TW202344686A - 從幹細胞產生t細胞之方法及使用該t細胞之免疫療法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供產生T細胞之方法及組合物。本發明亦提供使用經改造T細胞之治療方法。舉例而言，在某些態樣中，方法包括於無血清培養基中製備包含基質細胞及造血幹細胞或祖細胞之三維細胞培養組合物以產生T細胞。

Description

從幹細胞產生T細胞之方法及使用該T細胞之免疫療法
本發明概言之係關於細胞培養及發育之領域。更具體而言，本發明係關於自幹細胞或祖細胞產生T細胞。
當前經改造T細胞療法(包括經TCR改造之方法及CAR-T方法)依賴於基因修飾自體末梢血T細胞(即用於修飾之T細胞係自接受其之同一患者分離)。需要自體方法之原因在於，供體T細胞在移植至同種異體(非自身)接受者中時之同種異體反應性，此可引起接受者之組織損傷症候群，稱為移植物抗宿主病(GVHD)。然而，儘管當前在晚期臨床試驗中快速推動自體細胞療法之商業化，但使用患者特異性自體經改造T細胞療法係勞動及成本極其密集的且具有不確定可擴縮性。此外，在無法充分收集正常T細胞之患者(例如，少淋巴球性患者)或T細胞功能受損之彼等(例如，HIV/AIDS患者；因年齡相關之免疫功能障礙之老年患者)中，無法使用自體經改造T細胞療法或該等療法具有降低的效能。鑒於該等許多問題，產生非同種異體反應性現成經改造T細胞療法之方法係授受性細胞療法領域中極為迫切的商業需要。
本文闡述產生經改造T細胞之方法及所得T細胞之組合物。在一些實施例中，T細胞係非同種異體反應性的且表現外源TCR及/或CAR。該等T細胞可用於「現成」T細胞療法且無需使用患者之自身T細胞。因此，當前方法提供更成本有效、更低勞動密集型T細胞免疫療法。本文亦闡述使用該等T細胞之免疫療法。 本發明之態樣係關於新穎三維細胞培養系統，其自較低分化之細胞(例如胚胎幹細胞、多潛能幹細胞、造血幹細胞或祖細胞或本文所述及業內已知之幹細胞或祖細胞)產生T細胞。在具體實施例中，該系統涉及使用無血清培養基。在某些態樣中，新穎系統使用適於神經細胞發育之無血清培養基來培養三維細胞聚集體(包括基質細胞及幹細胞或祖細胞)以產生T細胞，或更特定而言抗原特異性T細胞或已經歷活體外正向或負向選擇之T細胞。在本發明實施例中，將3D細胞聚集體於包含胰島素之無血清培養基中培養一段時間以足以使幹細胞或祖細胞在活體外分化成T細胞。在一些實施例中，T細胞經歷正向選擇，此提供對特異性抗原具高親合力之T細胞。 因此，本發明之態樣係關於細胞培養組合物，其包含三維(3D)細胞聚集體及培養基。在一些實施例中，3D細胞聚集體包含：a) 所選基質細胞群；及/或b) 所選幹細胞或祖細胞群。明確預期在具體實施例中可不包括或實質上不包括a)或b)。在某些實施例中，細胞中之一或多者、具體而言基質細胞可表現Notch配體。在一些實施例中，Notch配體係外源配體。在一些實施例中，Notch配體係內源配體。在其他實施例中，培養基可包含外加之Notch配體。在其他實施例中，外加之Notch配體可附接至固體支撐物或經固定。舉例而言，在一些實施例中，基質細胞具有編碼Notch配體之外源核苷酸序列，該核苷酸序列可藉由轉染或轉導引入(或先前已引入)細胞中。在某些實施例中，培養組合物可不包含Notch配體，或可不包含外加之Notch配體。 如本文所用術語「notch配體」包括完整notch配體(全長)、部分notch配體(截短形式)或經修飾notch配體(包含一或多個突變，例如保守突變)以及來自任何物種之Notch配體或其保留全長Notch配體之至少一種活性或功能的片段。亦包括模擬notch配體之肽。Notch配體可為「典型notch配體」或「非典型notch配體」。典型notch配體之特徵在於細胞外結構域，其通常包含N末端(NT)結構域，其後為Delta/Serrate/LAG-2 (DSL)結構域及多個串聯排列之表皮生長因子(EGF)樣重複。DSL結構域以及側接NT結構域及前兩個含有δ及OSM-11樣蛋白質(DOS)基序之EGF重複通常為典型配體結合Notch所必需。一些典型配體之細胞內結構域含有獨立於Notch信號傳導起作用之羧基末端PSD-95/Dlg/ZO-1配體(PDZL)基序。隱桿線蟲(C. elegans) DSL配體缺少DOS基序，但業內已提出與僅含DOS之配體協作來活化Notch信號傳導。說明性典型notch配體包括(但不限於) δ樣配體4 (DLL4)、δ樣配體1 (DLL1)、Jagged 1 (JAG1 )、Jagged 2 (JAG2)、δ樣配體3 (DLL3)及X-δ 2；其他類似說明性典型配體涵蓋於其他實施例中。 非典型notch配體缺少DSL結構域(Delta/Serrate/LAG-2)，結構多樣且包括整合及GPI偶聯膜蛋白以及多種分泌蛋白。當本文提及「notch配體片段」或「典型notch配體片段」時，預期該片段係結合notch之片段。非典型notch配體之實例包括(但不限於)接觸蛋白-1、NOV/CCN3、接觸蛋白-6、骨膜素/OSF-2、DLK2/EGFL9、Pref-1/DLK1/FA1、DNER、凝血酶敏感蛋白-2、MAGP-1/MFAP2、凝血酶敏感蛋白-3、MAGP-2/MFAP5、凝血酶敏感蛋白-4及神經導向因子-1。 在一些實施例中，培養基進一步包含維生素。在一些實施例中，培養基包含以下中之1者、2者、3者、4者、5者、6者、7者、8者、9者、10者、11者、12者或13者(及其中衍生之任一範圍)：生物素、乙酸DL α生育酚、DL α-生育酚、維生素A、氯化膽鹼、泛酸鈣、泛酸、葉酸菸鹼醯胺、吡哆醇、核黃素、硫胺素、肌醇、維生素B12，或培養基包括其組合或其鹽。在一些實施例中，培養基包含以下各項或基本上由其組成：生物素、乙酸DL α生育酚、DL α-生育酚、維生素A、氯化膽鹼、泛酸鈣、泛酸、葉酸菸鹼醯胺、吡哆醇、核黃素、硫胺素、肌醇及維生素B12。在一些實施例中，維生素包括以下各項或基本上由其組成：生物素、乙酸DL α生育酚、DLα-生育酚、維生素A或其組合或鹽。在一些實施例中，培養基進一步包含蛋白質。在一些實施例中，蛋白質包含白蛋白或牛血清白蛋白、BSA之部分、過氧化氫酶、胰島素、運鐵蛋白、超氧化物歧化酶或其組合。在一些實施例中，培養基進一步包含以下中之一或多者：皮質酮、D-半乳糖、乙醇胺、麩胱甘肽、L-肉鹼、亞麻油酸、次亞麻油酸、助孕酮、腐胺、亞硒酸鈉或三碘-L-甲狀腺胺酸或其組合。在一些實施例中，培養基包含以下中之一或多者：B-27 ®補充物、不含異源成份之B-27 ®補充物、GS21 TM補充物或其組合。在一些實施例中，培養基包含或進一步包含胺基酸、單醣、無機離子。在一些實施例中，胺基酸包含精胺酸、胱胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、麩醯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、色胺酸、組胺酸、酪胺酸或纈胺酸或其組合。在一些實施例中，無機離子包含鈉、鉀、鈣、鎂、氮或磷或其組合或鹽。在一些實施例中，培養基進一步包含以下中之一或多者：鉬、釩、鐵、鋅、硒、銅或錳或其組合。在某些實施例中，培養基包含本文所論述之一或多種維生素及/或本文所論述之一或多種蛋白質及/或以下中之一或多者或基本上由其組成：皮質酮、D-半乳糖、乙醇胺、麩胱甘肽、L-肉鹼、亞麻油酸、次亞麻油酸、助孕酮、腐胺、亞硒酸鈉或三碘-L-甲狀腺胺酸、B-27 ®補充物、不含異源成份之B-27 ®補充物、GS21 TM補充物、胺基酸(例如精胺酸、胱胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、麩醯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、色胺酸、組胺酸、酪胺酸或纈胺酸)、單醣、無機離子(例如鈉、鉀、鈣、鎂、氮及/或磷)或其鹽及/或鉬、釩、鐵、鋅、硒、銅或錳。 在某些態樣中，培養基可使用用於培養動物細胞之培養基(例如以下中之任一者)作為其基礎培養基來製備：AIM V、X-VIVO-15、NeuroBasal、EGM2、TeSR、BME、BGJb、CMRL 1066、Glasgow MEM、經改良之MEM鋅選擇、IMDM、培養基199、伊格爾(Eagle) MEM、αMEM、DMEM、Ham、RPMI-1640及費希爾培養基(Fischer's media)以及其任何組合，但培養基可不具體限於該等培養基，只要其可用於培養動物細胞即可。具體而言，培養基可為不含異源成份或化學上定義的。 培養基可為含血清或無血清培養基或不含異源成份之培養基。在防止異質動物源組份污染之情況下，血清可與幹細胞源自同一動物。無血清培養基係指不含未經處理或未經純化之血清之培養基，且因此可包括含有經純化血液源組份或動物組織源組份(例如生長因子)之培養基。 培養基可含或可不含血清之任何替代物。血清之替代物可包括適當含有以下各項之材料：白蛋白(例如富含脂質之白蛋白、牛白蛋白、諸如重組白蛋白或人類化白蛋白等白蛋白替代品、植物澱粉、聚葡萄糖及蛋白質水解產物)、運鐵蛋白(或其他鐵運輸蛋白)、脂肪酸、胰島素、膠原前體、微量元素、2-巰基乙醇、3'-硫醇甘油或其等效物。血清之替代物可藉由例如國際公開案第98/30679號(其全文併入本文中)中所揭示之方法來製備。或者，為更方便起見可使用任何市售材料。市售材料包括剔除血清替代品(KSR)、化學上定義的濃縮脂質(Gibco)及Glutamax (Gibco)。 在其他實施例中，培養基可為適於細胞發育之無血清培養基。舉例而言，培養基可包含可有效地自3D細胞聚集體產生T細胞之濃度之B-27 ®補充物、不含異源成份之B-27 ®補充物(可在全球資訊網(world wide web)之thermofisher.com/us/en/home/technical-resources/media-formulation.250.html上購得)、NS21補充物(Chen等人，J Neurosci Methods, 2008年6月30日; 171(2): 239-247，其全文併入本文中)、GS21 TM補充物(可在全球資訊網之amsbio.com/B-27.aspx上購得)或其組合。 在某些實施例中，培養基可包含以下中之1者、2者、3者、4者、5者、6者、7者、8者、9者、10者、11者、12者、13者、14者、15者、16者、17者、18者、19者、20者或更多者：維生素，例如生物素；乙酸DL α生育酚；DL α-生育酚；維生素A (乙酸酯)；蛋白質，例如BSA (牛血清白蛋白)或人類白蛋白、不含脂肪酸之部分V；過氧化氫酶；人類重組胰島素；人類運鐵蛋白；超氧化物歧化酶；其他組份，例如皮質酮；D-半乳糖；乙醇胺HCl；麩胱甘肽(還原性)；L-肉鹼HCl；亞麻油酸；次亞麻油酸；助孕酮；腐胺2HCl；亞硒酸鈉；及/或T3 (三碘-L-甲狀腺胺酸)。 在其他實施例中，培養基可包含外加之抗壞血酸。培養基亦可含有一或多種外加之脂肪酸或脂質、胺基酸(例如非必需胺基酸)、維生素、生長因子、細胞介素、抗氧化物質、2-巰基乙醇、丙酮酸、緩衝劑及/或無機鹽。 培養基組份中之一或多者可以下列濃度來添加：至少、至多或約0.1、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、180、200、250 ng/L、ng/ml、µg/ml、mg/ml或其中衍生之任一範圍。 所用培養基可補充有以下濃度之至少一種外加之細胞介素：約0.1 ng/mL至約500 ng/mL，更具體而言1 ng/mL至100 ng/mL，或至少、至多或約0.1、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、180、200、250 ng/L、ng/ml、µg/ml、mg/ml或其中衍生之任一範圍。適宜細胞介素包括(但不限於) FLT3配體(FLT3L)、介白素7 (IL-7)、幹細胞因子(SCF)、促血小板生成素(TPO)、IL-2、IL-4、IL-6、IL-15、IL-21、TNF-α、TGF-β、干擾素-γ、干擾素-λ、TSLP、胸腺五肽、多效生長因子(pleiotrophin)及/或中期因子。具體而言，培養基可包括FLT3L及IL-7中之至少一者。更具體而言，培養基可包括FLT3L及IL-7二者。 在某些實施例中，3D細胞聚集體可包含定義或未定義的外源細胞外基質，例如膠原、明膠、聚-L-離胺酸、聚-D-離胺酸、層黏蛋白及纖連蛋白及其混合物(例如Matrigel TM)及溶解細胞膜製劑。在其他實施例中，3D細胞聚集體不包含外源基質或支架。 可適當定義其他培養條件。舉例而言，培養溫度可為約20℃至40℃，例如至少、至多或約20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃ (或其中衍生之任一範圍)，但溫度可高於或低於該等值。CO 2濃度可為約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10% (或其中衍生之任一範圍)，例如約2%至10%，例如約2%至5%，或其中衍生之任一範圍。氧張力可為至少或約1%、5%、8%、10%、20%或其中衍生之任一範圍。 基質細胞及幹細胞或祖細胞可以例如以下等任一比率存在：約100:1、80:1、40:1、20:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:20、1:40、1:80及/或1:100或其中衍生之任一範圍。 在一些實施例中，基質細胞可為鼠類基質細胞系、人類基質細胞系、所選原代基質細胞群、所選在活體外自多潛能幹細胞分化之基質細胞群或其組合。在一些實施例中，基質細胞係自與在本文所述方法中用作起始材料之細胞相同之幹細胞或祖細胞群分化而來。在一些實施例中，基質細胞係自人類細胞分化而來。在一些實施例中，基質細胞係自人類多潛能幹細胞分化而來。在一些實施例中，基質細胞係自人類或非人類HSPC或PSC細胞分化而來。 在其他實施例中，基質細胞或其祖細胞可經基因修飾。舉例而言，基質細胞可表現外源人類主要組織相容性複合物(MHC)。在其他實施例中，基質細胞可表現外源抗原特異性共刺激分子、細胞介素、抗原或細胞外基質蛋白或任何T細胞調節劑，如調節T細胞分化、增殖或功能之任何生物活性分子或基因。在一些實施例中，基質細胞(或祖細胞)經改造以表現抗原或HLA分子。 在一些實施例中，細胞聚集體包含或進一步包含腫瘤細胞或腫瘤抗原。在一些實施例中，細胞聚集體包含外源主要組織相容性複合物(MHC)。在一些實施例中，MHC係人類MHC。在一些實施例中，細胞聚集體包含外源抗原特異性共刺激分子、細胞介素、抗原或細胞外基質蛋白或任何T細胞調節劑，如調節T細胞分化、增殖或功能之任何生物活性分子或基因。在一些實施例中，基質細胞(或祖細胞)經改造以表現抗原或HLA分子。 在某些實施例中，幹細胞或祖細胞可選自胚胎幹細胞、造血幹細胞或祖細胞、自骨髓、臍帶血、末梢血、胸腺分離之細胞，或幹細胞或祖細胞可在活體外自胚胎幹細胞(ESC)或誘導性多潛能幹細胞(iPSC)分化。來自原代組織或ESC或iPSC之幹細胞或祖細胞可來自人類或非人類動物(例如小鼠)來源。 在其他實施例中，幹細胞或祖細胞可經基因修飾。舉例而言，幹細胞或祖細胞可表現外源T細胞受體(TCR)或嵌合抗原受體(CAR)或二者。在其他實施例中，幹細胞或祖細胞可表現外源不變的天然殺手T細胞(iNKT)相關之TCR。在另一實施例中，幹細胞或祖細胞表現外源抗原特異性TCR或具有調節T細胞分化、擴增或功能之基因之外源基因修飾。 在一些實施例中，用於本文所述培養組合物及方法中之幹細胞或祖細胞或基質細胞係先前已經冷凍之細胞。在一些實施例中，細胞從未經冷凍。在一些實施例中，細胞已傳代至少、至多或恰好0次、1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、15次、20次、25次、30次、35次、40次、45次或50次(或其中衍生之任一範圍)。 在某些實施例中，諸如基質細胞、幹細胞或祖細胞或其中所產生之T細胞等細胞群中之任一者可包含至少、約或至多以下數量之細胞：1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、200個、300個、400個、500個、1 × 10 3個、2 × 10 3個、3 × 10 3個、4 × 10 3個、5 × 10 3個、6 × 10 3個、7 × 10 3個、8 × 10 3個、9 × 10 3個、1 × 10 4個、2 × 10 4個、3 × 10 4個、4 × 10 3個、5 × 10 4個、6 × 10 4個、7 × 10 4個、8 × 10 4個、9 × 10 4個、1 × 10 5個、2 × 10 5個、3 × 10 5個、4 × 10 5個、5 × 10 5個、6 × 10 5個、7 × 10 5個、8 × 10 5個、9 × 10 5個、1 × 10 6個或2 × 10 6個(或其中衍生之任一範圍)。在具體實施例中，幹細胞或祖細胞為1至200,000個。 本發明之態樣亦係關於自幹細胞或祖細胞製備T細胞組合物之方法，該方法包含培養包含以下之三維(3D)細胞聚集體：a) 所選表現Notch配體之基質細胞群；b) 所選幹細胞或祖細胞群；其中將3D細胞聚集體於包含胰島素之無血清培養基中培養一段時間以足以使幹細胞或祖細胞在活體外分化成T細胞。培養組合物可包括本文闡述為培養組合物及培養基之組份之任何實施例。此外，用於本發明之方法態樣中之細胞可為本文闡述為適用於培養組合物中之任何幹細胞或祖細胞或基質細胞。 本文所述之組合物及方法可經改質以使得該方法用於製備具有某一表型之T細胞。在一些實施例中，該等方法用於製備具有以下表型之T細胞：CD4 +CD8 -T細胞、CD4 -CD8 +T細胞、CD34 +CD7 +CD1a +細胞、CD3+ TCRab+、CD3+ TCRgd+、CD3+ TCRab+ CD4+ CD8-、CD3+ TCRab+ CD8+ CD4-、CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+、CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+、CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CCR7+、CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CCR7+、CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CD27+、CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CD27+、CD34 +CD7 +CD1a +細胞、CD34+CD5+CD7+、CD34+CD5+CD7-、天然殺手T細胞、調節T細胞、抗原特異性T細胞、上皮內淋巴球T細胞或具有以下表型之細胞：CD45+、CD11b+、CD11b-、CD15+、CD15-、CD24+、CD24-、CD114+、CD114-、CD182+、CD182-、CD4+、CD4-、CD14+、CD14-、CD11a+、CD11a-、CD91+、CD91-、CD16+、CD16-、CD3+、CD3-、CD25+、CD25-、Foxp3+、Fox3p-、CD8+、CD8-、CD19+、CD19-、CD20+、CD20-、CD24+、CD24、CD38+、CD38-、CD22+、CD22-、CD61+、CD61-、CD16+、CD16-、CD56+、CD56-、CD31+、CD31-、CD30+、CD30-、CD38+及/或CD38-或其組合。舉例而言，上皮內淋巴球(IEL)可藉由在基質細胞中表現同源抗原來製備。 在一些實施例中，該方法進一步包含離心幹細胞或祖細胞及基質細胞以形成3D細胞聚集體。該等方法可包含培養三維(3D)細胞聚集體。3D細胞聚集體包含所選表現外源Notch配體之基質細胞群；及所選幹細胞或祖細胞群。培養基成份之替代物中之任一者可如上文所述。 在其他實施例中，培養可包含使用離心以形成3D細胞聚集體。培養可持續任一時間長度，例如至少、至多或恰好約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48小時、天或週或其中衍生之任一範圍。在其他實施例中，培養可涉及或可不涉及細胞傳代。 在一些實施例中，該等方法進一步包含來自活體外分化之T細胞之內源表現之TCR。在一些實施例中，該方法進一步包含引發T細胞。在一些實施例中，T細胞係用抗原呈遞細胞來引發。在一些實施例中，抗原呈遞細胞呈遞腫瘤抗原。 在其他實施例中，可提供包含以下之方法或步驟：將來自3D細胞聚集體之T細胞投與有需要之個體或使來自3D細胞聚集體之T細胞進一步分化。 在一些實施例中，來自3D細胞聚集體之T細胞並不經由等位基因排除來表現內源TCR。在其他實施例中，來自3D細胞聚集體之T細胞表現外源TCR或CAR。 可提供產生T細胞之方法，其包含培養如上文所述之細胞培養組合物，由此產生T細胞。亦可提供如上文所述之方法，其可進一步定義為產生抗原特異性T細胞之方法，其中祖細胞表現外源抗原特異性TCR或CAR。 可提供產生T細胞之方法或任一培養方法可自3D細胞聚集體產生T細胞。在某些態樣中，各方法可進一步包含檢測以下細胞之數量、對於或針對該等細胞進行選擇或增加該等細胞之數量：CD4 +CD8 -T細胞、CD4 -CD8 +T細胞、CD34 +CD7 +CD1a +細胞、CD3+ TCRab+、CD3+ TCRgd+、CD3+ TCRab+ CD4+ CD8-、CD3+ TCRab+ CD8+ CD4-、CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+、CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+、CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CCR7+、CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CCR7+、CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CD27+、CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CD27+、CD34 +CD7 +CD1a +細胞、CD34+CD5+CD7+、CD34+CD5+CD7-、天然殺手T細胞、調節T細胞、使用四聚體或抗TCR抗體之抗原特異性T細胞、使用經修飾抗原之CAR T細胞、使用螢光標記物之經轉導T細胞或其組合。在一些實施例中，上皮內淋巴球係CD4- CD8+、CD4+ CD8-、CD4+ CD8+、CD4- CD8-、TCRab+、TCRgd+、CD5+CD7+、CD5+CD7+CD3-CD4-CD8-、CD5+CD7+CD3-CD4-CD8aa或其組合。在一些實施例中，排除諸如以下等上皮內淋巴球：CD4- CD8+、CD4+ CD8-、CD4+ CD8+、CD4- CD8-、TCRab+、TCRgd+、CD5+CD7+、CD5+CD7+CD3-CD4-CD8-及/或CD5+CD7+CD3-CD4-CD8aa。 可提供增加個體中T細胞之數量或治療個體疾病或病況之方法，該方法包含向個體投與有效量之如本文所述製備之T細胞或抗原特異性T細胞或本發明之任何T細胞，例如包含外源TCR之彼等。在一些實施例中，T細胞具有本文所述之細胞表面標記物。 個體可為任何動物，具體而言小鼠、非人類靈長類動物或人類。在其他態樣中，個體可已經確定患有自體免疫疾病、癌症、感染、免疫缺失或其組合或具有罹患該等疾病之風險。 在其他實施例中，可提供產生不與自身抗原反應之T細胞之方法，其包含一起培養三維(3D)細胞聚集體與可有效地自3D細胞聚集體產生T細胞之濃度的無血清培養基。在某些態樣中，3D細胞聚集體包含：a) 所選表現外源Notch配體之基質細胞群及b) 所選幹細胞或祖細胞群，其中a)或b)中之一或多個細胞表現外源自身抗原；由此3D細胞聚集體產生不與自身抗原反應之T細胞。在其他態樣中，其中a)或b)中之一或多個細胞表現或不表現外源自身MHC。 本發明之態樣係關於藉由本文所述之方法製得之T細胞。在一些實施例中，T細胞具有特異性表型、細胞表面標記物或本揭示內容通篇所述之特徵。 因此，本發明之態樣係關於包含嵌合抗原受體(CAR)之經分離T細胞或T細胞群，其中T細胞具有上皮內淋巴球表型。在一些實施例中，T細胞係TCR-。在一些實施例中，T細胞係CD4- CD8+、CD4+ CD8-、CD4+ CD8+、CD4-CD8-、TCRab+、TCRgd+、CD5+CD7+、CD5+CD7+CD3-CD4-CD8-、CD5+CD7+CD3-CD4-CD8aa或其組合。在一些實施例中，T細胞係CD5+CD7+CD3-CD4-CD8-。在一些實施例中，T細胞係CD5+CD7+CD3-CD4-CD8aa。在一些實施例中，CAR包含CD19 CAR。在一些實施例中，T細胞進一步包含外源TCR。在一些實施例中，T細胞係CD3+。在一些實施例中，T細胞係CD4 +CD8 -T細胞、CD4 -CD8 +T細胞、CD34 +CD7 +CD1a +細胞、CD3+ TCRab+、CD3+ TCRgd+、CD3+ TCRab+ CD4+ CD8-、CD3+ TCRab+ CD8+ CD4-、CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+、CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+、CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CCR7+、CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CCR7+、CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CD27+、CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CD27+、CD34 +CD7 +CD1a +細胞、CD34+CD5+CD7+、CD34+CD5+CD7-、天然殺手T細胞、調節T細胞、抗原特異性T細胞、上皮內淋巴球T細胞或具有以下表型之細胞：CD45+、CD11b+、CD11b-、CD15+、CD15-、CD24+、CD24-、CD114+、CD114-、CD182+、CD182-、CD4+、CD4-、CD14+、CD14-、CD11a+、CD11a-、CD91+、CD91-、CD16+、CD16-、CD3+、CD3-、CD25+、CD25-、Foxp3+、Fox3p-、CD8+、CD8-、CD19+、CD19-、CD20+、CD20-、CD24+、CD24、CD38+、CD38-、CD22+、CD22-、CD61+、CD61-、CD16+、CD16-、CD56+、CD56-、CD31+、CD31-、CD30+、CD30-、CD38+或CD38-或其組合。其他態樣係關於經分離T細胞或T細胞群，其中T細胞表現外源TCR或CAR，且其中T細胞係CD4 +CD8 -T細胞、CD4 -CD8 +T細胞、CD34 +CD7 +CD1a +細胞、CD3+ TCRab+、CD3+ TCRgd+、CD3+ TCRab+ CD4+ CD8-、CD3+ TCRab+ CD8+ CD4-、CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+、CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+、CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CCR7+、CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CCR7+、CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CD27+、CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CD27+、CD34 +CD7 +CD1a +細胞、CD34+CD5+CD7+、CD34+CD5+CD7-、天然殺手T細胞、調節T細胞、抗原特異性T細胞、上皮內淋巴球T細胞、具有以下表型之細胞：CD45+、CD11b+、CD11b-、CD15+、CD15-、CD24+、CD24-、CD114+、CD114-、CD182+、CD182-、CD4+、CD4-、CD14+、CD14-、CD11a+、CD11a-、CD91+、CD91-、CD16+、CD16-、CD3+、CD3-、CD25+、CD25-、Foxp3+、Fox3p-、CD8+、CD8-、CD19+、CD19-、CD20+、CD20-、CD24+、CD24、CD38+、CD38-、CD22+、CD22-、CD61+、CD61-、CD16+、CD16-、CD56+、CD56-、CD31+、CD31-、CD30+、CD30-、CD38+或CD38-或其組合。在一些實施例中，T細胞係T細胞群，且其中T細胞群包含至少50%之細胞為成熟初始CD8或CD4單陽性細胞。在一些實施例中，T細胞包含至少、至多或恰好5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的成熟初始CD8單陽性及/或CD4單陽性細胞(或其中衍生之任一範圍)。在一些實施例中，細胞表現外源不變的天然殺手T細胞(iNKT)相關之TCR。在一些實施例中，細胞已在活體外自幹細胞或祖細胞分化。在一些實施例中，幹細胞或祖細胞選自胚胎幹細胞、誘導性多潛能幹細胞、人類中胚層祖細胞、中胚層祖細胞、人類胚胎中胚層祖細胞、造血幹細胞或祖細胞、自骨髓分離之細胞、自臍帶血分離之細胞、自末梢血分離之細胞、自胸腺分離之細胞或已在活體外自胚胎幹細胞(ESC)或誘導性多潛能幹細胞(iPSC)分化之細胞。在一些實施例中，已經由等位基因排除抑制內源TCR。 在其他實施例中，可使用任何基因修飾組合物或方法將外源核酸引入細胞中或編輯基因體DNA，該等方法係例如基因編輯、同源重組或非同源重組、RNA介導之遺傳遞送或任何習用核酸遞送方法。基因修飾方法之非限制性實例可包括例如藉由CRISPR/CAS9、鋅指核酸酶或TALEN技術之基因編輯方法。 基因修飾亦可包括引入有助於活體外或活體內選擇或篩選或成像之可選擇或可篩選標記物。具體而言，活體內成像劑或自殺基因可以外源方式表現或添加至起始細胞或子代細胞中。在其他態樣中，該等方法可涉及影像引導之授受性細胞療法。 本發明之態樣係關於治療患者之方法，其包含向患者投與包含外源TCR及/或CAR之活體外分化T細胞或T細胞前體。在一些實施例中，涵蓋包含外源TCR及/或CAR之活體外分化T細胞或T細胞前體之用途。外源TCR可具有任何定義的抗原特異性。在一些實施例中，其將基於對預期接受者不存在或降低的同種異體反應性(實例包括某些病毒特異性TCR、異源成份特異性TCR或癌症-睪丸抗原特異性TCR)來選擇。在外源TCR具有非同種異體反應性之實例中，在T細胞分化期間外源TCR經由發育過程抑制內源TCR基因座之重排及/或表現(稱為等位基因排除)，從而產生僅表現非同種異體反應性外源TCR且因此具有非同種異體反應性之T細胞。在一些實施例中，外源TCR之選擇可不必基於缺少同種異體反應性來定義。在一些實施例中，內源TCR基因已經基因體編輯修飾以使其不表現蛋白質。基因編輯之方法(例如使用CRISPR/Cas9系統之方法)為業內已知且闡述於本文中。 在一些實施例中，本文所述方法係關於表現外源TCR之幹細胞及祖細胞，且其中該等方法、組合物或細胞進一步包含本文所揭示之實施例。在此情形下，幹細胞或祖細胞可在活體外分化。在一些實施例中，幹細胞或祖細胞係CD34+細胞。 在一些實施例中，T細胞包含外源TCR及另一抗原或配體識別受體。在一些實施例中，另一抗原識別受體係基於CDR (互補決定區)之抗原識別受體。在一些實施例中，外源TCR包含自TCR-α及TCR-β基因表現之蛋白質。在一些實施例中，外源TCR包含自TCR-γ及TCR-δ基因表現之蛋白質。在一些實施例中，外源TCR包含自TCR-α及TCR-β基因表現之蛋白質且抗原識別受體包含自TCR-γ及TCR-δ基因表現之蛋白質。在一些實施例中，外源TCR包含自TCR-γ及TCR-δ基因表現之蛋白質且抗原識別受體包含自TCR-α及TCR-β基因表現之蛋白質。 在一些實施例中，另一抗原識別受體並非TCR分子。在一些實施例中，另一抗原識別受體係嵌合抗原受體分子(CAR)。在一些實施例中，CAR係腫瘤抗原特異性CAR (即識別腫瘤抗原之CAR)。在一些實施例中，CAR係病毒抗原特異性CAR (即識別病毒抗原之CAR)。在該等實施例中，外源TCR調介T細胞發育期間之等位基因排除，但在移植至患者中後預期抗腫瘤或抗病毒反應性係由CAR來調介，且外源TCR係惰性「過客」。 在一些實施例中，外源TCR特異性針對第一抗原，且另一抗原識別受體特異性針對第二抗原。此產生具有雙重特異性之T細胞，一種特異性係由另一抗原受體賦予，且一種特異性係由外源TCR賦予。在一些實施例中，第一及第二抗原係由患者之癌細胞表現之癌細胞抗原。舉例而言，患者可患有已知癌症或患者癌症之抗原可經實驗測定。在一些實施例中，業內已知抗原與癌症相關。在一些實施例中，抗原係經實驗測定。舉例而言，可分離患者之癌細胞並分析細胞表面蛋白質之表現或免疫原性新抗原。當第一及第二抗原係由患者之癌細胞表現之癌症抗原時，T細胞展現針對相同癌細胞之雙重特異性。此有利之原因在於當一種抗原因抗原下調(或其他機制)丟失時，其限制癌症之免疫逃避。因此，用於誘導等位基因排除之外源TCR賦予功能性抗腫瘤或抗病毒特異性，從而產生具有雙重靶特異性之T細胞。實例係經改造之非同種異體反應性CAR-T細胞，其中CAR調介針對腫瘤抗原A之特異性，且非同種異體反應性TCR調介針對腫瘤抗原B之特異性(後者以MHC限制性方式)。靶向一種以上之由靶細胞群表現之抗原可改良效能且減少抗性純系之逃逸。 在一些實施例中，外源TCR係病毒特異性TCR、異源成份特異性TCR、癌細胞特異性TCR、細菌特異性TCR或癌症-睪丸抗原特異性TCR。結合外源TCR之抗原可為業內已知或根據T細胞對表現該等抗原之細胞之反應的分析經實驗測定。 在一些實施例中，T細胞係接受者之同種異體細胞。 在一些實施例中，患者患有癌症。在一些實施例中，該方法用於治療個體之癌症。在一些實施例中，癌症選自肺癌、前列腺癌、卵巢癌、睪丸癌、腦癌、皮膚癌、黑色素瘤、結腸癌、直腸癌、胃癌、食道癌、氣管癌、頭頸癌、胰臟癌、肝癌、乳癌、卵巢癌、淋巴癌(包括淋巴瘤及多發性骨髓瘤)、白血病、骨或軟組織肉瘤、子宮頸癌及外陰癌。 在一些實施例中，該方法進一步包含投與可經純化、偶聯至其他分子或由細胞或細胞樣媒介呈遞之抗原，其中抗原係由外源TCR識別。此可使得所投與之經改造T細胞在活體內擴增。 在一些實施例中，該等方法進一步包含使T細胞在投與患者之前與活化組合物接觸。舉例而言，T細胞可根據以下來活化：
T細胞子集 CTL Th1 Th1/Th2 Th1 Th17 Treg Th2/Th9
由以下各項活化 抗CD3/28；抗CD2；IL-2、IL-21、IL-15、IL-7、PMA；離子黴素；PHA；過釩酸鹽 抗CD3/CD28；IL-2；PMA；離子黴素；PHA；過釩酸鹽 抗CD3/CD28；IL-2；PMA；離子黴素；PHA；過釩酸鹽 IFN-α IL6；IL-21 IL-2；IL-7；IL-15 IL-4
用於活化T細胞之套組亦在市面上有售。實例性套組包括抗生物素粒子(例如MACSiBead或DYNABEADS ®)及針對人類CD2、CD3及CD28之生物素化抗體。使用負載有生物素化抗體之抗生物素粒子來模擬抗原呈遞細胞且活化來自PBMC之靜止T細胞以及經純化T細胞。T細胞擴增係藉由培養且在培養第14天時再活化來達成。其他套組可包括直接偶聯之抗CD3/28微球；多聚抗體複合物；或使用靶向替代性T細胞蛋白(例如CD2)之抗體。舉例而言，T細胞亦可藉由有絲分裂促進劑(例如ConA、PHA及PWM)來活化。 在一些實施例中，外源TCR具有非同種異體反應性。術語「非同種異體反應性」係指當移植至接受者中時不會引起免疫反應性之蛋白質。在一些實施例中，外源TCR呈惰性，此意味著其不會引起臨床上顯著之毒性。 在一些實施例中，患者患有微生物感染或具有罹患該疾病之風險。在某些實施例中，已測試患者之微生物感染。在一些實施例中，第一及第二抗原係由相同病毒類型或由感染該病毒類型之細胞表現之病毒抗原。在一些實施例中，第一及第二抗原係由相同細菌或在感染該細菌之細胞中表現之細菌細胞抗原。在一些實施例中，第一及第二抗原係由相同微生物之細胞或感染該微生物之細胞表現之微生物細胞抗原。 在一些實施例中，外源TCR係NY-ESO-1特異性TCR。 在一些實施例中，該方法進一步包含向患者投與抗原呈遞細胞。在一些實施例中，抗原呈遞細胞係樹突細胞。在一些實施例中，抗原呈遞細胞係人工抗原呈遞細胞。在一些實施例中，抗原呈遞細胞負載有由外源TCR識別之抗原。用抗原負載抗原呈遞細胞之方法為業內已知。在一些實施例中，抗原呈遞細胞為自體的。通常用成熟劑(例如IL-4及/或GM-CSF)來處理經分離抗原呈遞細胞(其可自所治療之患者分離)。然後可用抗原(例如特異性針對外源TCR之抗原)對抗原呈遞細胞實施脈衝處理以產生負載抗原之APC。在一些實施例中，將負載抗原之APC與促發炎細胞介素(例如LPS、干擾素γ、TNF-α、IL-1β、IL-6及/或PGE2)一起培養(與其接觸)。該方法可進一步包含冷凍負載抗原之APC，解凍負載抗原之APC，及向患者投與負載抗原之APC。 外源TCR亦可用於將等位基因排除引導至自幹細胞及祖細胞產生之經改造調節/抑制T細胞及/或賦予該等T細胞抗原特異性或其他功能，而與用另一抗原或配體受體之轉導無關。 在一些實施例中，活體外分化T細胞經改造為T調節細胞。在一些實施例中，T細胞進一步包含FOXP3之表現。在一些實施例中，T細胞經改造或經選擇以表現FOXP3。在一些實施例中，FOXP3表現為組成型。FOXP3之表現可賦予T細胞調節功能。因此，T細胞可為可用於抑制患者之自體免疫或同種異體反應性之抑制T細胞。此方法之實例係將外源TCR引入幹細胞及祖細胞中，該等細胞亦經改造以產生等位基因排除之FOXP3 T調節細胞；在此情形下，外源TCR可不必基於降低的同種異體反應性來選擇。 在上文所揭示方法中任一者之一些實施例中，個體患有自體免疫疾病、移植物抗宿主病(GVHD)或移植物排斥或具有罹患該等疾病之風險。個體可為經診斷患有該疾病者或已基於遺傳或家族史分析確定為易患該疾病者。個體亦可為準備或已經歷移植者。在一些實施例中，該方法用於治療自體免疫疾病、GVHD或移植物排斥。 經改造T細胞(例如本文所述方法中所述之彼等)亦在本發明範疇內。因此，某些態樣係關於包含外源TCR之活體外分化T細胞。在一些實施例中，TCR係病毒特異性TCR、異源成份特異性TCR、癌細胞特異性TCR、細菌特異性TCR或癌症-睪丸抗原特異性TCR。在一些實施例中，T細胞進一步包含另一抗原或配體識別受體。在一些實施例中，外源TCR包含自TCR-α及TCR-β基因表現之蛋白質。在一些實施例中，外源TCR包含自TCR-γ及TCR-δ基因表現之蛋白質。在一些實施例中，外源TCR係經改造模擬TCR信號傳導之分子。在一些實施例中，外源TCR包含自TCR-α及TCR-β基因表現之蛋白質且抗原識別受體包含自TCR-γ及TCR-δ基因表現之蛋白質。在一些實施例中，外源TCR包含自TCR-γ及TCR-δ基因表現之蛋白質且抗原識別受體包含自TCR-α及TCR-β基因表現之蛋白質。在一些實施例中，另一抗原識別受體並非TCR分子。在一些實施例中，另一抗原識別受體係嵌合抗原受體(CAR)。在一些實施例中，CAR係腫瘤抗原特異性CAR。在一些實施例中，CAR係病毒抗原特異性CAR。在一些實施例中，外源TCR特異性針對第一抗原，且另一抗原識別受體特異性針對第二抗原。在一些實施例中，第一及第二抗原係由癌細胞表現之癌細胞抗原。在一些實施例中，第一及第二抗原係由病毒或感染該病毒之細胞表現之病毒抗原。在一些實施例中，第一及第二抗原係由細菌細胞或感染該細菌之細胞表現之細菌細胞抗原。在一些實施例中，外源TCR係NY-ESO-1特異性TCR。在一些實施例中，T細胞進一步包含FOXP3之表現。在一些實施例中，T細胞經改造或經選擇以表現FOXP3。在一些實施例中，FOXP3表現為組成型。 在一些實施例中，細胞包含：CD4 +CD8 -T細胞、CD4 -CD8 +T細胞、CD34 +CD7 +CD1a +細胞、CD3+ TCRab+、CD3+ TCRgd+、CD3+ TCRab+ CD4+ CD8-、CD3+ TCRab+ CD8+ CD4-、CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+、CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+、CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CCR7+、CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CCR7+、CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CD27+、CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CD27+、CD34 +CD7 +CD1a +細胞、CD34+CD5+CD7+、CD34+CD5+CD7-、天然殺手T細胞或調節T細胞、抗原特異性T細胞。在一些實施例中，排除CD4 +CD8 -T細胞、CD4 -CD8 +T細胞、CD34 +CD7 +CD1a +細胞、CD3+ TCRab+、CD3+ TCRgd+、CD3+ TCRab+ CD4+ CD8-、CD3+ TCRab+ CD8+ CD4-、CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+、CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+、CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CCR7+、CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CCR7+、CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CD27+、CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CD27+、CD34 +CD7 +CD1a +細胞、CD34+CD5+CD7+、CD34+CD5+CD7-、天然殺手T細胞、調節T細胞、抗原特異性T細胞。在一些實施例中，細胞包含本文所述之細胞表面標記物或細胞不表現本文所述之細胞表面標記物。在一些實施例中，細胞包含上皮內淋巴球(IEL)。在一些實施例中，上皮內淋巴球係CD4- CD8+、CD4+ CD8-、CD4+ CD8+、CD4- CD8-、TCRab+、TCRgd+、CD5+CD7+、CD5+CD7+CD3-CD4-CD8-、CD5+CD7+CD3-CD4-CD8aa或其組合。在一些實施例中，排除諸如以下等上皮內淋巴球：CD4- CD8+、CD4+ CD8-、CD4+ CD8+、CD4- CD8-、TCRab+、TCRgd+、CD5+CD7+、CD5+CD7+CD3-CD4-CD8-及/或CD5+CD7+CD3-CD4-CD8aa。 其他態樣係關於將藥劑遞送至具有該等表現外源TCR之T細胞之患者中的表現外源TCR之T細胞之方法，其包含向患者投與偶聯至抗原之藥劑，其中抗原係由外源TCR來識別。在一些實施例中，外源TCR呈惰性。在一些實施例中，藥劑係消除劑。舉例而言，藥劑可為在藥劑-抗原與細胞表面上之TCR接觸後消除細胞之細胞毒性劑。消除劑包括(但不限於)例如胺甲喋呤、胺喋呤、6-巰嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶、達卡巴嗪(decarbazine)；烷基化劑，例如甲基二氯乙基胺、塞替派(thioepa)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、美法侖(melphalan)、卡莫司汀(carmustine) (BSNU)、絲裂黴素C (mitomycin C)、洛莫司汀(lomustine) (CCNU)、1-甲基亞硝基脲、環磷醯胺、甲基二氯乙基胺、白消安(busulfan)、二溴甘露醇、鏈佐黴素(streptozotocin)、絲裂黴素C、順式-二氯二胺鉑(II) (DDP) (順鉑)及卡鉑(佳鉑帝(paraplatin))；蒽環類(anthracyclines)包括道諾黴素(daunorubicin) (舊稱道諾黴素(daunomycin))、多柔比星(doxorubicin) (阿德力黴素(adriamycin))、地托比星(detorubicin)、洋紅黴素(carminomycin)、伊達比星(idarubicin)、泛艾黴素(epirubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)及比生群(bisantrene)；抗生素包括放線菌素(dactinomycin) (放線菌素D)、博來黴素(bleomycin)、卡奇黴素(calicheamicin)、光輝黴素(mithramycin)及安麯黴素(anthramycin) (AMC)；抗有絲分裂劑，例如長春花生物鹼(vinca alkaloid)、長春新鹼(vincristine)及長春鹼(vinblastine)、太平洋紫杉醇(paclitaxel) (紫杉醇(taxol))、蓖麻毒蛋白、假單胞菌屬(pseudomonas)外毒素、吉西他濱(gemcitabine)、細胞鬆弛素B (cytochalasin B)、短桿菌素D (gramicidin D)、溴乙錠、吐根素(emetine)、依託泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、秋水仙鹼(colchicin)、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、1-去氫睪固酮、糖皮質激素、普魯卡因(procaine)、四卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)、嘌呤黴素(puromycin)、丙卡巴肼(procarbazine)、羥基脲、天冬醯胺酶、皮質類固醇、米托坦(mitotane) (O,P'-(DDD))、干擾素及該等消除劑之混合物。其他消除劑包括(但不限於)化學治療劑，例如卡鉑、順鉑、太平洋紫杉醇、吉西他濱、卡奇黴素、多柔比星、5-氟尿嘧啶、絲裂黴素C、放線菌素D、環磷醯胺、長春新鹼及博來黴素。 其他態樣係關於在活體外選擇及分離本發明之經改造T細胞(即表現外源TCR之活體外分化T細胞)之方法。該方法包含使包含T細胞之組合物與特異性結合至外源TCR之藥劑接觸以製備藥劑-TCR表現細胞複合物，及自組合物純化藥劑-TCR表現細胞複合物自組合物。藥劑可為特異性結合至外源TCR之抗體、肽-MHC多聚體或特異性識別外源TCR之任何其他分子。在一些實施例中，藥劑附接至固體支撐物。固體支撐物可為珠粒(例如磁珠或瓊脂糖)、板(例如組織培養皿)、蓋玻片或陣列。固體支撐物亦可為純化管柱。在一些實施例中，該方法進一步包含投與特異性結合至藥劑之二級分子。二級分子可為例如結合至一級抗體之二級抗體。在一些實施例中，二級分子附接至固體支撐物。在一些實施例中，該方法進一步包含自組合物分離固體支撐物及所結合分子。分離可藉由自固體支撐物洗滌未結合分子及/或其他分離技術(例如離心或管柱分離)來進行。在一些實施例中，該方法進一步包含將固體支撐物及所締合分子洗滌一或多次。在一些實施例中，可將一級或二級分子偶聯至螢光分子方法，且可藉由流式細胞測量術/螢光活化細胞分選來分離。在一些實施例中，該方法進一步包含解離使藥劑自藥劑-TCR表現細胞複合物解離。在一些實施例中，該方法進一步包含基於納入或排除其他T細胞標記物(例如CD4、CD8、CD45RA、CD45RO、CCR7/CD197、CD62L、CD27、CD28及CD1a)來進一步純化TCR表現細胞。在一些實施例中，該方法進一步包含培養經純化之TCR表現細胞。在一些實施例中，該方法進一步包含冷凍經純化之TCR表現細胞。 其他態樣係關於製備本文所述之表現外源TCR之活體外分化T細胞之方法，該方法包含將外源TCR或TCR衍生物轉移至幹細胞或免疫祖細胞中；及使幹細胞或免疫祖細胞分化成T細胞或T細胞前體。分化可根據業內已知之方法或根據本文所述之分化/培養方法來實施。在一些實施例中，使幹細胞或免疫祖細胞在與分化劑接觸之前、同時及/或之後與同源MHC及/或肽分子接觸。 在一些實施例中，使幹細胞或免疫祖細胞分化成T細胞包含共培養幹細胞或免疫祖細胞與異位表現Notch配體之基質細胞。在一些實施例中，基質細胞係OP9細胞。在一些實施例中，Notch配體係δ樣1 (Dll1)。在一些實施例中，Notch配體係本文或業內、例如美國專利7,795,404中所述者，該專利以引用方式併入本文中。在一些實施例中，該方法進一步包含使共培養之幹細胞或免疫祖細胞及基質細胞與Flt-3配體及/或IL-7及/或幹細胞因子/Kit配體及/或促血小板生成素接觸。在一些實施例中，使幹細胞或免疫祖細胞分化成T細胞包含：一起培養三維(3D)細胞聚集體，其包含：a) 所選表現外源Notch配體之基質細胞群；b) 所選幹細胞或祖細胞群；與無血清培養基，其包含可有效地自3D細胞聚集體產生T細胞之濃度的B-27®補充物、不含異源成份之B-27®補充物、GS21TM補充物、抗壞血酸、Flt-3配體、IL-7或其組合，其中3D細胞聚集體產生T細胞。在一些實施例中，該方法進一步包含下文所述之一或多個實施例。 在一些實施例中，T細胞群或細胞組合物包含：CD4 +CD8 -T細胞、CD4 -CD8 +T細胞、CD34 +CD7 +CD1a +細胞、CD3+ TCRab+、CD3+ TCRgd+、CD3+ TCRab+ CD4+ CD8-、CD3+ TCRab+ CD8+ CD4-、CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+、CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+、CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CCR7+、CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CCR7+、CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CD27+、CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CD27+、CD34 +CD7 +CD1a +細胞、CD34+CD5+CD7+、CD34+CD5+CD7-、天然殺手T細胞或調節T細胞及/或抗原特異性T細胞。在一些實施例中，排除CD4 +CD8 -T細胞、 CD4 -CD8 +T細胞、CD34 +CD7 +CD1a +細胞、CD3+ TCRab+、CD3+ TCRgd+、CD3+ TCRab+ CD4+ CD8-、CD3+ TCRab+ CD8+ CD4-、CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+、CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+、CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CCR7+、CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CCR7+、CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CD27+、CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CD27+、CD34 +CD7 +CD1a +細胞、CD34+CD5+CD7+、CD34+CD5+CD7-、天然殺手T細胞、調節T細胞及/或抗原特異性T細胞。在一些實施例中，上皮內淋巴球係CD4- CD8+、CD4+ CD8-、CD4+ CD8+、CD4- CD8-、TCRab+、TCRgd+、CD5+CD7+、CD5+CD7+CD3-CD4-CD8-、CD5+CD7+CD3-CD4-CD8aa或其組合。在一些實施例中，排除諸如以下等上皮內淋巴球：CD4- CD8+、CD4+ CD8-、CD4+ CD8+、CD4- CD8-、TCRab+、TCRgd+、CD5+CD7+、CD5+CD7+CD3-CD4-CD8-及/或CD5+CD7+CD3-CD4-CD8aa。 在一些實施例中，T細胞群或細胞組合物包含至少或至多5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100% (或其中衍生之任一範圍)之具有本文所述之表型及/或細胞標記物之活細胞。細胞可來自第1週、第1.5週、第2週、第2.5週、第3週、第3.5週、第4週、第4.5週、第5週、第5.5週、第6週、第6.5週、第7週、第8週、第9週、第10週、第11週、第12週、第13週、第14週、第15週或第16週(或其中之任一衍生範圍) ATO。 在一些實施例中，T細胞群或細胞組合物包含以下比率之活細胞:具有本文所述之表型及/或細胞標記物之細胞或以下比率之具有本文所述之表型及/或細胞標記物之細胞:活細胞：至少或至多1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9、1:3、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.4、1:3.5、1:3.6、1:3.7、1:3.8、1:3.9、1:4、1:4.1、1:4.2、1:4.3、1:4.4、1:4.5、1:4.6、1:4.7、1:4.8、1:4.9、1:5、1:5.1、1:5.2、1:5.3、1:5.4、1:5.5、1:5.6、1:5.7、1:5.8、1:5.9、1:6、1:6.1、1:6.2、1:6.3、1:6.4、1:6.5、1:6.6、1:6.7、1:6.8、1:6.9、1:7、1:7.1、1:7.2、1:7.3、1:7.4、1:7.5、1:7.6、1:7.7、1:7.8、1:7.9、1:8、1:8.1、1:8.2、1:8.3、1:8.4、1:8.5、1:8.6、1:8.7、1:8.8、1:8.9、1:9、1:9.1、1:9.2、1:9.3、1:9.4、1:9.5、1:9.6、1:9.7、1:9.8、1:9.9、1:10、1:10.5、1:11、1:11.5、1:12、1:12.5、1:13、1:13.5、1:14、1:14.5、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45或1:50 (或其中衍生之任一範圍)。 如本文說明書中所用，「一(a或an)」可意指一或多者。如本文申請專利範圍中所用，當結合詞語「包含」使用時，詞語「一(a或an)」可意指一者或一者以上。 除非明確指示此術語僅指替代物或該等替代物相互排斥，否則在申請專利範圍中使用術語「或」意指「及/或」，但本發明支持僅指替代物及「及/或」之定義。如本文所用之「另一」意指至少第二者或更多者。預期在申請專利範圍中可明確排除本文所論述之一或多個實施例。 在本申請案通篇中，術語「約」用於指示，一值包括裝置之固有誤差變異，用於確定該值之方法，或研究個體之間存在之變異。 在本文所論述之任一實施例中，術語「由……組成」或「基本上由……組成」可取代術語「包含」。 根據以下詳細描述將明瞭本發明之其他目標、特徵及優點。然而，應理解，儘管詳細描述及特定實例指示本發明之較佳實施例，但其僅以說明方式給出，此乃因熟習此項技術者自此詳細描述將明瞭在本發明之精神及範疇內之各種改變及修改。
相關申請案之交叉參考本發明係根據國立衛生研究院(National Institutes of Health)授予之基金號HL066992在政府支持下進行。政府擁有本發明的某些權利。 I. 導論本文闡述產生可與接受患者同種異體之非同種異體反應性T細胞之組合物及方法。此為業內之顯著改良，其提供更成本有效、更低勞動密集型療法且提供自體T細胞療法不可能之個體中之免疫療法。此外，提供產生經改造T細胞之新穎組合物及方法。該等組合物及方法係部分地基於以下發現來提供：包含人工胸腺類器官(ATO) 3D培養物之細胞培養組合物使用高度標準化、無血清組份及基質細胞系來促進來自人類HSPC之穩健且高度可再現之T細胞分化。在某些實施例中，發現ATO中之T細胞分化嚴密地模擬內源胸腺細胞生成，且與單層共培養物不同，其支持具有多樣TCR譜及抗原初始表型之功能性CD3+ TCRαβ+ CD8+及CD4+ T細胞之有效正向選擇。 作為非限制性實例，細胞培養組合物至少可用於產生源自經特異性針對諸如NY-ESO-1癌症相關抗原等抗原之經TCR轉導之HSPC的初始經等位基因排除的經TCR改造之抗原特異性T細胞。 在另一實施例中，利用此轉基因TCR系統展示，ATO中之正向選擇係由自體造血細胞上之自身MHC來驅動，但亦可藉由自身MHC之基質細胞表現來操縱以對活體外正向選擇建模或增強活體外正向選擇。 因此，諸如ATO等3D細胞培養組合物提供簡單、現成且高度標準化之端端T細胞發育模型，且可推進與造血、免疫再生、宿主免疫性及細胞免疫療法相關之一系列研究。 本文所述之方法及組合物代表技術之顯著進步。人工胸腺類器官實施例提供若干優於先前T細胞自HSPC分化方法之優點。益處包括(但不限於)以下中之一或多者： •       ATO產生來自造血幹細胞及祖細胞(HSPC)之所有T細胞分化階段，包括且最重要地成熟初始T細胞(CD4SP及CD8SP二者) •       在ATO中自HSPC產生成熟T細胞之能力允許藉由在HSPC中表現基因(例如TCR或CAR)來改質ATO系統以產生經改造T細胞 •       ATO系統亦可藉由在基質隔室(MS5)中表現基因來改質。 •       ATO培養物可為無血清的，且因此並不限制胎牛血清(FCS)之批次間變化或使用含FCS培養基之臨床轉化問題。 與人類HSPC之活體外T細胞分化之其他模型的比較說明其差異且展示本文所提供方法及細胞之益處。舉例而言，OP9-DL1系統自從約2005年即已視為來自人類HSPC之T細胞分化之黃金標準。該系統(由Juan Carlos Zuniga-Pflucker實驗室，Toronto, Canada研發)使用經notch配體δ樣配體1 (DLL1 aka DL1)轉導之鼠類基質細胞系(OP9)單層來誘導小鼠(Schmitt等人，Immunity, 2002)或人類( La Motte-Mohs, BLOOD 2005) HSPC之T細胞定型。將HSPC共培養於含有胎牛血清及細胞介素之培養基中之OP9-DL1單層上。此系統之變化形式使用DLL4替代DLL1 (OP9-DLL4)；使用DLL4之結果與DLL1無顯著不同。 然而，OP9-DL1系統有諸多問題。例如，存在可忽略的成熟T細胞產生。儘管OP9-DL1 (或OP9-DLL4)單層可誘導來自臍帶血(CB) HSPC之早期T細胞定型階段(CD7+CD5+/-細胞)，但經過CD4+CD8+ (DP)階段之分化因含有極少(若有) CD8+或CD4+單陽性(SP)成熟T細胞而非常無效(參見 LaMotte Mohs, BLOOD 2005)。來自La Motte-Mohs, Blood2005之圖4顯示此問題。Zuniga-Pflucker組之最新公開案( Awong 等人， BMC Immunol 2011)顯示，來自含有至多約2%-4% 成熟CD8+細胞(即CD8+CD3+CD1a-CD27+細胞)之60-70日齡OP9-DL1 /CB HSPC培養物之數據(在Awong之8% CD8+之圖1中，40%為CD3+CD27+)。 公開OP9-DL1模型之其他領先組來自Belgium (論文分別來自Vandekerckhove、Plum、Taghon)。類似於Zuniga-Pflucker組，Belgian組顯示當使用 CBHSPC時至多5% CD3+TCRab+細胞及極少(若有) SP8及SP4 ( de Smedt 等人， Haematologica, 2011)。應注意，在此組之另一論文中，可見較高頻率之成熟T細胞，此乃因培養物係用自人類 胸腺分離之HSPC來起始。在胸腺中，CD34+ HSPC主要包含原T細胞，其已暴露於胸腺信號以供T細胞分化且因此經引發以產生T細胞。參見圖2A，Van Coppernolle等人，2009 (HSPC來源自胸腺)。 作為OP9-DL1系統中較差成熟T細胞分化之進一步證據，Awong等人，2011中之表1顯示該等培養物中之產量：每一單一CD34+CD38- CB HSPC僅產生0.27至1.16個TCRab+CD3+細胞(n=6)。相比之下，ATO系統可產生1,000-2,000個TCRab+CD3+細胞/CB HSPC ( Seet 等人， 2016)。 其他證據顯示，使用其他(非CB)臨床HSPC來源OP9-DL1之作用甚至更差。使用OP9-DL1之幾乎所有的論文皆使用CB HSPC，此乃因與使用CB相比其他來源(即骨髓、BM或經動員末梢血(MPB)甚至更無效且更不可靠。 Plum組直接比較OP9-DL1基質上之CB與BM HSPC ( De Smedt 等人， Hematologica 2011)。其在其論文之圖2中顯示，與CB相比，BM HSPC起始之培養物具有約10%之DP及TCRab+CD3+細胞頻率(BM對CB分別為1%-2%對12% DP及0.7%對5% CD3+TCRab+)。 相比之下，ATO系統係自所有HSPC來源(BM、MPB、靜止PB、胸腺、CB)分化之高度有效之方法(參見 Seet 等人， 2016)。 此外，OP9-DL1在無血清培養基中無法存活。本發明者無法在3D聚集體及RB27培養基中使用OP9DL-1使來自MS5-DL1之ATO發現再現。OP9-DL1似乎無法在無血清條件下存活。 先前所研發之胎兒胸腺器官培養物(FTOC)係由完整人類胎兒胸腺片段組成之3D培養物，其接種有人類HSPC且生長於使用空氣流體界面之含胎牛血清培養基中。因notch配體係由人類胸腺上皮細胞(TEC)供應而無需轉導。關於FTOC系統之大部分論文皆用此進行鼠類T細胞分化( Anderson 等人，Annu Rev Immunol. 1996)。 另外，FTOC因存在保留於完整胸腺片段中之同種異體人類T細胞而無法用於臨床轉化；另外，分析顯示較大實驗變異性及定量困難。人類胎兒組織之有限可用性完全排除臨床轉化且使得甚至FTOC之實驗使用極為困難。因上述限制FTOC已經OP9-DL1或OP9-DLL4替代。 Crooks組研發出出生後胸腺類器官來研究胸腺微環境( Chung 等人， Stem Cells 2014)。其係由3D培養物組成，該等3D培養物係由人類TEC及胸腺間質形成，該等人類TEC及胸腺間質源自出生後胸腺、以單層單獨培養10-21天、且然後與臍帶血HSPC一起離心以形成3D聚集體。此模型之概念類似於ATO，其不同之處在於，1. 使用原代胸腺組織，2. 需要血清，3. 依賴於來自TEC而非經由轉導之內源notch配體表現。然而，使用出生後胸腺類器官存在問題：原代人類胸腺組織因其取自心臟手術患者而極難獲得，且因此無法頻繁地獲得且僅來自有限次數之情況。另外，胸腺基質之品質及量高度可變且因此T細胞分化不一致且產量較差。由於胸腺組織與CB HSPC同種異體，該模型產生免疫激發。出於所有該等原因，此模型無法用於臨床應用且對於實驗應用因定量及再現性而成問題。出於下文更詳細論述之原因，所提供之方法及組合物具有優於先前所研發方法之優點。 II. 定義術語「外源TCR」係指在活體外轉移(即藉助基因轉移/轉導/轉染技術)至細胞中之TCR基因或TCR基因衍生物。將外源TCR基因插入接受細胞之基因體中。在一些實施例中，插入係隨機插入。TCR基因之隨機插入容易地藉由業內已知之方法來達成。在一些實施例中，將TCR基因插入內源基因座(例如內源TCR基因座)中。在一些實施例中，細胞包含一或多個插入為非內源基因座之基因座之TCR基因。在一些實施例中，細胞進一步包含異源序列，例如標記物或抗性基因。 術語「嵌合抗原受體」或「CAR」係指將任意特異性移植至免疫效應細胞上之經改造受體。該等受體用於將單株抗體之特異性移植至T細胞上；且反轉錄病毒或慢病毒載體有助於其編碼序列之轉移。受體稱為嵌合之原因在於其係由不同來源之部分構成。該等分子之最常見形式係源自單株抗體之單鏈可變片段(scFv)融合至CD3-ζ跨膜及胞內結構域、CD28或41BB細胞內結構域或其組合之融合物。該等分子可傳遞因應scFv識別其靶之信號。該構築體之實例係14g2a-ζ，其係源自雜交瘤14g2a之scFv (其識別二唾液酸神經節苷酯GD2)。當T細胞表現此分子(通常藉由致癌反轉錄病毒載體轉導來達成)時，其識別並殺死表現GD2之靶細胞(例如神經胚細胞瘤細胞)。為靶向惡性B細胞，發明者已使用特異性針對B-譜系分子CD19之嵌合免疫受體重定向T細胞之特異性。藉由撓性連接體融合免疫球蛋白重鏈及輕鏈之可變部分以形成scFv。此scFv之前為信號肽以將初生蛋白質引導至內質網及後續表面表現(此為裂解的)。撓性間隔體允許scFv在不同方向上取向以使得能夠抗原結合。跨膜結構域係通常源自信號傳導胞內結構域之原始分子之典型疏水α螺旋，其突出至細胞中且傳遞期望信號。 術語「抗原」係指使免疫系統產生針對其之抗體或T細胞所因應之任何物質。在一些實施例中，抗原係長度為5-50個胺基酸或為至少、至多或恰好5個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、125個、150個、175個、200個、250個或300個胺基酸或其中之任一衍生範圍之肽。 術語「與接受者同種異體」欲指並非自接受者分離之細胞。在一些實施例中，細胞並非自患者分離。在一些實施例中，細胞並非自遺傳上匹配之個體(例如與相容基因型相關)分離。 術語「惰性」係指不產生不期望臨床毒性者。此可為靶控或脫靶毒性。「惰性」可基於已知或經預測之臨床安全性數據。 術語「不含異源成份(XF)」或「不含動物組份(ACF)」或「不含動物」在用於培養基、細胞外基質或培養條件時係指基本上不含異質動物源組份之培養基、細胞外基質或培養條件。為培養人類細胞，非人類動物(例如小鼠)之任何蛋白質將為異源成份組份。在某些態樣中，不含異源成份之基質可基本上不含任何非人類動物源組份，因此排除小鼠飼養細胞或Matrigel™。Matrigel™係自Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)小鼠肉瘤提取之可溶性基底膜製劑，該小鼠肉瘤係富含細胞外基質蛋白之腫瘤以包括層黏蛋白(主要組份)、膠原IV、硫酸肝素蛋白多醣及內功素/巢蛋白。 術語「定義的」在用於培養基、細胞外基質或培養條件時係指其中已知適宜地所有組份之性質及量之培養基、細胞外基質或培養條件。 「化學上定義的培養基」係指其中已知適宜地所有成份之化學性質及其量之培養基。該等培養基亦稱為合成培養基。化學上定義的培養基之實例包括TeSR™。 如本文所用，細胞「實質上不含」某些試劑或元件，例如血清、信號傳導抑制劑、動物組份或飼養細胞、外源遺傳元件或載體元件(當其具有小於10%之元件時)，且「基本上不含」某些試劑或元件(當其具有小於1%之元件時)。然而，甚至更期望者係其中總細胞群之小於0.5%或小於0.1%包含外源遺傳元件或載體元件之細胞群。 當培養物、基質或培養基之某些試劑之量分別低於使用熟習此項技術者已知之習用檢測方法的可檢測量或該等藥劑尚未在外部添加至培養物、基質或培養基中時，培養物、基質或培養基「基本上不含」該等試劑或元件，例如血清、信號傳導抑制劑、動物組份或飼養細胞。無血清培養基可基本上不含血清。 「末梢血球」係指在循環血池內發現之血液之細胞組份，包括紅血球、白血球及血小板。 「造血幹細胞及祖細胞」或「造血前體細胞」係指以下細胞：定型至造血譜系但能夠進一步造血分化且包括造血幹細胞、多能造血幹細胞(血胚細胞)、骨髓樣祖細胞、巨核細胞祖細胞、紅血球祖細胞及淋巴樣祖細胞。「造血幹細胞(HSC)」係產生所有血球類型、包括骨髓樣譜系(單核球及巨噬細胞、嗜中性球、嗜鹼性球、嗜酸性球、紅血球、巨核細胞/血小板、樹突細胞)及淋巴樣譜系(T細胞、B細胞、NK細胞)之多能幹細胞。 造血幹細胞及祖細胞可表現或可不表現CD34。造血幹細胞可共表現CD133且對CD38表現呈陰性、對CD90呈陽性、對CD45RA呈陰性、對呈譜系標記物陰性或其組合。造血祖細胞/前體細胞包括CD34(+)/ CD38(+)細胞及CD34(+)/ CD45RA(+)/lin(-)CD10+ (共同淋巴樣祖細胞)、CD34(+)CD45RA(+)lin(-)CD10(-)CD62L(hi) (淋巴氧引發之多能祖細胞)、CD34(+)CD45RA(+)lin(-)CD10(-)CD123+ (顆粒球-單核球祖細胞)、CD34(+)CD45RA(-)lin(-)CD10(-)CD123+ (共同骨髓樣祖細胞)或CD34(+)CD45RA(-)lin(-)CD10(-)CD123- (巨核細胞-紅血球祖細胞)。 「載體」或「構築體」(有時稱為基因遞送或基因轉移「媒劑」)係指包含欲在活體外或活體內遞送至宿主細胞之多核苷酸之大分子、分子複合物或病毒顆粒。多核苷酸可為線性或環狀分子。 一種常見類型之載體「質體」係自染色體DNA分離之染色體外DNA分子，其能夠獨立於染色體DNA複製。在某些情形下，其為環狀及雙鏈。 「表現構築體」或「表現盒」意指能夠引導轉錄之核酸分子。表現構築體至少包括啟動子或功能等效於啟動子之結構。亦可包括其他元件，例如增強子及/或轉錄終止信號。 術語「外源」在用於細胞或生物體中之蛋白質、基因、核酸或多核苷酸時係指已藉由人工方式引入細胞或生物體中之蛋白質、基因、核酸或多核苷酸，或在用於細胞時係指經分離且隨後藉由人工方式引入其他細胞或生物體之細胞。外源核酸可來自不同的生物體或細胞，或其可為天然存在於生物體或細胞中之核酸之一或多個額外拷貝。外源細胞可來自不同生物體，或其可來自相同生物體。藉助非限制性實例，外源核酸處於不同於天然細胞之染色體位置，或以其他方式側接有不同於在自然界中所發現之核酸序列。 在本文中使用術語「對應於」意指多核苷酸序列與參照多核苷酸序列之全部或一部分同源(即，一致但在進化上並不嚴格相關)，或多肽序列與參照多肽序列一致。相比之下，在本文中使用術語「與……互補」意指互補序列與參照多核苷酸序列之全部或一部分同源。出於說明之目的，核苷酸序列「TATAC」對應於參照序列「TATAC」且與參照序列「GTATA」互補。 「編碼」具體蛋白質之「基因」、「多核苷酸」、「編碼區」、「序列」、「區段」、「片段」或「轉基因」係在置於適宜調節序列之控制下時在活體外或活體內轉錄且亦視情況轉化成基因產物(例如多肽)之核酸分子。編碼區可以cDNA、基因體DNA或RNA形式存在。當以DNA形式存在時，核酸分子可為單鏈(即，有義鏈)或雙鏈。編碼區之邊界係由5' (胺基)末端之起始密碼子及3' (羧基)末端之轉化終止密碼子確定。基因可包括(但不限於)來自原核或真核mRNA之cDNA、來自原核或真核DNA之基因體DNA序列及合成DNA序列。轉錄終止序列通常將位於基因序列之3'。 術語「細胞」在本文中係以其業內最廣泛意義使用，且係指為多細胞生物體組織之結構單元、由使其與外部分離之膜結構圍繞、具有自我複製能力且具有用於表現其之遺傳資訊及機制的生活體。本文所用之細胞可為天然細胞或經人工修飾之細胞(例如，融合細胞、基因修飾細胞等)。 如本文所用術語「幹細胞」係指能夠自我複製且具有多潛能性或多能性之細胞。通常，幹細胞在受損組織中可再生。本文之幹細胞可為(但不限於)胚胎幹(ES)細胞、誘導性多潛能幹細胞或組織幹細胞(亦稱為組織特異性幹細胞或成體幹細胞)。 「胚胎幹(ES)細胞」係源自早期胚胎之多潛能幹細胞。ES細胞首次確立於1981年，其自從1989年亦適於產生剔除小鼠。在1998年，確立人類ES細胞，其當前正變得可用於再生醫學。 與ES細胞不同，組織幹細胞具有有限的分化潛能。組織幹細胞存在於組織中之具體位置且具有未分化之細胞內結構。因此，組織幹細胞之多潛能性通常較低。組織幹細胞具有較高的核/細胞質比率且具有極少細胞內細胞器。大部分組織幹細胞具有較低多潛能性、較長細胞週期及超出個體壽命之增殖能力。組織幹細胞基於衍生出細胞之位點分成多個類別，例如表皮系統、消化系統、骨髓系統、神經系統及諸如此類。表皮系統中之組織幹細胞包括表皮幹細胞、毛囊幹細胞及諸如此類。消化系統中之組織幹細胞包括胰臟(常用)幹細胞、肝幹細胞及諸如此類。骨髓系統中之組織幹細胞包括造血幹細胞、間葉幹細胞及諸如此類。神經系統中之組織幹細胞包括神經幹細胞、視網膜幹細胞及諸如此類。 「誘導性多潛能幹細胞」通常縮寫為iPS細胞或iPSC，其係指藉由引入某些因子(稱為再程式化因子)自非多潛能細胞(通常成人體細胞)或末端分化細胞(例如纖維母細胞、造血細胞、肌細胞、神經元、表皮細胞或諸如此類)人工製備之多潛能幹細胞類型。 「多潛能性」係指幹細胞具有分化成構成一或多個組織或器官或具體而言三個胚層中之任一者之所有細胞的潛能：內胚層(胃內黏膜、胃腸道、肺)、中胚層(肌肉、骨、血液、泌尿生殖器)或外胚層(表皮組織及神經系統)。本文所用之「多潛能幹細胞」係指可分化成源自三個胚層中之任一者之細胞(例如引導全能細胞或誘導性多潛能細胞之後代)的細胞。 「可操作連接」在提及核酸分子時意指以一定方式連接兩個或更多個核酸分子(例如，欲轉錄之核酸分子、啟動子及增強子元件)以容許該核酸分子轉錄。「可操作連接」在提及肽及/或多肽分子時意指以一定方式連接兩個或更多個肽及/或多肽分子以產生單一多肽鏈，即融合多肽，其具有融合物之每一肽及/或多肽組份之至少一種性質。融合多肽具體而言係嵌合的，即由異源分子構成。 III. T 細胞受體 (TCR) 及產生外源 TCR 之方法 .T細胞受體或TCR係在T淋巴球(T細胞)表面上發現之負責將抗原之片段識別為結合至主要組織相容性複合物(MHC)分子之肽之分子。TCR由兩個不同的蛋白質鏈構成(亦即其為異二聚體)。在95%之人類T細胞中，TCR係由阿爾法(α；在本文中亦稱為「a」)鏈及貝他(β-在本文中亦稱為「b」)鏈組成，而在5%之T細胞中，TCR係由γ鏈及δ鏈(γ/δ)組成。此比率在個體發育期間及在患病狀態下以及在不同物種中有所變化。 當TCR與抗原肽及MHC (肽/MHC)接合時，T淋巴球經由信號轉導(亦即由相關酶、共受體、專門銜接子分子及經活化或釋放之轉錄因子介導之一系列生物化學事件)活化。TCR係二硫鍵連接之膜錨定異二聚蛋白質，其通常係由高度可變之阿爾法(α)鏈及貝他(β)鏈組成，表現為與不變的CD3鏈分子之複合物之一部分。表現此受體之T細胞稱為α:β (或αβ或ab) T細胞，但少量T細胞表現由可變伽馬(γ - 在本文中亦稱為「g」)鏈及德爾塔(δ - 在本文中亦稱為「d」)鏈形成之替代性受體，稱為γδ (或gd) T細胞。 每一鏈係由兩個細胞外結構域構成：可變區(V)及恆定區(C)，兩者均係形成反向平行之β-摺疊之免疫球蛋白超家族(IgSF)結構域。恆定區毗鄰細胞膜，其後為跨膜區及短細胞質尾，而可變區結合至肽/MHC複合物。 TCR α鏈及β鏈二者之可變結構域各自具有三個超變區或互補決定區(CDR)，而β鏈之可變區具有額外超變區(HV4)，其通常不接觸抗原且因此並不視為CDR。 殘基位於TCR之兩個區域、即在α鏈及β鏈之界面及β鏈框架區中，人們認為其毗鄰CD3信號轉導複合物。CDR3係主要負責識別經處理抗原之CDR，但亦已顯示α鏈之CDR1與抗原肽之N末端部分相互作用，而β鏈之CDR1與肽之C末端部分相互作用。人們認為CDR2識別MHC。人們認為β鏈之CDR4不參與抗原識別，但已顯示與超抗原相互作用。TCR結構域之恆定結構域係由短連接序列組成，其中半胱胺酸殘基形成二硫鍵，此在雙鏈之間形成連接。 TCR係IgSF蛋白之成員意指其可與抗體及BCR進行比較。就相似性而言，TCR如同具有重鏈及輕鏈之抗體之一半，只是重鏈不含其可結晶部分(Fc) (應注意：在個體發育上，TCR α經歷VJ重組，故其如同輕鏈；TCR β經歷VDJ重組，故其如同重鏈)。因此TCR在個體發育上如同抗體之一個抗體結合片段。TCR之兩個亞單位扭轉在一起。而抗體利用其Fc區結合至固有白血球上之Fc受體，TCR已停駐至細胞膜上。然而，TCR因其短細胞質尾所致自身無法調介信號轉導，故TCR仍需要CD3及ζ在其位置實施信號轉導，如同抗體需要結合至FcR來起始信號轉導一般。以此方式，T細胞之MHC-TCR-CD3相互作用在功能上類似於骨髓樣白血球之Ag-Ig-FcR相互作用及B細胞之Ag-Ig-CD79相互作用。 產生抗原特異性TCR之方法為業內已知。方法可包括例如1) 合成源自所關注蛋白質(例如腫瘤抗原、來自測序數據之新抗原等)之已知或經預測之HLA限制性肽表位；2) 經由抗原呈遞細胞(用於擴增)或四聚體(用於直接分選)將該等抗原呈遞至T細胞池，欲自該T細胞池提取TCR序列(例如在腫瘤-ag特異性T細胞之情形下為腫瘤浸潤淋巴球)；3) 選擇或篩選抗原特異性T細胞(例如基於四聚體結合FACS分選抗原特異性T細胞)；4) 對TCR基因(即TCR之α及β鏈或γ及δ鏈)進行選殖(經由RT-PCR)及測序；選殖及測序可在群或單細胞層級上進行；及5) 確認及分析TCR特異性，其係藉由例如用該等序列轉導末梢血T細胞並評價其對表現同源肽-MHC複合物之靶細胞之反應性測試TCR純系之功能來實施。反應性通常係基於細胞介素產生(例如干擾素γ)來量測。 Ⅳ . 細胞培養組合物及方法3D培養組合物(例如人工胸腺類器官(ATO))係用於在活體外自幹細胞產生人類T細胞之最佳化、高度有效且高度可再現之現成溶液。與用於T細胞分化之現有實驗模型相比，3D培養組合物之某些態樣使用無血清條件，避免使用人類胸腺組織或專有支架材料，且有助於自幹細胞正向選擇及穩健產生全功能成熟人類T細胞。作為活體外T細胞發育之潛在商業平臺，與競爭性技術相比，3D培養組合物提供效率、再現性、可擴縮性及降低的成本及勞動。非限制性商業應用可包括人類T細胞發育之活體外實驗建模及在活體外自多個幹細胞來源產生經改造之T細胞免疫療法。 在某些實施例中，可提供最佳化三維(3D)培養系統，其用於在活體外自人類幹細胞及/或祖細胞(HSPC)產生功能T細胞。所得細胞3D結構可稱為人工胸腺類器官(ATO)。 在具體實施例中，此系統可包含人類HSPC與基質細胞之3D結構聚集，該等基質細胞在含有FLT3配體(FLT3L)、介白素7 (IL-7)、B27及抗壞血酸之最佳化培養基存在下表現Notch配體。亦可存在容許培養物處於空氣-流體界面之條件。已確定ATO內來自可溶性因子(細胞介素、抗壞血酸、B27組份及基質細胞源因子)以及造血細胞與基質細胞之間之3D細胞-細胞相互作用之組合信號傳導促進人類T譜系定型、正向選擇及有效分化成功能性成熟T細胞。 在特定實施例中，可提供一種3D培養組合物之方法(例如ATO產生)，如所研發，其涉及經人類 DLL1轉導之MS-5鼠類基質細胞系(下文稱為MS5-hDLL1)與自人類臍帶血、骨髓或經G-CSF動員之末梢血分離之CD34 +HSPCs之聚集。將多至1×10 6個HSPC與MS5-hDLL1細胞以最佳化比率(通常1:10 HSPC對基質細胞)混合。 舉例而言，聚集係藉由離心混合之細胞懸浮液(「緊密聚集」)、然後吸出無細胞上清液來達成。在特定實施例中，然後可將細胞沈澱物吸出呈5-10 μl分化培養基中之漿液且以液滴轉移至0.4 μm耐綸transwell培養插入物上，使該等插入物漂浮在分化培養基之孔中，允許插入物之底部與培養基接觸且插入物之頂部與空氣接觸。 舉例而言，分化培養基係由RPMI-1640、5 ng/ml人類FLT3L、5 ng/ml人類IL-7、4%無血清B27補充物及30 μM L-抗壞血酸組成。可每3-4天完全更換培養插入物周圍之培養基。在培養最初2週期間，細胞聚集體可自我組織為ATO，且發生早期T細胞譜系定型及分化。在某些態樣中，將ATO培養至少6週以允許最佳T細胞分化。藉由吸量管抽吸使ATO解聚來達成自ATO提取造血細胞。 此方案之變化容許使用對效能具有不同影響之替代組份，特定而言： 基礎培養基RPMI可由若干市售替代物(例如IMDM)取代。 所用基質細胞系係MS-5 (先前所述之鼠類骨髓細胞系(Itoh等人，1989))，然而MS-5可由類似鼠類基質細胞系(例如OP9、S17)、人類基質細胞系(例如HS-5、HS-27a)、原代人類基質細胞或人類多潛能幹細胞源基質細胞取代。 用編碼人類 DLL1cDNA之慢病毒轉導基質細胞系；然而，可改變基因遞送方法以及Notch配體基因。替代性Notch配體基因包括 DLL4、 JAG1、 JAG2及其他基因。Notch配體亦包括美國專利7795404及8377886中所述者，該等專利以引用方式併入本文中。Notch配體進一步包括δ 1、3及4及Jagged 1、2。 HSPC之類型及來源可包括骨髓、臍帶血、末梢血、胸腺或其他主要來源；或源自人類胚胎幹細胞(ESC)或誘導性多潛能幹細胞(iPSC)之HPSC。 可改變細胞介素條件：例如可改變FLT3L及IL-7之含量以改變T細胞分化動力學；可添加其他造血細胞介素，例如幹細胞因子(SCF/KIT配體)、促血小板生成素(TPO)、IL-2、IL-15。 亦可將基因修飾引入某些組份以產生抗原特異性T細胞並對正向及負向選擇建模。該等修飾之實例包括：用編碼抗原特異性T細胞受體(TCR)或嵌合抗原受體(CAR)之慢病毒載體轉導HSPC以產生抗原特異性、等位基因排除之初始T細胞；用基因轉導HSPC以將譜系定型引導至專門淋巴樣細胞。舉例而言，在ATO中用不變的天然殺手T細胞(iNKT)相關之TCR轉導HSPC以產生功能性iNKT細胞；用人類MHC基因轉導ATO基質細胞系(例如，MS5-hDLL1)以增強ATO中經TCR改造或未經改造T細胞之正向選擇及成熟；及/或用抗原加共刺激分子或細胞介素轉導ATO基質細胞系以增強ATO中CAR T細胞之正向選擇。 V. 細胞培養條件可針對本文所述之3D細胞聚集體之培養及T細胞產生及/或其正向/負向選擇來提供細胞培養條件。在某些態樣中，所選群之起始細胞可包含至少或約10 4個、10 5個、10 6個、10 7個、10 8個、10 9個、10 10個、10 11個、10 12個、10 13個細胞或其中衍生之任一範圍。起始細胞群可具有以下接種密度：至少或約10個細胞/ml、10 1個細胞/ml、10 2個細胞/ml、10 3個細胞/ml、10 4個細胞/ml、10 5個細胞/ml、10 6個細胞/ml、10 7個細胞/ml、10 8個細胞/ml或其中衍生之任一範圍。 B. 培養容器用於培養3D細胞聚集體或其子代細胞之培養容器可包括(但不具體限於)：燒瓶、用於組織培養之燒瓶、培養皿、皮氏培養皿、用於組織培養之培養皿、複合培養皿、微量板、微孔板、複合板、多孔板、載玻片、腔室玻片、管、盤、CellSTACK®室、培養袋及轉瓶，只要其中能夠培養幹細胞即可。幹細胞可以下列體積來培養：至少或約0.2 ml、0.5 ml、1 ml、2 ml、5 ml、10 ml、20 ml、30 ml、40 ml、50 ml、100 ml、150 ml、200 ml、250 ml、300 ml、350 ml、400 ml、450 ml、500 ml、550 ml、600 ml、800 ml、1000 ml、1500 ml或其中衍生之任一範圍，此端視培養物之需要而定。在某一實施例中，培養容器可為生物反應器，其可指支持生物活性環境之任何裝置或系統。生物反應器之體積可為至少或約2升、4升、5升、6升、8升、10升、15升、20升、25升、50升、75升、100升、150升、200升、500升、1立方米、2立方米、4立方米、6立方米、8立方米、10立方米、15立方米或其中衍生之任一範圍。 培養容器可為細胞黏著或非黏著的且端視該目的來選擇。細胞黏著培養容器可塗覆有用於細胞黏著之任一受質(例如細胞外基質(ECM))以改良容器表面對細胞之黏著性。用於細胞黏著之受質可為意欲附接幹細胞或飼養細胞(如使用)之任何材料。用於細胞黏著之受質包括膠原、明膠、聚-L-離胺酸、聚-D-離胺酸、層黏蛋白、及纖連蛋白及其混合物(例如Matrigel TM)以及溶解細胞膜製劑。 C. 基質組份多種定義的基質組份可用於培養方法或組合物中。舉例而言，可使用呈組合形式之重組膠原IV、纖連蛋白、層黏蛋白及玻連蛋白來塗覆培養表面以為多潛能細胞生長提供固體支撐物，如Ludwig等人 (2006a; 2006b)中所述，該文獻之全文以引用方式併入本文中。 可將基質組合物固定在表面上以為細胞提供支撐。基質組合物可包括一或多種細胞外基質(ECM)蛋白及水性溶劑。業內認可術語「細胞外基質」。其組份包括以下蛋白質中之一或多者：纖連蛋白、層黏蛋白、玻連蛋白、生腱蛋白、內功素、凝血酶敏感蛋白、彈性蛋白、明膠、膠原、小纖維蛋白、分區蛋白、錨定蛋白、軟骨黏連蛋白、連接蛋白、骨唾液酸蛋白、骨鈣化素、骨橋蛋白、表皮黏連蛋白、透明質黏連蛋白、粗纖維調節素、表皮整聯配體蛋白及韁蛋白。其他細胞外基質蛋白闡述於Kleinman等人，(1993)中，該文獻以引用方式併入本文中。術語「細胞外基質」意欲涵蓋目前未知之可在將來發現之細胞外基質，此乃因熟習此項技術者將可容易地確定其表徵為細胞外基質。 在一些態樣中，基質組合物中之總蛋白質濃度可為約1 ng/mL至約1 mg/mL。在一些實施例中，基質組合物中之總蛋白質濃度為約1 μg/mL至約300 μg/mL。在更佳實施例中，基質組合物中之總蛋白質濃度為約5 μg/mL至約200 μg/mL。 細胞外基質(ECM)蛋白可具有天然來源且自人類或動物組織純化。或者，ECM蛋白在自然界中可為經遺傳改造之重組蛋白或合成蛋白。ECM蛋白可為全蛋白或呈天然或經改造之肽片段形式。可用於細胞培養用基質之ECM蛋白之實例包括層黏蛋白、I型膠原、IV型膠原、纖連蛋白及玻連蛋白。在一些實施例中，基質組合物包括纖連蛋白或重組纖連蛋白之合成產生之肽片段。 在其他實施例中，基質組合物包括至少纖連蛋白及玻連蛋白之混合物。在一些其他實施例中，基質組合物較佳包括層黏蛋白。 基質組合物較佳包括單一類型之細胞外基質蛋白。在一些實施例中，基質組合物包括纖連蛋白，具體而言用於培養祖細胞。舉例而言，適宜基質組合物可藉由將人類纖連蛋白(例如由Franklin Lakes, N.J.之Becton, Dickinson & Co. (BD)出售之人類纖連蛋白(目錄號354008))於達爾伯克氏磷酸鹽緩衝鹽水(Dulbecco's phosphate buffered saline，DPBS)中稀釋至5 μg/mL至約200 μg/mL之蛋白質濃度來製備。在具體實例中，基質組合物包括纖連蛋白片段，例如RetroNectin®。RetroNectin®係具有(574胺基酸)之約63 kDa蛋白質，其含有中心細胞結合結構域(III型重複，8,9,10)、高親和力肝素結合結構域II (III型重複，12,13,14)及人類纖連蛋白之選擇式剪接之IIICS區內之CS1位點。 在一些其他實施例中，基質組合物可包括層黏蛋白。舉例而言，適宜基質組合物可藉由將層黏蛋白(Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo.)；目錄號L6274及L2020)於達爾伯克氏磷酸鹽緩衝鹽水(DPBS)中稀釋至5 μg/ml至約200 μg/ml之蛋白質濃度來製備。 在一些實施例中，基質組合物不含異源成份在於基質或其組份蛋白質僅具有人類來源。此可期望用於某些研究應用。舉例而言，為在不含異源成份之基質中培養人類細胞，可使用人類來源之基質組份，其中可排除任何非人類動物組份。在某些態樣中，可排除Matrigel TM作為培養組合物之受質。Matrigel TM係由小鼠腫瘤細胞分泌之凝膠狀蛋白質混合物且可自BD Biosciences (New Jersey, USA)購得。此混合物類似於在許多組織中發現之複雜細胞外環境且通常被細胞生物學家用作細胞培養之受質，但其可引入不期望異源抗原或污染物。 VI. 可選擇或可篩選標記物在某些實施例中，可在活體外或活體內藉由在表現載體或外源核酸中引入標記物來鑑別含有外源核酸之細胞。該等標記物將賦予細胞可鑑別之變化，從而容許容易地鑑別出含有表現載體之細胞。通常，選擇標記物可為賦予允許選擇性質者。正向選擇標記物可為標記物之存在允許其選擇者，而負向選擇標記物係其存在阻止其選擇者。正向選擇標記物之實例係抗藥性標記物。 通常，納入藥物選擇標記物有助於選殖及鑑別轉變體，例如賦予新黴素、嘌呤黴素、潮黴素、DHFR、GPT、吉歐黴素及組胺醇抗性之基因係有用的選擇標記物。除賦予允許基於條件之實施區別轉變體之表型的標記物外，亦涵蓋基於比色分析之其他類型之標記物，包括可篩選標記物，例如GFP。或者，可使用可篩選為負向選擇標記物之酶，例如單純皰疹病毒胸苷激酶( tk)或氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)。熟習此項技術者亦應知曉如何可能地結合FACS分析來使用免疫標記物。人們認為所用標記物並不重要，只要其能夠與編碼基因產物之核酸同時表現即可。選擇及可篩選標記物之其他實例為熟習此項技術者所熟知。 可選擇標記物可包括一種類型之報導基因，其用於實驗室微生物學、分子生物學及遺傳工程中來指示意欲將外源DNA引入細胞中之轉染或其他程序之成功。可選擇標記物通常係抗生素抗性基因；使已經受引入外源DNA之程序之細胞生長於含有抗生素之培養基上，且可生長之彼等細胞已成功地吸收且表現所引入之遺傳材料。可選擇標記物之實例包括：來自Tn5之Abicr基因或Neo基因，其賦予建那黴素抗生素抗性。 可篩選標記物可包含報導基因，其允許研究者區分期望與不期望細胞。本發明之某些實施例利用報導基因來指示特定細胞譜系。舉例而言，報導基因可位於表現元件內且在通常與心室或心房選擇性基因之編碼區締合之心室或心房選擇性調節元件控制下用於同時表現。報導基因允許分離特定譜系之細胞而不將其置於藥物或其他選擇壓力下或以其他方式損害細胞活力。 該等報導基因之實例包括編碼細胞表面蛋白(例如，CD4、HA表位)、螢光蛋白、抗原決定子及酶(例如，β-半乳糖苷酶)之基因。含有載體之細胞可例如藉由FACS使用帶螢光標籤之抗體來分離，該等抗體係針對可藉由載體編碼之酶轉化成螢光產物之細胞表面蛋白質或受質。 在特定實施例中，報導基因係螢光蛋白。業內已研發出一系列螢光蛋白遺傳變體，其特徵在於跨越幾乎整個可見光譜之螢光發射光譜特徵(關於非限制性實例參見表1)。原始維多利亞多管發光水母(Aequorea victoria jellyfish)綠色螢光蛋白中之誘變努力已產生新的螢光探針，其色彩介於藍色至黃色之範圍內，且係在生物研究中最廣泛使用之活體內報導基因分子中之一些。已自海葵(marine anemone)紋狀海葵(Discosoma striata)及屬珊瑚綱(class Anthozoa)之礁珊瑚研發出在橙色及紅色光譜區域中發射之較長波長螢光蛋白。其他物種意欲產生具有青色、綠色、黃色、橙色及深紅色螢光發射之類似蛋白質。業內正致力於發育研究以改良螢光蛋白之亮度及穩定性，由此改良其總體有用性。 表 1 螢光蛋白性質
蛋白質 (字首語) 激發 最大值 (nm) 發射 最大值 (nm) 莫耳 消光 係數 量子 產率 活體內 結構 相對 亮度 (佔EGFP之%)
GFP (wt) 395/475 509 21,000 0.77 單體* 48
綠色螢光蛋白
EGFP 484 507 56,000 0.60 單體* 100
AcGFP 480 505 50,000 0.55 單體* 82
TurboGFP 482 502 70,000 0.53 單體* 110
Emerald 487 509 57,500 0.68 單體* 116
Azami Green 492 505 55,000 0.74 單體 121
ZsGreen 493 505 43,000 0.91 四聚體 117
藍色螢光蛋白
EBFP 383 445 29,000 0.31 單體* 27
Sapphire 399 511 29,000 0.64 單體* 55
T-Sapphire 399 511 44,000 0.60 單體* 79
青色螢光蛋白
ECFP 439 476 32,500 0.40 單體* 39
mCFP 433 475 32,500 0.40 單體 39
Cerulean 433 475 43,000 0.62 單體* 79
CyPet 435 477 35,000 0.51 單體* 53
AmCyan1 458 489 44,000 0.24 四聚體 31
Midori-Ishi Cyan 472 495 27,300 0.90 二聚體 73
mTFP1 (Teal) 462 492 64,000 0.85 單體 162
黃色螢光蛋白
EYFP 514 527 83,400 0.61 單體* 151
Topaz 514 527 94,500 0.60 單體* 169
Venus 515 528 92,200 0.57 單體* 156
mCitrine 516 529 77,000 0.76 單體 174
YPet 517 530 104,000 0.77 單體* 238
PhiYFP 525 537 124,000 0.39 單體* 144
ZsYellow1 529 539 20,200 0.42 四聚體 25
mBanana 540 553 6,000 0.7 單體 13
橙色及紅色螢光蛋白
Kusabira Orange 548 559 51,600 0.60 單體 92
mOrange 548 562 71,000 0.69 單體 146
dTomato 554 581 69,000 0.69 二聚體 142
dTomato-Tandem 554 581 138,000 0.69 單體 283
DsRed 558 583 75,000 0.79 四聚體 176
DsRed2 563 582 43,800 0.55 四聚體 72
DsRed-Express(T1) 555 584 38,000 0.51 四聚體 58
DsRed-單體 556 586 35,000 0.10 單體 10
mTangerine 568 585 38,000 0.30 單體 34
mStrawberry 574 596 90,000 0.29 單體 78
AsRed2 576 592 56,200 0.05 四聚體 8
mRFP1 584 607 50,000 0.25 單體 37
JRed 584 610 44,000 0.20 二聚體 26
mCherry 587 610 72,000 0.22 單體 47
HcRed1 588 618 20,000 0.015 二聚體 1
mRaspberry 598 625 86,000 0.15 單體 38
HcRed-Tandem 590 637 160,000 0.04 單體 19
mPlum 590 649 41,000 0.10 單體 12
AQ143 595 655 90,000 0.04 四聚體 11
*弱二聚體
VII. 外源基因編輯在某些實施例中，可使用經改造核酸酶來引入外源核酸序列用於本文所用之任何細胞、具體而言培養方法或組合物中之起始細胞(例如基質細胞或幹細胞或祖細胞)之基因修飾。 基因體編輯或利用經改造核酸酶之基因體編輯(GEEN)係一種類型之遺傳改造，其中使用經人工改造之核酸酶或「分子剪刀」自基因體插入、替代或移除DNA。核酸酶在基因體中之期望位置產生特定雙鏈斷裂(DSB)，且利用細胞之內源機制藉由同源重組(HR)及非同源末端連結(NHEJ)之天然過程來修復所誘導之斷裂。 非限制性經改造核酸酶包括：鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄活化劑樣效應物核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas9系統及經改造大範圍核酸酶再改造之歸巢內核酸酶。在方法及組合物之某些態樣中可使用業內已知之任一經改造核酸酶。 在遺傳分析中通常實踐，為理解基因或蛋白質之功能，以序列特異性方式對其進行干擾且監測其對生物體之效應。然而，在一些生物體中，難以或無法實施位點特異性誘變，且因此必須使用更間接之方法，例如藉由短RNA干擾(siRNA)使所關注基因沉默。但藉由siRNA破壞基因可變化且不完全。利用核酸酶(例如ZFN)之基因體編輯與siRNA之不同之處在於，經改造核酸酶能夠改質DNA結合特異性且因此原則上可切割基因體中之任何靶向位置，並為習用RNAi無法明確靶向之基因引入內源序列之修飾。此外，ZFN及TALEN之特異性得到增強，此乃因兩個ZFN為識別其靶之部分及隨後引導至相鄰序列所必需。 通常在微生物物種中發現之大範圍核酸酶之獨特性質在於具有極長識別序列(＞14 bp)，因此使其通常極具特異性。此可用於在基因體編輯中製備位點特異性DSB；然而，挑戰在於業內已知或可能曾經已知之大範圍核酸酶不足以覆蓋所有可能的靶序列。為克服此挑戰，已使用誘變及高通量篩選方法來產生識別獨特序列之大範圍核酸酶變體。其他核酸酶已能夠融合多種大範圍核酸酶且產生識別新序列之雜合酶。但他人已嘗試在方法中改變大範圍核酸酶之DNA相互作用胺基酸來設計序列特異性大範圍核酸酶，稱為經合理設計之大範圍核酸酶(美國專利8,021,867 B2，其以引用方式併入本文中)。 大範圍核酸酶具有與諸如ZFN等方法相比在細胞中引起較小毒性之益處，此可能歸因於更嚴格之DNA序列識別；然而，針對所有可能序列之序列特異性酶之構築成本高且費時，此乃因無法自使用諸如ZFN及TALEN等方法之組合可能性受益。因此其存在優點及缺點二者。 與大範圍核酸酶不同，ZFN及TALEN背後之概念更多係基於非特異性DNA切割酶，該酶此後連接至識別諸如鋅指及轉錄活化劑樣效應物(TALE)等肽之特異性DNA序列。一種方式係發現DNA識別位點及裂解位點彼此分開之內核酸酶，該情況在限制酶中並不常見。發現此酶後，可立即分離其裂解部分，該部分因其不具識別能力而極具非特異性。然後可將此部分連接至可產生極高特異性之序列識別肽。具有該等性質之限制酶之實例係FokI。另外，FokI之優點在於需要二聚化以具有核酸酶活性，且此意味著該特異性因每一核酸酶伴侶將識別獨特的DNA序列而顯著增加。為增強此效應，FokI核酸酶已經改造以僅可用作異二聚體且具有增加的催化活性。異二聚體功能性核酸酶將避免不期望同二聚體活性之可能性且因此增加DSB之特異性。 儘管ZFN及TALEN二者之核酸酶部分具有相似性質，但該等經改造核酸酶之間之差別在於其DNA識別肽。ZFN依賴於Cys2-His2鋅指且TALEN依賴於TALE。該等DNA識別肽結構域皆具有以下特徵：其以組合形式天然發現於其蛋白質中。Cys2-His2鋅指通常出現在間隔3 bp之重複中且以不同組合發現於多種核酸相互作用蛋白質(例如轉錄因子)中。另一方面，TALE發現於胺基酸與所識別核苷酸對之間為1:1識別比率之重複中。由於鋅指及TALE二者係以重複模式出現，故可嘗試不同組合以產生眾多種序列特異性。鋅指已更加確立於該等術語及方法中，例如模組組裝(其中與三聯體序列相關聯之鋅指附接在一列中以涵蓋所需序列)、OPEN (在細菌系統中，肽結構域對三聯體核苷酸之低嚴格性選擇，然後肽組合對最終靶之高嚴格性選擇)，且在其他方法中已使用鋅指文庫之細菌單雜合篩選來製備位點特異性核酸酶。 VIII. 外源基因遞送在某些實施例中，載體可經構築以包含外源核酸序列用於本文所用之任何細胞、具體而言培養方法或組合物中之起始細胞(例如基質細胞或幹細胞或祖細胞)之基因修飾。該等載體及遞送方法之組份之細節揭示於下文中。 A. 載體熟習此項技術者充分準備好經由標準重組技術構築載體(例如，參見Maniatis等人，1988及Ausubel等人，1994，該二者皆以引用方式併入本文中)。 載體亦可包含進一步調節基因遞送及/或基因表現或以其他方式向所靶向細胞提供有益性質之其他組份或功能。該等其他組份包括例如影響與細胞(包括調介細胞類型或組織特異性結合之組份)之結合或靶向之組份；影響細胞對載體核酸之攝取之組份；影響多核苷酸在攝取後在細胞內定位之組份(例如調介核定位之藥劑)；及影響多核苷酸表現之組份。 該等組份亦可包括標記物，例如可用於檢測或選擇已吸收且表現由載體遞送之核酸之細胞的可檢測及/或選擇標記物。該等組份可提供為載體之天然特徵(例如使用具有調介結合及攝取之組份或功能之某些病毒載體)，或載體可經修飾以提供該等功能。眾多種該等載體為業內已知且通常可獲得。當將載體維持於宿主細胞中時，該載體可在有絲分裂期間作為自主結構藉由細胞穩定地複製，納入宿主細胞之基因體內或維持於宿主細胞之核或細胞質中。 B. 調節元件包括在載體中之真核表現盒具體而言含有(在5'至3'方向)可操作連接至蛋白質編碼序列之真核轉錄啟動子、剪接信號(包括間插序列)及轉錄終止/多聚腺苷酸化序列。 i. 啟動子 / 增強子「啟動子」係為核酸序列之控制起始及轉錄速率之區域的控制序列。其可含有調節蛋白質及分子可結合以起始特定轉錄核酸序列之遺傳元件，例如RNA聚合酶及其他轉錄因子。片語「可操作定位」、「可操作連接」、「在控制下」及「在轉錄控制下」意指啟動子相對於核酸序列處於正確功能位置及/或取向以控制該序列之轉錄起始及/或表現。 啟動子通常包含用於定位RNA合成之起始位點之序列。此之最佳已知實例係TATA盒，但在一些缺少TATA盒之啟動子(例如用於哺乳動物末端去氧核苷酸轉移酶基因之啟動子及用於SV40晚期基因之啟動子)中，上覆起始位點自身之離散元件有助於固定起始位置。其他啟動子元件調節轉錄起始之頻率。通常，該等元件位於起始位點上游之30-110 bp區域中，但已顯示多種啟動子亦含有位於起始位點下游之功能元件。為使編碼序列「處於啟動子控制下」，定位所選啟動子之轉錄閱讀框「下游」(即，3')之轉錄起始位點之5'末端。「上游」啟動子刺激DNA之轉錄且促進所編碼RNA之表現。 啟動子元件之間之間距通常較靈活，以使得在相對於彼此插入或移動元件時保留啟動子功能。在tk啟動子中，啟動子元件之間之間距可在活性開始下降之前增加至50 bp。端視啟動子，似乎個別元件可協同或獨立地發揮活化轉錄之功能。啟動子可結合或可不結合「增強子」使用，「增強子」係指參與核酸序列之轉錄活化之順式作用調節序列。 啟動子可為與核酸序列天然締合、如可藉由分離位於編碼區段及/或外顯子上游之5'非編碼序列獲得者。該啟動子可稱為「內源」啟動子。類似地，增強子可為與核酸序列天然締合、位於該序列之下游或上游者。或者，藉由在重組或異源啟動子控制下定位編碼核酸區段將獲得某些優點，該重組或異源啟動子係指通常不與其天然環境中之核酸序列締合之啟動子。重組或異源增強子亦係指通常不與其天然環境中之核酸序列締合之增強子。該等啟動子或增強子可包括其他基因之啟動子或增強子、及自任何其他病毒或原核或真核細胞分離之啟動子或增強子、及非「天然」(即含有不同轉錄調節區域之不同元件及/或改變表現之突變)啟動子或增強子。舉例而言，最常用於重組DNA構築之啟動子包括β-內醯胺酶(青黴素酶)、乳糖及色胺酸(trp)啟動子系統。除以合成方式產生啟動子及增強子之核酸序列外，各序列可使用重組選殖及/或核酸擴增技術(包括PCR™)結合本文所揭示之組合物來產生(參見美國專利第4,683,202號及第5,928,906號，其各自以引用方式併入本文中)。此外、預期亦可採用引導非核細胞器(例如粒線體、葉綠體及諸如此類)內序列之轉錄及/或表現之控制序列。 通常，採用有效地引導經選擇用於表現之細胞器、細胞類型、組織、器官或生物體中之DNA區段之表現的啟動子及/或增強子至關重要。熟習分子生物學技術者通常知曉使用啟動子、增強子及細胞類型組合進行蛋白質表現(例如，參見Sambrook等人，1989，其以引用方式併入本文中)。所用啟動子可為組成型、組織特異性、誘導型，及/或可在適宜條件下用於引導所引入DNA區段之大量表現，例如有利地用於大規模產生重組蛋白質及/或肽。啟動子可為異源或內源啟動子。 另外，亦可使用任何啟動子/增強子組合(根據例如真核啟動子數據庫EPDB、經由全球資訊網epd.isb-sib.ch/)來驅動表現。使用T3、T7或SP6細胞質表現系統係另一可能的實施例。若提供適宜細菌聚合酶作為遞送複合物之一部分或作為另一遺傳表現構築體，則真核細胞可支持來自某些細菌啟動子之細胞質轉錄。 啟動子之非限制性實例包括早期或晚期病毒啟動子，例如SV40早期或晚期啟動子、巨細胞病毒(CMV)立即早期啟動子、勞斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus，RSV)早期啟動子；真核細胞啟動子，例如β肌動蛋白啟動子(Ng, 1989；Quitsche等人，1989)、GADPH啟動子(Alexander等人，1988；Ercolani等人，1988)、金屬硫蛋白啟動子(Karin等人，1989；Richards等人，1984)；及串聯反應元件啟動子，例如環狀AMP反應元件啟動子(cre)、血清反應元件啟動子(sre)、佛波醇酯啟動子(TPA)及靠近最小TATA盒之反應元件啟動子(tre) 。亦可使用人類生長激素啟動子序列(例如，基因庫上所述之人類生長激素最小啟動子，登錄號X05244，核苷酸283-341)或小鼠乳房腫瘤促進劑(可自ATCC購得，目錄號ATCC 45007)。特定實例可為磷酸甘油酯激酶(PGK)啟動子。 ii. 蛋白酶裂解位點 / 自 身裂解肽及內部核糖體結合位點適宜蛋白酶裂解位點及自身裂解肽為熟習此項技術者已知(例如，參見Ryan等人，1997；Scymczak等人，2004)。蛋白酶裂解位點之實例係以下蛋白酶之裂解位點：馬鈴薯Y病毒屬(potyvirus) NIa蛋白酶(例如菸草蝕刻病毒蛋白酶)、馬鈴薯Y病毒屬HC蛋白酶、馬鈴薯Y病毒屬P1 (P35)蛋白酶、byovirus Nla蛋白酶、byovirus RNA-2編碼之蛋白酶、口蹄疫病毒L蛋白酶、腸病毒2A蛋白酶、鼻病毒2A蛋白酶、小核糖核酸病毒3C蛋白酶、豇豆花葉病毒屬24K蛋白酶、線蟲傳多面體病毒24K蛋白酶、RTSV (水稻東格魯球狀病毒(rice tungro spherical virus)) 3C樣蛋白酶、PY\IF (歐防風黃點病毒) 3C樣蛋白酶、凝血酶、因子Xa及腸激酶。由於其高裂解嚴格性，可使用TEV (菸草蝕刻病毒)蛋白酶裂解位點。 實例性自身裂解肽(亦稱為「順式作用水解元件」、CHYSEL；參見deFelipe (2002)係源自馬鈴薯Y病毒屬及心病毒2A肽。具體自身裂解肽可選自源自FMDV (口蹄疫病毒)、馬鼻炎A病毒、明脈扁刺蛾β四體病毒(Thoseà asigna virus)及豬鐵士古病毒之2A肽。 亦可使用特定起始信號來有效轉化多順反子信使中之編碼序列。該等信號包括ATG起始密碼子及毗鄰序列。可能需要提供外源轉化控制信號，包括ATG起始密碼子。熟習此項技術者將容易地能夠確定此且提供所需信號。業內熟知起始密碼子必須在期望編碼序列之閱讀框之「框內」以確保整個插入物之轉化。外源轉化控制信號及起始密碼子可為天然或合成的。可藉由納入適宜轉錄增強子元件增強表現之效率。 在某些實施例中，使用內部核糖體進入位點(IRES)元件用於產生多基因或多順反子信使。IRES元件能夠繞開5'甲基化帽依賴性轉化之核糖體掃描模型且開始在內部位點轉化(Pelletier及Sonenberg, 1988)。業內已闡述來自小核糖核酸病毒家族之兩個成員(脊髓灰質炎及腦心肌炎)之IRES元件(Pelletier及Sonenberg, 1988)以及來自哺乳動物信使之IRES (Macejak及Sarnow, 1991)。IRES元件可連接至異源開放閱讀框。多個開放閱讀框可一起轉錄，其各自藉由IRES分開，以產生多順反子信使。藉助IRES元件，每一開放閱讀框為核糖體可及用於有效轉化。可使用單一啟動子/增強子有效地表現多個基因以轉錄單一信使(參見美國專利第5,925,565號及第5,935,819號，其各自以引用方式併入本文中)。 iii. 多選殖位點載體可包括多選殖位點(MCS)，其為含有多個限制酶位點之核酸區域，該等位點中之任一者可與標準重組技術結合使用來消化載體(例如，參見Carbonelli等人，1999；Levenson等人，1998；及Cocea, 1997，其以引用方式併入本文中。)  「限制酶消化」係指用僅在核酸分子中之特定位置發揮功能之酶催化裂解核酸分子。該等限制酶中之許多在市面上有售。熟習此項技術者廣泛地理解該等酶之使用。通常，使用在MCS內切割之限制酶將載體線性化或片段化以使得外源序列能夠接合至載體。「接合」係指在兩個核酸片段之間形成磷酸二酯鍵之過程，該兩個核酸片段可或可不彼此鄰接。涉及限制酶及接合反應之技術為熟習重組技術者所熟知。 iv. 剪接位點大多數經轉錄之真核RNA分子將經歷RNA剪接以自初級轉錄本移除內含子。含有基因體真核序列之載體可能需要供體及/或受體剪接位點以確保適當處理用於蛋白質表現之轉錄本(例如，參見Chandler等人，1997，其以引用方式併入本文中。) v. 終止信號載體或構築體可包含至少一個終止信號。「終止信號」或「終止子」包含參與RNA聚合酶對RNA轉錄本之特異性終止之DNA序列。因此，在某些實施例中，涵蓋結束產生RNA轉錄本之終止信號。終止子可為在活體內達成期望信使含量所必需。 在真核系統中，終止子區域亦可包含容許新轉錄本之位點特異性裂解以暴露多聚腺苷酸化位點之特定DNA序列。此發送專門內源聚合酶信號以將一段約200 A殘基(聚A)添加至轉錄本之3’末端。經此聚A尾修飾之RNA分子似乎更穩定且更有效地轉化。因此，在涉及真核生物之其他實施例中，終止子包含裂解RNA之信號，且終止子信號促進信使之多聚腺苷酸化。終止子及/或多聚腺苷酸化位點元件可用於增強信使含量且最小化自盒至其他序列中之連讀(read through)。 所涵蓋之終止子包括本文所述或熟習此項技術者已知之任何已知轉錄終止子，包括(但不限於)例如基因之終止序列，例如牛生長激素終止子或病毒終止序列，例如SV40終止子。在某些實施例中，終止信號可缺少可轉錄或可轉化之序列，例如此歸因於序列截短。 vi. 多聚腺苷酸化信號在表現、具體而言真核表現中，通常將包括多聚腺苷酸化信號以實現轉錄本之適當多聚腺苷酸化。人們認為多聚腺苷酸化信號之性質對於成功實踐並不關鍵，且可採用任一該序列。實例性實施例包括SV40多聚腺苷酸化信號或牛生長激素多聚腺苷酸化信號，其係便利的且已知在多個靶細胞中良好地發揮功能。多聚腺苷酸化可增加轉錄本之穩定性或可有助於細胞質運輸。 vii. 複製起點為使載體在宿主細胞中繁殖，其可含有一或多個複製起始位點(通常稱為「ori」)，例如對應於如上文所述EBV之oriP或經遺傳改造在分化程式化中具有類似或增加的功能之oriP的核酸序列，其係複製起始時之特定核酸序列。或者，可採用如上文所述其他染色體外複製病毒之複製起點或自主複製序列(ARS)。 C. 載體遞送外源核酸之基因修飾或將其引入培養組合物或方法之起始細胞中可使用任何適宜方法進行核酸遞送以轉變細胞，如本文所述或如熟習此項技術者已知。該等方法包括(但不限於)例如藉由以下方法直接遞送DNA：藉由離體轉染(Wilson等人，1989, Nabel等人，1989)、藉由注射(美國專利第5,994,624號、第5,981,274號、第5,945,100號、第5,780,448號、第5,736,524號、第5,702,932號、第5,656,610號、第5,589,466號及第5,580,859號，其各自以引用方式併入本文中)，包括顯微注射(Harland及Weintraub, 1985；美國專利第5,789,215號，其以引用方式併入本文中)；藉由電穿孔(美國專利第5,384,253號，其以引用方式併入本文中；Tur-Kaspa等人，1986；Potter等人，1984)；藉由磷酸鈣沈澱(Graham及Van Der Eb, 1973；Chen及Okayama, 1987；Rippe等人 ，1990)；藉由使用DEAE-聚葡萄糖、然後使用聚乙二醇(Gopal, 1985)；藉由直接音波負載(Fechheimer等人 ，1987)；藉由脂質體介導之轉染(Nicolau及Sene, 1982；Fraley等人，1979；Nicolau等人，1987；Wong等人，1980；Kaneda等人，1989；Kato等人，1991)及受體介導之轉染(Wu及Wu, 1987；Wu及Wu, 1988)；藉由微彈轟擊(PCT申請案第WO 94/09699號及第95/06128號；美國專利第5,610,042號；第5,322,783號、第5,563,055號、第5,550,318號、第5,538,877號及第5,538,880號，且各自以引用方式併入本文中)；藉由用碳化矽纖維抽吸(Kaeppler等人，1990；美國專利第5,302,523號及第5,464,765號，其各自以引用方式併入本文中)；藉由農桿菌屬( Agrobacterium)介導之轉變(美國專利第5,591,616號及第5,563,055號，其各自以引用方式併入本文中)；藉由PEG介導之原生質體轉變(Omirulleh等人，1993；美國專利第4,684,611號及第4,952,500號，其各自以引用方式併入本文中)；藉由乾化/抑制介導之DNA攝取(Potrykus等人，1985)及該等方法之任何組合。經由應用諸如該等技術，可穩定或瞬時轉變細胞器、細胞、組織或生物體。 i. 脂質體介導之轉染在某一實施例中，核酸可包埋在脂質複合物(例如脂質體)中。脂質體係特徵在於磷脂雙層膜及內部水性培養基之囊泡狀結構。多層脂質體具有多個由水性介質分開之脂質層。其係在磷脂懸浮於過量水溶液中時自發形成。脂質組份在閉合結構形成之前經受自我重排且將水及所溶解溶質包埋在脂質雙層之間(Ghosh及Bachhawat, 1991)。亦涵蓋核酸與Lipofectamine (Gibco BRL)或Superfect (Qiagen)之複合物。所用脂質體之量可根據脂質體以及所用細胞之性質而變化，例如可涵蓋約5 μg至約20 μg載體DNA/100萬至1000萬個細胞。 外源DNA之脂質體介導之核酸遞送及表現在活體外已極其成功(Nicolau及Sene, 1982；Fraley等人，1979；Nicolau等人，1987)。亦展示在所培養雞胚、HeLa及肝細胞瘤細胞中外源DNA之脂質體介導之遞送及表現之可行性(Wong等人，1980)。 在某些實施例中，脂質體可為含有血球凝集病毒(HVJ)之複合物。已顯示此有助於與細胞膜融合且促進細胞進入脂質體囊封之DNA (Kaneda等人，1989)。在其他實施例中，脂質體可與核非組織蛋白染色體蛋白(HMG-1)複合或與其結合使用(Kato等人，1991)。在其他實施例中，脂質體可與HVJ及HMG-1二者複合或與該二者結合使用。在其他實施例中，遞送媒劑可包含配體及脂質體。 ii. 電穿孔在某些實施例中，核酸係經由電穿孔引入細胞中。電穿孔涉及使細胞及DNA之懸浮液暴露於高電壓放電下。可藉由機械損傷使接受細胞更易於轉變。所用載體之量亦可根據所用細胞之性質而變化，例如可涵蓋約5 μg至約20 μg載體DNA/100萬至1000萬個細胞。 使用電穿孔轉染真核細胞已極其成功。以此方式，已用人類κ-免疫球蛋白基因轉染小鼠前B淋巴球(Potter等人，1984)，且已用氯黴素乙醯基轉移酶基因轉染大鼠肝細胞(Tur-Kaspa等人，1986)。 iii. 磷酸鈣在其他實施例中，核酸係使用磷酸鈣沈澱引入細胞中。已使用此技術用腺病毒5 DNA轉染人類KB細胞(Graham及Van Der Eb, 1973)。亦以此方式，用新黴素標記物基因轉染小鼠L(A9)、小鼠C127、CHO、CV-1、BHK、NIH3T3及HeLa細胞(Chen及Okayama, 1987)，且用多種標記物基因轉染大鼠肝細胞(Rippe等人，1990)。 iv.  DEAE- 聚葡萄糖在另一實施例中，核酸係使用DEAE-聚葡萄糖、然後使用聚乙二醇遞送至細胞中。以此方式，將報導基因質體引入小鼠骨髓瘤及紅血球性白血病細胞中(Gopal, 1985)。 IX. 細胞培養物應用本文所述之培養組合物可用於產生具有如下文所例示之商業或臨床應用之T細胞。 可提供在活體外自幹細胞產生抗原特異性T細胞之方法用於免疫療法。使用經遺傳改造以因應特異性抗原之T細胞係用於癌症及傳染病之授受性細胞療法之有前途的研究方法。經改造T細胞策略包括用T細胞受體(TCR)及嵌合抗原受體(CAR)轉導以傳遞抗原特異性；及基因修飾以改良轉移T細胞之效能或安全性(例如藉由下調抑制性信號傳導、缺失病毒共受體或引入所謂的自殺基因)。 迄今為止，經改造T細胞之研究療法已使用末梢血T細胞。此方法已展示在若干惡性病及傳染病之臨床試驗中之效能，然而出於以下原因仍有問題。第一，活體內授受性轉移之T細胞數隨時間減少，此使得最終損失腫瘤或病毒特異性免疫性。第二，T細胞之離體活化及擴增通常為促進有效基因轉導所必需，且可引起T細胞耗竭及免疫潛能降低。第三，在經TCR改造T細胞之情形下，轉基因及內源TCR鏈之錯配可產生具有降低的抗原識別或脫靶毒性/自體免疫性之雜合受體(或在CART細胞之情形下，高度活化T細胞上之殘餘內源TCR表現亦可引起脫靶毒性)。 使用ATO自幹細胞重新產生經改造T細胞可以下列方式克服經改造T細胞療法之該等限制：1) 將TCR或CAR基因引入HSPC (其為胸腺前細胞)中抑制內源TCR基因座在正發育T細胞中之重排(等位基因排除)，從而產生僅表現轉基因抗原受體之T細胞，由此降低來自TCR鏈錯配或過客TCR表現之脫靶毒性之風險；及2) HSPC可產生具有初始非耗竭表型之抗原特異性T細胞，由此增強可用於授受性療法之T細胞之品質及壽命。此外，產生經等位基因排除之抗原特異性T細胞創造研發現成抗原特異性T細胞文庫之機會，該等文庫可用於同種異體供體中且無來自內源供體TCR表現之移植物抗宿主病(GVHD)風險。儘管具有該等優點，但當前尚無自幹細胞或祖細胞發育出抗原特異性T細胞之商業方法。 可似真地使用ATO系統之臨床應用之特定實例包括： 在活體外自HSPC產生自體經TCR及/或CAR改造之T細胞用於授受性細胞抗腫瘤或抗病毒免疫療法。自體HSPC來源包括臍帶血、骨髓及經動員末梢血。 在活體外自人類多潛能幹細胞(包括iPSC)產生自體經TCR及/或CAR改造之T細胞。 在活體外自HSPC或多潛能幹細胞產生同種異體(HLA匹配或HLA修飾)經TCR或CAR改造之T細胞作為商業上可擴縮之現成產品用於授受性細胞療法。如上文所論述，經由等位基因排除自TCR及/或CAR轉導之胸腺前HSPC產生之T細胞並不表現內源TCR，且在移植至同種異體接受者中時不應具有脫靶GVHD之風險。用於此目的之幹細胞可進一步經選擇或基因修飾以增強同種異體宿主中之子代T細胞植入(例如藉由使用HLA匹配之HSPC或藉由HLA基因座或NK細胞配體之基因修飾以減少同種免疫識別)。 在引入或不引入TCR及/或CAR之情況下修飾幹細胞中之非抗原受體基因以增強ATO源T細胞之活體內功能。實例包括共抑制受體(例如PD-1、TIM-3或LAG-3)之遺傳不活化或敲低；抑制性信號傳導路徑，例如TGFβ；或病毒進入共受體，例如CCR5。 例如在藥物毒性分析中使用3D培養物聚集體作為胸腺類器官以對醫藥或生物化合物對T細胞發育及功能之效應建模。此可擴展至使用具有自體患者細胞之ATO對患者特異性藥物基因體或疾病特異性相互作用建模。 可提供使用研究工具來研究T細胞發育之方法及組合物。如上文所述，3D細胞聚集體(例如ATO)係用於研究來自多個幹細胞來源之人類T細胞發育之有力工具，該等幹細胞來源包括幹細胞及祖細胞及造血幹細胞及祖細胞(HSPC)及人類多潛能幹細胞，包括胚胎幹細胞(ESC)及誘導性多潛能幹細胞(iPSC))。 當前在實驗室中實踐之對T細胞發育建模之實驗方法具有若干重要限制： 基於OP9-DL1及類似基質細胞之 單層系統使用經Notch配體(通常鼠類 Dll1或 Dll4)轉導之無限增殖之鼠類骨髓細胞系作為HSPC之「飼養層」。OP9-DL1上人類HSPC之活體外共培養物可定型至T細胞譜系，然而，T細胞之正向選擇顯著受損，此導致該等系統中之成熟功能性T細胞顯著缺失。基質細胞共培養系統亦係高度勞動密集的，且效率及再現性取決於多個變量，包括胎牛血清批次。 胎兒胸腺器官培養(FTOC)方法使用清除造血細胞之完整或再聚集之鼠類或人類胎兒胸腺組織作為研究來自HSPC之活體外T細胞發育之微環境。該等方法係高度勞動密集的，引起低效率T細胞產生，提供有限的定量分析能力，因組織年齡及品質而展現高實驗變異性，且受限於對原代胸腺組織之可及性。 基於支架之類器官通常使用接種至生物材料基質上之原代胸腺基質細胞或類似細胞類型(例如真皮纖維母細胞)。該等系統受限於較低效率及可擴縮性、較差再現性及有限的專有支架材料可用性。 活體內人類T細胞發育之異源基因(xenogeneic)(鼠類)模型之T細胞分化效率高度可變且定量較差，且許多方法亦需要將人類胎兒胸腺、肝及骨髓細胞或片段植入免疫缺失小鼠中。 與該等方法不同，ATO使用「現成」組份及無血清條件以降低源自使用原代組織或胎牛血清之生物變異性；且避免使用專有支架材料。重要的是，ATO支持經顯著改良之正向選擇，此允許研究活體外成熟T細胞及T細胞正向/負向選擇。因此，ATO可商業化為研究活體外T細胞發育之工具。 本文所述之方法及組合物亦可用作研發針對癌症或其他治療相關抗原之新抗原特異性TCR之工具。舉例而言，ATO源T細胞可基於對腫瘤相關抗原或新抗原之反應性使用所公開方法及使用所公開方法自該等反應T細胞鑑別出之抗原特異性TCR序列來選擇。由於假設ATO可提供具有最小或無負向選擇之T細胞之產生，故可產生對自身抗原具有較高親合力之TCR，從而提供不同於內源「胸腺教化」之T細胞池的新穎TCR譜。第二種方法係在T細胞發育期間在ATO中引入腫瘤相關抗原，該抗原在其在ATO中發育時應誘導反應性T細胞純系之激動劑選擇(及IEL樣分化)；然後可藉由標準方法來鑑別該等細胞及其TCR序列。所分離之TCR序列亦可用於本文所述用於授受性免疫療法之下游應用及方法中。 本文所述之方法及組合物亦可包括用於擴增胚胎幹細胞及/或祖細胞之方法及組合物。業內已知之方法(例如US 20060205072、US 7344881、US 20060205071、US 20020076747及US 20030044978 (其以引用方式併入本文中)中所述之彼等)可包括在本發明之組合物及方法中。 本文所述之方法及組合物亦可包括用於增加細胞(例如ES細胞、HSPC/PSC及/或CD34+細胞)之增殖能力之方法及組合物。實例性化合物包括HSC835 (由Novartis出售)，其達成CD34+細胞之離體擴增 。其他化合物闡述於US 8,927,281中，該專利以引用方式併入本文中。 X. 起始細胞之來源起始細胞(例如多潛能幹細胞或造血幹細胞或祖細胞)可於某些組合物或方法中用於沿所選T細胞譜系進行分化。可使用基質細胞與幹細胞或祖細胞共培養。 A. 基質細胞基質細胞係任何器官(例如骨髓、胸腺、子宮黏膜(子宮內膜)、前列腺及卵巢中)之結締組織細胞。其係支持該器官之實質細胞之功能之細胞。纖維母細胞(亦稱為間葉基質細胞/MSC)及周細胞係基質細胞之最常見類型。 已知基質細胞與腫瘤細胞之間之相互作用在癌症生長及進展方面起主要作用。另外，藉由局部調節細胞介素網絡(例如M-CSF、LIF)，已闡述骨髓基質細胞參與人類造血及發炎過程。 骨髓、胸腺及其他造血器官中之基質細胞經由細胞-細胞配體-受體相互作用及經由釋放可溶性因子(包括細胞介素及趨化介素)來調節造血及免疫細胞發育。該等組織中之基質細胞形成調節幹細胞維持、譜系特異性及定型以及分化至效應細胞類型之生態位。 基質係由非惡性宿主細胞構成。基質細胞亦提供其上可生長組織特異性細胞類型及(在一些情形下)腫瘤之細胞外基質。 B. 造血幹細胞及祖細胞由於造血幹細胞及祖細胞之顯著醫學潛能，已進行大量工作來嘗試改良自胚胎幹細胞分化造血祖細胞之方法。在人類成人中，主要存在於骨髓中之造血幹細胞產生分化成血液系統之所有細胞之異質造血(CD34+)祖細胞群。在成人人類中，造血祖細胞增殖及分化，此使得每天產生數千億成熟血球。造血祖細胞亦存在於臍帶血中。在活體外，人類胚胎幹細胞可分化成造血祖細胞。造血祖細胞亦可自末梢血樣品擴增或富集，如下文所述。造血細胞可具有人類來源、鼠類來源或任何其他哺乳動物物種。 造血祖細胞之分離包括任何選擇方法，包括細胞分選儀、使用抗體包覆之磁珠磁分離、封裝管柱；親和層析；連結至單株抗體或與單株抗體結合使用之細胞毒性劑，包括(但不限於)補體及細胞毒素；及用附接至固體基質(例如板)之抗體「淘選」或任何其他便利技術。 使用分離(separation)或分離(isolation)技術包括(但不限於)基於物理性質差異(密度梯度離心及反流動離心淘析)、細胞表面性質差異(凝集素及抗體親和力)及活體染色性質差異(粒線體結合染料rho123及DNA結合染料Hoechst 33342)之彼等。提供精確分離之技術包括(但不限於) FACS (螢光活化細胞分選)或MACS (磁活化細胞分選)，其可具有不同的精密度，例如複數個色彩通道、低角度及鈍光散射檢測通道、阻抗通道等。 先前技術或用於評價細胞類型純度之技術(例如流式細胞測量術)中所使用之抗體可偶聯至可鑑別藥劑，包括(但不限於)酶、磁珠、膠體磁珠、半抗原、螢光染料、金屬化合物、放射性化合物、藥物或半抗原。可偶聯至抗體之酶包括(但不限於)鹼性磷酸酶、過氧化酶、尿素酶及β-半乳糖苷酶。可偶聯至抗體之螢光染料包括(但不限於)異硫氰酸螢光黃、異硫氰酸四甲基羅丹明(tetramethylrhodamine isothiocyanate)、藻紅素、別藻藍蛋白及德克薩斯紅(Texas Red)。關於可偶聯至抗體之其他螢光染料參見Haugland, Molecular Probes: Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1992-1994)。可偶聯至抗體之金屬化合物包括(但不限於)鐵蛋白、膠體金，且具體而言膠體超順磁珠。可偶聯至抗體之半抗原包括(但不限於)生物素、地高辛(digoxygenin)、噁唑酮及硝基苯酚。可偶聯或納入抗體中之放射性化合物為業內已知，且包括(但不限於)鍀99m (99TC)、125I及包含任何放射性核種(包括(但不限於) 14C、3H及35S)之胺基酸。 可採用容許精確分離之其他正向選擇技術，例如親和管柱及諸如此類。該方法應容許移除至殘餘量小於約20%、較佳小於約5%之非靶細胞群。 細胞可基於光散射性質以及其多種細胞表面抗原之表現來選擇。藉由FACS分析，經純化幹細胞具有低側向散射及低至中等的前向散射特徵。細胞離心塗片(cytospin preparation)顯示經富集幹細胞具有介於成熟淋巴樣細胞與成熟顆粒球之間之大小。 亦可在培養之前使用例如Sutherland等人(1992)及美國專利第4,714,680號中所述之方法富集CD34+細胞之接種群。舉例而言，使細胞經受負向選擇以移除表現譜系特異性標記物之彼等細胞。在說明性實施例中，可使細胞群經受負向選擇以清除非CD34+造血細胞及/或具體造血細胞子集。負向選擇可基於多個分子之細胞表面表現來實施，該等分子包括T細胞標記物，例如CD2、CD4及CD8；B細胞標記物，例如CD10、CD19及CD20；單核球標記物CD14；NK細胞標記物CD2、CD16、及CD56或任何譜系特異性標記物。負向選擇可基於多個分子之細胞表面表現來實施，例如抗體混合劑(例如，CD2、CD3、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD56、CD123及CD235a)，其可例如經由MACS或管柱分離用於分離其他細胞類型。 如本文所用譜系陰性(LIN-)係指缺少至少一種與譜系定型之細胞相關之標記物的細胞，該標記物係例如與T細胞相關之標記物(例如CD2、3、4及8)、與B細胞相關之標記物(例如CD10、19及20)、與骨髓細胞相關之標記物(例如CD14、15、16及33)、與天然殺手(「NK」)細胞相關之標記物(例如CD2、16及56)、與RBC相關之標記物(例如血型糖蛋白A)、與巨核細胞相關之標記物(CD41)、與肥胖細胞相關之標記物、與嗜酸性球或嗜鹼性球相關之標記物或諸如CD38、CD71及HLA-DR等其他標記物。較佳地，譜系特異性標記物包括(但不限於) CD2、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD33、CD38、HLA-DR及CD71中之至少一者。更佳地，LIN-將包括至少CD14及CD15。可藉由針對例如c-kit+或Thy-1+正向選擇來達成進一步純化。可藉由使用粒線體結合染料玫瑰紅123且藉由業內已知之方法針對玫瑰紅+細胞進行選擇來獲得進一步富集。可藉由選擇性分離為CD34+、較佳CD34+LIN-、且最佳CD34+ Thy-1+ LIN-之細胞來獲得高度富集之組合物。幹細胞高度富集之群及獲得其之方法為熟習此項技術者所熟知，參見例如PCT/US94/09760；PCT/US94/08574及PCT/US94/10501中所述之方法。 可採用多種技術來藉由首先移除專用譜系之細胞來分離細胞。單株抗體尤其可用於鑑別與具體細胞譜系及/或分化階段相關之標記物。可將抗體附接至固體支撐物以允許粗分離。所用分離技術應最大化地保留欲收集部分之活力。可採用多種具有不同效能之技術來獲得「相對較粗」之分離物。該等分離物係其中所存在總細胞之至多10%、通常不大於約5%、較佳不大於約1%為與欲保留之細胞群一起留下之不期望細胞。所用具體技術將端視分離效率、相關細胞毒性、實施之容易性及速度以及精密設備及/或專門技術之必需性而定。 僅使用特異性針對細胞之標記物無需達成祖細胞之選擇。藉由使用負向選擇及正向選擇之組合可獲得經富集之細胞群。 C. 血球之來源造血幹細胞(HSC)通常駐留於骨髓中但可被迫進入血液中，此過程稱為動員在臨床上用於收穫末梢血中之大量HSC。所選一種動員劑係顆粒球群落刺激因子(G-CSF)。 可在未受擾動狀態下或在外部投與造血生長因子(如G-CSF)後動員後藉由血球分離技術收集在末梢血中循環之CD34+造血幹細胞或祖細胞。在動員後收集之幹細胞或祖細胞之數量大於在未受擾動狀態下在血球分離後獲得之數量。在本發明之具體態樣中，細胞群之來源係細胞尚未經外部施加之因子動員之個體，此乃因無需在活體內富集造血幹細胞或祖細胞。 用於本文所述方法中之細胞群可為哺乳動物細胞，例如人類細胞、非人類靈長類動物細胞、齧齒類動物細胞(例如，小鼠或大鼠)、牛細胞、綿羊(ovine)細胞、豬細胞、馬細胞、綿羊(sheep)細胞、犬細胞及貓細胞或其混合物。非人類靈長類動物細胞包括恒河獼猴細胞。細胞可自動物(例如人類患者)獲得，或其可來自細胞系。若細胞係自動物獲得，則其可用作例如未分離細胞(即，混合群)；其可例如藉由轉變首先確立於培養物中；或其可已經受初步純化方法。舉例而言，細胞群可藉由正向或負向選擇基於細胞表面標記物之表現來操縱；在活體外或活體內用一或多種抗原刺激；在活體外或活體內用一或多種生物改質劑處理；或該等中任一者或全部之組合。 細胞群包括末梢血單核細胞(PBMC)、全血或其含有混合群之部分、脾細胞、骨髓細胞、腫瘤浸潤淋巴球、藉由白血球分離獲得之細胞、生檢組織、淋巴結(例如源自腫瘤之淋巴結)。適宜供體包括經免疫供體、未經免疫之(初始)供體、經處理或未經處理之供體。「經處理」供體係已暴露於一或多種生物改質劑下者。「未經處理」之供體尚未暴露於一或多種生物改質劑下。 舉例而言，末梢血單核細胞(PBMC)可如根據業內已知之方法所述來獲得。該等方法之實例論述於Kim等人(1992)；Biswas等人(1990)；Biswas等人(1991)。 自細胞群獲得前體細胞之方法亦為業內所熟知。可使用多種細胞介素(例如hSCF、hFLT3及/或IL-3)來擴增前體細胞(Akkina等人，1996)，或可使用MACS或FACS來富集CD34+細胞。如上文所提及，亦可使用負向選擇技術來富集CD34+細胞。 亦可自個體獲得細胞樣品，且然後針對期望細胞類型對其進行富集。舉例而言，可自血液分離PBMC及/或CD34+造血細胞，如本文所述。細胞亦可使用多種技術(例如分離及/或用結合至期望細胞類型之細胞表面上之表位之抗體活化)自其他細胞分離。可使用之另一方法包括使用針對細胞表面標記物之抗體進行負向選擇以選擇性富集特定細胞類型而不因受體接合而使細胞活化。 可自髂崤、股骨、脛骨、脊柱、肋或其他骨髓腔獲得骨髓細胞。骨髓可自患者取出且經由多個分離及洗滌程序來分離。用於分離骨髓細胞之實例性程序包含以下步驟：a) 離心分離三個部分中之骨髓懸浮液且收集中間部分或棕黃層；b) 於分離流體(通常為Ficoll，Pharmacia Fine Chemicals AB之商標)中將來自步驟(a)之棕黃層部分再離心一次，且收集含有骨髓細胞之中間部分；及c) 洗滌來自步驟(b)之所收集部分以回收可再輸血骨髓細胞。 D. 多潛能幹細胞適於本文所述之組合物及方法之細胞可為造血幹細胞，且祖細胞亦可自活體外分化多潛能幹細胞來製備。在一些實施例中，用於本文所述方法中之細胞係直接接種至ATO中之多潛能幹細胞(胚胎幹細胞或誘導性多潛能幹細胞)。在其他實施例中，用於本文所述方法及組合物中之細胞係PSC之衍生物或子代，例如(但不限於)中胚層祖細胞、血管內皮祖細胞或造血祖細胞。 術語「多潛能幹細胞」係指能夠產生所有三個胚層(亦即內胚層、中胚層及外胚層)之細胞之細胞。儘管在理論上多潛能幹細胞可分化成身體之任何細胞，但多潛能性之實驗測定通常係基於多潛能細胞分化成每一胚層之若干細胞類型。在一些實施例中，多潛能幹細胞係源自胚囊之內部細胞團之胚胎幹(ES)細胞。在其他實施例中，多潛能幹細胞係由再程式化體細胞衍生出之誘導性多潛能幹細胞。在某些實施例中，多潛能幹細胞係由體細胞核轉移衍生出之胚胎幹細胞。 胚胎幹(ES)細胞係源自胚囊之內部細胞團之多潛能細胞。ES細胞可藉由移除正發育胚胎之外部滋養外胚層、然後在非生長細胞之飼養層上培養內部細胞團來分離。在適宜條件下，產生增殖性未分化ES細胞之群落。群落可移除，解離成個別細胞，然後再平鋪於新鮮飼養層上。再平鋪細胞可繼續增殖，產生新的未分化ES細胞群落。然後可移除新群落，使其解離，亦再平鋪且允許生長。可將此「繼代培養」未分化ES細胞或使其「傳代」之過程重複多次以產生含有未分化ES細胞之細胞系(美國專利第5,843,780號；第6,200,806號；第7,029,913號)。「原代細胞培養物」係直接自組織(例如胚囊之內部細胞團)獲得之細胞之培養物。「繼代培養物」係源自原代細胞培養物之任何培養物。 用於獲得小鼠ES細胞之方法為業內所熟知。在一種方法中，用小鼠抗血清處理來自小鼠129品系之植入前胚囊以移除滋養外胚層，且將內部細胞團培養於含有胎牛血清之培養基中之化學不活化小鼠胚胎纖維母細胞之飼養細胞層上。在胎牛血清存在下將發育之未分化ES細胞群落繼代培養於小鼠胚胎纖維母細胞飼養層上以產生ES細胞群。在一些方法中，可在飼養層不存在下藉由將細胞介素白血病抑制因子(LIF)添加至含血清培養基中使小鼠ES細胞生長(Smith, 2000)。在其他方法中，可在骨形態演發蛋白及LIF存在下使小鼠ES細胞生長於無血清培養基中(Ying等人，2003)。 人類ES細胞可使用先前所述之方法自胚囊獲得(Thomson等人，1995；Thomson等人，1998；Thomson及Marshall, 1998；Reubinoff等人，2000。)在一種方法中，將第5天人類胚囊暴露於兔抗人類脾細胞抗血清下，然後暴露於1:5稀釋之天竺鼠補體對溶解滋養外胚層細胞下。自完整內部細胞團移除溶解滋養外胚層細胞後，在胎牛血清存在下將內部細胞團培養於γ-不活化小鼠胚胎纖維母細胞之飼養層上。9至15天後，可將源自內部細胞團之細胞簇以化學(即暴露於胰蛋白酶下)或機械方式解離且再平鋪於含有胎牛血清及小鼠胚胎纖維母細胞飼養層之新鮮培養基中。進一步增殖後，藉由微量吸量管選擇具有未分化形態之群落，以機械方式解離成簇，且再平鋪(參見美國專利第6,833,269號)。ES樣形態表徵為具有表觀上較高之核對細胞質比率及明顯核仁之緊密群落。所得ES細胞通常可藉由短暫胰蛋白酶化或藉由微量吸量管選擇個別群落來傳代。在一些方法中，可藉由在鹼性纖維母細胞生長因子存在下將人類ES細胞培養於纖維母細胞飼養層上使該等ES細胞在無血清下生長(Amit等人，2000)。在其他方法中，可藉由在含有鹼性纖維母細胞生長因子之「條件化」培養基存在下將人類ES細胞培養於蛋白質基質(例如Matrigel TM或層黏蛋白)上使該等細胞在無飼養細胞層下生長(Xu等人，2001)。培養基先前藉由與纖維母細胞共培養來條件化。 業內亦已知用於分離恒河猴與普通狨猿ES細胞之方法(Thomson及Marshall, 1998；Thomson等人，1995；Thomson及Odorico, 2000)。 ES細胞之另一來源係所確立之ES細胞系。業內已知多種小鼠細胞系及人類ES細胞系且已定義用於其生長及繁殖之條件。舉例而言，自小鼠品系129胚胎之內部細胞團確立小鼠CGR8細胞系，且可使CGR8細胞之培養物在LIF存在下在無飼養層下生長。作為另一實例，人類ES細胞系H1、H7、H9、H13及H14由Thompson等人確立。另外，業內已研發出H9系之亞純系H9.1及H9.2。 ES細胞之來源可為胚囊、源自培養胚囊之內部細胞團之細胞或自所確立細胞系之培養物獲得之細胞。因此，如本文所用術語「ES細胞」可指胚囊之內部細胞團細胞、自內部細胞團之培養物獲得之ES細胞及自ES細胞系之培養物獲得之ES細胞。 誘導性多潛能幹(iPS)細胞係具有ES細胞之特徵但藉由再程式化分化體細胞獲得之細胞。誘導性多潛能幹細胞係藉由多種方法來獲得。在一種方法中，使用反轉錄病毒轉導用轉錄因子Oct4、Sox2、c-Myc及Klf4轉染成人人類真皮纖維母細胞(Takahashi等人，2007)。將經轉染細胞平鋪於補充有鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)之培養基中之SNL飼養細胞(產生LIF之小鼠細胞纖維母細胞細胞系)上。在約25天後，在培養物中出現類似於人類ES細胞群落之群落。挑選出ES細胞樣群落且使其在bFGF存在下在飼養細胞上擴增。 基於細胞特徵，ES細胞樣群落之細胞係誘導性多潛能幹細胞。誘導性多潛能幹細胞之形態類似於人類ES細胞，且表現多種人類ES細胞標記物。而且，當在已知可使人類ES細胞分化之條件下生長時，誘導性多潛能幹細胞相應地分化。舉例而言，誘導性多潛能幹細胞可分化成具有神經元結構及神經元標記物之細胞。 在另一方法中，使用慢病毒屬轉導用四個基因Oct4、Sox2、Nanog及Lin28轉染人類胎兒或新生纖維母細胞(Yu等人，2007)。在感染後12-20天時，具有人類ES細胞形態之群落變得可見。挑選出群落且使其擴增。構成群落之誘導性多潛能幹細胞之形態類似於人類ES細胞，表現多種人類ES細胞標記物，且在注射至小鼠中後形成具有神經組織、軟骨及腸上皮之畸胎瘤。 自小鼠製備誘導性多潛能幹細胞之方法亦為業內已知(Takahashi及Yamanaka, 2006)。引入iPS細胞通常需要表現或暴露於Sox家族之至少一個成員及Oct家族之至少一個成員。人們認為Sox及Oct係指定ES細胞身份之轉錄調節體系之關鍵。舉例而言，Sox可為Sox-1、Sox-2、Sox-3、Sox-15或Sox-18；Oct可為Oct-4。其他因子可增加再程式化效率，如Nanog、Lin28、Klf4或c-Myc；再程式化因子之特定集合可為包含Sox-2、Oct-4、Nanog及視情況Lin-28之集合；或包含Sox-2、Oct4、Klf及視情況c-Myc之集合。 IPS細胞(如ES細胞)具有可藉由免疫組織化學或流式細胞測量術、使用針對SSEA-1、SSEA-3及SSEA-4 (Developmental Studies Hybridoma Bank, National Institute of Child Health and Human Development, Bethesda Md.)及TRA-1-60及TRA-1-81 (Andrews等人，1987)之抗體鑑別或確認之特徵性抗原。胚胎幹細胞之多潛能性可藉由將約0.5-10 × 10 6個細胞注射至8-12週齡雄性SCID小鼠之後腿肌肉中來確認。發育成展示三個胚層中每一者之至少一種細胞類型之畸胎瘤。 XI. 分化細胞之遺傳變異在某些實施例中，細胞可藉由在分化之前或之後對細胞進行遺傳改造來製備以含有一或多種遺傳變異(US 2002/0168766)。當外源核酸或多核苷酸已藉由任何適宜人工操縱方式轉移至細胞中時或當細胞係已繼承多核苷酸之原始改變細胞之子代時，認為細胞「經遺傳改變」、「經基因修飾」或「轉基因」。舉例而言，可藉由在細胞進展至限制性發育譜系細胞或末端分化細胞之前或之後對其進行遺傳改變以表現端粒酶反轉錄酶來處理細胞以增加其複製潛能(US 2003/0022367)。 在某些實施例中，可在活體外或活體內藉由將標記物(例如可選擇或可篩選標記物)納入表現載體中來鑑別含有外源核酸構築體之細胞。該等標記物將賦予細胞可鑑別之變化，從而容許容易地鑑別出含有表現載體之細胞，或藉由使用組織特異性啟動子幫助富集或鑑別分化心臟細胞。舉例而言，在心肌細胞分化之態樣中，可使用心臟特異性啟動子，例如以下蛋白質之啟動子：心臟肌鈣蛋白I (cTnI)、心臟肌鈣蛋白T (cTnT)、肌節肌凝蛋白重鏈(MHC)、GATA-4、Nkx2.5、N-鈣黏蛋白、β1-腎上腺素受體、ANF、MEF-2轉錄因子家族、肌酸激酶MB (CK-MB)、肌紅蛋白或心房利鈉因子(ANF)。在神經元分化之態樣中，可使用神經元特異性啟動子，包括(但不限於) TuJ-1、Map-2、Dcx或突觸蛋白。在肝細胞分化之態樣中，可使用確定性內胚層及/或肝細胞特異性啟動子，包括(但不限於) ATT、Cyp3a4、ASGPR、FoxA2、HNF4a或AFP。 通常，可選擇標記物係賦予允許選擇性質者。正向可選擇標記物係標記物之存在允許其選擇者，而負向可選擇標記物係其存在阻止其選擇者。正向可選擇標記物之實例係抗藥性標記物。 通常，納入藥物選擇標記物有助於選殖及鑑別轉變體，例如賦予殺稻瘟菌素、新黴素、嘌呤黴素、潮黴素、DHFR、GPT、吉歐黴素及組胺醇抗性之基因係有用的可選擇標記物。除賦予允許基於條件之實施區別轉變體之表型的標記物外，亦涵蓋基於比色分析之其他類型之標記物，包括可篩選標記物，例如GFP。或者，可使用可篩選酶，例如氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)。熟習此項技術者亦應知曉如何可能地結合FACS分析來使用免疫標記物。人們認為所用標記物並不重要，只要其能夠與編碼基因產物之核酸同時表現即可。可選擇及可篩選標記物之其他實例為熟習此項技術者所熟知。 XII. 疾病及病況之治療方法可用於已測試對該等病症呈陽性、具有病症之一或多個症狀或認為具有罹患該病況或相病況之風險的個體。在一些實施例中，本文所述之組合物及方法用於治療本文所列示及/或業內已知之病症之發炎或自體免疫組份。 本發明之某些態樣係關於癌症之治療及/或癌症抗原之用途。欲治療之癌症或抗原可為與業內已知之任一癌症或例如以下癌症相關之抗原：上皮癌(例如，乳房、胃腸、肺)、前列腺癌、膀胱癌、肺癌(例如，小細胞肺癌)、結腸癌、卵巢癌、腦癌、胃癌、腎細胞癌、胰臟癌、肝癌、食道癌、頭頸癌或結腸直腸癌。在一些實施例中，欲治療之癌症或抗原來自以下癌症中之一者：腎上腺皮質癌、原因不明性骨髓樣化生、AIDS相關之癌症(例如，AIDS相關之淋巴瘤)、肛門癌、闌尾癌、星細胞瘤(例如，小腦及大腦)、基底細胞癌、膽管癌(例如，肝外)、膀胱癌、骨癌(骨肉瘤及惡性纖維性組織細胞瘤)、腦瘤(例如，神經膠質瘤、腦幹膠質瘤、小腦或大腦星細胞瘤(例如，毛狀細胞星細胞瘤、瀰漫性星細胞瘤、退行性(惡性)星細胞瘤)、惡性神經膠質瘤、室管膜瘤、少突神經膠質瘤、腦脊髓膜瘤、腦脊膜肉瘤、顱咽管瘤、成血管細胞瘤、髓母細胞瘤、小腦幕上原始神經外胚層瘤、視覺路徑及下視丘神經膠質瘤及神經膠母細胞瘤)、乳癌、支氣管腺瘤/類癌、類癌腫瘤(例如，胃腸類癌腫瘤)、未知原發性癌、中樞神經系統淋巴瘤、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、慢性骨髓增生性病症、子宮內膜癌(例如，子宮癌)、室管膜瘤、食道癌、尤文氏腫瘤家族(Ewing's family of tumors)、眼癌(例如，眼內黑色素瘤及視網膜母細胞瘤)、膽囊癌、胃(gastric) (胃(stomach))癌、胃腸類癌腫瘤、胃腸基質瘤(GIST)、生殖細胞瘤(例如，顱外、性腺外、卵巢)、妊娠滋養層腫瘤、頭頸癌、肝細胞(肝)癌(例如，肝癌及肝瘤)、下嚥癌、胰島細胞癌(內分泌胰臟)、喉癌、白血病、唇及口腔癌、口腔癌、肝癌、肺癌(例如，小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及肺鱗狀癌)、淋巴樣贅瘤(例如，淋巴瘤)、髓母細胞瘤、卵巢癌、間皮瘤、轉移性鱗狀頸癌、口癌、多發性內分泌贅瘤形成症候群、骨髓發育不良症候群、骨髓發育不良/骨髓增生性疾病、鼻腔及副鼻竇癌、鼻咽癌、神經胚細胞瘤、神經內分泌癌、口咽癌、卵巢癌(例如，卵巢上皮癌、卵巢生殖細胞瘤、卵巢臨界惡性腫瘤)、胰臟癌、副甲狀腺癌、陰莖癌、腹膜癌、咽癌、嗜鉻細胞瘤、松果體母細胞瘤及小腦幕上原始神經外胚層瘤、垂體瘤、胸膜肺母細胞瘤、淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤(小神經膠質細胞瘤)、肺淋巴管肌瘤病、直腸癌、腎癌、腎盂及輸尿管癌(移行細胞癌)、橫紋肌肉瘤、唾液腺癌、皮膚癌(例如，非黑色素瘤(例如，鱗狀細胞癌)、黑色素瘤及默克細胞癌(Merkel cell carcinoma))、小腸癌、鱗狀細胞癌、睪丸癌、喉癌、胸腺瘤及胸腺癌、甲狀腺癌、結節性硬化症、尿道癌、陰道癌、外陰癌、威爾姆氏腫瘤(Wilms' tumor)及移植後淋巴增殖性病症(PTLD)、與斑痣性錯構瘤病相關之異常血管增殖、水腫(例如與腦瘤相關者)或梅格斯症候群(Meigs' syndrome)。 本發明之某些態樣係關於自體免疫病況之治療及/或自體免疫相關抗原之用途。欲治療之自體免疫疾病或抗原可為與業內已知之任何自體免疫病況或例如以下病況相關之抗原：糖尿病、移植物排斥、GVHC、關節炎(類風濕性關節炎，例如急性關節炎、慢性類風濕性關節炎、痛風或痛風性關節炎、急性痛風性關節炎、急性免疫關節炎、慢性發炎關節炎、退化性關節炎、II型膠原誘發之關節炎、感染性關節炎、萊姆關節炎(Lyme arthritis)、增生性關節炎、牛皮癬關節炎、史迪爾氏病(Still's disease)、脊椎關節炎及幼髮型類風濕性關節炎、骨關節炎、慢性進行性關節炎、變形性關節炎、原發性多關節炎、反應性關節炎及關節黏連性脊椎炎)、發炎性過度增生性皮膚病、牛皮癬(例如斑塊狀牛皮癬、點滴狀牛皮癬、膿皰性牛皮癬及指甲之牛皮癬)、特異體質過敏症(包括異位病，例如花粉熱及賈伯斯症候群(Job's syndrome))、皮膚炎(包括接觸性皮膚炎、慢性接觸性皮膚炎、剝落性皮膚炎、過敏性皮膚炎、過敏性接觸性皮膚炎、皰疹性皮膚炎、錢幣狀皮膚炎、脂溢性皮膚炎、非特異性皮膚炎、原發性刺激性接觸性皮膚炎及異位性皮膚炎)、x性聯高IgM症候群、過敏性眼內發炎性疾病、蕁麻疹(例如慢性過敏性蕁麻疹及慢性特發性蕁麻疹，包括慢性自體免疫蕁麻疹)、肌炎、多發性肌炎/皮肌炎、幼年型皮肌炎、中毒性表皮壞死松解症、硬皮症(包括全身性硬皮症)、硬化(例如全身性硬化、多發性硬化(MS)，例如脊髓-眼MS、原發進展型MS (PPMS)及復發緩解型MS (RRMS)、進行性全身性硬化、動脈粥樣硬化、動脈硬化、散播性硬化、共濟失調性硬化)、視神經脊髓炎(NMO)、發炎性腸病(IBD) (例如，克隆氏病(Crohn's disease)、自體免疫介導之胃腸疾病、結腸炎(例如潰瘍性結腸炎、潰瘍結腸炎、顯微鏡下結腸炎、膠原性結腸炎、息肉狀結腸炎、壞死性小腸結腸炎及透壁性結腸炎)及自體免疫發炎性腸病)、腸發炎、壞疽性膿皮病、結節性紅斑、原發性硬化性膽道炎、呼吸窘迫症候群(包括成人或急性呼吸窘迫症候群(ARDS))、腦膜炎、眼色素層之全部或一部分發炎、虹膜炎、脈絡膜炎、自體免疫血液病症、類風濕性脊椎炎、類風濕性滑膜炎、遺傳性血管性水腫、腦膜炎中之腦神經損傷、妊娠期皰疹、妊娠期類天皰瘡、陰囊瘙癬、自體免疫卵巢早衰、因自體免疫病況突發聽力損失、IgE介導之疾病(例如過敏反應及過敏性及異位性鼻炎)、腦炎(例如羅氏腦炎(Rasmussen's encephalitis)及邊緣及/或腦幹腦炎)、眼色素層炎(例如前眼色素層炎、急性前眼色素層炎、肉芽腫性眼色素層炎、非肉芽腫性眼色素層炎、晶狀體抗原性眼色素層炎、後眼色素層炎或自體免疫眼色素層炎)、伴有或不伴有腎病症候群之腎小球性腎炎(GN) (例如慢性或急性腎小球性腎炎，例如原發性GN、免疫介導之GN、膜性GN (膜性腎病變)、特發性膜性GN或特發性膜性腎病變、膜或膜性增生性GN (MPGN)，包括I型及II型，及急速進行性GN)、增生性腎炎、自體免疫多腺體內分泌衰竭、龜頭炎(包括漿細胞限界龜頭炎)、龜頭包皮炎、遠心性環狀紅斑、持續性色素異常性紅斑、多形性紅斑、環形肉芽腫、光澤苔蘚、外陰硬化萎縮苔蘚、慢性單純苔癬、小棘苔癬、扁平苔癬、板層狀魚鱗病、表皮鬆懈性過度角化症、癌前角化症、壞疽性膿皮病、過敏性病況及反應、過敏反應、濕疹(包括過敏性或異位性濕疹、乾裂性濕疹、出汗障礙性濕疹及水泡性掌蹠濕疹)、氣喘(例如支氣管氣喘、支氣管性氣喘及自體免疫氣喘)、涉及浸潤T細胞及慢性發炎反應之病況、針對外來抗原(例如懷孕期間之胎兒A-B-O血型)之免疫反應、慢性肺發炎性疾病、自體免疫心肌炎、白血球黏著缺失、狼瘡(包括狼瘡性腎炎、狼瘡性腦炎、小兒狼瘡、非腎狼瘡、腎外狼瘡、盤狀狼瘡及盤狀紅斑狼瘡、脫髪性狼瘡、全身性紅斑狼瘡(SLE)，例如皮膚SLE或亞急性皮膚SLE、新生狼瘡症候群(NLE)及播散性紅斑狼瘡)、幼年發作型(I型)糖尿病(包括小兒胰島素依賴性糖尿病(IDDM))及成人發作型糖尿病(II型糖尿病)及自體免疫糖尿病。亦涵蓋與由細胞介素及T淋巴球介導之急性及延遲性過敏症相關之免疫反應、類肉瘤病、肉芽腫(包括淋巴瘤樣肉芽腫)、華格納氏肉芽腫(Wegener's granulomatosis)、顆粒球缺乏症、血管炎(包括血管炎、大血管炎(包括風濕性多肌痛及巨細胞(高安氏)動脈炎)、中等血管炎(包括川崎氏病(Kawasaki's disease)及結節性多動脈炎/結節性動脈周圍炎)、顯微鏡下多動脈炎、免疫血管炎、CNS血管炎、皮膚血管炎、過敏性血管炎、壞死性血管炎(例如全身性壞死性血管炎及ANCA相關之血管炎，例如丘-施二氏血管炎(Churg-Strauss vasculitis)或症候群(CSS)及ANCA相關之小血管炎))、顳動脈炎、再生障礙性貧血、自體免疫再生障礙性貧血、庫氏陽性貧血(Coombs positive anemia)、戴布二氏貧血(Diamond Blackfan anemia)、溶血性貧血或免疫溶血性貧血(包括自體免疫溶血性貧血(AIHA))、愛迪生氏病(Addison's disease)、自體免疫嗜中性球減少症、全部血球減少症、白血球減少症、涉及白血球滲出之疾病、CNS發炎性病症、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、多發性器官損傷症候群(例如繼發於敗血症之彼等)、創傷或出血、抗原-抗體複合物介導之疾病、抗腎小球基底膜疾病、抗磷脂抗體症候群、過敏性神經炎、貝切特氏病(Behcet's disease)/症候群、卡斯特爾曼氏症候群(Castleman's syndrome)、古巴士德氏症候群(Goodpasture's syndrome)、雷諾氏症候群(Reynaud's syndrome)、休格倫氏症候群(Sjogren's syndrome)、史蒂芬-強森症候群(Stevens-Johnson syndrome)、類天皰瘡(例如大皰性類天皰瘡及皮膚類天皰瘡)、天皰瘡(包括尋常天皰瘡、落葉型天皰瘡、天皰瘡黏膜類天皰瘡及紅斑型天皰瘡)、自體免疫多內分泌病、萊特爾氏病(Reiter's disease)或症候群、熱損傷、先兆子癇、免疫複合物病症(例如免疫複合物腎炎)、抗體介導之腎炎、多發性神經病、慢性神經病變(例如IgM多發性神經病或IgM介導之神經病變)、自體免疫或免疫介導之血小板減少症(例如特發性血小板減少紫斑症(ITP)，包括慢性或急性ITP)、鞏膜炎(例如特發性角膜-鞏膜炎、上鞏膜炎)、睪丸及卵巢之自體免疫疾病(包括自體免疫睪丸炎及卵巢炎)、原發性甲狀腺功能減退、副甲狀腺功能減退、自體免疫內分泌疾病(包括甲狀腺炎，例如自體免疫甲狀腺炎、橋本氏病(Hashimoto's disease)、慢性甲狀腺炎(橋本氏甲狀腺炎)或亞急性甲狀腺炎)、自體免疫甲狀腺疾病、特發性甲狀腺功能減退、格雷氏病(Grave's disease)、多腺體症候群(例如自體免疫多腺體症候群或多腺體內分泌病症候群)、腫瘤伴生症候群(包括神經性腫瘤伴生症候群，例如藍伯-伊頓肌無力症候群(Lambert-Eaton myasthenic syndrome)或伊頓-藍伯症候群)、僵硬人(stiff-man或stiff-person)症候群、腦脊髓炎(例如過敏性腦脊髓炎(allergic encephalomyelitis或encephalomyelitis allergica)及實驗性過敏性腦脊髓炎(EAE)、實驗性自體免疫腦脊髓炎)、重症肌無力(例如胸腺瘤相關之重症肌無力、小腦退化、神經性肌強直、僵直性肌陣攣症候群(OMS)及感覺神經病變)、多灶性運動神經病、席漢氏症候群(Sheehan's syndrome)、自體免疫肝炎、慢性肝炎、類狼瘡性肝炎、巨細胞肝炎、慢性活動性肝炎或自體免疫慢性活動性肝炎、淋巴樣間質性肺炎(LIP)、閉塞性細支氣管炎(非移植)與NSIP、格林-巴利症候群(Guillain-Barre syndrome)、伯格氏病(Berger's disease，IgA腎病變)、特發性IgA腎病變、線性IgA皮膚病、急性發熱性嗜中性球皮膚病、角膜下膿皰性皮膚病、暫時性棘層松解性皮膚病、硬化(例如原發性膽汁性肝硬化及肺硬化)、自體免疫腸病症候群、乳糜瀉或腹部疾病、脂肪痢(麩蛋白腸病)、難治性口炎性腹瀉、特發性口炎性腹瀉、冷凝球蛋白血症、肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS；路格裡克氏病(Lou Gehrig's disease))、冠狀動脈疾病、自體免疫耳病(例如自體免疫內耳病(AIED))、自體免疫聽力損失、多發性軟骨炎(例如難治性或復發性或復發型多發性軟骨炎)、肺泡蛋白沈積症、寇甘症候群(Cogan's syndrome)/非梅毒性間質性角膜炎、貝爾氏麻痺(Bell's palsy)、斯威特病(Sweet's disease)/症候群、自體免疫性紅斑痤瘡、帶狀皰疹相關之疼痛、類澱粉變性、非癌性淋巴細胞增多症、原發性淋巴細胞增多症(其包括單株B細胞淋巴細胞增多症，例如良性單株γ球蛋白症及意義未明之單株γ球蛋白症，MGUS)、外周神經病變、腫瘤伴生症候群、離子通道病變(例如癲癇、偏頭痛、心律不整、肌肉病症、耳聾、失明、週期性麻痺及CNS之離子通道病變)、自閉症、發炎性肌病、局灶性或節段性或局灶性節段性腎小球硬化(FSGS)、內分泌眼病變、葡萄膜視網膜炎、脈絡膜視網膜炎、自體免疫肝病、纖維肌痛、多發性內分泌衰竭、施密特氏症候群(Schmidt's syndrome)、腎上腺炎、胃萎縮、早老性失智症、脫髓鞘病(例如自體免疫脫髓鞘病及慢性發炎性去髓鞘型多發性神經病變)、卓斯勒症候群(Dressler's syndrome)、斑禿、全部脫髪、CREST症候群(鈣沉著症、雷諾氏現象、食道運動功能障礙、指端硬化及毛細血管擴張)、例如歸因於抗精子抗體之男性及女性自體免疫不孕、混合型結締組織疾病、查加斯氏病(Chagas' disease)、風濕熱、習慣性流產、農夫、多形性紅斑、心臟切開術後症候群、庫欣氏症候群(Cushing' s syndrome)、養鳥人肺、過敏性肉芽腫性血管炎、良性淋巴球性血管炎、亞伯氏症候群(Alport's syndrome)、肺泡炎(例如過敏性肺泡炎及纖維化肺泡炎)、間質性肺病、輸血反應、麻風、瘧疾、寄生蟲病(例如利什曼體病(leishmaniasis)、錐蟲病、血吸蟲病、蛔蟲病、麴菌病、塞氏症候群(Sampter's syndrome)、卡普蘭氏症候群(Caplan's syndrome)、登革熱(dengue))、心內膜炎、心肌內膜纖維化、瀰漫性間質性肺纖維化、間質性肺纖維化、肺纖維化、特發性肺纖維化、囊性纖維化、眼內炎、持久隆起性紅斑、胎兒紅血球母細胞增多症、嗜酸性球筋膜炎、夏爾曼氏症候群(Shulman's syndrome)、費爾提氏症候群(Felty's syndrome)、絲蟲病、睫狀體炎(例如慢性睫狀體炎、虹膜異色性睫狀體炎、虹膜睫狀體炎(急性或慢性)或富克斯睫狀體炎(Fuch's cyclitis))、亨-舒二氏紫斑病(Henoch-Schonlein purpura)、人類免疫缺失病毒(HIV)感染、SCID、獲得性免疫缺失症候群(AIDS)、埃可病毒感染(echovirus infection)、敗血症、內毒血症、胰臟炎、甲狀腺毒症、小病毒感染、德國麻疹病毒感染、疫苗接種後症候群、先天性風疹感染、艾司坦-巴爾病毒感染、流行性腮腺炎、伊文氏症候群(Evan's syndrome)、自體免疫性腺衰竭、席登罕氏舞蹈症(Sydenham's chorea)、鏈球菌感染後腎炎、血栓閉塞性血管炎、甲狀腺毒症、運動失調、絨膜炎、巨細胞多肌痛、慢性過敏性肺炎、乾性角膜結膜炎、流行性角膜結膜炎、特發性腎病症候群、微小病變性腎病、良性家族性及缺血-再灌注損傷、移植器官再灌注、視網膜自體免疫性、關節發炎、支氣管炎、慢性阻塞性氣道/肺病、矽粉沉著病、口瘡、口瘡口炎、動脈硬化病症、無精子形成(aspermiogenese)、自體免疫溶血、伯克氏病(Boeck's disease)、冷凝球蛋白血症、杜普宜特朗氏攣縮(Dupuytren's contracture)、晶體過敏性眼內炎、過敏性小腸炎、麻風性結節性紅斑、特發性面神經麻痹、慢性疲勞症候群、風濕熱、哈-裡二氏病(Hamman-Rich's disease)、感音神經性聽力損失、陣發性血紅蛋白尿、性腺低能症、侷限性迴腸炎、白血球減少症、傳染性單核細胞增多症、貫穿性脊髓炎、原發性特發性黏液水腫、腎病、交感性眼炎、肉芽腫性睪丸炎、胰臟炎、急性多神經根炎、壞疽性膿皮病、奎汶氏甲狀腺炎(Quervain's thyreoiditis)、獲得性脾萎縮、非惡性胸腺瘤、白斑病、中毒性休克症候群、食物中毒、涉及T細胞浸潤之病況、白血球黏著缺失、與由細胞介素及T淋巴球介導之急性及延遲性過敏症相關之免疫反應、涉及白血球滲出之疾病、多發性器官損傷症候群、抗原-抗體複合物介導之疾病、抗腎小球基底膜疾病、過敏性神經炎、自體免疫多內分泌病、卵巢炎、原發性黏液水腫、自體免疫萎縮性胃炎、交感性眼炎、風濕性疾病、混合型結締組織疾病、腎病症候群、胰島炎、多內分泌衰竭、I型自體免疫多腺體症候群、成人發作型特發性副甲狀腺功能減退(AOIH)、心肌病(例如擴張性心肌病)、獲得性大皰性表皮松解(EBA)、血色素沉著症、心肌炎、腎病症候群、原發性硬化性膽道炎、化膿性或非化膿性竇炎、急性或慢性竇炎、篩骨、額葉、上頜或蝶骨竇炎、嗜酸性球相關之病症(例如嗜酸性球增多症、肺浸潤嗜酸性球增多症、嗜酸性球增多症-肌痛症候群、呂弗勒氏症候群(Loffler's syndrome)、慢性嗜酸性球肺炎、熱帶性肺嗜酸性球增多症、支氣管肺麴菌病、麴菌瘤或含有嗜酸性球之肉芽腫)、過敏症、血清陰性脊椎關節病變、多內分泌自體免疫疾病、硬化性膽道炎、鞏膜、上鞏膜、慢性黏膜皮膚念珠菌病、布魯頓氏症候群(Bruton's syndrome)、新生兒暫時性低γ球蛋白血症、偉-爾二氏症候群(Wiskott-Aldrich syndrome)、共濟失調毛細血管擴張症候群、血管擴張、與膠原疾病相關之自體免疫病症、風濕病、神經疾病、淋巴腺炎、血壓反應降低、血管功能障礙、組織損傷、心血管缺血、痛覺過敏、腎缺血、大腦缺血及伴隨血管形成之疾病、過敏性過敏症(allergic hypersensitivity disorder)、腎小球腎炎、再灌注損傷、缺血性再灌注病症、心肌或其他組織之再灌注損傷、淋巴瘤性氣管支氣管炎、發炎性皮膚病、具有急性發炎組份之皮膚病、多器官衰竭、水皰病、腎皮質壞死、急性化膿性腦膜炎或其他中樞神經系統發炎性病症、眼及眼眶發炎性病症、顆粒球輸血相關之症候群、細胞介素誘發之毒性、嗜睡病、急性嚴重發炎、慢性難治性發炎、腎盂炎、動脈內增生、消化性潰瘍、心臟瓣膜炎、移植物抗宿主病、接觸性過敏症、氣喘性氣道超反應及子宮內膜異位症。 其他態樣係關於治療或預防微生物感染及/或微生物抗原之用途。欲治療或預防之微生物感染或抗原可為與業內已知之任何微生物感染或例如以下各項相關之抗原：炭疽、子宮頸癌(人類乳頭瘤病毒)、白喉、A型肝炎、B型肝炎、b型流感嗜血桿菌(Hib)、人類乳頭瘤病毒(HPV)、流行性感冒(Flu)、日本腦炎(JE)、萊姆病、麻疹、腦膜炎球菌、猴痘、流行性腮腺炎、百日咳、肺炎球菌、脊髓灰質炎、狂犬病、輪狀病毒、風疹、帶狀皰疹(shingles) (帶狀皰疹(herpes zoster))、天花、破傷風、傷寒、結核病(TB)、水痘(varicella) (水痘(Chickenpox))及黃熱病。 在一些實施例中，該等方法及組合物可用於對個體進行疫苗接種以預防感染。 XIII. 實例本發明包括下列實例以展示本發明之較佳實施例。熟習此項技術者應瞭解，下列實例中所揭示之技術代表本發明者發現在實踐本發明中良好地發揮功能之技術，且因此可認為構成其實踐之較佳方式。然而，熟習此項技術者藉助本揭示內容應瞭解，可對所揭示之特定實施例作出多種改變且仍獲得相同或類似之結果，此並不背離本發明之精神及範疇。 實例 1 - 用於產生 T 細胞之 3D 類器官系統之研發 用於人類 T 細胞發育之現成 3D 類器官系統之研發- 目的係依賴Notch配體轉導基質細胞系之能力(如由OP9-DL1系統所例示)來研發標準化人工胸腺類器官系統用於研究3D相互作用在T細胞分化及選擇中之作用。然而，OP9-DL1細胞在長期培養中不穩定，此需要每幾天更換細胞以維持T支持潛能且預防脂肪生成轉變。由於要求3D培養物穩定數週，故業內尋求鑑別容許延長的完整培養物之培養物及細胞組份。此外，OP9-DL1系統之效能對胎牛血清(FCS)批次中之生物變異高度敏感，且因此亦尋求鑑別可以可再現方式支持T細胞分化之無血清培養條件。 發現補充有無血清B27補充物、FLT3L、IL-7及抗壞血酸(下文稱為RB27)之RPMI有助於OP9-DL1系統內與標準血清條件類似程度之T細胞分化，然而，基質細胞活力及造血細胞擴增較低。相比之下，MS-5鼠類骨髓基質細胞系在RB27中保留長期活力，然而，如所預期不支持T細胞分化。因此用全長人類 DLL1cDNA轉導MS-5細胞(下文稱為MS5-hDLL1)以產生在RB27中具有長期穩定性之T支持系。選擇DLL1，此乃因已顯示其為在人類胸腺中表現之生理上相關之Notch配體。為測試T細胞在該等條件下之分化，利用FACS清除臍帶血(CB) CD34+ HSPC之CD3+細胞且將其接種至MS5-hDLL1單層上。無血清RB27中之MS5-hDLL1共培養物支持自CB HSPC之T譜系定型及早期T細胞分化。與在標準培養基條件下在OP9-DL1系統上相比，在RB27中在MS5-hDLL1上之造血擴增較低，然而，兩個系統之間之T細胞分化之純度及程度相似。MS5-hDLL1支持T細胞前體之β-選擇，從而產生少量CD3+ TCRαβ+細胞，然而，如在OP9-DL1系統中，該等細胞在DP階段顯著受阻，此指示正向選擇受損。 隨後使用MS5-hDLL1/無血清RB27來產生標準化3D人工胸腺類器官(ATO)系統。為產生ATO，使MS5-hDLL1細胞與T細胞清除之人類臍帶血(CB) CD34+ HSPC聚集在一起。為最大化可及性及再現性，避免使用專有支架材料或外源ECM，而是使用改編自鼠類再聚集胸腺器官培養物(RTOC)之離心再聚集方式。由於來自RTOC之數據亦已展示空氣-液體界面培養物增強T細胞發育，故將ATO佈置在市售0.4 μm transwell插入物上，該插入物之底部容許與培養基接觸且頂部與空氣接觸。與需要將造血細胞連續轉移至新基質層之單層共培養物不同，將ATO完整培養長達10週，其中唯一幹預係每週兩次更換插入物周圍之培養基及細胞介素。佈置後，ATO立即形成黏結性3D結構。截至第2週ATO在光學顯微鏡下高度富於細胞性且外觀保持穩定直至第10週。在一些實施例中，結構經囊封。 起始於CB CD34+ CD3- HSPC之ATO揭露與OP9-DL1或MS5-hDLL1單層共培養物相比T譜系之加速動力學分化。第2週ATO之T譜系定型之特徵在於明顯出現T定型之CD34+ CD1a+ CD7+早期胸腺祖細胞(ETP)表型以及重疊原T1及原T2表型。如所預期，在用親代MS-5細胞系產生之類器官中未觀察到在CD34+ CD1a+ CD7+ ETP階段外之T細胞分化，該親代MS-5細胞系反而支持骨髓樣及B細胞發育。在ATO內，CD34- CD7+ CD5+ CD4- CD8- (「雙陰性」，DN) T細胞前體代表第2週時之大多數細胞，但之後隨著CD7+ CD4+ CD3-不成熟單陽性(ISP)及CD4+ CD8+雙陽性(DP)群之倒數式增加而降低。總之，ATO中之早期T細胞分化有序地且密切地類似於天然人類胸腺中之早期T細胞分化。 隨後檢查ATO內β-選擇及正向選擇之效率。ATO DP前體早在第2週即顯示CD3及TCRαβ之表面表現，其增加直至第6週，此指示成功過渡經過β-選擇。CD3+ TCRαβ+ DP細胞在ATO中之頻率與在人類胸腺中之頻率相當，二者皆高於OP9-DL1及MS5-hDLL1單層培養物。重要的是，成熟CD3+ TCRαβ+ CD8+及CD4+單陽性(SP) T細胞截至第4週在ATO中出現，其頻率增加直至第7週，此與ATO中之功能性正向選擇一致。CD3+ TCRαβ+ CD8+及CD4+ SP細胞在第7週ATO中之頻率分別高於在樣本匹配之OP9-DL1及MS5-hDLL1單層共培養物中之頻率。儘管在ATO中觀察到CD3+ TCRαβ+ CD8+及CD4+ SP細胞二者，但CD8+細胞對CD4+細胞之比率高於人類胸腺中之比率，此指示經正向選擇之CD8+細胞在ATO中之相對優勢。最後，在ATO中容易地鑑別出CD3+ TCRγ∂+細胞，且主要為CD8- CD4-，此與胸腺中類似。總之，該等數據展示與單層共培養系統相比，ATO有助於快速且穩健的T細胞分化，且極大地改良成熟人類T細胞之正向選擇。 在 ATO 中 TCR 多樣性及功能性初始 T 細胞之產生 -隨後測試在ATO中產生之T細胞表現TCR多樣性且在功能上成熟。在ATO中產生之CD3+ CD8 SP T細胞內，TCR Vβ鏈區段使用之流式細胞測量術分析揭露與自人類胸腺分離之CD8 SP細胞相當之分佈，此與多樣多株TCR譜一致。ATO源CD3+ TCRαβ+ SP T細胞基於CD45RO下調以及CD45RA、CD27及CCR7上調亦展示成熟初始表型。應注意，CD3+ TCRαβ+ CD8及CD4 SP細胞二者之子集係CD45RO+ CD45RA-，然而，該等細胞經鑑別為自DP前體形成之不成熟T細胞而非記憶T細胞，此乃因與CD45RO一樣，其CD1a表現在胸腺內成熟期間及在胸腺流出之前下調。隨後測試ATO源T細胞因應抗原刺激經歷活化及純系擴增之能力。如所預期，經純化ATO源CD8 SP T細胞因應TCR信號傳導模擬物PMA/離子黴素表現干擾素γ (IFNg)，且因應CD3/28接合及IL-2經歷活化誘導之增殖，如藉由CFSE稀釋及CD25上調所展示。因此，ATO可產生具有多樣TCR譜之功能性初始T細胞。 自多種造血組織產生 T 細胞 -先前報導已顯示，來自成人HSPC來源(包括經動員末梢血)之T細胞發育在OP9-DL1系統內高度無效。相反，自CB及出生後胸腺分離之CD34+ HSPC之T細胞發育可能分別因淋巴樣定型及T細胞定型之祖細胞之高頻率而尤其有效。因此，測試ATO支持來自末梢血、經G-CSF動員之末梢血及穩態成人骨髓分離之經純化CD34+ HSPC的T細胞發育之能力。發現在自所有來源開始之ATO中之T細胞發育經分析具有與臍帶血相似之效率，且產生相似數量之成熟CD4+及CD8+ T細胞。此外，自臍帶血、骨髓及經動員末梢血高度富集造血幹細胞之經純化CD34+ Lin- CD38- CD45RA- HSPC產生具有相似效率之T細胞。因此，ATO容許自臨床上相關之HSPC來源發育，且亦可用作研究T譜系潛能及來自多種幹細胞及祖細胞類型之T細胞分化的頗具價值之研究工具。 ATO 之結構態樣 -隨後檢查ATO中T細胞分化之結構態樣。第2-6週之間之ATO之系列蘇木素及伊紅(H&E)切片展示緊密的細胞組織樣組織。針對CD3之免疫螢光染色展示CD3 +細胞優先在ATO之外緣形成緻密叢。因此，ATO中之T細胞發育發生在有助於多個造血細胞之間之細胞-細胞接觸之細胞架構內，此類似於人類胸腺內之條件。 ATO 中經改造抗原特異性 T 細胞之分化及等位基因排除 -在末梢血T細胞中強迫表現特異性針對癌症相關或病毒肽-MHC (pMHC)複合物之TCR係抗腫瘤及抗病毒免疫療法之有前途的方式。自HSPC重新產生抗原特異性T細胞可提供優於外周T細胞之TCR轉導之安全性及效能方面之顯著優點。當在ATO中產生功能T細胞時，測試該系統自CD34+ HSPC產生經TCR改造之抗原特異性T細胞之能力。 用先前表徵之特異性針對由HLA-A*0201呈遞之癌症相關之NY-ESO-1 157-165肽的慢病毒TCRαβ構築體轉導健康供體之臍帶血CD34+ HSPC。使用HLA-A*0201/NY-ESO-1 157-165四聚體及針對經轉導Vβ13.1區段之抗體監測ATO中抗原特異性細胞之分化。在ATO中，四聚體陽性細胞在第3週初始分析時存在明顯分化，該等細胞皆對Vβ13.1及表面CD3呈陽性。令人感興趣的是，CD3及經轉導TCR之共表現首先見於CD34- CD7+ CD5+ DN細胞以及CD4 ISP樣及DP樣T細胞前體中，然而，自第4-6週逐漸限於DP及CD8 SP群。此與在功能TCR存在下在DN階段繞過β-選擇、然後進行相對保留之分化及適宜I類MHC限制性正向選擇一致。相比之下，經模擬物轉導之來自對照ATO之細胞在DP階段展示正常的CD3及TCRαβ表現，隨後進行CD8+及CD4+ T細胞二者之正向選擇。該等觀察與轉基因TCR對內源TCR α及β基因座之等位基因排除一致。實際上，＞95%之四聚體+ CD3+ CD8 SP細胞表現經轉導Vβ13.1區段以排除替代區段。 隨後確認ATO源抗原特異性T細胞在功能上成熟。與來自經模擬物轉導之ATO之CD8 SP T細胞一樣，四聚體+ CD8 SP細胞展現至成熟初始CD45RA+ CD45RO- CD1a 低CD27+ CCR7+表型之成熟。如在對照ATO中，殘餘CD45RO+細胞為CD1a +，此與自DP池之最新出現一致，與活化/記憶表型相反。對四聚體 +CD8 SP T細胞(或來自經模擬物轉導之ATO之等效TCRαβ +CD8 SP細胞)進行分選且將其暴露於基於K562之人工抗原呈遞細胞(aAPC)下，該等人工抗原呈遞細胞共表現HLA-A*0201、β-2-微球蛋白、CD80及NY-ESO-1 157-165(ESO+)或來自MART-1之不相關對照肽(MART1+)。如所預期，抗原特異性T細胞因應ESO+而非MART1+ aAPC產生干擾素γ且去粒(如特徵在於LAMP1/CD107a之膜輸送)。來自經模擬物轉導之ATO之T細胞不經歷因應任一aAPC之顯著活化。抗原特異性T細胞亦經歷因應ESO+ aAPC之增殖。由aAPC介導之持續活體外擴增可維持超過14天。最後，在用NY-ESO-1而非MART1肽實施脈衝處理之HLA-A*0201+ K562靶細胞激發時，aAPC引發之抗原特異性T細胞展示抗原特異性腫瘤細胞殺死。總之，ATO提供用於功能性抗原特異性T細胞之重新產生及操縱之穩健系統。 展示ATO可經操縱以特定研究並增強正向選擇之過程。胸腺中之正向選擇係經由正發育胸腺細胞與皮質上皮細胞(cTEC)之相互作用來發生。在缺少cTEC之ATO中，假設正向選擇係由與自體造血細胞上之自身MHC相互作用來調介。為測試此，如上文，用HLA-A*0201/NY-ESO-1 157-165特異性TCR轉導來自HLA-A*0201陽性及陰性供體之CB HSPC，且使其在ATO中分化成T細胞。使用此模型發現，除誘導與增強的正向選擇、如CCR7上調相關之定性變化外，供體HLA-A*0201改良CD8SP細胞之百分比。令人感興趣的是，在ATO中HLA-A*02:01在MS5-hDLL1基質細胞中之異位表現適當增強HLA-A*02:01陰性供體ATO中之CD8SP百分比，且極大地增強具有HLA-A*02:01+供體HSPC之ATO中之CD8SP百分比。此展示ATO可藉由用人類HLA轉導來操縱以增強經正向選擇之抗原特異性T細胞之產生，且與同種異體TCR及MHC轉導之基質組合使用之ATO提供精確定義之用於人類T細胞中正向選擇之機制研究的系統。 實例 2 - 人工胸腺類器官誘導來自人類造血幹細胞之經 TCR 改造 T 細胞之正向選擇及等位基因排除經改造T細胞療法為治療癌症及慢性病毒感染提供空前機會。直接自造血幹細胞及祖細胞(HSPC)產生經改造T細胞之能力可克服與使用末梢血T細胞相關之關鍵治療限制，包括同種異體反應性。此處闡述臨床上相關之人工胸腺類器官(ATO)系統，其支持來自臍帶血、骨髓及末梢血HSPC之天然及經TCR改造之人類T細胞的高度有效之活體外分化及正向選擇。ATO源T細胞展現初始表型、多樣TCR譜及TCR依賴性活化及增殖。經TCR改造之ATO源T細胞亦成熟至初始表型且另外顯示幾乎完全缺少內源TCR表現，此與等位基因排除之誘導一致。因此，ATO呈現產生用於授受性細胞療法之初始非同種異體反應性經改造T細胞之簡單且直接之方法。 使用經改造以表現抗原特異性T細胞受體(TCR)之T細胞之授受性細胞療法提供惡性病及慢性病毒感染之靶向及潛在治癒性治療。當前策略依賴於成熟循環T細胞之基因修飾及離體擴增。該等方法具有關鍵治療限制，包括再輸注後有限的活體內活性及經轉導與內源TCR鏈之間之錯配，且可降低抗原特異性反應性或自體免疫性誘導。此外，由內源TCR表現賦予之同種異體反應性已限制大多數方法使用自體T細胞，此可因增加的成本、有限的產生能力及淋巴球減少症環境下之患者不合格性而最終限制療法之使用。在活體外自造血幹細胞及祖細胞(HSPC)產生經改造T細胞可藉由同時容許重新產生初始抗原特異性T細胞且經由等位基因排除抑制內源TCR表現來解決該等問題。 由於胸腺中T細胞發育之時空複雜性，活體外T細胞分化之方法迄今無法完整重演人類T細胞發育。該等方法之主要進步係發現經Notch配體轉導之鼠類基質細胞系可支持來自鼠類或人類HSPC之活體外T細胞分化，如在經典OP9-DL1共培養系統中所展示。在此及類似單層系統中，人類HSPC經歷T譜系定型及早期T細胞分化。然而，具有有成效重排TCR之T細胞前體之正向選擇受損，且可見至CD8+或CD4+單陽性(SP) T細胞之最小成熟。本發明者及其他人已顯示使用鼠類或人類胸腺組織之三維(3D)類器官系統支持活體外人類T細胞經改良之正向選擇及成熟。然而，該等系統因低細胞輸出、高實驗變異性及對原代胸腺組織之依賴性而不適於產生用於治療應用之T細胞。因此，本發明者致力於研發出能夠支持來自HSPC之人類T細胞之分化及正向選擇、同時保留關鍵轉化性質(例如標準化組份、再現性及可擴縮性)之人工類器官系統。 在此實例中闡述基於經DLL1轉導之基質細胞系及無血清現成組份之人工胸腺類器官(ATO)系統之研發。與單層系統不同，ATO支持來自人類臍帶血、骨髓及末梢血CD34+ HSPC之人類CD3+TCRαβ+CD8SP及CD4SP T細胞之穩健活體外分化、正向選擇及成熟。ATO源成熟T細胞展現抗原初始表型、多樣TCR譜及因應抗原刺激之活化/增殖。ATO亦支持來自經特異性針對腫瘤相關抗原NY-ESO-1之HLA-A*02:01限制性TCR轉導之HSPC之經TCR改造之抗原特異性T細胞的高度有效之分化。ATO源經改造T細胞展現初始表型且經歷抗原特異性活化及細胞毒性引發。藉由在ATO基質細胞中表現同源主要組織相容性複合物(MHC)來進一步增強經TCR改造T細胞之正向選擇。最後，在ATO中產生之經TCR改造之T細胞展現幾乎完全缺少內源TCR表現，此與在發育期間等位基因排除之誘導一致，且表明產生用於授受性細胞療法之非同種異體反應性經改造T細胞之直接且有效之方法。 A. 結果 1. 用於活體外人類 T 細胞分化之最佳化人工胸腺類器官系統之研發一個目標係研發出可支持來自HSPC之人類T細胞之活體外正向選擇及成熟的臨床上可轉化之類器官系統。為避免使用原代胸腺組織，測試經DLL1轉導之基質細胞系支持3D類器官培養物中之人類T細胞發育之能力。由於本發明者及其他人已觀察到，端視特定胎牛血清批次及基質細胞頻率變化，OP9-DL1系統中之T細胞分化高度可變，故本發明者亦尋求鑑別能夠一致地支持類器官培養物中之T細胞分化之無血清條件。為避免使用專有支架材料，本發明者利用緊密再聚集技術，顯示其可有效地用於基於胸腺組織之類器官中，其中藉由離心使基質細胞與HSPC聚集在一起且佈置在空氣-流體界面之細胞培養插入物上(圖3A)。在該等3D培養物中，本發明者鑑別出強烈支持來自T細胞清除CD34+臍帶血(CB) HSPC之人類T細胞分化的經人類DLL1轉導之MS-5鼠類骨髓基質細胞系(下文稱為MS5-hDLL1)。此外，本發明者鑑別出補充有B27 (用於神經元及胚胎幹細胞培養物中之多組份添加劑)及FLT3L、IL-7及抗壞血酸(下文稱為「RB27」)之RPMI作為新穎無血清培養基，其一致地支持MS5-hDLL1類器官培養物中之穩健人類T細胞分化。 此最佳化人工胸腺類器官(ATO)系統誘導快速且穩健的來自CB CD34+CD3- HSPC之T譜系定型，如藉由截至第2週CD5+CD7+細胞之優勢及CD4 ISP及CD4+CD8+ (DP)細胞之出現所顯示(圖3B)。成熟CD3+TCRαβ+細胞早在第2週即出現，且隨時間增多，在第6週時達到25%之平均值(圖3B及G)。CD3+TCRαβ+細胞在早期時間點主要為DP，但逐漸成熟至CD8SP T細胞且在較小程度上成熟至CD4SP T細胞，此與ATO中之正向選擇一致。 ATO甚至在延長培養中持續進行來自原始祖細胞之T細胞分化。在6週時，存在胸腺T細胞祖細胞之所有三個表型階段，包括多能CD34+CD7-CD1a-早期胸腺祖細胞(ETP)及下游CD34+CD7+CD1a-及CD34+CD7+CD1a+ T譜系祖細胞(圖3C)。基於替代分類方案在CD34+部分中亦鑑別出原T1及原T2祖細胞表型(圖3C)。CD19+ B細胞頻率隨時間減小，且NK及骨髓樣頻率始終較低(圖3B、F-G)。ATO之組織學切片展示具有大量淋巴樣細胞之緻密組織樣架構(數據未顯示)，其叢對CD3呈陽性(圖3D)。在第6週時，ATO中相對於輸入HSPC之細胞擴增平均為80倍(圖3E)，且儘管在不同生物CB單元之間可見擴增之變化，但自所有樣品(n=18)一致地產生前體及成熟T細胞(圖3G)。總細胞擴增亦與起始細胞數及HSPC對基質細胞比率呈負相關，其中在一些組合中相對於輸入HSPC增加至多800倍(圖9A、B)。在技術重複(n=11)及不同批次之B27 (n=4)中可見細胞擴增及T細胞分化二者之高再現性(圖10A-C)。就臨床轉化之顯著性而言，在使用補充有不含異源成份之B27之培養基(含有人類血清白蛋白) (圖10D-E)或用經輻照基質細胞製得(圖10F-B)之ATO中可見相當T細胞分化。 當與使用相同供體CB HSPC之OP9-DL1單層培養系統相比時，ATO揭露顯著優異之CD3+TCRαβ+ T細胞產生(圖11A-C)。與先前報導一致，OP9-DL1單層支持有效的T譜系定型(CD7+CD5+)及進展通過ETP、原T及CD4 ISP階段，但不支持DP、CD3+TCRαβ+及成熟SP細胞之無效產生，所有該等細胞容易地在ATO中進行發育(圖11B-C)。實際上，最佳正向選擇及成熟需要ATO系統之所有三種組份：3D結構、MS5-hDLL1基質細胞及RB27培養基(圖11A)。與MS5-hDLL1不同，OP9-DL1在RB27中存活較差且顯示較差地支持類器官培養物中之T細胞分化。缺少DLL1表現之親代MS-5細胞系不支持單層或3D培養物中之T細胞發育(圖11A)。 總而言之，ATO提供標準化無血清類器官系統，其支持穩健且可再現之來自CD34+ HSPC之T細胞分化，從而容許人類TCRαβ+及TCRγδ+ T細胞之正向選擇及成熟。 2.   ATO 中胸腺初始 T 細胞發育之重演隨後比較長期ATO中之T細胞分化與出生後人類胸腺中之T細胞分化。第12週CB ATO顯示T譜系定型(CD5+CD7+)及CD34+ T細胞祖細胞與胸腺相似之頻率(圖4A)，而DP及SP頻率表明在第12週ATO中比胸腺中更晚期之T細胞成熟(圖4A)。如在胸腺中，在ATO中大多數CD3+細胞為TCRαβ+以及較小但一致之TCRγδ+群(圖4A)。在ATO源CD3+TCRαβ+細胞中，成熟CD8SP及CD4SP T細胞之產生在第6-12週之間增加(圖4B及圖12A)。與胸腺相比，ATO展現CD4SP T細胞相對於CD8SP T細胞比例較小，可能反映CD4+ T細胞發育較慢動力學；CD4+細胞之頻率持續增加直至第12週(分析之最遠時間點)(圖4B及圖12A)。 如在胸腺中，ATO源CD3+TCRαβ+CD8SP及CD4SP T細胞自「不成熟初始」表型(CD45RA-CD45RO+CD27+CCR7-CD1A hi)過渡至「成熟初始」表型(CD45RA+CD45RO-CD27+CCR7+CD1a lo) (圖4C及圖12A-C)。在ATO中，此發生在第6-12週之間，且在第12週ATO中產生高於胸腺中之成熟初始T細胞頻率(圖4C及圖12B-C)。不成熟及成熟初始子集二者共表現CD62L及CD28，與CD127及CD31之子集共表現，後者與血液中新近胸腺遷出之T細胞相關(圖12B-C)。活化標記物CD25不在ATO源CD8SP T細胞上表現，但在CD4SP T細胞子集上觀察到(圖12B-C)。總之，該等數據顯示在ATO中與人類胸腺相比顯著的T細胞分化保真度，與胸腺及血液中所發現者類似之真實初始T細胞之出現達到極點。 3. 來自多個 HSPC 來源及子集之 T 細胞分化自所有臨床上相關之HSPC來源(即成人骨髓(BM)、經G-CSF動員之末梢血(MPB)及未經動員之末梢血(PB))可見具有相似的前體及CD3+TCRαβ+ T細胞頻率之有效T細胞分化(圖5A-B及圖13A、B)。HSPC來源之總細胞擴增亦相當(圖13C)。自CB、BM或MPB高度富集之造血幹細胞(HSC)部分(Lin-CD34+CD38)展示同樣穩健之T細胞分化(圖5C-D及圖13D-E)，表明來自該等來源之T細胞潛能獨立於預先存在之淋巴定型之祖細胞。 ATO中之T細胞分化亦起始於經純化淋巴樣祖細胞。在3週時，成人BM淋巴樣引發之多能祖細胞(LMPP)及CD24-共同淋巴樣祖細胞(CLP)比HSC或未分級之CD34+ HSPC更快速且有效地分化通過CD4 ISP及DP階段(圖5E-F)。相比之下，主要具有B及NK細胞潛能之CD24+ CLP在具有較低細胞輸出之ATO中生長較差(圖13F)。因此，ATO可用作評估來自人類幹細胞及祖細胞群之T譜系潛能之工具。 4.   ATO 源 T 細胞之 TCR 多樣性及功能本發明者隨後表徵在ATO中產生之成熟T細胞之TCR多樣性及功能。針對共同TCR Vβ區段之ATO源CD3+TCRαβ+CD8SP T細胞之流式細胞測量術揭露與來自人類胸腺之相應CD8SP T細胞顯著相似之多樣性(圖6A)。重要的是，既未觀察到偏斜的Vβ使用亦未觀察到純系選擇，此分別批駁非習用T細胞子集或經純系擴增之成熟T細胞在ATO中之優勢。 ATO源CD8SP T細胞展現因應PMA/離子黴素之強IFNγ及低IL-4產生，此與細胞毒性表型一致(圖6B)。CD4SP細胞產生IFNγ+及IL-4+細胞二者，此分別與Th1及Th2極化一致；且極少DP細胞對刺激有反應，此與其不成熟狀態一致(圖6B)。ATO源CD8SP細胞亦經歷因應抗CD3/CD28抗體及IL-2之增殖及CD25上調(圖6C)。此外，自CB、BM或MPB ATO產生之CD8SP細胞展現相似的因應PMA/離子黴素之IFNγ產生(圖6D)及具有抗CD3/CD28及IL-2之活體外擴增(圖6E)。總而言之，在ATO中產生之成熟T細胞展現生理TCR多樣性及針對抗原刺激之功能反應。 5.   ATO 中初始經 TCR 改造 T 細胞之產生本發明者隨後使ATO適用於在活體外自HSPC產生經TCR改造之T細胞。用編碼特異性針對NY-ESO-1 157-165之HLA-A*02:01限制性TCR之α及β鏈之慢病毒載體轉導CB CD34+CD3- HSPC。在6週時，經TCR轉導之ATO顯示與經模擬物轉導之對照相似的CD5+CD7+ T定型細胞頻率，但CD3+TCRαβ+ T細胞顯著增加，其中之大多數表現經轉導TCR，如藉由用四聚體或針對經轉導Vβ13.1鏈之抗體染色可見(圖7A)。四聚體+細胞與來自經模擬物轉導之對照之CD3+TCRαβ+細胞之間的CD8SP細胞頻率相似，然而，四聚體+CD8SP細胞顯示至成熟初始表型之加速成熟(即CD45RA+CD45RO-CD27+CCR7+CD1a lo) (圖7A)。如使用未經轉導之ATO，未觀察到至效應物/記憶體表型之分化(圖7A)。 TCR轉導亦可增強ATO中之總細胞擴增(圖7B)，其中之大多數為四聚體+CD3+ T細胞。在經TCR轉導之ATO中相對於輸入HSPC之總細胞擴增通常為150倍(圖7A)，但可藉由限制起始HSPC及基質細胞數/ATO進一步增加至700倍以上(圖7C)。因此，起始於7,500個經TCR轉導之HSPC之單一ATO可產生約5×10 6個細胞，其中約7.5×10 5個(15%)為四聚體+CD3+CD8SP成熟初始T細胞(圖7A-C)。 來自經TCR轉導之ATO之ATO源CD8SP細胞經歷因應表現同源肽-MHC及CD80之人工抗原呈遞細胞、但不因應親代K562細胞之抗原特異性活化及去粒，如分別藉由IFNγ產生及CD107a膜動員所量測(圖7D)。此外，來自經TCR轉導之ATO之CD8SP T細胞經歷與來自經模擬物轉導之ATO的彼等等效之因應抗CD3/CD28及IL-2之活體外擴增(圖7E)。 經TCR改造之ATO源T細胞中Vβ多樣性之分析揭露98%以上之四聚體+ CD8SP T細胞僅表現經轉導Vβ13.1區段(圖7F-G)，此與經TCR改造之T細胞分化期間之內源TCR表現之幾乎完全之等位基因排除一致。因此，ATO支持來自HSPC之功能性經TCR改造T細胞之穩健分化，且引入TCR增強細胞擴增且促進缺少內源TCR表現之成熟初始T細胞之分化。 6. 在 MHC 改質之 ATO 中經 TCR 改造 T 細胞之增強的正向選擇胸腺中之正向選擇係藉由T細胞前體上之TCR與胸腺基質及造血細胞上之自身MHC之間的相互作用來調介。因此，研究ATO中「自身」MHC之造血或基質表現是否可增強經TCR改造T細胞之正向選擇。使用HLA-A*02:01陽性或陰性供體來測試自身MHC之造血表現對ATO內之正向選擇之效應，且藉由使用經HLA-A*02:01轉導之MS5-hDLL1細胞產生ATO來測試基質細胞MHC表現(圖8A)。在所有情形下，用HLA-A*02:01限制性NY-ESO-1特異性TCR轉導HSPC，且使用四聚體+CD3+CD8SP T細胞之頻率作為正向選擇之讀出。HLA-A*02:01之造血表現對四聚體+CD8SP T細胞之正向選擇僅發揮適度效應(圖8B)。相比之下，ATO基質細胞中HLA-A*02:01之表現顯著增強四聚體+CD8SP T細胞之正向選擇，且與供體造血HLA-02:01表現協同作用(圖8B)。MHC改質之ATO中經TCR改造之T細胞亦展現至成熟初始表型之較大成熟，包括CCR7上調(圖8C)，此與增強的正向選擇一致。總而言之，包含經TCR轉導之HSPC及經MHC轉導之基質細胞之ATO係用於對活體外人類T細胞之正向選擇建模之通用系統，以及增強用於授受性細胞療法之活體外源經TCR改造T細胞之正向選擇及成熟的簡單方法。 B. 註解忠實地重演活體外胸腺細胞生成之能力創造了用於產生具有期望治療特性(包括抗原初始狀態及缺少內源TCR表現)之經改造T細胞之獨特機會。如此處使用標準化現成組份所展示，ATO系統忠實地重演來自HSPC之胸腺細胞生成，從而使極類似於來自胸腺或末梢血之初始T細胞之成熟CD3+TCRαβ+CD8SP及CD4SP T細胞之產生達到極點。 ATO提供與現有活體外T細胞分化方法(例如OP9-DL1系統)相比不同之生物及轉化優點。第一，ATO支持人類T細胞之正向選擇及成熟，該二者在單層系統中受損。ATO中增強的正向選擇依賴於3D結構，此乃因用相同ATO組份設定之單層培養物產生無效T細胞分化。此與支持使用胸腺組份之FTOC或再聚集3D培養物中之正向選擇一致，但效率較低。3D相互作用可藉由增加T細胞前體與發育配體(例如DLL1)或選擇性配體(例如自身MHC)之間之化合價及/或接觸持續時間來支持T細胞發育。或者，3D構形可經由機械力及/或2D中原本不可能之代謝變化來促進基質與造血細胞之間之串擾或產生T細胞前體上之發育信號。 ATO系統優於現有方法之另一主要進步係來自臨床上相關之成人HSPC來源(包括骨髓及靜止的或經動員末梢血)之高度有效之T細胞分化。使用OP9-DL1系統之研究顯示來自CB、BM或MPB16-19之TCRαβ+ T細胞之無效發育，且業內未報導關於靜止的末梢血之HSPC數據。使用出生後胸腺源CD34+細胞已報導OP9-DL1上經改良之T細胞發育，此與由胸腺微環境引發該等祖細胞群一致，然而，人類胸腺保留用於治療轉化之不切實際之HSPC來源。 ATO系統亦提供技術簡單性、再現性及潛在可擴縮性。使用無血清培養基避免在單層系統中使用胎牛血清所觀察到之顯著變異性，且利用簡單培養基變化維持ATO完整達培養持續時間(高達12週)之能力避免細胞頻繁轉移至新鮮基質細胞中，如使用單層系統所必需。使用現成組份及特定而言避免原代基質細胞或專有支架材料以及組合ATO產生與不含異源成份之試劑及基質細胞輻照之能力應促進ATO轉化至臨床級平臺以產生用於授受性療法之T細胞。該系統之簡單性亦容許在對人類T細胞發育及正向選擇建模感興趣之實驗室中直接採取該方法。 如此處所展示，ATO系統係在活體外自HSPC產生經TCR改造之初始T細胞之高度有效之方法。在OP9-DL1系統中已展示來自人類HSPC之經TCR改造T細胞之分化，然而在該等情形下，至CD8SP細胞之成熟受損(通常僅代表0-2%之培養物)，且使用胸腺源CD34+細胞達成最高效率。相比之下，ATO支持來自CB HSPC之經TCR改造T細胞之穩健的正向選擇，且使用MPB HSPC觀察到類似結果(未顯示)。基於顯示授受性轉移之T細胞之經改良活體內存活率及活性與較少活化表型相關之研究，在ATO中達成之成熟初始T細胞表型可係ATO源經改造細胞優於經改質末梢血T細胞之獨特優點。藉由在基質細胞中表現同源MHC增強ATO中經改造T細胞之正向選擇可提供增加ATO源經改造T細胞之品質及產率之另一途徑。 在整個T細胞分化期間在ATO中經轉導TCR之存在調介內源TCR基因座之幾乎完全之等位基因排除，此與使用移植鼠類及人類HSPC之活體內研究一致。經改造末梢血T細胞上潛在同種異體反應性內源TCR之表現係研發可擴縮現成授受性T細胞療法之主要障礙，該等療法當前需要自體經改造T細胞之勞動密集型個別化產生。研發同種異體經改造T細胞療法之策略包括使用基因編輯工具或TCR轉導病毒特異性T細胞來破壞內源TCR/CD3表現；然而，該兩種策略需要基因修飾T細胞之廣泛操縱及擴增，此可能損害活體內功能。因此，使用ATO重新產生初始經等位基因排除之經改造T細胞呈現產生用於授受性細胞療法之非同種異體反應性T細胞之高度有效之替代策略。 C. 方法 1. 人類 CD34+CD3- HSPC 之分離新生臍帶血係自在UCLA正常分娩之廢棄胎盤獲得。骨髓(BM)係經由在UCLA收穫同種異體BM供體之廢棄材料自健康成人供體獲得或購自AllCells Inc. (Alameda, CA)。G-CSF動員之末梢血係在UCLA自同意經歷血球分離用於同種異體幹細胞移植捐贈之健康成人供體獲得。未經動員之末梢血係經由UCLA CFAR Virology Core自健康成人供體獲得。所有組織樣品係在經UCLA IRB核准之方案或豁免下獲得。藉由Ficoll-Paque (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA)梯度離心、然後藉由磁細胞分選(MACS)使用CD34微球套組UltraPure (Miltenyi, Auburn CA)對CD34+細胞進行正向選擇來對所有樣品富集單核細胞。除非另外註明，否則在MACS後將CD34+細胞富集之部分冷凍保存。在使用之前，將細胞解凍且藉由FACS藉由分選CD34+CD3-細胞排除殘餘T細胞，將其立即接種至ATO中或如下文所述轉導。在一些實驗中，藉由FACS分選對HSC富集Lin-CD34+CD38-細胞，然後接種於ATO中。由UCLA免疫遺傳學中心(UCLA Immunogenetics Center)使用高解析度序列特異性寡核苷酸(SSO)珠粒實施HSPC之HLA分型。 2. 人類骨髓祖細胞子集之分離如上述，自新鮮BM吸出物富集CD34+ HSPC，且基於CD45之陽性表現及譜系標記物(CD3、CD14、CD19、CD56及CD235a；「Lin-」)與以下標記物之組合之不表現，立即藉由FACS針對幹細胞/祖細胞群進行分選：全HSPC (CD34+)、HSC (CD34+CD38-CD45RA)、LMPP (CD34+CD38+CD45RA+CD10-CD62Lhi)、CD24- CLP (CD34+CD38+CD45RA+CD10+CD24-)及CD24+ CLP (CD34+CD38+CD45RA+CD10 CD24+)。 3. 人類胸腺細胞之分離出生後人類胸腺係在IRB豁免下自在洛杉磯兒童醫院(Children’s Hospital Los Angeles) (CHLA)經歷心臟手術之患者之廢棄物獲得。將胸腺片段在RPMI中充分切碎且藉由抽吸破壞以將胸腺細胞釋放至懸浮液中，然後穿過70 µm耐綸篩濾器。在當天或第二天分析新鮮細胞。胸腺及ATO源T細胞祖細胞之流式細胞測量術分析使用以下表面表型：早期胸腺祖細胞(ETP；CD34+CD7-CD1a-)、CD1a-原T (CD34+CD7+CD1a-)及CD1a+原T (CD34+CD7+CD1a+)；或CD5-原T (原T1；CD34+CD7+CD5-)及CD5+原T (原T2；CD34+CD7+CD5+)。胸腺及ATO源T細胞及前體定義為CD14-CD56-與以下表型之組合：全T譜系細胞(CD7+CD5+)、雙陰性(DN；CD4-CD8-)、CD4不成熟單陽性(CD4ISP；CD5+CD4+CD3)、雙陽性(DP；CD4+CD8+)、CD8SP (CD3+TCRαβ+CD8+CD4-)、CD4SP (CD3+TCRαβ+CD8-CD4+)、不成熟初始(為CD8SP或CD4SP之CD45RA-CD45RO+)、成熟初始(為CD8SP或CD4SP之CD45RA+CD45RO-)。不成熟及成熟初始表型係藉由針對CD1a、CD27、CD28及CCR7共染色來確認。 4. 細胞系MS-5鼠類基質細胞系係以饋贈方式獲得。為產生MS5-hDLL1，用編碼人類DLL1及GFP之慢病毒載體轉導MS-5細胞。藉由FACS分選最高5%之GFP表現細胞且在DMEM/10% FCS中傳代。在培養若干週後藉由針對GFP表現之流式細胞測量術來確認穩定表現。藉由用人類HLA-A*02:01慢病毒載體(來自Dr. David Baltimore, Caltech之饋贈)轉導MS5-hDLL1細胞、然後使用識別人類HLA-A2之抗體(BB7.2) (Biolegend, San Diego, CA)對經轉導細胞進行FACS分選來產生MS5-hDLL1-A2.1細胞。OP9-DL1細胞系係來自Dr. Juan Carlos Zúñiga-Pflücker (University of Toronto)之饋贈，且使其在0.1%明膠塗覆之搖瓶中之MEMα (ThermoFisher Scientific, Grand Island, NY)/20% FBS中傳代。K562細胞系係自ATCC獲得。K562-CD80/HLA-A*02:01/NY-ESO-1 aAPC細胞系係來自Dr. Antoni Ribas (UCLA)之饋贈。 5. 人工胸腺類器官 (ATO) 培養物藉由胰蛋白酶化收穫MS5-hDLL1 (或MS-5或OP9-DL1，如所註明)細胞且將其重懸浮於由以下各項構成之無血清ATO培養基(「RB27」)中：RPMI 1640 (Corning, Manassas, VA)、4% B27補充物(ThermoFisher Scientific, Grand Island, NY)、30 mM於PBS中重構之L-抗壞血酸2-磷酸鹽倍半鎂鹽水合物(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)、1%青黴素(penicillin)/鏈黴素(streptomycin) (Gemini Bio-Products, West Sacramento, CA)、1% Glutamax (ThermoFisher Scientific, Grand Island, NY)、5 ng/ml rhFLT3L及5 ng/ml rhIL-7 (Peprotech, Rocky Hill, NJ)。每週新鮮製備RB27。在所指示實驗中用4%不含異源成份之B27取代B27。端視實驗，於1.5 ml埃彭道夫管(Eppendorf tube)中合併1.5-6×10 5個MS5-hDLL1細胞與5×10 2-1×10 5個經純化CD34+CD3-細胞(或其他HSPC群，如所指示)/ATO，且在4℃下在搖擺鬥離心機中在300 g下離心5 min。小心地移除上清液且藉由短暫渦旋重懸浮細胞沈澱物。對於每一ATO，將0.4 µm Millicell transwell插入物(EMD Millipore, Billerica, MA；目錄號PICM0RG50)置於含有1 ml RB27/孔之6孔板中。為平鋪ATO，取出插入物且將其置於板之邊緣上以排出過量培養基。將細胞漿液調節至5-8 µl/ATO，用20 µl吸量管尖端吸取且藉由在吸量管尖端之末端形成液滴來平鋪，將該液滴輕柔地沈積至細胞插入物上。將細胞插入物放回含有1 mL RB27之孔中。每3-4天藉由自細胞插入物周圍吸出、然後用含有新鮮RB27/細胞介素之1 ml替代來完全更換培養基。以此方式將ATO培養至多12週。在所指示時間，藉由將FACS緩衝液(PBS/0.5%牛血清白蛋白/2 mM EDTA)添加至每一孔中，且藉由用1 ml 「P1000」吸量管抽吸使ATO短暫解聚、然後穿過70 µm耐綸篩濾器來收穫ATO細胞。在一些實驗中，在用於ATO中之前以所指示劑量γ-輻照MS5-hDLL1細胞之單細胞懸浮液。 6.   T 細胞單層共培養物如業內先前所述設定OP9-DL1單層培養物。簡言之，在使用之前1-2天將OP9-DL1接種至0.1%明膠塗覆之12孔板中，以達成70%-80%鋪滿。自單層吸出培養基且將1×10 4-1.5×10 4個經純化CD34+CD3- HSPC平鋪於2 ml由MEMα、20% FBS、30 mM L-抗壞血酸、5 ng/ml rhFLT3L及5 ng/ml rhIL-7構成之培養基中之基質單層上。在一些實驗中，用MS-5或MS5-hDLL1取代OP9-DL1，且將RB27取代為培養基。每4-5天藉由收穫細胞、經由70 µm耐綸篩濾器過濾並再平鋪於新鮮培養基中將細胞轉移至新基質細胞單層。當鋪滿時，將細胞分至多個含有新鮮基質層之孔中。使培養物維持至多10週。 7. 慢病毒載體及轉導藉由RT-PCR自人類通用參考RNA集合(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)將人類DLL1之全長編碼序列選殖至第三代慢病毒載體pCCL-c-MNDU3-X-IRES-eGFP (來自Dr. Donald Kohn, UCLA之饋贈)中。HLA-A*02:01慢病毒載體pHAGE6-HGHSS-HLAA2.1-IRES-ZsGreen係來自Dr. David Baltimore (Caltech)之饋贈。編碼特異性針對HLA-A*02:01/NY-ESO-1 157-165之密碼子最佳化TCR之α及β鏈之第三代慢病毒載體先前已經闡述，且係來自Dr. Antoni Ribas (UCLA)之饋贈。如先前所述實施慢病毒顆粒之包裝及濃縮。簡言之，使用TransIT 293T (Mirus Bio, Madison, WI)用慢病毒載體質體pCMV-∆R8.9及pCAGGS-VSVG將293T細胞(ATCC)共轉染17小時，然後用20 mM丁酸鈉處理8小時，隨後使細胞上清液在無血清UltraCulture中傳代48小時。根據製造商之方案藉由切向流過濾使用Amicon Ultra-15 100K過濾器(EMD Millipore, Billerica, MA)濃縮上清液，且儲存在下-80℃下。對於HSPC轉導，將1×10 5-1×10 6個FACS分選之CD34+CD3- HSPC於塗覆有20 µg/ml Retronectin (Clontech, Mountain View, CA)之6孔未經處理板中之1 ml補充有50 ng/ml重組人類SCF、FLT3L及TPO及10 ng/ml IL-3 (Peprotech, Rocky Hill, NJ)之X-VIVO-15 (Lonza, Basel, Switzerland)中平鋪12-18 h，然後以感染複數(MOI) 100添加經濃縮之慢病毒上清液。將經模擬物轉導之細胞培養於相同條件下但不添加載體。在轉導後24小時收穫細胞，洗滌，且接種至ATO中。除非有指示，否則經TCR轉導之HSPC來自HLA-A*02:01+ CB單元。 8. 免疫組織化學對於蘇木素及伊紅(H&E)影像，將ATO包埋於Histogel (ThermoFisher Scientific, Grand Island, NY)中且在10%中性緩衝福馬林(ThermoFisher Scientific, Grand Island, NY)中固定過夜。由UCLA Translational Pathology Core Laboratory (TPCL)實施5 µm切片及H&E染色。對於免疫螢光成像，藉由用解剖刀切割每一ATO周圍之培養插入物、然後將膜及ATO包埋於Tissue-Tek OCT (VWR Radnor, PA)中且冷凍於乾冰上來分離ATO。將5 μm冷凍切片固定於10%中性緩衝福馬林中，且在4℃下用以1:50稀釋之抗CD3 (純系UCHT1；Biolegend, San Diego, CA)染色過夜，然後在室溫下與AlexaFluor 594偶聯之抗小鼠IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)一起培育。在Zeiss AzioImager M2上使用AxioCam MRM及AxioVision軟體(Zeiss, Jena, Germany)獲取H&E及免疫螢光影像。 9. 細胞內細胞介素染色藉由FACS使用抗CD8及抗CD4抗體分選來自ATO之CD8SP、CD4SP或DP細胞且平鋪於96孔U形底板中之200 µl含有5%熱不活化人類AB血清(Gemini Bio-Products, West Sacramento, CA)之AIM V (ThermoFisher Scientific, Grand Island, NY)中。將PMA/離子黴素/蛋白質運輸抑制劑混合劑或對照蛋白質運輸抑制劑混合劑(二者皆來自eBioscience, San Diego, CA)添加至每一孔中且培育過夜。針對CD3、CD4及CD8 (Biolegend, San Diego, CA)及UV455可固定活力染料(eBioscience, San Diego, CA)對細胞染色，然後用細胞內染色緩衝液套組(eBioscience, San Diego, CA)固定及透化，並用針對IFNγ及IL-4之抗體(Biolegend, San Diego, CA)進行細胞介素染色。 10. T 細胞活化及增殖分析對於CFSE增殖分析，根據製造商之方案，藉由FACS分選ATO源CD8SP T細胞且用5 µM CFSE (Biolegend, San Diego, CA)標記。將經標記細胞與抗CD3/CD28珠粒(ThermoFisher Scientific, Grand Island, NY)於補充有5% AB血清及20 ng/ml rhIL-2 (Peprotech, Rocky Hill, NJ)或單獨IL-2之AIM V中一起培育，在第5天時針對CD25 (Biolegend, San Diego, CA)共染色，且藉由流式細胞測量術來分析。對於活體外細胞擴增分析，將1×10 4個經FACS分選之ATO源CD8SP T細胞平鋪於96孔U形底板中之200 µl補充有20 ng/ml rhIL-2及1×抗CD3/CD28四聚體抗體複合物(Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Canada)之Immunocult XF培養基(Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Canada)中。每2-3天添加新鮮培養基及細胞介素，且視需要再平鋪至較大孔中。在第7天及第14天時添加新鮮抗CD3/CD28。每週用血球計對細胞計數。 11. 人工 APC (aAPC) CTL 引發分析自第6週經TCR轉導之ATO分選總共5×10 4個ATO源CD8SP T細胞，且以5:1 T細胞:K562比率與表現CD80及HLA-A*02:01/B2M/NY-ESO-1 157-165單鏈三聚體之基於K562之aAPC (來自Dr. Antoni Ribas, UCLA之饋贈)或親代K562細胞於96孔U形底板中之200 µl AIM V/5%人類AB血清中共培養過夜。以1:50最終稀釋將CD170a-APC抗體(Biolegend, San Diego, CA)與蛋白質運輸抑制劑混合劑(eBioscience, San Diego, CA)一起添加至孔中持續培養最後4小時，然後固定、透化且進行細胞內細胞介素染色，如上文所述。 12. TCR Vβ 分析結合IOTest Beta Mark TCR V套組(Beckman Coulter, Indianapolis, IN)，針對CD3、CD4、CD8及TCRγδ對來自第7週ATO或出生後胸腺之總細胞染色。對CD3+TCRgd-CD8+CD4-細胞設門用於Vβ分析。對於經TCR轉導之ATO，亦用APC偶聯之HLA-A*02:01/NY-ESO-1 157-165四聚體(MBL International, Woburn, MA)標記第6週總ATO細胞，且針對CD3+TCRγδ-四聚體+CD8+CD4-設門用於Vβ分析。 13. 流式細胞測量術及抗體使所有流式細胞測量術染色在冰上在PBS/0.5% BSA/2 mM EDTA中實施30 min。經5 min將FcX (Biolegend, San Diego, CA)添加至所有樣品中，然後進行抗體染色。對於四聚體共染色，在室溫下經10分鐘將PE或APC偶聯之四聚體(MBL International, Woburn, MA)以1:50最終稀釋添加至細胞中，然後再經20分鐘在冰上添加抗體。在分析之前將DAPI添加至所有樣品中。在LSRII Fortessa上實施分析，且在UCLA布勞德幹細胞研究中心流式細胞測量術核心(UCLA Broad Stem Cell Research Center Flow Cytometry Core)之ARIA或ARIA-H儀器(BD Biosciences, San Jose, CA)上實施FACS。對於所有分析，設門選出DAPI+細胞，且基於FSC-H對FSC-W及SSC-H對SSC-W特徵對單細胞設門。用於表面及細胞內染色之抗體純系係自Biolegend (San Diego, CA)獲得：CD1a (HI149)、CD3 (UCHT1)、CD4 (RPA-T4)、CD5 (UCHT2)、CD8 (RPA-T8)、CD10 (6H6)、CD14 (M5E2)、CD19 (HIB19)、CD24 (ML5)、CD25 (BC96)、CD27 (O323)、CD28 (CD28.2)、CD31 (WM59)、CD34 (581)、CD38 (HIT2)、CD45 (HI30)、CD45RA (HI100)、CD45RO (UCHL1)、CD56 (HCD56)、CD107a (H4A3)、CD127 (A019D5)、CD235a (HI264)、CCR7 (G043H7)、HLA-A2 (BB7.2)、干擾素γ (4S.B3)、IL-4 (MP4-25D2)、TCRαβ (IP26)、TCRγδ (B1)、Vβ13.1 (H131)、人類譜系混合劑(CD3、CD14、CD19、CD20、CD56)；或自BD Biosciences (San Jose, CA)獲得：CD7 (M-T701)及CD62L (DREG-56)。 實例 3 ：人工胸腺類器官誘導來自人類造血幹細胞之經 TCR 改造 T 細胞之正向選擇及等位基因排除經改造T細胞療法為治療癌症及慢性病毒感染提供空前機會。直接自造血幹細胞及祖細胞(HSPC)產生經改造T細胞之能力可克服與使用末梢血T細胞相關之關鍵治療限制，包括同種異體反應性。此實例闡述臨床上相關之人工胸腺類器官(ATO)系統，其支持來自臍帶血、骨髓及末梢血HSPC之天然及經TCR改造之人類T細胞的高度有效之活體外分化及正向選擇。ATO源T細胞展現初始表型、多樣TCR譜及TCR依賴性活化及增殖。經TCR改造之ATO源T細胞亦成熟至初始表型且另外顯示活體外及活體內抗原特異性腫瘤殺死且幾乎完全缺少內源TCR Vβ表現，此與等位基因排除之誘導一致。因此，ATO呈現產生用於授受性細胞療法之初始及潛在非同種異體反應性經改造T細胞之有效方法。 使用經改造以表現抗原特異性T細胞受體(TCR)之T細胞之授受性細胞療法提供惡性病及慢性病毒感染之靶向及潛在治癒性治療。當前策略依賴於成熟循環T細胞之基因修飾及離體擴增。該等方法具有若干治療限制，包括再輸注後有限的活體內活性及經轉導與內源TCR鏈之間之錯配，且可降低抗原特異性反應性或自體免疫性誘導。此外，由內源TCR表現賦予之同種異體反應性已限制大多數方法使用自體T細胞，此可因增加的成本、有限的產生能力及淋巴球減少症環境下之患者不合格性而最終限制療法之使用。在活體外自造血幹細胞及祖細胞(HSPC)產生經改造T細胞可藉由同時容許重新產生初始抗原特異性T細胞且經由等位基因排除抑制內源TCR表現來解決該等問題。 由於胸腺中T細胞發育之時空複雜性，活體外T細胞分化之方法迄今無法完整重演人類T細胞發育。該等方法之主要進步係發現經Notch配體轉導之鼠類基質細胞系可支持來自鼠類或人類HSPC之活體外T細胞分化，如在經典OP9-DL1共培養系統中所展示。在此及類似單層系統中，人類HSPC經歷T譜系定型及早期T細胞分化。然而，具有有成效重排TCR之T細胞前體之正向選擇受損，且可見至CD8+或CD4+單陽性(SP) T細胞之最小成熟。本發明者已顯示使用鼠類或人類胸腺組織之三維(3D)類器官系統支持活體外人類T細胞經改良之正向選擇及成熟。然而，該等系統因低細胞輸出、高實驗變異性及對原代胸腺組織之依賴性而不適於產生用於治療應用之T細胞。因此，本發明者致力於研發出能夠支持來自HSPC之人類T細胞之分化及正向選擇、同時保留關鍵轉化性質(例如標準化組份、再現性及可擴縮性)之人工類器官系統。 此實例顯示基於經DLL1轉導之基質細胞系及無血清現成組份之人工胸腺類器官(ATO)系統之研發。與單層系統不同，ATO支持來自人類臍帶血、骨髓及末梢血CD34+ HSPC之人類CD3+TCRαβ+CD8SP及CD4SP T細胞之穩健活體外分化、正向選擇及成熟。ATO源成熟T細胞展現抗原初始表型、多樣TCR譜及因應抗原刺激之活化/增殖。ATO亦支持來自經特異性針對腫瘤相關抗原NY-ESO-1之HLA-A*02:01限制性TCR轉導之HSPC之經TCR改造之抗原特異性T細胞的高度有效之分化。藉由在ATO基質細胞中表現同源主要組織相容性複合物(MHC)來進一步增強經TCR改造T細胞之正向選擇。經TCR改造之ATO源T細胞展現初始表型且經歷抗原特異性活化及穩健的活體外及活體內腫瘤殺死。最後，在ATO中產生之經TCR改造之T細胞展現幾乎完全缺少內源Vβ TCR表現，此與在發育期間等位基因排除之誘導一致，且表明產生用於授受性細胞療法之非同種異體反應性經改造T細胞之直接且有效之方法。 I. 結果 A. 用於活體外人類 T 細胞分化之最佳化人工胸腺類器官系統之研發目標係研發出可支持來自HSPC之人類T細胞之活體外正向選擇及成熟的臨床上可轉化之類器官系統。為避免使用原代胸腺組織，本發明者測試經DLL1轉導之基質細胞系支持3D類器官培養物中之人類T細胞發育之能力。觀察到端視特定胎牛血清批次，OP9-DL1系統中之T細胞分化高度可變，且本發明者尋求鑑別能夠一致地支持類器官培養物中之T細胞分化之無血清條件。為避免使用專有支架材料，利用緊密再聚集技術，顯示其可有效地用於基於胸腺組織之類器官中，其中藉由離心使基質細胞與HSPC聚集在一起且佈置在空氣-流體界面之細胞培養插入物上(圖3A)。在該等3D培養物中，本發明者鑑別出強烈支持來自T細胞清除CD34+臍帶血(CB) HSPC之人類T細胞分化的經人類DLL1轉導之MS-5鼠類骨髓基質細胞系(下文稱為MS5-hDLL1)。此外，本發明者鑑別出補充有B27 (用於神經元及胚胎幹細胞培養物中之多組份添加劑)及FLT3L、IL-7及抗壞血酸(下文稱為「RB27」)之RPMI作為新穎無血清培養基，其一致地支持MS5-hDLL1類器官培養物中之穩健人類T細胞分化。 此最佳化人工胸腺類器官(ATO)系統誘導快速且穩健的來自CB CD34+CD3- HSPC之T譜系定型，如藉由截至第2週CD5+CD7+細胞之優勢及CD4+CD3-不成熟單陽性(ISP)細胞及CD4+CD8+ (DP)細胞之出現所顯示(圖3B)。更多成熟CD3+TCRαβ+細胞早在第4週即出現，且隨時間增多，在第6週時達到約30%之平均值(圖3B、14A)。亦產生較小部分CD3+TCRγδ+ T細胞(圖14A)。CD3+TCRαβ+細胞在早期時間點主要為DP (圖14A)，但逐漸成熟至CD8SP且在較小程度上成熟至CD4SP T細胞，此與ATO中之正向選擇一致。 CD34+祖細胞在所研究之所有時間點保持可在ATO中檢測到，且在6週時仍包括胸腺T細胞祖細胞之所有三個表型階段：多能CD34+CD7-CD1a-早期胸腺祖細胞(ETP)及發育下游CD34+CD7+CD1a-及CD34+CD7+CD1a+ T譜系祖細胞(圖3C)。基於替代分類方案亦在CD34+部分內鑑別出原T1及原T2祖細胞表型(圖3C)。CD19+ B細胞頻率隨時間減小，且NK及骨髓樣頻率始終較低(圖3B、14A)。ATO之組織學切片展示具有大量淋巴樣細胞之緻密組織樣架構(圖19)，其叢對CD3呈陽性(圖3D)。 在6週時每一ATO通常產生總共約2×10 6個細胞(圖14B)；然而，ATO細胞產量/HSPC與所接種HSPC之數量及HSPC對基質細胞比率呈負相關，且在最低比率下產生4-5,000個細胞/HSPC之產量(圖20A)。ATO中前體及成熟T細胞之頻率在不同起始HSPC數及比率下相似(圖20B)，但用大量基質細胞(6×10 5個/ATO)產生之ATO除外，其顯示受損的成熟T細胞發育。因此，將最佳HSPC對基質細胞比率為1:20 (通常7500個HSPC:6×10 5個基質細胞/ATO)之較小ATO用於進一步實驗。在技術重複(n=11)及四個不同批次之B27中觀察到細胞輸出及T細胞分化二者之高再現性(圖21A-D)。就轉化相關性而言，在使用補充有不含異源成份之B27 (含有人類血清白蛋白) (圖21E-F)或含有輻照基質細胞(圖21G-J)之培養基之ATO中亦可見相當T細胞分化及細胞輸出。藉由簡單機械破壞及細胞懸浮液收集達成在ATO中產生之造血細胞之回收，此產生＞99% CD45+造血細胞及＜0.5%基質細胞(圖21K)。 當與使用相同供體CB HSPC之OP9-DL1單層培養系統相比時，ATO揭露顯著優異之CD3+TCRαβ+ T細胞產生(圖11A、22)。與先前報導一致，OP9-DL1單層支持有效的T譜系定型(CD7+CD5+)及進展通過ETP、原T及CD4 ISP階段，但不支持DP、CD3+TCRαβ+及成熟SP細胞之無效產生，所有該等細胞容易地在ATO中進行發育(圖11A、22)。實際上，最佳正向選擇及成熟需要ATO系統之所有三種組份：3D結構、MS5-hDLL1基質細胞及RB27培養基(圖11A)，此乃因OP9-DL1在RB27中存活較差且顯示較差地支持3D培養物中之T細胞分化。缺少DLL1表現之親代MS-5細胞系不支持單層或3D培養物中之T細胞發育(圖11A)。 總而言之，ATO提供標準化無血清3D系統，其支持來自CD34+ HSPC之穩健及可再現T細胞分化，從而容許人類TCRαβ+ T細胞之正向選擇及成熟。 B.  ATO 中胸腺初始 T 細胞發育之重演隨後比較ATO中之T細胞分化與出生後人類胸腺中之T細胞分化。第12週CB ATO顯示T譜系定型(CD5+CD7+)及CD34+祖細胞與胸腺相似之頻率 ( 圖 4A) 。如在胸腺中，ATO中之大多數CD3+ T細胞為TCRαβ+，但亦一致地可見可容易檢測到之TCRγδ+群 ( 圖 4A) 。在ATO源CD3+TCRαβ+細胞中，成熟CD8SP及CD4SP T細胞之產生在第6-12週之間增加 ( 圖 4B 及圖 12A-C) 。與胸腺相比，ATO展現相對於CD8SP T細胞比例較小之CD4SP T細胞。 如在胸腺中，ATO源CD3+TCRαβ+CD8SP及CD3+TCRαβ+CD4SP T細胞自「不成熟初始」表型(CD45RA-CD45RO+CD27+CCR7-CD1Ahi)過渡至「成熟初始」表型(CD45RA+CD45RO-CD27+CCR7+CD1alo) ( 圖 4C 、 12A-C) 。在ATO中此發生在第6-12週之間，且第12週ATO產生高於胸腺中之成熟初始T細胞頻率 ( 圖 4C 、 12B-C) 。不成熟及成熟初始子集二者共表現CD62L及CD28，且子集共表現CD127及CD31，後者標記物與血液中新近胸腺遷出之T細胞相關 ( 圖 12B-C) 。活化標記物CD25不在ATO源CD8SP T細胞上表現，但在CD4SP T細胞子集上觀察到 ( 圖 12B-C) 。總之，該等數據顯示在ATO中與人類胸腺相比顯著的T細胞分化保真度，此使與胸腺及血液中所發現之彼等類似之真實初始T細胞之出現達到極點。 鑒於成熟CD4SP T細胞在ATO中較晚出現，假定樹突細胞亦可在ATO中發育且經由II類MHC表現調介正向選擇。實際上，稀有HLA-DR+細胞以與胸腺中相似之頻率存在於ATO中 ( 圖 23A) 。此群之進一步分析揭露抗原呈遞細胞包括單核球、B細胞及漿細胞樣、CLEC9A+及CD1c+樹突細胞，所有該等細胞亦存在於胸腺中( 圖 23B)。 C. 來自多個 HSPC 來源及子集之 T 細胞分化自所有臨床上相關之HSPC來源(即成人骨髓(BM)、經G-CSF動員之末梢血(MPB)及未經動員之末梢血(PB))可見具有相似的前體及CD3+TCRαβ+ T細胞頻率之ATO中之有效T細胞分化 ( 圖 3A-B 、 15A-B 、 13A-B) 。來自該等來源亦及來自胸腺之HSPC顯示不同的T細胞分化動力學( 圖 15A)，然而，T細胞輸出在不同HSPC來源中相當 ( 圖 3d) 。自CB、BM或MPB高度富集之造血幹細胞(HSC)部分(lin-CD34+CD38-)展示同樣穩健之T細胞分化 ( 圖 5C-D 、 13D-E) 。ATO亦誘導自BM分離之經純化淋巴樣祖細胞之T細胞分化(圖15C-D ) 。淋巴樣引發之多能祖細胞(LMPP)及CD24共同淋巴樣祖細胞(CLP)之分化更快於HSC (未顯示)或未分級CD34+lin- HSPC ( 圖 24A-B) 。相比之下，主要具有B及NK細胞潛能之CD24+ CLP在ATO中產生較差T細胞分化及細胞輸出 ( 圖 15C-D 、 24A) 。因此，ATO可用作評估來自人類幹細胞及祖細胞群之T譜系潛能之工具。 D.  ATO 源 T 細胞之 TCR 多樣性及功能與胸腺類似， RAG1及 RAG2在ATO源DP中表現 ( 圖 25A) 。ATO源CD3+TCRαβ+CD8SP ( 圖 16A)及CD3+TCRαβ+CD4SP ( 圖 25B)T細胞中TCR Vβ家族使用之流式細胞測量術分析揭露與來自人類胸腺之相應T細胞顯著相似之多樣性。另外，藉由對TCR Vα及Vβ CDR3區域深度測序可見CD3+TCRαβ+CD8SP中高度多樣之TCR譜，此與胸腺CD8SP細胞及PB初始CD8+ T細胞中之TCR譜相當 ( 圖 16B-C) 。重要的是，未觀察到偏斜的Vα或Vβ使用，此批駁非習用T細胞子集或經純系擴增之成熟T細胞在ATO中之優勢。 ATO源CD8SP T細胞展現因應PMA/離子黴素之多功能IFNγ、TNFα及IL-2產生，此與細胞毒性表型一致( 圖 16D)，以及因應抗CD3/CD28及IL-2刺激之穩健增殖及CD25及4-1BB上調 ( 圖 16E) 。ATO源CD4SP細胞產生IFNγ及IL-2且因應抗CD3/CD28及IL-2增殖 ( 圖 25C-D) 。在14天內使用抗CD3/CD28及IL-2自ATO分離之CD8SP ( 圖 16F)及CD4SP ( 圖 25E)之數量分別擴增約60倍及約40倍。總而言之，在ATO中產生之成熟T細胞展現生理TCR多樣性及針對抗原刺激之功能反應。 E.  ATO 中初始經 TCR 改造 T 細胞之產生本發明者隨後使ATO適用於在活體外自HSPC產生經TCR改造之T細胞。用編碼特異性針對NY-ESO-1 157-165肽之HLA-A*02:01限制性TCR之密碼子最佳化α及β鏈的慢病毒載體轉導CB CD34+CD3-HSPC。在7週時，經TCR轉導之ATO顯示與經模擬物轉導之對照相似的CD5+CD7+ T譜系細胞頻率，但CD3+TCRαβ+ T細胞顯著增加，其中之大多數表現經轉導TCR，如藉由用四聚體或針對經轉導Vβ13.1鏈之抗體染色可見 ( 圖 7A) 。CD3+TCRαβ+四聚體+細胞與來自經模擬物轉導之對照之CD3+TCRαβ+細胞之間的CD8SP細胞頻率相似，然而，四聚體+CD8SP細胞顯示至成熟初始表型之加速成熟(即CD45RA+CD45RO-CD27+CCR7+CD1a lo) ( 圖 7A) 。應注意，四聚體+CD8SP細胞顯示習用CD8αβ T細胞表型但不表現CD16或CD56，其係與NK細胞及上皮內淋巴球相關之標記物 ( 圖 17A) 。TCR轉導亦產生來自ATO之顯著增強之細胞產量(平均約450個細胞/HSPC) ( 圖 17B)，其中之大多數為CD3+四聚體+ T細胞。因此，截至7週，起始於7,500個經TCR轉導之HSPC之單一ATO通常產生約4×10 6個細胞，其中約15% (6×10 5)為CD3+四聚體+ CD8SPCD45RA+成熟初始T細胞 ( 圖 7A 、 17B) 。來自經TCR轉導之ATO之ATO源CD8SP細胞經歷因應表現CD80及同源HLA-A*02:01/NY-ESO-1肽-MHC單鏈三聚體之人工抗原呈遞細胞(aAPC)、但不因應不相關HLA-A*02:01/MART-1 aAPC或親代K562細胞之抗原特異性活化(IFNγ、TNFα及IL-2產生)、去粒(CD107a膜動員) ( 圖 17C)及增殖( 圖 17ED)。此外，自經TCR轉導之ATO分離之CD8SP T細胞顯示因應抗CD3/CD28及IL-2或IL-7/IL-15之穩健擴增 ( 圖 17E)。另外，四聚體+細胞甚至在延長擴增及再活化後仍維持習用CD8αβ表型 ( 圖 26A) 。經TCR改造之ATO源T細胞中Vβ多樣性之流式細胞測量術分析揭露98%以上之四聚體+ CD8SP T細胞僅表現經轉導Vβ13.1區段 ( 圖 7F 、 26B)，此與在ATO中之經TCR改造T細胞分化期間內源Vβ表現之幾乎完全之等位基因排除一致。因此，ATO支持來自HSPC之功能性經TCR改造T細胞之穩健分化，且引入TCR增強細胞擴增並促進缺少內源TCR Vβ表現之成熟初始T細胞之分化。 為測試上述發現是否可延伸至NY-ESO-1 TCR外，使用密碼子最佳化之HLA-A*02:01限制性MART-1特異性TCR產生ATO。自該等ATO分離之CD3+四聚體+CD8SP展示初始T細胞表型 ( 圖 26C)，及因應MART-1 aAPC而非NY-ESO-1 aAPC上調的IFNγ及CD107a表面表現( 圖 26D)。 F. 在 MHC 改質之 ATO 中經 TCR 改造 T 細胞之增強的正向選擇胸腺中之正向選擇係藉由T細胞前體上之TCR與胸腺基質及造血細胞上之自身MHC之間的相互作用來調介。因此，研究ATO中「自身」MHC之增加的基質表現是否可增強經TCR改造T細胞之正向選擇。用HLA-A*02:01限制性NY-ESO-1特異性TCR轉導HLA-A*02:01陽性HPSC，且與對照MS5-hDLL1基質或經HLA-A*02:01轉導之MS5-hDLL1組合 ( 圖 27A) 。ATO基質細胞中HLA-A*02:01之表現增強四聚體+CD3+CD8SP T細胞之正向選擇 ( 圖 27A)，同時維持至成熟初始表型之正常分化 ( 圖 27B) 。 G.  ATO 源經 TCR 改造 T 細胞對抗原特異性腫瘤之殺死本發明者隨後測試經TCR改造之ATO源T細胞之抗原特異性細胞毒性。自經NY-ESO-1特異性TCR轉導之ATO分離且在活體外活化36小時之經純化CD8SP T細胞強效地誘導表現NY-ESO-1之細胞系(經HLA-A*02:01/NY-ESO-1 pMHC複合物轉導之K562細胞；及內源表現NY-ESO-1抗原之HLA-A*02:01+ U266多發性骨髓瘤細胞系)中之細胞凋亡，但顯示針對親代K562細胞或表現不相關HLA-A*02:01/MART-1 pMHC之K562細胞之極低活性(圖18A-B)。此外，在延長(14天)活體外擴增後保留抗原特異性細胞毒性，此與保留習用T細胞表型一致(圖18C)；細胞毒性類似於經同一時段擴增之經TCR轉導之PB CD8+ T細胞的細胞毒性(圖18C)。與該等結果一致，擴增的經TCR改造之ATO源T細胞能夠顯著控制皮下植入有表現同源(K562-ESO)而非不相關(K562-MART1) pMHC抗原之K562腫瘤之NSG小鼠中的疾病負荷(圖18D-F)。 II. 註解忠實地重演活體外胸腺細胞生成之能力創造了用於產生具有期望治療特性(包括抗原初始狀態及缺少內源TCR表現)之經改造T細胞之獨特機會。如此處使用標準化現成組份所展示，ATO系統有效地起始且維持來自HSPC之T細胞定型及分化之正常階段，從而使極類似於來自胸腺或末梢血之初始習用T細胞之成熟CD3+TCRαβ+CD8SP及CD3+TCRαβ+CD4SP T細胞之產生達到極點。 ATO提供與現有活體外T細胞分化方法相比不同之生物及轉化優點。第一，ATO支持人類T細胞之正向選擇及成熟，該二者在單層系統中受損。ATO中增強的正向選擇依賴於3D結構，此乃因用相同組份設定之單層培養物產生無效T細胞分化。此與在使用胸腺組份之FTOC或再聚集3D培養物中所觀察到之正向選擇一致，但效率較低。3D相互作用可藉由增加T細胞前體與發育配體(例如DLL1)或選擇性配體(例如自身MHC)之間之化合價及/或接觸持續時間來支持經改良之T細胞發育。或者，3D構形可經由機械力及/或2D中原本不可能之代謝變化來促進基質與造血細胞之間之串擾或產生T細胞前體上之發育信號。 ATO系統優於現有方法之另一主要進步係來自臨床上相關之成人HSPC來源(包括臍帶血、骨髓及靜止的或經動員末梢血)之高度有效之T細胞分化。當前單層系統僅允許來自CB、BM或MPB之TCRαβ+ T細胞之無效發育；業內未報導關於靜止的末梢血HSPC之數據。 如此處所展示，ATO系統亦可自HSPC產生經TCR改造之初始T細胞。在OP9-DL1系統中已展示來自人類HSPC之經TCR改造T細胞之分化，然而在該等報導中，至CD3+CD8SP細胞之成熟受損(通常僅代表0-2%之培養物)，且使用胸腺源CD34+細胞達成最高效率。相比之下，ATO支持來自CB HSPC之經TCR改造T細胞之穩健的正向選擇，且使用MPB HSPC觀察到類似結果(未顯示)。基於顯示授受性轉移之T細胞之經改良活體內存活率及活性與分化較差之活化表型相關之研究，在ATO中達成之成熟初始T細胞表型亦可為ATO源經改造細胞優於經改質末梢血T細胞之獨特優點。藉由在ATO基質細胞中表現同源MHC增強經TCR改造之初始T細胞之正向選擇可提供增加成熟ATO源抗原特異性T細胞之產率之另一途徑。 在整個T細胞分化期間在ATO中經轉導TCR之存在調介內源Vβ TCR基因座之幾乎完全之等位基因排除，此與移植鼠類及人類HSPC之活體內研究一致。經改造末梢血T細胞上潛在同種異體反應性內源TCR之表現係研發可擴縮現成授受性T細胞療法之主要障礙，該等療法需要自體經改造T細胞之勞動密集型個別化產生。研發同種異體經改造T細胞療法之策略包括藉由基因編輯或TCR轉導病毒特異性T細胞來破壞內源TCR/CD3表現；然而，該兩種方法需要基因修飾T細胞之廣泛操縱及擴增，此可能損害後續活體內功能。因此，使用ATO重新產生初始經等位基因排除之經改造T細胞呈現產生用於授受性細胞療法之非同種異體反應性T細胞之高度有效之替代策略。 ATO系統亦提供技術簡單性、再現性及潛在可擴縮性。使用無血清培養基避免在單層系統中使用胎牛血清所觀察到之顯著變異性，且利用簡單培養基變化維持ATO完整達培養持續時間(高達20週)之能力避免細胞頻繁轉移至新鮮基質細胞中，如使用單層系統所必需。高度純淨之T細胞群容易地藉由機械解離自ATO收集且可藉由標準方法進一步經純化以移除＜0.5%之污染基質細胞。使用現成組份及特定而言避免原代基質細胞或專有支架材料以及組合ATO產生與不含異源成份之試劑及基質細胞輻照之能力將簡化ATO轉化至臨床級平臺以產生用於授受性療法之T細胞。另外，該系統之簡單性容許在對人類T細胞發育及正向選擇建模感興趣之實驗室中直接採取該方法。 III. 方法 A. 人類 CD34+CD3- HSPC 之分離新生臍帶血係自在UCLA分娩之廢棄臍帶及胎盤單元獲得。骨髓(BM)係經由在UCLA收穫同種異體BM供體之廢棄材料自健康成人供體獲得或購自AllCells Inc. (Alameda, CA)。G-CSF動員之末梢血係在UCLA自同意經歷血球分離用於同種異體幹細胞移植捐贈之健康成人供體獲得。未經動員之末梢血係經由UCLA CFAR Virology Core自健康成人供體獲得。所有組織樣品係在經UCLA IRB核准之方案或豁免下獲得。藉由Ficoll-Paque (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA)梯度離心、然後藉由磁細胞分選(MACS)使用CD34微球套組UltraPure (Miltenyi, Auburn CA)對CD34+細胞進行正向選擇來對所有樣品富集單核細胞。除非另外註明，否則在MACS後將CD34+細胞富集之部分冷凍保存。在使用之前，將細胞解凍且藉由FACS藉由分選CD34+CD3-細胞清除殘餘T細胞，將其立即接種至ATO中或如下文所述轉導。在一些實驗中，藉由FACS分選對HSC富集Lin-CD34+CD38-細胞，然後接種於ATO中。用於TCR轉導實驗中之HSPC來自HLA-A*02:01+ CB單元。由UCLA免疫遺傳學中心使用序列特異性寡核苷酸(SSO)珠粒實施高解析度HLA-A2分型。 B. 人類骨髓祖細胞子集之分離如上述，自新鮮BM吸出物富集CD34+ HSPC，且基於CD45之陽性表現及譜系標記物(CD3、CD14、CD19、CD56及CD235a；「Lin-」)與以下標記物之組合之不表現，立即藉由FACS針對幹細胞/祖細胞群進行分選：全HSPC (CD34+)、HSC (CD34+CD38-CD45RA-)、LMPP (CD34+CD38+CD45RA+CD10-CD62L hi)、CD24- CLP (CD34+CD38+CD45RA+CD10+CD24-)及CD24+ CLP (CD34+CD38+CD45RA+CD10CD24+)。 C. 人類胸腺細胞之分離出生後人類胸腺係在IRB豁免下自在洛杉磯兒童醫院(CHLA)經歷心臟手術之患者之廢棄物獲得。將胸腺片段在RPMI中充分切碎且藉由抽吸破壞以將胸腺細胞釋放至懸浮液中，然後穿過70 µm耐綸篩濾器。在當天或第二天分析新鮮細胞。胸腺及ATO源T細胞祖細胞之流式細胞測量術分析使用以下表面表型：早期胸腺祖細胞(ETP；CD34+CD7-CD1a-)、CD1a-原T (CD34+CD7+CD1a-)及CD1a+原T (CD34+CD7+CD1a+)；或CD5-原T (原T1；CD34+CD7+CD5-)及CD5+原T (原T2；CD34+CD7+CD5+)。胸腺及ATO源T細胞及前體定義為CD14-CD56-與以下表型之組合：全T譜系細胞(CD7+CD5+)、雙陰性(DN；CD4-CD8-)、CD4不成熟單陽性(CD4 ISP；CD5+CD4+CD3-)、雙陽性(DP；CD4+CD8+)、CD8SP (CD3+TCRαβ+CD8+CD4-)、CD4SP (CD3+TCRαβ+CD8-CD4+)、不成熟初始(為CD8SP或CD4SP之CD45RA-CD45RO+)、成熟初始(為CD8SP或CD4SP之CD45RA+CD45RO-)。不成熟及成熟初始表型係藉由針對CD1a、CD27、CD28及CCR7共染色來確認。 D. 原代人類 T 細胞之分離如上文所述自胸腺細胞製劑分離胸腺T細胞，且如上文所述自單核細胞部分分離末梢血及臍帶血CD8+ T細胞。使用CD8+ T細胞分離套組(Miltenyi)藉由磁珠對自所有來源分離之CD8+ T細胞富集CD8SP T細胞。在一些實驗中，藉由FACS進一步純化胸腺T細胞以清除CD4 ISP或DP前體，且純化PB T細胞以分離初始T細胞(CD45RO-CCR7+)。 E. 細胞系MS-5鼠類基質細胞系係以饋贈方式獲得。為產生MS5-hDLL1，用編碼人類 DLL1及GFP之慢病毒載體轉導MS-5細胞。藉由FACS分選最高5%之GFP表現細胞且在DMEM/10% FCS中傳代。在培養若干週後藉由針對GFP表現之流式細胞測量術來確認穩定表現，且藉由qRT-PCR及DNA測序來確認 DLL1表現。藉由用人類HLA-A*02:01慢病毒載體(來自Dr. David Baltimore, Caltech之饋贈)轉導MS5-hDLL1細胞、然後使用識別人類HLA-A2之抗體(BB7.2) (Biolegend, San Diego, CA)對經轉導細胞進行FACS分選來產生MS5-hDLL1-A2.1細胞。OP9-DL1細胞系(表現鼠類 Dll1)係來自Dr. Juan Carlos Zúñiga-Pflücker (University of Toronto)之饋贈，且使其在0.1%明膠塗覆之搖瓶中之MEMα (ThermoFisher Scientific, Grand Island, NY)/20% FBS中傳代。K562細胞系係自ATCC獲得且維持於RPMI/10% FCS中。藉由用編碼全長人類CD80及HLA-A*02:01/B2M/NY-ESO-1 157-165或MART-1 26-35單鏈三聚體(SCTs；來自Dr. David Baltimore, Caltech之饋贈)之慢病毒載體共轉導K562細胞來產生K562 aAPCs。藉由用任一單獨SCT轉導來產生K562靶細胞。藉由相繼用螢火蟲螢光素酶慢病毒載體(來自Dr. Donald Kohn, UCLA之饋贈)轉導、然後用任一SCT轉導來產生K562活體內靶細胞。在使用之前對K562轉導體進行FACS分選。U266多發性骨髓瘤細胞系係來自Dr. John Chute (UCLA)之饋贈且維持於RPMI/10% FCS中。 F. 人工胸腺類器官 (ATO) 培養物藉由胰蛋白酶化收穫MS5-hDLL1 (或MS-5或OP9-DL1，如所註明)細胞且將其重懸浮於由以下各項構成之無血清ATO培養基(「RB27」)中：RPMI 1640 (Corning, Manassas, VA)、4% B27補充物(ThermoFisher Scientific, Grand Island, NY)、30 μM於PBS中重構之L-抗壞血酸2-磷酸鹽倍半鎂鹽水合物(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)、1%青黴素/鏈黴素(Gemini Bio-Products, West Sacramento, CA)、1% Glutamax (ThermoFisher Scientific, Grand Island, NY)、5 ng/ml rhFLT3L及5 ng/ml rhIL-7 (Peprotech, Rocky Hill, NJ)。每週新鮮製備RB27。在所指示實驗中用4%不含異源成份之B27取代B27。端視實驗，於1.5 ml埃彭道夫管中合併1.5-6×10 5個MS5-hDLL1細胞與3×10 2-1×10 5個經純化CD34+CD3-細胞(或其他HSPC群，如所指示)/ATO，且在4℃下在搖擺鬥離心機中在300 g下離心5 min。小心地移除上清液且藉由短暫渦旋重懸浮細胞沈澱物。對於每一ATO，將0.4 µm Millicell transwell插入物(EMD Millipore, Billerica, MA；目錄號PICM0RG50)置於含有1 ml RB27/孔之6孔板中。為平鋪ATO，取出插入物且將其靜於板之邊緣上以排出過量培養基。將細胞漿液調節至5-8 µl/ATO，用20 µl吸量管尖端吸取且藉由在吸量管尖端之末端形成液滴來平鋪，將該液滴輕柔地沈積至細胞插入物上。將細胞插入物放回含有1 mL RB27之孔中。每3-4天藉由自細胞插入物周圍吸出、然後用含有新鮮RB27/細胞介素之1 ml替代來完全更換培養基。以此方式將ATO培養至多20週。在所指示時間，藉由將FACS緩衝液(PBS/0.5%牛血清白蛋白/2 mM EDTA)添加至每一孔中，且藉由用1 ml 「P1000」吸量管抽吸使ATO短暫解聚、然後穿過70 µm耐綸篩濾器來收穫ATO細胞。在一些實驗中，在用於ATO中之前以所指示劑量γ-輻照MS5-hDLL1細胞之單細胞懸浮液。 G.  T 細胞單層共培養物如先前所述設定OP9-DL1單層培養物。簡言之，在使用之前1-2天將OP9-DL1細胞接種至0.1%明膠塗覆之12孔板中，以達成70%-80%鋪滿。自單層吸出培養基且將1×10 4-1.5×10 4個經純化CD34+CD3- HSPC平鋪於2 ml由MEMα、20% FBS、30 mM L-抗壞血酸、5 ng/ml rhFLT3L及5 ng/ml rhIL-7構成之培養基中之基質單層上。在一些實驗中，用MS-5或MS5-hDLL1取代OP9-DL1，且將RB27取代為培養基。每4-5天藉由收穫細胞、經由70 µm耐綸篩濾器過濾並再平鋪於新鮮培養基中將細胞轉移至新基質細胞單層。當鋪滿時，將細胞分至多個含有新鮮基質層之孔中。使培養物維持至多10週。 H. 慢病毒載體及轉導藉由RT-PCR自人類通用參考RNA集合(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)將人類 DLL1之全長編碼序列選殖至第三代慢病毒載體pCCL-c-MNDU3-X-IRES-eGFP (來自Dr. Donald Kohn, UCLA之饋贈)中。以類似方式將人類 CD80選殖至pCCL-c-MNDU3中。編碼特異性針對HLA-A*02:01/NY-ESO-1 157-165之TCR (源自1G4 TCR純系)之密碼子最佳化α及β (Vb13.1)鏈之第三代慢病毒載體先前已經闡述，且係來自Dr. Antoni Ribas (UCLA)之饋贈。密碼子最佳化之HLA-A*02:01/MART-1 26-35特異性TCR (源自F5 TCR純系)係來自Dr. Donald Kohn (UCLA)之饋贈。HLA-A*02:01及HLA-A*02:01/B2M/ NY- ESO-1 157-165或HLA-A*02:01/B2M/ MART-1 26-35單鏈三聚體之編碼序列係來自Dr. David Baltimore (Caltech)之饋贈，且將其亞選殖至pCCL-c-MNDU3-X-IRES- mStrawberry中。如先前所述實施慢病毒顆粒之包裝及濃縮。簡言之，使用TransIT 293T (Mirus Bio, Madison, WI)用慢病毒載體質體pCMV-∆R8.9及pCAGGS-VSVG將293T細胞(ATCC)共轉染17小時，然後用20 mM丁酸鈉處理8小時，隨後使細胞上清液在無血清UltraCulture中傳代48小時。藉由切向流過濾使用Amicon Ultra-15 100K過濾器(EMD Millipore, Billerica, MA)在4000 ×g下將上清液濃縮40分鐘，且以等份儲存在下-80℃下。對於HSPC轉導，將1×10 5-1×10 6個FACS分選之CD34+CD3- HSPC於塗覆有20 µg/ml Retronectin (Clontech, Mountain View, CA)之6孔未經處理板中之1 ml補充有50 ng/ml重組人類SCF、FLT3L及TPO及10 ng/ml IL-3 (Peprotech, Rocky Hill, NJ)之X-VIVO-15 (Lonza, Basel, Switzerland)中平鋪12-18 h，然後以感染複數(MOI) 100添加經濃縮之慢病毒上清液。將經模擬物轉導之細胞培養於相同條件下但不添加載體。在轉導後24小時收穫細胞，洗滌，且接種至ATO中。對於末梢血T細胞之轉導，藉由磁負向選擇使用CD8+ T細胞分離套組(Miltenyi)分離來自健康供體之CD8+ T細胞，且在轉導之前於AIM V/5%人類AB中用抗CD3/CD28珠粒(ThermoFisher Scientific)及20 ng/ml IL-2活化/擴增4天，如先前所述。隨後在使用之前於IL-2 (20 ng/ml)中擴增經轉導T細胞。 I. 免疫組織化學對於蘇木素及伊紅(H&E)影像，將ATO包埋於Histogel (ThermoFisher Scientific, Grand Island, NY)中且在10%中性緩衝福馬林(ThermoFisher Scientific, Grand Island, NY)中固定過夜。由UCLA Translational Pathology Core Laboratory (TPCL)實施5 µm切片及H&E染色。對於免疫螢光成像，藉由用解剖刀切割每一ATO周圍之培養插入物、然後將膜及ATO包埋於Tissue-Tek OCT (VWR Radnor, PA)中且冷凍於乾冰上來分離ATO。將5 μm冷凍切片固定於10%中性緩衝福馬林中，且在4℃下用以1:50稀釋之抗CD3 (純系UCHT1；Biolegend, San Diego, CA)染色過夜，然後在室溫下與AlexaFluor 594偶聯之抗小鼠IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)一起培育。在Zeiss AzioImager M2上使用AxioCam MRM及AxioVision軟體(Zeiss, Jena, Germany)獲取H&E及免疫螢光影像。 J.   T 細胞細胞介素分析藉由磁負向選擇使用CD8+或CD4+分離套組(Miltenyi)自ATO分離成熟CD8SP或CD4SP細胞且藉由FACS來分選，以進一步清除CD45RO+細胞(含有不成熟初始T細胞及CD4ISP前體)。將經純化T細胞群平鋪於96孔U形底板中之200 µl含有5%人類AB血清(Gemini Bio-Products, West Sacramento, CA)之AIM V (ThermoFisher Scientific, Grand Island, NY)中。將PMA/離子黴素/蛋白質運輸抑制劑混合劑或對照蛋白質運輸抑制劑混合劑(eBioscience, San Diego, CA)添加至每一孔中且培育6 h。針對CD3、CD4及CD8 (Biolegend, San Diego, CA)及UV455可固定活力染料(eBioscience, San Diego, CA)對細胞染色，然後用細胞內染色緩衝液套組(eBioscience, San Diego, CA)固定及透化且用針對IFNγ、TNFα、IL-2、IL-4或IL-17A之抗體(Biolegend, San Diego, CA)進行細胞內染色。 K.  T 細胞活化及增殖分析對於CFSE增殖分析，如上述藉由負向選擇MACS (及上述CD4SP T細胞之進一步FACS純化)來分離ATO源CD8SP或CD4SP T細胞，且根據製造商之方案用5 µM CFSE (Biolegend, San Diego, CA)標記。將經標記細胞與抗CD3/CD28珠粒(ThermoFisher Scientific, Grand Island, NY)於補充有5% AB血清及20 ng/ml rhIL-2 (Peprotech, Rocky Hill, NJ)之AIM V中一起培育，且在第5天時針對CD25或4-1BB (Biolegend, San Diego, CA)共染色並藉由流式細胞測量術來分析。在一些實驗中，根據製造商之方案利用標記用CFSE取代CellTrace Violet (CTV; ThermoFisher)。對於活體外細胞擴增分析，將5×10 3-1×10 4個如上述分離之ATO源CD8SP或CD4SP T細胞平鋪於96孔U形底板中之200 µl中，且用抗CD3/28珠粒及20 ng/mL IL-2或5 ng/mL IL-7及5 ng/mL IL-15 (Peprotech)活化/擴增。在第4天時移除珠粒，且每2-3天添加新鮮培養基及細胞介素，且視需要再平鋪於較大孔中。每週用血球計對細胞計數。在一些實驗中，在第14天時用新鮮抗CD3/CD28珠粒再刺激細胞。 L. 人工 APC (aAPC) CTL 引發分析如上述，藉由MACS自第6週經TCR轉導之ATO分離總共1×10 5個ATO源CD8SP T細胞，且以4:1 T細胞:K562比率與表現CD80及HLA-A*02:01/B2M/NY-ESO-1 157-165或HLA-A*02:01/B2M/MART-1 26-35單鏈三聚體之K562源aAPC或親代K562細胞於96孔U形底板中之200 µl AIM V/5%人類AB血清中共培養6 h。以1:50最終稀釋將CD170a-APC抗體(Biolegend, San Diego, CA)與蛋白質運輸抑制劑混合劑(eBioscience, San Diego, CA)一起添加至孔中達培養持續時間。然後針對表面標記物對細胞染色、固定、透化且針對細胞介素進行細胞內染色，如上文所述。 M. TCR Vβ 表型分析結合IOTest Beta Mark TCR V套組(Beckman Coulter, Indianapolis, IN)，針對CD3、CD4、CD8及TCRγδ對來自第7週ATO或出生後胸腺之總細胞染色。針對CD3+TCRγδ-CD8+CD4-細胞設門用於Vβ分析，且藉由代表每管3種不同Vβ抗體之FITC+、PE+或FITC+PE+細胞百分數來確定Vβ家族使用。對於經TCR轉導之ATO之Vβ分析，另外用APC偶聯之HLA-A*02:01/NY-ESO-1 157-165四聚體(MBL International, Woburn, MA)將來自第6-7週ATO之總細胞標記10分鐘，然後進行表面抗體染色，且針對CD3+TCRγδ-四聚體+CD8+CD4-對細胞設門以供Vβ分析。 N.  TCR 譜測序根據製造商之說明書藉由FACS使用RNeasy Micro套組(Qiagen)自40,000-200,000個ATO或胸腺CD8SP或PB CD45RO- CCR7+初始CD8+ T細胞純化總RNA。使用Agilent RNA 6000 Nano晶片來測定RNA濃度及品質。藉由5’-RACE使用具有如下修改之SMARTer PCR cDNA合成套組(Clontech)來製備包含重排TCR可變基因之靶向cDNA文庫。使用製造商之方案但取代聚-dT引子(5’- T30VN-3’)自3.5-500 ng總RNA製備第一鏈cDNA。藉由半巢式PCR使用Advantage 2 PCR套組(Clontech)單獨製備雙鏈TCRα及TCRβ cDNA文庫。TCRα cDNA之初始擴增使用0.5 µL含有製造商之正向通用引子混合物及結合TRAC之反向引子對(5’-GCCACAGCACTGTTGCTCTTGAAGTCC-3’ (SEQ ID NO. 1))之第一鏈反應物(=2.5 µL於TE中之1:5稀釋物)。利用製造商之正向引子IIA及結合TRAC之條碼反向引子(5’- X5GGCAGGGTCAGGGTTCTGGAT-3’ (SEQ ID NO. 2)實施TCRα cDNA之半巢式擴增，其中X5係使得樣品能夠在深度測序之前彙集之5-nt樣品特異性條碼)。TCRβ cDNA之擴增類似但初始擴增係利用結合TRBC之反向引子(5’- CCACCAGCTCAGCTCCACGTG-3’ (SEQ ID NO. 3))來實施，且半巢式擴增係利用結合TRBC之條碼引子(5’- X5GGGAACACSTTKTTCAGGTCCTC-3’ (SEQ ID NO. 4))來實施。使用DNA Clean及Concentrator-5套組(Zymo Research)來淨化TCRα及TCRβ cDNA製劑。彙集來自至多10個樣品之TCRα及TCRβ cDNA製劑，然後進行Illumina銜接子接合且在MiSeq測序儀(Illumina)上進行2 × 150 bp末端配對測序。使用樣品特異性條碼去多倍體化後，使用BLAT比對讀數與包含自IMGT數據庫下載之人類TRAV、TRAJ、TRBV、TRBD及TRBJ序列之所有可能組合之自定義參考數據庫。利用BLAT組之pslCDnaFilter實用程序使用「-maxAligns=1 - ignoreIntrons」選項來鑑別最佳BLAT命中，且使用自定義Perl腳本來計算純系型頻率。 O. 活體外細胞毒性分析如上文所述藉由機械破壞及磁負向選擇自ATO分離CD8SP T細胞。將T細胞於96孔圓底板中之AIM V/5%人類AB血清中用抗CD3/CD28珠粒(ThermoFisher Scientific)及20 ng/ml IL-2活化36 h。為延長擴增，將細胞於IL-2中再培養高達14天。對於細胞毒性分析，將T細胞之2倍連續稀釋物以1×10 5個細胞/孔開始平鋪於96孔圓底板之每孔中之AIM V/5%人類AB血清中。將經HLA-A*02:01/NY-ESO-1 157-165或HLA-A*02:01/MART-1 26-35單鏈三聚體轉導之K562靶細胞或內源表現NY-ESO-1之HLA-A*02:01+ U266以5×10 4個細胞平鋪於每孔中。在9 h時藉由膜連蛋白V/DAPI染色來量化靶細胞之凋亡細胞死亡。藉由四聚體染色來測定抗原特異性T細胞%，且用於回溯性計算每一孔之效應物:靶(E:T)比率。藉由自接收T細胞之孔中減去未接收T細胞之孔中之膜連蛋白V+靶細胞%來計算T細胞特異性細胞死亡。 活體內腫瘤分析在經UCLA Chancellor之動物研究委員會(Animal Research Committee)核准之方案下實施所有動物實驗。向4-6週齡NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)小鼠(Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine)皮下植入2×10 5個經HLA-A*02:01/NY-ESO-1 157-165或MART-1 26- 35單鏈三聚體及螢火蟲螢光素酶轉導之K562靶細胞(如上文所述)。在第3天時藉由腹膜內注射螢光素使小鼠之腫瘤生物發光成像。如上述經14天分離並活化/擴增ATO源CD8SP T細胞。在腫瘤植入後第3天時，經由眶後靜脈注射5.7×10 6個(含有4.5×10 6個抗原特異性T細胞，如在注射當天藉由四聚體染色所測定)。亦將PBS注射至對照小鼠中。每3-4天持續至少21天重複腫瘤生物發光，此後基於疾病負荷準則殺死小鼠。 P. 流式細胞測量術及抗體使所有流式細胞測量術染色在冰上在PBS/0.5% BSA/2 mM EDTA中實施30 min。經5 min將FcX (Biolegend, San Diego, CA)添加至所有樣品中，然後進行抗體染色。對於四聚體共染色，在室溫下經10分鐘將PE或APC偶聯之HLA-A*02:01/NY-ESO-1 157-165或HLA-A*02:01/MART-1 26-35四聚體(MBL International, Woburn, MA)以1:50最終稀釋添加至細胞中，然後再經20分鐘在冰上添加抗體。在分析之前將DAPI添加至所有樣品中。在LSRII Fortessa上實施分析，且在UCLA布勞德幹細胞研究中心流式細胞測量術核心之ARIA或ARIA-H儀器(BD Biosciences, San Jose, CA)上實施FACS。對於所有分析，設門選出DAPI+細胞，且基於FSC-H對FSC-W及SSC-H對SSC-W對單細胞設門。用於表面及細胞內染色之抗體純系係自Biolegend (San Diego, CA)獲得：CD1a (HI149)、CD3 (UCHT1)、CD4 (RPA-T4)、CD5 (UCHT2)、CD8 (SK1)、CD10 (6H6)、CD14 (M5E2)、CD19 (HIB19)、CD24 (ML5)、CD25 (BC96)、CD27 (O323)、CD28 (CD28.2)、CD31 (WM59)、CD34 (581)、CD38 (HIT2)、CD45 (HI30)、CD45RA (HI100)、CD45RO (UCHL1)、CD56 (HCD56)、CD107a (H4A3)、CD127 (A019D5)、CD235a (HI264)、CCR7 (G043H7)、HLA-A2 (BB7.2)、干擾素γ (4S.B3)、IL-2 (MQ1-17H12)、IL-4 (MP4-25D2)、IL-17A (BL168)、TCRαβ (IP26)、TCRγδ (B1)、TNFα (Mab11)、Vβ13.1 (H131)、人類譜系混合劑(CD3、CD14、CD19、CD20、CD56)；及自BD Biosciences (San Jose, CA)獲得：CD7 (M-T701)及CD62L (DREG-56)。 實例 4 ：在 ATO 模型系統中可使用不同的基質細胞 .為使ATO系統更具轉化性，測試其他基質細胞系替代來自鼠類來源之MS5-hDLL1之能力。HS27a細胞係人類骨髓細胞系及極好候選者，此乃因其分泌少量生長因子。藉由用hDLL1轉導HS27a細胞來產生表現Notch配體(hDLL1)之HS27a細胞系。藉由FACS純化表現大量hDLL1之細胞且擴增。在Notch信號傳導不存在下，ATO系統中之HS27a細胞無法支持T細胞分化(圖28A-C)。發現HS27a以及MS5基質細胞能夠支持ATO系統中三種不同臍帶血樣品製劑中之T細胞分化，圖29A-C。如圖30中所顯示，HS27a-DLL1 ATO中可見之穩健CD8+細胞群中之大多數細胞並非習用CD8SP細胞，此乃因該等細胞不表現CD3及TCRab。使用成熟標記物顯示HS27a-hDLL1基質細胞可支持成熟T細胞之分化，且自三種不同臍帶血製劑產生TCRab+CD3+ CD8SP及CD4SP細胞(圖31A-C)。然而，效率低於MS5-hDLL1 ATO中之效率。 實例 5 ：可使用 ATO 系統使不同幹細胞及祖細胞來源分化成 T 細胞 .本文所述之ATO系統係在活體外自人類造血幹細胞(來自不同來源)產生功能性初始T細胞之有效且穩健之模型。此系統已經調整以自人類胚胎幹細胞(hESC)產生成熟功能性初始人類T細胞。本發明者已鑑別出胚胎中胚層祖細胞(hEMP)群，其對應於最早期中胚層定型之祖細胞且可產生所有中胚層譜系(平滑肌、心肌細胞、造血譜系、間葉譜系)。此hEMP群係藉由Epcam標記物(CD326)之表現損失及CD56之表現增加來定義，且可容易地藉由FACS來分離(例如，參見Evseenko等人， Proc Natl Acad Sci U S A.2010 Aug 3;107(31):13742-7)。簡言之，培養於MEF (小鼠胚胎纖維母細胞)上之hESC可在80%-90%鋪滿時轉移至Matrigel。轉移(第0天)後，立即將細胞培養於包含活化素、BMP4、VEGF、bFGF之培養基中。1-2天後，添加包含BMP4、VEGF及bFGF之新培養基。在第3-4天時，可基於細胞EPCAM之損失及CD56之增加來分選細胞。藉由分離hEMP群、並使其與MS5-hDLL1基質細胞聚集在一起來產生ES源ATO系統。該方案需要兩週之造血誘導，用EGM2培養基及造血細胞介素(SB及SFT3)飼養ATO，然後藉由使用RPMI-B27培養基(且添加SCF/IL7/Flt3L)來誘導T細胞分化。發現在hEMP階段之3D聚集支持T細胞之產生。自OP9細胞(無ATO)上之hEMP分化之經分離CD34+產生ATO不支持T細胞分化(數據未顯示)。圖32中顯示源自使用hESC作為所選幹細胞群之ATO之T細胞群。圖33中顯示來自hESC之ATO系統中T細胞分化之動力學及CD8ab SP細胞之產生。如圖34-35中所顯示，在來自hESC之ATO系統中產生之T細胞表現成熟初始表型之標記物，此與使用臍帶血球所觀察到者類似。如圖36中所顯示，使用hESC在多個幹細胞來源中係可再現的。圖36顯示來自三種不同hESC系之ATO系統(第4週)之T細胞分化。ATO系統允許自iPSC系產生成熟T細胞(圖37)。此外，使未分化hESC (而非經分離hEMP) 3D聚集、然後使用先前所述之不同分化培養基亦允許產生T細胞(圖38)。此外，可將多個Notch配體用於ATO系統中。如圖39中所顯示，當基質細胞系表現hJAG1而非hDLL1時，ATO系統亦可支持來自hESC之T細胞成熟。亦發現在來自hESC之ATO系統中產生之T細胞顯示多樣TCR Vb譜(圖40)。如圖41中所顯示，hESC源T細胞展現因應抗CD3/CD28及IL2之增殖及CD25上調。用CTV (紫色細胞示蹤劑)對經分離細胞染色且與CD3/CD28活化珠粒一起培育5天。細胞經歷多次細胞分裂(如藉由CTV之稀釋所顯示)及活化(如藉由CD25之表現所顯示) (圖41A)。在另一實驗中，用PMA/離子黴素將經分離細胞處理6小時，且細胞內染色顯示因應刺激產生細胞毒性細胞介素(IFNg、IL2、TNFa) (圖41B)。 隨後，尋求確定自使用hESC細胞作為起始材料之ATO系統是否可產生經改造以表現外源TCR之T細胞。用表現GFP之opt1G4載體(NY-ESO TCR)轉導H1 hESC。藉由分離GFP+細胞且使其擴增來產生H1 NY-ESO TCR hESC系。然後將細胞提交給與上文所述相同之方案以誘導T細胞分化。此繪示於圖42中。可藉由GFP及四聚體之表現來監測在ATO中自hESC產生之經改造T細胞。該等細胞遵循經典T細胞分化方式(DP、CD3+/TCR+ CD8SP) (圖43)。在第5週時，經改造hESC源CD8SP T細胞顯示成熟初始表型：CD45 RA+、CD27+、CD62L+、CD31+ (圖44A-B)。測試在ATO中自hESC產生之經改造CD8 SP T細胞(第5週)之活體外功能。用CTV (紫色細胞示蹤劑)對經分離細胞染色且與CD3/CD28活化珠粒一起或在表現CD80及同源HLA-A*02:01/NY-ESO-1肽-MHC單鏈三聚體之人工抗原呈遞細胞(aAPC)或不相關HLA-A*02:01/MART-1 aAPC存在下培育5天。細胞經歷多次細胞分裂(如藉由CTV之稀釋所顯示)及活化(如藉由因應CD3/28活化及表現同源肽之aAPC之CD25表現所顯示) (圖45)。在此分析中，細胞在表現不相關肽之aAPC存在下無法存活。在另一實驗中，用PMA/離子黴素將經分離細胞處理6小時。細胞內染色顯示因應刺激產生細胞毒性細胞介素(IFNg、IL2、TNFa) (圖46)。細胞亦經歷去粒，如藉由CD107a之表現所顯示(圖46)。在兩個個別分析中，在表現CD80及同源HLA-A*02:01/NY-ESO-1肽-MHC單鏈三聚體之人工抗原呈遞細胞(aAPC)或不相關HLA-A*02:01/MART-1 aAPC存在下，將經分離細胞培育6小時。分析顯示因應表現同源肽而非不相關者之aAPC產生細胞毒性細胞介素(IFNg、IL2、TNFa)及去粒(CD107a)。一個代表性實驗顯示於圖47中。隨後，測試經分離細胞之增殖能力。用CD3/CD28珠粒將其活化4天且於補充有5%人類AB血清及IL2 (20 ng/ml)之AIM V培養基中維持2週。結果顯示在2週時細胞擴增20倍(圖48)。 實例 6 ： ATO 培養基補充測試B27補充物之組份以確定其對ATO系統之相對貢獻。下表展示B27補充物之組份：
維生素 生物素
乙酸DL α生育酚
DL α-生育酚
維生素A (乙酸酯)
蛋白質 BSA、不含脂肪酸之部分V
過氧化氫酶
人類重組胰島素
人類運鐵蛋白
超氧化物歧化酶
其他組份 皮質酮
D-半乳糖
乙醇胺HCl
麩胱甘肽(還原性)
L-肉鹼HCl
亞麻油酸
次亞麻油酸
助孕酮
腐胺2HCl
亞硒酸鈉
T3 (三碘-L-甲狀腺胺酸)
臍帶血ATO (起始於CD34+CD3- HSPC)經設定以確定B27補充物之哪些組份係必需的。比較完全(標準) B27 (「B27 comp」)與除缺失單一組份外相同之四種補充物(所有皆由同一製造商供應)：不含維生素A (B27-Vit A)、不含抗氧化劑(B27-AO)、不含胰島素(B27-胰島素)及不含異源成份組份(不含異源成份之B27)。所顯示之數據來自兩個獨立實驗，兩個6週時之圖表顯示總細胞輸出(頂圖)及T細胞定型之細胞(CD5+CD7+) % (底圖)。如圖49-50中所顯示，確定胰島素為ATO系統中之T細胞定型所必需且維生素A及抗氧化劑促進細胞擴增。此外，與非不含異源成份之B27配方相比，不含異源成份之B27配方給予ATO中類似的T細胞分化及擴增結果。總之，胰島素為ATO中之T細胞產生所必需，不含異源成份等效於完全B27，且VitA及抗氧化劑增強細胞輸出但並非T細胞分化所必需。 實例 7 ：使用人工胸腺類器官 (ATO) 系統自人類造血幹 / 祖細胞產生 CAR-T 細胞 .在此研究中，本發明者尋求確定CAR信號傳導對ATO中之正常T細胞分化之效應，確定ATO源CAR-T細胞之活體外及活體內功能及抗腫瘤效能，及確定CAR調介TCR等位基因排除之能力。為此，將CD19靶向CAR轉導至臍帶血CD34+CD3- HSPC中。然後使該等細胞經受ATO系統達4-6週之時間段。 如圖52中所顯示，ATO中之CAR表現極大地受限於T譜系細胞。由於嵌合抗原受體(CAR)並不依賴CD3或TCR亞單位進行表面表現及信號傳導，故其可在多個細胞譜系中表現。測試在標準ATO培養物(即MS5-hDLL1基質、補充有5 ng/ml FLT3L及5 ng/ml IL-7之RB27培養基)中經編碼CD19特異性第2代(CD28/CD3ζ) CAR及eGFP之載體轉導之CD34+CD3- CB HSPC的譜系輸出。簡言之，使7500個經轉導HSPC以1:20 HSPC:基質細胞比率聚集且如所述培養4週。在4週時，破壞ATO且分析總人類細胞之譜系標記物(此處所顯示)。存在極少的eGFP+ (CAR+)單核球(CD14+)、顆粒球(CD66b+)、B細胞(CD19+)或NK細胞(CD56+)。大多數CAR+細胞為CD5+及CD7+，此與T細胞譜系一致。應注意，CAR+細胞顯示幾乎完全缺少CD3、TCRab及TCRgd表現，此表明非習用T細胞分化。 ATO源CAR-T細胞顯示非習用T細胞分化。分析起始於經模擬物或CD19特異性第2代(CD28/CD3ζ) CAR轉導之CB HSPC之第4週ATO之細胞的T細胞標記物。經CAR轉導之細胞(針對GFP+設門)主要為T譜系(CD5+CD7+)，但並不顯示典型DN至DP至SP T細胞分化模式。相反，大多數細胞為DN或CD8SP (中間列)。此外，業內不存在ATO CAR-T細胞中之CD3/TCR表面表現之證據。此顯示於圖53中。儘管非習用T細胞分化，ATO源CAR-T細胞(來自經CD19特異性第2代(CD28/CD3ζ) CAR轉導之CB HSPC)顯示表徵為CD45RA+CD45RO-以及CD27及CCR7共表現之正常初始T細胞表型(圖54)。該等細胞亦共表現CD62L (未顯示)。 ATO源CAR-T細胞表現CD2、細胞內CD3。如圖55中所顯示，ATO源CAR-T細胞(來自經CD19特異性第2代(CD28/CD3ζ) CAR轉導之CB HSPC)共表現CD5、CD7、CD2及細胞內CD3，從而確認其作為T譜系細胞之身份。 ATO源CAR-T細胞係DN或CD8αα+。ATO源CAR-T細胞(來自經CD19特異性第2代(CD28/CD3ζ) CAR轉導之CB HSPC)並不表現CD8β (圖56A)，此與來自人類胸腺之習用T細胞或自經TCR轉導之HSPC產生之ATO源T細胞不同。其亦表現先天樣T細胞所特有之標記物，包括CD56及CD16 (圖56B)。總之，ATO源CAR-T細胞類似人類上皮內淋巴球(IEL)。 假設ATO中之IEL樣CAR-T細胞分化係由經由與ATO中之同源抗原相互作用及/或經由CAR之滋養信號傳導進行之激動劑選擇(即經由CAR之強信號傳導)來驅動。早期T細胞分化(例如在DN階段)期間之強信號傳導驅動正發育T細胞繞過習用T細胞分化並進入至IEL樣譜系之非經典分化(圖57)。 ATO源CAR-T細胞可在其與CAR共轉導時表現TCR。將經CAR (CD19特異性第2代(CD28/CD3ζ))及/或TCR (密碼子最佳化1G4 TCR)共轉導之CB HSPC在ATO中培養4週，產生共表現CD3及經轉導TCR之CAR+細胞(GFP+) (藉由四聚體染色所顯示) (圖58)。此與其作為T細胞之身份一致(此乃因CD3亞單位為TCR表現所必需)。應注意，TCR之轉導並不影響CAR-T細胞在ATO中之非習用IEL樣分化。 藉由CAR及TCR抗原信號傳導活化共表現經轉導TCR之ATO源CAR-T細胞。將自經CAR (CD19特異性第2代(CD28/CD3ζ) CAR)及TCR (密碼子最佳化1G4 TCR)共轉導之CB HSPC產生之ATO源總GFP+細胞自第6週ATO分離，且與非特異性K562細胞、經CD19 (CAR靶)或HLA-A*02:01/B2M/NYESO1 157-165單鏈三聚體(TCR靶)轉導之K562細胞共培育6小時。藉由針對干擾素γ之細胞內染色及針對CD107a之表面染色來分析T細胞活化。來自CAR+TCR共轉導之ATO之T細胞對CAR及TCR靶細胞二者有反應(圖59)。 ATO源CD19 CAR-T細胞因應CD19+細胞來發揮功能且無額外活化/共刺激。將自經CAR (CD19特異性第2代(CD28/CD3ζ))轉導之CB HSPC產生之ATO源總GFP+細胞自第6週ATO分離，且與非特異性K562細胞、經CD19 (CAR靶)轉導之K562細胞、CD19+ Nalm-6白血病細胞系或CD19+ Raji淋巴瘤細胞系共培育6小時。藉由針對干擾素γ、TNFa及IL-2之細胞內染色及針對CD107a之表面染色來分析T細胞活化。ATO源CAR-T細胞經歷因應未添加外源細胞介素之靶細胞之活化(圖60)。 圖61顯示ATO源CD19 CAR-T細胞具有細胞毒性。將自經CAR (CD19特異性第2代(CD28/CD3ζ))轉導之CB HSPC產生之ATO源總GFP+細胞自第6週ATO分離，與非特異性K562細胞或CD19+ Nalm-6白血病細胞系以不同效應物對靶(E:T)比率共培育9小時。藉由膜連蛋白V/DAPI染色量測腫瘤細胞系之細胞凋亡。 如圖62中所顯示，利用不同CAR構築體可見ATO中之IEL樣分化(即激動劑選擇)。用以下不同CAR構築體轉導CB HSPC：CD19特異性第1代(CD3ζ) CAR、第2代(CD28/CD3ζ或4-1BB/CD3ζ) CAR；或GD2特異性第2代(CD28/CD3ζ) CAR。在6週時評估ATO中之分化(對經轉導GFP+細胞設門)。利用所有CAR構築體可見相似的IEL樣T細胞分化。 實例 8 ：在 ATO 中來自經 CAR 轉導之 ES 細胞之 CAR-T 細胞分化 .來自人類ES細胞之ATO源CAR-T細胞因應PMA/離子黴素產生細胞介素。用PMA/離子黴素將來自第5週ATO之H1或H1-CAR源CD45+細胞處理6小時。藉由針對干擾素γ及IL-2之細胞內染色顯示活化。 來自H1細胞或經CD19特異性第2代(CD26/CD3ζ) CAR轉導之H1細胞之T細胞分化。用編碼CAR及eGFP之慢病毒屬穩定轉導H1-CAR系。如所述使H1或H1-CAR細胞分化至hEMP階段且使所分選hEMP與MS5-hDLL1細胞聚集在一起並如所述分化(簡言之，在EGM2培養基+ TGFβ中抑制1週，然後添加SCF、FLT3L、TPO及IL-3保持1週，然後將培養基更換為用於ATO培養物之含有SCF、FLT3L及IL-3之RB27保持至多額外6週。上文顯示來自起始ATO培養條件後第1-4週之CD45+細胞。T譜系分化係藉由CD5及CD7之共表現來顯示。發現在ATO中經CAR轉導之人類ES細胞可產生CAR-T細胞(圖63)。 來自起始ATO培養條件後第1-4週之H1或H1-CAR源CD45+細胞顯示不存在T細胞成熟之正常標記物，此與CB HSPC ATO源CAR-T細胞相似。不存在DP階段T細胞，且大多數細胞為DN。H1及H1-CAR ATO中之CD4 dim細胞可能為不成熟單陽性CD4 (ISP4) T細胞前體。如圖64中所顯示，來自人類ES細胞之ATO源CAR-T細胞展現非習用T細胞分化。如圖65中所顯示，來自人類ES細胞之ATO源CAR-T細胞不表現CD8β。來自起始ATO培養條件後第1-4週之H1或H1-CAR源CD45+細胞顯示不存在CD8β，此與CB HSPC ATO源CAR-T細胞相似。進一步發現來自人類ES細胞之ATO源CAR-T細胞因應PMA/離子黴素產生細胞介素(圖66A-B)。用PMA/離子黴素將來自第5週ATO之H1或H1-CAR源CD45+細胞處理6小時。藉由針對干擾素γ及TNF α (圖66A)或干擾素γ及IL-2 (圖66B)之細胞內染色顯示活化。最後，發現來自人類ES細胞之ATO源CAR-T細胞因應靶細胞產生細胞介素並去粒(圖67)。將來自第4週ATO之H1-CAR源總GFP+細胞與CD19- K562細胞、經CD19轉導之K562細胞或CD19+ Nalm-6或RAJI細胞系共培養6 h。藉由針對CD107a之表面染色及針對干擾素γ之細胞內染色來量測活化。對於分析，對成熟表型(CD45RA+) CAR-T細胞設門。 實例 9 ：用於 T 細胞分化之 ATO 系統之優點 . A. 在 HSPC/ATO 中表現 TCR 優於用 TCR 轉導末梢血 (PB) T 細胞之標準免疫治療方式之一些優點PB T細胞在經轉導以表現特異性抗腫瘤TCR時具有預先存在之多樣TCR譜。因此，使用自體細胞可發生內源TCR鏈與轉基因TCR之錯配；此可減小抗腫瘤特異性或產生新穎自體反應性錯配TCR。由於經TCR改造之ATO源T細胞中內源TCRβ重排之等位基因排除，經轉導與內源TCR鏈之間之錯配風險應極大地降低。 如上文所提及，TCR在早期T細胞分化期間在ATO中之表現產生內源TCRβ鏈之等位基因排除(參見Seet等人)。此現象增加使用同種異體HSPC產生不針對患者反應之T細胞之治療可能性。相比之下，在治療上無法使用來自PB之同種異體T細胞，此乃因其多樣內源TCR譜將攜載移植物抗宿主病(GvHD)之風險。因此，在ATO系統中誘導之等位基因排除可允許自同種異體供體研發現成產品用於免疫療法 B. 在 HSPC/ATO 中表現嵌合抗原受體 (CAR) 優於用 CAR 轉導 PB T 細胞之標準免疫治療方式之一些優點用於CART細胞療法之常用方式係在PB中表現CAR。因此，如此產生之CART細胞亦表現來自內源表現之多樣TCR。相比之下，HSPC之CAR轉導產生CD3-TCR-表型與上皮內淋巴球(IEL)相似之T細胞。TCR表現之不存在應預防呈現通用產品可能性之同種異體接受者之GvHD。 C.  ATO 在自 HSPC 產生經 TCR 改造 T 細胞方面優於 OP9-DL1 之優點Belgium之Bart Vandekerckhove組已使用OP9-DL1自經TCR轉導之CD34+胸腺原T細胞或CD34+動員之末梢血(MPB) HSPC產生不成熟T細胞前體( Snauwaert 等人， Leukemia , 2014)。然而，在此系統中，在第14天(胸腺原T)或第33天(MPB)，＜1%之細胞為成熟CD8+ T細胞。大多數經TCR轉導之細胞在DP階段受阻，此與OP9-DL1支持T細胞成熟之較差能力一致。本發明方法產生更多成熟CD8+ T細胞。 D. 使用 ATO 自人類多潛能幹細胞 (hPSC) 分化 T 細胞優於 OP9-DL1 之優點OP9-DL1 (或Dll4)係先前唯一用於自hPSC (hESC或hiPSC)分化T細胞之系統。在OP9-DL1上，來自PSC之細胞產率極差且T細胞分化甚至比使用CB HSPC更差。相比之下，在ATO系統中來自hPSC (hESC或iPSC二者)之T細胞分化高度有效。成熟初始CD8及CD4 SP細胞自PSC之產生甚至更快於自CB HSPC產生。自hPSC產生成熟T細胞之能力意味著，經由hPSC之基因編輯移除或替代免疫反應性基因可容易地產生真正現成之通用產品。單一PSC源T細胞產品將可用於多個潛在患者，從而克服存在於產生患者特異性產品中之時間及成本之當前限制。除自少淋巴球性患者收穫足夠自體T細胞外，將避免後化學療法。 E. 在 ATO 系統對 OP9-DLL1 中來自臍帶血之 T 細胞分化之比較先前實例顯示使用CD34+臍帶血球及MS5-hDLL1基質之ATO系統與用於活體外人類T細胞分化之當前最先進方案：OP9-Dll1系統之間的比較。為提供ATO系統優於OP9-DLL1之進一步證據，自3個不同臍帶血供體(E37、E43、E68)產生ATO且與OP9-DLL1基質上之分化進行比較。圖68顯示在第4週時CD34+及T細胞祖細胞於兩個系統中之維持(圖68)。兩個系統皆允許細胞定型至T細胞譜系，如由CD5及CD7之表現所顯示。然而，ATO系統在產生CD4CD8雙陽性細胞(DP)方面高度優異(圖69)。在第4週時，ATO系統已允許產生穩健的TCRab+CD3+細胞群且其中之一些已為CD8SP，而OP9-hDLL1更加無效且自OP9-hDLL1系統產生之活細胞之量不允許產生足夠T細胞用於治療及商業活力(圖70)。圖70中數據之數值表示顯示於圖71中。 *  *  * 根據本發明，本文中所揭示及主張之所有方法皆可在無需過度實驗之情形下進行及執行。儘管本發明之組合物及方法已根據較佳實施例予以闡述，但熟習此項技術者應明瞭，可改變該等方法及本文所述方法之步驟或步驟之順序，此並不背離本發明之概念、精神及範疇。更特定而言，應明瞭，某些在化學及生理上皆相關之試劑可取代本文所述試劑，同時可達成相同或相似之結果。熟習此項技術者顯而易見之所有該等類似取代物及修改皆應視為在如由隨附申請專利範圍所界定之本發明精神、範疇及概念內。 參考文獻以下參考文獻就其提供實例性程序性或其他細節來補充本文所述之彼等而言以引用方式明確併入本文中。 Aasen及Belmonte, Nat. 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以下圖式形成本說明書之一部分且經納入以進一步展示本發明之某些態樣。藉由參照該等圖式中之一或多者結合本文所呈現特定實施例之詳細描述可更好地理解本發明。 圖 1A-1B ：在人工胸腺類器官 (ATO) 中自臍帶血 (CB) CD34+ HSPC 產生人類 T 細胞。使CB CD34+ HSPC在ATO中分化達7週。A) ATO之每週分析顯示CD3+T CRαβ+ T細胞之漸進發育(針對CD14- CD56-細胞設門以分別排除單核球及NK細胞)。B) 針對CD3+ TCRαβ+細胞設門之ATO之每週分析顯示成熟CD8+及CD4+ T細胞之發育。 圖 2A-2B ：在 ATO 中自臍帶血 CD34+ HSPC 產生經 TCR 改造之抗原特異性 T 細胞，及藉由在 ATO 中表現人類 MHC 分子來增強正向選擇。在HLA-A*02:01背景下用編碼特異性針對NY-ESO-1 157 - 165之TCR之慢病毒屬(lentivirus)轉導CB CD34+ HSPC，且使其在ATO中分化達6週。A) ATO中成熟、初始、抗原特異性CD8+ T細胞之產生，如藉由TCR (使用HLA-A*02:01/NY-ESO-1 157 - 165四聚體檢測)、CD3、CD8、CD45RA、CD27及CCR7之表現所展示。每一圖代表自最後一圖連續設門。B) 在經改質以在ATO基質細胞隔室中表現HLA-A*02:01之ATO中之正向選擇之增強及成熟抗原特異性T細胞產生。 圖 3A-G ：在 ATO 系統中人類 T 細胞發育之效率及再現性。 (a)ATO模型之示意圖。 (b)在所指示時間來自CB CD34+CD3- HSPC之T細胞分化之動力學(針對CD14-CD56-細胞設門以分別排除骨髓樣細胞及NK細胞)。 (c)基於兩種分類方案維持ATO中之早期CD34+胸腺T細胞祖細胞表型(如(b)中所顯示針對CD34+細胞設門)。 (d)在用CB HSPC及MS-5細胞(左圖)或MS5-hDLL1細胞(即ATO)產生之第4週類器官中針對CD3之免疫螢光染色(右圖)。 (e)以1:10至1:30 HSPC對基質細胞比率起始於2-5×10 4個HSPC之生物重複CB ATO (n=18)中之總細胞擴增。 (f)單核球(CD14+)、NK細胞(CD56+)或T譜系細胞(CD7+CD5+)頻率(針對總細胞設門)；及 (g)第6週生物重複ATO (n=18)中之T細胞及前體頻率(針對CD14-CD56-細胞設門)。 圖 4A-C ： ATO 中胸腺細胞生成及初始 T 細胞發育之重演。針對 (a)總CD14-CD56-及( b) CD3+TCRαβ+細胞設門比較第12週CB ATO與人類出生後胸腺細胞之間之T細胞分化。 (c)第12週ATO或胸腺中不成熟初始T細胞(CD45RA-CD45RO+)及成熟初始T細胞(CD45RA+CD45RO-)之產生(針對CD3+TCRαβ+細胞設門，且指示CD8SP或CD4SP子門)。 圖 5A-F ：自多個 HSPC 來源及子集產生 T 細胞。起始於人類臍帶血(CB)、成人骨髓(BM)、經G-CSF動員之末梢血(MPB)或未經動員之末梢血(PB)之CD34+CD3- HSPC之第6週ATO中之有效T細胞發育。針對 (a)總CD14-CD56-細胞及 (b)CD14-CD56-CD3+TCRαβ+ T細胞設門。 (c)在第6週ATO中來自CB、BM及MPB之Lin-CD34+CD38-造血幹細胞(HSC)富集部分的T細胞分化，針對CD14-CD56-或 (d)CD14-CD56-CD3+TCRαβ+ T細胞設門。 (e)起始於成人BM HSC及祖細胞子集之第3週ATO中之T細胞分化，針對CD14-CD56-細胞及 (f)CD34+細胞設門，如(e)中所顯示。 圖 6A-E ： ATO 源 T 細胞之 TCR 多樣性及功能。 (a)在來自第7週ATO (n=5)或人類胸腺(n=4)之CD8SP T細胞中生理TCR多樣性之產生，如藉由TCR Vβ使用之流式細胞測量術分析所顯示。 (b)在經PMA/離子黴素處理12 h之所分選ATO源DP、CD8SP及CD4SP細胞中針對干擾素γ及IL-4產生之細胞內染色。 (c)ATO源CD8SP細胞因應抗CD3/CD28及IL-2之增殖(CFSE稀釋)及活化(CD25上調)。 (d)自起始於臍帶血(CB)、骨髓(BM)或經動員末梢血(MPB)之HSPC之ATO分離之CD8SP細胞之相當反應，如藉由因應PMA/離子黴素之干擾素γ產生所顯示(相對於空白分析通道顯示)，及 (e)相對於輸入細胞數因應抗CD3/CD28及IL-2之相當活體外擴增。 圖 7A-G ： ATO 中經 TCR 改造 T 細胞之分化及等位基因排除。 (a)在起始於經TCR轉導(頂列)或經模擬物轉導(底列)之CB HSPC之第7週ATO中經HLA-A*0201/NY-ESO-1 157-165特異性TCR改造之T細胞之有效產生。各圖係針對CD14-CD56-細胞設門，且在每一圖上指示連續子門。 (b)以1:20 HSPC對基質細胞比率用3×10 4個CB HSPC產生之第6週經TCR轉導對經模擬物轉導之ATO中增強的總細胞擴增。 (c)在第5週經TCR轉導之ATO中藉由減少HSPC及基質二者之數量增強細胞擴增。ATO係以1:20 HSPC對基質細胞比率用3×10 4個或7.5×10 3個經TCR轉導之CB HSPC來產生。 (d)經TCR轉導之ATO源CD8SP T細胞之細胞毒性引發。與K562細胞或表現CD80及同源肽-MHC之K562人工APC共培養後之干擾素γ產生及CD107a膜動員(針對CD3+四聚體+CD8SP對T細胞設門)。 (e)來自經TCR轉導或經模擬物轉導之ATO之CD8SP T細胞因應抗CD3/CD28及IL-2的細胞擴增。 (f)來自經TCR轉導之ATO (n=3)或未經轉導之ATO (n=5)之CD8SP細胞之TCR Vβ多樣性。藉由流式細胞測量術測定之Vβ頻率，針對來自經TCR轉導之ATO (n=3)之四聚體+CD3+CD8SP細胞或來自未經轉導之ATO (n=5)之CD3+CD8SP細胞設門。 (g)(f)之代表性流式細胞測量術圖顯示在來自經TCR轉導之ATO之四聚體+CD3+CD8SP細胞中富集經轉導Vβ13.1鏈。顯示來自未經轉導ATO或人類胸腺之CD3+CD8SP T細胞用於比較。 圖 8A-C ：經 TCR 改造之 T 細胞在 MHC 改質之 ATO 中增強的正向選擇。 (a)對ATO中之造血及/或基質「自身」MHC表現建模之方法之示意圖。造血HLA-A*02:01表現係藉由使用HLA型供體CB單元來達成，且基質表現係藉由用表現HLA-A*02:01之慢病毒屬轉導MS4-hDLL1細胞來達成。所有HSPC皆經HLA-A*02:01限制性NY-ESO-1特異性TCR轉導。 (b)在ATO中基質及造血「自身」MHC表現對四聚體+CD8SP T細胞之正向選擇之協同效應。針對CD14-CD56-對細胞設門，且在圖上指示連續子門。 (c)在具有基質HLA-A*02:01表現之ATO中經TCR改造之T細胞至成熟初始T細胞表型之增強的成熟，如藉由CD45RA、CD27及CCR7之上調以及CD45RO及CD1a之下調所顯示。所有圖皆針對四聚體+CD3+CD8SP T細胞設門。 圖 9A-B ： ATO 細胞擴增及 T 細胞分化與輸入 HSPC 數及 HSPC: 基質細胞比率相關。用 (a)不同CD34+CD3- CB HSPC數及恆定基質細胞(MS5-hDLL1)數，或 (b)不同HSPC及基質細胞數產生之第6週ATO之細胞擴增及T細胞頻率數據。利用最低輸入HSPC數/ATO (7,500個細胞)及1:20-1:40 HSPC對基質細胞比率可見最佳總細胞及成熟T細胞擴增。 圖 10A-G ： ATO 中之 T 細胞分化係高度可再現的且不受 B27 批次、不含 異源成份 之 B27 或基質輻照影響。在自單一CB樣品產生且使用4個不同批次之B27補充物(標記為A-D)培養之第6週ATO中，B27批次變化對(a) 總ATO細胞輸出、(b) 骨髓樣(CD14+)或NK細胞(CD56+)分化、或(c) B細胞(CD19+)或T細胞分化無顯著效應。顯示每一B27批次之ATO技術重複(n=2-3)。所有ATO皆係用3×10 4個HSPC以1:20 HSPC對基質細胞比率來設定。(d) 在第6週ATO中用不含異源成份之B27取代B27對細胞數或(e) T細胞分化無影響。(f) 用以所指示劑量輻照之MS5-hDLL1細胞產生之ATO不顯示相當T細胞分化(針對總CD14-CD56-細胞設門)或(g) 針對CD3+TCRαβ+細胞設門，如(f)中所顯示。 圖 11A-C ：在 ATO 對單層系統中增強的正向選擇。 (a)與單層共培養物相比ATO (即含有RB27之3D培養物中之MS5-hDLL1)中增強的T細胞正向選擇及成熟。比較第6週單層培養物(左圖)與3D類器官培養物(右圖)且包括與OP9-DL1之交叉比較，如圖所指示。用於OP9-DL1單層共培養物之標準培養基係MEMα/20%FCS，且用於ATO之標準培養基係RB27，如 方法中所述 。亦顯示使用親代MS-5細胞系(未經 DLL1轉導)之單層或類器官培養物。所有圖皆針對CD14-CD45-細胞或如圖上所指示之CD3+TCRαβ+子門設門。在6週時，標準OP9-DL1單層培養物對ATO中相關細胞群之 (b)%及 (c)倍數擴增。培養物係使用相同CB單元平行起始。ATO係用3×10 4個HSPC以1:20 HSPC對基質細胞比率來設定。 圖 12A-C ： ATO 中胸腺細胞生成及初始 T 細胞表型之重演。 (a)在第6週-第10週之間ATO中CD3+TCRαβ+CD8SP及CD4SP細胞之漸進分化。ATO係自相同供體CB HSPC平行培養且在所指示時間連續分析。針對CD14-CD56-TCRαβ+CD3+細胞對細胞設門，且在圖上指示連續子門(CD8SP或CD4SP)。 (b 、 c)與人類胸腺中之相應群相比表徵第12週ATO源初始CD8SP及CD4SP T細胞之其他標記物。所有細胞皆針對CD14-CD56-CD3+TCRαβ+設門且針對 (b)CD8SP或 (c)CD4SP細胞設子門。 圖 13A-F ：自多個 HSPC 來源及子集產生 T 細胞。 (a)來自不同人類臍帶血(CB)、成人骨髓(BM)、經G-CSF動員之末梢血(MPB)或未經動員之末梢血(PB) HSPC之第6週ATO中CD34+細胞之維持。 (b)CD34+ T細胞祖細胞子集之表型，針對CD34+細胞設門，如(a)中所顯示。 (c)使用如(a)中所顯示之HSPC來源在第6週ATO中總細胞及相關T細胞子集之倍數擴增。倍數擴增係相對於起始HSPC數量而言。ATO係使用3×10 4個CD34+CD3- HSPC/ATO以1:20 HSPC對基質細胞比率來設定。在起始於不同HSPC來源之造血幹細胞(HSC)富集(Lin-CD34+CD38-)部分之第6週ATO中， (d)CD34+細胞之維持及 (e)CD34+ T細胞祖細胞之表型。 (f)起始於經純化BM造血幹細胞及祖細胞子集之第3週ATO中總細胞之倍數擴增。ATO係用每一群2-4×10 4個/ATO以1:15-1:40 HSPC對基質細胞比率起始。數據係相對於起始HSPC數量而言。 圖 14A-B ： ATO 系統中人類 T 細胞發育之效率及再現性。(a) 在6週時ATO中細胞類型之頻率。頂圖：單核球(CD14+)、NK細胞(CD56+)、B細胞(CD19+)、HSPC (CD34+)或T譜系細胞(CD7+CD5+)之頻率(針對總活細胞設門)。中圖：T細胞前體及TCR+ T細胞頻率(針對CD14-CD56-細胞設門)。底圖：DP及成熟CD8及CD4單陽性(SP) T細胞之頻率(針對CD3+TCRαβ+細胞設門)。(b) 在第6週時自7.5-22.5 ×10 3個CB HSPC/ATO產生之總細胞數及CD3+TCRαβ+CD8SP T細胞/ATO。顯示11個生物重複之數據(誤差槓指示標準偏差)。 圖 15A-D ：自多個 HSPC 來源及子集產生 T 細胞。(a) 在自CB、新生胸腺、BM或MPB分離之7500個CD34+CD3-細胞產生之ATO中在12週內之T細胞分化動力學。顯示三個技術重複/組織之T細胞前體及成熟T細胞之頻率之平均值及SD且數據代表兩次不同實驗。(b) 來自(a)中所指示ATO之總細胞數及CD3+TCRαβ+CD8SP T細胞數。(c) 在第6週時在ATO中成人BM HSPC (CD34+lin-)及祖細胞(LMPP及CLP)子集之T細胞分化潛能(指示各門)。(d) 來自(c)中所顯示之ATO之總細胞數及CD3+TCRαβ+CD8SP T細胞數。顯示技術性一式三份之平均值及SD，且數據代表三個生物重複。 圖 16A-F ： ATO 源 T 細胞之 TCR 多樣性及功能。(a) 來自第7週ATO (n=5)或人類胸腺(n=4)之CD3+TCRαβ+CD8SP T細胞中TCR多樣性之產生，如藉由TCR Vβ家族表現之頻率之流式細胞測量術分析所顯示。(b) 藉由TCR Vα及(c) TCR Vβ CDR3區之深度測序，來自ATO、胸腺及末梢血(PB)初始T細胞之CD3+TCRαβ+CD8SP T細胞中之TCR純系型多樣性。顯示個別純系型之頻率。數據代表三個生物重複。(d) 經PMA/離子黴素處理6 h之ATO源CD3+TCRαβ+CD8SP T細胞之多功能細胞介素產生。數據代表三次不同實驗。(e) 在5天後ATO源CD3+TCRαβ+CD8SP細胞因應抗CD3/CD28及IL-2之增殖(CFSE稀釋)及活化(CD25及4-1BB上調)。數據代表兩次個別實驗。(f) 在7天及14天後，相對於起始細胞數因應抗CD3/CD28及IL-2之ATO擴增後的ATO源CD3+TCRαβ+CD8SP T細胞。顯示技術性一式三份之平均值及SD，且數據代表三個生物重複。 圖 17A-F ： ATO 中經 TCR 改造 T 細胞之分化及等位基因排除。(a) 在來自經TCR轉導之CB ATO之CD3+TCRαβ+四聚體+ T細胞上CD8α及CD8β之共表現以及缺少CD56及CD16表現指示習用T細胞發育。數據代表3個生物重複。(b) 在6週或7週時用7.5-18×10 3個起始CB HSPC產生之經TCR轉導對經模擬物轉導之ATO中相對於起始HSPC數之增強的總細胞輸出及細胞產量。顯示生物重複實驗之平均值及SD (模擬物n=3，TCR n=8，**p=0.002)。(c) 人工抗原呈遞細胞(aAPC)對經TCR改造之ATO源T細胞之細胞毒性引發。CD3+四聚體+CD8SP T細胞因應K562細胞或K562 aAPC之細胞介素產生及CD107a膜動員，該等K562 aAPC表現CD80及呈遞不相關(MART1 26-35)或同源(NY-ESO1 156-165)肽之HLA-A*02:01單鏈三聚體。數據代表三個生物重複。(d) 經72 h ATO源CD3+四聚體+CD8SP T細胞因應不相關(MART1)或同源(NY-ESO-1) aAPC之增殖(CFSE稀釋)及活化(CD25上調)。數據代表兩個生物重複。(e) 在7天及14天後，相對於起始細胞數因應抗CD3/CD28及IL-2或IL-7/IL-15之ATO擴增後的來自經TCR轉導之ATO之ATO源CD3+TCRαβ+CD8SP T細胞。顯示技術性一式三份之平均值及SD，且數據代表三個生物重複。(f) 與未經轉導之ATO (n=5)相比，來自經TCR轉導之ATO (n=3)之CD3+TCRαβ+四聚體+CD8SP細胞中內源TCR Vβ之等位基因排除，如藉由流式細胞測量術分析所顯示。誤差槓代表SD。 圖 18A-F ：經 TCR 改造之 ATO 源 T 細胞之抗原特異性腫瘤細胞殺死。(a、b) 經TCR改造之ATO源T細胞對抗原陽性腫瘤細胞之活體外細胞毒性。用抗CD3/28 +IL-2將來自經HLA-A*02:01/NY-ESO-1 157-165特異性TCR轉導之ATO之CD8SP T細胞活化36 h，且與K562細胞、經呈遞不相關(MART1 26-35)或同源(NY-ESO1 156-165)肽之HLA-A*02:01單鏈三聚體轉導之K562細胞(分別為K562-MART-1及K562-ESO)或HLA-A*02:01+ NY-ESO-1+ U266多發性骨髓瘤細胞系共培育。(a) 在9 h時藉由流式細胞測量術測定早期(膜連蛋白V+ DAPI-)或晚期(膜連蛋白V+ DAPI+)凋亡腫瘤細胞%。基於共培養開始時之四聚體+ T細胞%來計算效應物:靶(E:T)比率。數據代表兩個生物重複。(b) (a)中所顯示細胞毒性分析之特異性細胞死亡。調節未接受T細胞之孔中總膜連蛋白V+細胞之自發(非特異性)細胞死亡。(c) 在T細胞之延長ATO活化/擴增後之後保留的抗原特異性。用抗CD3/28及IL-2使自經TCR轉導之ATO分離之CD8SP T細胞擴增14天，且如(a)中所述實施細胞毒性分析。顯示使用在相同條件下擴增14天之經TCR轉導之末梢血CD8+供體T細胞的分析用於比較。(d-f) 經TCR改造之ATO源T細胞之活體內腫瘤控制。將來自經TCR轉導之ATO之CD8SP T細胞活化/擴增14天，如(c)中所述。(d) 將5.7×10 6個T細胞(包括藉由四聚體染色之4.5×10 6個抗原特異性T細胞)或PBS IV注射至在3天前皮下植入2.5×10 5個經螢光素酶轉導之K562-ESO或K562-MART腫瘤細胞的NSG小鼠中。(e) K562-ESO對K562-MART1腫瘤細胞對ATO CD8SP之反應。在所指示時間點記錄生物發光。顯示2-3隻小鼠/組之平均值及SD (PBS n=2，含有K562-ESO之經TCR轉導之ATO T細胞n=3，或含有K562-MART1之經TCR轉導之ATO T細胞n=2) (**p=0.00033，****p=0.000066)。(f) 來自(d)及(e)中所述分析之所選小鼠之生物發光成像。應注意，中列顯示總共三隻攜載K562-ESO之小鼠中經其中腫瘤生長之ATO CD8SP T細胞處理之唯一小鼠。 圖 19 ：來自固體組織樣結構之 ATO 。蘇木素及伊紅染色顯示用CB HSPC及MS5-hDLL1 (即ATO) (左圖)、親代MS-5細胞(中圖)或單獨MS5-hDLL1細胞(右圖)產生之第6週3D培養物之組織架構。放大倍數係100× (頂列)或400× (底列)。 圖 20 ：起始HSPC數/ATO影響細胞產量/HSPC，但不影響總細胞輸出或T細胞分化。(A) 用不同數量之CD34+CD3- CB HSPC (0.3-30×10 3個/ATO)及恆定數量之MS5-hDLL1基質細胞(1.5×10 5個/ATO)產生之第6週ATO中之總細胞數及產量/輸入HSPC。在右側顯示使用較大ATO (使用30×10 3個HSPC及6×10 5個基質細胞，比率為1:20)之比較。(B) 如(A)中所述之ATO中之T細胞前體及成熟T細胞頻率。顯示一式三份ATO之平均值及SD。數據代表兩個生物重複。 圖 21 ：ATO中之T細胞分化係高度可再現的且不受B27批次變化、不含異源成份之B27或基質輻照影響。在自單一CB (7.5×10 3個CD34+CD3- HSPC/ATO)產生且使用4個不同批次之B27補充物(標記為A-D)培養之第6週ATO中，B27批次變化對(A) T譜系定型、(B-C) T細胞分化、或(D) 總細胞數無顯著效應。顯示每一B27批次之重複ATO (n=2-3)。(E) 用不含異源成份之B27取代B27對第6週ATO中之T細胞分化或(F) 總細胞數無顯著影響。在ATO產生之前用20-80 Gy輻照MS5-hDLL1基質細胞對(G-I) T細胞分化、或(J) 總細胞數及CD3+TCRαβ+CD8SP T細胞數具有極小影響。顯示一式三份ATO之平均值及SD。數據代表兩次個別實驗。(H)中之流圖顯示來自(G)中所顯示CD3+TCRαβ+門之細胞。(K) 在6週時藉由機械破壞自ATO收穫細胞，產生＞99%人類造血CD45+細胞(頂圖)及＜0.5% GFP+基質(底圖)之懸浮液。顯示8個生物重複ATO之人類及鼠類細胞之頻率。 圖 22 ：在 ATO 對單層培養系統中增強的正向選擇。在6週時在OP9-DL1單層培養物對ATO中單核球(CD14+)、NK細胞(CD56+)、B細胞(CD19+)、HSPC (CD34+)或T譜系細胞(CD7+CD5+)之頻率以及T細胞前體及T頻率細胞類型(在每一圖上指示連續設門)。培養物係對於單層及ATO培養物使用相同CB單元來起始。數據代表三個生物重複。 圖 23A-B ： ATO 中胸腺細胞生成及初始 T 細胞表型之重演。(a) 與出生後胸腺相比CB ATO中之HLA-DR+細胞之頻率(針對CD45+細胞設門)。(b) 多個HLA-DR+抗原呈遞細胞(APC)群存在於第6週ATO中。在每一圖上顯示連續設門。HLA-DR+群包括單核球(CD14+)、顆粒球(CD66b+)、B細胞(CD19+)、HSPC (CD34+)、漿細胞樣DC (CD303+CD123+)、CLEC9A+ DC (CD141+CLEC9A+)及CD1c+ DC (CD1c+CLEC9A-)。顯示出生後胸腺之成對分析用於比較。(a)及(b)中之數據代表三個生物重複。 圖 24A-B ：在 3 週 ATO 中來自 LMPP 及 CD24- CLP 之 T 細胞定型之早期發生，其係由(a) DP之早期出現及(b) T細胞定型之CD34+CD7+祖細胞之早期出現 揭露。b)中之數據係針對CD34+細胞設門，如a)中所顯示。數據代表兩個生物重複。 圖 25A-E ： ATO 源 T 細胞之 TCR 多樣性及功能驗證。(a) RAG1及 RAG2表現於ATO源CD3+CD4+CD8+ (DP)而非成熟CD3+CD8SP T細胞中，此與人類胸腺細胞相似。顯示相對於在FACS分選之ATO源及出生後胸腺源T細胞群中之 B2M表現， RAG1及 RAG2之定量RT-PCR。顯示一式三份反應之平均值及SD。(b) 在自第7週ATO (n=5)或人類胸腺(n=4)分離之CD3+TCRαβ+CD4SP T細胞中TCR多樣性之產生，如藉由TCR Vβ家族表現之頻率之流式細胞測量術分析所顯示。(c) 經PMA/離子黴素處理6 h之第12週ATO源CD4SP T細胞之細胞介素產生。數據代表兩個生物重複。(d) 在5天後臍帶血(CB)及ATO源(第12週) CD4SP T細胞因應抗CD3/CD28及IL-2之增殖(CTV稀釋)及活化(CD25上調)。數據代表兩次個別實驗。(e) 在7天及14天後，相對於起始細胞數因應抗CD3/CD28及IL-2之ATO擴增後的ATO源CD4SP T細胞。顯示技術性一式三份之平均值及SD。 圖 26A-D ： ATO 中經 TCR 改造 T 細胞之分化及等位基因排除。(a) 經TCR改造之ATO源T細胞保留習用T細胞表型，與擴增及再刺激無關。用抗CD3/28珠粒+ IL-2活化自經HLA-A*0201/NY-ESO-1 157-165特異性TCR轉導之CB HSPC產生之ATO的CD8SP T細胞，於IL-2中擴增，且在第14天時用抗CD3/28珠粒再刺激。藉由流式細胞測量術確認保留的CD8α及CD8β表面共表現。數據代表兩個生物重複。(b) 來自經TCR轉導之CB ATO之CD3+TCRαβ+四聚體+CD8SP T細胞之流式細胞測量術Vβ分析。數據代表5個生物重複。(c) 在使用HLA-A*02:01/MART1 26-35特異性TCR之ATO中自經TCR轉導之CB HSPC產生經TCR改造之T細胞。顯示第6週時之分化(針對總CD14-CD56- ATO細胞設門，且在每一圖上顯示連續設門)。數據代表兩個生物重複。(d) 人工抗原呈遞細胞(aAPC)對經MART1特異性及NY-ESO-1特異性TCR改造之ATO源T細胞之抗原特異性引發，該等人工抗原呈遞細胞表現CD80及呈遞MART1 26-35或NY-ESO1 156-165肽之HLA-A*02:01單鏈三聚體。顯示6 h時之CD107a膜動員及細胞內IFNγ染色。 圖 27A-B ：經 TCR 改造之 T 細胞在 MHC 改質之 ATO 中增強的正向選擇。(a) 在用來自單一供體之經TCR轉導之CB HSPC及標準或HLA-A*02:01轉導之MS5-hDLL1基質細胞產生之第6週ATO中，經TCR改造之CD3+TCRαβ+四聚體+CD8SP T細胞之增強的產生。在每一圖上顯示連續設門。(b) 在MHC改質之ATO中經TCR改造之T細胞至成熟初始T細胞表型之正常成熟，如(a)中所顯示。針對CD3+Vβ13.1+四聚體+CD8SP T細胞對細胞設門。數據代表三個生物重複。 圖 28A-C ：未經修飾之人類基質系 HS27a 不支持 T 細胞分化。將人類基質細胞系(HS27a)用於無載體介導之notch配體表現之ATO系統中。測試來自三個不同臍帶血樣品之CD34+ HSPC：(a) E37、(b) E43、(c) E68。在第4週時，在Notch信號傳導不存在下，無臍帶血供體可產生CD5+CD7+ T細胞定型之細胞。除非另外顯示，否則所顯示之數據係針對CD45+CD56-CD14-設門。 圖 29A-F ：人類基質系 HS27a 中之 Notch 配體表現可支持 ATO 中之 T 細胞分化。顯示來自用經由慢病毒轉導改造以表現hDLL1之HS27a製得之ATO之數據。來自圖28中所顯示三個相同臍帶血樣品之CD34+ HSPC：(a,b) E37、(c,d) E43及(e,f) E68。比較使用HS27a-hDLL1 ATO之數據與使用MS5-hDLL1基質作為陽性對照獲得之數據。在第4週時，所有三個臍帶血供體在HS27a-hDDL1及MS5-hDLL1 ATO二者中產生CD5+CD7+ T細胞定型之細胞。除非另外顯示，否則所顯示數據係針對CD45+CD56-CD14-設門。 圖 30 ：在 4 週 HS27a-DLL1 ATO 中產生之大多數 CD8+ 細胞不表現 CD3 或 TCRab 。顯示比較MS5-hDLL1 ATO與HS27a-DLL1 ATO之數據。 圖 31A-C ： HS27a-hDLL1 ATO 可支持成熟 T 細胞之分化。顯示使用三個不同臍帶血群(a) E37、(b) E43、(c) E68在MS5-hDLL1 ATO及HS27a-hDLL1 ATO (在4週時)中之T細胞分化。數據係針對CD45+CD56-CD14-設門，且在右圖中另外針對CD3+TCRab設門。 圖 32A-B ：在第 5 週時在 ATO 中來自人類胚胎中胚層祖細胞 (hEMP) ( 自 hESC 產生 ) 之 T 細胞分化。(a)中顯示針對CD56-CD14-設門之T細胞群。(b)中顯示針對CD56-CD14-設門之細胞及如圖所顯示之另一設門(底列)。 圖 33A-B ：在 ATO 中來自 hEMP 之 T 細胞分化之動力學。(a)中顯示如在3週、5週及7週時所顯示設門之群。(b)中顯示在7週時分化之進一步分析，顯示CD3+TCRab細胞係CD8ab+。 圖 34A-C ： hES 源 hEMP 產生具有成熟初始表型之 T 細胞。顯示第5週時ATO之分析，(A) TCRab+CD3+群包含CD4+及CD8+細胞及DP細胞。(B) CDSP8及(C) CDSP4細胞之進一步分析 圖 35A-B ：成熟標記物在 hEMP 源 T 細胞中之表現。(a)中顯示第5週時CD8SP細胞之分析。(b)中顯示在第5週時CD4SP細胞之分析。 圖 36 ： T 細胞產生在多個 hESC 系中係可再現的。在ATO系統中自三個不同hESC系產生之hEMP產生T細胞。 圖 37 ：使用 ATO 系統自 iPSC 產生 T 細胞。此圖展示在ATO系統中iPSC系(HLA.A02.02，來自健康供體之皮膚纖維母細胞)產生T細胞。數據來自第6週。 圖 38A-B ：直接聚集在 ATO 中之未分化之 hESC 可產生 T 細胞。顯示來自第5週(a)及第7週(b) ATO之T細胞群。 圖 39 ：在使用表現 JAG1 之基質細胞之 ATO 系統中自 hEMP 產生成熟 T 細胞。 圖 40 ：在 ATO 系統中自 hEMP 產生之 T 細胞顯示多樣 TCR Vb 譜。顯示第5週時在ATO (CD8SP)中自hEMP產生之T細胞之TCR Vb家族使用的流式細胞測量術分析。比較結果與胸腺細胞中之TCR Vb家族效用。 圖 41A-B ： hESC 源 T 細胞展現因應抗 CD3/CD28 及 IL2 之增殖及 CD25 上調。測試在ATO中自hESC (第5週)產生之CD8 SP T細胞之活體外功能。(a) 用CTV (紫色細胞示蹤劑)對經分離細胞染色且與CD3/CD28活化珠粒一起培育5天。細胞經歷多次細胞分裂(如藉由CTV之稀釋所顯示)以及活化及CD25之表現。(b) 用PMA/離子黴素將經分離細胞處理6小時且細胞內染色顯示產生細胞毒性細胞介素(IFNg、IL2、TNFa)。 圖 42 ：在 ATO 系統中自 hESC 產生經改造 T 細胞之方案。用表現GFP之opt1G4載體(NY-ESO TCR)轉導H1 hESC。藉由分離GFP+細胞並使其擴增來產生H1 NY-ESO TCR hESC系。然後將細胞提交至與上文所述相同之方案來誘導T細胞分化。 圖 43A-B ：經 NY-ESO TCR 改造之 T 細胞之表徵。顯示(a) 第3週及(b) 第5週之FACS數據。顯示來自未經轉導之hESC (H1)及經TCR轉導之hESC之數據。藉由GFP及四聚體之表現及用於T細胞分化之標記物表現(DP、CD3+/TCR+ CD8SP)來鑑別在ATO中自hESC產生之經改造T細胞。 圖 44A-B ：發現(a) 經改造之hESC源CD8SP T細胞顯示成熟初始表型，及(b) 成熟標記物在經改造之ES源T細胞中表現。 圖 45顯示在ATO擴增(第5週)後5天，經分離之NY-ESO TCR CD8SP細胞在CD3/28或aAPC刺激時經歷活化。 圖 46顯示經分離之NY-ESO TCR CD8SP細胞因應刺激產生細胞毒性細胞介素(IFNg、IL2、TNFa)。 圖 47展示經改造hESC源(hEMP) T細胞因應人工抗原呈遞細胞(K562)之特異性活化。分析顯示因應表現同源(NY-ESO)肽而非不相關(MART-1)肽之aAPC產生細胞毒性細胞介素(IFNg、IL2、TNFa)及去粒(CD107a)。 圖 48顯示經TCR轉導之ES源T細胞顯示因應抗CD3/CD28之穩健擴增。 圖 49顯示使用缺失單一組份(胰島素(-ins)、Vit A、抗氧化劑(AO))或不含異源成份(xeno free)之不同B27補充物形式與標準(完全) B27 (Comp)相比之數據。ATO培養物係用CD34+CD3-臍帶血HSPC起始且在6週時分析。顯示總細胞數及為CD5+CD7+ T細胞前體之培養物%。 圖 50顯示使用缺失單一組份(胰島素(-ins)、Vit A、抗氧化劑(AO))或不含異源成份(xeno free)之不同B27補充物形式與完全B27 (Comp)相比之數據。數據顯示胰島素為T細胞定型所必需且維生素A及抗氧化劑促進細胞輸出。 圖 51繪示用於以下實驗中之第2代CD19靶向CAR之設計。 圖 52顯示經CAR轉導之CB ATO之FACS分析，其展示ATO中之CAR表現(即GFP+)極大地受限於為CD3-TCRab-及CD3-TCRgd-之T譜系細胞(CD5+及CD7+)。 圖 53顯示經CAR轉導之CB ATO之FACS分析，其展示ATO源CAR-T細胞顯示非習用T細胞分化，即CD5+CD7+CD3-TCRab-CD4-CD8-。顯示經模擬物轉導之ATO用於比較。 圖 54顯示，CB ATO源CAR-T細胞顯示初始T細胞表型(CD45RA+)且在表型上成熟(CD27+CCR7+)。 圖 55顯示CB ATO源CAR-T細胞表現CD2及細胞內CD3e 圖 56A-B ：ATO源CB CAR-T細胞係CD4-CD8- (DN)或表現CD8αα同二聚體(a)，且表現與IEL (及NK細胞)相關之CD56及CD16 (b)。 圖 57顯示ATO中CAR-T細胞激動劑選擇之假設模型。 圖 58展示藉由TCR共轉導恢復CB ATO CAR-T細胞中之CD3/TCR複合物表現(而非CD4或CD8表現)。 圖 59顯示CB ATO源CAR+TCR+ T細胞中之功能TCR重構。 圖 60顯示CB ATO源CD19 CAR-T細胞之功能分析。CAR-T細胞因應CD19+細胞(經CD19載體轉導之K562、Nalm6及Raji細胞)之細胞介素釋放及活化(在無額外活化/共刺激下分析)。 圖 61顯示CB ATO源CAR-T細胞之細胞毒性分析。CD19+靶係Nalm6且CD19-對照係K562 (未經轉導)。 圖 62顯示在CB-ATO中在CAR構築體之不同共活化及scFv結構域中觀察到IEL樣CD8aa CAR-T細胞之產生(推測係經由激動劑選擇)。 圖 63顯示在ATO中經CAR轉導之人類ES細胞可產生CAR-T細胞。針對CD45+對細胞設門。顯示第1-4週時自未經轉導之H1 hESC或經CAR轉導之hESC產生之hEMP之ATO的分析 圖 64顯示來自人類ES細胞之ATO源CAR-T細胞展現非習用T細胞分化。針對CD45+對細胞設門。顯示第1-4週時自未經轉導之H1 hESC或經CAR轉導之hESC產生之hEMP的ATO之分析。 圖 65顯示來自人類ES細胞之ATO源CAR-T細胞不表現CD8β。顯示兩次實驗(657及659)在所顯示時間點之數據。細胞係自未經轉導之H1 hESC或經CAR轉導之hESC產生之hEMP產生且針對CD45+設門 圖 66A-B顯示來自人類ES細胞之ATO源CAR-T細胞因應PMA/離子黴素產生細胞介素。藉由在(a)中針對干擾素γ及TNF α及在(b)中針對干擾素γ及IL-2之細胞內染色顯示活化。數據來自第5週ATO。 圖 67顯示來自人類ES細胞之ATO源CAR-T細胞因應CD19+靶細胞(Cd19+K562、Nalm6、RAJI細胞)而非親代(Cd19-) K562細胞產生細胞介素及去粒。數據來自第5週hESC-ATO且根據CD7+CD45RA+對細胞設門。 圖 68顯示ATO (MS5-DLL1)及單層(OP9-DLL1)系統皆允許維持CD34+ T細胞祖細胞及定型至CD5+CD7+ T細胞前體。顯示第4週CB-ATO，如所顯示設門，源自三個不同的CB樣品(E37、E43、E68)。 圖 69顯示ATO及OP9-DLL1系統皆允許細胞定型至T細胞譜系，如由CD5及CD7之表現所顯示。然而，ATO系統在產生CD4+CD8+雙陽性細胞(DP)方面極為優異。顯示第4週CB-ATO，如所顯示設門，源自三個不同的CB樣品(E37、E43、E68)。 圖 70顯示TCRab+CD3+細胞穩健群之穩健產生，該穩健群在CB-ATO系統而非在OP9-DLL1單層系統中為DP及CD8SP。顯示第4週CB-ATO，如所顯示設門，源自三個不同的CB樣品(E37、E43、E68)。 圖 71顯示圖70中所呈現數據之數值表示。 
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Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002

Claims (12)

  1. 一種成熟CD4 +CD8 −或CD8ab +CD4 −T細胞群之用途，其用於製備治療患者之腦癌之醫藥品，該成熟T細胞群係藉由包含培養三維(3D)細胞聚集體之方法自幹細胞或祖細胞產生，該3D細胞聚集體包含： a)  MS5基質細胞，其表現Notch配體； b)  經選擇之造血幹細胞或祖細胞群； 其中該3D細胞聚集體係於包含胰島素、FLT3配體(FLT3L)、IL-7及抗壞血酸之無血清培養基中經培養一段足以使該等造血幹細胞或祖細胞在活體外分化為成熟CD4 +CD8 −或CD8ab +CD4 −T細胞之時間； 其中該3D細胞聚集體不包含外源基質或支架； 其中該等造血幹細胞或祖細胞係(i)自胚胎幹細胞(ESC)、誘導性多潛能幹細胞(iPSC)或人類胚胎中胚層祖細胞之培養中產生；或(ii)分離自骨髓、臍帶血、胸腺、末梢血(peripheral blood)或經動員血(mobilized blood)。
  2. 一種先天樣(innate-like)CD4 −CD8 −或CD4 −CD8aa +T細胞群之用途，其用於製備治療患者之腦癌之醫藥品，該先天樣T細胞係藉由包含培養3D細胞聚集體之方法自幹細胞或祖細胞產生，該3D細胞聚集體包含： a)  MS5基質細胞，其表現Notch配體； b)  經選擇之造血幹細胞或祖細胞群； 其中該3D細胞聚集體係於包含胰島素、FLT3L、IL-7及抗壞血酸之無血清培養基中經培養一段足以使該等造血幹細胞或祖細胞在活體外分化為先天樣CD4 −CD8 −或CD4 −CD8aa +T細胞之時間； 其中該3D細胞聚集體不包含外源基質或支架； 其中該等造血幹細胞或祖細胞係(i)自胚胎幹細胞(ESC)、誘導性多潛能幹細胞(iPSC)或人類胚胎中胚層祖細胞之培養中產生；或(ii)分離自骨髓、臍帶血、胸腺、末梢血(peripheral blood)或經動員血(mobilized blood)。
  3. 如請求項1或2之用途，其中該腦癌係神經膠質瘤(glioma)或神經膠母細胞瘤(glioblastoma)。
  4. 如請求項1或2之用途，其中該等T細胞對於該患者為同種異體的(allogeneic)。
  5. 如請求項1或2之用途，其中該方法進一步包含離心該等幹細胞或祖細胞及該等基質細胞以形成3D細胞聚集體。
  6. 如請求項1或2之用途，其中該等基質細胞具有外源核苷酸序列，其編碼完整、部分或經修飾之Notch配體，該Notch配體係DLL4、DLL1、JAG1、JAG2或其組合。
  7. 如請求項1或2之用途，其中該等基質細胞表現外源人類主要組織相容性複合物(MHC)、外源抗原特異性共刺激分子或細胞介素、外源抗原或其組合。
  8. 如請求項1或2之用途，其中該等造血幹細胞或祖細胞包含一或多個外源T細胞受體(TCR)、嵌合抗原受體(CAR)及HLA表現或功能之基因修飾。
  9. 如請求項1或2之用途，其中源自該3D細胞聚集體之該等T細胞不經由等位基因排除表現內源TCR，或該等T細胞包含插入內源TCR基因座之外源TCR基因。
  10. 如請求項1或2之用途，其中源自該3D細胞聚集體之該等T細胞表現外源TCR及CAR中之一者或二者。
  11. 如請求項10之用途，其中該CAR包含CD19 CAR。
  12. 如請求項10之用途，其中該外源TCR係NY-ESO-1特異性TCR。
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