CN110499288A - 体外诱导造血干细胞向胸腺t细胞分化的试剂盒及其应用 - Google Patents

体外诱导造血干细胞向胸腺t细胞分化的试剂盒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110499288A
CN110499288A CN201910876838.XA CN201910876838A CN110499288A CN 110499288 A CN110499288 A CN 110499288A CN 201910876838 A CN201910876838 A CN 201910876838A CN 110499288 A CN110499288 A CN 110499288A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
thymus
dll4
cells
stem cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910876838.XA
Other languages
English (en)
Inventor
龚拯
张万明
王斌
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qingdao Huasaiberman Medical Cell Biology Co Ltd
Original Assignee
Qingdao Huasaiberman Medical Cell Biology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qingdao Huasaiberman Medical Cell Biology Co Ltd filed Critical Qingdao Huasaiberman Medical Cell Biology Co Ltd
Priority to CN201910876838.XA priority Critical patent/CN110499288A/zh
Publication of CN110499288A publication Critical patent/CN110499288A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/125—Stem cell factor [SCF], c-kit ligand [KL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2307—Interleukin-7 (IL-7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/26—Flt-3 ligand (CD135L, flk-2 ligand)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/42—Notch; Delta; Jagged; Serrate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C12N2502/1323—Adult fibroblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/11—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells

Abstract

本发明发现了体外诱导造血干细胞向胸腺T细胞分化的试剂盒及其应用。本发明的体外诱导造血干细胞向胸腺T细胞分化试剂盒包含CXCL12蛋白。本发明的意义在于DN2或DN3是T细胞胸腺发育的两个重要阶段。DN2到DN3是一个相对连续的过程，并且从DN1到DN2细胞经过10次分裂细胞总数增加1000倍左右，并且在DN2阶段细胞分化已完全限定在T系，同时Υσ和αβT细胞定向分化也已完成；并且DN2与DN3阶段细胞位于T细胞发育的β选择、阳性选择和阴性选择之前，在体外诱导的异体DN2或DN3细胞具有定植胸腺并发育成为功能完全的成熟T细胞同时细胞数也在异体胸腺内得到大量扩增，并通过异体胸腺的阴选和阳选成为没有对受体耐受的T细胞，因此成为通用型Car‑T的基础。

Description

体外诱导造血干细胞向胸腺T细胞分化的试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于分子和细胞生物学领域，特别涉及细胞分化。
背景技术
免疫系统，特别是T细胞群的重建，是治疗艾滋病、肿瘤、衰老的重大临床问题之一。当前HIV-1感染所致的获得性免疫缺陷综合征(acquired immune deficiencysyndrome,AIDS)是一个重大的公共健康威胁，艾滋病往往伴随着免疫功能下降或受到抑制，进而导致一系列临床症状。在完全抑制HIV病毒繁殖和清除病毒后，CD4+T细胞数量和功能的恢复与重建，一直是艾滋病治疗的终极目标。目前抗逆转录病毒治疗(anti-retroviral therapy,ART)能改善患者的生活质量并延长寿命，降低了机会性感染率和早期死亡率，这种效果与病毒引起的免疫退化终止，以及其在一定程度上免疫功能的重建有关。但是该法治疗后短期内，机体免疫重建并不快，外周血CD4+T淋巴细胞数增加有限。此外，临床上约有16％患者在ART长期治疗后，病毒得到抑制的情况下仍不能取得良好的免疫重建，导致发生免疫重建不良现象。另一方面，感染艾滋病毒患者随着免疫功能下降，往往合并感染乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)，以及ART治疗过程中药物产生的肝毒性，所以常会导致病人严重的肝硬化和肝功能的丧失。因此，也很有必要寻找有效的治疗策略以满足这些艾滋病合并肝炎病毒感染患者的治疗。
近年来课题组和复旦大学上海市公共卫生临床中心合作研究发现：通过肝门静脉输注进行自体骨髓移植(autologous bone marrow transplantation,ABMT)，能够促进艾滋病合并肝硬化病人外周血CD4+T细胞的重建。这个现象引起了发明人的注意，其表明可以通过ABMT有效辅助治疗艾滋病患者。随后发明人尝试在肝脏正常的艾滋病患者上，重复该项实验，结果却没有看到CD4+T细胞水平的上升。表明患者的肝硬化在其中起到了重要的作用。探索研究该现象及其机制具有十分重要的现实意义，考虑到肝脏是一个十分复杂的器官，肝纤维化状态下其微环境又极其特殊，因此发明人进而对其导致该现象的机制进行阐明，以有助于开发治疗艾滋病的新途径和新药物。
众所周知，胸腺是T淋巴细胞发育和分化的主要场所。本质上，它可被视为一个由高度特化的胸腺上皮细胞构成的三维网络，其间充满着不同发育阶段T细胞。在上皮细胞所提供的各种信号的支持下，从骨髓迁入胸腺的造血祖细胞展开既定的发育程序，经历增殖、定向分化、TCR重排、β选择、阳性选择和阴性选择等复杂发育过程，最终形成一个具有高度多样性，并能有效区分“自我”与“非我”的T细胞库。T细胞在胸腺内的发育是一个高度有序的、多阶段、极为复杂的过程，如图1所示，不同的发育阶段有赖于胸腺微环境所提供的各异的信号。胸腺内T细胞发育包括DN(双阴)、DP(双阳)和SP(单阳)三个主要阶段，DN阶段又可以分为DN1-4四个不同阶段，其表面标志物分别为：Lin-CD25-CD44+、Lin-CD25+CD44+、Lin-CD25+CD44-、Lin-CD25-CD44-，DP细胞其表面标志物分别为：CD3+CD4+CD8+，SP细胞其表面标志物分别为：CD3+CD4-CD8+或CD3+CD4+CD8-，胸腺T细胞相应也由这几群细胞组成。所用的Lineage cocktail由标记的B220,CD3e,CD4,CD8α,CD19,CD11b,Gr1,Ter119,CD11c,andNK1.1抗体组成。
考虑到哺乳动物肝脏是一个十分特殊和复杂的器官，肝脏在胚胎期参与机体的造血。但当出生后，其造血功能丧失，而成为具有分泌各种蛋白、胆汁及解毒等多种功能的实体器官。那么是不是在肝纤维化和肝硬化过程中，肝脏又恢复了这种造血能力，为胸腺提供淋巴前体细胞，从而使得外周血T细胞的水平升高呢？换而言之，胸腺T细胞生成的能力在一定程度上受淋巴前体细胞的多少来决定的。事实上，在临床上中老年人的胸腺产生很少T细胞，但放射后再进行骨髓移植，又能够促进T细胞大量产生，说明胸腺产生T细胞的能力是可以恢复的。
此外也要考虑T细胞在胸腺外发育和分化的可能性，大量文献表明，胸腺是T淋巴细胞发育和分化的重要场所，但并不是唯一场所。固然，T细胞的胸腺外发育和分化在机体正常状态下显得微不足道，但是当机体处于自身免疫疾病、胸腺切除、以及老年状态时就会显出尤其重要的作用。早在1995年就有T细胞在小肠和肝脏等脏器内，进行胸腺外发育和分化的报道。在肝脏中也存在着一部分非胸腺来源的T细胞群体，其发育成熟由T系前体细胞在肝脏中完成。基因Rag1和Rag2(Recombinase-activated genes 1and 2)是参与淋巴细胞发育过程中基因重排的重要基因，其在正常人肝脏来源的淋巴细胞中具有较高程度的表达，表明在肝脏中存在淋巴细胞的发育和分化的过程。可见肝脏是能够成为T细胞胸腺外发育的重要场所，能对T细胞发育产生不同程度的影响，但是目前对肝脏T细胞胸腺外发育的机制鲜有报道。但是不论从结构还是细胞学的角度，肝脏产生大量T细胞的可能性很小，即便是胚胎和婴儿期，T细胞的产生仍然主要依靠胸腺。
课题组和复旦大学上海市公共卫生临床中心合作的临床研究表明：通过肝门静脉输注进行自体骨髓移植，能够促进艾滋病合并肝硬化病人外周血CD4+T细胞的重建，而在肝脏正常的艾滋病患者上，却没有看到CD4+T细胞水平的上升。
虽然OP9-DL1基质细胞诱导T细胞培养体系已被越来越多的实验室采纳和使用。但是也要看到，该体外诱导系统尚存在一些理论上和实际应用方面的问题。首先，OP9细胞不表达MHC分子和CD1d分子，无法实现发育过程中T细胞或NKT细胞的阳性选择和阴性选择；另外，OP9是鼠源的骨髓基质细胞，因此尚需对其诱导产生的人源T淋巴细胞的确切性质做进一步的研究，如：T细胞表面TCR分子的表达谱型、T细胞的体内外功能等。因此也有必要寻找与OP9类似能产生相同作用的细胞类型和参与该作用的细胞因子。
发明内容
本发明其中一个目的在于提供一种体外诱导造血干细胞向胸腺T细胞分化的方法和试剂盒，可以用于重建免疫系统，特别是T细胞群的重建，治疗艾滋病、肿瘤、衰老的重大临床问题研究。本发明有助于开发治疗艾滋病的新途径和新药物。本发明所有权利要求不包含限制疾病的治疗或诊断方法的内容。
根据本发明技术的其中一方面提供了一种体外诱导造血干细胞向胸腺T细胞分化试剂盒，该体外诱导造血干细胞向胸腺T细胞分化试剂盒包含CXCL12蛋白。
根据本发明技术的其中一方面还提供了一种体外诱导造血干细胞向胸腺T细胞分化试剂盒，该体外诱导造血干细胞向胸腺T细胞分化试剂盒包含有共培养饲养层细胞。
根据本发明技术的其中一方面还提供了一种体外诱导造血干细胞向胸腺T细胞分化试剂盒，其中上述共培养饲养层细胞为DLL4过表达的小鼠或人肝脏成纤维细胞、DLL4过表达的OP9细胞系、DLL4过表达的TSC细胞系中任意一种或多种的组合。
根据本发明技术的其中一方面还提供了一种体外诱导造血干细胞向胸腺T细胞分化试剂盒，其中上述的DLL4过表达的小鼠或人肝脏成纤维细胞为原代细胞。
根据本发明技术的其中一方面还提供了一种体外诱导造血干细胞向胸腺T细胞分化试剂盒，该体外诱导造血干细胞向胸腺T细胞分化试剂盒包含有重组DLL4蛋白包被的培养皿。本发明发现只有包被的DLL4蛋白才能起作用，而可溶性重组DLL4蛋白无效。我们研究表明可溶性蛋白阻断了其配体notch向下游进行信号转导。如果使用DLL4包被的培养皿，共培养饲养层细胞可以为：小鼠或人肝脏成纤维细胞、OP9细胞系、TSC细胞系；以及DLL4过表达的小鼠或人肝脏成纤维细胞、DLL4过表达的OP9细胞系、DLL4过表达的TSC细胞系等饲养层细胞。
根据本发明技术的其中一方面还提供了一种体外诱导造血干细胞向胸腺T细胞分化试剂盒，其中上述共培养饲养层细胞为小鼠或人肝脏成纤维细胞、OP9细胞系、TSC细胞系共培养饲养层细胞中任意一种或多种的组合。只有DLL4包被的才不需要过表达细胞。
根据本发明技术的其中一方面还提供了体外诱导造血干细胞向胸腺T细胞分化试剂盒，该试剂包含上述任意一种试剂盒并且还包含细胞因子：SCF、IL-7、Flt3L。其使用终浓度为25-50ng/mL的SCF、5-10ng/mL的Flt3L、1-20ng/mL的IL-7。
根据本发明技术的其中一方面还提供了一种上述重组DLL4蛋白包被的培养皿的包被方法，采用DLL4重组蛋白进行包被，包被浓度为10μg/ml 4℃24h或37℃4h。
根据本发明技术的其中一方面还提供了一种使用上述任意一种体外诱导造血干细胞向胸腺T细胞分化试剂盒体外诱导造血干细胞向胸腺T细胞分化的方法，该所述方法含有步骤：
步骤1：配制含15％FBS的MEMα培养基，并添加终浓度为25-50ng/mL的SCF、5-10ng/mL的Flt3L、1-20ng/mL的IL-7、20-100ng/mL的CXCL12；
步骤2：上述的共培养饲养层细胞以1×105细胞量铺设试剂盒培养皿；
步骤3：将1×105分选获得的造血干细胞加入步骤2的培养皿的培养基中并混匀，置培养箱共培养。
步骤4：定时换液；
步骤5：收获细胞将细胞吹散；过筛网，然后采用磁珠分选或者流式抗体标记后流式分选获得DN2或DN3细胞。
根据本发明技术的其中一方面还提供了上述意一种的体外诱导造血干细胞向胸腺T细胞分化试剂盒的应用，体外诱导造血干细胞向胸腺T细胞分化试剂盒应用于制备胸腺T细胞，该胸腺T细胞作为人或动物T细胞群的重建的药物。
根据本发明技术的其中一方面提供了一种体外诱导造血干细胞向胸腺T细胞分化试剂盒，本体外诱导造血干细胞向胸腺T细胞分化试剂盒包含如下组分：
DLL4包被过的培养皿或未包被过的培养皿，
饲养层细胞，
SCF、IL-7、Flt3L和CXCL12，
MEMα完全培养基。
尝试在动物水平重复背景技术中临床实验，将CD45.1小鼠骨髓，门静脉注射入辐照后的CD45.2患有经CCl4诱导产生肝纤维化的小鼠，与没有纤维化的小鼠相比纤维化小鼠显示出其CD45.1+细胞在胸腺内和外周具有更快速的重建恢复现象(详见图3)。可见肝纤维化状态下其微环境的改变，可能参与了促进造血干细胞(Hematopoietic stem cell,HSC)到成熟T细胞发育的过程。考虑到正常成熟T细胞发育是一个高度有序的、多阶段、极为复杂的过程，不同的发育阶段有赖于胸腺微环境所提供的各异的信号。因此肝脏微环境对T细胞重建的影响是在其定植胸腺前的阶段，过某种机制促进了造血干细胞向T淋巴前体细胞的分化，并能够更好的定植到胸腺发育成熟，从而间接的导致了外周血CD4+T水平的重建。
发明人最近研究表明，小鼠或人纤维化肝脏来源的原代成纤维细胞与OP9相似，转染DLL4后能够出现相同的促进T细胞发育的作用；将CCl4诱导的肝纤维化肝脏消化分离成单细胞，筛网过滤去除大部分实质细胞，CD140α免疫磁珠阳选后，采用流式分选获得CD140α+CD11b-CD146-F4/80-细胞，采用差速贴附法，换液后获得αSMA表达阳性的贴壁原代细胞；同时连续传代获得αSMA阳性表达纯度很高的肝成纤维细胞。发明人实验表明，分离的原代肝成纤维细胞与OP9细胞相似，与造血干细胞共培养后能够出现CD19+细胞，证明造血干细胞在该系统下可以分化发育为淋巴前体(CLP)细胞，但传代纯化的肝成纤维细胞没有该现象。随后发明人分别对其进行病毒转染获得DLL4过表达细胞，并采用与OP9-DL1相同的共培养系统与造血干细胞共培养，结果表明与文献相似肝脏来源的原代成纤维细胞，能够出现相同的促进T前体细胞发育的作用，而传代纯化后的肝成纤维细胞却失去了该作用。表明原代肝成纤维细胞能够通过某种机制，限定造血干细胞向T/B淋巴细胞系分化，并在过表达DLL4后能够促进T细胞的分化和发育。同时发明人在人组织上实验表明，人原代肝脏成纤维细胞在过表达DLL4后也具有同样的促进作用，能够促进人脐带来源的造血干细胞向DN2-DN3细胞分化。
为什么原代肝成纤维具有促进T细胞发育的作用，而传代后的肝成纤维却失去了该作用？在以上的研究基础上，发明人进而对其进行研究并显示CXCL12(又名SDF-1)参与到这种体外T细胞发育的过程，并起到重要的作用，在传代后的肝成纤维共培养体系中补充CXCL12可以恢复其促进T细胞发育的作用。(Fibrotic liver microenvironment promotesDll4 and SDF-1-dependent T cell lineage development.Cell death&Disease[J]2019.IF＝5.638)。在此研究基础上发明人提出了一些技术内容包括：本发明的意义在于DN2或DN3是T细胞胸腺发育的两个重要阶段。DN2到DN3是一个相对连续的过程，并且从DN1到DN2细胞经过10次分裂细胞总数增加1000倍左右，并且在DN2阶段细胞分化已完全限定在T系，同时Υσ和αβT细胞定向分化也已完成；并且DN2与DN3阶段细胞位于T细胞发育的β选择、阳性选择和阴性选择之前，在体外诱导的异体DN2或DN3细胞具有定植胸腺并发育成为功能完全的成熟T细胞同时细胞数也在异体胸腺内得到大量扩增，并通过异体胸腺的阴选和阳选成为没有对受体耐受的T细胞，因此成为通用型Car-T的基础。
本发明的其中一个目的是提供一个可以体外诱导小鼠或人造血干细胞向T细胞发育的试剂或试剂盒；本发明的再一个目的是提供如上限定的特异性体外诱导小鼠或人造血干细胞向T细胞发育的试剂盒在临床上的应用。
附图说明
图1.T细胞胸腺发育流程示意图；
图2.ABMT治疗艾滋病合并肝硬化病人的白蛋白变化和CD4+T变化图；
图3.小鼠骨髓肝门静脉输注实验结果图；
图4.小鼠不同程度肝纤维化下肝组织DLL4 mRNA表达水平结果图；
图5.不同临床标本冰冻连续切片分别染色CD31和DLL4抗体显微照片；
图6.不同临床标本冰冻连续切片分别染色αSMA和DLL4抗体显微照片；
图7.不同临床标本冰冻连续切片分别染色CK18和DLL4抗体显微照片；
图8.不同临床标本DLL4的mRNA表达水平；
图9.过表达DLL4的MSCs mRNA表达水平；
图10.OP9-DLL4与造血干细胞共培养实验结果；
图11.MSC-DLL4和3T3-DLL4与造血干细胞共培养实验结果；
图12.MSC-DLL4促使造血干细胞分化发育为CD11b+巨噬细胞；
图13.TSC-DLL4与造血干细胞共培养结果；
图14.成功分离获得小鼠肝脏成纤维细胞；
图15.原代肝成纤维细胞具有与OP9细胞相似的限定造血干细胞分化作用；
图16.分离获得的肝成纤维细胞过表达DLL4与造血干细胞共培养结果；
图17.原代肝成纤维细胞和过表达DLL4的肝实质细胞系AML12混合后与造血干细胞共培养结果；
图18.CXCL12可能是肝纤维化微环境中协同DLL4促进T细胞发育的因子；
图19.阻断CXCL12-CXCR4信号通路能抑制DLL4过表达细胞对T细胞发育的促进作用；
图20.添加CXCL12蛋白能恢复P5代LF-DLL4对T细胞发育的促进作用；
图21.采用本试剂盒共培养获得的DN2和DN3移植免疫缺陷小鼠示意图。
具体实施方式
下述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。下面将结合附图对本发明作进一步的说明。
为了便于理解本发明的技术提供了如图1所示的T细胞胸腺发育流程示意图(现有技术)。淋巴前体细胞(Common lymphoid progenitor,CLP)由骨髓迁入胸腺，遵从一定的发育程序向成熟T细胞分化。根据CD4和CD8表达如否，胸腺T细胞发育分为三个主要阶段，即双阴性(Double Negative,DN)、双阳性(Double Positve,DP)和单阳性(Single Positive,SP)阶段。基于CD117、CD44及CD25表达情况，DN细胞又分作DN1～DN4四群，分别代表不同发育阶段。胸腺T细胞相应也由这几群细胞组成。
发明人通过独具创造性的基础研究获得本发明技术方案，以下将详细说明。
实施例1基础研究
1肝门静脉输注ABMT能促进艾滋病合并肝硬化病人CD4+T重建
课题组长期以来采用骨髓来源干细胞治疗终末期肝脏疾病，取得了很好的临床效果。但是，大规模分离获取自体干细胞目前还是比较困难，所以阻碍了其在临床中大规模的应用。因此，发明人尝试直接采用自体骨髓移植(ABMT)，来达到治疗目标是否可行。因此发明人大量招募了临床肝硬化病人进入该项研究，其中有4例艾滋病并伴有乙肝病毒或丙肝病毒导致的晚期肝硬化患者。虽然这4例患者外周血的病毒载量在ART治疗后得到了有效控制，但是他们的外周血CD4+T细胞数量依然维持在很低水平。发明人通过手术穿刺获得骨髓，然后通过连接肠系膜静脉的导管输注进入肝门静脉。
结果显示发明人ABMT的效果非常成功。随后检查表明，该方法没有导致任何可察的副作用和并发症。肝纤维化指标明显稳定并得到降低。非常令人惊讶的是，在手术1个月后，每个病人的外周血CD4+T细胞水平开始增加(图2)，且这种趋势在2年的回复检查期间得到一直维持，这一现象在艾滋病患者常规的ART治疗过程中是非常罕见的。发明人的数据表明ABMT能够有效和安全治疗艾滋病患者晚期肝硬化，并促进CD4+T细胞恢复。随后发明人尝试在肝脏正常的艾滋病患者上，重复该项实验，结果却没有看到CD4+T细胞水平的上升。
如图2所示ABMT治疗艾滋病合并肝硬化病人的白蛋白变化和CD4+T变化。图a描述了发明人采用的ABMT策略以及临床血液标本的采集时间点。图b为患者白蛋白水平的变化，表明在ABMT术后患者的肝功能得到明显的改善。图c为患者外周CD4+T水平在肝门静脉ABMT术后的变化。结果表明所有患者在术后外周CD4+T水平随时间稳步提高，并迅速恢复到正常水平。表明肝门静脉输注ABMT能促进艾滋病合并肝硬化病人CD4+T重建。
2动物实验表明骨髓肝门静脉注射能对T细胞发育产生影响
采用CCl4诱导8周的C57BL/6小鼠肝纤维化模型作为受体实验组，并设正常肝脏老鼠作为对照组。供体小鼠为CD45.1 C57BL/6小鼠，收集左右大腿肱骨与小腿胫骨，采用灌注冲洗获得骨髓细胞，经红细胞裂解液裂红后计数，并以1×106个骨髓单核细胞采用脾内注射法200μl体积，注射进入受体小鼠脾脏，通过脾脏内血管经受体小鼠肝门静脉入肝；受体小鼠移植前经9.5Gy的致死剂量辐照。受体小鼠在骨髓移植后的4周分别处死收集外周血并计数，分析胸腺、脾脏、骨髓和外周血内的T细胞在两组中的重建水平。
虽然在外周血、脾脏、骨髓分析CD4+T和CD8+T在两组中均没有显著差异。但是如图中所示，在胸腺内以CD45.1设门分析，DN阶段分析表明：表明在CCl4组中DN2 and 3细胞较对照组具有较高的比例(图3:A-B)；同时DP细胞在CCl4组中也比对照组具有更高的比例(图3:C-D)，并且这些差异在两组中具有显著性。而且更重要的是CCl4组胸腺内各群T细胞比例更接近正常老鼠所应具有的比例。表明肝纤维化老鼠骨髓门静脉输注后，具有更快的T细胞重建能力。说明在肝纤维化状态下，门静脉骨髓输注对T细胞重建能产生一定影响。
如图3所示小鼠骨髓肝门静脉输注实验结果。图A-B分别为正常对照组与CCl4组于ABMT后4周分析胸腺内的DN阶段各群细胞比例。图C-D分别为正常对照组与CCl4组于ABMT后4周分析胸腺内的DP和SP阶段各群细胞比例。结果表明CCl4组比较正常对照组有更高比例的DN2 and 3细胞比例，以及DP细胞比例，并且这种差异在两组中具有显著性。并且在CCl4组胸腺内各群细胞比例更接近于未手术健康老鼠所具有的比例，表明肝纤维化老鼠肝门静脉ABMT后能够更快的重建胸腺及外周的T细胞水平。
3小鼠被诱导肝纤维化能上调肝组织DLL4表达水平
考虑到notch信号通路DLL1和DLL4在T细胞发育过程中的重要作用，发明人采用qPCR对CCl4肝纤维化老鼠和正常老鼠肝组织的DLL1和DLL4的mRNA表达水平进行检测，并与β-actin比较计算相对值，结果表明只有DLL4在小鼠肝脏中有表达。并且发现在肝纤维化C57BL/6小鼠肝组织中DLL4分子的mRNA表达水平显著高于正常肝组织，并且随着肝纤维化程度逐渐升高(图4)。
如图4所示小鼠不同程度肝纤维化下肝组织DLL4 mRNA表达水平。肝纤维化小鼠肝组织中DLL4分子的mRNA表达水平显著高于正常肝组织，并且随着肝纤维化程度逐渐升高。
4肝实质细胞是肝脏纤维化下被上调DLL4表达的主要细胞
(1)考虑到notch信号通路在T细胞发育中起到重要作用。对艾滋病合并肝硬化病人肝脏组织标本进行DLL1与DLL4蛋白免疫组化染色，结果表明：只有DLL4在肝脏中得到表达。同时肝实质细胞是表达DLL4的主要细胞，肝脏成纤维细胞不能表达DLL4。发明人随后对临床标本采用冰冻连续切片，进行DLL4免疫组化染色以及CD31(血管内皮细胞标志物)、CK18(肝脏实质细胞标志物)、αSMA(成纤维细胞标志物)免疫组化染色，并进行共定位分析(图5-7)。表明肝实质细胞是表达DLL4的主要细胞，而血管内皮和纤维化组织均不表达DLL4；并且随着病人肝纤维化程度的加重，肝实质细胞DLL4蛋白表达升高。
图5为冰冻连续切片后分别染色CD31和DLL4抗体，并对同一位置进行拍摄以共定位，A1为艾滋病合并肝硬化病人具有较高程度的肝纤维化标本，A2为艾滋病合并肝硬化病人具有中等程度的肝纤维化标本，A3为一正常肝脏标本。图中可见CD31做为血管内皮细胞标志物，在其阳性表达区域，DLL4表达均呈阴性。
如图5所示：不同临床标本冰冻连续切片分别染色CD31和DLL4抗体。A1为艾滋病合并肝硬化病人具有较高程度的肝纤维化标本，A2为艾滋病合并肝硬化病人具有中等程度的肝纤维化标本，A3为一正常肝脏标本。图片A-C为免疫组化分别对A1-A3病人3个标本进行CD31染色；图片D-F为免疫组化分别对A1-A3病人3个标本在同一位置进行DLL4染色。图中可见在A-C阳性表达区域，在D-F相同位置DLL4表达均呈阴性。表明血管内皮细胞不表达DLL4。
图6为冰冻连续切片后分别染色αSMA和DLL4抗体，并对同一位置进行拍摄以共定位，A1为艾滋病合并肝硬化病人具有较高程度的肝纤维化标本，A2为艾滋病合并肝硬化病人具有中等程度的肝纤维化标本，A3为一正常肝脏标本。图中可见αSMA做为肝成纤维细胞标志物，在其阳性表达区域，DLL4表达均呈阴性。表明肝成纤维细胞不是表达DLL4的细胞。
如图6所示：不同临床标本冰冻连续切片分别染色αSMA和DLL4抗体。A1为艾滋病合并肝硬化病人具有较高程度的肝纤维化标本，A2为艾滋病合并肝硬化病人具有中等程度的肝纤维化标本，A3为一正常肝脏标本。图片A-C为免疫组化分别对A1-A3病人3个标本进行CD31染色；图片D-F为免疫组化分别对A1-A3病人3个标本在同一位置进行DLL4染色。图中可见在A-C阳性表达区域，在D-F相同位置DLL4表达均呈阴性。表明肝成纤维细胞不是表达DLL4的细胞。
图7为冰冻连续切片后分别染色CK18和DLL4抗体，并对同一位置进行拍摄以共定位，A1为艾滋病合并肝硬化病人具有较高程度的肝纤维化标本，A2为艾滋病合并肝硬化病人具有中等程度的肝纤维化标本，A3为一正常肝脏标本。图中可见CK18做为肝实质细胞标志物，在其阳性表达区域，DLL4表达均呈阳性。表明肝实质细胞是DLL4高表达的主要细胞，而不是肝成纤维细胞。同时其表达程度随病人肝纤维化程度的增加而升高。
如图7所示：不同临床标本冰冻连续切片分别染色CK18和DLL4抗体。A1为艾滋病合并肝硬化病人具有较高程度的肝纤维化标本，A2为艾滋病合并肝硬化病人具有中等程度的肝纤维化标本，A3为一正常肝脏标本。图片A-C为免疫组化分别对A1-A3病人3个标本进行CD31染色；图片D-F为免疫组化分别对A1-A3病人3个标本在同一位置进行DLL4染色。图中可见在A-C阳性表达区域，在D-F相同位置DLL4表达均呈阳性。表明肝实质细胞是DLL4高表达的主要细胞，而不是肝成纤维细胞。同时可见其表达程度随病人肝纤维化程度的增加而升高。
(2)采用qPCR对艾滋病合并肝硬化病人标本和正常人肝组织的DLL4的mRNA表达水平进行检测，并与β-actin比较计算相对值(图8)。A1为艾滋病合并肝硬化病人具有较高程度的肝纤维化标本，A2为艾滋病合并肝硬化病人具有中等程度的肝纤维化标本，A3为一正常肝脏标本。发现在艾滋病合并肝硬化病人肝组织中DLL4分子的mRNA表达水平显著高于正常肝组织，并且随着肝纤维化程度逐渐升高。
图8所示不同临床标本DLL4的mRNA表达水平。A1为艾滋病合并肝硬化病人具有较高程度的肝纤维化标本，A2为艾滋病合并肝硬化病人具有中等程度的肝纤维化标本，A3为一正常肝脏标本。图中可见在艾滋病合并肝硬化病人肝组织中DLL4分子的mRNA表达水平显著高于正常肝组织，并且随着肝纤维化程度逐渐升高。
5原代肝脏成纤维细胞具有与OP9相似的促进T系发育作用
(1)成功构建DLL4慢病毒载体及其过表达细胞
为了进一步研究，尝试构建了过表达DLL4蛋白的MSCs细胞，以用于机制的研究。采用Infusion技术高效构建表达质粒pLVX-IRES-Puro-DLL4。根据Genebank中鼠DLL4cDNA序列设计引物Forward(5’-ATCCCGCGACTCTAGAT GACGCCTGCGTCCCG-3’)Reverse(5’-GGTAGAATTATCTAGTTATACCTCT GTGGCAATCACAC-3’，下划线部分表示与质粒插入位置互补的15bp碱基)，用于扩增成熟C57BL/6鼠源DLL4 cDNA基因。
用Trizol法提取C57BL/6小鼠肝脏的总RNA，并经逆转录获得cDNA文库，AccuPrimeTMPfx SuperMix(Invitrogen公司)PCR扩增cDNA文库获得目的片段，PCR产物用1％琼脂糖胶切胶回收。pLVX-IRES-Puro质粒(Invitrogen公司)分别用BamHI和XbaI双酶切过夜，将PCR产物与质粒酶切产物采用HD Cloning Plus试剂进行连接。然后转化DH5α感受态菌，涂氨苄抗性LB平板，挑阳性克隆送测序。提质粒获得过表达质粒pLVX-IRES-Puro-DLL4。
过表达质粒pLVX-IRES-Puro-DLL4与包装质粒按比例混合，加入lipo2000感染293T细胞，于24h和48h后收集上清过滤并超滤离心浓缩获得病毒，然后将浓缩的病毒感染MSCs细胞，于感染48h后加入嘌呤霉素进行筛选。筛选两周待其稳定后，收集贴壁细胞提取RNA，逆转录为cDNA后采用qPCR分析结果表明过表达的细胞DLL4 mRNA转录水平，其表达量相对β-actin的平均值高达28％，显著高于转染空质粒MSCs细胞和对照MSCs细胞(图11)。在此基础上发明人分别构建了OP9、3T3/NIH、TSC、AML12、原代肝成纤维细胞、传代肝成纤维细胞等的DLL4过表达细胞株。
(2)只有特定的DLL4过表达细胞具有促进T细胞发育的作用
虽然OP9-DL1基质细胞诱导T细胞培养体系已被越来越多的实验室采纳和使用。但是发明人也要看到，该体外诱导系统尚存在一些理论上和实际应用方面的问题。首先，OP9细胞不表达MHC分子和CD1d分子，无法实现发育过程中T细胞或NKT细胞的阳性选择和阴性选择；另外，OP9是鼠源的骨髓基质细胞，因此尚需对其诱导产生的人源T淋巴细胞的确切性质做进一步的研究，如：T细胞表面TCR分子的表达谱型、T细胞的体内外功能等。因此也有必要寻找与OP9类似能产生相同作用的细胞类型。
由于课题组长期从事间充质干细胞(MSCs)研究，并有很好的研究基础，发明人尝试在MSCs细胞上转染慢病毒过表达DLL4蛋白。并在此基础上分别构建了OP9、3T3/NIH、TSC、AML12、原代肝成纤维细胞、传代肝成纤维细胞等的DLL4过表达细胞株。
构建过表达DLL4的OP9细胞株OP9-DLL4，与流式分选的造血干细胞(Lin-CD117+Sca1+)细胞共培养6天、10天、14天、18天。如图10所示，在CD45设门下分析，非常明显的出现了DN2(CD44+CD25+)和DN3(CD44-CD25+)俩群，并且随着时间的延长，其比例逐渐升高，并有部分DP(Double Positive)细胞的出现。
图10.OP9-DLL4与造血干细胞共培养实验结果。成功构建DLL4过表达的OP9细胞并与造血干细胞共培养，图A-D分别为共培养6天、10天、14天、18天后的流式分析DN阶段的发育状况，结果表明共培养后非常明显的出现了DN2-DN3俩群，并随着共培养时间的延长其比例逐步增加。图E为共培养18天后分析其CD4和CD8的表达，表明其中有部分DP细胞的出现。
MSC-DLL4或3T3-DLL4与骨髓来源的造血干细胞共培养，发现其并没有出现OP9-DL4相同的促进T细胞发育的作用。随后发明人尝试将OP9细胞与MSC-DLL4细胞或3T3-DLL4细胞1:1比例混合后，重复与造血干细胞共培养的实验，结果能够出现促进T细胞发育的现象。
图11.MSC-DLL4和3T3-DLL4与造血干细胞共培养实验结果。图A-C分别为MSCs细胞、MSC-DLL4细胞、MSC-DLL4与OP9 1:1比例混合细胞与HSC共培养后的实验结果，结果表明MSC-DLL4不具有促进T细胞发育的作用，但与OP9细胞混合后有能够出现促进作用。图E-G分别为3T3/NIH细胞、3T3-DLL4细胞、3T3-DLL4与OP9 1:1比例混合细胞与HSC共培养后的实验结果，结果表明3T3-DLL4不具有促进T细胞发育的作用，但与OP9细胞混合后有能够出现促进作用。提示OP9细胞能够提供某些因子或条件，使得原来不具备促进T细胞发育作用的MSC-DLL4或3T3-DLL4出现了该功能。
进一步分析表明，MSC-DLL4细胞不能限定造血干细胞向T/B细胞系发育，其高表达的M-SCF促进了其发育为CD11b+巨噬细胞(图12)。表明OP9细胞能够提供某些因子或条件，阻断M-SCF的作用，从而限定造血干细胞向T/B系分化发育。
图12.MSC-DLL4促使造血干细胞分化发育为CD11b+巨噬细胞。结合前面的结果进一步表明OP9细胞能够提供某些因子或条件，通过阻断M-SCF的作用，从而限定造血干细胞向T/B系分化发育。
胸腺上皮基质细胞系(thymic epithelial stomal cell lines,TSCs)由上海中科院健康所张笑人教授馈赠，其尾静脉注射裸鼠体内能形成胸腺上皮样组织，并能在裸鼠体内检测到CD4+和CD8+SP T细胞(Established Thymic Epithelial Progenitor/StemCell-Like Cell Lines Differentiate into Mature Thymic Epithelial Cells andSupport T Cell Development.PLOS one,2013.8(9):p.e75222)。但是发明人在体外采用与OP9-DLL4相同的体系与造血干细胞共培养，却没有出现相同的促进T细胞分化和发育的作用；qPCR显示TSCs表现为DLL4低表达状态，发明人对TSCs进行病毒转染，构建了DLL4过表达的TSC-DLL4细胞，并再次重复与造血干细胞共培养实验，结果表明TSCs过表达DLL4后能够出现与OP9-DL4相同的效果。
图13.TSC-DLL4与造血干细胞共培养结果。A-B分别为TSC过表达DLL4的TSC-DLL4细胞与HSC体外共培养6天和10天的结果，结果表明TSCs过表达DLL4后能够出现与OP9-DLL4相同的效果。提示发明人TSC与OP9细胞具有相同的可以限定造血干细胞向T/B系细胞分化的作用。
(3)成功分离获得小鼠肝脏成纤维细胞
对CCl4肝纤维化小鼠或正常小鼠肝脏经Liver Dissociation Kit处理分离成单细胞，筛网过滤去除大部分实质细胞，采用免疫磁珠阳选CD140α+细胞，然后再用流式抗体CD140α-APC、CD11b-FITC、CD146-PE、F4/80-PerCP-Cy5.5标记，流式细胞仪分选获得CD140α+CD11b-CD146-F4/80-细胞；含10％FBS的DMEM重悬后采用差速贴附法去除贴壁慢的非成纤维细胞，并DMEM换液后获得αSMA表达阳性的贴壁原代细胞；同时连续传代获得αSMA阳性表达纯度很高的肝成纤维细胞(图14)。
图14.成功分离获得小鼠肝脏成纤维细胞。图A-C分别为MSCs作为阴性对照、原代肝成纤维细胞、P5代肝成纤维细胞，破膜后分别采用αSMA-FITC染色后流式分析结果。可见原代肝成纤维细胞和传代肝成纤维细胞均具有较高比例的αSMA阳性细胞，P5代传代肝成纤维细胞具有更高的纯度。
(4)原代肝脏成纤维细胞具有与OP9相似的促进T系发育作用
原代肝成纤维细胞与造血干细胞共培养，与OP9细胞相似在CD45+设门下分析能够出现一群CD19+的细胞，而传代的肝成纤维细胞却没有。表明原代肝成纤维细胞与OP9细胞相似能够限定造血干细胞向T/B细胞系即CLP细胞分化，而不是向CMP细胞分化。
图15.原代肝成纤维细胞具有与OP9细胞相似的限定造血干细胞分化作用。图A为P5代的肝脏成纤维细胞与HSC共培养9天后以CD45+设门分析CD19+B系细胞比例；图B为原代的肝脏成纤维细胞与HSC共培养9天后以CD45+设门分析CD19+B系细胞比例；图C为OP9细胞与HSC共培养9天后以CD45+设门分析CD19+B系细胞比例。结果可见，只有原代肝脏成纤维细胞和OP9细胞的共培养体系中能够出现CD19+细胞，表明原代肝成纤维细胞与OP9细胞相似能够限定造血干细胞向T/B细胞系分化，并在DLL4缺乏的情况下进一步发育为CD19+B系细胞。而传代肝脏成纤维细胞不具有该功能。
将分离获得的原代肝成纤维细胞和P5代肝成纤维细胞，进行慢病毒转染获得过表达DLL4的原代肝成纤维细胞和P5代肝成纤维细胞，并将其与与分离的造血干细胞细胞共培养。如图16所示，在CD45设门下分析，表明只有原代肝成纤维细胞过表达DLL4后能够出现促进T细胞发育的作用，出现了DN2细胞群，而传代细胞却没有该作用。
图16.分离获得的肝成纤维细胞过表达DLL4与造血干细胞共培养结果。图A为P5代的肝脏成纤维细胞过表达DLL4后与HSC共培养6天后以CD45+设门分析DN阶段细胞比例；图B为原代的肝脏成纤维细胞过表达DLL4后与HSC共培养6天后以CD45+设门分析DN阶段细胞比例；结果可见，只有过表达DLL4的原代肝脏成纤维细胞和OP9-DLL4细胞的共培养体系中能够出现DN2细胞，进一步表明原代肝成纤维细胞与OP9细胞相似能够限定造血干细胞向T/B细胞系分化，同时在DLL4存在的情况下进一步促进其发育为T细胞。
AML12为肝实质细胞系，进行慢病毒转染获得过表达DLL4的AML12-DLL4细胞，并将其与与分离的造血干细胞细胞共培养。如图17-C所示，在CD45+设门下分析，表明AML12-DLL4不具有与OP9相同的促进T细胞发育的作用。但是当其与原代肝成纤维细胞混合后，又能够出现促进T细胞发育的作用，出现DN2和DN3细胞(如图17-A所示)。进一步表明原代肝成纤维细胞与OP9细胞相似能够限定造血干细胞向T/B细胞系分化，同时在DLL4存在的情况下进一步促进其发育为T细胞，但是肝实质细胞和传代肝成纤维细胞不具有该作用。
图17.原代肝成纤维细胞和过表达DLL4的肝实质细胞系AML12混合后与造血干细胞共培养结果。图A为原代的肝脏成纤维细胞和过表达DLL4的肝实质细胞系AML12 1:1比例混合后与HSC共培养6天后以CD45+设门分析DN阶段细胞比例；图B为OP9细胞过表达DLL4后与HSC共培养6天后以CD45+设门分析DN阶段细胞比例，作为阳性对照；图C为小鼠肝实质细胞系AML12过表达DLL4后与HSC共培养6天后以CD45+设门分析DN阶段细胞比例。结果可见，AML12-DLL4不具有促进T细胞发育的作用。但是当其与原代肝成纤维细胞混合后，能够在其共培养体系中出现和OP9-DLL4共培养体系相同的DN2和DN3细胞。进一步表明原代肝成纤维细胞与OP9细胞相似能够限定造血干细胞向T/B细胞系分化，同时在DLL4存在的情况下进一步促进其发育为T细胞。而肝实质细胞不具有该作用。
6.肝纤维化微环境中的CXCL12-CXCR4信号通路参与DLL4促进T系发育的作用
为什么原代肝成纤维具有促进T细胞发育的作用，而传代后的肝成纤维细胞却失去了该作用？在以上的研究基础上，进一步采用qPCR比较能够促进T细胞发育的OP9细胞、TSC细胞、原代肝成纤维细胞不同蛋白表达谱，与NIH/3T3、AML12、MSCs、原代肝实质、传代肝成纤维细胞等不具有该促进作用的细胞系之间的差异。重点关注炎症相关因子与趋化因子，发现CXCL12(又名SDF-1)在具有促进作用的OP9、TSC和原代肝成纤维细胞中具有很高程度的表达，而在不具有该促进作用的细胞系：NIH/3T3细胞、AML12细胞、MSCs细胞、原代肝实质细胞、传代肝成纤维细胞中表达量很低。并且CXCL12在原代肝成纤维细胞中表达水平，随着传代的次数增加而呈比例下降。显示CXCL12可能参与到这种体外T细胞发育的过程，并起到重要的作用。
图18.CXCL12可能是肝纤维化微环境中协同DLL4促进T细胞发育的因子。图A:qPCR比较不同细胞表达谱，发现CXCL12在具有促进作用的OP9、TSC和原代肝成纤维细胞中具有很高程度的表达，而在不具有该促进作用的细胞系：P5代肝成纤维细胞、NIH/3T3细胞、MSCs细胞、AML12细胞、原代肝实质细胞中表达量很低。图B:CXCL12在原代肝成纤维细胞(P0代)中表达水平很高，但其表达水平随着传代的次数增加(P1-P5代)而逐级下降。
为了进一步证明，发明人采用CXCL12-CXCR4信号通路化学阻断剂AMD3100(其作用机制在于能够优势竞争结合CXCR4，从而封闭了CXCL12的结合位点。)加入到发明人的共培养体系中，结果表明阻断CXCL12-CXCR4信号通路，能够有效抑制过表达DLL4的原代肝成纤维细胞或OP9细胞的促进T细胞发育的作用，进一步证明CXCL12在DLL4促进造血干细胞向T细胞发育的过程中发挥了重要作用。我们随后在P5代肝脏成纤维细胞与HSC共培养体系中添加CXCL12，发现能使得原来不具有促进T细胞发育作用的P5代肝脏成纤维细胞出现了与原代肝脏成纤维类似的促进作用。
图19.阻断CXCL12-CXCR4信号通路能抑制DLL4过表达细胞对T细胞发育的促进作用。图A-D:CXCL12-CXCR4信号通路抑制剂AMD3100从高到低(10μM-0μM)不同浓度，加入过表达DLL4的原代肝成纤维细胞与骨髓造血干细胞的共培养体系中。可见AMD3100的加入显著抑制了DN2和DN3细胞的分化，并且随着AMD3100浓度的增加DN2和DN3逐渐减少。
图20.添加CXCL12蛋白能恢复P5代LF-DLL4对T细胞发育的促进作用。NC是未添加CXCL12的P5代LF-DLL4细胞与HSC共培养的结果，CXCL12组是添加终浓度为50ng/mL的CXCL12蛋白，发现能恢复P5代LF-DLL4由于传代后失去的促进T细胞发育的作用。
7.共培养获得的胸腺T前体细胞能定植胸腺并发育成为成熟T细胞
将所获得的DN2和DN3细胞尾静脉注射Rag2小鼠，我们发现可在外周检测到单阳性的CD4+和CD8+T细胞，而Rag2小鼠由于Rag基因的缺陷外周是不可能出现T细胞的，表明该培养体系获得的DN2和DN3细胞是可以通过定植胸腺，并进而发育成为成熟的CD4+和CD8+T的，具有非常广泛的应用前景，能成为通用Car-T细胞的一种基础。
如图21.采用本试剂盒共培养获得的DN2和DN3移植免疫缺陷小鼠。将所获得的DN2和DN3细胞尾静脉注射Rag2小鼠，我们发现可在外周检测到单阳性的CD4+和CD8+T细胞，
实施例2
试剂盒组成
1.重组DLL4蛋白：小鼠或人重组DLL4蛋白(R&D)10μg/管，1管；
2.小鼠或人P5代肝脏成纤维细胞：1×109管，1管，液氮冻存；
4.细胞因子：SCF、IL-7、Flt3L、CXCL12，各10μg/管，合计4管；
5.培养基：MEMα完全培养基，1瓶；
6.70μm孔径筛网(Falcon),10个；
7.细胞培养皿(Costar)，10cm直径细胞培养皿1块。
样品处理：
小鼠骨髓细胞或人脐带血细胞，红细胞裂解液完全裂红后，用Lineage CellDepletion Kit(Miltenyi Biotec)阴选后，采用流式分选小鼠造血干细胞(Lin-Sca1+cKit+)或人造血干细胞(Lin-CD34+CD38+)。所用的Lineage cocktail由标记的B220,CD3e,CD4,CD8α,CD19,CD11b,Gr1,Ter119,CD11c,and NK1.1抗体组成。
操作步骤：
1.配制含15％FBS的MEMα培养基，并添加终浓度为25-50ng/mL的SCF、5-10ng/mL的Flt3L、1-20ng/mL的IL-7、20-100ng/mL的CXCL12，分装后于-20℃保存；
2.培养皿提前24h采用小鼠或人DLL4重组蛋白进行包被，包被浓度为10μg/ml 4℃24h或37℃4h；
3.复苏P5代肝脏成纤维细胞，并以5×105细胞量铺设培养皿，并添加培养基到10ml，养24h；
4.将1×105分选获得的造血干细胞加入培养皿的培养基中并混匀，置37℃，5％CO2培养箱培共培养；
5.每间隔72h半量换液；
6.并在共培养的第6天或10天收获细胞将细胞吹散；过70μm孔径筛网，然后采用CD25+磁珠分选或者CD44+、CD25+流式抗体标记后流式分选获得DN2或DN3细胞。
结果分析：
1.CD44+、CD25+流式抗体标记后流式分析细胞比例并计数，结果如图16；
实施例3
试剂盒组成
1.DLL4过表达的小鼠或人肝脏成纤维细胞：1×109管，1管，液氮冻存；
2.细胞因子：SCF、IL-7、Flt3L、CXCL12，各10μg/管，合计4管；
3.培养基：MEMα完全培养基，1瓶；
4.70μm孔径筛网(Falcon),10个；
5.细胞培养皿(Costar)，10cm直径细胞培养皿1块。
样品处理：
小鼠骨髓细胞或人脐带血细胞，红细胞裂解液完全裂红后，用Lineage CellDepletion Kit(Miltenyi Biotec)阴选后，采用流式分选小鼠造血干细胞(Lin-Sca1+cKit+)或人造血干细胞(Lin-CD34+CD38+)。所用的Lineage cocktail由标记的B220,CD3e,CD4,CD8α,CD19,CD11b,Gr1,Ter119,CD11c,and NK1.1抗体组成。
操作步骤：
1.配制含15％FBS的MEMα培养基，并添加终浓度为25-50ng/mL的SCF、5-10ng/mL的Flt3L、1-20ng/mL的IL-7，此外添加终浓度20-100ng/mL CXCL12分装后于分装后于-20℃保存；
2.复苏DLL4过表达的肝脏成纤维细胞(可以是原代细胞，也可以是P5代细胞)，并以1×105细胞量铺设培养皿，并添加培养基到10ml；
3.将1×105分选获得的造血干细胞加入培养皿的培养基中并混匀，置37℃，5％CO2培养箱培共培养；
4.每间隔72h半量换液；
5.并在共培养的第6天或10天收获细胞将细胞吹散；过70μm孔径筛网，然后采用CD25+磁珠分选或者CD44+、CD25+流式抗体标记后流式分选获得DN2或DN3细胞。
结果分析：
1.CD44+、CD25+流式抗体标记后流式分析细胞比例并计数，结果如图20；
上述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。

Claims (10)

1.体外诱导造血干细胞向胸腺T细胞分化试剂盒，其特征在于，所述体外诱导造血干细胞向胸腺T细胞分化试剂盒包含CXCL12蛋白。
2.根据权利要求1所述的体外诱导造血干细胞向胸腺T细胞分化试剂盒，其特征在于，所述体外诱导造血干细胞向胸腺T细胞分化试剂盒包含有共培养饲养层细胞。
3.根据权利要求2所述的体外诱导造血干细胞向胸腺T细胞分化试剂盒，其特征在于，所述共培养饲养层细胞为DLL4过表达的小鼠或人肝脏成纤维细胞、DLL4过表达的OP9细胞系、DLL4过表达的TSC细胞系中任意一种或多种的组合。
4.根据权利要求3所述的体外诱导造血干细胞向胸腺T细胞分化试剂盒，其特征在于，所述DLL4过表达的小鼠或人肝脏成纤维细胞为原代细胞。
5.根据权利要求1所述的体外诱导造血干细胞向胸腺T细胞分化试剂盒，其特征在于，所述体外诱导造血干细胞向胸腺T细胞分化试剂盒包含有重组DLL4蛋白包被的培养皿。
6.根据权利要求5所述的体外诱导造血干细胞向胸腺T细胞分化试剂盒，其特征在于，所述共培养饲养层细胞为小鼠或人肝脏成纤维细胞、OP9细胞系、TSC细胞系共培养饲养层细胞中任意一种或多种的组合。
7.根据权利要求1-6所述的任意一种体外诱导造血干细胞向胸腺T细胞分化试剂盒，其特征在于，所述体外诱导造血干细胞向胸腺T细胞分化试剂盒还包含细胞因子：SCF、IL-7、Flt3L。
8.权利要求5所述的重组DLL4蛋白包被的培养皿的包被方法，其特征在于，采用DLL4重组蛋白进行包被，包被浓度为10μg/ml 4℃24h或37℃4h。
9.使用权利要求1-7所述的任意一种体外诱导造血干细胞向胸腺T细胞分化试剂盒体外诱导造血干细胞向胸腺T细胞分化的方法，其特征在于，所述方法含有步骤：
步骤1：配制含15％FBS的MEMα培养基，并添加终浓度为25-50ng/mL的SCF、5-10ng/mL的Flt3L、1-20ng/mL的IL-7、20-100ng/mL的CXCL12；
步骤2：权利要求3所述的共培养饲养层细胞以1×105细胞量铺设试剂盒培养皿；
步骤3：将1×105分选获得的造血干细胞加入步骤2的培养皿的培养基中并混匀，置培养箱共培养；
步骤4：定时换液；
步骤5：收获细胞将细胞吹散；过筛网，然后采用磁珠分选或者流式抗体标记后流式分选获得DN2或DN3细胞。
10.权利要求1-7任意一种所述的体外诱导造血干细胞向胸腺T细胞分化试剂盒的应用，其特征在于，所述体外诱导造血干细胞向胸腺T细胞分化试剂盒应用于制备胸腺T细胞，所述胸腺T细胞作为人或动物T细胞群的重建的药物。
CN201910876838.XA 2019-09-17 2019-09-17 体外诱导造血干细胞向胸腺t细胞分化的试剂盒及其应用 Pending CN110499288A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910876838.XA CN110499288A (zh) 2019-09-17 2019-09-17 体外诱导造血干细胞向胸腺t细胞分化的试剂盒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910876838.XA CN110499288A (zh) 2019-09-17 2019-09-17 体外诱导造血干细胞向胸腺t细胞分化的试剂盒及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110499288A true CN110499288A (zh) 2019-11-26

Family

ID=68592031

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910876838.XA Pending CN110499288A (zh) 2019-09-17 2019-09-17 体外诱导造血干细胞向胸腺t细胞分化的试剂盒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110499288A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018013589A1 (en) * 2016-07-12 2018-01-18 Flagship Pioneering, Inc. Methods and compositions for thymic transplantation
CN108463548A (zh) * 2015-10-30 2018-08-28 加利福尼亚大学董事会 由干细胞产生t细胞的方法及使用所述t细胞的免疫治疗方法
CN110106144A (zh) * 2019-05-17 2019-08-09 苏州大学 一种诱导造血干细胞向前t系细胞分化的方法和试剂盒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108463548A (zh) * 2015-10-30 2018-08-28 加利福尼亚大学董事会 由干细胞产生t细胞的方法及使用所述t细胞的免疫治疗方法
WO2018013589A1 (en) * 2016-07-12 2018-01-18 Flagship Pioneering, Inc. Methods and compositions for thymic transplantation
CN110106144A (zh) * 2019-05-17 2019-08-09 苏州大学 一种诱导造血干细胞向前t系细胞分化的方法和试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHENG GONG等: "Fibrotic liver microenvironment promotes Dll4 and SDF-1-dependent T-cell lineage development", 《CELL DEATH AND DISEASE》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ohm et al. VEGF inhibits T-cell development and may contribute to tumor-induced immune suppression
Duan et al. Leukemia propagating cells rebuild an evolving niche in response to therapy
CA2550961A1 (en) Induction of myocardial cell with the use of mammalian bone marrow cell or cord blood-origin cell and fat tissue
KR20110127111A (ko) 중간엽 줄기 세포의 용도
CN108602873A (zh) 工程化抗原呈递细胞及其用途
CN111918963A (zh) 表达趋化因子受体和细胞粘附分子的cd3阴性细胞群体及其用途和制备方法
US20220275337A1 (en) Cellular compositions comprising viral vectors and methods of treatment
Mikhailova et al. Towards an advanced cell-based in vitro glioma model system
CN110106144A (zh) 一种诱导造血干细胞向前t系细胞分化的方法和试剂盒
CN110551688B (zh) 一种诱导体细胞重编程为造血干/祖细胞且促进造血干/祖细胞体外扩增的组合物及其应用
CN108495924A (zh) 用于产生间充质干细胞的方法
CN110499288A (zh) 体外诱导造血干细胞向胸腺t细胞分化的试剂盒及其应用
CN106267413A (zh) 艾滋病血浆净化器
CN106039448B (zh) Aids细胞吸附治疗仪
WO2022204564A2 (en) Methods and compositions for t-cell coculture potency assays and use with cell therapy products
CN114304065A (zh) 一种阻断il-8联合抗pd-1抗体治疗胃癌的动物模型构建及应用
CN103800919A (zh) Tuft1在制备肝癌诊断和治疗制剂中的应用
CN112210015A (zh) 靶向gpc3的car及应用其的car-nk细胞
AU2008361210A1 (en) An endogenous short hairpin RNA and the use of the same
JP4809940B2 (ja) 血液から分離した単核細胞を試験管内で増幅させる方法
CN110904038B (zh) 一种间充质干细胞及其应用
US20230293590A1 (en) Cellular compositions and methods of treatment
Jin et al. Murine neonatal dermal fibroblast acquires a lymphoid tissue organizer cell-like activity upon synergistic activation of TNF-α receptor and LTβ receptor
Dolinska Understanding the role of bone marrow niche in myeloid malignancies
Kong et al. CD19 CAR-expressing iPSC-derived NK cells effectively enhance migration and cytotoxicity into glioblastoma by targeting to the pericytes in tumor microenvironment

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20191126