CN103031299B - 一种基于定向点突变的革兰阴性菌无疤痕基因敲除方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于定向点突变的革兰阴性菌无疤痕基因敲除方法，第一次PCR设计引物时，以质粒pKD267为模板，选目的基因上下游各500bp处的序列50nt加pKD267上的序列20nt用以扩增质粒上的抗性基因(kan)和细胞死亡控制基因(ccdB)；第二次PCR设计引物时，分别在目的基因上下游各500bp和目的基因开放阅读框内设计引物，同时在目的基因的开放阅读框引入点突变，使其起始密码和其互补链相应位置突变为AAA；两次PCR产物混合后进行第三次PCR，获得的长片段，再利用同源重组技术，将PCR产物直接转化第一次的阳性克隆菌，以鼠李糖培养基筛选阳性克隆。

Description

一种基于定向点突变的革兰阴性菌无疤痕基因敲除方法

技术领域

本发明涉及革兰阴性菌基因敲除技术，尤其涉及的是一种基于定向点突变的革兰阴性菌无疤痕基因敲除方法。

背景技术

革兰阴性菌是人和动物常见的病原细菌，肠杆菌科的大肠杆菌和沙门菌可引起人和动物不同的疾病，如腹泻、出血性肠炎等。而研究这些病原菌的毒力基因及其功能可为这些疾病的免疫防制奠定理论基础。

基因敲除技术是研究基因功能的一种常用方法。常规的基因敲除技术是基于同源重组的双交换或者单交换，将靶基因用特定的标记基因(如抗性基因)替换，以达到完全去除靶基因的目的。但由于基因在染色体上是以双链的形式存在，当同源重组交换目的基因时，将目的基因的正反向链同时交换去除，因此获得的突变体实际上是两条单链的同时缺失，而突变体所表现出的表型也是正反两条单链上的基因共同缺失所表现出来的。所以，常规的同源重组基因敲除技术还需做回复突变以验证目的基因的功能。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种基于定向点突变的革兰阴性菌无疤痕基因敲除方法。

本发明的技术方案如下：

一种基于定向点突变的革兰阴性菌无疤痕基因敲除方法，以质粒pKD267为模板，选目的基因上下游各500 bp处的序列50 nt加pKD267上的序列20 nt用以扩增质粒上的抗性基因(kan)和细胞死亡控制基因(ccdB)，采用电转法将PCR产物转化入目的菌，该目的菌已经被提前转入pKD46，并在30℃条件下，以阿拉伯糖诱导让其大量表达Red重组酶，以卡那抗性筛选阳性克隆。

分别在目的基因上下游各500bp和目的基因开放阅读框内设计引物，同时在目的基因的开放阅读框引入点突变，使其起始密码和其互补链相应位置突变为AAA。进行两次PCR，引物5a-RECO-RED和luxS-RECO-RED扩增luxS上游500bp和luxS基因，在起始密码ATG的互补链上引入点突变AAA。引物3a-RECO-RED和luxS-5a-RED扩增luxS下游500bp和luxS基因，在编码链起始密码ATG处引入点突变AAA。

两次PCR产物混合后进行第三次PCR，获得的长片段，再利用同源重组技术，将PCR产物直接转化第一次的阳性克隆菌(此时的目的菌已经被提前转入pKD46，并在30℃条件下，以阿拉伯糖诱导让其大量表达Red重组酶)，以鼠李糖培养基筛选阳性克隆；第三次PCR采用引物对：5a-RECO-RED：5’-CCCAAAGTCGGGAAAGATC-3’、3a-RECO-RED：5’-CGAATTTGCGCCTCGGCATC-3’。

由于细胞死亡因子启动子是鼠李糖诱导的，因此重组成功的克隆不含ccdB基因，可以在限制性培养基上生长，从而获得只有一条正向单链发生点突变的突变体，而其互补链上的基因序列除了引入的点突变外，未发生任何改变。

附图说明

图1为本发明基于无疤痕突变的定向突变技术策略；

图2为第一次插入突变菌落PCR鉴定结果；M：DNA Marker；泳道1-17：待检菌落；泳道18：SL1344野生株；

图3为回复突变菌落PCR鉴定结果；M：DNA Marker；泳道1-10：待检菌落；泳道11：阳性对照；泳道12：阴性对照；

图4为AI-2实验结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

一、材料与方法

1.菌株与培养条件

所有的质粒保存在TOP10E.coli中，S.typhimurium SL1344作为突变的对象。带有pKD46的细菌培养在30℃，质粒去除及其它细菌培养在37℃。LB培养基用于常规的细菌培养，SOC培养基用于电转后的恢复培养基。抗生素浓度为：氨苄青霉素100μg/ml，卡那青霉素的浓度为50μg/ml。

2.质粒

质粒pKD46和pKD267(pKD267公开文献：Shoji M，Ratnayake D，Shi Y，KadowakiT，Yamamoto K，Yoshimura F，Akifumi A，Curtis M，and Nakayama K.Construction andcharacterization of a nonpigmented mutant of Porphyromonas gingivalis：cell surfacepolysaccharide as an anchorage for gingipains.Microbiology，2002，148：1183-1191.)用于本研究。质粒pKD46编码λ-Red重组酶系统，它可介导线性DNA分子与染色体DNA的同源重组，同时包含一个氨苄抗性基因，为温度敏感型质粒，需要细胞维持在30℃。质粒pKD267用作模板扩增卡那霉素抗性基因盒和ccdB基因，后者用于后续的筛选。

3.PCR反应

本发明中所有用于PCR反应的引物列于表1。50μL PCR体系中包含0.1μgDNA模板(可以采用纯化的基因组DNA、质粒DNA或PCR产物作模板)，1×PhusionDNA聚合酶缓冲液，5U Phusion DNA聚合酶(Finnzymes)，1mM dNTPs(Sigma)，2μM引物。所用PCR仪为Bio-Rad热循环仪。

以pKD267为模板的扩增，条件为：5个循环，每个循环94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸2.5min；25个循环，每个循环94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸2.5min；最后72℃延伸5min。

其它PCR程序条件为：98℃预变性30s；35个循环，每个循环98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸1min/1kb；最后72℃延伸10min。获得的PCR产物纯化后用50μl EB缓冲液洗脱后用于overlapping extension PCR，纯化后用于S.typhimuriumSL1344的电转。

表1.引物序列

5a-RECO-RED、luxS-RECO-RED这两条引物配对，以SL1344基因组DNA为模板，扩增luxS上游500bp和luxS基因。第二条引物有个下划线加粗的AAA序列，是luxS基因起始密码ATG互补的位置，即原先此处为CAT，现在人为引入点突变AAA，即扩增的片段没有起始密码ATG的互补序列CAT，只有AAA。互补链上同。

3a-RECO-RED、luxS-5a-RED这两条引物配对，以SL1344基因组DNA为模板，扩增luxS下游500bp和luxS基因。第二条引物有个下划线加粗的AAA序列，是luxS基因起始密码ATG的位置，即原先此处为ATG，现在人为引入点突变AAA，即扩增的片段没有起始密码ATG，只有AAA。互补链上同。

luxS-F-267、luxS-R-267这一对引物是以pKD267为模板，扩增卡那霉素抗性盒和ccdB基因。两条引物的下划线加粗表示是在pKD267上的序列，在所扩增片段的上下游，可以包含要扩增的卡那霉素抗性盒和ccdB基因。luxS-F-267斜体序列表示是在luxS基因起始密码ATG上游的49个碱基，luxS-R-267斜体序列表示包含luxS基因终止密码TAG及其上游的51个碱基。

4.电转

质粒pKD46转化S.typhimurium SL1344是第一步需要做的，以便于λ-Red重组酶系统在后续的突变中发挥重组作用。质粒pKD46从TOP10E.coli中提取，采用试剂盒Invitrogen，然后将1μl纯化的pKD46DNA转化S.typhimurium SL1344感受态细胞。S.typhimurium SL1344感受态细胞制备为常规方法，略作修改，即将细菌接种于5mL LB培养基中，37℃过夜振荡培养，然后将10μl过夜培养物重新接种于10mL新鲜LB培养基，37℃振荡培养3-4h，收获细胞，用冰预冷无菌dd H₂O洗涤4次，重悬浮于90μl冰预冷无菌dd H₂O中，细胞以2500kV电压脉冲1-6ms，在SOC培养基中30℃孵育1h后涂布含有适宜抗生素的LB平板。含有pKD46的转化子用于后续电转时，感受态细胞洗涤前1h，培养基中加入10mM的阿拉伯糖诱导λ-Red重组酶系统表达，其余制备方法如前所述。

5.重组子鉴定

根据重组片段不同，在luxS基因上下游分别设计引物5a-RECO-RED和3a-RECO-RED进行菌落PCR鉴定重组子。重组子菌落PCR延伸时间为3min，其余条件同上述PCR反应所列条件。

6.AI-2检测试验

参考(Surette and Bassler 1999；Surette，Miller et al.1999)的方法。检测菌株接种于2ml LB，37℃，200rpm过夜培养，第二天以1∶1000的比例接种于5ml新鲜的LB中，当OD₆₀₀达到1.0时，离心收集上清，并用0.22μm灭菌微孔滤膜过滤，除去菌体，-20℃保藏备用。哈氏弧菌BB170(Vibrio harveyi BB170，biosensor 1-，biosensor 2+)30℃过夜摇培于2ml含50μg/ml卡那霉素的LB中，在灭菌96孔板中加入180μl的发光检测培养液、2μl培养好的BB170和检测菌的上清，同时用灭菌LB作对阴性对照。检测仪器为TECAN Infinite 200PRO NanoQuant，检测参数设置为在30℃下每30min检测一次，持续至10h。

二、结果

1.突变策略

本发明的目的是获得一种利用无疤痕技术和定点突变技术对细菌基因组进行改造的策略。发明人使用的是鼠伤寒沙门菌SL1344作为模式菌株，利用覆盖延伸PCR技术(overlapping extension PCR)和Red重组酶系统。整体的策略用图1所示。

第一次PCR设计引物时，以质粒pKD267为模板，选目的基因上下游各500bp处的序列50nt加pKD267上的序列20nt用以扩增质粒上的抗性基因(kan)和细胞死亡控制基因(ccdB)，采用电转法将PCR产物转化入目的菌，该目的菌已经被提前转入pKD46，并在30℃条件下，以阿拉伯糖诱导让其大量表达Red重组酶，以卡那抗性筛选阳性克隆。

第二次PCR设计引物时，分别在目的基因上下游各500bp和目的基因开放阅读框内设计引物，同时在目的基因的开放阅读框引入点突变，使其起始密码和其互补链相应位置突变为AAA。进行两次PCR，引物5a-RECO-RED和luxS-RECO-RED扩增luxS上游500bp和luxS基因，在起始密码ATG的互补链上引入点突变AAA。引物3a-RECO-RED和luxS-5a-RED扩增luxS下游500bp和luxS基因，在编码链起始密码ATG处引入点突变AAA。两次PCR产物混合后进行第三次PCR，获得的长片段，再利用同源重组技术，将PCR产物直接转化第一次的阳性克隆菌(此时的目的菌已经被提前转入pKD46，并在30℃条件下，以阿拉伯糖诱导让其大量表达Red重组酶)，以鼠李糖培养基筛选阳性克隆；

第三次PCR采用引物对：5a-RECO-RED：5’-CCCAAAGTCGGGAAAGATC-3’、3a-RECO-RED：5’-CGAATTTGCGCCTCGGCATC-3’。

由于细胞死亡因子启动子是鼠李糖诱导的，因此重组成功的克隆不含ccdB基因，可以在限制性培养基上生长，从而获得只有一条正向单链发生点突变的突变体，而其互补链上的基因序列除了引入的点突变外，未发生任何改变。覆盖延伸PCR用于获得以AAA替换luxS开放阅读框(ORF)中的起始密码ATG的线性DNA序列和目的基因的侧翼同源序列。Red重组酶系统用于介导线性DNA的同源重组。在两步法的突变中，卡那霉素和ccdB基因(细胞死亡控制基因)通过同源重组首先代替luxS正常序列；接着，在第二步的同源重组中，期望的序列，即以AAA代替luxS开放阅读框中起始密码ATG的序列代替第一步插入的序列。为了筛选成功代替的突变体，用含有鼠李糖的M9限制性培养基检测卡那霉素和ccdB基因是否被期望序列代替。

2.Kam^r/ccdB序列的插入突变结果

第一步的突变涉及设计的PCR片段，即含有Kam^r/ccdB的片段插入luxS位点。该PCR片段含有Kam^r/ccdB和近50nt的luxS上下游侧翼区域。该步的突变体直接用含有卡那霉素的抗性板进行筛选，同时用引物5a-RECO-RED和3a-RECO-RED进行菌落PCR鉴定阳性克隆。鉴定结果如图2所示，插入突变成功的菌株，其PCR扩增片段介于2.5-3.0kb之间(图中泳道1-17)，而未插入菌株，PCR扩增片段介于1.0-1.5kb之间(图中泳道18)。所检测的17个克隆全部为阳性克隆，说明此重组方法重组效率很高，假阳性率低。

3.回复突变结果

第二步突变要求构建一个PCR片段，该片段命名为luxS-RECO-RED，含有一个最终被插入的序列，即由AAA代替luxS编码序列中的起始密码ATG。这一步突变的筛选在含有鼠李糖的M9限制性培养基上进行，然后用引物5a-RECO-RED和3a-RECO-RED进行菌落PCR鉴定阳性克隆，鉴定结果如图3所示，回复突变成功的菌株，其PCR扩增片段介于1.0-1.5kb之间(图中泳道1-3，5，7-9)，而回复突变未成功者，PCR扩增片段介于2.5-3.0kb之间(图中泳道12)。菌落PCR鉴定为阳性的克隆进行luxS序列测序验证，看引入的点突变是否正确，测序结果表明luxS的ORF已经被破坏，起始密码ATG被AAA代替，无法启动基因表达(测序结果见SEQ ID NO：1)。

同时进行AI-2实验验证luxS基因是否失活。实验结果表明由AAA代替luxS编码序列中的起始密码ATG的突变株luxS scarless luxS基因失活，失去了产生AI-2的功能，即无法使指示菌株哈氏弧菌BB170发光，与常规敲除突变株luxS KO表型完全一致，结果见图4。

测序结果：

AATTTAATGGAATTTTTAGTTTATGTGATCAATACACTCTGGCATCGTGAGTTATCCGCCTTTTCTGTTTACCAGATCACATTTTATTATTTAACAGGCCAGGCATTACTTAATTTAAAATGTATTCTCGCCGCAAATATAATAAACGCAAATTATATTAAGCAATAAAAAACCCCGGCCATAAACCGGGGTTAATTTAAATACTAGGAACCGCTTACAAATAAGACTAAATATGCAGTTCCTGCAGTTTTTCTTTCGGCAGCGCCAGCTCTTTATTGCTGTTCACGCGCACATCACGCTCCAGAATATGACGGGCAATGTCCTGCGCTTCACTGAGCGAGTGCATCTGATACGTACCGCACTGGTAAACGTTCAGCTCCGGGATCTGGTTTTGATCCTGCACTTTCAGCACATCCGCCATCGCCGCTTTCCAGGCGTCGGCAACACGCTGCTCGTCCGGCGTGCCAATCAGGCTCATGTAAAAGCCGGTGCGGCAGCCCATCGGCGAGATATCGATAATCTCAACGCCGTTACCGTTGAGGTGGTCGCGCATAAAGCCAGCAAACAGATGCTCAAGCGTATGAATCCCTTTTTCCGGCATCACTTCTTTGTTCGGAATGCAAAAACGCAGATCAAACACGGTGATTGCGTCGCCATGCGGGGTGTTCATCGTTTTTGCAACCCGGACCGCCGGCGCTTGCATCCGGGTATGATCGACTGCGAAGCTATCTAATAATGGTTTTTAGTCACCTCCGATAATTTTTTAAAAATAAACTGAACTCTTTGTTCCGGGGCGAGTCTGAGTATATGAAAGACGCGCATTTGTTATCATCATCCCTGTTTTCAGCGATGAAATTTGGCATCGGGGGGGGTTGTTTTTTATATATTAAAAGGAGGGGGGGGGGTTGATAAAAGGGGCGGCGCTTCTTTAATAAACACAGACCCGCCGGGAAAAAAGGAGTTCAGTTTATTTTTAAAAAATTAGGCGGAGGGTGACTAAAAACCATTATTAGATAGCTTCCGAGGTCGATCATACCGAGATGCAGCGCGGGCGGCTCGGGTTGAAAAAACGATGAACACACGGCATGCGACGCAATCACGATGTTTGATCTGCGTTTTGCATCGAGACAAAGAAGTGATGCGGGAAAAAAGGGATTATCGCTTGAG

CTA：与luxS终止密码TAG互补；

TTT：与代替起始密码ATG的AAA互补；

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (1)

1.一种基于定向点突变的革兰阴性菌无疤痕基因敲除方法，其特征在于，包括以下步骤：

A1，以质粒pKD267为模板，选目的基因上下游各500bp处的序列50nt加pKD267上的序列20nt用以扩增质粒上的抗性基因(kan)和细胞死亡控制基因(ccdB)，采用电转法将PCR产物转化入目的菌，该目的菌已经被提前转入pKD46，并在30℃条件下，以阿拉伯糖诱导让其大量表达Red重组酶，以卡那抗性筛选阳性克隆；

A2，分别在目的基因上下游各500bp和目的基因开放阅读框内设计引物，同时在目的基因的开放阅读框引入点突变，使其起始密码和其互补链相应位置突变为AAA；进行两次PCR，引物5a-RECO-RED和luxS-RECO-RED扩增luxS上游500bp和luxS基因，在起始密码ATG的互补链上引入点突变AAA；引物3a-RECO-RED和luxS-5a-RED扩增luxS下游500bp和luxS基因，在编码链起始密码ATG处引入点突变AAA；

A3，步骤A2中的两次PCR产物混合后进行第三次PCR，获得的长片段，再利用同源重组技术，将PCR产物直接转化第一次的阳性克隆菌，以鼠李糖培养基筛选阳性克隆；第三次PCR采用引物对：5a-RECO-RED：5’-CCCAAAGTCGGGAAAGATC-3’、3a-RECO-RED：5’-CGAATTTGCGCCTCGGCATC-3’。