CN109337849B - 一株ExPEC yafON基因缺失株的构建及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株ExPEC yafON基因缺失株的构建及应用，属于基因工程技术领域。本发明利用DNA同源重组技术构建了一株yafON基因缺失的肠外致病性大肠杆菌（Escherichia coli）ExPEC PPECC42‑ΔyafON，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018688。该菌株被应用于细菌生物被膜形成能力评价及控制ExPEC细菌生物被膜的形成新药物靶标的研究中。

Description

一株ExPEC yafON基因缺失株的构建及应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株ExPECyafON基因缺失株的构建及应用。
背景技术
肠外致病性大肠埃希菌（Extraintestinal Pathogenic E. coli, ExPEC）是一种重要的病原菌，近年来其对畜牧业（猪、禽、牛羊）和人类健康的危害日益受到关注，多重耐药性和生物被膜的形成更增加了其防控的难度和对公共卫生的威胁。ExPEC可以引起人、宠物以及食用动物的肠外感染，比如新生儿脑膜炎、败血症、肺炎和乳房炎。此外ExPEC也是一种重要的食源菌，可通过污染的饮水、食品引起食源性疾病暴发流行；ExPEC菌株目前在不同的国家广泛的从零售鸡肉、牛肉、猪肉、餐馆、即食食品（包括肉类，水果和蔬菜）中分离得到，因此推测肉制品可能是人ExPEC感染的重要来源。
细菌生物被膜（Bacterial Biofilm）是细菌粘附聚集到有生命或无生命固体表面的一种群体性行为，是细菌为了适应环境而长期存活采取的一种策略。生物被膜的形成具有广泛的危害性，一旦形成生物被膜，菌体被大量的胞外基质包裹，形成一个物理屏障，可增强细菌对抗生素、消毒剂、胆盐等化合物的抗性；在生物体内可以抵抗巨噬细胞等吞噬细胞的吞噬作用，逃避宿主的免疫清除；在机体组织表面形成，可以导致慢性感染和持续性感染；在食品加工设备等形成的生物被膜可以导致食源性微生物的传播、食品保存期限缩短。细菌生物被膜的存在将严重威胁畜禽和人类的健康，在食品生产过程中存在的生物被膜，将成为影响公共卫生安全的重要隐患。因此，控制细菌生物被膜的形成在兽医、医学、食品等领域均具有极为重要的意义。
毒素-抗毒素系统（toxin-antitoxin, T-A）广泛存在于细菌基因组中，在细菌的生理活动中发挥着重要作用：维持基因组的稳定性、促进抗生素压力下持留细胞的形成、增强噬菌体感染的耐受性、调控细菌细胞程序性死亡、在细菌致病中发挥作用。因此T-A系统成为了多重耐药病原菌致病机理和防控技术研究的新靶标，引起了国内外研究者的高度关注。
本发明构建毒素-抗毒素yafON基因缺失菌株来评价YafON系统在ExPEC生物被膜形成中的作用，作为新的药物靶标来控制ExPEC细菌生物被膜的形成。
发明内容
本发明的目的之一在于构建一株ExPECyafON基因缺失株ExPEC PPECC42-Δ yafON，该菌株的分类命名为肠外致病性大肠杆菌（Escherichia coli）ExPEC PPECC42-Δ yafON，于2018年10月17日，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2018688，保藏地址为：武汉大学。
本发明的另一目的在于提供一株ExPEC yafON基因缺失株ExPEC PPECC42-Δ yafON的构建方法。
本发明的再一目的在于提供一株ExPECyafON基因缺失株ExPEC PPECC42-ΔyafON在评价YafON系统在ExPEC生物被膜形成作用中的应用，及提供控制ExPEC细菌生物被膜的形成新的药物靶标中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
利用DNA同源重组技术进行肠外致病性大肠杆菌（ExPEC）yafON基因缺失株的构建和生物被膜形成能力的测定。
yafON基因缺失株的构建，包括如下具体步骤：
1、基因的克隆与同源重组质粒的构建
（1）基因组DNA的提取：采用热煮沸法提取亲本菌株ExPEC PPECC42的基因组DNA：挑单菌落到已加入50μL双蒸水的EP管中，沸水浴煮沸5min，10000rpm离心3min，吸取上清到新的EP管中则为基因组DNA，-20℃保存备用。
（2）引物的设计
利用引物设计软件Primer5.0，设计yafON基因的上下游片段的引物，及缺失鉴定引物，其引物序列见表1：
表1. yafON基因缺失株构建所用引物序列和PCR产物大小
Figure DEST_PATH_IMAGE001
3）同源重组质粒的构建
1）yafON基因上下游片段扩增
根据重叠PCR（overlapping-PCR）的原理和方法，使用P1/P2（SEQ ID NO:1/SEQ IDNO:2），P3/P4（SEQ ID NO:3/SEQ ID NO:4）两对引物分别对yafON基因的上游片段和下游片段进行扩增，P1/P2扩增yafON基因上游片段大小为665 bp，P3/P4扩增的yafON基因下游片段为690 bp。
扩增体系如表2所示：
表2 yafON基因上下游片段扩增体系
Figure DEST_PATH_IMAGE002
PCR反应条件： [98℃ 10s → 56℃ 5s → 72℃1min] ×30cycles →4℃。
2）重叠PCR
将上下游片段的扩增产物分别切胶回收，将回收的产物做为模板，利用重叠PCR对yafON基因上下游手段进行重叠PCR。以引物P1/P4（SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:4）为模板进行扩增，其扩增的yafON基因同源重组所需基因缺失片段ΔyafON的大小为1330 bp，扩增体系如表3所示。
表3 重叠PCR扩增体系
Figure DEST_PATH_IMAGE003
先扩增5个循环，然后再加入引物P1/P4各1μL进行PCR扩增；
PCR反应条件： [98℃ 10s → 56℃ 5s → 72℃1min40sec] ×（5+28）cycles →4℃。
3）酶切与酶切产物的连接
将上述重叠PCR获得的ΔyafON基因片段产物进行切胶回收，将回收产物和自杀性载体pRE112各自进行Xba I和 Sac I双酶切，37℃酶切3h。酶切产物进行切胶回收，将回收的目的片段和载体片段以T4 DNA 连接酶16℃过夜连接。
酶切反应体系如表4所示：
表4 酶切反应体系
Figure DEST_PATH_IMAGE004
酶切产物连接反应体系如表5所示：
表5 酶切产物连接反应体系
Figure DEST_PATH_IMAGE005
4）连接产物转化感受态细胞
10μL过夜连接产物加入到100μL感受态细胞χ7213中，轻轻混匀，冰浴30min，取出后立即42℃水浴热激90sec，立即冰浴90sec，再加入600μL含终浓度为10μg/mlDAP的 LB液体培养基，放入37℃摇床中振荡培养45min-60min，转速≤200rpm，进行菌液的复苏。取200μL复苏的菌液涂布于含终浓度25μg/ml氯霉素和10μg/mlDAP的L-A平板上，37℃培养24h可出现单菌落。挑取单菌落培养，提取质粒，酶切鉴定，将酶切鉴定正确的质粒送测序；测序正确，获得同源重组质粒pRE112-ΔyafON。
2、接合转移与yafON基因缺失菌株的筛选和鉴定
以转化了同源重组质粒pRE112-ΔyafON的χ7213菌株为供体菌，以亲本菌株ExPECPPECC42为受体菌进行接合转移。转化了同源重组质粒pRE112-ΔyafON的χ7213菌供体菌和亲本菌株ExPEC PPECC42各自进行37℃，200rpm过夜振荡培养，用新鲜的LB液体培养基调整OD600值为0.7~0.9，各取100μL混合；将灭菌的硝酸纤维滤膜贴于含终浓度为10μg/mlDAP的L-A平板上，将200μL混合菌液均匀滴于滤膜上，共培养8~10h后，用LB液体培养基将滤膜上的菌洗涤两次，洗涤液6000rpm离心5min，将洗涤沉淀菌用200μL新鲜LB液体培养基重悬，均匀涂布于含终浓度12.5μg/ml氯霉素的L-A平板上，37℃培养12~14h，挑取单菌落于含终浓度25μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，37℃，200 rpm振荡培养8h，划线接种于含氯霉素终浓度为12.5μg/ml和蔗糖终浓度50mg/ml的L-A平板上，筛选氯霉素抗性，蔗糖敏感的接合子。
将上述筛选到的氯霉素抗性，蔗糖敏感的接合子接种在无NaCl，无抗性的LB液体培养基中，37℃，200 rpm振荡培养17~18h后10倍，100倍，1000倍稀释，将各个稀释梯度的菌液分别取100μL涂布含蔗糖终浓度50mg/ml且无抗性无NaCl 的L-A平板上，37℃培养12-14h，挑取单菌落接种含氯霉素终浓度为12.5μg/ml和蔗糖终浓度50mg/ml的L-A平板，筛选氯霉素敏感，蔗糖抗性的菌落，使用引物P5/P6（SEQ ID NO:5/SEQ ID NO:6）进行PCR鉴定，产物送测序。测序正确，获得一株ExPEC ΔyafON基因缺失株，即ExPEC PPECC42-ΔyafON菌株。
PCR鉴定反应体系如表6：
表6 PCR鉴定反应体系
Figure DEST_PATH_IMAGE006
PCR反应条件： [98℃ 10s → 56℃ 5s → 72℃1min40sec] ×30cycles→ 4℃。
3、ExPEC野生菌株和yafON基因缺失菌株的生物被膜形成能力测定
根据参考文献（Stepanovic et al 2000）中的方法并修改进行，将亲本菌株ExPECPPECC42和yafON基因缺失菌株，即ExPEC PPECC42-ΔyafON菌株，分别接种于LB培养基，37℃，200rpm振荡培养过夜，将过夜培养物分别用新鲜M9培养基进行1:100稀释，稀释好的菌液分别加入96孔细胞培养板中，每孔100μL，每株细菌分别设8个重复。以无菌培养基作空白对照，28℃静置培养5 天，将培养物轻轻吸出，用灭菌蒸馏水洗涤微孔三次，晾干，96孔板中，每孔加125μL的1wt%的结晶紫染色15min，用流水轻轻冲掉染液，轻甩晾干，再每孔加入33vol%的乙酸150μL，振荡溶解10min，置于酶标仪下测定OD630值，运用统计学分析所得数据。
本发明的优点在于：本发明的一株ExPEC yafON基因缺失株，即ExPEC PPECC42-Δ yafON菌株，是亲本菌株ExPEC PPECC42中的yafON基因缺失的菌株，该菌株被应用于细菌生物被膜形成能力评价及控制ExPEC细菌生物被膜形成新药物靶标的研究中，对细菌毒素-抗毒素系统的研究及细菌致病机理和防控技术的研究具有重要意义。
附图说明
图1 yafON基因上下游片段扩增PCR产物电泳结果。泳道M：DNA Marker；泳道1：引物P1/P2扩增的yafON基因上游片段，665bp；泳道2：引物P3/P4扩增的yafON基因下游片段，690bp。
图2 yafON基因上下游片段重叠PCR产物电泳结果。泳道M：DNA Marker；泳道1：引物P1/P4扩增的yafON缺失重叠PCR产物片段，1330bp。
图3鉴定引物P5/P6扩增缺失菌株ExPEC PPECC42-ΔyafON以及亲本菌株ExPECPPECC42的yafON基因产物电泳结果。泳道M：DNA Marker；泳道1：以ExPEC PPECC42-ΔyafON菌株基因组为模板，扩增所得目的条带为277bp；2：以亲本菌株ExPEC PPECC42基因组为模板，扩增所得目的条带为817bp。
图4 在M9培养基中，结晶紫染色法测定ExPEC PPECC42-ΔyafON与亲本菌株EXPECPPECC42的生物被膜形成情况。ΔYafON：ExPEC PPECC42-ΔyafON；WT：亲本菌株EXPECPPECC42；NC：无菌培养基的空白对照；**：p＜0.01。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步的说明
实施例1
利用DNA同源重组技术进行肠外致病性大肠杆菌（ExPEC）yafON基因缺失株ExPECPPECC42-ΔyafON的构建和生物被膜形成能力的测定。
yafON基因缺失株ExPEC PPECC42-ΔyafON的构建，包括如下具体步骤：
1、基因的克隆与同源重组质粒的构建
（1）基因组DNA的提取：采用热煮沸法提取亲本菌株ExPEC PPECC42的基因组DNA：挑单菌落到已加入50μL双蒸水的EP管中，沸水浴煮沸5min，10000rpm离心3min，吸取上清到新的EP管中则为基因组DNA，-20℃保存备用。
（2）引物的设计
利用引物设计软件Primer5.0，设计yafON基因的上下游片段的引物，以及缺失鉴定引物，其引物序列见表7：
表7. yafON基因缺失株构建所用引物序列和PCR产物大小
Figure DEST_PATH_IMAGE007
3）同源重组质粒的构建
1）yafON基因上下游片段扩增
根据重叠PCR（overlapping-PCR）的原理和方法，使用P1/P2，P3/P4两对引物分别对yafON基因的上游片段和下游片段进行扩增，P1/P2扩增的预期上游片段大小为665 bp，P3/P4扩增的yafON基因下游片段为690 bp。
扩增体系如表8所示：
表8 yafON基因上下游片段扩增体系
Figure DEST_PATH_IMAGE008
PCR反应条件： [98℃ 10s → 56℃ 5s → 72℃1min] ×30cycles→ 4℃。
2）重叠PCR
将上下游片段的扩增产物分别切胶回收，将回收的产物做为模板，利用重叠PCR对yafON基因上下游片段进行重叠PCR。以引物P1/P4为模板进行扩增，扩增的yafON基因的同源重组基因缺失片段ΔyafON的大小为1330 bp，扩增体系和表9所示。
表9 重叠PCR扩增体系
Figure DEST_PATH_IMAGE009
先扩增5个循环，然后再加入引物P1/P4各1μL进行PCR扩增；
PCR反应条件： [98℃ 10s → 56℃ 5s → 72℃1min40sec] ×（5+28）cycles→4℃。
3）酶切与酶切产物的连接
将上述重叠PCR获得的ΔyafON基因片段产物进行切胶回收，将回收产物和自杀性载体pRE112各自进行Xba I和 Sac I双酶切，37℃酶切3h。酶切产物进行切胶回收，将回收的目的片段和载体片段以T4 DNA 连接酶16℃过夜连接。
酶切反应体系如表10所示：
表10 酶切反应体系
Figure DEST_PATH_IMAGE010
酶切产物连接反应体系如表11所示：
表11酶切产物连接反应体系
Figure DEST_PATH_IMAGE011
4）连接产物转化感受态细胞
10μL过夜连接产物加入到100μL感受态细胞χ7213中，轻轻混匀，冰浴30min，取出后立即42℃水浴热激90sec，立即冰浴90sec，再加入600μL含终浓度为10μg/mlDAP的 LB液体培养基，放入37℃摇床中振荡培养60min，转速200rpm，进行菌液的复苏。取200μL复苏的菌液涂布于含终浓度25μg/ml氯霉素和10μg/mlDAP的L-A平板上，37℃培养24h可出现单菌落。挑取单菌落培养，提取质粒，酶切鉴定，将酶切鉴定正确质粒的送Takara公司测序测序正确，获得同源重组质粒pRE112-ΔyafON。
2、接合转移与yafON基因缺失菌株的筛选和鉴定
以转化了同源重组质粒pRE112-ΔyafON的χ7213菌为供体菌，以亲本菌株ExPECPPECC42为受体菌进行接合转移。转化了同源重组质粒pRE112-ΔyafON的χ7213菌供体菌和亲本菌株ExPEC PPECC42各自进行200rpm，37℃过夜振荡培养，用新鲜的LB液体培养基调整OD600值为0.8，各取100μL混合；将灭菌的硝酸纤维滤膜贴于含终浓度为10μg/mlDAP的L-A平板上，将200μL混合菌液均匀涂布于滤膜上，共培养10h后，用LB液体培养基将滤膜上的菌洗涤两次，洗涤液6000rpm离心5min，将洗涤沉淀菌用200μL新鲜LB液体培养基重悬，均匀涂布于含终浓度为12.5μg/ml氯霉素的L-A平板上，37℃培养12h，挑取单菌落于含终浓度为25μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，37℃，200 rpm振荡培养8h，划线接种于含氯霉素终浓度为12.5μg/ml和蔗糖终浓度50mg/ml的L-A平板上，筛选氯霉素抗性，蔗糖敏感的接合子。
将上述筛选到的氯霉素抗性，蔗糖敏感的接合子接种在无NaCl，无抗性的LB液体培养基中，37℃，200 rpm振荡培养17h后10倍，100倍，1000倍稀释，将各个稀释梯度的菌液分别取100μL涂布于含蔗糖终浓度50mg/ml蔗糖且无抗性无NaCl 的L-A平板上，37℃培养12h，挑取单菌落接种于含氯霉素终浓度为12.5μg/ml和蔗糖终浓度50mg/ml的L-A平板，筛选氯霉素敏感，蔗糖抗性的菌落，使用引物P5/P6进行PCR鉴定，产物送南京金斯瑞生物技术有限公司测序。测序正确，获得一株ExPEC基因缺失株，即ExPEC PPECC42-ΔyafON菌株。
PCR鉴定反应体系如表12：
表12 PCR鉴定反应体系
Figure DEST_PATH_IMAGE012
PCR反应条件：[98℃ 10s → 56℃ 5s → 72℃1min40sec] ×30cycles → 4℃。
实施例2 ExPEC野生菌株和yafON基因缺失菌株的生物被膜形成能力测定
根据参考文献（Stepanovic et al 2000）中的方法并修改进行，将亲本菌株ExPECPPECC42和yafON基因缺失菌株，即ExPEC PPECC42-ΔyafON菌株，分别接种LB培养基，37℃，200rpm振荡培养过夜，将过夜培养物分别用新鲜M9培养基进行1:100稀释，稀释好的菌液分别加入96孔细胞培养板中，每孔100μL，每株细菌分别设8个重复。以无菌培养基作空白对照，28℃静置培养5 天，将培养物轻轻吸出，用灭菌蒸馏水洗涤微孔三次，晾干，96孔板中，每孔加125μL的1wt%的结晶紫染色15min，用流水轻轻冲掉染液，轻甩晾干，再每孔加入33vol%的乙酸150μL，振荡溶解10min，置于酶标仪下测定OD630值，经Excel进行非配对的Student’s t-test.检验，在28℃条件下，培养5天后，yafON基因缺失菌株，即ExPECPPECC42-ΔyafON（ΔYafON）菌株与亲本菌株ExPEC PPECC42（WT）相比，生物被膜形成能力显著下降（p＜0.01）。
实施例3 结果
根据同源重组的原理和自杀性质粒pRE112进行缺失株的构建。首先扩增yafON基因的上下游片段，其大小分别为665 bp、690 bp，其扩增结果如图1。将扩增的上下游片段纯化后采用重叠PCR的方法扩增同源重组所需基因缺失片段ΔyafON，其大小为1330 bp，其扩增结果如图2。将重叠PCR产物的片段回收，和自杀性载体pRE112同时酶切，纯化回收酶切产物，连接后转入χ7213，挑单菌落扩大培养抽提质粒进行酶切鉴定，将酶切条带位置正确的质粒再经过测序证实序列缺失正确。
接合转移后，经两次筛选，将表型正确的单菌落接种于LB培养基，扩大培养后，采用引物P5/P6进行PCR鉴定，PCR产物经电泳鉴定见图3，结果显示yafON基因缺失菌株，即ExPEC PPECC42-ΔyafON菌株的PCR扩增产物大小为277 bp，对照组亲本菌株ExPECPPECC42的PCR扩增产物大小为817bp，与预期结果一致，初步证实yafON基因缺失菌株构建成功，并且将PCR产物片段回收纯化后测序证实缺失序列正确。
为探索YafON在ExPEC生物被膜形成中的作用，采用结晶紫染色法对ExPEC野生菌株PPECC42和yafON基因缺失菌株ExPEC PPECC42-ΔyafON的生物被膜形成能力进行测定和比较。结果显示在在M9培养基28℃条件下培养5天，亲本菌株ExPEC PPECC42的生物被膜形成能力非常强，为强生物被膜形成菌株，而yafON基因缺失菌株ExPEC PPECC42-ΔyafON的生物被膜形成能力显著下降（p＜0.01），结果见图4，因此YafON能提供控制ExPEC生物被膜形成的新的潜在的药物靶标。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 一株ExPEC yafON基因缺失株的构建及应用
<130> 6
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcctctagac atttttacaa acctta 26
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggttgttatc ttacgtaact cagtgata 28
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cactgagtta cgtaagataa caaccaaatg c 31
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tccgagctcc cagggcaaga aaaaagaat 29
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cgtaaaacct gggatgaa 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
accgctctaa ggaaaata 18

Claims (1)

1.一株ExPEC yafON基因缺失株ExPEC PPECC42-ΔyafON在ExPEC生物被膜形成能力下降中的应用，其特征在于：所述ExPEC PPECC42-ΔyafON菌株即肠外致病性大肠杆菌（Escherichia coli）ExPEC PPECC42-ΔyafON是亲本菌株ExPEC PPECC42缺失yafON基因所得，于2018年10月17日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2018688。
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