于最后4小时培养，随后如上所述进行固定、透化和细胞内细胞因子染色。
12.TCR Vβ分析
与IOTest Beta Mark TCR V试剂盒(Beckman Coulter，Indianapolis，IN)结合，对来自第7周ATO或出生后胸腺的总细胞进行CD3、CD4、CD8和TCRγδ染色。对CD3+TCRgd-CD8+CD4-细胞设门用于Vβ分析。对于经TCR转导的ATO，第6周的总ATO细胞还用APC缀合的HLA-A*02：01/NY-ESO-1157-165四聚体(MBL International，Woburn，MA)标记，并对CD3+TCRγδ-四聚体+CD8+CD4-设门用于Vβ分析。
13.流式细胞术和抗体
所有流式细胞术染色在PBS/0.5％BSA/2mM EDTA中在冰上进行30分钟。在抗体染色前，将FcX(Biolegend，San Diego，CA)添加到所有样品中5分钟。对于四聚体共染色，在室温下将PE或APC缀合的四聚体(MBL International，Woburn，MA)以1∶50的最终稀释度添加到细胞中10分钟，然后在冰上添加抗体额外20分钟。在分析之前将DAPI添加到所有样品中。在LSRII Fortessa上进行分析，并在UCLA Broad Stem Cell Research Center FlowCytometry Core的ARIA或ARIA-H仪器(BD Biosciences，San Jose，CA)上进行FACS。对于所有分析，对DAPI+细胞设门，并且基于FSC-H vs.FSC-W和SSC-H vs.SSC-W对单细胞设门。用于表面和细胞内染色的抗体克隆获自Biolegend(San Diego，CA)：CD1a(HI149)、CD3(UCHT1)、CD4(RPA-T4)、CD5(UCHT2)、CD8(RPA-T8)、CD10(6H6)、CD14(M5E2)、CD19(HIB19)、CD24(ML5)、CD25(BC96)、CD27(O323)、CD28(CD28.2)、CD31(WM59)、CD34(581)、CD38(HIT2)、CD45(HI30)、CD45RA(HI100)、CD45RO(UCHL1)、CD56(HCD56)、CD107a(H4A3)、CD127(A019D5)、CD235a(HI264)、CCR7(G043H7)、HLA-A2(BB7.2)、干扰素γ(4S.B3)、IL-4(MP4-25D2)、TCRαβ(IP26)、TCRγδ(B1)、Vβ13.1(H131)、人谱系混合物(CD3、CD14、CD19、CD20、CD56)；或者BD Biosciences(San Jose，CA)：CD7(M-T701)和CD62L(DREG-56)。
实施例3：人工胸腺类器官诱导来自人工血干细胞的经TCR改造T细胞的正选择和等位基因排斥
经改造T细胞治疗为治疗癌症和慢性病毒感染提供了前所未有的机会。从造血干细胞和祖细胞(HSPC)直接产生经改造T细胞的能力具有克服与使用外周血T细胞有关的关键治疗限制(包括同种异体反应性)的潜能。本实施例描述了临床相关的人工胸腺类器官(ATO)系统，其支持来自脐带血、骨髓和外周血HSPC的天然和经TCR改造人T细胞的高效体外分化和正选择。ATO来源的T细胞表现出初始表型、多样化TCR库和TCR依赖性活化和增殖。ATO来源的经TCR改造T细胞还成熟为初始表型，而且在体外和体内表现出抗原特异性肿瘤杀伤，并且几乎完全缺少内源性TCR Vβ表达，这与等位基因排斥的诱导一致。因此，ATO提供了用于产生用于过继性细胞治疗的初始且潜在的非同种异体反应的经改造T细胞的有效方法。
使用经改造以表达抗原特异性T细胞受体(TCR)的T细胞的过继性细胞治疗为恶性肿瘤和慢性病毒感染提供了靶向且可能根治的治疗。目前的策略依赖于成熟循环T细胞的遗传修饰和离体扩增。这些方法具有多种治疗局限性，包括再输注后有限的体内活性以及转导的和内源性TCR链之间的错配，具有降低的抗原特异性反应性或诱导自身免疫的可能性。此外，内源性TCR表达所赋予的同种异体反应性限制了使用自体T细胞的大多数方法，这可能最终通过提高的成本、受限的生产能力和淋巴细胞减少症中患者不合格性来限制治疗的获得。来自造血干细胞和祖细胞(HSPC)的经改造T细胞的体外产生有可能通过同时允许从头产生初始抗原特异性T细胞和通过等位基因排斥抑制内源性TCR表达来解决这些问题。
由于胸腺中T细胞发育的时空复杂性，迄今为止体外T细胞分化方法不能完全重现人T细胞发育。这种方法的一个主要进展是发现用Notch配体转导的鼠基质细胞系可以支持来自鼠或人HSPC的体外T细胞分化，如在经典的OP9-DL1共培养系统中所证明的。在这种和类似的单层系统中，人HSPC经历T谱系定型和早期T细胞分化。然而，具有有效重排的TCR的T细胞前体的正选择受损，并且可以看到最小限度地成熟为CD8+或CD4+单阳性(SP)T细胞。发明人已经表明，使用鼠或人胸腺组织的三维(3D)类器官系统支持体外人T细胞的改善的正选择和成熟。然而，由于细胞输出低、实验变异性高以及对原代胸腺组织的依赖性，这些系统不适合用于治疗应用的T细胞的产生。发明人因此追求开发一种人工类器官系统，其能够支持来自HSPC的人T细胞的分化和正选择，同时保留关键的转移特性，例如标准化组分、再现性和可扩展性。
本实施例显示了基于DLL1转导的基质细胞系和无血清现成成分的人工胸腺类器官(ATO)系统的开发。与单层系统相比，ATO支持来自人脐带血、骨髓和外周血CD34+HSPC的人CD3+TCRαβ+CD8SP和CD4SP T细胞的稳健体外分化、正选择和成熟。ATO来源的成熟T细胞表现出抗原初始表型、多样化TCR库和响应于抗原刺激的活化/增殖。ATO还支持来自用对肿瘤相关抗原NY-ESO-1具有特异性的HLA-A*02：01限制性TCR转导的HSPC的经TCR改造的抗原特异性T细胞的高效分化。在ATO基质细胞中，通过同源主要组织相容性复合物(MHC)的表达进一步增强了经TCR改造T细胞的正选择。ATO来源的经TCR改造T细胞表现出初始表型，并且在体外和体内经历具有稳健肿瘤杀伤的抗原特异性活化。最后，在ATO中产生的经TCR改造T细胞表现出几乎完全缺少内源性Vβ TCR表达，与发育期间等位基因排斥的诱导一致，并且暗示了产生用于过继性细胞治疗的非同种异体反应性经改造T细胞的直接和有效的方法。
I.结果
A.用于体外人T细胞分化的优化的人工胸腺类器官系统的开发
目标是开发可支持来自HSPC的人T细胞的体外正选择和成熟的临床可转移的类器官系统。为了避免使用原代胸腺组织，本发明人测试了经DLL1转导的基质细胞系在3D类器官培养物中支持人T细胞发育的能力。观察到OP9-DL1系统中的T细胞分化取决于胎牛血清的特定批次而高度可变，本发明人试图鉴定能够一致地支持类器官培养物中的T细胞分化的无血清条件。为了避免使用专有的支架材料，使用了被示出在基于胸腺组织的类器官中有效的压实再聚集技术，其中基质细胞通过离心与HSPC聚集并且部署在空气-流体界面处的细胞培养插入物上(图3A)。在这些3D培养物中，本发明人鉴定了用人DLL1转导的MS-5鼠骨髓基质细胞系(以下称为MS5-hDLL1)稳健支持来自T细胞耗尽的CD34+脐带血(CB)HSPC的人T细胞分化。此外，本发明人鉴定了补充有B27(用于神经元和胚胎干细胞培养物中的多组分添加剂)以及FLT3L、IL-7和抗坏血酸的RPMI(下文称为“RB27”)为一致地支持MS5-hDLL1类器官培养物中的稳健人T细胞分化的新的无血清培养基。
这种优化的人工胸腺类器官(ATO)系统诱导来自CB CD34+CD3-HSPC的快速且稳健的T谱系定型，如通过到第2周时CD5+CD7+细胞的优势以及CD4+CD3-未成熟单阳性(ISP)细胞和CD4+CD8+(DP)细胞的出现所示的(图3B)。更成熟的CD3+TCRαβ+细胞早在第4周出现，并且随时间增加，在第6周达约30％细胞的平均值(图3B、14A)。还产生了小部分的CD3+TCRγδ+T细胞(图14A)。CD3+TCRαβ+细胞在早期时间点主要是DP(图14A)，但逐渐成熟为CD8SP，以及较小程度的CD4SPT细胞，与ATO中的正选择一致。
在研究的所有时间点，CD34+祖细胞在ATO中保持可检测，并且在6周时依然包括胸腺T细胞祖细胞的所有三个表型阶段：多能CD34+CD7-CD1 a-早期胸腺祖细胞(ETP)以及发育下游CD34+CD7+CDla-和CD34+CD7+CD1a+T谱系祖细胞(FIG 3C)。基于另一种分类方案，在CD34+级分中还鉴定了原T1和原T2祖细胞表型(图3C)。CD19+B细胞频率随时间降低，NK和髓细胞频率始终很低(图3B、14A)。ATO的组织学切片显示具有丰富的淋巴细胞的密集的组织样构造(图19)，其聚簇对CD3呈阳性(图3D)。
在6周时每ATO通常产生约2×106个总细胞(图14B)；然而，每HSPC的ATO细胞产量与接种的HSPC的数量和HSPC与基质细胞的比例成反比，在最低比例下产生每HSPC产量为4至5,000个细胞(图20A)。不同初始HSPC数量和比例下ATO中前体和成熟T细胞的频率类似(图20B)，除了用大量基质细胞产生的ATO(每ATO 6×105)，其显示受损的成熟T细胞发育。因此，将具有1∶20的最佳HSPC与基质细胞比例的较小ATO(通常7500个HSPC：每ATO 6×105个基质细胞)用于进一步实验。在技术重复(n＝11)和四个不同批次的B27中观察到细胞输出和T细胞分化的高重现性(图21A-D)。在转移相关性方面，使用补充有无异源B27(含有人血清白蛋白)的培养基(图21E-F)或含有经辐照的基质细胞的培养基(图21G-J)，在ATO中也见到了相当的T细胞分化和细胞输出。ATO中产生的造血细胞的回收通过简单的机械破碎和收集细胞悬液来实现，其得到＞99％的CD45+造血细胞和＜0.5％的基质细胞(图21K)。
当与使用相同供体CB HSPC的OP9-DL1单层培养系统比较时，ATO显示明显优异的CD3+TCRαβ+T细胞的产生(图11A、22)。与先前的报道一致，OP9-DL1单层支持有效的T谱系定型(CD7+CD5+)和通过ETP、pro-T和CD4ISP阶段的进展，但DP、CD3+TCRαβ+和成熟SP细胞低效产生，而所有这些都很容易在ATO中发育(图11A、22)。事实上，最佳的正选择和成熟需要ATO系统的所有三个组分：3D结构、MS5-hDLL1基质细胞和RB27培养基(图11A)，因为OP9-DL1在RB27中存活较差，并且在3D培养物中显示对T细胞分化的支持较差。缺少DLL1表达的亲本MS-5细胞系不支持单层或3D培养物中的T细胞发育(图11A)。
总之，ATO提供了标准化的无血清3D系统，其支持来自CD34+HSPC的稳健的和可再现的T细胞分化，允许人TCRαβ+T细胞的正选择和成熟。
B.ATO中胸腺初始T细胞发育的重演
接下来将ATO中的T细胞分化与出生后人胸腺中的进行比较。第12周，CB ATO显示与胸腺类似频率的T谱系定型(CD5+CD7+)和CD34+祖细胞(图4A)。如在胸腺中一样，ATO中的大多数CD3+T细胞是TCRαβ+，但是可容易检测的TCRγδ+群体也始终可见(图4A)。在ATO来源的CD3+TCRαβ+细胞中，成熟CD8SP和CD4SP T细胞的产生在第6-12周之间增加(图4B和图12A-C)。与胸腺相反，ATO显示出相对于CD8SPT细胞明显较少的CD4SPT细胞。
如在胸腺中一样，ATO来源的CD3+TCRαβ+CD8SP和CD3+TCRαβ+CD4SP T细胞从“未成熟初始”(CD45RA-CD45RO+CD27+CCR7-CD1Ahi)转变为“成熟初始”(CD45RA+CD45RO-CD27+CCR7+CD1alo)表型(图4C和图12A-C)。在ATO中，这发生在第6-12周之间，并且导致到第12周时ATO中成熟初始T细胞的频率高于胸腺中(图4C和图12B-C)。未成熟和成熟初始亚型共表达CD62L和CD28，亚型共表达CD127和CD31，后者标志物与血液中最近的胸腺迁出T细胞相关(图12B-C)。活化标志物CD25在ATO来源的CD8SP T细胞上不表达，但在CD4SP T细胞亚群上观察到(图12B-C)。总之，这些数据显示，与人胸腺相比，ATO中T细胞分化的显著的保真度，最终出现类似于胸腺和血液中发现的真实初始T细胞。
鉴于ATO中成熟CD4SP T细胞的晚期出现，假定树突细胞也可能在ATO中发育并且介导通过MHC II类表达的正选择。事实上，很少有HLA-DR+细胞以与胸腺中类似的频率存在于ATO中(图23A)。该群体的进一步分析揭示了包括单核细胞、B细胞和浆细胞样CLEC9A+和CD1c+树突细胞的抗原呈递细胞，所有这些细胞也存在于胸腺中(图23B)。
C.来自多个HSPC来源和亚群的T细胞分化
从所有临床相关的HSPC来源，即成人骨髓(BM)、G-CSF动员的外周血(MPB)和未动员的外周血(PB)中观察到ATO中具有类似频率的前体和CD3+TCRαβ+T细胞的有效T细胞分化(图3A-B、15A-B、13A-B)。来自这些来源以及还有来自胸腺的HSPC显示不同的T细胞分化动力学(图15A)，然而不同HSPC来源的T细胞输出相当(图3d)。来自CB、BM或MPB的高度富集的造血干细胞(lin-CD34+CD38-)级分显示出类似的稳健T细胞分化(图5C-D、13D-E)。
ATO还诱导从分离自BM的纯化的淋巴祖细胞的T细胞分化(图15C-D)。与HSC(未示出)或未分级的CD34+lin-HSPC相比，淋巴引发的多能祖细胞(LMPP)和CD24-共同淋巴祖细胞(CLP)更快分化(图24A-B)。相比之下，主要具有B细胞和NK细胞潜能的CD24+CLP在ATO中导致差的T细胞分化和细胞输出(图15C-D、24A)。因此，ATO可以作为评估来自人干细胞和祖细胞群体的T谱系潜能的工具。
D.ATC来源的T细胞的TCR多样性和功能
类似于胸腺，RAG1和RAG2在ATO来源的DP中表达(图25A)。在ATO来源的CD3+TCRαβ+CD8SP(图16A)和CD3+TCRαβ+CD4SP(图25B)T细胞中使用TCR Vβ家族的流式细胞术分析揭示了与来自人胸腺的相应T细胞显著类似的多样性。此外，通过对TCR Vα和Vβ CDR3区进行的深度测序可以看到CD3+TCRαβ+CD8SP中高度多样化的TCR库，与胸腺CD8SP细胞和PB初始CD8+T细胞相当(图16B-C)。重要的是，没有观察到偏斜的Vα或Vβ使用，反对ATO在非常规T细胞亚群或克隆扩增的成熟T细胞中的优势。
ATO来源的CD8SP T细胞响应于PMA/离子霉素表现出多功能IFNγ、TNFα和IL-2产生，与细胞毒性表型一致(图16D)，以及响应于抗CD3/CD28和IL-2刺激表现出稳健增殖和CD25和4-1BB的上调(图16E)。ATO来源的CD4SP细胞响应于抗CD3/CD28和IL-2而产生IFNγ和IL-2并增殖(图25C-D)。用抗CD3/CD28和IL-2，从ATO分离的CD8SP(图16F)和CD4SP(图25E)的数目经过14天分别扩大了约60倍和约40倍。总之，在ATO中产生的成熟T细胞表现出生理学TCR多样性和对抗原刺激的功能响应。
E.ATO中初始经TCR改造T细胞的产生
本发明人接下来将ATO调整用于从HSPC体外产生经TCR改造T细胞。用编码对NY-ESO-1157-165肽具有特异性的HLA-A*02：01限制性TCR的密码子优化的α和β链的慢病毒载体转导CB CD34+CD3-HSPC。在7周时，TCR转导的ATO显示出与模拟转导的对照类似的CD5+CD7+T谱系细胞频率，但显著增加的CD3+TCRαβ+T细胞，其中大多数表达经转导的TCR，如通过用针对转导的Vβ13.1链的四聚体或抗体的染色看到的(图7A)。在来自模拟转导对照的CD3+TCRαβ+四聚体+细胞和CD3+TCRαβ+细胞之间，CD8SP细胞的频率类似，然而四聚体+CD8SP细胞显示出加速成熟为成熟初始表型(即CD45RA+CD45RO-CD27+CCR7+CD1alo)(图7A)。值得注意的是，四聚体+CD8SP细胞显示了常规CD8αβ T细胞表型，未表达CD16或CD56，这是与NK细胞和上皮内淋巴细胞相关的标志物(图17A)。
TCR转导还导致ATO中显著提高的细胞产量(平均每个HSPC约450个细胞)(图17B)，其中大多数是CD3+四聚体+T细胞。因此，用7,500个经TCR转导的HSPC起始的单个ATO通常到7周时产生约4×106个细胞，其中约15％(6×105)是CD3+四聚体+CD8SPCD45RA+成熟初始T细胞(图7A、17B)。
响应于表达CD80和同源HLA-A*02：01/NY-ESO-1肽-MHC单链三聚体的人工抗原呈递细胞(aAPC)而非无关HLA-A*02：01/MART-1aAPC或亲本K562细胞，来自经TCR转导的ATO的ATO来源的CD8SP细胞经历了抗原特异性活化(IFNγ、TNFα和IL-2产生)、脱颗粒(CD107a膜移动)(图17C)和增殖(图17ED)。此外，从经TCR转导的ATO分离的CD8SP T细胞响应于抗CD3/CD28和IL-2或IL-7/IL-15表现出稳健扩增(图17E)。四聚体+细胞即使在延长的增殖和再活化之后还保持了常规的CD8αβ表型(图26A)。
ATO来源的经TCR改造T细胞中Vβ多样性的流式细胞术分析揭示超过98％的四聚体+CD8SP T细胞仅表达经转导的Vβ13.1区段(图7F、26B)，与ATO中经TCR改造T细胞分化期间内源性Vβ表达的几乎完全的等位基因排斥一致。因此，ATO支持来自HSPC的功能性经TCR改造T细胞的稳健分化，以及TCR增强的细胞扩增的引入，并促进缺少内源性TCR Vβ表达的成熟初始T细胞的分化。
为了测试上述发现是否可以延伸到NY-ESO-1TCR以外，使用密码子优化的HLA-A*02：01限制性MART-1特异性TCR产生ATO。从这些ATO分离的CD3+四聚体+CD8SP表现出初始T细胞表型(图26C)，并响应于MART-1aAPC而不是NY-ESO-1aAPC上调IFNγ和CD107a表面表达(图26D)。
F.MHC修饰的ATO中经TCR改造T细胞的增强的正选择
胸腺中的正选择由T细胞前体上的TCR与胸腺基质和造血细胞上的自身MHC之间的相互作用介导。因此研究了ATO中“自身”MHC的增加的基质表达是否可增强经TCR改造T细胞的正选择。用HLA-A*02：01限制性NY-ESO-1特异性TCR转导HLA-A*02：01阳性HPSC，并与用HLA-A*02：01转导的对照MS5-hDLL1基质或MS5-hDLL1组合(图27A)。ATO基质细胞中HLA-A*02：01的表达增强了四聚体+CD3+CD8SP T细胞的正选择(图27A)，同时保持正常分化成为成熟初始表型(图27B)。
G.ATO来源的经TCR改造T细胞的抗原特异性肿瘤杀伤
本发明人接下来测试了ATO来源的经TCR改造T细胞的抗原特异性细胞毒性。从NY-ESO-1特异性TCR转导的ATO中分离并在体外活化36小时的纯化的CD8SP T细胞有效诱导表达NY-ESO-1的细胞系的凋亡(用HLA-A*02：01/NY-ESO-1pMHC复合物转导的K562细胞；以及其中内源表达NY-ESO-1抗原的HLA-A*02：01+U266多发性骨髓瘤细胞系)，但对亲本K562细胞或表达无关HLA-A*02：01/MART-1pMHC的K562细胞几乎不表现出活性(图18A-B)。此外，在延长(14天)体外扩增后保留了抗原特异性细胞毒性，与常规T细胞表型的保留一致(图18C)；细胞毒性与同期扩增的TCR转导的PB CD8+T细胞类似(图18C)。与这些结果一致，扩增的ATO来源的经TCR改造T细胞能够显著控制皮下移植表达同源(K562-ESO)而非无关(K562-MART1)pMHC抗原的K562肿瘤的NSG小鼠中的疾病负担(图18D-F)。
II.评论
在体外忠实地概括胸腺生成的能力为产生具有期望治疗特性(包括抗原初始状态和缺少内源性TCR表达)的经改造T细胞创造了独特的机会。如在此使用标准化的现成组分证明的，ATO系统有效地启动并维持来自HSPC的T细胞定型和分化的正常阶段，最终产生了与来自胸腺和外周血的初始常规T细胞非常类似的成熟CD3+TCRαβ+CD8SP和CD3+TCRαβ+CD4SP T细胞。
与现有的体外T细胞分化方法相比，ATO提供了独特的生物学和转移优势。首先，ATO支持人T细胞的正选择和成熟，这两者在单层系统中都受到损害。ATO中增强的正选择依赖于3D结构，因为使用相同的组分建立的单层培养物导致T细胞分化效率低下。这与使用胸腺组分的FTOC或重聚3D培养物中观察到的正选择(尽管较低效率)一致。可能的是，3D相互作用通过增加T细胞前体与发育配体如DLL1或选择性配体如自身MHC之间的接触的价和/或持续时间来支持改善的T细胞发育。或者，3D构造可通过机械力和/或代谢变化来促进基质细胞和造血细胞之间的串扰或在T细胞前体上施加发育信号，而这在2D中是不可能的。
ATO系统相对于现有方法的另一个主要进展是来自临床上相关的成人HSPC来源(包括脐带血、骨髓和静息或动员的外周血)的高效T细胞分化。目前的单层系统仅允许来自CB、BM或MPB的TCRαβ+T细胞的低效发育；没有报道静息外周血HSPC的数据。
如本文所证明的，ATO系统也可以从HSPC产生经TCR改造的初始T细胞。已经在OP9-DL1系统中证实了来自人HSPC的经TCR改造T细胞的分化，但是在这些报道中，CD3+CD8SP细胞的成熟受损(通常仅占培养物的0-2％)，使用胸腺来源的CD34+细胞实现最高效率。相比之下，ATO支持来自CB HSPC的经TCR改造T细胞的稳健正选择，使用MPBHSPC观察到类似的结果(未示出)。基于研究显示过继转移的T细胞的改善的体内存活率和活性与较少分化活化的表型相关，ATO中实现的成熟初始T细胞表型也可提供ATO来源的经改造细胞相对于经修饰外周血T细胞的明显优势。通过在ATO基质细胞中表达同源MHC增强经TCR改造的初始T细胞的正选择为提高成熟ATO来源的抗原特异性T细胞的产量提供了进一步的途径。
整个T细胞分化期间ATO中经转导TCR的存在介导了内源性VβTCR基因座的几乎完全的等位基因排斥，与移植的鼠和人HSPC的体内研究一致。经改造外周血T细胞上潜在同种异体反应性的内源性TCR的表达是可扩展的现成过继性T细胞治疗发展的主要障碍，需要自体经改造T细胞的劳动密集的个体化生产。开发同种异体的经改造T细胞治疗的策略包括通过基因编辑或病毒特异性T细胞的TCR转导破坏内源性TCR/CD3表达；然而，这两种方法都需要对基因修饰的T细胞进行大量操作和扩增，这可能会影响随后的体内功能。因此，使用ATO从头产生初始的、等位基因排斥的经改造T细胞因此提供了用于产生用于过继性细胞治疗的非同种异体反应性T细胞的高效替代策略。
ATO系统还提供了技术简单性、再现性和潜在的可扩展性。使用无血清培养基避免了单层系统中利用胎牛血清所观察到的显著变异性，并且在简单培养基更换的情况下在培养期间(长达12周)维持ATO完整的能力避免了如单层系统需要的那样将细胞频繁转移到新鲜基质细胞。高纯度的T细胞群可以通过机械分离从ATO容易地收集，并且可以通过标准方法进一步纯化以去除＜0.5％的污染性基质细胞。使用现成组分，特别地避免原代基质细胞或专有支架材料，以及将ATO生产与无异源试剂和基质细胞辐照相结合的能力，将简化将ATO转移到用于产生用于过继性治疗的T细胞的临床级平台。该系统的简单性还允许直接采用对人T细胞发育和正选择建模具有兴趣的实验室方法。
III.方法
A.分离人CD34+CD3-HSPC
新生儿脐带血获自在UCLA分娩的废弃脐带和胎盘单元。骨髓(BM)通过来自UCLA的同种异体BM供体收获物的废弃材料从健康成人供体获得，或购自AllCells Inc.(Alameda，CA)。G-CSF动员的外周血获自在UCLA进行单采血液成分分离用于同种异体干细胞移植物捐献的同意的健康的成年供体。未动员的外周血通过UCLA CFAR Virology Core获自健康的成年供体。所有组织样品在UCLA IRB批准的方案或豁免下获得。所有样品通过Ficoll-Paque(GE Healthcare Life Sciences，Pittsburgh，PA)梯度离心富集单核细胞，然后使用CD34MicroBead Kit UltraPure(Miltenyi，Auburn CA)通过磁性细胞分选(MACS)进行CD34+细胞的正选择。除非另有说明，否则将富含CD34+细胞的级分在MACS后冷冻保存。在使用之前，将细胞解冻并且通过分选CD34+CD3-细胞通过FACS消耗残余T细胞，将其立即接种到ATO中或如下所述进行转导。在一些实验中，HSC在接种到ATO中之前通过FACS来富集Lin-CD34+CD38-细胞。TCR转导实验中使用的HSPC来自HLA-A*02：01+CB单元。高分辨率HLA-A2分型由UCLA Immunogenetics Center使用序列特异性寡核苷酸(SSO)珠进行。
B.分离人骨髓祖细胞亚群
如上所述从新鲜BM抽吸物中富集CD34+HSPC，并且立即通过FACS分选干/祖细胞群体，其基于与以下标志物的组合的CD45的阳性表达和缺少谱系标志物(CD3、CD14、CD19、CD56和CD235a；“Lin-“)的表达：总HSPC(CD34+)、HSC(CD34+CD38-CD45RA-)、LMPP(CD34+CD38+CD45RA+CD10-CD62Lhi)、CD24-CLP(CD34+CD38+CD45RA+CD10+CD24-)和CD24+CLP(CD34+CD38+CD45RA+CD10CD24+)。
C.分离人胸腺细胞
在IRB豁免下获得作为来自在洛杉矶儿童医院(Children’s Hospital LosAngeles，CHLA)经历心脏外科的患者的丢弃废物的出生后人胸腺。将胸腺碎片在RPMI中精细切碎，并通过吸取将胸腺细胞释放到悬液中，然后通过70μm尼龙过滤器。将细胞在同一天新鲜分析或第二天进行分析。胸腺和ATO来源的T细胞祖细胞的流式细胞术分析使用以下表面表型：早期胸腺祖细胞(ETP；CD34+CD7-CD1a-)、CD1a-pro-T(CD34+CD7+CD1 a-)和CD1a+pro-T(CD34+CD7+CDla+)；或CD5-pro-T(pro-T1；CD34+CD7+CD5-)和CD5+pro-T(pro-T2；CD34+CD7+CD5+)。将胸腺和ATO来源的T细胞和前体定义为与以下表型组合的CD14-CD56-：总T谱系细胞(CD7+CD5+)、双阴性(DN；CD4-CD8-)、CD4未成熟单阳性(CD4ISP；CD5+CD4+CD3-)、双阳性(DP；CD4+CD8+)、CD8SP(CD3+TCRαβ+CD8+CD4-)、CD4SP(CD3+TCRαβ+CD8-CD4+)、未成熟初始(为CD8SP或CD4SP的CD45RA-CD45RO+)、成熟初始(为CD8SP或CD4SP的CD45RA+CD45RO-)。通过CD1 a、CD27、CD28和CCR7共染色证实未成熟和成熟的初始表型。
D.分离原代人T细胞
如上所述从胸腺细胞制备物中分离胸腺T细胞，并如上所述从单核细胞级分中分离外周血和脐带血CD8+T细胞。从所有来源分离CD8+T细胞是通过使用CD8+T细胞分离试剂盒(Miltenyi)对CD8SP T细胞进行磁珠富集。在一些实验中，通过FACS进一步纯化胸腺T细胞以耗尽CD4ISP或DP前体以及PB T细胞以分离初始T细胞(CD45RO-CCR7+)。
E.细胞系
MS-5鼠基质细胞系通过惠赠获得。为了产生MS5-hDLL1，用编码人DLL1和GFP的慢病毒载体转导MS-5细胞。通过FACS分选最高5％的GFP表达细胞并在DMEM/10％FCS中传代。在培养数周后，通过GFP表达的流式细胞术证实稳定表达，并通过qRT-PCR和DNA测序证实DLL1表达。MS5-hDLL1-A2.1细胞通过用人HLA-A*02：01慢病毒载体(由Caltech的DavidBaltimore博士惠赠)转导MS5-hDLL1细胞，然后使用识别人HLA-A2的抗体(BB7.2)(Biolegend，San Diego，CA)对经转导细胞进行FACS分选来产生。OP9-DL1细胞系(表达鼠Dll1)由Juan Carlos 博士(University of Toronto)惠赠，并在0.1％明胶包被的瓶中在MEMα(ThermoFisher Scientific，Grand Island，NY)/20％FBS中传代。K562细胞系从ATCC获得并维持在RPMI/10％FCS中。K562aAPC通过用编码全长人CD80和HLA-A*02：01/B2M/NY-ESO-1157-165或MART-126-35单链三聚体(SCT；由Caltech的DavidBaltimore博士惠赠)的慢病毒载体共转导K562细胞来产生。K562靶细胞通过单独用SCT转导产生。K562体内靶细胞通过用萤火虫萤光素酶慢病毒载体(由UCLA的Donald Kohn博士惠赠)然后任一SCT顺序转导产生。K562转导子在使用前进行FACS分选。U266多发性骨髓瘤细胞系由John Chute博士(UCLA)惠赠并保存在RPMI/10％FCS中。
E人工胸腺类器官(ATO)培养物
通过胰蛋白酶消化收获MS5-hDLL1(或MS-5或OP9-DL1，如所述的)细胞，并将其重悬浮于无血清ATO培养基(“RB27”)中，所述培养基由RPMI 1640(Coming，Manassas，VA)、4％B27补充物(ThermoFisherScientific，Grand Island，NY)、30μM在PBS中重构的L-抗坏血酸2-磷酸倍半镁盐水合物(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、1％青霉素/链霉素(Gemini Bio-Products，West Sacramento，CA)、1％Glutamax(ThermoFisher Scientific，GrandIsland，NY)、5ng/ml rhFLT3L和5ng/mlrhIL-7(Peprotech，Rocky Hill，NJ)构成。RB27每周新鲜制备。在指出的实验中用4％XenoFree B27代替B27。取决于实验，将每ATO的1.5至6×105MS5-hDLL1细胞与3×102至1×105纯化的CD34+CD3-细胞(或其他HSPC群体，如所示)在1.5ml Eppendorf管中组合并在浮桶离心机(swinging bucket centrifuge)中在4℃下以300g离心5分钟。小心除去上清液，并通过短暂涡旋使细胞沉淀重悬。对于每个ATO，将0-4μmMillicell transwell插入物(EMD Millipore，Billerica，MA；Cat.PICM0RG50)置于每孔含有1ml RB27的6孔板中。为了铺ATO，将插入物取出并放在板的边缘以排出过量的培养基。将细胞浆液调整至每ATO 5-8μμl，用20μl移液管尖端吸入，并通过在移液管尖的端部处形成液滴，将液滴轻轻放置在细胞插入物来铺上。将细胞插入物放回含有1mL RB27的孔中。通过从细胞插入物周围抽吸然后用1ml新鲜RB27/细胞因子替换，每3-4天彻底更换培养基。将ATO以这种方式培养长达20周。在指定的时间，通过向每个孔加入FACS缓冲液(PBS/0.5％牛血清白蛋白/2mM EDTA)，用1ml“P1000”移液管吸取来简单地解聚ATO，然后通过70μμm尼龙过滤器来收获ATO细胞。在一些实验中，在用于ATO之前，将MS5-hDLL1细胞的单细胞悬液以指定的剂量进行γ-辐照。
G.T细胞单层共培养物
如先前所述建立OP9-DL1单层培养物。简单地说，在使用前1-2天将OP9-DL1接种到0.1％明胶包被的12孔板中以实现70-80％汇合。从单层抽吸培养基并且将1×104-1.5×104纯化的CD34+CD3-HSPC铺在2ml由MEMα、20％FBS、30μM L-抗坏血酸、5ng/ml rhFLT3L和5ng/ml rhIL-7构成的培养基中的基质单层上。在一些实验中，用MS-5或MS5-hDLL1代替OP9-DL1，用RB27代替培养基。每4-5天通过收集细胞，通过70μm尼龙过滤器过滤并重铺在新鲜培养基中来将细胞转移至新的基质细胞单层。汇合时，将细胞分到多个含有新鲜基质层的孔中。培养维持长达10周。
H.慢病毒载体和转导
通过RT-PCR将人DLL1的全长编码序列从人通用参考RNA集(AgilentTechnologies，Santa Clara，CA)克隆到第三代慢病毒载体pCCL-c-MNDU3-X-IRES-eGFP(由UCLA的Donald Kohn博士惠赠)中。将人CD80类似地克隆到pCCL-c-MNDU3中。编码对HLA-A*02：01/NY-ESO-1157-165具有特异性的TCR(来自1G4TCR克隆)的密码子优化的α和β(Vb13.1)链的第三代慢病毒载体先前已描述，并且由Antoni Ribas博士(UCLA)惠赠。密码子优化的HLA-A*02：01/MART-126-35特异性TCR(来自F5TCR克隆)由Donald Kohn博士(UCLA)惠赠。HLA-A*02：01和HLA-A*02：01/B2M/NY-ESO-1157-165或HLA-A*02：01/B2M/MART-126-35单链三聚体的编码序列由David Baltimore博士(Caltech)惠赠，并被亚克隆到pCCL-c-MNDU3-X-IRES-mStrawberry中。如前所述进行慢病毒颗粒的包装和浓缩。简单地说，使用TransIt 293T(Mirus Bio，Madison，WI)，用慢病毒载体质粒pCMV-ΔR8.9和pCAGGS-VSVG共转染293T细胞(ATCC)17小时，随后用20mM丁酸钠处理8小时，随后在无血清UltraCulture中产生细胞上清液48小时。在4℃下，使用Amicon Ultra-15100K过滤器(EMD Millipore，Billerica，MA)以4000×g通过切向流过滤浓缩上清液40分钟，并作为等分试样储存在-80℃。对于HSPC转导，将1 ×105-1 ×106FACS分选的CD34+CD3-HSPC铺在6孔未处理的板中12-18小时，所述板用补充有50ng/ml重组人SCF、FLT3L和TPO以及10ng/ml IL-3(Peprotech，Rocky Hill，NJ)的1ml X-VIVO-15(Lonza，Basel，Switzerland)中的20μg/ml Retronectin(Clontech，Mountain View，CA)包被，然后以100的感染复数(MOI)加入浓缩的慢病毒上清液。模拟转导的细胞在相同的条件下培养，但不添加载体。转导后24小时收集细胞、洗涤并接种到ATO中。为了转导外周血T细胞，如以前所述使用CD8+T细胞分离试剂盒(Miltenyi)通过磁性负选择分离来自健康供体的CD8+T细胞，并在转导前在含有抗CD3/CD28珠(ThermoFisherScientific)和20ng/ml IL-2的AIM V/5％人AB中活化/扩增4天。随后在使用前将转导的T细胞在IL-2(20ng/ml)中扩增。
I.免疫组织化学
对于苏木精和伊红(H&E)图像，将ATO包埋在Histogel(ThermoFisherScientific，Grand Island，NY)中并在10％中性缓冲福尔马林(ThermoFisherScientific，Grand Island，NY)中固定过夜。通过UCLA Translational Pathology CoreLaboratory(TPCL)进行5μm切片和H&E染色。对于免疫荧光成像，通过用解剖刀切割每个ATO周围的培养插入物，然后将膜和ATO包埋在Tissue-Tek OCT(VWR Radnor，PA)中并在干冰上冷冻来分离ATO。将5μm冷冻切片在10％中性缓冲的福尔马林中固定，并在4℃下以1∶50稀释度用抗CD3(克隆UCHT1；Biolegend，San Diego，CA)染色过夜，然后在室温下用AlexaFluor594缀合的抗小鼠IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)孵育。利用AxioCamMRM和AxioVision软件(Zeiss，Jena，Germany)在Zeiss AzioImager M2上获取H&E和免疫荧光图像。
J.T细胞细胞因子测定
使用CD8+或CD4+分离试剂盒(Miltenyi)通过磁性负选择分离来自ATO的成熟CD8SP或CD4SP细胞，并通过FACS分选以进一步消耗CD45RO+细胞(含有未成熟初始T细胞和CD4ISP前体)。将纯化的T细胞群铺在具有5％人AB血清(Gemini Bio-Products，WestSacramento，CA)的200μμl AIM V(ThermoFisher Scientific，Grand Island，NY)的96孔U底板中。将PMA/离子霉素/蛋白质转运抑制剂混合物或对照蛋白转运抑制剂混合物(eBioscience，San Diego，CA)加入到每个孔中并孵育6小时。在用细胞内染色缓冲液试剂盒(eBioscience，San Diego，CA)固定和透化之前，对细胞的CD3、CD4和CD8(Biolegend，SanDiego，CA)和UV455可固定存活染料(eBioscience，San Diego，CA)染色，并用抗IFNγ、TNFα、IL-2、IL-4或IL-17A的抗体(Biolegend，San Diego，CA)进行细胞内染色。
K.T细胞活化和增殖测定
对于CFSE增殖测定，如上所述通过负选择MACS分离ATO来源的CD8SP或CD4SP T细胞(具有上述CD4SP T细胞的进一步FACS纯化)并根据制造商的方案用5μM CFSE(Biolegend，San Diego，CA)标记。将标记的细胞用补充有5％AB血清和20ng/ml rhIL-2(Peprotech，Rocky Hill，NJ)的AIM V中的抗CD3/CD28珠(ThermoFisher Scientific，Grand Island，NY)孵育，在第5天对于CD25或4-1BB共染色(Biolegend，San Diego，CA)并通过流式细胞术进行分析。在一些实验中，根据制造商的方案将CFSE替换成具有标记的CellTrace Violet(CTV；ThermoFisher)。对于体外细胞扩增测定，将如上分离的5×103-1×104个ATO来源的CD8SP或CD4SP T细胞以200μl铺在96孔U底板中，并用抗CD3/28珠以及20ng/mL IL-2或5ng/mL IL-7和5ng/mL IL-15(Peprotech)活化/扩增。在第4天除去珠，并且每2-3天添加新鲜的培养基和细胞因子，根据需要重铺在更大的孔中。每周用血细胞计数仪对细胞计数。在一些实验中，在第14天将细胞用新鲜的抗CD3/CD28珠再刺激。
L.人工APC(aAPC)CTL引发测定
如上所述，通过MACS从第6周TCR转导的ATO中分离1×105个总ATO来源的CD8SP T细胞，并与表达CD80和HLA-A*02：01/B2M/NY-ESO-1157-165或HLA-A*02：01/B2M/MART-126-35的单链三聚体的K562来源的aAPC或亲本K562细胞以4∶1T细胞：K562比例在96孔U底板中在200μlAIM V/5％人AB血清中共培养6小时。在培养期间以1∶50的最终稀释度将CD1 70a-APC抗体(Biolegend，San Diego，CA)与蛋白质转运抑制剂混合物(eBioscience，San Diego，CA)一起添加到孔中。然后如上所述对细胞表面标志物进行染色、固定、透化并对细胞内细胞因子进行染色。
M.TCR Vβ表型分析
与IOTest Beta Mark TCR V试剂盒(Beckman Coulter，Indianapolis，IN)结合，对来自第7周ATO或出生后胸腺的总细胞进行CD3、CD4、CD8和TCRγδ染色。设门CD3+TCRγδ-CD8+CD4-细胞用于Vβ分析，并通过代表每管3种不同Vβ抗体的FITC+、PE+或FITC+PE+细胞百分比测定Vβ家族的使用。对于TCR转导的ATO的Vβ分析，将来自第6-7周ATO的总细胞在表面抗体染色前另外用APC缀合的HLA-A*02：01/NY-ESO-1157-165四聚体(MBL International，Woburn，MA)标记10分钟，并且在CD3+TCRγδ-四聚体+CD8+CD4-上设门细胞用于Vβ分析。
N.TCR库测序
根据制造商的说明书，使用RNeasy Micro试剂盒(Qiagen)通过FACS从40,000-200,000个ATO或胸腺CD8SP或PB CD45RO-CCR7+初始CD8+T细胞中纯化总RNA。使用AgilentRNA 6000纳米芯片测定RNA浓度和质量。使用SMARTer PCR cDNA合成试剂盒(Clontech)通过5′-RACE制备包含重排的TCR可变基因的靶向cDNA文库，具有以下修改。使用制造商的方案从3.5-500ng总RNA制备第一链cDNA，但用多聚dT引物(5’-T30VN-3’)替换。使用Advantage 2PCR试剂盒(Clontech)通过半巢式PCR分别制备双链TCRα和TCRβ cDNA文库。TCRα cDNA的初始扩增使用0.5μL第一链反应(＝2.5μL在TE中的1∶5稀释)以及制造商的正向通用引物混合物和结合TRAC(5’-GCCACAGCACTGTTGCTCTTGAAGTCC-3’(SEQ ID NO.1))的一对反向引物。用制造商的正向引物IIA和结合TRAC(5’-X5GGCAGGGTCAGGGTTCTGGAT-3’(SEQ ID NO.2))的条形码化反向引物进行TCRα cDNA的半巢式扩增，其中X5是在深度测序之前标记样品库的5nt的样品特异条形码)。TCRβ cDNA的扩增类似，但用结合TRBC(5’-CCACCAGCTCAGCTCCACGTG-3’(SEQ ID NO.3))的反向引物进行初始扩增，并用结合TRBC(5’-X5GGGAACACSTTKTTCAGGTCCTC-3’(SEQ ID NO.4))的条形码化引物进行半巢式扩增。使用DNA Clean and Concentrator-5试剂盒(Zymo Research)清洁TCRα和TCRβ cDNA制备物。将来自多至10个样品的TCRα和TCRβ cDNA制备物合并，之后进行Illumina衔接子连接和在MiSeq测序仪(Illumina)上进行2×150-bp配对末端测序。在使用样品特异性条形码解复用后，使用BLAT将读数与包含从IMGT数据库下载的人TRAV、TRAJ、TRBV、TRBD和TRBJ序列的所有可能组合的定制参考数据库进行比对。使用‘-maxAligns＝1-ignoreIntrons’选项，使用BLAT套件的pslCDnaFilter实用程序鉴定最佳BLAT命中，并使用定制Perrl脚本计算克隆型频率。
O.体外细胞毒性测定
如上所述，通过机械破碎和磁性负选择从ATO分离CD8SP T细胞。将T细胞在96孔圆底板中在抗CD3/CD28珠(ThermoFisher Scientific)和20ng/ml IL-2的AIM V/5％人AB血清中活化36小时。对于延伸的扩增，将细胞在IL-2中进一步培养长达14天。对于细胞毒性测定，将T细胞的2倍系列稀释液在AIM V/5％人AB血清中从每孔1×105个细胞开始，铺在96孔圆底板中的每孔中。将用内源性表达NY-ESO-1的HLA-A*02：01/NY-ESO-1157-165或HLA-A*02：01/MART-126-35单链三聚体或HLA-A*02：01+U266转导的K562靶细胞以每孔5×104个细胞铺板。在9小时通过膜联蛋白V/DAPI染色量化靶细胞的凋亡细胞死亡。通过四聚体染色测定抗原特异性T细胞百分比，并用于回顾性计算每个孔的效应物：靶标(E∶T)比例。通过从接受T细胞的孔中减去未接受T细胞的孔中的膜联蛋白V+靶细胞百分比来计算T细胞特异性细胞死亡。
体内肿瘤测定
所有动物实验在经UCLA Chancellor的Animal Research Committee批准的方案下进行。向4-6周龄的NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtmlWjl/SzJ(NSG)小鼠(JacksonLaboratory，Bar Harbor，Maine)皮下植入用HLA-A*02：01/NY-ESO-1157-165或MART-126-35单链三聚体和萤火虫萤光素酶(如上所述)转导的2×105K562靶细胞。在第3天通过腹膜内注射荧光素对小鼠肿瘤生物发光的成像。如上分离ATO来源的CD8SP T细胞并活化/扩增14天。在肿瘤植入后第3天通过眶后静脉注射5.7×106(包含4.5×106抗原特异性T细胞，如注射当天通过四聚体染色测定的)。还将PBS注射到对照小鼠中。每3-4天重复肿瘤生物发光，持续至少21天，之后根据疾病负担标准处死小鼠
P.流式细胞术和抗体
所有流式细胞术染色在PBS/0.5％BSA/2mM EDTA中在冰上进行30分钟。在抗体染色前，将FcX(Biolegend，San Diego，CA)加入到所有样品中5分钟。对于四聚体共染色，在室温下将PE或APC缀合的HLA-A*02：01/NY-ESO-1157-165或HLA-A*02：01/MART-126-35四聚体(MBL International，Woburn，MA)以1∶50最终稀释度加入到细胞10分钟，然后在冰上再加入抗体20分钟。在分析前将DAPI加入到所有样品中。在LSRII Fortessa上进行分析，并在UCLA Broad Stem Cell Research Center Flow Cytometry Core的ARIA或ARIA-H仪器(BDBiosciences，San Jose，CA)上进行FACS。对于所有分析，将DAPI+细胞设门出来，并且基于FSC-H vs.FSC-W和SSC-H vs.SSC-W对单细胞设门。用于表面和细胞内染色的抗体克隆获自Biolegend(San Diego，CA)：CD1a(HI149)、CD3(UCHT1)、CD4(RPA-T4)、CD5(UCHT2)、CD8(SK1)、CD10(6H6)、CD14(M5E2)、CD19(HIB19)、CD24(ML5)、CD25(BC96)、CD27(O323)、CD28(CD28.2)、CD31(WM59)、CD34(581)、CD38(HIT2)、CD45(HI30)、CD45RA(HI100)、CD45RO(UCHL1)、CD56(HCD56)、CD107a(H4A3)、CD127(A019D5)、CD235a(HI264)、CCR7(G043H7)、HLA-A2(BB7.2)、干扰素γ(4S.B3)、IL-2(MQ1-17H12)、IL-4(MP4-25D2)、IL-17A(BL168)、TCRαβ(IP26)、TCRγδ(B1)、TNFα(Mab11)、Vβ13.1(H131)、人谱系混合物(CD3、CD14、CD19、CD20、CD56)；以及BD Biosciences(San Jose，CA)：CD7(M-T701)、和CD62L(DREG-56)。
实施例4：在ATO模型系统中可以使用不同的基质细胞。
为了使ATO系统更具转移性，测试了其他基质细胞系替代来自鼠来源的MS5-hDLL1的能力。HS27a细胞是人骨髓细胞系，其为好的候选物，因为其分泌低水平的生长因子。通过用hDLL1转导HS27a细胞产生表达Notch配体(hDLL1)的HS27a细胞系。表达高水平hDLL1的细胞通过FACS纯化并扩增。在缺少Notch信号转导的情况下，ATO系统中的HS27a细胞不能支持T细胞分化(图28A-C)。发现除了MS5基质细胞之外，HS27a能够在三种不同的脐带血样品制备物中支持ATO系统中的T细胞分化(图29A-C)。如图30所示，在HS27a-DLL1 ATO中看到的稳健的CD8+细胞群中的大部分细胞不是常规CD8SP细胞，因为它们不表达CD3和TCRab。使用成熟标志物表明HS27α-hDLL1基质细胞可以支持成熟T细胞的分化与来自三种不同脐带血制备物的TCRab+CD3+CD8SP和CD4SP细胞的产生(图31A-C)。然而，效率低于MS5-hDLL1 ATO。
实施例5：使用ATO系统可将不同来源的干细胞和祖细胞分化成T细胞。
本文描述的ATO系统是用于从人工血干细胞(来自不同来源)体外产生功能性初始T细胞的有效且稳健的模型。该系统已经改编以从人胚胎干细胞(hESC)产生成熟的功能性初始人T细胞。本发明人已经鉴定了与最早的中胚层定型祖细胞相对应并且可以产生所有中胚层谱系(平滑肌、心肌细胞、造血谱系、间充质谱系)的胚胎中胚层祖细胞(hEMP)群体。该hEMP群体由失去Epcam标志物(CD326)的表达和获得CD56的表达来定义，并且可以通过FACS容易地分离(参见，例如，Evseenko等，Proc NatlAcadSci USA.2010Aug 3；107(31)：13742-7)。简单地说，在MEF(小鼠胚胎成纤维细胞)上培养的hESC在80-90％汇合下可以转移至基质胶。一旦转移(第0天)，将细胞在包含活化素、BMP4、VEGF、bFGF的培养基中培养。1-2天后，加入包含BMP4、VEGF和bFGF的新培养基。在第3-4天，基于其失去EPCAM和获得CD56来分选细胞。通过分离hEMP群体并将其与MS5-hDLL1基质细胞聚集来产生ES来源的ATO系统。该方案需要两周的造血诱导，在使用RPMI-B27培养基(添加SCF/IL7/Flt3L)诱导T细胞分化之前，用EGM2培养基和造血细胞因子(SB和SFT3)饲喂ATO。发现在hEMP阶段的3D聚集支持T细胞的产生。从OP9细胞(无ATO)上的hEMP分化的分离的CD34+产生ATO不支持T细胞分化(数据未示出)。图32中示出了来源于以hESC作为选择的干细胞群的ATO的T细胞群。图33中示出了ATO系统中来自hESC的T细胞分化的动力学，以及CD8ab SP细胞的产生。如图34-35所示，ATO系统中由hESC产生的T细胞表达成熟初始表型标志物，与使用脐带血细胞观察到的类似。如图36所示，使用hESC在多个干细胞来源之间可重现。图36显示来自三种不同hESC系的来自ATO系统(第4周)的T细胞分化。ATO系统允许从iPSC系产生成熟T细胞(图37)。此外，未分化的hESC(而不是分离的hEMP)的3D聚集随后使用前述不同分化培养基也允许T细胞的产生(图38)。此外，在ATO系统中可以使用多种Notch配体。如图39所示，当基质细胞系表达hJAG1而不是hDLL1时，ATO系统还可以支持来自hESC的T细胞成熟。还发现ATO系统中从hESC产生的T细胞显示出多样化的TCR Vb库(图40)。如图41所示，hESC-来源的T细胞显示响应于抗CD3/CD28和IL2表现出增殖和CD25上调。将分离的细胞用CTV(细胞追踪紫罗兰)染色并与CD3/CD28活化珠孵育5天。细胞经历多次细胞分裂(如CTV的稀释所示)以及活化(如通过CD25的表达所示)(图41A)。在进一步的实验中，用PMA/离子霉素处理分离的细胞6小时，细胞内染色显示响应刺激产生细胞毒性细胞因子(IFNg、IL2、TNFα)(图41B)。
接下来，试图确定经改造以表达外源TCR的T细胞是否可以由以hESC细胞作为起始材料的ATO系统产生。用表达GFP的opt1G4载体(NY-ESO TCR)转导H1 hESC。通过分离GFP+细胞并扩增它们产生H1NY-ESO TCR hESC系。然后使细胞接受与上述相同的方案以诱导T细胞分化。这在图42中示出。来自hESC的ATO中产生的经改造T细胞可通过GFP和四聚体的表达来监测。这些细胞遵循经典的T细胞分化方式(DP，CD3+/TCR+CD8SP)(图43)。在第五周，经改造的hESC来源的CD8SPT细胞显示出成熟的初始表型：CD45RA+、CD27+、CD62L+、CD31+(图44A-B)。对来自hESC的ATO(第5周)中产生的经改造CD8SP T细胞进行体外功能性测试。将分离的细胞用CTV(细胞追踪紫罗兰)染色并与CD3/CD28活化珠或在表达CD80和同源HLA-A*02：01/NY-ESO-1肽-MHC单链三聚体的人工抗原呈递细胞(aAPC)或无关HLA-A*02：01/MART-1aAPC的存在下孵育5天。细胞经历多次细胞分裂
(如通过CTV的稀释所示)以及活化(如通过响应于CD3/28活化和表达同源肽的aAPC的CD25的表达所示)(图45)。在该测定中，细胞不能在表达无关肽的aAPC的存在下存活。在进一步的实验中，将分离的细胞用PMA/离子霉素处理6小时。细胞内染色显示响应于刺激产生了细胞毒性细胞因子(IFNg、IL2、TNFα)(图46)。细胞还经历脱颗粒，如通过CD107a的表达所示(图46)。在两个单独的测定中，将分离的细胞在表达CD80和同源HLA-A*02：01/NY-ESO-1肽-MHC单链三聚体的人工抗原呈递细胞
(aAPC)或无关HLA-A*02：01/MART-1aAPC的存在下孵育6小时。分析表明响应于表达同源肽的aAPC而不是无关aAPC产生了细胞毒性细胞因子(IFNg、IL2、TNFα)和脱颗粒(CD107a)。一个代表性的实验在图47中示出。接下来，测试分离的细胞的增殖能力。将它们用CD3/CD28珠活化4天并在补充有5％人AB血清和IL2(20ng/ml)的AIM V培养基中维持2周。结果显示在2周时细胞扩增20倍(图48)。
实施例6：ATO培养基补充物
测试B27补充物的组分以确定它们对ATO系统的相对贡献。下表显示了B27补充物的组分：
建立脐带血ATO(用CD34+CD3-HSPC开始)以确定B27补充物的哪些组分是必需的。将完全(标准)B27(“B27comp”)与除了缺少单一组分以外相同的四种补充物(均由同一制造商提供)进行比较：不含维生素A(B27-VitA)、不含抗氧化剂(B27-AO)、不含胰岛素(B27-胰岛素)、不含异源组分(无异源B27)。示出的数据来自两个独立的实验，两者在在6周图中示出了总细胞输出(上)和T细胞定型细胞(CD5+CD7+)的百分比(下)。如图49-50所示，确定胰岛素对于ATO系统中T细胞定型是必需的，并且维生素A和抗氧化剂促进细胞扩增。此外，B27的无异源制剂与无异源在ATO中给出了类似的T细胞分化和扩增结果。总之，胰岛素对于ATO中T细胞产生是必需的，不含异源生物质与完全B27相当，Vit A和抗氧化剂增强细胞输出，但对于T细胞分化不是必需的。
实施例7：使用人工胸腺类器官(ATO)系统从人工血干细胞/祖细胞产生CAR-T细胞
在该研究中，发明人尝试确定CAR信号转导对ATO中正常T细胞分化的影响，确定ATO来源的CAR-T细胞的体外和体内功能以及抗肿瘤效力，并且确定CAR介导TCR等位基因排斥的能力。为此目的，将CD19靶向的CAR转导到脐带血CD34+CD3-HSPC中。然后使这些细胞经受ATO系统4-6周的时间。
如图52所示，ATO中的CAR表达主要限于T谱系细胞。由于嵌合抗原受体(CAR)的表面表达和信号转导不依赖于CD3或TCR亚基，所以它们可以在多种细胞谱系中表达。在标准ATO培养物(即MS5-hDLL1基质，补充有5ng/ml FLT3L和5ng/ml IL-7的RB27培养基)中测试了用编码CD19特异性第二代(CD28/CD3ζ)CAR和eGFP的载体转导的CD34+CD3-CB HSPC的谱系输出。简单地说，将7500个经转导的HSPC以1∶20HSPC：基质细胞比例聚集并如描述的那样培养4周。在第4周时，破坏ATO并且分析全部人细胞的谱系标志物(在此示出)。有非常少的eGFP+
(CAR+)单核细胞(CD14+)、粒细胞(CD66b+)、B细胞(CD19+)或NK细胞(CD56+)。大多数CAR+细胞是CD5+和CD7+，与T细胞谱系一致。值得注意的是，CAR+细胞显示几乎完全缺少CD3、TCRab和TCRgd表达，表明为非常规T细胞分化。
ATO来源的CAR-T细胞显示非常规的T细胞分化。分析来自用模拟或CD19特异性第二代(CD28/CD3ζ)CAR转导的CB HSPC起始的第4周ATO的细胞的T细胞标志物。CAR转导的细胞(在GFP+上设门)主要是T谱系(CD5+CD7+)，但没有显示DN至DP至SP T细胞分化的典型模式。相反，大多数细胞是DN或CD8SP(中间行)。此外，在ATO CAR-T细胞中没有CD3/TCR表面表达的证据。这在图53中示出。尽管为非常规T细胞分化，ATO来源的CAR-T细胞(来自CD19特异性第二代(CD28/CD3ζ)CAR转导的CB HSPC)显示正常的初始T细胞表型，其表征为具有CD27和CCR7的共表达的CD45RA+CD45RO-(图54)。这些细胞还共表达CD62L(未显示)。
ATO来源的CAR-T细胞表达CD2细胞内CD3。如图55所示，ATO来源的CAR-T细胞(来自CD19特异性第二代(CD28/CD3ζ)CAR转导的CB HSPC)共表达CD5、CD7、CD2和细胞内CD3，证实其作为T谱系细胞的身份。
ATO来源的CAR-T细胞是DN或CD8αα+。与来自人胸腺的常规T细胞或由TCR转导的HSPC产生的ATO来源的T细胞相反，ATO来源的CAR-T细胞(来自CD19特异性第二代(CD28/CD3ζ)CAR转导的CBHSPC)不表达CD8β(图56A)。它们还表达先天样T细胞的特征性标志物，包括CD56和CD16(图56B)。总之，ATO来源的CAR-T细胞类似人上皮内淋巴细胞(IEL)。
假设ATO中的IEL样CAR-T细胞分化是通过激动剂选择(即通过CAR的强信号转导)驱动的，其通过与ATO中的同源抗原相互作用和/或通过CAR的强信号转导发生。在早期T细胞分化(例如在DN阶段)期间的强信号转导驱动发育中的T细胞绕过常规T细胞分化并进入非经典向IEL样谱系的分化(图57)。
当用CAR共转导时，ATO来源的CAR-T细胞可以表达TCR。在ATO中培养4周的用CAR(CD19特异性第二代(CD28/CD3ζ)和/或TCR(密码子优化的1G4TCR)共转导的CB HSPC得到共表达CD3和转导的TCR(通过四聚体染色显示)的CAR+细胞(GFP+)(图58)。这与它们作为T细胞的身份一致(因为CD3亚基是TCR表达需要的)。值得注意的是，TCR的转导不影响ATO中CAR-T细胞的非常规、IEL样分化。
共表达转导的TCR的ATO来源的CAR-T细胞被CAR和TCR抗原信号转导活化。从第6周ATO中分离由用CAR(CD19特异性第2代(CD28/CD3ζ)或CAR和TCR(密码子优化的1G4TCR)共转导的CB HSPC产生的ATO来源的总GFP+细胞，并且与非特异性K562细胞、用CD19(CAR靶标)或HLA-A*02：01/B2M/NYESO1157-165(TCR靶标)的单链三聚体转导的K562细胞共孵育6小时。通过细胞内干扰素γ染色和表面CD107a染色分析T细胞活化。来自CAR+TCR共转导ATO的T细胞对CAR和TCR靶细胞两者具有响应(图59)。
在没有额外活化/共刺激的情况下，ATO来源的CD19CAR-T细胞响应于CD19+细胞而起作用。从第6周ATO分离由CAR(CD19特异性第2代(CD28/CD3ζ)转导的CB HSPC产生的ATO来源的总GFP+细胞，并与非特异性K562细胞、用CD19(CAR靶标)转导的K562细胞、CD19+Nalm-6白血病细胞系或CD19+Raji淋巴瘤细胞系共孵育6小时。通过细胞内干扰素γ、TNFα和IL-2染色以及表面CD107a染色分析T细胞活化。在不添加外源细胞因子的情况下，ATO来源的CAR-T细胞响应于靶细胞而经历活化(图60)。
图61显示ATO来源的CD19CAR-T细胞具有细胞毒性。从第6周ATO分离由CAR(CD19特异性第2代(CD28/CD3ζ)转导的CB HSPC产生的ATO来源的总GFP+细胞，并且以不同的效应物比靶标(E：T)比例与非特异性K562细胞或CD19+Nalm-6白血病细胞系共孵育9小时。通过膜联蛋白V/DAPI染色测量肿瘤细胞系的凋亡。
如图62所示，利用不同的CAR构建体看到了ATO中的IEL样分化(即激动剂选择)。用不同CAR构建体转导的CB HSPC：CD19特异性第一代(CD3ζ)，第二代(CD28/CD3ζ或4-1BB/CD3ζ)；或GD2特异性第二代(CD28/CD3ζ)CAR。在6周时评估ATO中的分化(在转导的GFP+细胞上设门)。所有CAR构建体看到了类似的IEL样T细胞分化。
实施例8：来自ATO中经CAR转导的ES细胞的CAR-T细胞分化。
来自人ES细胞的ATO来源的CAR-T细胞响应于PMA/离子霉素产生细胞因子。将来自第5周ATO的H1或H1-CAR来源的CD45+细胞用PMA/离子霉素处理6小时。通过细胞内干扰素γ和IL-2染色显示活化。
来自用CD19特异性第二代(CD26/CD3ζ)CAR转导的H1或H1细胞的T细胞分化。用编码CAR和eGFP的慢病毒稳定转导H1-CAR系。如所述使H1或H1-CAR细胞分化到hEMP阶段，并且如所述使分选的hEMP与MS5-hDLL1细胞聚集并分化。简单来说，在EGM2培养基+TGFβ抑制中1周，然后添加SCF、FLT3L、TPO和IL-3持续1周，然后将培养基更换为具有SCF、FLT3L和IL-3的RB27，用于ATO培养至多额外6周。在ATO培养条件开始后的第1-4周如上显示CD45+细胞。T谱系分化通过CD5和CD7的共表达显示。发现经CAR转导的人ES细胞可在ATO中产生CAR-T细胞(图63)。
来自ATO培养条件起始后第1-4周的H1或H1-CAR来源的CD45+细胞显示缺少T细胞成熟的正常标志物，与CB HSPC ATO来源的CAR-T细胞类似。没有DP阶段的T细胞，大多数细胞是DN。H1和H1-CARATO中的CD4dim细胞可能是不成熟的单阳性CD4(ISP4)T细胞前体。如图64所示，来自人ES细胞的ATO来源的CAR-T细胞表现出非常规的T细胞分化。如图65所示，来自人ES细胞的ATO来源的CAR-T细胞不表达CD8β。来自ATO培养条件起始后第1-4周的H1或H1-CAR来源的CD45+细胞显示缺少CD8B，与CB HSPC ATO来源的CAR-T细胞类似。进一步发现来自人ES细胞的ATO来源的CAR-T细胞响应于PMA/离子霉素产生细胞因子(图66A-B)。将来自第5周ATO的H1或H1-CAR来源的CD45+细胞用PMA/离子霉素处理6小时。通过细胞内干扰素γ和TNFα(图66A)或干扰素γ和IL-2染色(图66B)显示活化。最后，发现来自人ES细胞的ATO来源的CAR-T细胞响应于靶细胞产生细胞因子并脱颗粒(图67)。将来自第4周ATO的H1-CAR来源的总GFP+细胞与CD19-K562细胞、用CD19转导的K562细胞或CD19+Nalm-6或RAJI细胞系共培养6小时。通过表面CD107a染色和细胞内干扰素γ染色来测量活化。为了分析，对成熟表型(CD45RA+)CAR-T细胞设门。
实施例9：ATO系统用于T细胞分化的优点。
A.在HSPC/ATO中表达TCR相对于用TCR转导外周血(PB)T细胞的标准免疫治疗方法的一些优点
当PB T细胞被转导以表达特异性抗肿瘤TCR时，其具有预先存在的多样化TCR库。因此，可能在自体细胞中发生内源性TCR链与转基因TCR的错配；这可能导致降低的抗肿瘤特异性，或者产生新的自身反应性错配TCR。由于ATO来源的经TCR改造T细胞中内源性TCRβ重排的等位基因排斥，转导的TCR链与内源TCR链之间错配的风险极大降低。
如上所述，ATO中早期T细胞分化期间TCR的表达导致内源性TCRβ链的等位基因排斥(参见Seet等)。这种现象提高了使用同种异体HSPC产生不会对患者起反应的T细胞的治疗可能性。相反，来自PB的同种异体T细胞不能用于治疗，因为它们的多样化的内源TCR库具有移植物抗宿主病(GvHD)的风险。因此，在ATO系统中诱导的等位基因排斥可允许开发来自同种异体供体的用于免疫治疗的现成产品。
B.在HSPC/ATO中表达嵌合抗原受体(CAR)相对于用CAR转导PB T细胞的标准免疫治疗方法的一些优点
用于CART细胞治疗的常用方法是在PB中表达CAR。如此产生的CART细胞因此也表达来自内源表达的多样化TCR。相反，HSPC的CAR转导产生具有类似于上皮内淋巴细胞(IEL)的CD3-TCR-表型的T细胞。缺少TCR表达应可以预防同种异体接受者中的GvHD，代表了通用产品的可能性。
C.ATO相对于OP9-DL1从HSPC产生经TCR改造T细胞的优点
比利时Bart Vandekerckhove的小组使用OP9-DL1从经TCR转导的CD34+胸腺pro-T细胞或CD34+动员的外周血(MPB)HSPC产生未成熟的T细胞前体(Snauwaert，等，Leukemia，2014)。然而，在该系统中，在第14天(胸腺pro-T)或第33天(MPB)，＜1％的细胞是成熟的CD8+T细胞。大部分经TCR转导的细胞停滞在DP阶段，与OP9-DL1的差的支持T细胞成熟能力一致。本方法产生更成熟的CD8+T细胞。
D.使用ATO相对于OP9-DL1从人多能干细胞(hPSC)分化T细胞的优点
OP9-DL1(或Dll4)先前是用于从hPSC(hESC或hiPSC)分化T细胞的唯一系统。在OP9-DL1上，来自PSC的细胞产量很差，T细胞分化甚至比CB HSPC更差。相比之下，在ATO系统中来自hPSC(hESC或iPSC)的T细胞分化是高效的。从PSC产生的成熟初始CD8和CD4SP细胞甚至比CB HSPC更快。从hPSC产生成熟T细胞的能力意味着通过hPSC的基因编辑以去除或替换免疫反应性基因可以容易地产生真正的现成通用产品。单个PSC来源的T细胞产品可供多个潜在患者使用，克服了目前制造患者特异性产品时存在的时间和成本限制。另外避免了在化疗后从淋巴细胞减少症患者中收获足够的自体T细胞的问题。
E.ATO系统和OP9-DLL1中从脐带血分化的T细胞的比较
先前的实施例显示了使用CD34+脐带血细胞和MS5-hDLL1基质的ATO系统与用于体外人T细胞分化的现有技术方案(OP9-Dll1系统)之间的比较。为了提供ATO系统相对于OP9-DLL1的优势的进一步证据，产生来自3个不同脐带血供体(E37、E43、E68)的ATO并且与OP9-DLL1基质上的分化相比较。图68显示了第4周时两种系统中CD34+和T细胞祖细胞的维持(图68)。两种系统都允许细胞定型为T细胞谱系，如通过CD5和CD7表达所示的。然而，ATO系统在产生CD4CD8双阳性细胞(DP)方面非常有优势(图69)。已经在第4周，ATO系统允许产生稳定的TCRab+CD3+细胞群，其中一些已经是CD8SP，而OP9-hDLL1效率低得多并且由OP9-hDLL1系统产生的活细胞量不允许产生足够的T细胞用于治疗和商业可行性(图70)。图71中示出了图70中数据的数字表示。
***
根据本公开内容，本文公开和要求保护的所有方法可以在没有过度实验的情况下进行和执行。虽然本发明的组合物和方法已经根据优选实施方案进行了描述，但是对于本领域技术人员来说明显的是，可以对所述方法的步骤或者所述方法的步骤顺序进行变化而不脱离本发明的构思、精神和范围。更具体地说，明显的是，化学和生理学上相关的某些试剂可以代替本文所述的试剂，而获得相同或类似的结果。对于本领域技术人员明显的是所有这些类似的替代和修改被认为是在由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。
参考文献
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<150> 62/265,204
<151> 2015-12-09
<150> 62/359,456
<151> 2016-07-07
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 1
gccacagcac tgttgctctt gaagtcc 27
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(5)
<223> 5核苷酸样品特异性条形码
<400> 2
nnnnnggcag ggtcagggtt ctggat 26
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
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ccaccagctc agctccacgt g 21
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(5)
<223> 5核苷酸样品特异性条形码
<400> 4
nnnnngggaa cacsttkttc aggtcctc 28

Claims (186)

1.用于由干细胞或祖细胞制备T细胞组合物的方法，所述方法包括培养三维(3D)细胞聚集体，其包含：
a)表达Notch配体的选定基质细胞群；
b)选定的干细胞或祖细胞群；
其中在包含胰岛素、生物素、转铁蛋白和白蛋白的无血清培养基中培养所述3D细胞聚集体持续足以使所述干细胞或祖细胞体外分化成T细胞的时间。
2.用于由干细胞或祖细胞制备T细胞组合物的方法，所述方法包括培养三维(3D)细胞聚集体，其包含：
a)表达Notch配体的选定基质细胞群；
b)选定的干细胞或祖细胞群；
其中在包含胰岛素的无血清培养基中培养所述3D细胞聚集体持续足以使所述干细胞或祖细胞体外分化成T细胞的时间。
3.权利要求2所述的方法，其中所述Notch配体是外源Notch配体。
4.权利要求2或3所述的方法，其中所述方法还包括对所述干细胞或祖细胞和所述基质细胞进行离心以形成3D细胞聚集体。
5.权利要求2至4中任一项所述的方法，其中所述培养基还包含外部添加的抗坏血酸。
6.权利要求2至5中任一项所述的方法，其中所述培养基还包含外部添加的FLT3配体(FLT3L)、白介素7(IL-7)、干细胞因子(SCF)、促血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)、促血小板生成素(TPO)、IL-2、IL-4、IL-6、IL-15、IL-21、TNF-α、TGF-β、干扰素-γ、干扰素-λ、TSLP、胸腺五肽、多效营养因子、中期因子、或其组合。
7.权利要求2至6中任一项所述的方法，其中所述培养基还包含维生素。
8.权利要求7所述的方法，其中所述维生素包括生物素、DLα生育酚乙酸酯、DLα-生育酚、维生素A、氯化胆碱、泛酸钙、泛酸、叶酸烟酰胺、吡哆醇、核黄素、硫胺、肌醇、维生素B12、或者其组合或其盐。
9.权利要求8所述的方法，其中所述维生素包括生物素、DLα生育酚乙酸酯、DLα-生育酚、维生素A、或者其组合或盐。
10.权利要求2至9中任一项所述的方法，其中所述培养基还包含蛋白质。
11.权利要求10所述的方法，其中所述蛋白质包括白蛋白或牛血清白蛋白、BSA的级分、过氧化氢酶、胰岛素、转铁蛋白、超氧化物歧化酶、或其组合。
12.权利要求2至11中任一项所述的方法，其中所述培养基还包含皮质酮、D-半乳糖、乙醇胺、谷胱甘肽、L-肉毒碱、亚油酸、亚麻酸、孕酮、腐胺、亚硒酸钠或三碘-I-甲腺原氨酸、或其组合。
13.权利要求2至12中任一项所述的方法，其中所述培养基包含补充剂、无异源补充剂、GS21TM补充剂、或其组合。
14.权利要求2至13中任一项所述的方法，其中所述培养基包含或还包含氨基酸、单糖、无机离子。
15.权利要求14所述的方法，其中所述氨基酸包括精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸或缬氨酸、或其组合。
16.权利要求14所述的方法，其中所述无机离子包括钠、钾、钙、镁、氮或磷、或者其组合或盐。
17.权利要求2至16中任一项所述的方法，其中所述培养基还包含钼、钒、铁、锌、硒、铜或锰、或其组合。
18.权利要求2至17中任一项所述的方法，其中所述3D细胞聚集体包含确定的外源性细胞外基质。
19.权利要求2至17中任一项所述的方法，其中所述3D细胞聚集体不包含外源性基质或支架。
20.权利要求2至19中任一项所述的方法，其中所述基质细胞具有编码Notch配体的外源核苷酸序列。
21.权利要求2至20中任一项所述的方法，其中所述Notch配体是完整的、部分的或经修饰的DLL4、DLL1、JAG1、JAG2、或其组合。
22.权利要求2至21中任一项所述的方法，其中所述干细胞或祖细胞选自胚胎干细胞(ESC)、诱导多能干细胞(iPSC)、人胚胎中胚层祖细胞、造血干细胞或祖细胞、从骨髓分离的细胞、从脐带血分离的细胞、从外周血分离的细胞、从胸腺分离的细胞、或已由ESC或iPSC体外分化的细胞。
23.权利要求2至22中任一项所述的方法，其中基质细胞与干细胞或祖细胞之间的比例为约1∶5至1∶20。
24.权利要求2至23中任一项所述的方法，其中所述基质细胞是鼠基质细胞系、人基质细胞系、选定原代基质细胞群、由多能干细胞体外分化的选定基质细胞群、或其组合。
25.权利要求2至23中任一项所述的方法，其中所述基质细胞是由造血干细胞或祖细胞体外分化的选定基质细胞群。
26.权利要求2至25中任一项所述的方法，其中所述基质细胞表达外源性人主要组织相容性复合体(MHC)。
27.权利要求2至26中任一项所述的方法，其中所述基质细胞表达外源性抗原特异性共刺激分子或细胞因子。
28.权利要求2至27中任一项所述的方法，其中所述基质细胞表达外源性抗原。
29.权利要求2至28中任一项所述的方法，其中所述干细胞或祖细胞已预先冷冻。
30.权利要求2至28中任一项所述的方法，其中所述干细胞或祖细胞从未被冷冻。
31.权利要求2至30中任一项所述的方法，其中所述干细胞或祖细胞表达外源性T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)、或二者。
32.权利要求2至30中任一项所述的方法，其中所述干细胞或祖细胞表达内源性T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)、或二者。
33.权利要求2至32中任一项所述的方法，其中所述干细胞或祖细胞表达外源性不变自然杀伤T细胞(iNKT)相关TCR。
34.权利要求2至33中任一项所述的方法，其中所述干细胞或祖细胞表达外源性抗原特异性TCR、选择标志物或筛选标志物、体内追踪标志物或体内成像标志物，或者具有HLA基因座、自然杀伤细胞受体或配体的外源性遗传修饰。
35.权利要求2至34中任一项所述的方法，其中所述干细胞或祖细胞的数目为1,000至200,000。
36.权利要求2至35中任一项所述的方法，其中所述培养进行约2周至10周的时间。
37.权利要求2至36中任一项所述的方法，其中所述培养不涉及细胞传代。
38.权利要求2至37中任一项所述的方法，其还包括检测以下细胞的数目：CD4+CD8-T细胞、CD4-CD8+T细胞、CD34+CD7+CD1a+细胞、CD3+TCRab+细胞、CD3+TCRgd+细胞、CD3+TCRab+CD4+CD8-细胞、CD3+TCRab+CD8+CD4-细胞、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+细胞、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+细胞、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+CCR7+细胞、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+CCR7+细胞、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+CD27+细胞、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+CD27+细胞、CD34+CD7+CD1a+细胞、CD34+CD5+CD7+细胞、CD34+CD5+CD7-细胞、自然杀伤T细胞、调节性T细胞、上皮内淋巴细胞(IEL)、使用四聚体或抗TCR抗体的抗原特异性T细胞、使用经修饰抗原的CAR T细胞、使用荧光标志物的经转导T细胞、或其组合。
39.权利要求2至38中任一项所述的方法，其还包括选择CD4+CD8-T细胞、CD4-CD8+T细胞、CD34+CD7+CD1a+细胞、CD3+TCRab+细胞、CD3+TCRgd+细胞、CD3+TCRab+CD4+CD8-细胞、CD3+TCRab+CD8+CD4-细胞、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+细胞、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+细胞、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+CCR7+细胞、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+CCR7+细胞、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+CD27+细胞、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+CD27+细胞、CD34+CD7+CD1a+细胞、CD34+CD5+CD7+细胞、CD34+CD5+CD7-细胞、自然杀伤T细胞、调节性T细胞、上皮内淋巴细胞(IEL)、使用四聚体或抗TCR抗体的抗原特异性T细胞、使用经修饰抗原的CAR T细胞、使用荧光标志物的经转导T细胞、或其组合。
40.权利要求2至39中任一项所述的方法，其还包括增加以下细胞的数目：CD4+CD8-T细胞、CD4-CD8+T细胞、CD34+CD7+CD1a+细胞、CD3+TCRab+细胞、CD3+TCRgd+细胞、CD3+TCRab+CD4+CD8-细胞、CD3+TCRab+CD8+CD4-细胞、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+细胞、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+细胞、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+CCR7+细胞、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+CCR7+细胞、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+CD27+细胞、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+CD27+细胞、CD34+CD7+CD1a+细胞、CD34+CD5+CD7+细胞、CD34+CD5+CD7-细胞、自然杀伤T细胞、调节性T细胞、上皮内淋巴细胞(IEL)、使用四聚体或抗TCR抗体的抗原特异性T细胞、使用经修饰抗原的CAR T细胞、使用荧光标志物的经转导T细胞、或其组合。
41.权利要求2至40中任一项所述的方法，其还包括将来自所述3D细胞聚集体的所述T细胞施用于有此需要的对象。
42.权利要求2至40中任一项所述的方法，其还包括使来自所述3D细胞聚集体的所述T细胞分化。
43.权利要求2至42中任一项所述的方法，其中来自所述3D细胞聚集体的所述T细胞通过等位基因排斥而不表达内源性TCR。
44.权利要求2至43中任一项所述的方法，其中来自所述3D细胞聚集体的所述T细胞表达外源性TCR或CAR。
45.权利要求2至44中任一项所述的方法，其中所述时间为2至16周。
46.权利要求2至45中任一项所述的方法，其中所述T细胞经历正选择。
47.权利要求2至46中任一项所述的方法，其中所述细胞聚集体还包含肿瘤细胞或肿瘤抗原。
48.权利要求2至47中任一项所述的方法，其中所述方法还包括从所述T细胞分离内源性表达的TCR。
49.权利要求48所述的方法，其中所述方法还包括使所述T细胞致敏。
50.权利要求49所述的方法，其中所述T细胞用抗原呈递细胞致敏。
51.权利要求50所述的方法，其中所述抗原呈递细胞呈递肿瘤抗原。
52.细胞培养组合物，其包含：
a)包含以下的三维(3D)细胞聚集体：
i)表达Notch配体的选定基质细胞群，
ii)选定的干细胞或祖细胞群；和
b)包含胰岛素的无血清培养基。
53.权利要求52所述的组合物，其中所述Notch配体是外源Notch配体。
54.权利要求52或53所述的组合物，其中所述培养基还包含外部添加的抗坏血酸。
55.权利要求52至54中任一项所述的组合物，其中所述培养基还包含外部添加的FLT3配体(FLT3L)、白介素7(IL-7)、干细胞因子(SCF)、促血小板生成素(TPO)、IL-2、IL-4、IL-6、IL-15、IL-21、TNF-α、TGF-β、干扰素-γ、干扰素-λ、TSLP、胸腺五肽、多效营养因子、中期因子、或其组合。
56.权利要求52至55中任一项所述的组合物，其中所述培养基还包含维生素。
57.权利要求56所述的组合物，其中所述维生素包括生物素、DLα生育酚乙酸酯、DLα-生育酚、维生素A、氯化胆碱、泛酸钙、泛酸、叶酸烟酰胺、吡哆醇、核黄素、硫胺、肌醇、维生素B12、或者其组合或其盐。
58.权利要求56所述的组合物，其中所述维生素包括生物素、DLα生育酚乙酸酯、DLα-生育酚、维生素A、或者其组合或盐。
59.权利要求52至58中任一项所述的组合物，其中所述培养基还包含蛋白质。
60.权利要求59所述的组合物，其中所述蛋白质包括白蛋白或牛血清白蛋白、BSA的级分、过氧化氢酶、胰岛素、转铁蛋白、超氧化物歧化酶、或其组合。
61.权利要求52至60中任一项所述的组合物，其中所述培养基还包含皮质酮、D-半乳糖、乙醇胺、谷胱甘肽、L-肉毒碱、亚油酸、亚麻酸、孕酮、腐胺、亚硒酸钠或三碘-I-甲腺原氨酸、或其组合。
62.权利要求52至61中任一项所述的组合物，其中所述培养基包含补充剂、无异源补充剂、GS21TM补充剂、或其组合。
63.权利要求52至62中任一项所述的组合物，其中所述培养基包含或还包含氨基酸、单糖或无机离子、或其组合。
64.权利要求63所述的组合物，其中所述氨基酸包括精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸或缬氨酸、或其组合。
65.权利要求63所述的组合物，其中所述无机离子包含钠、钾、钙、镁、氮或磷、或者其组合或盐。
66.权利要求52至65中任一项所述的组合物，其中所述培养基还包含钼、钒、铁、锌、硒、铜或锰、或其组合。
67.权利要求52至66中任一项所述的组合物，其中所述3D细胞聚集体包含确定的外源性细胞外基质。
68.权利要求52至67中任一项所述的组合物，其中所述3D细胞聚集体不包含外源性基质或支架。
69.权利要求52至68中任一项所述的组合物，其中所述基质细胞具有编码Notch配体的外源核苷酸序列。
70.权利要求52至69中任一项所述的组合物，其中所述Notch配体是完整的、部分的或经修饰的DLL4、DLL1、JAG1、JAG2、或其组合。
71.权利要求52至70中任一项所述的组合物，其中所述干细胞或祖细胞选自ESC、iPSC、人胚胎中胚层祖细胞、造血干细胞或祖细胞、从骨髓分离的细胞、从脐带血分离的细胞、从外周血分离的细胞、从胸腺分离的细胞或已由ESC或iPSC体外分化的细胞。
72.权利要求52至71中任一项所述的组合物，其中基质细胞与干细胞或祖细胞之间的比例为约1∶5至1∶20。
73.权利要求52至72中任一项所述的组合物，其中所述基质细胞是鼠基质细胞系、人基质细胞系、选定原代基质细胞群、由多能干细胞体外分化的选定基质细胞群、或其组合。
74.权利要求52至73中任一项所述的组合物，其中所述基质细胞是由造血干细胞或祖细胞体外分化的选定基质细胞群。
75.权利要求52至74中任一项所述的组合物，其中所述干细胞或祖细胞已预先冷冻。
76.权利要求52至74中任一项所述的组合物，其中所述干细胞或祖细胞从未被冷冻。59.权利要求52至76中任一项所述的组合物，其中所述基质细胞表达外源性人主要组织相容性复合体(MHC)。
77.权利要求52至76中任一项所述的组合物，其中所述基质细胞表达外源性抗原特异性共刺激分子、细胞因子、抗原或细胞外基质蛋白，或调节T细胞分化、增殖或功能的任何其他生物活性分子或基因。
78.权利要求52至77中任一项所述的组合物，其中所述干细胞或祖细胞表达外源性T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)或二者。
79.权利要求52至78中任一项所述的组合物，其中所述干细胞或祖细胞表达外源性不变自然杀伤T细胞(iNKT)相关TCR。
80.权利要求52至79中任一项所述的组合物，其中所述干细胞或祖细胞表达外源性抗原特异性TCR或具有调节T细胞分化、扩增或功能的基因的外源性遗传修饰。
81.权利要求52至80中任一项所述的组合物，其中所述干细胞或祖细胞的数目为1至200,000。
82.用于产生T细胞的方法，其包括培养权利要求52至81中任一项所述的细胞培养组合物，从而产生T细胞。
83.权利要求82所述的方法，其还限定为用于产生抗原特异性T细胞的方法，其中所述祖细胞表达外源性抗原特异性TCR或CAR。
84.权利要求82或83所述的方法，其还包括检测以下细胞的数目：CD4+CD8-T细胞、CD4-CD8+T细胞、CD34+CD7+CD1a+细胞、CD3+TCRab+细胞、CD3+TCRgd+细胞、CD3+TCRab+CD4+CD8-细胞、CD3+TCRab+CD8+CD4-细胞、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+细胞、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+细胞、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+CCR7+细胞、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+CCR7+细胞、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+CD27+细胞、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+CD27+细胞、CD34+CD7+CD1a+细胞、CD34+CD5+CD7+细胞、CD34+CD5+CD7-细胞、自然杀伤T细胞、调节性T细胞、上皮内淋巴细胞(IEL)、使用四聚体或抗TCR抗体的抗原特异性T细胞、使用经修饰抗原的CAR T细胞、使用荧光标志物的经转导T细胞、或其组合。
85.权利要求82至84中任一项所述的方法，其还包括增加以下细胞的数目：CD4+CD8-T细胞、CD4-CD8+T细胞、CD34+CD7+CD1a+细胞、CD34+CD7+CD1a+细胞、CD3+TCRab+细胞、CD3+TCRgd+细胞、CD3+TCRab+CD4+CD8-、CD3+TCRab+CD8+CD4-细胞、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+细胞、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+细胞、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+CCR7+细胞、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+CCR7+细胞、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+CD27+细胞、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+CD27+细胞、CD34+CD7+CD1a+细胞、CD34+CD5+CD7+细胞、CD34+CD5+CD7-细胞、自然杀伤T细胞、调节性T细胞、上皮内淋巴细胞(IEL)、使用四聚体或抗TCR抗体的抗原特异性T细胞、使用经修饰抗原的CAR T细胞、使用荧光标志物的经转导T细胞、或其组合。
86.包含嵌合抗原受体(CAR)的分离的T细胞或T细胞群，其中所述T细胞具有上皮内淋巴细胞表型。
87.权利要求87所述的T细胞，其中所述T细胞是TCR-。
88.权利要求86所述的T细胞，其中所述T细胞是CD4-CD8+、CD4+CD8-、CD4+CD8+、CD4-CD8-、TCRab+、TCRgd+、CD5+CD7+、CD5+CD7+CD3-CD4-CD8-、CD5+CD7+CD3-CD4-CD8aa、或其组合。
89.权利要求88所述的分离的T细胞，其中所述T细胞是CD5+CD7+CD3-CD4-CD8-。
90.权利要求89所述的分离的T细胞，其中所述T细胞是CD5+CD7+CD3-CD4-CD8aa。
91.权利要求86至90中任一项所述的分离的T细胞，其中所述CAR包括CD19CAR。
92.权利要求86至91中任一项所述的分离的T细胞，其中所述T细胞还包含外源性TCR。
93.权利要求92所述的分离的T细胞，其中所述T细胞是CD3+。
94.权利要求86至93中任一项所述的分离的T细胞，其中所述T细胞是CD4+CD8-T细胞、CD4-CD8+T细胞、CD34+CD7+CD1a+细胞、CD3+TCRab+、CD3+TCRgd+细胞、CD3+TCRab+CD4+CD8-细胞、CD3+TCRab+CD8+CD4-细胞、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+ 细胞、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+细胞、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+CCR7+细胞、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+CCR7+细胞、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+CD27+细胞、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+CD27+、CD34+CD7+CD1a+细胞、CD34+CD5+CD7+细胞、CD34+CD5+CD7-细胞、自然杀伤T细胞、调节性T细胞、抗原特异性T细胞、上皮内淋巴细胞T细胞，或是CD45+、CD11b+、CD11b-、CD15+、CD15-、CD24+、CD24-、CD114+、CD114-、CD182+、CD182-、CD4+、CD4-、CD14+、CD14-、CD11a+、CD11a-、CD91+、CD91-、CD16+、CD16-、CD3+、CD3-、CD25+、CD25-、Foxp3+、Fox3p-、CD8+、CD8-、CD19+、CD19-、CD20+、CD20-、CD24+、CD24、CD38+、CD38-、CD22+、CD22-、CD61+、CD61-、CD16+、CD16-、CD56+、CD56-、CD31+、CD31-、CD30+、CD30-、CD38+或CD38-的细胞，或其组合。
95.分离的T细胞或T细胞群，其中所述T细胞表达外源性TCR或CAR，并且其中所述T细胞是CD4-CD8-T细胞、CD4-CD8+T细胞、CD34+CD7+CD1a+细胞、CD3+TCRab+、CD3+TCRgd+、CD3+TCRab+CD4+CD8-、CD3+TCRab+CD8+CD4-、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+CCR7+、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+CCR7+、CD3+TCRab+CD4+CD8-CD45RO-CD45RA+CD27+、CD3+TCRab+CD8+CD4-CD45RO-CD45RA+CD27+、CD34+CD7+CD1a-细胞、CD34+CD5+CD7+、CD34+CD5+CD7-、自然杀伤T细胞、调节性T细胞、抗原特异性T细胞、上皮内淋巴细胞T细胞、CD45+、CD11b+、CD11b-、CD15+、CD15-、CD24+、CD24-、CD114+、CD114-、CD182+、CD182-、CD4+、CD4-、CD14+、CD14-、CD11a+、CD11a-、CD91+、CD91-、CD16+、CD16-、CD3+、CD3-、CD25+、CD25-、Foxp3+、Fox3p-、CD8+、CD8-、CD19+、CD19-、CD20+、CD20-、CD24+、CD24、CD38+、CD38-、CD22+、CD22-、CD61+、CD61-、CD16+、CD16-、CD56+、CD56-、CD31+、CD31-、CD30+、CD30-、CD38+或CD38-细胞，或具有其组合的细胞。
96.权利要求86至96中任一项所述的T细胞，其中所述T细胞是T细胞群，并且其中所述T细胞群包含至少50％的为成熟初始CD8或CD4单阳性细胞的细胞。
97.权利要求86至96中任一项所述的T细胞，其中所述细胞表达外源性不变自然杀伤T细胞(iNKT)相关TCR。
98.权利要求86至97中任一项所述的T细胞，其中所述细胞已由干细胞或祖细胞体外分化。
99.权利要求98所述的T细胞，其中所述干细胞或祖细胞选自ESC、iPSC、人胚胎中胚层祖细胞、造血干细胞或祖细胞、从骨髓分离的细胞、从脐带血分离的细胞、从外周血分离的细胞、从胸腺分离的细胞或已由ESC或iPSC体外分化的细胞。
100.权利要求86至99中任一项所述的T细胞，其中内源性TCR已通过等位基因排斥而被抑制。
101.用于治疗患者的方法，其包括向所述患者施用包含外源性TCR的体外分化T细胞或T细胞前体。
102.权利要求101所述的方法，其中所述T细胞包含所述外源性TCR和另外的抗原或配体识别受体。
103.权利要求101或102所述的方法，其中所述外源性TCR包括来自NKT的TCR。
104.权利要求101至103中任一项所述的方法，其中所述外源性TCR包含由TCR-α和TCR-β基因表达的蛋白质。
105.权利要求101至103中任一项所述的方法，其中所述外源性TCR包含由TCR-γ和TCR-δ基因表达的蛋白质。
106.权利要求101至103中任一项所述的方法，其中所述外源性TCR包含由TCR-α和TCR-β基因表达的蛋白质，并且所述抗原识别受体包含由TCR-γ和TCR-δ基因表达的蛋白质。
107.权利要求101至103中任一项所述的方法，其中所述外源性TCR包含由TCR-γ和TCR-δ基因表达的蛋白质，并且所述抗原识别受体包含由TCR-α和TCR-β基因表达的蛋白质。
108.权利要求102所述的方法，其中所述另外的抗原识别受体不是TCR分子。
109.权利要求101至108中任一项所述的方法，其中所述外源性TCR是模拟TCR信号转导的经改造分子。
110.权利要求102或108所述的方法，其中所述另外的抗原识别受体是嵌合抗原受体(CAR)。
111.权利要求110所述的方法，其中所述CAR是肿瘤抗原特异性CAR。
112.权利要求102至111中任一项所述的方法，其中所述外源性TCR对第一抗原具有特异性，并且所述另外的抗原识别受体对第二抗原具有特异性。
113.权利要求112所述的方法，其中所述第一和第二抗原是由所述患者的癌细胞表达的癌细胞抗原。
114.权利要求101至113中任一项所述的方法，其中所述外源性TCR是病毒特异性TCR、异种特异性TCR、癌细胞特异性TCR、细菌特异性TCR或癌症-睾丸抗原特异性TCR。
115.权利要求101至114中任一项所述的方法，其中所述T细胞相对于接受者是同种异体的。
116.权利要求101至115中任一项所述的方法，其中所述患者患有癌症。
117.权利要求116所述的方法，其中所述方法用于在对象中治疗癌症。
118.权利要求116或117所述的方法，其中所述癌症选自肺癌、前列腺癌、卵巢癌、睾丸癌、脑癌、皮肤癌、黑素瘤、结肠癌、直肠癌、胃癌、食管癌、气管癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、包括淋巴瘤和多发性骨髓瘤的淋巴样癌症、白血病、骨肉瘤或软组织肉瘤、宫颈癌和外阴癌。
119.权利要求101至118中任一项所述的方法，其中所述方法还包括施用抗原，其中所述抗原被所述外源性TCR识别。
120.权利要求119所述的方法，其中所述抗原是经纯化的、与其他分子缀合的或由细胞或细胞样载剂呈递的。
121.权利要求101至120中任一项所述的方法，其中所述外源性TCR是非同种异体反应性的。
122.权利要求101至121中任一项所述的方法，其中所述外源性TCR是惰性的。
123.在一些实施方案中，所述CAR是病毒抗原特异性CAR或细菌抗原特异性CAR。
124.权利要求101至115或119至123中任一项所述的方法，其中所述患者患有微生物感染或处于患有微生物感染风险之中。
125.权利要求124所述的方法，其中所述第一和第二抗原是由相同病毒类型表达或由被所述病毒类型感染的细胞表达的病毒抗原。
126.权利要求124所述的方法，其中所述第一和第二抗原是由相同细菌表达或在被所述细菌感染的细胞中表达的细菌细胞抗原。
127.权利要求101至123中任一项所述的方法，其中所述外源性TCR是NY-ESO-1特异性TCR。
128.权利要求101至127中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述患者施用抗原呈递细胞。
129.权利要求128所述的方法，其中所述抗原呈递细胞是树突细胞。
130.权利要求128所述的方法，其中所述抗原呈递细胞是人工抗原呈递细胞。
131.权利要求128至130中任一项所述的方法，其中所述抗原呈递细胞装载有被所述外源性TCR或CAR识别的抗原。
132.权利要求101至131中任一项所述的方法，其中所述T细胞还包含FOXP3表达。
133.权利要求132所述的方法，其中所述T细胞被改造或选择以表达FOXP3。
134.权利要求133所述的方法，其中所述FOXP3表达是组成型的。
135.权利要求132至134中任一项所述的方法，其中所述对象患有自身免疫病、移植物抗宿主病(GVHD)或移植物排斥，或处于患有上述疾病的风险之中。
136.权利要求135所述的方法，其中所述方法用于治疗自身免疫病、GVHD或移植物排斥。
137.体外分化的T细胞或T细胞前体，其包含外源性TCR。
138.权利要求137所述的T细胞，其中所述TCR是病毒特异性TCR、异种特异性TCR、癌细胞特异性TCR、细菌特异性TCR或癌症-睾丸抗原特异性TCR。
139.权利要求137或138所述的T细胞，其中所述T细胞还包含另外的抗原识别受体。
140.权利要求138或139所述的T细胞，其中所述外源性TCR包含由TCR-α和TCR-β基因表达的蛋白质。
141.权利要求138或139所述的T细胞，其中所述外源性TCR包含由TCR-γ和TCR-δ基因表达的蛋白质。
142.权利要求139所述的T细胞，其中所述外源性TCR包含由TCR-α和TCR-β基因表达的蛋白质，并且所述抗原识别受体包含由TCR-γ和TCR-δ基因表达的蛋白质。
143.权利要求139所述的T细胞，其中所述外源性TCR包含由TCR-γ和TCR-δ基因表达的蛋白质，并且所述抗原识别受体包含由TCR-α和TCR-β基因表达的蛋白质。
144.权利要求139所述的T细胞，其中所述另外的抗原识别受体不是TCR分子。
145.权利要求139或144所述的T细胞，其中所述另外的抗原识别受体是嵌合抗原受体(CAR)。
146.权利要求145所述的T细胞，其中所述CAR是肿瘤抗原特异性CAR。
147.权利要求145所述的T细胞，其中所述CAR是病毒抗原特异性CAR。
148.权利要求138至144中任一项所述的T细胞，其中所述外源性TCR对第一抗原具有特异性，并且所述另外的抗原识别受体对第二抗原具有特异性。
149.权利要求148所述的T细胞，其中所述第一和第二抗原是由癌细胞表达的癌细胞抗原。
150.权利要求148所述的T细胞，其中所述第一和第二抗原是由病毒表达或被所述病毒感染的细胞表达的病毒抗原。
151.权利要求148所述的T细胞，其中所述第一和第二抗原是由细菌细胞表达或被所述细菌感染的细胞表达的细菌抗原。
152.权利要求137至149中任一项所述的T细胞，其中所述外源性TCR是NY-ESO-1特异性TCR。
153.权利要求137至152中任一项所述的T细胞，其中所述T细胞还包含FOXP3表达。
154.权利要求153所述的T细胞，其中所述T细胞被改造或选择以表达FOXP3。
155.权利要求154所述的T细胞，其中所述FOXP3表达是组成型的。
156.用于向具有外源性TCR表达T细胞的患者中的所述外源性TCR表达T细胞递送药剂的方法，其包括向所述患者施用与抗原缀合的药剂，其中所述抗原被所述外源性TCR识别。
157.权利要求156所述的方法，其中所述外源性TCR是惰性的。
158.权利要求156或157所述的方法，其中所述药剂是消除剂。
159.用于体外选择和分离权利要求137至155中任一项所述的T细胞的方法，其包括使包含所述T细胞的组合物与与所述外源性TCR特异性结合的药剂接触以制备药剂-TCR表达细胞复合物，以及从所述组合物纯化所述药剂-TCR表达细胞复合物。
160.权利要求159所述的方法，其中所述药剂是抗体。
161.权利要求159所述的方法，其中所述药剂是肽-MHC多聚体。
162.权利要求159至161中任一项所述的方法，其中所述药剂与固体支持物连接。
163.权利要求159至161中任一项所述的方法，其中所述方法还包括施用与所述药剂特异性结合的第二分子。
164.权利要求163所述的方法，其中所述第二分子与固体支持物连接。
165.权利要求162至164中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述固体支持物和结合的分子与所述组合物分离。
166.权利要求165所述的方法，其中所述方法还包括洗涤所述固体支持物和缔合的分子一次或更多次。
167.权利要求159至165中任一项所述的方法，其中所述药剂或第二分子与荧光分子缀合。
168.权利要求159至167中任一项所述的方法，其中纯化所述药剂-TCR表达细胞复合物包括流式细胞术、荧光激活细胞分选(FACS)、珠和/或柱。
169.权利要求159至168中任一项所述的方法，其中纯化所述药剂-TCR表达细胞复合物包括基于另外的T细胞标志物的纯化。
170.权利要求169所述的方法，其中所述另外的T细胞标志物是CD4、CD8、CD45RA、CD45RO、CCR7/CD197、CD62L、CD27、CD28和CD1a中的一种或更多种。
171.权利要求159至170中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述药剂从所述药剂-TCR表达细胞复合物解离。
172.权利要求159至166中任一项所述的方法，其中所述方法还包括培养所纯化的TCR表达细胞。
173.权利要求159至172中任一项所述的方法，其中所述方法还包括冷冻所纯化的TCR表达细胞。
174.制备权利要求137至155中任一项所述的T细胞的方法，其包括：
a)将外源性TCR或TCR衍生物转移到干细胞或祖细胞中；以及
b)使所述干细胞或祖细胞分化成T细胞或T细胞前体。
175.权利要求174所述的方法，其中所述干细胞或祖细胞在与分化剂接触之前、同时和/或之后与同源MHC和/或肽分子接触。
176.权利要求174或175所述的方法，其中使所述干细胞或祖细胞分化成T细胞包括将干细胞或祖细胞与表达Notch配体的基质细胞共培养。
177.权利要求176所述的方法，其中所述基质细胞是OP9细胞、MS5或HS27细胞。
178.权利要求176或177所述的方法，其中所述Notch配体是δ样1(Dll1)。
179.权利要求176至178中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使共培养的干细胞或祖细胞和基质细胞与Flt-3配体和/或IL-7接触。
180.权利要求174或175所述的方法，其中使所述干细胞或免疫祖细胞分化成T细胞包括权利要求2至52中任一项所述的方法。
181.用于增加对象中T细胞的数目或用于在对象中治疗疾病或病症的方法，所述方法包括向对象施用有效量根据权利要求2至52中任一项制备的T细胞或抗原特异性T细胞或者权利要求137至155或86至100中任一项所述的T细胞。
182.权利要求181所述的方法，其中所述对象已被确定患有自身免疫病、癌症、感染、免疫缺陷、或其组合，或处于其风险之中。
183.权利要求181或182所述的方法，其中所述T细胞是调节性T细胞。
184.权利要求183所述的方法，其中所述对象已被确定患有自身免疫病或处于其风险之中。
185.用于产生不与自身抗原反应的T细胞的方法，其包括以有效地由3D细胞聚集体产生T细胞的浓度用无血清培养基培养三维(3D)细胞聚集体，其中所述3D细胞聚集体包含：a)表达Notch配体的选定基质细胞群和b)选定的干细胞或祖细胞群，其中a)或b)中的一种或更多种细胞表达外源性自身抗原；由此所述3D细胞聚集体产生不与自身抗原反应的T细胞。
186.权利要求185所述的方法，其中a)或b)中的一种或更多种细胞表达外源性自身MHC。
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