KR20090115142A

KR20090115142A - 초기 중배엽 세포，내배엽 및 중배엽 계통의 생성에 유용한 중내배엽 세포의 안정한 집단 및 다능성 유주 세포（ｍｍｃ）

Info

Publication number: KR20090115142A
Application number: KR1020097016814A
Authority: KR
Inventors: 스티븐 달튼; 데이비드 레이놀즈
Original assignee: 유니버시티 오브 조지아 리서치 파운데이션, 인코포레이티드
Priority date: 2007-01-30
Filing date: 2008-01-30
Publication date: 2009-11-04
Also published as: CN103627671A; AU2008211103A1; CA2676044A1; AU2008211103B2; WO2008094597A3; CN101641436A; CA2676044C; WO2008094597A2; US20100166713A1; EP2126045A2; EP2126045A4; US9175260B2

Abstract

본 발명은 중배엽 또는 내배엽 계통으로 분화될 수 있는 다능성 유주 세포(MMC)의 생성에 관한 것이다. 다능성 유주 세포(MMC)는 안정하고 강건하며 20회 이상 (아마도 무기한) 계대배양될 수 있고, 동결 후에 회수되어 재증폭되고 다수의 계통으로 분화될 수 있다. 이들은 따라서 저장 안정성을 지닌다. 이러한 세포를 생성하는 방법은 전통적인 hESC 상태를 거치지 않고 치료적으로 유용한 세포 유형의 생성을 위해 주머니배로부터 다능성 세포 유형(중내배엽)을 생성하는 방식을 강조한다. 다능성 유주 세포, 중내배엽 세포 및 중배엽 세포 (Isl1+)의 생성도 기술한다.

Description

초기 중배엽 세포，내배엽 및 중배엽 계통의 생성에 유용한 중내배엽 세포의 안정한 집단 및 다능성 유주 세포（ＭＭＣ）{EARLY MESODERM CELLS，A STABLE POPULATION OF MESENDODERM CELLS THAT HAS UTILITY FOR GENERATION OF ENDODERM AND MESODERM LINEAGES AND MULTIPOTENT MIGRATORY CELLS(MMC)}

본 발명은 특히 hESC를 포함하는 영장류 다능성(pluripotent) 줄기 세포(pPSC)로부터의 초기 중배엽 세포의 생성, 및 중배엽 분화를 위한 신규한 방법에 관한 것이다. 이러한 접근법은 심장, 평활근 및 내피 계통을 형성할 수 있는 중요 다능성 전구체를 생성할 수 있다. 이러한 접근법은 BG01 및 BG02를 포함하는 모든 hESC 라인에 효과가 있다.

본 발명은 또한 중배엽 또는 내배엽 계통으로 분화될 수 있는 안정한 다능성 유주(migratory) 세포(MMC)의 생성에 관한 것이다. MMC는 적어도 20회 이상 (아마도 무기한으로) 계대배양될 수 있고, 동결 이후 회수될 수 있으며, 재증폭되고, 다수의 계통으로 분화될 수 있다. 이러한 세포를 생성하는 방법은 전통적인 hESC 상태를 거치지 않고 치료적으로 유용한 세포 유형의 생성을 위해 주머니배로부터 다능성 세포 유형(MMC)을 생성하는 방식을 강조한다.

본 발명은 또한 pPSC, 특히 hESC로부터 중내배엽 세포를 제조하는 방법, 규정된 완성 내배엽 세포를 제조하는 방법, MMC를 제조하는 방법, 중배엽 전구체 (IMP)를 제조하는 방법 및 심혈관 질환용 세포 치료제에 관한 것이다.

관련 출원

본 출원은 2007년 1월 30일 출원된 가출원 US60/898,204호 및 2007년 9월 19일 출원된 US60/994,354호의 우선권의 이득을 주장하며, 두 출원 모두는 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다.

인간 배야 줄기 세포(hESC)(hESC에 대한 마커는 SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81 항원, Nanog, Oct4를 포함한다)는 세 개 모두의 배아 배엽 및 배아밖 계통으로부터 유래된 세포로 분화될 수 있는 세포의 다능성 집단이다. hESC의 이러한 특성은 세포 치료법 (예컨대, 당뇨병, 심장병, 신경퇴행성 질환), 약물 발견 및 발생 모델링에 있어서 중요한 관련성을 지닌다.

다른 다능성 세포 유형이 마우스에서 동정되었다. 원시 외배엽 유사 (EPL; Rathjen et al., 1999, J. Cell Sci) 세포는 mESC로 탈분화되는 능력을 지닌 mESC로부터 생겨나는 것으로 밝혀졌다. 최근, 신규한 마우스 세포로서 이식후 배아덩이위판 줄기 세포(EpiSC; Tesar et al., Nature 448: 196-202; 2007)가 hESC의 특성을 공유하는 것으로 확인되었다 (Nanog+ Sox2+ Oct4+). 마우스로부터의 이러한 모든 다능성 세포 유형이 시험관내 또는 기형종 검정에서 3개의 배아 배엽을 생성할 수 있다.

배아덩이위판 줄기 세포(EpiSc) 및 유도된 다능성 줄기 세포(iPS)는 광범한 다능성 세포 범주에 적합하며, 개념적으로 본 출원에 개시된 기술은 상기 및 기타 다능성 세포 유형(즉, 영장류 다능성 세포)에 적용될 수 있었다. EpiSc 배아덩이위판 줄기 세포는 이식후 초기 단계 배아로부터 분리되며 Oct4를 발현시키고 다능성이다(Tesar et al., Nature, Vol 448, p. 196 12 July 2007). 유도된 다능성 줄기 세포(iPS 세포)는 성인 피부 섬유모세포 또는 다른 성인 체세포를 탈분화시켜 네 개의 유전자(c-myc, Klf4, Sox2, Oct4)의 레트로바이러스 형질도입에 의해 다능성 상태로 되돌림에 의해 제조된다.

다른 비-ESC, 자가 증식성(self renewing), 다능성(pluripotent/multipotent) 줄기 세포를 개발하는 이점은 발생 모델을 개선하고, 성체 세포로의 유도 분화를 개선시키며, 통상적인 방법 보다 효율적이고 덜 비싼 접근법을 제공하는 데 도움이 될 것이기 때문이다.

도면의 간단한 설명

도 1은 10×, 20×, 40× 배율에서 규정된 배지의 마트리겔 상에서 성장한 BG02 hESC의 명시 사진이다.

도 2는 외배엽, 중배엽, 내배엽 및 배아밖 계통을 나타내는 잠재적인 hESC 세포 운명 결정의 도식이다.

도 3은 중배엽(meso) 또는 완성 내배엽(definitive endoderm: DE)으로 추가로 분화될 수 있는 T+ 중내배엽의 형성을 초래하는 분화 경로를 보여주는 도식이다.

도 4는 Wnt3a를 BG01 hESC에 첨가한 후 규정된 배지 조건하에 중내배엽의 형성을 도시한다. (A) Wnt3a(25 ng/㎖)를 3일의 기간에 걸쳐 첨가한 후 Nanog, T, Eomes 및 MixL1 전사체의 Q-PCR 분석. (B) Wnt3a로 2일(48시간) 동안 처리된 세포의 면역염색 - 패널은 미처리되고 (hESC) 처리된 (+Wnt3a) 샘플의 경우에 E-카드헤린(cadherin), Nanog, T, β-카테닌(catenin) 및 Snail에 대한 염색을 도시한다.

도 5는 TGFβ 시그널링의 부재하에 정준(canonical) Wnt 시그널을 존재시켜 중내배엽의 형성을 도시하는 모델이다.

도 6은 BIO를 지니는 마트리겔 상의 규정된 배지에서 48시간 동안 성장시킨 BG02 hESC의 처리 후에 중내배엽의 형성을 도시한다. 면역염색은 미처리된 hESC 및 BIO 처리된 세포에서 T, Nanog, E-카드헤린 및 Snail에 대한 염색을 도시한다. DAPI를 이용하여 DNA를 염색하였다. (B) hESC를 BIO로 48시간 동안 처리한 후 Nanog, T, MixL1 전사체의 Q-PCR 분석.

도 7에서 MEF-CM의 마트리겔 상에서 성장시킨 트립신 계대배양된 BG01 hESC를 BIO(2 μM)으로 4일 동안 처리하였다. 세포를 (A) T 및 (B) E-카드헤린, Oct4로 프로빙시켜 면역염색하였다. 합성된 이미지도 도시한다. DAPI를 이용하여 DNA를 검출하였다.

도 8에서 MEF-CM의 마트리겔 상에서 성장시킨 콜라게나제 계대배양된 BG01 hESC를 BIO(2 μM)으로 4일 동안 처리하였다. 세포를 (A) E-카드헤린 및 (B) T 및 Nanog로 프로빙시켜 면역염색하였다. 합성된 이미지도 도시한다. DAPI를 이용하여 DNA를 검출하였다.

도 9는 BIO 및 SB431542의 존재하에 중내배엽의 형성을 도시한다. BIO(2 μM) 및 SB431542(20 μM)로 8일 동안 처리된 hESC의 Q-PCR 분석. Nanog, T, Sox17, CXCR4, FoxF1 및 PDGFR알파에 대한 메시지 수준을 도시한다.

도 10은 hESC를 BMP4 및 Wnt3a/BIO로 처리한 후 중내배엽 중간체를 통한 중배엽의 형성을 도시하는 도식이다.

도 11은 Wnt3a(25 ng/㎖) 및 BMP4(100 ng/㎖)로 10일의 기간 동안 처리한 후 hESC의 Isl1+ 다능성 선조(IMP) 세포로의 분화를 도시한다. T, Sox17, PDGFR알파, KDR, Isl1, Tbx20, GATA4, VE-카드헤린 및 cTNT에 대한 전사체 분석을 도시한다.

도 12는 Wnt3a(25 ng/㎖) 및 BMP4(100 ng/㎖)로 144시간의 프레임 동안 처리한 후 T+ 상태를 통한 hESC의 변이를 도시한다. T에 대한 면역염색을 도시한다. DAPI를 이용하여 DNA를 나타낸다. 합성 이미지는 겹쳐진 DAPI/T 염색을 나타낸다.

도 13은 Wnt3a(25 ng/㎖) 및 BMP4(100 ng/㎖)로 144시간의 프레임 동안 처리한 후 hESC의 Isl1+ 상태로의 분화를 도시한다. 세포를 Isl1, Nanog, Nkx2.5 및 Tbx20에 대해 염색하였다. DAPI를 이용하여 DNA를 나타낸다. 합성 이미지는 Nanog/Isl1 또는 Nkx2.5/Tbx20으로의 DAPI 염색을 나타낸다.

도 14는 지시된 시점에서 hESC(BG02) 및 Wnt3a(25 ng/㎖), BMP(100 ng/㎖) 처리된 세포의 명시 이미지이다. 이미지의 배율은 표시되어 있다.

도 15는 hESC가 중내배엽(MesEnd) 및 이후 중배엽으로 분화되는 경로를 예시하는 도식이다. 첫 번째 단계는 1-3일 동안 Wnt3a/BIO로 처리한 후 추가로 2-4일 동안 BMP4로 처리하는 것을 포함한다.

도 16은 5일 동안 BIO(2 μM) 및 BMP4(100 ng/㎖)로 처리된 hESC의 명시 이미지이다. 이 경우, hESC는 MEF-CM의 마트리겔 상에서 성장하였다. 배율은 표시 되어 있다.

도 17은 hESC(BG02)를 6일의 기간 동안 BIO(2 μM) 및 BMP4(100 ng/㎖)로 처리한 후 Isl1+ 다능성 선조 (IMP)의 생성을 도시한다. Q-PCR 분석은 시간 경과에 따른 Oct4, Nanog, Lefty A, T, MixL1, Goosecoid, Sox17, CXCR4, FoxF1, PDGFR알파, PDGFR베타, GATA4, Tbx20 및 Isl1에 대한 전사체 수준을 도시한다.

도 18은 hESC가 중내배엽 이후 중배엽으로 분화되는 경로를 도시하는 도식이다. hESC는 SB431542 및 Wnt3a/BIO와 같은 TGFβ 억제제 및 BMP4(1-4일)의 존재하에 중내배엽으로 분화된다. 중내배엽에서 중배엽으로의 분화는 2-4일에 걸쳐 Wnt3a/BIO 및 BMP4의 존재하에 도시된다.

도 19는 hESC가 중내배엽 이후 중배엽으로 분화되는 경로를 도시하는 도식이다. hESC는 SB431542 및 Wnt3a/BIO(1-4일)와 같은 TGFβ 억제제의 존재하에 중내배엽으로 분화된다. 중내배엽에서 중배엽으로의 분화는 2-4일에 걸쳐 BMP4의 존재하에 도시된다.

도 20에서, hESC는 Wnt3a(25 ng/㎖), BMP4(100 ng/㎖)를 함유하는 배지에서 6일 동안 마트리겔 상에서 6일 동안 IMP로 분화되었다. 세포를 6일째에 1:5 비율로 계대배양시킨 후 동일한 농도의 Wnt3a 및 BMP4를 함유하는 규정된 배지에서 추가로 10일 동안 마트리겔 위로 플레이팅하였다. 세포를 평활근 마커 칼포닌, 평활근 액틴(SMA), 평활근 미오신 중쇄(SM-MHC) 및 칼데스민(caldesmin)에 대해 면역염색하였다. DAPI를 이용하여 DNA를 염색하였다.

도 21은 Isl1+ 다능성 선조(IMP)로부터 심근세포 및 내피 세포의 생성을 도 시한다. 이 세포들을 IMP를 만드는 세 변형법으로 6일 동안 처리하였다. 처리 1; hESC를 처음 24시간 동안 액티빈 A(100 ng/㎖), 1-4일 동안 Wnt3a(25 ng/㎖) 및 2-6일 동안 BMP4(100 ng/㎖)를 지니는 규정된 배지에서 성장시켰다. 처리 2: hESC를 1-2일 동안 Wnt3a(25 ng/㎖) 및 2-6일 동안 BMP4(100 ng/㎖)와 함께 IGF-I, 헤레굴린(heregulin) 및 FGF2를 뺀 규정된 배지에서 성장시켰다. 이후 세포를 추가로 14일 동안 규정된 배지에서 성장시켰다. Q-PCR 분석을 마커 심장 알파 액틴/ACTC1, cTNT, CD31/PECAM1 및 CDH5/VE-카드헤린에 대해 수행하였다.

도 22는 hESC가 중내배엽(MesEnd) 중간체 상태를 통해 완성 내배엽(DE)으로 분화되는 것을 나타내는 도식이다. 규정된 배지의 hESC를 SB431542, Wnt3a/BIO와 같은 TGFβ 억제제로 1-3일 동안 처리한 후 높은 수준의 액티빈 A(100 ng/㎖)를 함유하나 IGF-I 및 헤레굴린이 없는 규정된 배지로 추가로 1-3일 동안 스위칭시켰다.

도 23은 hESC가 중내배엽(MesEnd) 중간체 상태를 통해 완성 내배엽(DE)으로 분화되는 것을 나타내는 도식이다. 규정된 배지의 hESC를 높은 수준의 액티빈 A(100 ng/㎖)를 존재시키고 IGF-I 및 헤레굴린을 부재시켜 3-5일 동안 BIO로 처리하였다.

도 24는 hESC가 중내배엽(MesEnd) 중간체 상태를 통해 완성 내배엽(DE)으로 분화되는 것을 나타내는 도식이다. 규정된 배지의 hESC를 낮은 수준의 액티빈 A(10 ng/㎖)를 존재시키고 IGF-I 및 헤레굴린을 부재시켜 3-5일 동안 BIO로 처리하였다.

도 25는 마트리겔 상에서 규정된 배지에서 성장시킨 hESC(BG02)로부터, 4일 동안 BIO(2 μM) 및 SB431542(20 μM)를 첨가시킨 후 헤레굴린 및 IGF-I의 부재하에 추가로 4일 동안 높은 수준의 액티빈 A(100 ng/㎖)로 처리함을 통한 완성 내배엽(DE)의 형성을 도시한다. Nanog, T, Sox17, CXCR4, FoxF1 및 PDGFR알파에 대한 전사체의 Q-PCR 분석을 도시한다.

도 26은 hESC(BG02)를 BIO(2 μM) 및 SB431542(20 μM)로 8시간의 프레임 동안 처리한 후 다능성 중간엽 세포(MMC)의 형성을 도시한다. Nanog, T, Sox17, CXCR4, FoxF1 및 PDGFR알파에 대한 전사체 수준의 Q-PCR 분석을 도시한다.

도 27은 hESC(BG02)를 BIO(2 μM) 및 SB431542(20 μM)로 4일 동안 처리한 후 다능성 중간엽 세포(MMC)의 형성을 도시한다. (A) T, (B) Oct4 및 Nanog 및, (C) E-카드헤린에 대한 면역염색을 DNA에 대한 DAPI 염색을 따라 도시한다.

도 28에서, 다능성 중간엽 세포(MMC)를 BIO(2 μM) 및 SB431542(20 μM)를 함유하는 규정된 배지에서 10 계대 동안 연속하여 성장시켰다. 세포를 매 5일마다 Accutase(상표명)(Innovative Cell Technologies)로 1:5의 분할(split)로 계대배양하였다. Q-PCR 분석은 상이한 계대에 걸쳐 hESC(BG01)에서 Nanog, T, Eomes, FoxF1, Sox17 및 Fgf5에 대한 전사체 수준을 도시한다.

도 29에서, P7로 성장시킨 BG02 hESC로부터 유래된 다능성 중간엽 세포(MMC)는 E-카드헤린, Nanog 및 Oct4와 같은 다능성 hESC 마커의 발현을 나타내지 않는다. DAPI 염색은 DNA를 나타낸다. Nanog 또는 E-카드헤린/Oct4를 이용한 DAPI에 대한 합성 이미지를 도시한다.

도 30은 (A) 20계대 동안 BIO(2 μM) 및 SB431542(20 μM)의 존재하에 규정 된 배지에서 성장시킨 hESC(BG02)로부터 유래된 다능성 중간엽 세포(MMC)의 명시 이미지를 도시한다. 플레이팅 3일 후(저 밀도) 및 플레이팅 6일 후(고 밀도)의 세포를 도시한다. 이미지의 배율은 표시되어 있다. (B) BG02 hESC로부터 생성된 P14 MMC를 저온보존하고, 해동시키고, MMC의 유지를 위한 앞서 개시된 조건하에 재플레이팅하였다. 저온보존되기 전의 MMC (P14) 및 저온보존된 MMC의 명시 이미지를 도시한다. (C) P14 MMC를 APC-컨주게이션된 항-CXCR4 항체로 염색하고 FACS(형광성 활성화된 세포 분류)로 처리하였다. FACS로부터 회수된 CXCR4+ 세포를 표준 MMC 배양 조건하에 플레이팅하였고, 분류 5일 후의 명시 사진으로서 도시하였다.

도 31은 규정된 배지에서 성장시킨 hESC(BG02) 및 BIO(2 μM) 및 SB431542(20 μM)를 지닌 규정된 배지에서 성장시킨 다능성 중간엽 세포(MMC)에서 SSEA3 및 SSEA4 세포 표면 마커의 분석을 도시한다. MMC 계대 수가 표시되어 있다. 유세포 측정 분석이 도시되며, 여기서 MMC 및 hESC는 SSEA3 및 SSEA4에 대한 항체로 염색된다. IC, 항체 이소형 대조군을 나타낸다.

도 32에서, 다능성 중간엽 세포(MMC)를 BIO(2 μM) 및 SB431542(20 μM)를 더한 규정된 배지에서 6 계대까지 성장시켰다. 이후, MMC를 IGF-I 및 헤레굴린이 결여되어 있으나 높은 수준의 액티빈 A(100 ng/㎖)를 갖는 규정된 배지에서 마트리겔 위로 4일 동안 플레이팅하였다. Q-PCR 분석이 도시되며, 여기에 Nanog, T, Ffg5, Eomes, Sox17 및 CXCR4에 대한 전사체가 도시된다.

도 33은 hESC로부터 다능성 중간엽 세포(MMC)의 형성 및 이들이 분화될 수 있는 잠재적인 세포 유형을 도시하는 도식이다.

발명의 개요

첫 번째 양태에서, 본 발명은 pPSC(특히 hESC)를 유효량의 하나 이상의 GSK 억제제(바람직하게는 GSK3), 예컨대 BIO, 또는 Wnt 단백질(날개 없는 단백질, 예컨대 특히 Wnt3a) 을 포함하는 관련 화합물(본원에서 달리 개시된 대로) 또는 관련 단백질을 포함하는 분화 배지에 중내배엽 세포 집단을 생성하기에 충분한 기간 동안 (일반적으로 약 18시간 내지 약 72 시간 또는 이를 초과하는 범위) 노출시키는 것을 포함하여 중내배엽 세포 집단을 생성하는 신규한 방법에 관한 것으로서, 중내배엽 세포 집단을 분리 및 계대배양하고, 저장하거나 (저온보존) 추가로 분화시켜 (하기 지시된 대로) 중배엽(Isl+) 전구체 세포를 생성할 수 있다.

두 번째 양태에서, 본 발명은 pPSC(특히 hESC)를 유효량의 하나 이상의 GSK 억제제, 예컨대 BIO, 또는 Wnt 단백질(날개 없는 단백질, 예컨대 특히 Wnt3a) 을 포함하는 관련 화합물(본원에서 달리 개시된 대로) 또는 관련 단백질을 포함하는 분화 배지에 중내배엽 세포 집단을 생성하기에 충분한 기간 동안(일반적으로 약 18시간 내지 약 36 시간, 바람직하게는 약 1-2일의 범위) 노출시켜 중내배엽 세포 집단을 생성하고, 상기 중내배엽 세포 집단을 임의로 분리시키고, 후속하여 첫 번째 단계에서 생성된 중내배엽 세포 집단을 유효량의 GSK 억제제, 예컨대 BIO, 또는 Wnt 단백질(날개 없는 단백질, 예컨대 특히 Wnt3a) 을 포함하는 관련 화합물(본원에서 달리 개시된 대로) 또는 관련 단백질과 함께 유효량의 골 형태발생 단백질(BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7)을 포함하는 분화 배지에 중배엽 Isl1+ 세포(섬-1 심혈관 선조 세포)를 생성하기에 충분한 기간 동안(일반적으로 약 2-9일, 약 3-6일, 약 3-5일, 약 72-132시간, 약 120-130시간) 노출시키는 것을 포함하여, 중배엽(Isl+) 세포 집단을 생성하는 신규한 방법에 관한 것이다. 특정 구체예에서, GSK 억제제는 중내배엽이 GSK 억제제의 부재하에 유효량의 BMP를 이용하여 중배엽 세포로 분화될 수 있도록 분화 배지로부터 제거될 수 있음이 본원에서 주목된다.

분리된 중내배엽 세포는 심장, 평활근 및 내피 계통을 형성하도록 분화되거나 내배엽 세포로 분화될 수 있는 중배엽(Isl1+) 세포로 추가로 분화될 수 있다. 중내배엽 세포 또는 중배엽(Isl1+) 세포를 형성하는 기본적인 접근법은 특히 hESC 세포주를 포함하고, 그 중에서도 BG01 및 BG02 세포주를 포함하는 실제로 모든 pPSC에 영향을 미친다.

중배엽 (Isll+) 세포는 당업계에서 표준이 되는 방법을 이용하여 심근세포(심장 근육 세포)로 분화될 수 있다. 이러한 심근세포는 심근경색(경색된 심장)을 포함하는 심혈관 질환 및 기타 심혈관 질환을 치료하는 요법에 이용될 수 있다.

중배엽(Isl+) 세포는, 세포를 유효 농도의 GSK 억제제(바람직하게는, Wnt3a)와 함께 골 형태발생 단백질(BMP4)을 포함하는 세포 분화 배지에서 매 5-6일마다 세포를 계대배양함에 의해 혈관 평활근 세포로도 분화될 수 있다. 본 발명에 의해 생성된 이러한 혈관 평활근 세포를 이용하여 허혈성 혈관 질환을 치료하고 혈관을 수복시킬 수 있다.

대안적인 구체예에서, 본 발명은 다능성 중간엽 유주 세포(다능성 유주 세포 또는 MMC로서 언급됨)의 안정한 집단의 생성에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 양태에서, pPSC, 특히 hESC를 유효량의 GSK 억제제(바람직하게는, GSK3 억제제, 예컨대 BIO 또는 본원에 달리 개시된 대로 날개 없는 단백질과 같은 관련 GSK3 억제제, 예를 들어 Wnt3a) 및 유효량의 액티빈 A 억제제(길항제), 예컨대 SB-431542(Sigma), 폴리스타틴, 폴리스타틴 유전자 관련 단백질(FGRP, R and D Systems로부터 이용가능함), BMP 및 액티빈 막 결합된 억제제(BAMBI), 항-BAMBI(모노클로날 항체), Smad7(Mothers Against Decapentaplegic Homolog 7), TGF RI 억제제(Calbochem) 및/또는 골 형태발생 단백질 길항제(BMP 길항제), 예컨대 노긴(noggin), 스클레로스틴, 그렘린(Dmr 그렘린) 및 자궁 민감화 관련 유전자 1 단백질(USAG-1, SOST11)을 포함하는 분화 배지에서 성장시킨다. 본 발명의 상기 양태에서, 신규한 다능성 유주 세포의 생성은 본원에서 달리 개시된 분화 배지의 pPSC(특히 hESC)를 GSK 억제제 및 액티빈 A 억제제 및/또는 BMP 억제제에 약 3일 내지 12일, 약 4일 내지 9일, 약 5일 내지 8일, 약 6일 내지 8일, 약 7일 동안 노출시킴에 의해 수행된다. 안정한 MMC인 이러한 세포들을 수집하고, 저장하거나 (저온보존), 다수 횟수로 계대배양할 수 있다(적어도 20회 내지 무한 횟수의 계대배양 동안). 이러한 세포들은 자가 증식성이다. 이러한 MMC는 다능성이며, 내배엽 세포 및/또는 중배엽 세포를 포함하는 수많은 성숙한 세포 집단으로 본원에 달리 개시된 기술을 이용하여 추가로 분화될 수 있다. MMC는 내세포괴(mass) 단계 배아 또는 태아 조직으로부터 분리될 수도 있다.

본 발명은 또한 다능성 및 자가 증식성인 분리된 다능성 유주 세포(MMC)의 집단에 관한 것이다. 이러한 세포를 이들의 마커 프로필을 유지하면서 연장된 기간에 걸쳐(다수 세대를 통해) 성장시킬 수 있고 그렇게 자가 증식성인 것으로 보인다. 이들 세포는 내배엽 및 중배엽을 포함하는 다수의 세포 유형으로 분화될 수 있으므로 다능성이다. 따라서, 상기 세포들은 현저한 발생 형성성(plasticity)을 지닌다. 그러나, 이들 세포는 마커 프로필에 기초하는 hESC가 아니다. 이들은 hESC로부터 유래된 대안적인 다능성 세포의 첫 번째 예를 나타내다. 상기 세포를 분리하고 저장한다(저온보존).

본 발명에 따른 MMC는 하기 특징을 갖는다:

- 이들은 다능성이며 자가 증식성이다;

- 이들은 내배엽 및 중배엽을 포함하는 다수의 세포 유형으로 분화될 수 있다;

- 이들은 MMC들(E-cad- Oct4- Nanog- SSEA3- CXCR4+) 간에 교대될 수 있는 동적 세포이고 이의 E-cad- Oct4+ Nanog+ SSEA3- CXCR4+(고 밀도 (상피 시트))가 현저한 발생 형성성을 지니는 대안적인 세포 유형이다.

- 마커 프로필에 기초하여, 이들 세포는 hESC가 아니다.

본 발명에 따른 MMC는 안정하고, 세포주의 생육성에 영향을 미치지 않으며 20회 이상 계대배양될 수 있으며, 당 분야에 널리 공지된 표준 저온보존 기술을 이용하여 저장될 수 있다. 본 발명에 따른 MMC를 저장하고, 수송하고, (세포의 초기 생성과) 먼 위치에서 이용할 수 있다.

발명의 상세한 설명

하기 용어를 이용하여 본 발명을 설명한다.

달리 언급되지 않는 한, 본원에서 사용된 용어들은 관련 분야의 당업자에게 통상적인 용법에 따라 이해되어야 한다. 하기 제시된 용어 정의에 추가하여, 분자 생물학에서의 일반적인 용어의 정의를 문헌[Rieger et al., 1991 Glossary of genetics: classical and molecular, 5th Ed., Berlin: Springer-Verlag; and in Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1998 Supplement)]에서 찾아볼 수 있다. 본 명세서 및 청구범위에 사용된 단수 형태는 사용된 문맥에 따라서 하나 이상을 의미할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 예를 들어 "세포"라는 언급은 하나 이상의 세포가 이용될 수 있음을 의미할 수 있다.

본 발명은 본 발명의 바람직한 구체예 및 본원에 포함된 실시예의 하기 상세한 설명을 참조하여 보다 용이하게 이해될 수 있다. 그러나, 본 발명의 조성물 및 방법을 기술하기에 앞서, 본 발명이 특정 조건 또는 특정 방법 등으로 제한되지 않고, 그러한 것들이 물론 변화될 수 있으며, 그 안에서 수많은 변형 및 개질이 당업자에게 자명할 것임이 이해되어야 한다.

세포를 성장시키고, 세포를 분리시키고, 적절한 경우, DNA 리가아제, DNA 폴리머라제, 제한 엔도누클레아제 등을 포함하는 효소 반응을 위해 클로닝, DNA 분리, 증폭 및 정제시키는 표준 기술 및 다양한 분리 기술이 당업자에게 공지되어 있고 일반적으로 적용된다. 수많은 표준 기술이 문헌[Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York; Maniatis et al., 1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York; Wu (Ed.) 1993 Meth. Enzymol. 218, Part I; Wu (Ed.) 1979 Meth. Enzymol. 68; Wu et al., (Eds.) 1983 Meth. Enzymol. 100 and 101; Grossman and Moldave (Eds.) 1980 Meth. Enzymol. 65; Miller (ed.) 1972 Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Old and Primrose, 1981 Principles of Gene Manipulation, University of California Press, Berkeley; Schleif and Wensink, 1982 Practical Methods in Molecular Biology; Glover (Ed.) 1985 DNA Cloning Vol. I and II, IRL Press, Oxford, UK; Hames and Higgins (Eds.) 1985 Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK; 및 Setlow and Hollaender 1979 Genetic Engineering: Principles and Methods, Vols. 1-4, Plenum Press, New York]에 개시되어 있다. 사용된 약어 및 전문어는 당 분야의 표준으로 여겨지며 본원에 인용된 것과 같은 전문 잡지에서 일반적으로 사용되는 것이다.

"인간 배아 줄기 세포" 또는 hESC가 서브셋인 용어 "영장류 다능성 줄기 세포"는 전-배아, 배아 또는 수정 후 임의의 시점에 있는 태아 조직으로부터 유래되며, 3개 층(내배엽, 중배엽 및 외배엽) 모두의 유도체인 여러 상이한 세포 유형의 자손을 생성하는 적합한 조건하에 표준 기술-허용된 시험에 따라서, 예컨대 8-12주령 SCID 마우스에서 기형종을 형성하는 능력과 같은 가능한 특성을 지닌다. 이 용어는 다양한 종류의 줄기 세포의 확립된 라인, 및 기술된 식으로 다능성인 일차 조직으로부터 수득된 세포 둘 모두를 포함한다.

다능성 또는 pPS 세포 (pPSC)의 정의에는 문헌[Thomson et al. (Science 282: 1145, 1998)]에 개시된 인간 배아 줄기 세포(hESC)를 특히 포함하는 다양한 유형의 배아 세포 뿐만 아니라 다른 영장류로부터의 배아 줄기 세포, 예컨대 레수스 줄기 세포(Thomson et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 92: 7844, 1995)가 포함된다. 다른 유형의 다능성 세포도 이 용어에 포함된다. 인간 다능성 줄기 세포는 인간 탯줄 또는 태반혈 및 인간 태반 조직으로부터 수득될 수 있는 줄기 세포를 포함한다. 이들이 배아 조직, 태아 또는 다른 공급원으로부터 유래되었는지와 무관하게, 3개 모두의 배엽의 유도체인 자손을 생성할 수 있는 영장류 기원의 임의의 세포가 포함된다. pPS 세포가 악성 공급원에서 유래되지 않는 것이 바람직하다. 세포가 핵형적으로 정상인 것이 바람직하다(그러나 항상 필수적인 것은 아니다).

집단에서 줄기 세포 및 이의 유도체의 실질적인 비율이 미분화된 세포의 형태적 특성을 나타낼 때, 이들을 배아 또는 성체 기원의 분화된 세포와 확실히 구별하기 위해, pPS 세포 배양액을 "미분화된" 것으로 기술한다. 미분화된 pPS 세포는 당업자에 의해 용이하게 인식되며, 통상적으로 세포 콜로니의 이차원 현미경 관찰에서 높은 핵/세포질 비율 및 두드러진 핵인을 지니는 것으로 보인다. 집단 중 미분화된 세포의 콜로니가 종종 분화된 이웃 세포들에 의해 둘러싸일 것으로 이해된다.

다능성 줄기 세포는 단계-특이적 배아 항원(SSEA) 3 및 4, 및 Tra-1-60 및 Tra-1-81로 명명된 항체를 이용하여 검출될 수 있는 마커 중 하나 이상을 발현시킬 수 있다(Thomson et al., Science 282:1145, 1998). 시험관내에서 다능성 줄기 세포의 분화는 SSEA-4, Tra-1-60, 및 Tra-1-81 발현(존재하는 경우)의 손실을 초래하고 SSEA-1의 발현을 증가시킨다. 미분화된 다능성 줄기 세포는 통상적으로 알칼리성 포스파타제 활성을 지니는데, 이는 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시킨 다음, 기질로서의 벡터 레드(Vector Red)로 제조자가 기술한 대로 현상시킴에 의해 검출될 수 있다(Vector Laboratories, Burlingame Calif). 미분화된 다능성 줄기 세포도 RT-PCR에 의해 검출되는 Oct-4 및 TERT를 통상적으로 발현시킨다.

번식된 다능성 줄기 세포의 또 다른 바람직한 표현형은 3개 모두의 배엽: 내배엽, 중배엽 및 외배엽 조직의 세포로 분화될 수 있다는 것이다. 다능성 줄기 세포의 다능성은, 예를 들어 세포를 엄격하게 조합된 면역결핍(SCID) 마우스에게 주사하고, 형성된 기형종을 4% 파라포름알데히드를 이용하여 고정시킨 다음, 3개 배엽으로부터의 세포 유형의 입증을 위해 이들을 조직학적으로 조사함에 의해 확인될 수 있다. 대안적으로, 다능성은 배아체를 형성시키고 3개 배엽과 관련된 마커의 존재하에 배아체를 평가함에 의해 결정될 수 있다.

번식된 다능성 줄기 세포주를 표준 G-밴딩 기술을 이용하여 핵형분석하고 상응하는 영장류 종의 공개된 핵형과 비교할 수 있다. "정상 핵형"을 지니는 세포를 수득하는 것이 바람직한데, 이는 세포가 정배수체임을 의미하고, 여기에 모든 인간 염색체가 존재하고 현저하게 변경되지 않는다.

이용될 수 있는 다능성 줄기 세포의 유형은 전-배아 조직(예컨대, 주머니배), 배아 조직, 또는 임신 중 임의의 시점, 통상적으로 필수적인 것은 아니나 대략 임신 10-12주에 취해진 태아 조직을 포함하는, 임신 후 형성된 조직으로부터 유래된 다능성 세포의 확립된 라인을 포함한다. 비제한적인 예로는 인간 배아 줄기 세포 또는 인간 배아 생식 세포, 예컨대 인간 배아 줄기 세포주 WAO1, WA07, 및 WA099(WiCell)의 확립된 라인이다. 이러한 세포의 초기 확립 또는 안정화 동안, 본 설명의 조성물의 이용도 고려되는데, 여기서 공급원 세포는 공급원 조직으로부터 직접 취해진 일차 다능성 세포일 것이다. 영양 세포(feeder cell)의 부재하에 이미 배양된 다능성 줄기 세포 집단으로부터 수득된 세포도 적합하다. 예를 들어, BGO1v(BresaGen, Athens, Ga.)와 같은 돌연변이 인간 배아 줄기 세포주 및 WAO1, WA07, WA09(WiCell) 및 BGOl, BG02(BresaGen, Athens, Ga.)와 같은 정상적인 인간 배아 줄기 세포주도 적합하다.

배아덩이위판 줄기 세포(EpiSc) 및 유도된 다능성 줄기 세포(iPS)가 하기 다능성 세포의 광범한 정의 내에 있으며, 개념적으로 본 출원에 개시된 기술이 상기 개시된 이러한 및 기타 다능성 세포 유형(즉, 영장류 다능성 세포)에 적용될 수 있었다. EpiSc를 이식후 초기 단계 배아로부터 분리한다. 이들은 Oct4를 발현시키며 다능성이다. 참조, 문헌[Tesar et al, Nature, Vol 448, p.196 12 July 2007]. iPS 세포는, 성체 체세포를 탈분화시켜 네 개 유전자(c-myc, Klf4, Sox2, Oct4)의 레트로바이러스 형질도입에 의해 다능성 상태로 되돌림에 의해 제조된다. 참조, 문헌[Takahashi and Yamanaka, Cell 126, 663-676, August 25, 2006].

인간 배아 줄기 세포는 본 발명 뿐만 아니라, 예를 들어 문헌[Thomson et al. (U.S. Pat. No. 5,843,780; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995)]에 개시된 방법에 의해 제조될 수 있다.

"배아 줄기 세포"라는 용어는 바람직하게는 인간을 포함하는 영장류의 다능성 세포를 언급하며, 이는 주머니배 단계 배아로부터 분리된다. 인간 배아 줄기 세포는 인간으로부터의 줄기 세포를 언급하며, 인간 치료 또는 진단과 관련된 본 발명의 양태에 바람직하게는 이용된다. 하기 표현형 마커가 인간 배아 줄기 세포에 의해 발현된다:

SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, CD9, 알칼리성 포스파타제, Oct 4, Nanog, Rex 1, Sox2 및 TERT. 이것에 대해서는 문헌[Ginis, et al., Dev . Biol, 269(2), 360-380 (2004); Draper, et al., J. Anat, 200(Pt. 3), 249-258, (2002); Carpenter, et al., Cloning Stem Cells, 5(1), 79-88 (2003); Cooper, et al., J. Anat., 200(Pt.3), 259-265 (2002); Oka, et al., Mol. Biol. Cell, 13(4), 1274-81 (2002); 및 Carpenter, et al., Dev . Dyn., 229(2), 243-258 (2004)]을 참조할 수 있다. 특히 인간 배아 줄기 세포를 포함하는 임의의 영장류 다능성 줄기 세포(pPSC)가 본 발명에 따라 중내배엽 세포, 중배엽 Isl1+ 세포 및 다능성 유주 세포(MMC)를 생성하기 위해 본 방법에 이용될 수 있으나, 본 발명에 사용되는 바람직한 pPSC는 세포주 BG01 및 BG02로부터의 것들을 포함하는 인간 배아 줄기 세포, 및 다수의 다른 이용가능한 줄기 세포주를 포함한다.

"분화"라는 용어는 특수화되지 않거나 ("계통결정되지 않음(uncommitted)") 덜 특수화된 세포가, 예를 들어 다능성 유주 세포, 중내배엽 세포, 중배엽 세포, 신경 세포, 근육 세포 또는 기타 세포와 같은 보다 특수화된 세포의 특징을 획득하는 과정을 기술하기 위해 이용된다. "분화된"이라는 용어는 hESC를 포함하는 다능성 줄기 세포가 선조 세포와 같은 보다 특수화된 중간체 세포가 되는 과정을 포함하며, 이 때 보다 특수화된 중간체 세포(MMC, 중내배엽 세포 또는 중배엽 세포)는 심지어 더욱 특수화된 세포가 된다. 분화되거나 분화-유도된 세포는 세포의 계통 내에서 더욱 특수화된("계통결정된") 위치를 수득한 세포이다. 분화 과정에 적용될 때 "계통결정된"이라는 용어는 분화 경로에 있어서 보통의 환경 하에, 특수한 세포 유형 또는 세포 유형의 서브셋으로 분화를 지속하고 보통의 환경 하에, 상이한 세포 유형으로 분화될 수 없거나 덜 분화된 세포 유형으로 되돌아갈 수 없는 지점에 이른 세포를 언급한다. "탈-분화"는 세포가 세포의 계통 내에서 덜 특수화된(또는 계통결정된) 위치로 되돌아가는 과정을 언급한다. 본원에서 사용된 대로, 세포의 계통은 세포의 유전, 즉 이것이 어떤 세포로부터 왔고 어떤 세포를 발생시킬지를 정의한다. 세포의 계통은 발생 및 분화의 유전 모형 내에 세포를 배치한다. 계통-특이적 마커는 관심있는 계통의 세포 표현형과 구체적으로 관련된 특성을 언급하며 계통결정되지 않은 세포의 관심있는 계통으로의 분화를 평가하기 위해 이용될 수 있다.

"다능성 유주 세포", "다능성 중간엽 세포" 또는 "MMC"라는 용어는 상호교환적으로 본 발명에 따라 생성된 세포 또는 세포들을 언급하기 위해 사용된다. MMC는 E-cad- Oct4- Nanog- SSEA3- CXCR4+로서 특성규명된 동적 다능성 세포인데, 이들은 낮거나 중간 밀도를 지니며 이동성이다. 이들은 안정한 저장성을 갖고 다수의 세대 동안 계대배양되어도 여전히 성장을 유지할 수 있다. 이들은 현저한 발생 형성성을 지닌다. 이들은 마커 프로필에 기초하여 hESC가 아니다.

본 발명에 따른 MMC는 유효량의 GSK 억제제 및 액티빈 A 억제제의 존재하에 저장에 안정할 수 있다. BMP 억제제, 예컨대 노긴도 GSK 억제제 및 액티빈 A 억제제와 함께 이용될 수 있다. 이러한 세포는 수많은 것들 중에서도 중배엽 세포 또는 완성 내배엽 세포로 분화될 수 있다.

본 발명에 다른 다능성 중간엽 세포(MMC)는 하기 특징 중 하나 이상(적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 10개, 바람직하게는 모두)을 갖는다:

· 이는 안정적인 세포 집단으로서 20 계대 이상 동안 배양될 수 있다.

· 세포는 낮은 밀도로 플레이팅되는 경우 중간엽을 나타내고 높은 밀도에서 시트로 성장한다.

· 이는 BG01, BG02, WA09를 포함하는 hESC 라인으로부터 생성될 수 있다.

· MMC는 표준 방법에 의해 동결되고 저온 보존될 수 있다.

· MMC를 저온 저장 후 회수하여, 복구하고, 분화시킬 수 있다.

· MMC는 높은 플레이팅 효율로 계대배양될 수 있다(50%를 초과하는 플레이팅 효율 - 계대배양되는 세포의 50%가 성공적으로 시딩되고 생존한다).

· 세포 표면 상에 SSEA3 및 SSEA4 항원을 나타내지 않는다.

· Oct4 및 Nanog와 같은 hESC 마커를 발현하지 않는다.

· MMC는 표면 상에 CXCR4를 발현할 수 있다.

· MMC는 전사체 Zic1, HoxA9, HoxD4, HoxA5, HoxC10, HoxD3, Pax6, N-CAM, CXCR4를 발현한다.

· MMC은 이들이 T/brachyury 또는 에오메소더민을 발현하지 않으므로 중내배엽이 아니다.

· E-카드헤린 네거티브이다.

· MMC는 Q-PCR 분석에 의해 감지할 수 있는 수준으로 Sox17, Isl1, musashi, nestin을 발현하지 않는다.

· 계대 동안 정상적인 핵형을 보유한다.

· 이동성의 중간엽 표현형을 나타낸다.

· 다능성 분화 능력(중배엽 및 내배엽을 포함함)을 지닌다.

· SCID 마우스에 주사시 기형종을 형성하지 않는다.

- MMC 유전자 발현 프로필의 보다 완전한 기재에 대해서는 마이크로어레이 데이터 참조.

본원에서 사용된 "중배엽(Isl1+) 세포", 중배엽-유래된 Isl1+ 다능성 선조 세포 또는 "IMP"는 상호교환적으로 본 발명의 방법에 따라 pPSC(특히 hESC), 중내배엽 세포 또는 MMC로부터 생성된 중배엽 Isl1+ 세포를 기술하기 위해 사용된다.

중배엽(Isl1+) 세포(섬 1+ 다능성 선조 또는 IMP)는 하기 특징을 갖는다:

· Isl1, Tbx20, Nkx2.5, Fgf10, GATA4, KDR(Flk1), FoxF1, PDGFRα를 발현한다.

· 핵형적으로 정상이다.

· Oct4, Nanog, T, 에오메소더민을 발현하지 않는다.

· 심근세포, 평활근 세포 및 내피 세포로 분화될 수 있다.

IMP의 형성에 대해 마이크로어레이를 수행하였다. hESC를 Wnt3a(25ng/㎖) 및 BMP4(100ng/㎖)가 첨가된 규정된 배지에서 6일 동안 배양하였다. mRNA 추출 및 후속적인 마이크로어레이 분석을 위해 샘플을 0시, 24시, 48시, 72시, 96시, 144시에 수득하였다. 마이크로어레이 분석을 본 문서에 첨부된 표에 요약한다(IMP 마이크로어레이).

본원에서 사용된 "분화 배지", "세포 분화 배지", "배양 배지", "기본 세포 배지", "기본 세포 배지들" 또는 "기본 배지" 또는 "안정화 배지"는 유의적으로 (사용된 추가 성분들에 따라서) hESC, 중내배엽 세포, 중배엽 세포 또는 다능성 유주 세포(MMC)를 생성, 성장/배양 또는 대안적으로 더욱 성숙한 세포로 분화시키는 세포 성장 배지를 기술하기 위해 사용된다. 분화 배지는 당 분야에 널리 공지되어 있고 하나 이상의 최소 필수 배지 및 섬유모세포 성장 인자(FGF)와 같은 성장 인자, 아스코르브산, 글루코스, 비-필수 아미노산, 염(미량 원소 포함), 글루타민, 인슐린(지시되고 배제되지 않은 경우), 액티빈 A, 트랜스페린, 베타 머캅토에탄올, 및 본원에 달리 개시되고 당 분야에 널리 공지된 다른 제제들과 같은 하나 이상의 임의 성분들을 포함한다. 바람직한 배지는 1% 내지 20% (바람직하게는 약 2-10%)의 우태아 혈청을 함유하는 기본 세포 배지를 포함하거나, 규정된 배지(바람직함)의 경우, 우태아 혈청 및 KSR이 부재하나, 소 혈청 알부민(약 1-5%, 바람직하게는 약 2%)을 포함한다. 바람직한 분화 배지가 규정되어 있고 무 혈청이다. MMC가 생성되고 액티빈 A 억제제가 사용된 특정 구체예에서, 배지에서 액티빈 A가 제거될 수 있거나 실제로 이의 양이 감소될 수 있다.

본 발명에 따른 분화 배지에 임의로 첨가될 수 있는 다른 제제(agent)로는 다수의 다른 성분들 중에서도, 예를 들어 니코틴아미드, TGF-β 1, 2 및 3을 포함하는 TGF-β 패밀리의 구성원, 액티빈 A, 노들(nodal), 혈청 알부민, 섬유모세포 성장 인자 패밀리의 구성원, 혈소판-유래된 성장 인자-AA 및 -BB, 혈소판 부화 혈장, 인슐린 성장 인자(IGF-I, II), 성장 분화 인자(GDF-5, -6, -8, -10, -11), 글루카곤 유사 펩티드-I 및 II(GLP-I 및 II), GLP-1 및 GLP-2 모방체(mimetibody), 엑센딘-4, 부갑상선 호르몬, 인슐린, 프로게스테론, 아프로티닌, 히드로코르티손, 에탄올아민, 표피 성장 인자(EGF), 가스트린 I 및 II, 구리 킬레이터, 예컨대 트리에틸렌 펜트아민, 포르스콜린, Na-부티레이트, 베타셀룰린, ITS, 노긴, 신경돌기 성장 인자, 노들, 발포르산, 트리코스타틴 A, 나트륨 부티레이트, 간세포 성장 인자(HGF), 스핑고신-1, VEGF, MG132(EMD, CA), N2 및 B27 보충물(Gibco, CA), 스테로이드 알카로이드, 예컨대 시클로파민(EMD, CA), 각질세포 성장 인자(KGF), 딕코프(Dickkopf) 단백질 패밀리, 소 뇌하수체 추출물, 섬 신생-관련 단백질(INGAP), 인디안 헤드게호그(hedgehog), 음파 헤드게호그, 프로테아좀 억제제, 노치 경로 억제제, 음파 헤드게호그 억제제, 헤레굴린 또는 이들의 조합물이 있다. 이들 성분들 각각은 포함될 때 유효량으로 포함된다.

추가의 예로서, 적합한 배지는 하기 성분들, 예를 들어 둘베코의 개질된 이글 배지(DMEM), Gibco #11965-092; 녹아웃 둘베코의 개질된 이글 배지(KO DMEM), Gibco # 10829-018; Ham's F12/50% DMEM 기본 배지; 200 mM L-글루타민, Gibco #15039-027; 비필수 아미노산 용액, Gibco 11140-050; β-머캅토에탄올, Sigma #M7522; 인간 재조합 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), Gibco #13256-029로부터 제조될 수 있다. 본 발명에 이용된 배지의 바람직한 구체예는 본원에 달리 개시된 대로이다.

pPSC(특히 hESC)를 성장/배양하고 본 발명의 세포를 분화시키기에 특히 바람직한 분화 배지는 약 2%의 프로알부민(알부민; 밀리포어/혈청학적), 1x Pen/Strep, 1x NEAA, 1x 미량 원소 A, B, C(Mediatech), 아스코르브산(10-100 ng/㎖, 약 25-65 ng/㎖, 약 50 ng/㎖), 약 0.1 mM(0.025-0.5mM)의 β-머캅토에탄올(Gibco), 약 2-10 ng/㎖, 약 5-9 ng/㎖, 약 8 ng/㎖의 bFGF(Sigma), 200 ng/㎖(5-500 ng/㎖)의 LR-IGF(IGF-I로서 언급됨; JRH Biosciences), 10 ng/㎖의 액티빈 A(약 1 ng/㎖ 내지 약 20 ng/㎖ 이하) 및 lO ng/㎖(약 1-20 ng/㎖ 이상)의 헤레굴린을 함유하는 DMEM/F12(50:50)이다. 액티빈 A 또는 액티빈 A 시그널링이 다능성 유주 세포 MMC 및 중내배엽 세포의 생성에 요구되지 않으나, 특히 중배엽(Isl+) 세포를 생성할 때, 포함될 수 있음을 주목한다(포함되는 경우, 액티빈 A는 낮은 농도, 일반적으로 약 20 ng/㎖ 미만으로 포함되는 것이 바람직하다). 대조적으로, 약 20 ng/㎖ 내지 약 100 ng/㎖ 또는 이를 초과하는 액티빈 A 또는 "높은 농도의 액티빈 A"가 완성 내배엽 세포를 생성하는데 사용된다. 대안적으로, DMEM/F12와 유사한 성분을 갖는(componentry) 마우스 배아 섬유모세포-조건 배지 (MEF-CM)도 hESC를 계대배양시키고 본 발명에 따른 중내배엽 세포, 중배엽 세포(중배엽 Isl1+ 세포) 및 다능성 유주 세포(MMC)를 생성하는데 이용될 수 있다.

본 발명에 유용한 분화 배지는 시판되고 시판되는 성분들로 보충될 수 있으며, Calbiochem을 포함하는 다른 수많은 시판원 중에서도 Invitrogen Corp.(GIBCO), Cell Applications, Inc. 및 Biological Industries, Beth HaEmek, Israel이 있다. 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 분화 제제, 예컨대 섬유모세포 성장 인자(FGF), LR-IGF(인슐린-유사 성장 인자의 유사체) 및 헤레굴린(바람직하게는 세 개 모두 유효량으로)을 줄기 세포가 배양되고 다능성 유주 세포, 중내배엽 세포 또는 중배엽 세포(또는 심지어 MMC로부터의 완성 내배엽 세포)로 분화되는 세포 배지에 첨가한다. 당업자는 본 발명에 따른 표적 세포 중 임의의 하나 이상을 생성하도록 세포 배지를 용이하게 개질시킬 수 있을 것이다. 세포 분화 배지는 기본 세포 배지와 본질적으로 동일하나 분화 과정의 상황에서 사용되며 세포를 다른 세포로 분화시키는 세포 분화 제제를 포함한다. 안정화 배지는 추가 이용을 위해 세포주를 안정화시키기 위해 분화 단계 이전 또는 이후에 사용되는 기본 세포 배지이다. 배양 배지는 본질적으로 안정화 배지와 동일하나, 분화 전에 다능성 또는 다른 세포주를 성장시키거나 배양시키는 배지를 언급한다. 일반적으로, 본원에 사용된 세포 분화 배지 및 안정화 배지는 기본 세포 배지와 본질적으로 유사한 성분들을 포함할 수 있으나 상이한 상황에서 이용되고 의도된 배지 이용의 결과를 완수하기 위해 다소 상이한 성분들을 포함할 수 있다. MMC, 특히 저장 안정성을 지닌 MMC의 경우에, 본원의 다른 부분에 기재된 유효량의 GSK 억제제와 함께 본원의 다른 부분에 기재된 유효량의 액티빈 A 시그널링 억제제를 배양 배지에 포함시켜 MMC를 분화 및 안정화시키고, 즉 이들의 추가 분화를 억제하고 세포 집단의 저장 안정성을 허락할 수 있다. 이 목적을 위해 BMP 억제제를 액티빈 A 억제제 및 GSK 억제제와 함께 이용할 수 있다.

다능성 줄기 세포도 당 분야에 개시된 다양한 방식으로 다능성 줄기 세포를 지지하는 영양 세포의 층 상에서 배양될 수 있다. 대안적으로, 다능성 줄기 세포를 영양 세포가 본질적으로 존재하지 않으나 그럼에도 불구하고 실질적인 분화를 진행하지 않으며 다능성 줄기 세포의 증식을 지지하는 배양 시스템에서 배양한다. 무-영양세포 배지에서 분화가 없는 다능성 줄기 세포의 성장은 이전에 또 다른 세포 유형과 배양시킴에 의해 적응용(conditioned) 배지를 이용하여 지지된다. 대안적으로, 무-영양세포 배양에서 분화 없는 다능성 줄기 세포의 성장은 화학적으로 규정된 배지를 이용하여 지지된다. 이러한 접근법은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 세포를 무-영양 세포 배지에서 성장시킨다.

영양 세포의 층 상에서 세포를 배양시키는 접근법은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Reubinoff et al.(Nature Biotechnology 18: 399-404 (2000)) 및 Thompson et al.(Science 6 Nov. 1998: Vol. 282. no. 5391, pp. 1145-1147)]은 마우스 배아 섬유모세포 영양 세포 층을 이용하여 인간 주머니배로부터 다능성 줄기 세포주의 배양을 기술하고 있다. 문헌[Richards et al.(Stem Cells 21: 546-556, 2003)]에서는 인간 다능성 줄기 세포 배양을 지지하는 능력에 대해 11개의 상이한 인간 성인, 태아 및 신생아 영양 세포 층의 패널을 평가하였다. 리챠드 등은 "성인 피부 섬유모세포 영양세포 상에서 배양된 인간 배아 줄기 세포주가 인간 배아 줄기 세포 형태를 보유하고 여전히 다능성을 유지한다"라고 언급한다. US20020072117호는 무-영양세포 배지에서 영장류 다능성 줄기 세포의 성장을 지지하는 배지를 생성하는 세포주를 기술하고 있다. 사용된 세포주는 배아 조직으로부터 수득되거나 배아 줄기 세포로부터 분화된 중간엽 및 섬유모세포-유사 세포주이다. US20020072117호는 일차 영양 세포 층으로서 세포주의 이용도 개시한다. 또 다른 예에서, 문헌[Wang et al.(Stem Cells 23: 1221-1227, 2005)]은 인간 배아 줄기 세포로부터 유래된 영양 세포 층 상에서 인간 다능성 줄기 세포의 장기간 성장 방법을 기술하고 있다. 또 다른 예에서, 문헌[Stojkovic et al.(Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005)]은 인간 배아 줄기 세포의 자발적인 분화로부터 유래된 영양 세포 시스템을 기술하고 있다. 추가의 구체예에서, 문헌[Miyamoto et al.(+ 22: 433-440, 2004)]은 인간 태반으로부터 수득된 영양 세포의 공급원을 기술하고 있다. 문헌[Amit et al.(Biol . Reprod 68: 2150-2156, 2003)]은 인간 음경 꺼풀로부터 유래된 영양 세포층을 기술하고 있다. 또 다른 예에서, 문헌[Inzunza et al.(Stem Cells 23: 544-549, 2005)]은 인간 출생후 음경 꺼풀 섬유모세포로부터의 영양 세포층을 기술하고 있다.

배지, 특히 무-영양세포 배지에서 pPSC를 배양하는 접근법은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 미국특허 제 6,642,048호는 무-영양세포 배지에서 영장류 다능성 줄기(pPS) 세포의 성장을 지지하는 배지, 및 이러한 배지의 생성에 유용한 세포주를 기술하고 있다. 미국특허 제 6,642,048호는 "본 발명은 배아 조직으로부터 수득되거나 배아 줄기 세포로부터 분화된 중간엽 및 섬유모세포-유사 세포주를 포함한다. 이러한 세포주를 유도하고, 배지를 프로세싱하고, 줄기 세포를 적응용 배지를 이용하여 성장시키는 방법이 본 설명에 개시되고 예시된다"라고 기재하고 있다. 또 다른 예에서, WO2005014799호는 포유동물 세포의 유지, 증식 및 분화를 위한 적응용 배지를 기술하고 있다. 여전히 또 다른 예에서, 문헌[Xu et al.(Stem Cells 22: 972-980, 2004)]은 인간 텔로머라제 역전사효소를 과발현시키도록 유전적으로 개질된 인간 배아 줄기 세포 유도체로부터 수득된 적응용 배지를 기술하고 있다. 또 다른 예에서, US20070010011호는 다능성 줄기 세포의 유지를 위한 화학적으로 규정된 배양 배지를 기술하고 있다.

대안적인 배양 시스템은 배아 줄기 세포의 증식을 촉진할 수 있는 성장 인자가 보충된 무-혈청 배지를 이용한다. 예를 들어, 문헌[Cheon et al.(BioReprod DOI:10.1095/biolreprod. 105.046870, Oct. 19, 2005)]은 배아 줄기 세포가 배아 줄기 세포 자가 증식을 일으킬 수 있는 상이한 성장 인자가 보충된 비적응용 혈청 교체(SR) 배지에서 유지되는 무-영양세포, 무-혈청 배양 시스템을 기술하고 있다. 또 다른 예에서, 문헌[Levenstein et al.(Stem Cells 24: 568-574, 2006)]은 bFGF가 보충된 배지를 이용하여 섬유모세포 또는 적응용 배지의 부재하에 인간 배아 줄기 세포의 장기간 배양 방법을 기술하고 있다. 여전히 또 다른 구체예에서, US20050148070호는 혈청 및 섬유모세포 영양 세포가 없는 규정된 배지에서 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 방법을 기술하며, 이 방법은 줄기 세포를 알부민, 아미노산, 비타민, 미네랄, 하나 이상의 트랜스페린 또는 트랜스페린 대용물, 하나 이상의 인슐린 또는 인슐린 대용물을 함유하는 배양 배지에서 배양시키는 것을 포함하는데, 배양 배지에는 본질적으로 포유동물 태아 혈청이 존재하지 않고 이는 적어도 섬유모세포 성장 인자 시그널링 수용체를 활성화시킬 수 있는 약 100 ng/㎖의 섬유모세포 성장 인자를 함유하고, 여기서 성장 인자는 단지 섬유모세포 영양세포 층이 아닌 공급원으로부터 공급되며, 배지는 영양 세포 또는 적응용 배지 없이 미분화된 상태의 줄기 세포의 증식을 지지하였다.

US20050233446호는 미분화된 영장류 원시 줄기 세포를 포함하는 줄기 세포를 배양하는데 유용한 규정된 배지를 기술하고 있다. 용액에서 배지는 배양되는 줄기 세포에 비해 실질적으로 등장성이다. 주어진 배양액에서, 특정 배지는 기본 배지 및 원시 줄기 세포의 실질적으로 미분화된 성장을 지지하는데 필요한 양의 각각의 bFGF, 인슐린 및 아스코르브산을 포함한다. 추가의 예에서, WO2005065354호는 본질적으로 무-영양세포 및 무-혈청인 규정된 등장성 배양 배지를 기술하고 있는 데, 이는 a. 기본 배지; b. 실질적으로 미분화된 포유동물 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 bFGF; c. 실질적으로 미분화된 포유동물 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 인슐린; 및 d. 실질적으로 미분화된 포유동물 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 아스코르브산을 포함한다.

여전히 또 다른 예에서, WO2005086845호는 미분화된 줄기 세포의 유지 방법을 기술하며, 이 방법은 줄기 세포를 미분화된 상태로 세포를 유지하기에 충분한 양의 단백질의 형질전환 성장 인자-베타 (TGF.베타.) 패밀리의 구성원, 단백질의 섬유모세포 성장 인자(FGF) 패밀리의 구성원, 또는 니코틴아미드 (NIC)에 요망되는 결과를 달성하기에 충분한 시간 동안 노출시키는 것을 포함한다.

세포를 배아유사체로서 또는 현탁액에서 라기보다 부착 단층으로서 세포 지지체 또는 매트릭스 상에서 성장시키는 것이 바람직하다. 본 발명에서, 세포 지지체로서 마트리겔을 이용하는 것이 바람직하다. 세포 지지체는 바람직하게는 하나 이상의 분화 단백질을 포함한다. "분화 단백질" 또는 "기질 단백질"이라는 용어는 세포를 성장시키고/거나 배아 줄기 세포 또는 중내배엽, 중배엽 또는 다능성 유주 세포(MMC)의 분화(또한 바람직하게는 부착)를 촉진하기 위해 사용되는 단백질을 기술하기 위해 사용된다. 본 발명에 바람직하게 이용되는 분화 단백질로는, 예를 들어 세포외 매트릭스에서 발견되는 단백질인 세포외 매트릭스 단백질, 예컨대 라미닌, 테나신, 트롬보스폰딘 및 이들의 혼합물이 있으며, 이들은 성장 촉진성을 나타내고 표피 성장 인자(EGF)와 상동성을 갖는 도메인을 함유하며 성장 촉진성 및 분화 활성을 나타낸다. 본 발명에 이용될 수 있는 다른 분화 단백질로는, 예를 들어 콜라겐, 피브로넥틴, 비브로넥틴, 폴리리신, 폴리오르니틴 및 이들의 혼합물이 있다. 예를 들어, 겔 및 다른 물질, 예컨대 배아 줄기 세포 분화 단백질 중 하나 이상을 유효 농도로 함유하는 다른 겔의 메틸셀룰로오스도 이용될 수 있다. 이러한 분화 단백질을 포함하는 예시적인 분화 단백질 또는 물질로는 그 중에서도 특히, 예를 들어 BD 세포-Tak(상표명) 세포 및 조직 부착제, BD(상표명) FIBROGEN 인간 재조합 콜라겐 I, BD(상표명) FIBROGEN 인간 재조합 콜라겐 III, BD 마트리겔(상표명) 기저막 매트릭스, BD 마트리겔(상표명) 기저막 매트릭스 고농도(HC), BD(상표명) PuraMatrix(상표명) 펩티드 히드로겔, 콜라겐 I, 콜라겐 I 고농도(HC), 콜라겐 II(소), 콜라겐 III, 콜라겐 IV, 콜라겐 V, 및 콜라겐 VI가 있다. 본 발명에 사용하기에 바람직한 물질은 마트리겔(상표명) 및 겔트렉스(상표명)을 포함한다.

하나 이상의 분화 또는 기질 단백질을 함유하는 바람직한 조성물/물질은 BD 마트리겔(상표명) 기저막 매트릭스이다. 이것은 ECM 단백질이 풍부한 종양인 엔겔브레쓰-홈-스웜(EHS) 마우스 육종으로부터 추출된 용해된 기저막 제조물이다. 이의 주요 성분은 라미닌에 이어 콜라겐 IV, 헤파란 설페이트, 프오테오글리칸, 엔탁틴 및 니도겐이다.

다능성 줄기 세포를 바람직하게는 분화 또는 기질 단백질 위로 플레이팅한다. 다능성 줄기 세포를 세포 생존, 번식 및 요망되는 특성의 보유를 촉진하는 배지의 존재하에 적합한 분포로 기질 위로 플레이팅할 수 있다. 이러한 모든 특성은 시딩 분포에 대한 신중한 주의로 이익을 얻으며 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본원에서 사용된 "활성화"라는 용어는 Isl과 같은 마커의 발현에 있어서의 증가 또는 혈액 세포, 혈관 세포(내피 세포), 신장 세포, 골 및 근육 세포와 관련된 마커 또는 Isl 활성의 상향조절을 언급한다. 이들 세포는 심장병, 신장 퇴행, 골 복구 및 혈관 퇴행을 치료하는데 있어서 유용성이 있다.

세포, 세포주, 세포 배양액 또는 세포 집단을 언급하는 경우, 본원에서 사용되는 용어 "분리된"은 세포의 천연 공급원으로부터 실질적으로 분리되어 세포, 세포주, 세포 배양액 또는 세포 집단이 시험관 내에서 배양될 수 있는 것을 의미한다. 또한, 용어 "분리시키는"은 두 종 이상의 세포 군에서 한 종 이상의 세포의 물리적 선택을 의미하는데 사용되며, 여기서 세포는 세포 형태 및/또는 다양한 마커의 발현에 기초하여 선택된다.

본원에서 사용된 "발현시키다"라는 표현은 분자의 수준이 분자를 발현시키지 않는 세포에서와 비교하여 분자를 발현시키는 세포에서 또는 세포 상에서 측정가능하게 더 높아지도록 하는 세포에서의 폴리누클레오티드의 전사 또는 폴리펩티드 (마커 포함)의 번역을 언급한다. 분자의 발현을 측정하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 제한 없이 노던 블롯팅, RT-PCR, 동일반응계내(in situ) 하이브리드화, 웨스턴 블롯팅 및 면역염색을 포함한다.

본원에서 사용된 "마커"라는 용어는 관심있는 세포에서 차별적으로 발현되는 핵산 또는 폴리펩티드 분자를 기술한다. 이러한 문맥에서, 차별적인 발현은 포지티브 마커의 경우 증가된 수준 및 네거티브 마커의 경우 감소된 수준을 의미한다. 마커 핵산 또는 폴리펩티드의 검출가능한 수준은 다른 세포에 비해 관심있는 세포에서 충분히 높거나 낮아서, 관심있는 세포가 당 분야에 공지된 임의의 다양한 방법을 이용하여 다른 세포들로부터 동정되거나 구별될 수 있다.

본원에서 사용된 "접촉시키는"(즉, 세포를 화합물과 접촉시키는)이라는 용어는 시험관 내에서 화합물과 세포를 인큐베이션(예를 들어, 배양 세포에 화합물을 첨가함)시키는 것을 포함한다. 용어 "접촉시키는"은 피검체에서 천연적으로 발생할 수 있는 분화 제제에 세포를 생체내 노출(즉, 천연 생리학적 과정의 결과로서 발생할 수 있는 노출)시키는 것을 포함하려는 의도가 아니다. 세포를 분화 배지 및 본원에 달리 개시된 하나 이상의 성장 인자(BMP 또는 기타) 및 억제제 (GSK, 액티빈 A(시그널링) 또는 BMP(시그널링)의 억제제)와 접촉시키는 단계는 임의의 적합한 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 부착 층이 종종 90% 이상의 표적 세포 집단(중내배엽, 중배엽 또는 다능성 유주 세포)에 분화를 제공하는 효율적인 분화 과정을 제공하기 때문에 부착 층을 이용하는 것이 바람직하나, 세포는 배상체 또는 현탁 배양과 같은 부착 층으로서 부착 배양으로 처리될 수 있다. 분화 제제와 접촉된 세포가 세포를 안정화시키거나, 세포를 추가로 분화하거나, 예를 들어 섬 세포를 생성하기 위해 다른 세포 분화 환경으로 추가로 처리될 수 있다.

중내배엽 세포 및/또는 MMC로부터 완성 내배엽 세포를 생성하는 경우에, 세포는 본원에 달리 개시된 유효량의 액티빈 A(약 20 ng/㎖ 내지 약 100ng/㎖ 또는 이를 초과) 및 임의로 유효량의 PI3 키나아제 시그널링의 억제제를 포함하는 본원에 달리 개시된 배지에서 분화된다. 노들, TGFβ, 또는 기타 TGF 성분들 중 하나 이상이 액티빈 A 대신 또는 이에 추가하여 사용될 수 있는 것으로 이해된다. 또한, PI3 키나아제 억제제를 포함시키는 대신/이에 추가하여 IGF-1 및 헤레굴린과 같이 PI3 키나아제 시그널링에 영향을 주고/촉진시키는 인자를 분화 배지로부터 제거하는 것도 이용할 수 있다.

본원에서 사용된 "분화 제제"라는 용어는 hESC, 중내배엽 세포, 다능성 유주 세포(MMC) 또는 Isl1+ 다능성 선조(IMP)와 같은 세포가 부분적으로 또는 종말적으로 분화하도록 유도하는 임의의 화합물 또는 분자를 언급하고, 여기서 상기 분화는 적어도 부분적으로 GSK의 억제, hESC의 중내배엽 또는 중배엽 Isl1+ 세포로의 분화에서와 같이 골 형태발생 단백질(BMP-2, BMP-4, BMP-6 또는 BMP-7)의 포함, 또는 대안적으로 GSK의 억제 및 액티빈 A의 억제 및/또는 다능성 유주 세포(MMC)를 생성하는 골 형태발생 단백질의 억제, 또는 내배엽을 생성하는 액티빈 A의 첨가로 인한 것이다. 분화 제제가 하기 기술된 대로일 수 있으나, 이 용어는 그에 제한되지 않는다. 본원에서 사용된 "분화 제제"라는 용어는 동일한 생물학적 활성을 나타내는 천연 또는 합성 분자 또는 분자들을 그 범위 내에 포함한다.

"유효한"이라는 표현은 문맥에서 의도된 효과를 제공하기에 충분한 기간 동안 소정량으로 이용되거나 포함된 성분, 화합물 또는 조성물의 양을 기술하는데 이용된다. 예로서, 분화 제제의 유효량은 다른 성분들과 조합하여 분화 배지에서 요망되는 분화된 세포를 생성하는 양이다.

"골 형태발생 단백질" 또는 "BMP"라는 용어는 hESC 또는 중내배엽 세포를 중배엽 Isl1+ 세포로 분화시키기 위해 본원에 달리 개시된 기타 성분들과 함께 본 발명에서 이용되는 분화 제제를 기술하는데 사용된다. BMP-2, BMP-4, BMP-6 또는 BMP-7(BMP-2 또는 BMP-4가 바람직하다) 중 어느 하나를 분화 과정을 보조하기에 효과적인 양으로 이용할 수 있다. BMP를 약 1 ng/㎖ 내지 약 500 ng/㎖ 또는 이를 초과, 약 25 내지 약 500 ng/㎖, 약 25 내지 약 250 ng/㎖, 약 50 내지 약 150 ng/㎖, 약 75 내지 약 125 ng/㎖, 약 100 ng/㎖의 양으로 이용할 수 있다.

"GSK 억제제"라는 용어는 GSK(특히 GSK3, GSK3α 또는 GSK3β)를 억제하는 화합물을 기술하기 위해 이용된다. 본 발명에 사용되기에 바람직한 GSK 억제제의 예는 하기 중 하나 이상을 포함하며, 이들 모두는 Calbiochem으로부터 이용가능하다:

BIO(2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심(GSK3 억제제 IX);

BIO-아세톡심(2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-아세톡심(GSK3 억제제 X);

(5-메틸-1H-피라졸-3-일)-(2-페닐퀴나졸린-4-일)아민(GSK3-억제제 XIII);

피리도카르바졸-시클로페나디에닐루테늄 복합체(GSK3 억제제 XV);

TDZD-8 4-벤질-2-메틸-1,2,4-티아디아졸리딘-3,5-디온(GSK3β 억제제 I);

2-티오(3-요오도벤질)-5-(1-피리딜)-[1,3,4]-옥사디아졸(GSK3β 억제제 II);

OTDZT 2,4-디벤질-5-옥소티아디아졸리딘-3-티온(GSK3β 억제제 III);

α-4-디브로모아세토페논(GSK3β 억제제 VII);

AR-A014418 N-(4-메톡시벤질)-N'-(5-니트로-1,3-티아졸-2-일)우레아(GSK-3β 억제제 VIII);

3-(1-(3-히드록시프로필)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-일]-4-피라진-2-일-피롤-2,5-디온(GSK-3β 억제제 XI);

TWS119 피롤로피리미딘 화합물(GSK3β 억제제 XII);

L803 H-KEAPPAPPQSpP-NH₂ 또는 이의 미리스토일화된 형태(GSK3β 억제제 XIII); 및

2-클로로-1-(4,5-디브로모-티오펜-2-일)-에타논(GSK3β 억제제 VI).

또한, 다수의 날개 없는 단백질 또는 Wnt 단백질이 GSK 억제제 및 특히, 본 발명에 따른 GSK 억제제와 유사한 기능을 수행한다. 따라서, 이들은 GSK 억제제라는 용어 하에 준개략된다. 본 발명에 이용될 수 있는 예시적인 Wnt 단백질은 다른 Wnt 단백질 중에서도 Wnt1, Wnt2, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt10, Wnt14, Wnt14b, Wnt15, 및 Wnt16 중의 하나 이상을 포함한다. Wnt3a의 사용이 바람직하다.

본 발명에 사용되는 바람직한 GSK 억제제로는 BIO (GSK-3 IX) 및 Wnt3a가 있다.

GSK 억제제는 중내배엽 세포, 중배엽 세포, 다능성 유주 세포(MMC) 및 심지어 완성 내배엽 세포의 분화 및 형성과 관련된 본 발명의 모든 양태에 유용하다. 이들은 사용될 때, 유효량으로, (사용된 억제제의 분자량에 따라서) 약 0.001 내지 약 100 μM 또는 이를 초과, 약 0.05 내지 약 75 μM, 약 0.1 내지 약 50 μM, 약 0.25 내지 약 35 μM, 약 0.5 내지 약 25 μM의 농도로 사용된다. BIO를 사용하는 경우, GSK 억제제는 약 0.05 내지 약 50 μM, 약 0.1 내지 약 10 μM, 약 0.5 내지 약 5 μM, 약 1-3 μM의 양으로 분화 배지에 사용된다. Wnt 단백질을 사용하는 경우, 사용된 Wnt의 양은 약 1 내지 약 100 ng/㎖, 약 5 내지 약 50 ng/㎖, 약 10 내지 약 35 ng/㎖, 약 20 내지 약 30 ng/㎖, 약 25 ng/㎖이다.

"액티빈 A 억제제"라는 용어는 분화 과정에서 액티빈 A의 효과를 억제하기 위해 분화 배지에 임의로 첨가되고, 사용되는 경우, hESC로부터 다능성 유주 세포(MMC)를 생성하는 화합물 또는 성분을 기술하기 위해 사용된다. hESC로부터 MMC를 생성하기 위해, 분화 제제는 골 형태발생 단백질(BMP) 억제제와 함께 또는 이것을 빼고 유효량의 GSK 억제제(바람직하게는, GSK3 억제제, 예컨대 BIO 또는 다른 GSK3 억제제) 및 액티빈 A 억제제를 포함한다.

본 발명에 사용되는 예시적인 액티빈 A 억제제는 다른 것들 중에서도, 예를 들어 SB-431542(Sigma), 폴리스타틴, 폴리스타틴 유전자 관련 단백질(FGRP, R and D Systems으로부터 이용가능함), BMP 및 액티빈 막결합 억제제(BAMBI), 항-BAMBI(모노클로날 항체), Smad7(Mothers Against Decapentaplegic Homolog 7) 및 TGF RI 억제제(Calbiochem)를 포함한다. 액티빈 A 억제제는 본 발명에서 유효량으로 사용되며, 일반적으로 약 0.001 내지 약 100 μM 또는 이를 초과, 약 0.05 내지 약 75 μM, 약 0.1 내지 약 50 μM, 약 0.25 내지 약 35 μM, 약 0.5 내지 약 25 μM의 범위이다.

"골 형태발생 단백질 억제제" 또는 "BMP 억제제"라는 용어는 분화 배지에 유효량으로 첨가될 때 hESC를 다능성 유주 세포(MMC)로 분화시키는데 있어서 골 형태발생 단백질의 효과를 억제하는 화합물 또는 성분을 기술하기 위해 사용된다. 예시적인 BMP 억제제는 특히, 예를 들어 노긴, 스클레로스틴, 그렘린(Drm/그렘린) 및 USAG-1을 포함한다. 사용된 BMP 억제제의 양은 유효량이며, 일반적으로 (사용된 억제제의 분자량 및 유효성에 따라서) 약 0.01 ng/㎖ 내지 약 500 ng/㎖ 또는 이를 초과, 약 0.1 내지 약 350 ng/㎖, 약 0.5 내지 약 250 ng/㎖, 약 1 내지 약 500 ng/㎖, 약 5 내지 약 250 ng/㎖, 약 50 내지 약 150 ng/㎖, 약 75 내지 약 125 ng/㎖, 약 100 ng/㎖이다.

"PI3-키나아제 경로의 억제제" 또는 "PI3-키나아제 시그널링의 억제제"는 억제제와 접촉한 세포에서 PI3-키나아제의 활성 또는 PI3-키나아제의 하나 이상의 분자 다운스트림을 감소시키는 임의의 분자 또는 화합물을 언급한다. 이러한 억제제는 본 발명에 따라 중내배엽 세포 및/또는 다능성 유주 세포로부터 완성 내배엽 세포를 제조하는데 바람직한 억제제이다. 이 용어는, 예컨대 PI3-키나아제 길항제, PI3-키나아제 시그널 형질도입 캐스캐이드의 길항제, 내인성 PI3-키나아제의 합성 또는 발현을 감소시키는 화합물, 내인성 PI3-키나아제의 방출을 감소시키는 화합물, 및 PI3-키나아제 활성의 활성화제를 억제하는 화합물을 포함한다. 상기 특정 구체예에서, 억제제는 라파마이신, LY 294002, 어르트만닌, 염화리튬, Akt 억제제 I, Akt 억제제 II(SH-5), Akt 억제제 III(SH-6), NL-71-101, 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다. Akt 억제제 I, II, Akt III, 및 NL-71-101은 Calbiochem으로부터 시판된다. 기타 구체예에서, 억제제는 라파마이신 및 LY 294002로 구성된 군으로부터 선택된다. 추가의 바람직한 구체예에서, 억제제는 LY 294002를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 억제제는 Akt1-II를 포함한다. 억제제의 조합물이 요망되는 분화 효과를 유도하기 위해 이용될 수 있음이 이해된다. 궁극의 결과는 2007년 6월 4일 출원되고 WO 2007/143193으로서 공개된 국제 출원 PCT/US2007/013137호에 개시된 대로 췌장 내배엽 세포 및/또는 간 내배엽 세포의 생성에 이용될 수 있는 실질적인 양의 완성 내배엽 세포의 생성에 있으며, 상기 출원의 관련 부분이 본원에 참조로서 포함된다.

본 발명의 상황에서 세포, 세포주, 세포 배양액 또는 세포 집단을 언급하는 경우, 본원에서 사용되는 용어 "분리된"은 세포의 천연 공급원으로부터 실질적으로 분리되어 세포, 세포주, 세포 배양액 또는 세포 집단이 시험관 내에서 배양될 수 있는 것을 의미한다. 대안적으로, 본 발명의 상황에 따라, 용어 "분리된"은 세포 집단이 분화 배지 및 배양 플라스크로부터 분리되어 세포 집단이 저장(저온보존)될 수 있는 것을 의미한다. 또한, 용어 "분리시키는"은 두 종 이상의 세포 군에서 한 종 이상의 세포의 물리적 선택을 의미하는데 사용될 수 있으며, 여기서 세포는 세포 형태 및/또는 다양한 마커의 발현에 기초하여 선택된다.

용어 "계대배양된"은 추가 성장/재성장을 위해 세포를 분할하고 이러한 세포를 새로운 세포 바이얼로 옮기는 과정을 기술하는데 사용된다. 본 발명에 따른 바람직한 부착 세포(또는 배상체(embryoid bodies))는 효소(Accutase(상표명) 또는 콜라게나제) 계대, 수작업 계대(예를 들어, 주걱 또는 기타 다른 연성 기계 도구 또는 장치를 이용한 기계적 계대) 및 기타 비효소 방법, 예를 들어 세포 분산 완충용액을 이용하여 계대배양될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "접촉시키는"(즉, hESC, 중내배엽, 중배엽 또는 다능성 유주 세포를 화합물과 접촉시키는)은 시험관 내에서 화합물과 세포를 인큐베이션(예를 들어, 배양 세포에 화합물을 첨가함)시키는 것을 포함한다. 용어 "접촉시키는"은 피검체에서 천연적으로 발생할 수 있는 성장 인자 및/또는 다른 분화 제제 또는 억제제에 세포를 생체내 노출(즉, 천연 생리학적 과정의 결과로서 발생할 수 있는 노출)시키는 것을 포함하지 않는다. 본 발명에 따라 분화 배지에서 세포와 성장 인자 및/또는 억제제를 접촉시키는 단계는 임의의 적절한 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 세포는 배상체 또는 현탁 배양과 같이 부착 배양으로 처리될 수 있다. 분화 제제(들) 및/또는 억제제와 접촉된 세포는 세포를 안정화시키거나, 세포를 추가로 분화시키거나, 예를 들어 완성 내배엽 세포, 혈액 세포, 혈관 세포(내피 세포), 신장 세포, 골세포 및 근육 세포, 예를 들어 심근 세포를 생성시키기 위해 다른 세포 분화 환경으로 추가로 처리될 수 있다. 이러한 세포는 심장병, 신장 퇴행, 뼈의 복구 및 혈관 퇴행을 치료하기 위한 재생 의약에 유용하다.

출원인은 유효량의 골 형태발생 단백질(BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7)과 조합된 유효량의 GSK 억제제(특히, BIO)와 함께 hESC를 배양시키는 것이 중배엽 세포(Isl1+)를 발생시키는 것을 입증하였다.

본 발명은 분리된 분화 포유동물 세포, 특히 인간 중내배엽 세포, 중배엽(Isl1+) 세포 및/또는 다능성 유주 세포(MMC)의 집단을 포함하는 조성물을 고려하며, 상기 세포는 시험관 내에서 hESC(또는, 중배엽(Isl1+) 세포의 경우, 또한 중내배엽 세포)로부터 분화되고, 세포의 약 30% 초과가 중내배엽 세포, 중배엽(Isl1+) 세포 또는 MMC에 대한 마커를 발현한다. 본 발명의 한 구체예에서, 세포의 약 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 67%, 70%, 72%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 90% 초과가 중내배엽 세포이다. 바람직하게는, 조성물은 세포의 50% 이상, 및 70-80% 이상이 Pdx1 및/또는 Isl1를 발현하는 세포 집단을 포함한다. 중내배엽 세포는 마커 CD48, 에오메소더민(eomesodermin)(EOMES), T/Brachyury, Wnt3a 및 GSC중 하나 이상을 발현하는 세포이다.

본 발명은 분리된 중배엽 Isl1+, Nkx2.5, Tbx20, Fgf10 세포 집단을 포함하는 조성물을 추가로 고려하며, 상기 세포는 시험관내 배양으로 생성되고, 세포의 약 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 67%, 70%, 72%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% 초과 또는 80% 또는 90% 또는 90+%는 중배엽(Isl1+) 세포이다.

본 발명은 분리된 다능성 유주 세포 집단을 포함하는 조성물을 추가로 고려하며, 상기 세포는 시험관내 배양으로 생성되고, 세포의 약 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 67%, 70%, 72%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% 초과 또는 80% 또는 90% 또는 90+%는 MMC이다.

본 발명은 (a) hESC를 제공하고, (b) 세포 분화 배지에서 hESC와 유효량의 GSK 억제제(바람직하게는, GSK3)를 접촉시켜 중내배엽 세포를 생성시키고, (c) 임의로, 상기 중내배엽 세포를 분리시키는 것을 포함하여, hESC를 중내배엽 세포로 분화시키는 방법을 추가로 포함한다. 중내배엽 세포를 생성시키기 위해, hESC는 약 18 시간 내지 약 72 시간, 바람직하게는 약 1-2일의 기간 동안 상기 조건에서 분화된다.

본 발명은 (a) hESC를 제공하고, (b) 약 18 시간 내지 약 72 시간, 바람직하게는 약 1-2일의 기간 동안 세포 분화 배지에서 hESC와 유효량의 GSK 억제제를 접촉시키고, 이후 (c) 약 2-9일, 약 3-6일, 약 3-5일, 약 72-132 시간, 약 120-130 시간의 기간 동안 세포 분화 배지에서 단계 (b)에서 수득된 상기 세포와 유효량의 골 형태발생 단백질(BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7), 및 임의로 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 GSK 억제제를 접촉시켜 중배엽(Isl1+) 세포를 생성시키고, 임의로 상기 중배엽(Isl1+) 세포를 수집하고, 상기 중배엽 세포를 저장(저온보존)하고, 상기 중배엽 세포를 추가로 분화시켜 심근 및 평활근 조직, 내피 계열 또는 내배엽 세포를 생성시키는 것을 포함하여, hESC를 중배엽(Isl1+) 세포로 분화시키는 방법을 추가로 포함한다. 단계 c에서, GSK 억제제의 포함이 필요하지는 않으나, 이의 포함이 바람직함이 인식된다.

본 발명은 (a) 중내배엽 세포를 제공하고, (b) 약 2-9일, 약 3-6일, 약 3-5일, 약 72-132 시간, 약 120-130 시간의 기간 동안 세포 분화 배지에서 중내배엽 세포와 유효량의 골 형태발생 단백질(BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7), 및 임의로 GSK 억제제를 접촉시켜 중배엽(Isl1+) 세포를 생성시키고, 임의로 상기 중배엽(Isl1+) 세포를 수집하고, 상기 중배엽 세포를 저장(저온보존)하고, 상기 중배엽 세포를 추가로 분화시켜 심근 및 평활근 조직, 내피 계열 또는 내배엽 세포를 생성시키는 것을 포함하여, 중내배엽 세포를 중배엽(Isl1+) 세포로 분화시키는 방법을 추가로 포함한다. GSK 억제제의 포함은 임의 선택이며, 이의 포함이 바람직함을 인식하여야 한다.

본 발명은 또한 (a) hESC를 제공하고, (b) 약 4일 내지 12일, 약 4일 내지 9일, 약 5일 내지 8일, 약 6일 내지 8일, 약 7일의 기간 동안 hESC와 유효량의 액티빈 A 억제제 및/또는 BMP 억제제와 조합된 유효량의 GSK 억제제를 접촉시키는 것을 포함하여, hESC를 다능성 유주 세포(MMC)로 분화시키는 방법에 관한 것이다. 생성된 MMC는 수집되고, 저장(저온보존)될 수 있거나, 다수 횟수로 계대배양되어 자가 증식성(self-renewing)인 안정적인 MMC를 생성시킬 수 있다. 이러한 MMC는 본원의 다른 곳에 기재된 기술을 이용하여 내배엽 세포 및/또는 중배엽 세포를 포함하는 다수의 성숙 세포 집단으로 추가로 분화될 수 있다. MMC는 중내배엽 세포로부터 중배엽(Isl1+)을 생성하는데 사용되는 일반적인 방법을 이용하여 중배엽(Isl1+) 세포를 생성하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법에서, MMC는 약 2일 내지 12일, 3 내지 9일, 4 내지 8일 등의 기간 동안 유효량의 BMP, 및 임의로 GSK 억제제와 조합(뿐만 아니라, MMC를 생성하는데 사용되는 액티빈 A 및/또는 BMP 억제제를 제거함)된 세포 분화 배지에서 성장된다. MMC는 또한 본원에 다른 곳에 기재된 바와 같이 완성 내배엽 세포를 생성시키는데 사용될 수 있다.

중배엽 세포 집단 및/또는 완성 내배엽 집단으로의 MMC의 추가 분화에서, 액티빈 A 억제제, 및 사용되는 경우 hESC를 MMC로 분화시키기 위해 사용되는 BMP 억제제는 제거되고, MMC는 중배엽 Isl1+ 세포를 생성시키는 조건(유효량의 BMP, 예를 들어 BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7, 및 임의로 GSK 억제제, 예를 들어 BIO 또는 Wnt3a), 또는 완성 내배엽 세포를 생성시키는 조건(유효량의 액티빈 A 또는 동등한 화합물(노들, TGFβ 또는 기타 TGF 성분), 및 임의로 PI3K 억제제 및/또는 성분 IGF-I 및/또는 헤레굴린의 제거, 또는 중배엽 또는 완성 내배엽 세포 집단을 생성시키는 기타 조건에서 성장된다. 본 발명에서 MMC로부터 완성 내배엽 세포를 생성시키는데 사용될 수 있는, hESC로부터 완성 내배엽 세포를 생성시키기 위한 방법 및 조건은, 예를 들어 WO 2007/143193으로 공개된 PCT/US2007/013137호에 교시되어 있으며, 이의 관련 부분은 참조로서 본원에 포함된다.

또한, 본 발명에 따른 MMC는 추가된 성분을 지니는 세포 분화 배지(바람직하게는, DMEM/F12)에서 임의로 P13K 억제제의 존재하에서 액티빈 A를 이용하여 분화되어 완성 내배엽 세포 집단을 생성시킬 수 있다. 노들, TGFβ 또는 다른 TGF 성분 중 하나 이상이 액티빈 A 대신, 또는 액티빈 A와 함께 사용될 수 있음이 인지된다. 또한, 분화 배지로부터의 PI3 키나아제 시그널링에 영향을 주고/이를 촉진하는 인자, 예를 들어 IGF-I 및 헤레굴린의 제거가 또한 PI3 키나아제 억제제의 포함 대신, 또는 PI3 키나아제 억제제의 포함과 함께 사용될 수 있다.

완성 내배엽 세포는 생성된 후에 분리되고 저장될 수 있거나, 대안적으로 췌장 내배엽 세포 및/또는 췌장 β 세포를 생성시키는데 사용될 수 있다. 완성 내배엽 세포는 추가의 1일 이상(바람직하게는, 2일) 동안 약 0.05 ㎍/㎖ 내지 약 25 ㎍/㎖, 또는 약 0.1 ㎍/㎖ 내지 약 2 ㎍/㎖의 농도의 레티노산 및 Fgf10(25 ng/㎖, 약 1-75, 약 5-50, 약 15-35, 약 20-30 ng/㎖)의 존재하에서 임의로 FCS(바람직하게는, 약 10%)를 포함하는 DMEM/F12에 노출되며, 여기서 췌장 내배엽 세포는 분리될 수 있다. 췌장 내배엽 세포는 다수의 추가 일(약 10-24일) 동안 유효 농도의 레티노산(상기 기술된 농도) 및 Fgf10을 이용하여 췌장 β 세포로 추가로 분화되어 췌장 β 세포를 제공할 수 있다.

간 내배엽 세포는 약 2일 이상, 약 4일 이상, 약 5일 이상, 약 6일 이상, 약 8일 이상, 약 10일 이상, 약 10-24일의 기간 동안 레티노산이 존재하지 않으나, 유효량의 섬유모세포 성장 인자(Fgf10)를 이용하여 완성 내배엽 세포를 분화시킴으로써 완성 내배엽 세포로부터 생성될 수 있고, 이후 간 내배엽 세포는 췌장 내배엽 세포 대신 생성되고, 임의로 추가 사용을 위해 분리된다.

본 발명에서, 중내배엽 세포, 중배엽 세포(Isl1+) 또는 MMC로의 분화 전에, pPSC(특히, hESC)는 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 적절한 분화 제제/억제제와 접촉시킴으로써 세포 분화 배지에서 성장/배양된다. hESC는 분화 배지에서 분화 제제/억제제와 접촉시킴으로써 분화되어, 이에 따라 본원의 다른 곳에 교시된 바와 같이 중내배엽 세포, 중배엽 세포(Isl1+) 또는 MMC가 생성되는 것이 고려된다. 한 구체예에서, 세포는 기저 세포 배지 중의 분화 제제와 접촉되기 전에 본질적으로 단일 세포 배양으로 분리될 수 있다. 세포는 바람직하게는 부착 단층으로 성장하여, 분화 제제/억제제와 세포의 효과적인 접촉을 가능케 하고, 부착 층은 프로테아제, 비제한적인 예로 Accutase(상표명)를 이용하여 분리될 수 있다. 한 구체예에서, 세포는 약 12시간 내지 약 10일 이상 동안 플레이팅된 후, 약 12시간 내지 약 72시간 동안 플레이팅된 후, 약 24시간 내지 72시간 동안 플레이팅된 후, 약 18시간 내지 36시간 동안 플레이팅된 후, 또는 본원의 다른 곳에 기재된 시간 동안 플레이팅된 후 분화 제제(들)/억제제와 접촉된다. 한 구체예에서, 세포는 약 18시간 초과, 약 24시간 초과, 약 48시간 초과, 약 72시간 초과, 약 96시간 초과, 약 150시간 초과, 약 136 내지 약 152시간, 약 144시간, 또는 본원의 다른 곳에 기재된 시간 동안, 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이 분화 제제 및/또는 억제제와 접촉된다. 분화 제제(들)/억제제(들)을 함유하는 세포 배지에 대한 노출 후, 수득된 생성 세포(일반적으로, 부착 단층, 또는 대안적으로 배상체로서 수득됨)는 직접 분리(Accutase(상표명) 처리됨)된 후, 추가로 계대배양되어 세포 집단을 재생시키거나, 세포를 또 다른 세포 집단으로 추가로 분화시킬 수 있다.

특정 구체예에서, 추가로 분화되는 hESC, 중내배엽 세포, 중배엽(Isl1+) 세포, 또는 MMC는 약 2.5 × 10⁶ 세포/35 ㎜ 디쉬(dish) 미만, 약 2.5 × 10⁴ 세포/35 ㎜ 디쉬 이상, 약 2.5 × 10⁵ 내지 약 2 × 10⁶ 세포/35 ㎜ 디쉬, 약 5 × 10⁵ 내지 약 2 × 10⁶ 세포/35 ㎜ 디쉬, 약 2 × 10⁶ 세포/35 ㎜ 디쉬 미만의 농도, 또는 4 × 10⁵ 세포/35 ㎜ 디쉬 초과의 밀도로 플레이팅된다. 특정한 바람직한 양태에서, 분화되는 세포는 약 7.5 × 10⁵ 세포/35 ㎜ 디쉬의 농도로 플레이팅된다.

hESC로부터의 중내배엽, 중배엽(Isl1+) 세포 또는 MMC의 생성에서, 본 발명의 특정 구체예의 첫 번째 단계로서, 본 발명은 hESC의 부착 단층을 생성하기 위해 세포를 배양하기 위한 조성물의 사용을 추가로 고려한다. hESC는 규정된 세포 배지(혈청 또는 KSR 없음)에서 세포 지지체, 바람직하게는 마트리겔(Matrigel) 상의 부착 단층으로 성장한다. 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 통상적인 성분에 더하여, 세포 배지는 또한 바람직하게는 하기 성분 중 하나 이상을 유효량으로 포함한다: 아스코르브산, 트랜스페린, β-머캅토에탄올(Gibco), 섬유모세포 성장 인자(FGF), LR-IGF, 액티빈 A, 및 헤레굴린, 및 바람직하게는 상기 성분 모두. hESC의 부착 층(또는 배상체)이 분화를 위한 출발 세포 집단으로서 사용되기 위해 성장되는 세포 배지는 당 분야의 교시내용에 따라 다양할 수 있다.

상기 생성된 hESC는 이후 세포 지지체 상에 플레이팅되고, 유효량의 분화 제제 및/또는 억제제를 지니는 분화 배지(본원의 다른 곳에 기재되어 있는 바와 같음) 중에서 분화된다. 세포는 바람직하게는 부착 단층으로 성장한다. 중내배엽 세포의 경우, hESC는 적절한 기간(본원의 다른 곳에 기재되어 있음, 약 18 시간 내지 약 72 시간의 범위) 동안 본원에 다른 곳에 기재되어 있는 바와 같이 유효량의 GSK 억제제(바람직하게는, BIO 또는 Wnt3a)를 포함하는 분화 배지와 접촉되어, 중내배엽 세포 집단을 생성시킨다. 중배엽 세포의 경우, hESC는 중배엽(Isl1+) 세포 집단을 생성시키기에 적절한 기간(보다 긴 기간의 분화 - 약 5-10일, 약 4-8일, 약 5-7일, 약 6일, 약 140-150 시간) 동안 골 형태발생 단백질(BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7)과 조합된 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 유효량의 GSK 억제제(바람직하게는, BIO 또는 Wnt3a)를 포함하는 분화 배지와 접촉된다.

한 추가 구체예에서, 세포 배지는 적응용 배지(MEF-CM)일 수 있다. 적응용 배지는 영양세포층(feeder layer)으로부터 수득될 수 있다. 영양세포층은 섬유모세포, 한 구체예에서는 배아 섬유모세포를 포함할 수 있는 것이 고려된다. 바람직하게는, 배지는 영양세포를 포함하지 않는다.

한 특히 바람직한 구체예에서, 중내배엽 세포, 중배엽(Isl1+) 세포 또는 MMC를 생성하기 위한 분화 배지는 DMEM/F12(50/50), 약 2% 프로부민(probumin)(알부민), 항생제(1x Pen/Strep 1x NEAA), 미량 원소 A, B, C(예를 들어, 메디아테크(Mediatech)사로부터의 1×), 아스코르브산(예를 들어, 약 50㎍/㎖), 트랜스페린(예를 들어, 약 10㎍/㎖), β-머캅토에탄올(약 0.1mM), bFGF(예를 들어, 약 8 ng/㎖), LR-IGF(예를 들어, 약 200 ng/㎖), 액티빈 A(예를 들어, 약 10ng/㎖) 및 헤레굴린(예를 들어, 약 10ng/㎖)을 포함한다. 다능성 유주 세포(MMC)의 생성을 위해 액티빈 A 및 헤레굴린이 제거될 수 있음을 인지해야 한다. 물론, 상기 성분 중 하나 이상은 당 분야에 교시된 바와 같이 분화 배지에서 생략될 수 있으나, 본 발명에 사용하기 위해서는 상기 나열된 모든 구성 성분이 바람직하다.

본 세포는 또한 세포 분화에 영향을 주는(촉진하거나, 억제하거나, 좌우하는) 분자를 확인하기 위한 생물학적 검정에 사용하기 위한 잠재성을 제공한다. 본 발명의 세포의 분화에서의 첫 번째 단계는 특히 종양 전이의 일부로서 암의 진행에서 상피의 중간엽으로의 변이에 대해 연구할 중요한 기회를 제공한다. 따라서, 본 발명에 따른 방법 및 세포 집단은 분자 수준에서 EMT를 이해하고, 신규한 약물 표적을 확인하고, 또한 EMT를 촉진하는 조건하에서 EMT를 차단하는 소분자(BIO)를 스크리닝하는 특별한 시스템을 제공한다. 세포가 96/384 웰 플레이트에서 성장할 수 있는 경우, 이는 용이하게 수행될 수 있으며, 신속한 약물-스크리닝이 EMT를 차단하거나 억제하는 잠재적인 분자를 확인하는데 사용될 수 있으며, 이는 잠재적으로 가치있는 항암제가 될 수 있다.

MMC와 관련하여, 이는 다능성 분화 능력을 지니는, 규정된 배지에서 성장하는 안정적인 세포 집단이다. 이러한 세포는 특히 분화를 촉진하거나 억제하거나, 하나의 계통 또는 또 다른 계통으로의 분화를 촉진하고 지정하는 분자의 스크리닝에 특히 유용할 수 있다.

요법

본원에 기재된 세포 집단 및/또는 방법은 세포와 관련된 질병 및/또는 질환의 치료에서 유용한 요법을 제공할 수 있다.

첫 번째 양태에서, 본 발명은 심혈관 장애를 지닌 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 다능성 줄기 세포를 배양하고, 다능성 줄기 세포를 시험관 내에서 심혈관 근육 세포(심근세포)로 분화시키고, 유효량의 심혈관 근육 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 이식하는 것을 포함한다. 대안적으로, 환자에서 경색증을 포함하는 심혈관병을 치료하는 방법은 치료를 요하는 환자의 심장 조직에 유효량의 중배엽(Isl1+) 세포를 주입하는 것을 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 복구되어야 하는 혈관에 유효량의 중배엽(Isl1+) 세포를 주입하는 것을 포함하여, 손상 또는 허혈 맥관 조직(혈관)을 치료할 필요가 있는 환자의 손상 또는 허혈 맥관 조직(혈관)을 치료하는 방법을 제공한다. 한 대안적 구체예에서, 중배엽(Isl1+) 세포는 BMP(BMP4)와 조합된 유효량의 GSK 억제제(바람직하게는, Wnt3a)를 포함하는 세포 분화 배지에서 약 5-6일 이상의 기간 동안 세포를 계대배양함으로써 평활근 세포로 분화되고, 이에 따라 수득된 평활근 세포는 구조적 혈관 손상을 치료/복구하기 위해 환자의 구조적 혈관 손상 부위에 주입(이식)된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 타입 1 당뇨병에 걸렸거나 이의 발병 위험이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 다능성 줄기 세포를 배양하고, 다능성 줄기 세포를 시험관 내에서 β-세포 계통으로 분화시키고, β-세포 계통의 세포를 환자에 이식하는 것을 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 타입 2 당뇨병에 걸렸거나 이의 발병 위험이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 다능성 줄기 세포를 배양하고, 다능성 줄기 세포를 시험관 내에서 β-세포 계통으로 분화시키고, β-세포 계통의 세포를 환자에 이식하는 것을 포함한다.

적절한 경우, 환자는 이식된 세포의 생존 및 기능을 촉진하는 약학적 제제 또는 바이오액티브(bioactive)로 추가로 치료될 수 있다. 이러한 작용제는, 예를 들어 인슐린, TGF-β 패밀리의 구성원(TGF-β 1, 2 및 3), 골 형태발생 단백질(BMP-2, -3, -4, -5, -6, -7, -11, -12 및 -13), 섬유모세포 성장 인자-1 및 -2, 혈소판 유래 성장 인자-AA 및 -BB, 혈소판 부화 혈장, 인슐린 성장 인자(IGF-I, II), 성장 분화 인자(GDF-5, -6, -7, -8, -10, -15), 맥관 내피 세포 유래 성장 인자(VEGF), 플레이오트로핀(pleiotrophin), 엔도텔린 등을 포함할 수 있다. 다른 약학적 화합물은, 예를 들어 니코틴아미드, 글루카곤 유사 펩티드-I(GLP-I) 및 Ⅱ, GLP-1 및 2 모방체, 엑센딘-4, 레티노산, 부갑상선 호르몬, MAPK 억제제, 예를 들어 미국 공개 공보 2004/0209901호 및 미국 공개 공보 2004/0132729호에 기재된 화합물을 포함할 수 있다.

다능성 줄기 세포는 수용체로의 이식 전에 인슐린 생성 세포로 분화될 수 있다. 한 특정 구체예에서, 다능성 줄기 세포는 수용체로의 이식 전에 β-세포로 완전히 분화된다. 대안적으로, 다능성 줄기 세포는 분화되지 않은 상태 또는 부분적으로 분화된 상태로 수용체에 이식될 수 있다. 추가 분화가 수용체에서 발생할 수 있다.

중배엽(Isl1+) 세포 및/또는 심혈관 근육 세포는 분산된 세포로서 이식될 수 있거나, 심장 또는 간문맥으로 직접 주입될 수 있는 군집으로 형성될 수 있다. 완성 내배엽 세포, 또는 대안적으로 췌장 내배엽 세포, 또는 대안적으로 β 세포는 분산된 세포로서 이식될 수 있거나, 간문맥으로 직접 주입될 수 있는 군집으로 형성될 수 있다. 대안적으로, 세포는 생체적합성의 분해가능한 중합 지지체 또는 다공성의 비-분해성 장치로 제공되거나, 숙주 면역 반응으로부터 보호하기 위해 피막화될 수 있고, 이는 수용체의 적절한 부위에 이식될 수 있다. 이식 부위는 본 발명의 상황에서 심장, 간, 천연 췌장, 신장 낭하 공간, 그물막, 복막, 장막하 공간, 장, 위 또는 피하 주머니(subcutaneous pocket)를 포함한다.

이식된 세포의 추가 분화, 생존 또는 활성을 향상시키기 위해, 추가 인자, 예를 들어 성장 인자, 항산화제, 면역억제제 또는 항염증 제제가 세포의 주입 전, 주입과 동시, 또는 주입 후에 주입될 수 있다. 특정 구체예에서, 성장 인자는 생체내에서 주입된 세포를 분화시키기 위해 이용된다. 이러한 인자는 내인성 세포에 의해 분비되고, 동일반응계내에서 주입된 세포에 노출될 수 있다. 이식된 세포는 당 분야에 공지된 내인성 및 외생적으로 주입된 성장 인자의 임의의 조합에 의해 분화 유도될 수 있다.

이식에 사용되는 세포의 양은 환자의 상태 및 요법에 대한 반응을 포함하는 다수의 다양한 요인에 좌우되고, 이는 당업자에 의해 결정될 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 심혈관병 또는 당뇨병에 걸렸거나, 이의 발병 위험이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 다능성 줄기 세포를 배양하고, 배양된 세포를 시험관 내에서 심혈관 근육 세포 계통 또는 β-세포로 분화시키고, 세포를 3차원의 지지체에 통합시키는 것을 포함한다. 세포는 환자로의 이식 전에 상기 지지체 상에서 시험관 내에서 유지될 수 있다. 대안적으로, 세포를 함유하는 지지체는 추가 시험관내 배양 없이 환자에게 직접 이식될 수 있다. 지지체는 이식되는 세포의 생존 및 기능을 촉진하거나, 그렇지 않으면 당뇨병 또는 심혈관병 또는 기능장애를 치료하는데 사용될 수 있는 하나 이상의 약학적 제제와 임의로 통합될 수 있다.

본 발명의 목적에 사용하기에 적합한 지지체 물질은 조직 주형, 도관, 장벽 및 조직 복구에 유용한 저장소를 포함한다. 특히, 생물학적 조직을 재구성하거나 재생할 뿐만 아니라, 조직 성장을 유도하기 위한 화학주성 작용제를 전달하기 위해 시험관내 및 생체내에서 사용되는 발포체(foam), 스폰지, 겔, 하이드로겔, 직물 및 부직포 구조의 형태의 합성 및 천연 물질이 본 발명의 방법을 실시하는데 사용하기 위해 적합하다. 예를 들어, 미국 특허 제 5,770,417호, 미국 특허 제 6,022,743호, 미국 특허 제 5,567,612호, 미국 특허 제 5,759,830호, 미국 특허 제 6,626,950호, 미국 특허 제 6,534,084호, 미국 특허 제 6,306,424호, 미국 특허 제 6,365,149호, 미국 특허 제 6,599,323호, 미국 특허 제 6,656,488호, 미국 공개 공보 2004/0062753 A1호, 미국 특허 제 4,557,264호 및 미국 특허 제 6,333,029호에 기재된 물질을 참조할 수 있다.

약학적 제제와 통합된 지지체를 형성시키기 위해, 약학적 제제는 지지체를 형성시키기 전에 중합체 용액과 혼합될 수 있다. 대안적으로, 약학적 제제는 바람직하게는 약학적 담체의 존재하에서 제조된 지지체에 코팅될 수 있다. 약학적 제제는 액체, 미세하게 분할된 고체, 또는 임의의 다른 적절한 물리적 형태로 제공될 수 있다. 대안적으로, 약학적 제제의 방출 속도를 변경시키기 위해 부형제가 지지체에 첨가될 수 있다. 한 대안적 구체예에서, 지지체는 항염증성 화합물인 하나 이상의 약학적 화합물, 예를 들어 미국 특허 제 6,509,369호에 기재된 화합물과 통합된다.

지지체는 항아폽토시스 화합물인 하나 이상의 약학적 화합물, 예를 들어 미국 특허 제 6,793,945호에 기재된 화합물과 통합될 수 있다. 지지체는 또한 섬유증의 억제제인 하나 이상의 약학적 화합물, 예를 들어 미국 특허 제 6,331,298호에 기재된 화합물과 통합될 수 있다. 지지체는 또한 혈관 신생을 향상시킬 수 있는 하나 이상의 약학적 화합물, 예를 들어 미국 공개 공보 2004/0220393호 및 미국 공개 공보 2004/0209901호에 기재된 화합물과 통합될 수 있다. 지지체는 또한 면역억제 화합물인 하나 이상의 약학적 화합물, 예를 들어 미국 공개 공보 2004/0171623호에 기재된 화합물과 통합될 수 있다.

지지체는 또한 성장 인자인 하나 이상의 약학적 화합물, 예를 들어 TGF-β 1, 2 및 3을 포함하는 TGF-β 패밀리의 일원, 골 형태발생 단백질(BMP-2, -3, -4, -5, -6, -7, -11, -12 및 -13), 섬유모세포 성장 인자-1 및 -2, 혈소판-유래 성장 인자-AA 및 -BB, 혈소판 부화 혈장, 인슐린 성장 인자(IGF-I, II), 성장 분화 인자(GDF-5, -6, -8, -10, -15), 혈관 내피 세포 유래 성장 인자(VEGF), 플레이오트로핀, 엔도텔린 등과 통합될 수 있다. 다른 약학적 화합물은, 예를 들어 니코틴아미드, 저산소증 유도성 인자 1-α, 글루카곤 유사 펩티드-I(GLP-1), GLP-I 및 GLP-2 모방체 및 II, 엑센딘-4, 노들, 노긴, NGF, 레티노산, 부갑상선 호르몬, 테나신-C(tenascin-C), 모탄력소(tropoelastin), 트롬빈 유래 펩티드, 카텔리시딘cathelicidin), 디펜신(defensin), 라미닌, 부착성 세포외 매트릭스 단백질의 세포 및 헤파린 결합 도메인을 포함하는 생물학적 펩티드, 예를 들어 피브로넥틴 및 비트로넥틴(vitronectin), MARK 억제제, 예를 들어 미국 공개 공보 2004/0209901호 및 미국 공개 공보 2004/0132729호에 기재된 화합물을 포함할 수 있다.

본 발명의 세포의 스캐폴드(scaffold)로의 통합은 스캐폴드 상으로의 세포의 간단한 침착에 의해 달성될 수 있다. 세포는 간단한 확산에 의해 스캐폴드에 진입할 수 있다(J. Pediatr. Surg. 23 (1 Pt 2): 3-9 (1988)). 세포 시딩의 효율을 향상시키기 위한 여러 다른 방법이 개발되었다. 예를 들어, 폴리글리콜산 스캐폴드 상으로의 연골세포의 시딩에 스피너 플라스크가 사용된다(Biotechnol. Prog. 14(2): 193-202 (1998)). 세포를 시딩하기 위한 또 다른 방법은 시딩된 세포에 대해 최소의 스트레스를 발생시키고, 시딩 효율을 향상시키는 원심분리의 이용이다. 예를 들어, 문헌[Yang et al. developed a cell seeding method (J. Biomed. Mater. Res. 55(3): 379-86 (2001))]에는 원심분리 세포 고정(CCI)으로 언급되어 있다.

본 발명은 하기 본 발명의 바람직한 구체예의 상세한 설명 및 본원에 포함된 실시예를 참조로 하여 보다 용이하게 이해될 수 있다. 그러나, 본 발명의 조성물 및 방법이 기술되고 기재되기 전에, 본 발명은 특정 핵산, 특정 폴리펩티드, 특정 세포 유형, 특정 숙주 세포, 특정 조건, 또는 특정 방법 등에 제한되지 않고, 다양할 수 있음이 이해되어야 하며, 다수의 변형 및 변화가 당업자에게 명백할 것이다.

하기 실시예는 본 발명을 추가로 기재하기 위해 제공된다. 하기 실시예는 본 발명을 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 간주되지 않는다.

모든 실시예는 BG01, BG02, WA09를 포함하는 다수의 hESC 세포주에 적용가능하나, 이에 제한되지는 않는다.

실시예 1: 인간 배아 줄기 세포의 배양

(a) 인간 배아 줄기 세포

인간 배아 줄기 세포(hESC; 도 1)는 주머니배 단계의 후기 착상전 배아의 내 세포괴(ICM)으로부터 유래된다. 발달 생물학자를 위한 실험 도구로서의 상기 인간 배아 줄기 세포의 강력함은 특정 신호에 반응하여 자가 증식하고, 3개의 배아 배엽(외배엽, 내배엽 및 중배엽) 및 배아밖 계통으로 분화하는 이들의 능력에 기인한다(도 2). hESC의 특성 및 행동은 다수의 배아 과정을 개괄하므로, 이들은 배아덩이위판에서 다능성 세포의 발달, 및 장배형성에서 배엽으로의 분화를 지지하는 메커니즘의 이해에 사용될 수 있다. 이들은 또한 치료적으로 유용한 세포 유형의 발생을 위한 물질의 공급원이다.

(b) hESC 성장 방법.

방법: POU 도메인 전사 인자 Oct4와 같은 마커를 발현하는 hESC를 바람직하게는 성장 매트릭스로서 마트리겔(예를 들어)을 이용하여 마우스 배아 영양세포 적응용 배지 MEF-CM 또는 규정 배지에서 성장시켰다. 세포를 통상적으로 60㎜ 디쉬 당 1-1.5 × 10⁶개로 플레이팅하였다. 세포를 ~1:4 내지 1:10의 분할(split)로 4-5일마다 계대배양하였다.

(ⅰ) 마우스 배아 섬유모세포 적응용 배지(MEF-CM)

hESC는 Fgf2의 존재하에서 마트리겔(BD Biosciences; 1:20-1:200 희석이 바람직함) 또는 마우스 배아 섬유모세포 적응용 배지(MEF-CM)에서 hESC 유지를 지지하는 다른 매트릭스 상에서 성장할 수 있다(McLean et al. Stem Cells 25: 29). 세포는 효소(트립신, Accutase(상표명), 콜라게나아제), 수작업 계대(기계식) 및 비-효소적 방법을 이용하여 다양한 방법에 의해 계대배양될 수 있다. 세포를 60 ㎜ 디쉬 당 1.5 × 10⁶개의 밀도로 플레이팅하고, 1:4-1:10의 분할로 4-5일마다 계대배양하였다.

(ⅱ) 규정 조건(DC)

(a) hESC의 통상적인 배양을 위한 규정 배지는 StemPro(등록상표)로서 인비트로겐(Invitrogen)사에서 구입하였다(Wang et al., B100d 110: 4111). 배지는 단일 세포 현탁액으로서 Accutase(상표명)가 세포를 계대배양하기 위해 사용된 것을 제외하고는, 제조업체의 권고에 따라 사용하였다. 본 발명자들은 분화 실험을 위해 구성을 변경할 필요가 있는 경우 본 발명자들 스스로 제형을 만들었다. 하기는 이러한 제형을 나타내고, 이는 다능성 상태로 hESC를 유지시킬 수 있다. 하기 규정된 혈청을 포함하지 않는 배지 조건은 잘 작동하였으나, 이러한 특정 제형에 제한되지는 않으며, 상기 배지 조건은 영양세포를 포함하지 않는 배양액을 포함하였다: DMEM:F12(Gibco), 2% BSA(Seriologicals, #82-047-3), 1x Pen/Strep(Gibco), 1x 비-필수 아미노산(Gibco), 1x 미량 원소 A, B 및 C(Cellgro; #99-182-Cl, #99-176-Cl, #99-175-Cl), 50ug/㎖ 아스코르브산(Sigma, #A4034), 10ug/㎖ 트랜스페린(Gibco, #11107-018), 0.1nM 베타-머캅토에탄올, 8ng/㎖ Fgf2(Sigma, #F0291), 200ng/㎖ LR-IGF(JRH Biosciences, #85580), 10ng/㎖ 액티빈 A(R&D Systems, #338-AC), 10ng/㎖ 헤레굴린 베타(Peprotech; #100-03).

(b) hESC는 또한 제조업체의 권고에 따라 mTeSR1과 같은 추가의 시판되는 규정 배지 제형(BD/Stem Cell Technologies; Ludwig et al., Nat Biotechnol. 24:185)에서 배양될 수 있다. 상기 배지와 함께 Accutase(상표명) 계대를 또한 이용하였다.

c. hESC의 분화 능력

hESC는 배아밖 구조 계통 외에 3개의 배아 배엽(외배엽, 내배엽 및 중배엽) 각각으로 분화하는 능력을 지닌다(도 2). 따라서, 이들은 광범위한 치료적으로 유용한 세포 유형을 발생시키는 출발점이다.

실시예 2: 중내배엽 세포를 발생시키는 방법

중배엽 및 내배엽으로의 hESC의 분화는 Wnt3a 및 GSK 억제제와 같은 분화 유도 인자의 첨가에 의해 T+/Brachyury+ 중내배엽 중간체 세포 유형을 통한 변이를 포함한다(도 3).

(a) hESC로부터 중내배엽을 발생시키기 위한 Wnt 의 이용

이러한 방법은 정준 Wnt 시그널링 분자 Wnt3a의 첨가에 의한 hESC의 중내배엽으로의 분화를 포함한다.

(a-ⅰ) 액티빈 A를 적게 함유하는 배지의 존재하에서의 Wnt3a를 이용한 중내배엽의 발생.

hESC(BG01)를 규정 배지에서 실시예 1에 특정된 조건에 따라 플레이팅하였다. ~16-24시간 후, 인간 Wnt3a(25ng/㎖; R&D Systems)를 배양액에 첨가하였다. Q-PCR 분석은 Nanog 전사체가 48시간까지 감소하고; T, Eomes 및 MixL1 mRNA 수준이 1-2일에 걸쳐 증가한 후, 5일까지 감소하는 것을 나타내었다(도 4A). 48시간 후에 E-카드헤린 및 Nanog가 하향조절되는지 결정하기 위해 면역염색법을 이용하였 다. 이러한 기간 동안, β-카테닌 및 Snail이 핵에 축적되고, T/brachyury 수준이 증가하였다(도 4B). Q-PCR 데이터와 함께, 상기 결과는 Wnt3a가 상피의 중간엽으로의 변이를 포함하여, hESC를 중내배엽으로 분화시키는 것을 나타낸다.

(a-ⅱ) 액티빈 A 시그널링의 부재하에서의 Wnt3a 를 이용한 중내배엽의 발생.

hESC는 SB431542(20μM)가 보충된 규정 배지 중에 Wnt3a(25ng/㎖)를 첨가하여 중내배엽으로 분화될 수 있다. 이는 중내배엽으로의 hESC 분화는 액티빈 A 시그널링을 필요로 하지 않지만, 표준 Wnt 시그널링 경로의 활성화에 좌우되므로 가능하다(도 5).

(a-ⅲ) 액티빈 A를 함유하지 않는 배지에서의 Wnt3a를 이용한 중내배엽의 발생.

hESC는 액티빈 A가 결핍된 규정 배지 또는 MEF-CM 중에 Wnt3a(25ng/㎖)를 첨가하여 중내배엽으로 분화될 수 있다. 이는 중내배엽으로의 hESC 분화는 액티빈 A 시그널링을 필요로 하지 않지만, 표준 Wnt 시그널링 경로의 활성화에 좌우되므로 가능하다(도 5).

(a-ⅳ) SB431542의 존재하 및 액티빈 A의 부재하에서 Wnt3a를 이용한 중내배엽의 발생.

hESC는 액티빈 A 시그널링 억제제 SB431542의 존재하에서 액티빈 A가 결핍된 규정 배지 중에 Wnt3a(25ng/㎖)를 첨가하여 중내배엽으로 분화될 수 있다. 이는 중내배엽으로의 hESC 분화가 액티빈 A 시그널링을 필요로 하지 않으므로 가능하다.

(b) GSK의 억제제를 이용한 hESC로부터의 중내배엽의 발생.

본 방법은 GSK 억제제 BIO((2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심; GSK3 억제제 IX, Calbiochem)의 첨가에 의한 hESC의 중내배엽으로의 분화를 포함한다.

(b-ⅰ) 규정 배지에서 BIO를 이용한 hESC로부터의 중내배엽의 발생.

hESC(BG01)를 규정 배지 중에 실시예 1에 특정된 조건에 따라 플레이팅하였다. ~16-24 시간 후, BIO(2μM)를 배양액에 첨가하였다. Q-PCR 분석은 Nanog 전사체가 48시간까지 감소하고; T 및 MixL1 mRNA 수준이 처음 24시간에 걸쳐 증가한 후, 즉시 감소하는 것을 나타내었다(도 6). 48시간 후에, E-카드헤린 및 Nanog가 하향조절되는지 결정하기 위해 면역염색법을 사용하였다. 이러한 기간 동안, Snail이 핵에 축적되고, T/brachyury 수준이 증가하였다(도 6). Q-PCR 데이터와 함께, 상기 결과는 BIO가 상피의 중간엽으로의 변이를 포함하여, hESC를 중내배엽으로 분화시키는 것을 나타낸다.

(b-ⅱ) MEF-CM에서 성장된 hESC로의 GSK 억제제 BIO 의 첨가.

마트리겔 코팅된 플레이트 상에서 MEF-CM에서 성장된 hESC(BG02)를 4일에 걸쳐 MEF-CM + BIO(2μM)에서 계대배양시켰다. 첫 번째 실험은 트립신을 이용하여 계대배양된 세포를 나타낸다. 이러한 실험에서, BIO 처리는 Oct4 및 E-카드헤린의 하향조절, 및 T/Brachyury의 하향조절을 야기시켰다(도 7A, B). 이는 BIO 처리가 상피의 중간엽으로의 변이 및 중내배엽으로의 분화를 촉진하는 것을 나타낸다. 두번째 실험은 BIO가 MEF-CM에서 배양된 hESC에 첨가된 유사한 실험을 나타내고, 이번에는 콜라게나제로 계대배양하였다. BIO 처리는 Nanog 및 E-카드헤린의 하향조절, 및 T/Brachyury의 상향조절을 야기시켰다(도 8A, B). 이러한 결과는 또한 BIO 에 의한 GSK 억제가 중내배엽 분화를 야기시키고, 이는 상피의 중간엽으로의 변이와 관련되는 것을 나타낸다.

(b-ⅲ) GSK 억제제 BIO 및 SB431542의 첨가에 의한 중내배엽으로의 분화.

규정 배지에서 마트리겔 상에서 성장된 hESC(BG02)를 Accutase(상표명)를 이용하여 BIO(2μM) 및 SB431542(20μM)가 보충된 규정 배지로 계대배양시켰다. 8일의 기간에 걸쳐 상기 세포의 분화를 모니터링하기 위해 Q-PCR 분석을 이용하였다. 이러한 데이터는 BIO/SB431542 처리가 24-48시간 내에 Nanog 전사체를 감소시키는 것을 나타냈고, 이는 다능성의 상실을 나타낸다(도 9). 24시간 후, T/Brachyury 전사 수준은 현저하게 상승하였고, 시간 경과의 기간 동안 유지되었다. 중배엽(FoxF1, PDGFRalpha) 및 내배엽(Sox 17, CXCR4)에 대한 마커는 상기 시간 경과 동안 현저하게 변하지 않았다(도 9). 상기 결과는 BIO가 SB431542의 억제로 인해 액티빈 A 시그널링의 부재하에서 hESC의 중내배엽으로의 분화를 촉진할 수 있음을 나타낸다.

(b-ⅳ) 액티빈 A가 결핍된 배지에서 GSK 억제제 처리에 의한 hESC의 중내배엽으로의 분화.

hESC는 액티빈 A가 결핍된 MEF-CM 또는 규정 배지에서 성장하는 hESC에 BIO를 첨가하여 중내배엽으로 분화될 수 있다. 이는 중내배엽 분화가 액티빈 A 시그널링에 독립적이며, BIO가 MEF-CM 및 규정 배지에서 EMT/중내배엽 분화를 촉진할 수 있다는 것을 나타내는 본 발명자의 이전의 연구에 기초한 것이다(도 5).

(b-ⅴ) 액티빈 A를 많이 함유하는 배지에서 GSK 억제제 처리에 의한 hESC의 중내배엽으로의 분화.

hESC는 높은 수준의 액티빈 A(100ng/㎖)를 지니는 MEF-CM 또는 규정 배지에서 성장하는 hESC에 BIO를 첨가함으로써 중내배엽으로 분화될 수 있다. 이는 중내배엽 분화가 액티빈 A 시그널링에 독립적이며, BIO가 MEF-CM 및 규정 배지에서 EMT/중내배엽 분화를 촉진할 수 있다는 것을 나타내는 본 발명자의 이전의 연구에 기초한 것이다.

실시예 3: 중배엽 유래 Isl1+ 다능성 선조(IMP)의 발생 방법.

본 실시예는 심근세포, 평활근 세포 또는 내피 세포로 분화하는 능력을 지닌 중배엽 유래 Isl1+ 다능성 선조(IMP) 세포 유형의 발생 방법을 기재한다. 이러한 세포 유형은 중내배엽 상태를 통한 경로를 따라, 이후 중배엽으로 분화한다(도 10).

(a) hESC 배양액으로의 Wnt3a 및 BMP4의 첨가에 의한 Isl1+ 다능성 선조(IMP)의 발생.

StemPro(등록상표) 규정 배지에서 성장된 BG02 hESC를 Accutase(상표명)를 이용하여 계대배양시키고, 배지가 BMP4(100ng/㎖, R&D Systems) + 인간 Wnt3a(R&D Systems)로 보충된 것을 제외하고는 실시예 1에 기재된 바와 같이 마트리겔 코팅된 디쉬(60㎜ 디쉬 당 1.0 × 10⁶개의 세포)에 플레이팅시켰다. 배지를 매일 교체하였다. 분화를 평가하기 위해 240시간(10일)에 걸쳐 Q-PCR 분석을 수행하였다. 이러한 분석은 처리 24시간 후에 T와 같은 중내배엽 마커가 상승하나, 이후에는 감소한 것을 나타내었다(도 11). 처리 24시간 후, 중배엽 분화를 나타내는 전사체 마커가 현저하게 상향조절되었다(Isl1, PDGFRalpha, KDR, Tbx20, GATA4)(도 11). 면역염색법은 처리 후 24-96시간에 걸쳐, 대부분의 세포가 T에 대해 양성으로 염색되었으나, 이는 144시간까지 감소한 것을 나타내었다(도 12). BMP4 및 Wnt3a를 이용한 처리 6일(144시간) 후, 90%를 초과하는 세포가 Nkx2.5, Isl1 및 Tbx20에 대해 양성으로 염색되었다(도 13). 이러한 유전자 발현 프로파일은 2차 심장 선조의 다능성 Isl1+ 선조를 나타낸다(Laugwitz et al., Development 135: 193-205). Isl1+ 세포로의 분화는 독특한 세포 형태 변화를 동반한다(도 14).

(b) 1-3일 동안의 Wnt3a 첨가 후, BMP4의 첨가에 의한 Isl1+ 다능성 선조(IMP)의 발생.

Isl1+ 중배엽 세포는 최초 1-3일 동안 Wnt3a를 이용한 후, 추가 2-4일 동안 BMP4의 첨가에 의한, MEF-CM 또는 규정 배지에서 성장된 hESC의 처리에 의해 발생될 수 있다(도 15).

(c) MEF-CM에서 BMP4 및 BIO와 같은 GSK 억제제의 hESC로의 첨가에 의한 Isl1+ 다능성 선조(IMP)의 발생.

MEF-CM 중에서 마트리겔 상에서 성장된 BG02 hESC를 트립신으로 계대배양시키고, BIO(2μM) + BMP4(100ng/㎖)가 보충된 MEF-CM 중의 마트리겔 상에 60㎜ 디쉬 당 1.5 × 10⁶개의 세포로 다시 시딩하였다. 배지를 매일 교체하였다. 분화를 평가하기 위해 240시간(10일)에 걸쳐 Q-PCR 분석을 수행하였다. hESC(도 1)와 비교 하여, 처리된 세포는 분화를 나타내는 형태로 변화하였다(도 16). Q-PCR에 의한 전사체 수준 분석은 hESC 마커 Nanog, Oct4, Lefty A가 ~48시간까지 감소하고, 중내배엽 마커(T, MixL1)가 48시간에서 최고에 달하나, 96시간까지 감소한 것을 나타내었다. 중내배엽 마커 수준이 감소함에 따라, 초기 중배엽에 대한 마커(FoxF1, GATA4, Isl1, Tbx20, PDGFRalpha, PDGFRbeta)는 24-48시간 이후 상승하였다(도 17). 이러한 마커는 IMP의 형성을 나타낸다.

(d) 규정 배지에서 배양된 hESC에 BMP4 및 BIO와 같은 GSK 억제제의 첨가에 의한 Isl1+ 다능성 선조(IMP)의 발생.

hESC는 BMP4 및 BIO 처리 6일 후에 규정 배지에서 배양된 hESC에 BMP4 및 BIO의 첨가에 의해 Isl1+ 선조로 분화될 수 있다(도 10).

(d) 1-3일 동안 BIO와 같은 GSK 억제제의 첨가 후, BMP4의 첨가에 의한 Isl1+ 다능성 선조의 발생.

Isl1+ 중배엽 세포는 1-3일 동안 BIO와 같은 GSK 억제제의 첨가 후, 추가 2-4일 동안 BMP4의 첨가에 의해 MEF-CM 또는 규정 배지에서 성장된 hESC로부터 발생될 수 있다(도 15).

(e) hESC 배양액에 Wnt3a 및 BMP4 및 TGFβ 시그널링 억제제(예를 들어, SB431542)의 첨가에 의한 Isl1+ 다능성 선조(IMP)의 발생.

Isl1+ 중배엽 세포는 1-4일 동안의 Wnt3a, BMP4 및 TGFβ 억제제(예를 들어, SB431542)의 첨가 후, TGFβ 억제제의 제거, 및 추가 2-4일 동안의 Wnt3a 및 BMP4를 이용한 지속적인 배양에 의해, MEF-CM 또는 규정 배지에서 성장된 hESC로부터 발생될 수 있다(도 18).

(f) 1-4일 동안의 Wnt3a 및 TGFβ 시그널링 억제제(예를 들어, SB431542)의 첨가 후, BMP4의 첨가에 의한 Isl1+ 다능성 선조(IMP)의 발생.

Isl1+ 중배엽 세포는 1-4일 동안의 Wnt3a 및 TGFβ 억제제(예를 들어, SB431542)의 첨가 후, 추가 2-4일 동안의 BMP4의 첨가에 의해, MEF-CM 또는 규정 배지에서 성장된 hESC로부터 발생될 수 있다(도 19).

(g) 1-3일 동안의 Wnt3a의 첨가 후, BMP4 및 SB431542의 첨가에 의한 Isl1+ 다능성 선조(IMP)의 발생.

Isl1+ 중배엽 세포는 1-3일 동안의 Wnt3a 및 SB431542 첨가 후, 추가 2-4일 동안의 BMP4의 첨가에 의해, mEF-CM 또는 규정 배지에서 성장된 hESC로부터 발생될 수 있다.

실시예 4: IMP는 심근 계통, 내피 세포, 심근세포 및 평활근 세포로 분화될 수 있다.

(a) IMP로부터의 평활근 세포의 발생.

hESC를 6일 동안 Wnt3a(25ng/㎖) 및 BMP4(100ng/㎖)의 존재하에서 규정 배지에서 성장시켰다. 세포를 추가 4일 동안 동일 배지에 1:4-1:6으로 분할시켰다. 세포를 고정시키고, 평활근 마커인 평활근 액틴, 칼포닌, 칼데스민 및 SM-MHC에 대해 염색시켰다(도 20). 대부분의 세포는 상기 평활근 마커에 대해 염색되었다.

(b) IMP로부터의 심근세포 및 내피 세포의 발생.

3개의 상이한 처리를 통해 IMP를 제조하였다. 처리 1; hESC를 처음 24시간 동안 액티빈 A(100ng/㎖), 1-4일 동안 Wnt3a(25ng/㎖), 및 2-6일 동안 BMP4(100ng/㎖)를 지니는 규정 배지에서 성장시켰다. 처리 2; hESC(BG02)를 1-2일 동안 Wnt3a(25ng/㎖) 및 2-6일 동안 BMP4(100ng/㎖)를 지니고, IGF-I, 헤레굴린 및 FGF2를 지니지 않는 규정 배지에서 성장시켰다. 처리 3; hESC를 처음 24시간 동안 액티빈 A(100ng/㎖), 1-2일 동안 Wnt3a(25ng/㎖), 및 2-6일 동안 BMP4(10ng/㎖)를 지니는 규정 배지에서 성장시켰다. 6일 종료 시에, 세포를 추가 14일 동안 규정 배지에 두었다. 세포를 수집하였고, Q-PCR 분석은 처리 2가 내피 세포 마커(CD31/Pecam1 및 CDH5/VE-카드헤린)를 생성시키고, 처리 3이 심근세포 마커(ACTC1/심장 알파 액틴 및 cTNT)를 생성시켰음을 나타내었다(도 21). 이러한 결과는 IMP 세포가 심근세포 및 내피 세포로 분화할 수 있음을 나타낸다.

실시예 5: 중배엽 유래 Isl1+ 다능성 선조( IMP )에 대한 물질 조성물.

Islet1+ 다능성 선조(IMP)는 하기 특성을 지닌다:

· 핵형적으로 정상이다.

· Oct4, Nanog, T, 에오메소더민을 발현하지 않는다.

· 심근세포, 평활근 세포 및 내피 세포로 분화할 수 있다.

· SCID 마우스의 뒷다리에 주사시 기형종을 형성하지 않는다.

IMP의 형성에 대해 마이크로어레이를 수행하였다. hESC를 6일 동안 규정 배지 + Wnt3a(25ng/㎖) 및 BMP4(100ng/㎖)에서 배양하였다. mRNA 추출 및 이후의 마 이크로어레이 분석을 위해 샘플을 0, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간 및 144시간에 채취하였다. 마이크로어레이 분석은 본 명세서에 첨부된 표(IMP 마이크로어레이)에 요약되어 있다.

실시예 6: IMP 세포는 심혈관병; 심장 및 맥관계에 대한 세포 치료제로서 사용될 수 있다.

심장혈관계를 포함하는 중요한 세포 계통으로 분화하는 능력으로 인해, IMP 세포는 세포 치료제로 사용될 수 있다. 예를 들어, 이들은 당업자에 의해 이식되는 경우 손상된 심근을 재생시키는데 사용될 수 있다. 이들은 또한 당업자에 의해 손상된 혈관계를 복구시키기 위해 사용될 수 있다.

실시예 7: 완성 내배엽(DE)를 제조하기 위한 방법.

(a) Wnt 및 TGFβ(예를 들어, SB431542), 이후 많은 액틴 A를 이용한 hESC의 치료를 이용한 DE의 발생.

DE는 규정 hESC 배지에 1-3일 동안 Wnt3a 및 SB431542를 첨가한 후, 추가 1-3일 동안의 IGF-I 및 헤레굴린과 함께 Wnt3a 및 SB431542의 제거 및 많은 액티빈(50-100ng/㎖)의 첨가를 통해 형성될 수 있다. hESC는 마트리겔 코팅된 플레이트 또는 동등물 상으로 계대배양될 것이다(도 22).

(b) GSK 억제제(BIO) 및 높은 농도의 액티빈 A를 이용한 hESC의 처리를 이용한 DE의 발생.

hESC로부터의 DE의 형성은 3-5일 동안의 hESC 규정 배지(IGF-I 및 헤레굴린 비함유)로의 BIO(2-5μM) 및 높은 농도의 액티빈 A(50-100ng/㎖)의 첨가를 통해 달 성될 수 있다(도 23). hESC는 마트리겔 코팅된 플레이트 또는 동등물 상으로 계대배양될 것이다.

(c) BIO 및 낮은 농도의 액티빈 A(10ng/㎖)의 존재하에서의 hESC의 처리를 이용한 DE 형성.

DE는 3-5일 동안 IGF-I 및 헤레굴린을 포함하지 않는 hESC 규정 배지에 BIO(2-5μM)의 첨가를 통해 형성될 수 있다(도 24). hESC는 마트리겔 코팅된 플레이트 또는 동등물 상으로 계대배양될 것이다.

(d) 1-3일 동안의 BIO의 첨가 후, 1-3일 동안의 액티빈 A의 첨가를 통한 hESC로부터의 DE의 형성.

DE의 발생은 1-3일 동안 hESC 규정 배지에 BIO(2μM)의 첨가를 통해 중내배엽 단계에 도달시킨 후, 1-3일 동안 IGF-I 및 헤레굴린과 함께 BIO를 제거하고, 액티빈 A를 첨가하여 달성될 수 있다(도 22). hESC는 마트리겔 코팅된 플레이트 또는 동등물 상으로 계대배양될 것이다.

(e) 1-4일 동안의 BIO 및 SB431542의 첨가 후, 많은 액티빈 A 처리를 통한 DE의 발생.

hESC를 수득하고, 4일 동안 BIO(2μM) 및 SB431542(20μM)의 존재하에서 규정 배지에서 성장시켰다. 이후, 세포를 추가 4일 동안 IGF-I 및 헤레굴린을 포함하지 않고, 추가 액티빈 A(100ng/㎖)를 지니는 동일 배지 또는 규정 배지로 1-4 분할하였다(도 22). 샘플(BG02)을 Q-PCR 분석을 위해 8일까지 2일마다 채취하였다. BIO/SB431542의 첫 번째 단계로 세포를 처음 2일 내에 T/brachrury 포지티브이고, Nanog, Sox 17 및 CXCR4 네거티브인 세포로 분화시켰다. 이러한 세포 유형을 BIO/SB431542의 존재하에서 유지시켰다. 세포가 규정 배지(IGF-I 및 헤레굴린은 포함하지 않음) + 액티빈 A(100 ng/㎖)로 전환된 후, 이들을 DE로 추가로 분화시켰으며, 이는 DE 마커 Sox 17 및 CXCR4의 상향조절 및 중배엽 마커 FoxF1의 부재에 의해 입증된다(도 25). hESC는 마트리겔 코팅된 플레이트 또는 동등물 상에 계대배양될 것이다.

실시예 8: 다능성 중간엽 세포(MMC)의 발생 방법.

StemPro(등록상표) 규정 배지에서 성장된 BG02 hESC를 Accutase(상표명)로 계대배양시키고, 배지가 BIO(2μM) + SB431542(20μM; Sigma)로 보충된 것을 제외하고는 실시예 1에 기재된 바와 같이 마트리겔 코팅된 디쉬(60㎜ 디쉬 당 1.0 × 10⁶개의 세포) 상에 플레이팅시켰다. 배지를 매일 교체하고, 세포를 각각의 계대에서 1:5-1:10 분할로 Accutase(상표명)를 이용하여 5-6일마다 계대배양하였다. 상기 조건하에서 배양하는 경우, 첫 번째 계대 (PO) 동안 다능성 마커 Nanog는 감소하고, T 전사체 수준은 증가한 반면, Sox 17, FoxF1, CXCR4 및 PDGFRalpha는 낮게 유지되었다(도 26). ~90%의 세포가 BIO 및 SB431542의 처리 4일 후에 T에 대해 +ve로 염색되었고, 이는 이들이 몇몇 지점에서 중내배엽 상태를 통해 변이되었음을 나타낸다(도 27A). 이러한 시간 동안, Nanog, Oct4 및 E-cad는 면역염색법에 의해 나타나는 바와 같이 현저하게 하향조절되었다(도 27B, C). E-카드헤린의 소실은 세포가 중내배엽으로의 분화와 일치하게, 내피에서 중내배엽으로 변이하였음을 나 타낸다. 지속된 계대 후, T 발현(Q-PCR에 의해 결정됨)은 P1-P10에 걸쳐 감소하였고, 다능성 마커 Nanog는 다시 나타나지 않았다(도 28). 이는 hESC와 대조적으로, P7 세포가 Nanog, Oct4 또는 E-카드헤린을 발현하지 않는 면역염색법에 의해 확인되었다(도 29). 중배엽 및 내배엽 마커는 이러한 기간 동안 증가하지 않았다. BIO/SB431542 처리된 세포의 세포 운명을 확립하기 위해, 본 발명자들은 이들을 동일 조건하에서 지속적으로 계대배양하였고, 이들이 형태의 유지와 함께 20 계대를 초과하는 기간 동안 강한 증식 활성을 유지하는 것을 발견하였다(도 30A). MMC를 표준 방법을 이용하여 저온보존시키고, 10%를 초과하는 플레이팅 효율로 회수하였다. 저온보존된 MMC의 성장 특성 및 형태는 냉동보존 전의 MMC의 성장 특성 및 형태와 구별할 수 없었다(도 30B).

BG02 hESC로부터 생성된 MMC에서, CXCR4+ 집단에 대해 부화시키기 위해 CXCR4 항체를 사용하였고, 이는 MMC가 형광 활성화 세포 분류기(FACS)에 적용되고, 다시 플레이팅되고, 증폭될 수 있음을 입증한다(도 30C).

유세포 측정 분석은 BIO/SB431542로 처리된 hESC가 세포 표면 마커 SSEA3 및 SSEA4를 상실하는 것을 나타내며, 이는 다능성 hESC 상태가 부재하는 분화를 나타낸다(도 31). PO-P19로부터 유지된 처리 세포는 SSEA3 및 SSEA4의 부재를 지속적으로 나타내었다(도 31). 따라서, 처리된 세포는 상기 기준에 의해 hESC가 아니다.

P0-P3 세포(예를 들어)로부터 중배엽 및 내배엽에 대한 마커의 출현을 모니터링함에도 불구하고, 본 발명자들은 상기 계통으로의 분화의 명백한 징후를 발견 하지 못하였으며, 이는 BIO/SB431542 처리가 상기 계통에 대한 마커가 나타나기 전에 발달 단계에서 세포를 억류시켰음을 나타낸다. 본 발명자들은 상기 세포가 중배엽 전 및 내배엽 전의 세포이나 더 이상 hESC가 아닌 것으로 간주한다. 이는 상기 세포가 BIO/SB431542의 제거 후, 및 세포 분화 인자의 첨가에 의해 징후가 나타날 수 있는 다능성 분화 잠재성을 보유할 가능성을 제기하였다. BIO/SB431542 함유 배지 내의 세포가 내배엽으로 추가로 분화될 수 있는 가능성을 시험하기 위해, 본 발명자들은 세포를 BIO/SB431542에서 6 계대 동안 성장시킨 후, 배지로부터 BIO/SB431542, 및 IGF-I 및 헤레굴린(PI3K 활성의 두 활성화제)을 제거하고, 액티빈 A를 100ng/㎖로 보충하였다. 이는 hESC의 완성 내배엽으로의 분화를 지지하는 조건이다. 내배엽 분화 조건으로의 변경 후의 4일의 기간에 걸쳐, 본 발명자들은 Sox 17 및 CXCR4 전사체가 증가한 반면, Nanog, T 및 에오메소더민 전사체가 낮게 유지된 것을 관찰하였다(도 32). 이러한 결과는 BIO/SB431542에서 계대배양된 세포가 내배엽을 발생시킬 잠재성을 보유하고, 적절한 조건하에서 배양되는 경우 내배엽으로 분화 유도될 수 있음을 나타낸다. 본 발명자들은 BIO/SB431542 처리된 세포가 또한 적절한 특정 인자에 노출되는 경우 중배엽 및 혹은 다른 계통(외배엽)으로 분화될 수 있음을 제안한다. 예를 들어, 본 발명자들은 BIO/SB431542 처리된 세포가 BIO/SB431542가 제거되고 배지에 BMP4가 첨가되는 경우 중배엽 세포로 전환될 수 있는 것으로 생각한다.

BIO/SB431542를 이용한 hESC의 처리는 내배엽 및, 필시 중배엽으로 분화될 수 있는 안정적인 특성을 지니는 자가 증식 집단을 생성시켰다. 중간엽 특성으로 인해, 본 발명자들은 상기 세포 유형을 다능성 중간엽 세포(MMC)로 칭하였다(도 33).

실시예 9: 다능성 중간엽 세포(MMC)에 대한 물질 조성.

다능성 중간엽 세포(MMC)은 하기 특성을 지닌다:

· 이는 BG01, BG02, WA09를 포함하는 다양한 hESC 계통으로부터 생성될 수 있다.

· MMC는 표준 방법에 의해 동결되고, 저온 보존될 수 있다.

· MMC는 동결 저장된 후 회수되고, 복구되고, 분화될 수 있다.

· MMC는 높은 플레이팅 효율로 계대배양될 수 있다.