CN108379661B - 利用离心种植构建组织工程膀胱的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用离心种植构建组织工程膀胱的方法。该方法包括：利用离心种植设备制备膀胱脱细胞基质‑种子细胞悬浮液结构；将膀胱脱细胞基质‑种子细胞悬浮液结构放置于离心机中，离心机按照指定转速离心运转指定时间；将离心后的膀胱脱细胞基质放置于培养皿中，利用培养好的膀胱脱细胞基质构建组织工程膀胱。本发明构建了一套离心种植设备，并探寻了较为适宜的离心机转速和离心种植时间。相比于常用的静态种植，以及压力灌注种植、旋转瓶种植等动态种植方式，离心种植所需的细胞量较少，且离心力可以使种子细胞均匀分布于支架内壁，使种植细胞进入到膀胱脱细胞基质的内部，形成三维立体种植，使制备的组织工程膀胱更为贴合实际膀胱组织。
Description
技术领域
本发明涉及组织工程技术领域，尤其涉及一种利用离心种植构建组织工程膀胱的方法。
背景技术
泌尿系统的肿瘤、创伤、炎症和先天畸形等疾病均可使膀胱受损，目前利用肠道修复重建常伴随有一系列的并发症。组织工程技术为解决这一问题提供了新的思路。组织工程的研究内容主要集中于以下三个方面：种子细胞的培养；支架材料的研究；组织工程化的组织对各种病损组织替代研究。
随着研究的进展，组织工程技术的修复、改良和重建已应用于多个组织和器官，例如：皮肤、血管、神经、肠道等。组织工程膀胱的研究，无论是从支架材料的选取，还是种子细胞的筛选培养都有了长足的进步。但在如何能够更好地将支架材料和种子细胞复合，构建组织工程组织或器官上面临着很多的问题。支架材料的几何形状、渗透性、孔隙率、厚度及与种子细胞的接触面积等因素都影响着种子细胞在支架材料上的粘附、增殖和渗透进入支架材料的内部，进而影响组织工程膀胱的构建。膀胱组织工程重建过程中，因膀胱脱细胞基质材料去除了可引起免疫反应的细胞成分，保留了含有生物活性分子的细胞外基质，常被选取作为支架材料。膀胱组织的几何形状为球形，在种子细胞种植过程中会面临许多问题，例如：细胞种植不均匀、细胞仅在表层附着不易进入支架内部、营养供应等。
为了能更好地解决种子细胞和支架材料的复合问题，学者们设计了多种种植方式，大体分为两类，静态种植和动态种植。静态种植即直接将种子细胞种植在支架材料表面，依靠重力作用使细胞迁移到支架材料内部，常需要花费较多的时间和较大的细胞数量，且效率较低。动态种植又可分为压力灌注种植、旋转瓶种植等。压力灌注种植是通过灌注设备提供一定的压力使种子细胞在种植在支架材料过程中更好地渗透进入到内部。但压力灌注设备通常较为复杂，灌注压力选择较为困难。同时，压力作用可能会使种子细胞崩解，支架材料的空间结构被破坏；因而压力灌注种植有其一定的局限性和不足。旋转瓶种植，通过持续转动培养瓶，以达到种植细胞和支架材料各个面接触，达到均匀种植的目的，但通常需要较长的时间和较大的细胞量，此外，旋转培养瓶种植方案不能达到种子细胞快速渗透进入支架材料内部的目的。
发明内容
本发明的实施例提供了一种利用离心种植构建组织工程膀胱的方法，以克服现有技术的缺点。
为了实现上述目的，本发明采取了如下技术方案。
一种利用离心种植构建组织工程膀胱的方法，包括：
利用离心种植设备制备膀胱脱细胞基质-种子细胞悬浮液结构；
将膀胱脱细胞基质-种子细胞悬浮液结构放置于离心机中，离心机按照指定转速离心运转指定时间；
将离心后的膀胱脱细胞基质放置于培养皿中，利用培养好的膀胱脱细胞基质构建组织工程膀胱。
进一步地，所述的利用离心种植设备制备膀胱脱细胞基质-种子细胞悬浮液结构之前还包括：
选取离心种植设备，该离心种植设备包括：预先制备的种子细胞悬液；制备的膀胱脱细胞基质；3-0慕丝线3根；离心机一台；10cm的培养皿。
进一步地，所述的利用离心种植设备制备膀胱脱细胞基质-种子细胞悬浮液结构，包括：
利用2根3-0慕丝线将膀胱脱细胞基质两侧的输尿管断端结扎，用注射器将1×106的种子细胞悬液2ml通过膀胱下端的流出道注射到膀胱脱细胞基质中，用1根3-0慕丝线将膀胱脱细胞基质的流出道结扎，得到制备的膀胱脱细胞基质-种子细胞悬浮液结构。
进一步地，所述的将膀胱脱细胞基质-种子细胞悬浮液结构放置于离心机中，离心机按照指定转速离心运转指定时间，包括：
将所述膀胱脱细胞基质-种子细胞悬浮液结构放置于容积为20ml的离心管中，再将离心管放置于离心机中，配平后，离心机按照转速2400rpm/min离心运转8min，用剪刀将膀胱脱细胞基质两侧的输尿管的结扎线和膀胱脱细胞基质的流出道的结扎线剪断，将膀胱脱细胞基质中的悬浮有种子细胞的培养液丢弃。
进一步地，所述的将离心后的膀胱脱细胞基质放置于培养皿中，利用培养好的膀胱脱细胞基质构建组织工程膀胱，包括：
将离心后的膀胱脱细胞基质放置于10cm的培养皿中后，再将培养皿放置于37℃、含5％CO2的孵箱中培养2h，使种植于膀胱脱细胞基质中的种子细胞黏附，然后，向培养皿中加入20ml培养基，使离心后的膀胱脱细胞基质完全浸没在培养基中，继续培养膀胱脱细胞基质设定时间后，利用培养好的膀胱脱细胞基质构建组织工程膀胱。
由上述本发明的实施例提供的技术方案可以看出，本发明构建了一套离心种植设备，并探寻了较为适宜的离心机转速和离心种植时间。相比于常用的静态种植，以及压力灌注种植、旋转瓶种植等动态种植方式，离心种植所需的细胞量较少，且离心力可以使种子细胞均匀分布于支架内壁，使种植细胞进入到膀胱脱细胞基质的内部，形成三维立体种植，使制备的组织工程膀胱更为贴合实际膀胱组织。
本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，这些将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的一种利用离心种植构建组织工程膀胱的方法的实现原理示意图；
图2为本发明实施例提供的一种利用离心种植构建组织工程膀胱的方法的具体处理流程图：
图3为本发明实施例选取的离心种植设备示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施方式，所述实施方式的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施方式是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。
本技术领域技术人员可以理解，除非特意声明，这里使用的单数形式“一”、“一个”、“所述”和“该”也可包括复数形式。应该进一步理解的是，本发明的说明书中使用的措辞“包括”是指存在所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件、组件和/或它们的组。应该理解，当我们称元件被“连接”或“耦接”到另一元件时，它可以直接连接或耦接到其他元件，或者也可以存在中间元件。此外，这里使用的“连接”或“耦接”可以包括无线连接或耦接。这里使用的措辞“和/或”包括一个或更多个相关联的列出项的任一单元和全部组合。
本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。
为便于对本发明实施例的理解，下面将结合附图以几个具体实施例为例做进一步的解释说明，且各个实施例并不构成对本发明实施例的限定。
离心种植则是利用离心机的离心力使种植细胞均匀种植于支架材料表面，同时离心力也可促进种子细胞更好地渗透进入支架材料的内部。不同于压力灌注种植，离心种植所需设备常较为简单且易获取。在相同条件下，离心种植支架材料的细胞量约为旋转瓶培养种植的三倍。综合考虑上述因素，在膀胱组织工程重建中本发明构建了种子细胞离心种植设备，完善了系统各部分实验材料和设备的选取，通过多次实验尝试，探寻到较为合理的离心机转速和离心种植时间，以及支架材料-种子细胞复合物的培养方式，进而构建较为适用的组织工程膀胱，进一步推动组织工程膀胱的研究进展。
本发明实施例提供了一种利用离心种植构建组织工程膀胱的方法，该方法利用离心力促使种子细胞进入到支架材料内部，使种子细胞均匀分布于支架材料中，进而构建组织工程支架。在构建组织工程膀胱过程中，利用自制的脱细胞体系制备了完整的膀胱脱细胞基质支架，完全去除了膀胱组织中的细胞成分，并很好地保留了膀胱组织自身的三维结构。在此基础上进行细胞种植，因制备的膀胱脱细胞基质仍保留膀胱组织本身的三维结构，常规的静态种植，旋转瓶种植，和压力种植较不适于该支架材料的细胞种植。
本发明实施例提供的一种利用离心种植构建组织工程膀胱的方法的实现原理示意图如图1所示，具体处理流程如图2所示，包括如下的处理步骤：
步骤S210、利用慕丝线等离心种植设备，制备膀胱脱细胞基质-种子细胞悬浮液结构。
本发明实施例选取的离心种植设备如图3所示，包括：预先制备的种子细胞悬液；制备的膀胱脱细胞基质；3-0(线直径“22mm”，线长“45cm”)慕丝线3根；离心机一台，10cm的培养皿。首先，利用2根3-0慕丝线将膀胱脱细胞基质两侧的输尿管断端结扎，用注射器将1×106的种子细胞悬液2ml通过膀胱下端的流出道注射到膀胱脱细胞基质中，上述1×106指的是细胞量，即2ml种子细胞悬液中含有1×106个细胞。
用1根3-0慕丝线将膀胱脱细胞基质的流出道结扎，得到制备的膀胱脱细胞基质-种子细胞悬浮液结构。
步骤S220、将膀胱脱细胞基质-种子细胞悬浮液结构放置于离心机中，离心机按照指定转速离心运转指定时间。
将上述膀胱脱细胞基质-种子细胞悬浮液结构放置于容积为20ml的离心管中，将离心管放置于离心机中。对离心机进行配平处理后，离心机按照转速2400rpm/min离心运转8min。配平即相对位置的重量相等，防止在离心过程中重量失衡。然后，用剪刀将三个部位(膀胱脱细胞基质两侧的输尿管、膀胱脱细胞基质的流出道)的结扎线剪断，将膀胱脱细胞基质中的悬浮有种子细胞的培养液丢弃。
上述离心机提供的离心力将种子细胞种植在膀胱脱细胞基质内部，2400rpm/min的转速，在确保能够提供足够的离心力基础上更好地保护细胞不被离心力破坏而导致自身崩解。通过多次试验验证，8min的离心时间，能够确保种子细胞进入到膀胱脱细胞基质的内部。
本领域技术人员应能理解上述2400rpm/min的转速，8min的离心时间的孵箱的应用类型仅为举例，其他现有的或今后可能出现的离心机和离心时间的应用类型如可适用于本发明实施例，也应包含在本发明保护范围以内，并在此以引用方式包含于此。步骤S230、将离心后的膀胱脱细胞基质放置于培养皿中，利用培养好的膀胱脱细胞基质构建组织工程膀胱。
将离心后的膀胱脱细胞基质放置于直径为10cm的培养皿中后，再将培养皿放置于37℃、含5％CO2的孵箱中培养2h，使种植于膀胱脱细胞基质中的种子细胞充分黏附。然后，向培养皿中加入20ml培养基，使离心后的膀胱脱细胞基质完全浸没在培养基中，继续培养膀胱脱细胞基质设定时间后，利用培养好的膀胱脱细胞基质构建组织工程膀胱。
综上所述，本发明构建了一套离心种植设备，并探寻了较为适宜的离心机转速和离心种植时间。进而构建组织工程膀胱，用于膀胱组织的部分和完全替代。
本发明实施例的方法相比于常用的静态种植，以及压力灌注种植、旋转瓶种植等动态种植方式，离心种植所需的细胞量较少，且离心力可以使种子细胞均匀分布于支架内壁，且可提供一定的穿透力，使种植细胞进入到膀胱脱细胞基质的内部，进而形成三维立体种植，使制备的组织工程膀胱更为贴合实际膀胱组织。该系统制备膀胱脱细胞基质，花费时间较短，需要的细胞数量较少，且能使种子细胞均匀种植在膀胱脱细胞基质的内部。使制备的组织工程膀胱更实用于膀胱组织的修复重建。
本领域普通技术人员可以理解：附图只是一个实施例的示意图，附图中的模块或流程并不一定是实施本发明所必须的。
本说明书中的各个实施例均采用递进的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于装置或系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述得比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。以上所描述的装置及系统实施例仅仅是示意性的，其中所述作为分离部件说明的单元可以是或者也可以不是物理上分开的，作为单元显示的部件可以是或者也可以不是物理单元，即可以位于一个地方，或者也可以分布到多个网络单元上。可以根据实际的需要选择其中的部分或者全部模块来实现本实施例方案的目的。本领域普通技术人员在不付出创造性劳动的情况下，即可以理解并实施。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
Claims (1)
1.一种利用离心种植构建组织工程膀胱的方法，其特征在于，包括：
利用离心种植设备制备膀胱脱细胞基质-种子细胞悬浮液结构；
将膀胱脱细胞基质-种子细胞悬浮液结构放置于离心机中，离心机按照指定转速离心运转指定时间；
将离心后的膀胱脱细胞基质放置于培养皿中，利用培养好的膀胱脱细胞基质构建组织工程膀胱；
利用离心种植设备制备膀胱脱细胞基质-种子细胞悬浮液结构之前还包括：
选取离心种植设备，该离心种植设备包括：预先制备的种子细胞悬液；制备的膀胱脱细胞基质；3-0慕丝线3根；离心机一台；10cm的培养皿；
利用离心种植设备制备膀胱脱细胞基质-种子细胞悬浮液结构，包括：
利用2根3-0慕丝线将膀胱脱细胞基质两侧的输尿管断端结扎，用注射器将1×106的种子细胞悬液2mL通过膀胱下端的流出道注射到膀胱脱细胞基质中，用1根3-0慕丝线将膀胱脱细胞基质的流出道结扎，得到制备的膀胱脱细胞基质-种子细胞悬浮液结构；
将膀胱脱细胞基质-种子细胞悬浮液结构放置于离心机中，离心机按照指定转速离心运转指定时间，包括：
将膀胱脱细胞基质-种子细胞悬浮液结构放置于容积为20mL的离心管中，再将离心管放置于离心机中，配平后，离心机按照转速2400rpm/min离心运转8min，用剪刀将膀胱脱细胞基质两侧的输尿管的结扎线和膀胱脱细胞基质的流出道的结扎线剪断，将膀胱脱细胞基质中的悬浮有种子细胞的培养液丢弃；
将离心后的膀胱脱细胞基质放置于培养皿中，利用培养好的膀胱脱细胞基质构建组织工程膀胱，包括：
将离心后的膀胱脱细胞基质放置于10cm的培养皿中后，再将培养皿放置于37℃、含5％CO2的孵箱中培养2h，使种植于膀胱脱细胞基质中的种子细胞黏附，然后，向培养皿中加入20mL培养基，使离心后的膀胱脱细胞基质完全浸没在培养基中，继续培养膀胱脱细胞基质设定时间后，利用培养好的膀胱脱细胞基质构建组织工程膀胱。
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