CN116887846A - 工程化γδT细胞及其制备和使用方法 - Google Patents

工程化γδT细胞及其制备和使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116887846A
CN116887846A CN202180094700.XA CN202180094700A CN116887846A CN 116887846 A CN116887846 A CN 116887846A CN 202180094700 A CN202180094700 A CN 202180094700A CN 116887846 A CN116887846 A CN 116887846A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
cell
engineered
cell receptor
chain polypeptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180094700.XA
Other languages
English (en)
Inventor
L·杨
D·李
Y·周
Z·李
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of California
Original Assignee
University of California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of California filed Critical University of California
Publication of CN116887846A publication Critical patent/CN116887846A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1774—Immunoglobulin superfamily (e.g. CD2, CD4, CD8, ICAM molecules, B7 molecules, Fc-receptors, MHC-molecules)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4632—T-cell receptors [TCR]; antibody T-cell receptor constructs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464416—Receptors for cytokines
    • A61K39/464417—Receptors for tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin receptor [LTR], CD30
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/26—Universal/off- the- shelf cellular immunotherapy; Allogenic cells or means to avoid rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/125—Stem cell factor [SCF], c-kit ligand [KL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/14—Erythropoietin [EPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/145—Thrombopoietin [TPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2303—Interleukin-3 (IL-3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2306—Interleukin-6 (IL-6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2307—Interleukin-7 (IL-7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2315—Interleukin-15 (IL-15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/24—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/25—Tumour necrosing factors [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/26—Flt-3 ligand (CD135L, flk-2 ligand)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/51—B7 molecules, e.g. CD80, CD86, CD28 (ligand), CD152 (ligand)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本公开的方面涉及与制备免疫细胞相关的方法和组合物，该免疫细胞包括包含至少一种外源性γδT细胞受体的工程化T细胞，例如被选择成靶向特定疾病或病原体(例如，癌症或COVID‑19)。T细胞可以由人造血干细胞/祖细胞产生，并且适用于同种异体细胞疗法，因为它们不诱导移植物抗宿主病(GvHD)并且抵抗宿主免疫同种异体排斥。因此，此类细胞适用于在临床疗法中现成使用。

Description

工程化γδT细胞及其制备和使用方法
对相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C.Section 119(e)要求于2020年12月28日提交且标题为“ENGINEERED GAMMA DELTA(γδ)T CELLS AND METHODS OF MAKING AND USING THEREOF”的共同未决和共同转让的美国临时专利申请序列序列号63/131,170的权益，该申请以引用方式并入本文。
技术领域
本公开的实施方案至少涉及免疫学、细胞生物学、分子生物学和医学领域。
发明背景
Gamma delta(γδ)T细胞是T淋巴细胞的小亚群，具有桥接先天性和适应性免疫的能力。成人血液中的大多数γδT细胞表现出Vγ9Vδ2T细胞受体，并且对通常由恶性细胞产生的小磷酸化非肽抗原(称为磷酸抗原(pAg))作出应答(参见例如Yang等人,Immunity 50,1043-1053.e5(2019))。与常规的αβT细胞不同，γδT细胞不识别多态性经典主要组织相容性复合体(MHC)分子，并因此在过继转移到同种异体宿主中时没有移植物抗宿主病(GvHD)风险。另外，γδT细胞具有若干其他独特的特征，使它们成为开发出用于癌症的现成细胞疗法的理想细胞载体。这些特征包括：1)γδT细胞在癌症免疫监视中具有作用；2)γδT细胞具有显著的靶向肿瘤的能力，而不受肿瘤抗原和主要组织相容性复合体(MHC)的限制；3)γδT细胞可以通过直接杀伤和佐剂作用，采用多种机制攻击肿瘤细胞；以及4)γδT细胞表达表面受体FcγRIII(CD16)，该受体涉及抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，并且可以潜在地与单克隆抗体联合用于癌症疗法(参见例如Lepore等人,Front.Immunol.9,1–11(2018),Harrer等人,Hum.Gene Ther.29,547–558(2018)和Presti等人,Front.Immunol.8,1-11(2017))。然而，遗憾地，同种异体现成γδT细胞产品的开发因其可用性而受到极大阻碍——这些细胞在人类中的数量极低且变异性高(人类血液中约1-5％T细胞)，使得极难以使用同种异体人供体的血细胞产生治疗数量的γδT细胞(参见例如Silva-Santos等人,Nat.Rev.Immunol.15,683-691(2015))。
生成用于过继性疗法的γδT细胞(特别是Vγ9Vδ2亚群)的常规方法涉及使用氨基二膦酸盐(如唑来膦酸盐(ZOL))在体外或体内扩增外周血单个核细胞(PBMC)衍生的γδT细胞。然而，取决于PBMC供体，这种方法生成高度可变的γδT细胞产率；且最重要地，此类γδT细胞产品将典型地含有旁观者αβT细胞，由此招致GvHD风险(参见例如Torikai等人,Mol.Ther.24,1178-1186(2016))。
发明内容
可以用无饲养物分化体系可靠地大量生成同质单克隆γδT细胞群的新型方法和材料对于开发出可用于治疗各种各样的病理状况的“现成”γδT细胞疗法至关重要。特别地，设计可以用于制造治疗性γδT细胞群的细胞的能力将增加新细胞疗法的可用性和有用性。提供本发明的实施方案是为了解决对于新细胞疗法的需求，更特别地对于不受使用自体细胞的个体化疗法所带来的挑战阻碍的细胞疗法的需求。
如本文所公开，我们发现，通过对多能细胞(例如CD34+干细胞和祖细胞)进行γδTCR基因工程化，然后在体内或体外选择性地将基因工程化细胞分化为转基因γδT细胞，可以产生工程化γδT细胞。如下所讨论，此类γδT细胞可以进一步工程化成共表达其他疾病靶向性分子(例如，嵌合抗原受体“CAR”)以及免疫调节分子(例如，细胞因子、受体/配体等)来调节它们的性能。重要地，这些体外分化的γδT细胞的实施方案可以用于同种异体“现成”细胞疗法，以用于治疗范围广泛的疾病(例如，癌症、自身免疫性疾病、感染等)。
本发明的实施方案包括与下表1中所公开的γ和δ链多肽相关的材料和方法。例如，本发明的实施方案包括物质组合物，该物质组合物包含具有表1中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:52)的γ链多肽和/或δ链多肽。本发明的相关实施方案包括物质组合物，该物质组合物包含编码具有表1中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:52)的γ链多肽和/或δ链多肽的多核苷酸。在本发明的某些实施方案中，这些多核苷酸设置在载体，例如设计用于在细胞中表达这些γ和δ链多肽的表达载体中。本发明的一种此类实施方案是包含已用表达载体转导的免疫细胞的物质组合物，该表达载体包含编码具有表1中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:52)的至少一种T细胞受体γ链多肽和/或T细胞受体δ链多肽的多核苷酸。
本发明的实施方案还包括例如制备工程化功能性T细胞的方法，该工程化功能性T细胞被修饰成含有编码T细胞受体γ链多肽和/或T细胞受体δ链多肽(例如，如表1中所公开)的至少一种外源性核酸分子。典型地，这些方法包括用编码T细胞受体γ链多肽和/或T细胞受体δ链多肽的至少一种外源性核酸分子转导多能细胞(例如，人CD34+造血干细胞或祖细胞)，使得由外源性核酸分子转导的细胞表达包含γ链多肽和δ链多肽的T细胞受体；并然后使转导的人细胞分化，以便生成工程化功能性γδT细胞。
本发明的方法实施方案可以包括例如使转导的多能细胞在体外分化。在例示性方法中，可以使转导的CD34+人造血干细胞或祖细胞(HSPC)在不存在饲养细胞的情况下在体外分化；并且/或者在包含细胞因子如IL-3、IL-7、IL-6、SCF、EPO、TPO和FLT3L的一种或多种的培养基中，和/或在选择成有利于核酸转导效率的试剂(如纤维连接蛋白)的存在下进行培养。在某些实施方案中，该方法进一步包括使转导的细胞与激动剂抗原或其他刺激剂进行接触。在本发明的一些实施方案中，该方法进一步包括将转导的细胞与外周血单个核细胞、抗原呈递细胞或人工抗原呈递细胞共培养。本发明的某些实施方案进一步包括在体外扩增用编码T细胞受体γ链多肽或T细胞受体δ链多肽的核酸分子转导的多能细胞。本发明的替代方法可以包括将用编码T细胞受体γ链多肽和T细胞受体δ链多肽的核酸分子转导的细胞移植到受试者中，以在体内生成工程化细胞的克隆群体。
在本发明的一些实施方案中，工程化T细胞包含表征为以下中的至少一者的基因表达谱：HLA-I-阴性；HLA-II-阴性；HLA-E-阳性；并且/或者表达自杀基因。任选地，工程化T细胞进一步包含编码T细胞受体α链多肽或T细胞受体β链多肽的外源性T细胞受体核酸分子；和/或编码细胞因子的外源性核酸分子；和/或抑制的内源性TCR。在本发明的某些实施方案中，由这些工程化细胞表达的T细胞受体γ链多肽和/或T细胞受体δ链多肽包含表1中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:52)。
本发明的实施方案包括由本文所公开的方法产生的工程化功能性γδT细胞。例如，本发明的实施方案包括包含工程化T细胞的物质组合物，该工程化T细胞含有表征为以下的基因表达谱：HLA-I-阴性；HLA-II-阴性；HLA-E-阳性；表达自杀基因；以及表达至少一种外源性T细胞受体γ链多肽和至少一种外源性T细胞受体δ链多肽。在某些实施方案中，T细胞受体γ链多肽或T细胞受体δ链多肽包含SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:52中所示的至少一种氨基酸序列。在本发明的一些实施方案中，CD34+HSPC可以从脐带血(CB)或外周血中分离。在本发明的此类实施方案中，CB CD34+HSC可以从商业提供商(例如HemaCare)或从已建立的CB库获得。
由于γδTγ/δ细胞产品是现成产品，可以用于治疗患者而不受MHC限制，一旦商业化，该细胞产品将在多种潜在挽救生命的疗法中具有广泛应用。在这种情况下，本发明的又一个实施方案是治疗需要γδT细胞的受试者的方法(例如，以对抗疾病如自身免疫性疾病或癌症或感染，如COVID-19)，该方法包括向受试者施用本文所公开的工程化功能性T细胞。
根据以下详述，本发明的其他目的、特征和优点对于本领域技术人员将变得显而易见。然而，应理解，尽管指出了本发明的一些实施方案，但是给出的详述和具体实例是说明性的，而非限制性的。本发明的范围内的许多改变和修改可以在不脱离其精神的情况下进行，并且本发明包括所有此类修改。
附图简述
图1A-1C.人γδTCR基因的克隆。图1(A)：克隆出人γδTCR的实验设计。图1(B)：单一人γδT细胞的荧光激活细胞分选(FACS)。图1(C)：显示出来自五个分选的单一γδT细胞的人TCRγ9和δ2链PCR产物的代表性DNA凝胶图像。
图2A-2B.Lenti/G115和Lenti/γδT载体的示意图。指定用于基于HSC的基因疗法的pMNDW慢病毒载体被选择用于递送γδTCR基因。图2(A)：编码G115γδTCR基因的Lenti/G115载体。图2(B)：编码选定的γδTCR基因的Lenti/γδT载体。编码LYγδ1TCR基因(参见表1)的Lenti/γδT载体用于所提出的研究。
图3A-3E.克隆的γδTCR的功能表征。将PBMC-T细胞用编码所指示γδTCR链(即G115，γδ1)的Lenti/γδT载体转导，并且分析其TCR表达和功能。图3(A)：显示出Lenti/γδT载体转导的PBMC-T细胞上转基因γδTCR的表达的代表性FACS图。图3(B)：在ZOL刺激后Lenti/γδT载体转导的PBMC-T细胞的IFN-γ的细胞内产生的FACS分析。图3(C-E)：研究Lenti/γδT载体转导的PBMC-T细胞的肿瘤杀伤。图3(C)：实验设计。图3(D)：Lenti/γδT载体转导的PBMC-T细胞对人黑素瘤细胞系(A375-FG)的体外肿瘤杀伤。图3(E)：Lenti/γδT载体转导的PBMC-T细胞对人多发性骨髓瘤细胞系(MM.1S-FG)的体外肿瘤杀伤。需注意，亲本A375和MM.1s人肿瘤细胞系被工程化成表达萤火虫萤光素酶和绿色荧光蛋白双报道分子(FG)。数据表示为平均值±SEM。ns，不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，通过单因素方差分析。
图4A-4B.BLT-γδT人源化小鼠模型中HSC-γδT细胞的生成。
图4(A)：在BLT-γδT人源化小鼠模型中生成HSC-γδT细胞的实验设计。BLT，人骨髓-肝脏-胸腺植入的NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠。BLT-γδT，人γδTCR基因工程化BLT小鼠。图4(B)：在HSC转移后25周，BLT-γδT小鼠的各种组织中HSC-γδT细胞的FACS检测。接受模拟载体转导的CD34+HSC的BLT小鼠作为对照包括在内(表示为BLT-模拟物)。
图5A-5B.ATO培养物中AlloHSC-γδT细胞的生成。图5(A)：在ATO培养物中生成AlloHSC-γδT细胞的实验设计。图5(B)：显示出由PBSC在阶段1时AlloHSC-γδT细胞的发育和在阶段2时分化的AlloHSC-γδT细胞的扩增的FACS图。
图6A-6D.无饲养物的离体分化培养物中AlloHSC-γδT细胞的生成。将从G-CSF动员的外周血(表示为PBSC)或脐带血(表示为CB HSC)中分离的CD34+HSC用编码人γδTCR基因的Lenti/γδT载体转导，然后放入无饲养物的离体细胞培养物中，以生成AlloHSC-γδT细胞(图6A和6B)。PBSC和CB HSC均可以有效地分化为转基因AlloHSC-γδT细胞并作为其扩增(图6C和6D)。
图7A-7D.CMC研究-AlloCAR-γδT细胞。图7(A-B)：由图7(A)中的PBSC或图7(B)中的脐带血(CB)HSC生成单克隆AlloCAR-γδT细胞的无饲养物离体分化培养方法。需注意，可以由单个随机健康供体的PBSC或CB HSC生成高数量的AlloCAR-γδT细胞及其衍生物。图7(C-D)：由图7(C)中的PBSC或图7(D)中的CB HSC，在阶段1时AlloCAR-γδT细胞的发育和在阶段2时分化的AlloCAR-γδT细胞的扩增。
图8A-8B.AlloHSC-γδT细胞的药理学研究.图8(A)：呈现了代表性FACS图，显示了AlloHSC-γδT细胞的表型(表面标志物)和功能(效应分子的细胞内产生)的分析。从健康供体外周血中分离和扩增的内源性人γδT(PBMC-γδT)细胞和常规αβT(PBMC-T)细胞作为对照包括在内。图8(B)：AlloHSC-γδT细胞的表面NK受体表达的代表性FACS分析。从健康供体外周血中分离和扩增的内源性PBMC-γδT细胞、PBMC-T和PBMC-NK细胞作为对照包括在内。
图9A-9E.AlloHSC-γδT细胞的体外功效和MOA研究。图9(A)：体外肿瘤细胞杀伤测定的实验设计。图9(B)：AlloHSC-γδT细胞针对A375-FG肿瘤细胞的肿瘤杀伤功效(n＝3)。图9(C)：AlloHSC-γδT细胞针对MM.1s-FG肿瘤细胞的肿瘤杀伤功效(n＝3)。图9(D)：AlloHSC-γδT细胞针对多种人肿瘤细胞系的肿瘤杀伤功效(n＝3)。图9(E)：研究中测试的人肿瘤细胞系。数据以平均±SEM表示。ns，不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，通过单因素方差分析。E:T，效应物与靶标比率。
图10A-10C.AlloHSC-γδT细胞在A375-FG人黑素瘤异种移植NSG小鼠模型中的体内抗肿瘤功效和MOA研究。图10(A)：实验设计。BLI，活体动物生物发光成像。图10(B)：显示出实验小鼠随着时间推移的肿瘤负荷的BLI图像。图10(C)：B的量化(n＝4)。数据表示为平均值±SEM。ns，不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，通过单因素方差分析。
图11A-11D.AlloBCAR-γδT细胞的体外功效和MOA研究。图11(A)：体外肿瘤细胞杀伤测定的实验设计。图11(B)：在不存在或存在ZOL的情况下，AlloBCAR-γδT细胞针对A375-FG黑素瘤细胞的肿瘤杀伤功效(n＝3)。图11(C)：在不存在或存在ZOL的情况下，AlloBCAR-γδT细胞针对MM.1S-FG骨髓瘤细胞的肿瘤杀伤功效。BCAR-T细胞和非CAR-工程化PBMC-T细胞以及AlloHSC-γδT细胞作为对照包括在内(n＝3)。图11(D)：显示出可以由靶向肿瘤细胞的AlloBCAR-γδT细胞部署的三重机制的示意图，包括CAR介导的、γδTCR介导的以及NK受体介导的路径。数据表示为平均值±SEM。ns，不显著，*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001，通过单因素方差分析。E:T，效应物与靶标比率。
图12A-12D.AlloBCAR-γδT细胞的体内抗肿瘤功效(n＝8)。图12(A)：实验设计。图12(B)：显示出实验小鼠随着时间推移的肿瘤负荷的代表性BLI图像。图12(C)：B的量化。图12(D)：实验小鼠在肿瘤攻击后4个月时段内的Kaplan-Meier生存曲线(n＝8)。数据表示为平均值±SEM。ns，不显著；****p<0.0001，通过单因素方差分析图12(C)，或调整用于多重比较的对数秩(Mantel-Cox)检验图12(D)。
图13A-13D.体内抗肿瘤功效研究——AlloBCAR-γδT细胞联合ZOL治疗。图13(A)：实验设计。图13(B)：显示出实验小鼠随着时间推移的肿瘤负荷的BLI图像。图13(C)：13B的量化(n＝3)。图13(D)：肿瘤攻击后39天的肿瘤负荷的量化(n＝3)。数据表示为平均值±SEM。ns，不显著，*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001，通过单因素方差分析。E:T，效应物与靶标比率。
图14A-14F.Allo15CAR-γδT细胞的CMC研究和体内持久性.图14(A)：从脐带血(CB)HSC生成单克隆Allo15CAR-γδT细胞的无饲养物离体分化培养方法。需注意，可以由单个随机健康供体的CB HSC生成高数量的Allo15CAR-γδT细胞。图14(B)：由CB HSC在阶段1时Allo15CAR-γδT细胞的发育和在阶段2时分化的Allo15CAR-γδT细胞的扩增。图14(C)：研究Allo/15BCAR-γδT细胞的体内动力学的实验设计。需注意，Allo/15BCAR-γδT细胞标记有FG双报道分子。图14(D)：显示出随着时间推移，实验小鼠中FG标记的Allo/15BCAR-γδT细胞的存在的BLI图像。图14(E)：D的量化(n＝1-2)。数据表示为平均值±SEM。
图15A-15F.免疫原性研究。图15(A)：用于研究GvH应答的体外混合淋巴细胞培养(MLC)测定。图15(B)：来自15A的IFN-γ产生(n＝3)。供体不匹配的PBMC-T和PBMC-γδT细胞作为对照包括在内。来3个不匹配的健康供体的PBMC用作刺激物。N，无PBMC刺激物。图15(C)：用于研究HvG应答的体外MLC测定。图15(D)：来自3名不匹配的健康供体的C.PBMC的IFN-γ产生作为应答物进行测试。显示了来自一名代表性供体的数据(n＝3)。图15(E-F)：指定刺激细胞上的B2M/HLA-I和HLA-II表达的FACS分析(n＝3)。数据表示为平均值±SEM。ns，不显著，*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001，通过单因素方差分析。
图16.使用各种方法生成的人γδT细胞产品的特性。
呈现了代表性FACS图，显示了来自人PBMC培养物和来自AlloHSC-γδT细胞培养物的人γδT细胞的特性。Tc，常规αβT细胞。
图17A-17D.AlloHSC-γδT细胞直接靶向并杀伤SARS-CoV-2感染的细胞。图17(A)：显示出工程化293T-FG、293T-ACE2-FG和Calu3-FG细胞系的示意图。图17(B)：293T-FG、293T-ACE2-FG和Calu3-FG细胞上ACE2的FACS检测。图17(C-D)：AlloHSC-γδT细胞在体外直接杀伤SARS-CoV-2感染或未感染的靶细胞(n＝3)。数据表示为平均值±SSEM。ns，不显著，*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001，通过单因素方差分析。
发明详述
在实施方案的描述中，参考可以形成其一部分的附图，并且在附图中通过对可以实践本发明的具体实施方案举例说明来示出。应当理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可以利用其他实施方案，并且可以进行结构改变。
健康个体中Gamma delta(γδ)T细胞通常占外周血淋巴细胞的1％至5％。与识别主要组织相容性复合体(MHC)分子所呈递的特定肽抗原的经典αβT细胞不同，γδT细胞可以识别由于恶性转化或病毒感染而变得调节异常的细胞所表达的通用决定簇(genericdeterminants)。因此，γδ-T细胞具有以不需要常规肿瘤特异性抗原存在的方式识别和杀伤广谱肿瘤细胞类型的先天能力。
本领域中需要能够可靠地大量生成各种工程化人T细胞(如工程化γδT细胞)的同质单克隆群体的方法和材料。这些技术对于开发出现成T细胞疗法至关重要。此类方法和材料可以例如提供γδT细胞，该γδT细胞可用于同种异体或自体受者受试者以治疗多种病理状况，包括例如病毒性感染、真菌性感染、原生动物性感染和癌症。
如下所讨论，我们发现，可以通过对多能人细胞(如CD 34+干细胞和祖细胞(例如，HSC、iPSC、ESC))进行γδTCR基因工程化，继之以在体内和/或体外选择性地将基因工程化干细胞和祖细胞分化为转基因γδT细胞来产生工程化γδT细胞。如本领域中所知，造血干细胞或祖细胞具有多重潜能，使它们能够自我更新并且也产生成熟血细胞，如红细胞、白细胞、血小板和淋巴细胞。CD34是人HSC的标志物，且人骨髓(BM)细胞的所有集落形成活性均在CD34+级分中发现。参见例如Mata等人,Transfusion.2019年12月；59(12):3560-3569.doi:10.1111/trf.15597。
该发现是意料不到的，因为γδT细胞的发育路径是独特的，并且不同于其他T细胞如iNKT细胞和αβT细胞的发育路径(参见例如Dolens等人,EMBO Rep.2020年5月6日；21(5):e49006.doi:10.15252/embr.201949006.Epub2020和Shissier等人,Mol.Immunol.2019；105:116-130)。重要地，本文所公开的体外分化的γδT细胞可以用于同种异体“现成”细胞疗法，以用于治疗范围广泛的疾病(例如，癌症、感染、自身免疫等)。此外，γδT细胞还可以工程化成共表达其他疾病靶向性分子(例如CAR)以及免疫调节分子(例如，细胞因子、受体/配体)来增强它们的性能。
本发明的实施方案包括例如制备工程化功能性T细胞的方法，该工程化功能性T细胞被修饰成含有编码T细胞受体γ链多肽和/或T细胞受体δ链多肽如具有表1中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:52)的γ链多肽和/或δ链多肽的至少一种外源性核酸分子(例如，设置在表达载体中，如在下文所讨论的慢病毒载体)。典型地，这些方法包括用编码T细胞受体γ链多肽和/或T细胞受体δ链多肽的至少一种外源性核酸分子转导多能人细胞如造血干/祖细胞(即，多能干细胞、造血干细胞或造血祖细胞)，使得由外源性核酸分子转导的人细胞表达包含γ链多肽和δ链多肽的T细胞受体；并然后使转导的人细胞(例如，造血干/祖细胞)分化，以便生成工程化功能性γδT细胞。在本发明的某些方法实施方案中，由外源性核酸编码的T细胞受体γ链多肽和T细胞受体δ链多肽被选择为已知形成γδT细胞受体的那些，该γδT细胞受体先前已被观察到靶向癌细胞或者被病毒、细菌、真菌或原生动物感染的细胞。本发明的某些方法包括在体外培养物中使转导的人细胞分化；并然后在体外培养物中进一步扩增这些分化的细胞的步骤。在本发明的一些方法实施方案中，在体外培养物中扩增这些分化的细胞是在选择用于将转导细胞的分化群体扩增至少2倍、5倍、10倍或100倍的条件下执行。在本发明的一些实施方案中，使工程化功能性γδT细胞暴露于唑来膦酸。
本发明的方法实施方案包括在体外或体内分化转导的多能人细胞(例如，人造血干细胞或祖细胞)，然后扩增该分化的细胞群。在某些实施方案中，该方法还包括使转导的细胞与刺激剂如激动剂抗原进行接触。在本发明的一些方法实施方案中，γδT细胞群通过本文所公开的方法进行制备，其中此类方法不包括在将编码γ和δ多肽的核酸转导到人细胞中后的细胞分选步骤(例如，FACS或磁珠分选)。在本发明的一些实施方案中，该方法进一步包括将转导的细胞与外周血单个核细胞、抗原呈递细胞或人工抗原呈递细胞共培养。典型地，在这些方法中，使转导的人细胞在不存在饲养细胞的情况下在体外分化；并且/或者将转导的造血干细胞或祖细胞在包含细胞因子如IL-3、IL-7、IL-6、SCF、MCP-4、EPO、TPO、FLT3L、和/或选择成有利于核酸转导效率的试剂(如纤维连接蛋白)中的一种或多种的培养基中进行培养。本发明的替代方法可以包括将用编码T细胞受体γ链多肽或T细胞受体δ链多肽的核酸分子转导的细胞移植到受试者中(即体内)，以生成工程化细胞的克隆群体。
在本发明的一些方法实施方案中，工程化T细胞被选择成包含特定基因表达谱，例如表征为以下中的至少一者的基因表达谱：HLA-I-阴性；HLA-II-阴性；HLA-E-阳性；并且/或者表达自杀基因。典型地，工程化T细胞进一步包含编码T细胞受体α链多肽和T细胞受体β链多肽的一种或多种外源性T细胞受体核酸分子；和/或编码细胞因子的一种或多种外源性核酸分子；和/或抑制的内源性TCR。在本文所公开的本发明的一些实施方案中，T细胞受体γ链多肽和T细胞受体δ链多肽包含下表1中所示的氨基酸序列。在特定实施方案中，一种或多种额外的核酸编码一种或多种治疗性基因产物。治疗性基因产物的实例包括至少以下项：1.抗原识别分子，例如CAR(嵌合抗原受体)和/或αβTCR(T细胞受体)、γδT受体等等；2.共刺激分子，例如CD28、4-1BB、4-1BBL、CD40、CD40L、ICOS；和/或3.细胞因子，例如IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-9、IL-15、IL-12、IL-17、IL-21、IL-23、IFN-γ、TNF-α、TGF-β、G-CSF、GM-CSF；4.转录因子，例如T-bet、GATA-3、RORγt、FOXP3和Bcl-6。包括治疗性抗体，如嵌合抗原受体、单链抗体、单体、人源化抗体、双特异性抗体、单链FV抗体或它们的组合。
本发明的实施方案还包括与下表1中所公开的γ和δ链多肽相关的材料和方法。例如，本发明的实施方案包括物质组合物，该物质组合物包含具有表1中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:52)的γ链多肽和/或δ链多肽。本发明的相关实施方案包括物质组合物，该物质组合物包含编码具有表1中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:52)的γ链多肽和/或δ链多肽的多核苷酸。在本发明的某些实施方案中，这些多核苷酸设置在载体中，例如设计用于在细胞(例如哺乳动物细胞)中表达这些γ和δ链多肽的表达载体。本发明的组合物可以含有防腐剂和/或抗微生物剂以及接近生理条件所需的药学上可接受的赋形剂物质，如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂、洗涤剂等。对于此类组合物。术语“赋形剂”意在包括但不限于Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins,第21版(2006)中所述的那些成分。
本发明的实施方案进一步包括由本文所公开的方法产生的工程化功能性γδT细胞和这些细胞的群体。典型地，这些群体基本上由功能性γδT细胞(例如，不包括常规αβT细胞)组成。本发明的实施方案包括物质组合物，该物质组合物包含本文所公开的工程化γδT细胞或T细胞群，如包含表征为以下的基因表达谱的工程化γδT细胞或T细胞群：HLA-I-阴性；HLA-II-阴性；HLA-E-阳性；表达自杀基因；以及表达外源性T细胞受体γ链多肽和外源性T细胞受体δ链多肽。任选地，工程化T细胞进一步包含外源性核酸分子，该外源性核酸分子编码另一种多肽如T细胞受体α链多肽和/或T细胞受体β链多肽和/或iNKT受体多肽；和/或细胞因子；并且/或者包含抑制的内源性TCR。本发明的实施方案还包括包含已用表达载体转导的免疫细胞的物质组合物，该表达载体包含编码具有表1中所示的氨基酸序列(SEQID NO:1-SEQ ID NO:52)的至少一种外源性T细胞受体γ链多肽和/或T细胞受体δ链多肽的多核苷酸。
还提供了用如本文所公开的γδT细胞或细胞群治疗患者的方法。本发明的实施方案包括治疗需要γδT细胞的受试者的方法(例如，以对抗疾病如自身免疫性疾病或癌症或感染，如COVID-19)，该方法包括向受试者施用本文所公开的工程化功能性γδT细胞。以这种方式，工程化γδT细胞可用于治疗需要治疗性干预的患者。在本发明的一些治疗性实施方案中，该方法包括将一种或多种额外的核酸引入γδT细胞中，这些细胞可能或可能没有先前被冷冻和解冻。这种用途提供了创建现成γδT细胞的优势之一。
在本发明的某些治疗性方法中，患者已被诊断患有癌症。在一些实施方案中，患者患有涉及炎症的疾病或病症，在一些实施方案中，其不包括癌症。在具体实施方案中，患者患有自身免疫性疾病或病症。在特定方面，细胞或细胞群对于患者是同种异体的。在额外的实施方案中，患者未表现出细胞或细胞群排斥或消减的迹象。一些治疗性方法进一步包括向患者施用激活γδT细胞的刺激分子(例如，单独的或负载到APC上)或启动自杀基因产物的化合物。
在将细胞或细胞群施用于患者后，用γδT细胞治疗癌症患者可以导致癌症患者的肿瘤细胞被杀伤。炎性疾病或病症的治疗可以导致减少炎症。在其他实施方案中，患有自身免疫疾病或病症的患者可以经历疾病或病症的症状的改善，或者可以经历来自γδT细胞的其他治疗益处。可以采用γδT细胞和标准治疗方案或另一种免疫疗法方案的联合治疗。
如下所讨论，在此包括的附图提供了本发明的多个例示性工作实施方案的实例以及从本发明的此类实施方案获得的数据。
在本公开中为了表述方便，我们将一对γ9δ2TCR基因称为γδTCR基因。如图1所示，每对γδTCR基因均含有γ链和δ链。在一些实施方案中，工程化γδT细胞包含处于异源启动子控制之下的核酸，这意味着该启动子不是控制核酸转录的相同的基因组启动子。预期工程化γδT细胞包含外源性核酸，该外源性核酸包含一个或多个编码序列，在本文所述的许多实施方案中，其中一些或全部处于异源启动子的控制之下。
图2显示了用于递送γδTCR基因的慢病毒载体的构建。如图2所示，在本发明的例示性实施方案中，pMNDW慢病毒载体被选择用于递送γδTCR基因。该载体含有MND逆转录病毒LTR U2区作为内部启动子，并且含有额外的截短土拨鼠应答元件(WoodchuckResponsive Element，WPRE)以稳定化病毒mRNA，从而介导人HSC及其后代人免疫细胞中转基因的高而稳定的表达。通过将编码人TCRγ9-T2A-TCRδ2的合成双顺反子基因插入pMNDW中来构建Lenti/γδT载体。使用该策略构建了表达表1中的克隆G115和γδ1的两种质粒(图2)。
图3显示了克隆的γδTCR的功能表征。如图3所示，通过用慢病毒载体转导原代人PBMC衍生的常规αβT(表示为PBMC-T)细胞，继之以功能测试，研究了Lenti/γδT载体的基因递送能力(图3A)以及其编码的γδTCR的功能。值得注意的是，这种慢病毒载体介导了人γδTCR转基因在PBMC-T细胞中的高效表达(图3B)；所得的转基因人γδTCR对唑来膦酸盐(ZOL)刺激有应答，如由诱导的干扰素(IFN)-γ的产生(图3C)以及在使转导的PBMC-T细胞与人肿瘤细胞共培养时增强的肿瘤杀伤所证实(图3D-3F)。
图4显示了通过γδTCR基因工程化HSC的过继转移在体内长期提供的转基因γδT细胞。增加癌症患者中功能性γδT细胞的数量可以增强抗肿瘤免疫力；这可以潜在地通过将γδTCR基因工程化自体HSC过继转移到癌症患者中来实现。如图4所示，为了证明在体内生成HSC-工程化γδT细胞的可能性，我们将人CD34+HSC从G-CSF动员的健康供体PBMC(表示为PBSC)中分离出来；用Lenti/γδT载体转导，然后将这种基因工程化HSC过继地转移到BLT(骨髓-肝脏-胸腺)人源化小鼠模型中。高数量(例如，超过总血细胞的15％)的人HSC-γδT细胞在小鼠中生成，并在8周的时段内在多种组织和器官中检测出。只要实验运行，高水平的转基因HSC-γδT细胞就长期维持超过6个月。
图5显示了用于现成细胞疗法应用的同种异体造血干细胞工程化人γδT(AlloHSC-γδT)细胞(在人工胸腺类器官(ATO)培养物中)的体外生成。虽然自体细胞疗法在治疗血癌和实体瘤方面均显示出巨大前景，但其被赋予若干局限性。自体细胞，特别是从患者收集的T细胞是耗时的，后勤上具挑战性，并且昂贵；此外，经历严重淋巴细胞减少预治疗的患者也许并不总是有可能产生足够的自体细胞产品。可以大规模制造且易于分配以治疗范围广泛的癌症患者的同种异体细胞产品需求量很大。如图5所示，本发明的实施方案以HSC工程化方法为基础，并且开发出两种体外培养方法(饲养物依赖性和饲养物非依赖性培养物)，以产生大数量的现成人γδT细胞用于同种异体细胞疗法应用。
图6显示了无饲养物的离体分化培养物中AlloHSC-γδT细胞的生成。如图6所示，将从G-CSF动员的外周血(表示为PBSC)或脐带血(表示为CB HSC)中分离的CD34+HSC用编码人γδTCR基因的Lenti/γδT载体转导，然后放入无饲养物的离体细胞培养物中，以生成AlloHSC-γδT细胞(图6A和6B)。PBSC和CB HSC均可以有效地分化为转基因AlloHSC-γδT细胞并作为其扩增(图6C和6D)。相似地，AlloCAR-γδT细胞可以通过用编码人γδTCR基因连同CAR基因的慢病毒载体转导HSC而生成(图7)。据估计，可以由健康供体的PBSC或CB样品的HSC产生约1013规模的AlloHSC-γδT细胞，这些细胞可以配制成10,000-100,000剂(每剂约108-109个细胞)(图7A和7B)。尽管扩增倍数有差异，但由PBSC和CB HSC生成的AlloHSC-γδT细胞及其衍生物展现出相似的表型和功能。除非另外指明，否则CB HSC衍生的AlloHSC-γδT细胞及其衍生物用于下述原理验证研究。图7然后显示了无饲养物的离体分化培养物中AlloCAR-γδT细胞的生成。
图8显示了来自药理学研究—AlloHSC-γδT细胞的数据。使用流式细胞术研究了AlloHSC-γδT细胞的表型和功能(图8)。三个对照被包括在内：1)内源性人γδT细胞，它从健康供体外周血中分离出(表示为PBMC-γδT细胞)并在ZOL刺激下体外扩增(鉴定为CD3+TCRVδ2+)；2)内源性人常规αβT细胞，它从健康供体外周血中分离(表示为PBMC-T细胞)并在抗CD3/CD28刺激下在体外扩增(鉴定为CD3+TCRαβ+)；以及3)内源性人NK细胞，它从健康供体外周血中分离(表示为PBMC-NK细胞)，并在基于K562的人工抗原呈递细胞(aAPC)刺激下在体外扩增(鉴定为CD3-CD56+)。AlloHSC-γδT细胞产生极高水平的多种细胞毒性分子(例如，穿孔素和颗粒酶B)，并表达记忆T细胞标志物CD27和CD45RO，类似于内源性γδT细胞(图8A)。此外，AlloHSC-γδT细胞表达高水平的NK激活受体(例如NKG2D)和(例如DNAM-1)，其水平与内源性γδT细胞相似(图8B)。令人感兴趣地，AlloHSC-γδT细胞表达的NKp30和NKp44的水平(图8B)高于内源性γδT细胞，这表明AlloHSC-γδT细胞可能具有强于内源性γδT并甚至内源性NK细胞的增强的NK路径肿瘤杀伤能力。
图9显示了来自体外功效和MOA研究-AlloHSC-γδT细胞的数据。γδT细胞最有吸引力的特征之一在于它们可以通过多种机制攻击肿瘤，包括γδTCR介导和NK受体介导的途径。因此，我们建立了体外肿瘤细胞杀伤测定来研究这种肿瘤杀伤能力(图9A)。人肿瘤细胞系被工程化成过表达萤火虫萤光素酶(Fluc)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)双报道分子，以允许用发光读数或流式细胞术测定灵敏测量肿瘤细胞杀伤。本研究中使用多种工程化人肿瘤细胞系作为靶细胞(图9E)，包括黑素瘤细胞系(A375)、多发性骨髓瘤细胞系(MM.1S)、肺癌细胞系(H292-FG)、乳腺癌细胞系(MDA-MB-231)、前列腺癌(PC3-FG)、卵巢癌细胞系(OVCAR3和OVCAR8)、白血病细胞系(K562)。如所预期，AlloHSC-γδT细胞通过自身NK途径有效地杀伤肿瘤细胞，并且肿瘤杀伤功效可以通过添加ZOL进一步增强，指示存在γδTCR介导的杀伤机制(图9B、9C和9D)。
图10显示了来自体内抗肿瘤功效和MOA研究-AlloHSC-γδT细胞的数据。如图10所示，我们使用人卵巢癌异种移植NSG小鼠模型评价了AlloHSC-γδT细胞的体内抗肿瘤功效。将OVCAR3-FG肿瘤细胞经腹膜内(i.p.)接种到NSG小鼠中以形成肿瘤，然后i.p.注射PBMC-NK或AlloHSC-γδT细胞(图10A)。AlloHSC-γδT细胞以与PBMC-NK细胞相似或更高的功效有效地抑制肿瘤生长，如由时程活体动物生物发光成像(BLI)监测所证实(图10B和10C)。
图11显示了来自体外功效和MOA研究-AlloBCAR-γδT细胞的数据。如图11所示，同种异体HSC工程化B细胞成熟抗原(BCMA)靶向性CAR武装γδT(AlloBCAR-γδT)细胞的肿瘤攻击效力使用如先前所述已建立的体外肿瘤杀伤测定进行研究(图11A)。本研究中包括两种人肿瘤细胞系：1)人MM细胞系MM.1S，它是BCMA+并且充当CAR介导的杀伤的靶标；2)人黑素瘤细胞系A375，它是BCMA-并充当CAR介导的杀伤的阴性对照靶标。这两种人肿瘤细胞系均被工程化成过表达萤火虫萤光素酶(Fluc)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)双报道分子，然后将所得的MM.1S-FG和A375-FG细胞系用于研究。与AlloHSC-γδT细胞类似，AlloBCAR-γδT细胞以特定功效杀伤BCMA-A375-FG细胞，大概是通过CAR非依赖性NK杀伤路径；在ZOL的存在下，肿瘤杀伤功效进一步增强，可能是通过添加gdTCR杀伤路径(图11B)。更重要地，当使用BCMA+肿瘤系MM测试时，AlloBCAR-γδT细胞以优于HSC-γδT且与常规BCAR-T细胞相当的功效有效地杀伤肿瘤细胞(图11C)。总之，这些结果提供了AlloBCAR-γδT细胞可以使用三种机制靶向人肿瘤细胞的证据：1)CAR依赖性路径，2)γδTCR-依赖性路径，以及3)NK路径(图11D)。AlloBCAR-γδT细胞的这种独特的三重靶向性能力很有吸引力，因为它可以潜在地规避抗原逃逸(自体CAR-T疗法临床试验中所报道的现象)，其中肿瘤细胞下调其CAR靶向性抗原的表达以逃避CAR-T细胞的攻击。
图12显示了来自体内抗肿瘤功效研究-AlloBCAR-γδT细胞的数据。如图12所示，使用已建立的MM.1S-FG异种移植NSG小鼠模型研究了AlloBCAR-γδT细胞的体内抗肿瘤功效；常规BCAR-T细胞包括在内作为对照。在低肿瘤负荷条件下(图12A)，AlloBCAR-γδT细胞与BCAR-T细胞一样有效地消除了MM肿瘤细胞(图12B和12D)；然而，尽管无肿瘤，但用BCAR-T细胞治疗的实验小鼠最终死于移植物抗宿主病(GvHD)，而用AlloBCAR-γδT细胞治疗的实验小鼠在无肿瘤和无GvHD的情况下长期生存(图12C)。
图13显示了来自体内抗肿瘤功效研究-AlloBCAR-γδT细胞联合ZOL治疗的数据。如图13所示，还使用已建立的MM.1S-FG异种移植NSG小鼠模型在高肿瘤负荷条件下研究了AlloBCAR-γδT细胞联合ZOL治疗的体内抗肿瘤功效。ZOL治疗被包括在内，以测试通过γδTCR刺激对AlloBCAR-γδT细胞的抗肿瘤功效的可能增强。AlloBCAR-γδT细胞显著地抑制肿瘤生长(图13A)；ZOL治疗进一步增强了功效(图13B-13D)。这一结果表明，与ZOL治疗联合可以进一步增强AlloBCAR-γδT细胞的抗肿瘤功效。由于ZOL是临床可用的小分子药物，因此AlloBCAR-γδT细胞和ZOL联合疗法的潜能是可行和有吸引力的。
图14显示了来自IL-15增强的AlloBCAR-γδT细胞(表示为Allo15BCAR-γδT细胞)的生成和表征的研究的数据。IL-15是支持许多免疫细胞(包括许多T细胞和NK细胞的亚型)的体内持久性和功能的关键细胞因子；因此，我们研究了在AlloBCAR-T细胞产品中包括IL-15的可能益处。构建Lenti/BCAR-IL15-γδT慢病毒载体以共同递送BCAR、IL-15和γδTCR基因(图14A)。将CB衍生的CD34+HSC用Lenti/BCAR-IL15-γδT载体转导，然后放入已建立的无饲养物离体HSC-γδT分化培养物中(图14A)。Allo15BCAR-γδT细胞遵循分化路径并且以与基础AlloBCAR-γδT细胞相似的产率成功地产生(图14A&14B)。重要地，与基础AlloBCAR-γδT细胞相比，IL-15增强的Allo15BCAR-γδT细胞显示出显著改善的体内持久性，并且当遇到预建立的MM肿瘤时，显示出显著改善的抗肿瘤应答(例如，体内克隆扩增；图14C-14E)。
图15显示了来自免疫原性研究-AlloHSC-γδT和AlloBCAR-γδT细胞的数据。如图15所示，对于同种异体细胞疗法，存在着两个免疫原性问题：a)移植物抗宿主(GvH)应答，和b)宿主抗移植物(HvG)应答。GvHD是主要的安全性问题。然而，由于γδT细胞不与不匹配的HLA分子和蛋白质自身抗原发生反应，因此预计它们不诱导GvHD。这一概念由同种异体HSC转移和自体γδT细胞转移的人类临床经验中GvHD的缺乏得到证实，并且受到我们的体外混合淋巴细胞培养(MLC)测定的支持(图15A)。需注意，PBMC-γδT细胞或AlloHSC-γδT细胞均不对同种异体PBMC作出应答，这与常规PBMC-T细胞形成鲜明对照(图15B)。另一方面，HvG风险在很大程度上是通过宿主免疫细胞(主要是通过识别不匹配的HLA-I和HLA-II分子的常规CD8和CD4αβT细胞)对同种异体治疗性细胞的消除而介导的功效问题。实际上，在体外混合淋巴细胞培养(MLC)测定中(图15C)，常规PBMC-T和PBMC-γδT细胞均触发多个不匹配供体的PBMC-T细胞的显著应答(图15D)。令人感兴趣地，AlloHSC-γδT细胞显示出降低的免疫原性，可能归因于它们的低HLA-I/II表达水平(图15E和15F)。总之，这些结果强烈支持AlloHSC-γδT细胞作为无GvHD且抵抗HvG的现成细胞疗法的理想候选者。
图16提供了来自比较研究-AlloHSC-γδT细胞产品的独特特性的数据。现有的生成人γδT细胞产品的方法主要依赖于由人PBMC扩增γδT细胞。这种培养方法开始和结束于含有人γδT细胞以及其他细胞，特别是在转移到同种异体受者时可能致使GvHD的异质性常规αβT(Tc)细胞的混合细胞群(图16)。因此，该方法需要纯化步骤以制备“现成”γδT细胞产品，以便避免GvHD。在此，AlloHSC-γδT细胞培养在两个方面是独特的：1)其不支持生成随机重排的αβTCR重组，以产生随机重排的内源性αβTCR，由此没有GvHD风险；2)其支持转基因AlloHSC-γδT细胞的同步分化，由此消除了存在的未分化祖细胞和其他免疫细胞谱系。因此，AlloHSC-γδT细胞产品较纯、同质，无GvHD风险，因此在该方法中不需要细胞纯化/分选步骤。
我们建立了体外SARS-CoV-2感染模型(图17A-D)，以探索AlloHSC-γδT细胞对COVID-19的治疗潜能。SARS-CoV-2主要通过使用病毒刺突(S)蛋白与细胞表面ACE2(血管紧张素转化酶2)结合来进入宿主人细胞；因此，我们使用两种ACE2阳性人细胞作为靶细胞：一种是经工程化成过表达ACE2的293T人上皮细胞系，另一种是天然表达ACE2的Calu-3人肺上皮细胞系(图17A，B)。这些细胞系被进一步工程化成过表达萤火虫萤光素酶和增强型绿色荧光蛋白双报道分子(FG)，以允许使用发光读数灵敏测量细胞活力(图17A)。AlloHSC-γδT细胞有效地杀伤具有SARS-CoV-2感染的293T-ACE2-FG和Calu-3-FG靶细胞两者；在没有病毒感染的情况下未观察到靶细胞杀伤(图17D)。值得注意的是，单独的SARS-CoV-2感染不影响ACE2阳性靶细胞的活力(图17D)。
特别值得注意的是，在特定细胞或细胞群实施方案的上下文中所讨论的任何实施方案可相对于任何其他细胞或细胞群实施方案被采用。此外，在特定方法的上下文中所采用的任何实施方案可以在本文所述的任何其他方法的上下文中实现。此外，可以组合本文所述的不同方法的各方面，以便实现其他方法，以及创建或描述任何细胞或细胞群的用途。特别预期一个或多个实施方案的各方面可以与本文所述的一个或多个其他实施方案的各方面组合。此外，本文所述的任何方法均可表述为陈述本文所述的细胞或细胞群的一种或多种用途。例如，可以由本文所述的任何方法陈述工程化γδT细胞或γδT细胞群的用途。
在特定实施方案中，存在表达至少一种γδT细胞受体(γδTCR)和外源性自杀基因产物的工程化γδT细胞，其中至少一种γδTCR在重组修饰的启动子区的转录控制之下由外源性核酸和/或由内源性γδTCR基因表达。可以采用本领域的自杀基因使用方法，如美国专利No.8628767、美国专利申请公开20140369979、美国20140242033和美国20040014191中，所有这些全文以引用方式并入。在另一些实施方案中，TK基因是病毒TK基因，即，来自病毒的TK基因。在特定实施方案中，TK基因是单纯疱疹病毒TK基因。在一些实施方案中，自杀基因产物由底物激活。胸苷激酶是由更昔洛韦、喷昔洛韦或它们的衍生物激活的自杀基因产物。在某些实施方案中，将激活自杀基因产物的底物标记以便进行检测。在某些情况下，可以标记底物以进行成像。在一些实施方案中，自杀基因产物可以由编码TCR-γ或TCR-δ中的一者或两者的相同或不同的核酸分子编码。在某些实施方案中，自杀基因是sr39TK或诱导型半胱天冬酶9。在替代的实施方案中，细胞不表达外源性自杀基因。
在额外的实施方案中，工程化γδT细胞缺乏或者具有降低的至少一种HLA-I或HLA-II分子的表面表达。在一些实施方案中，HLA-I和/或HLA-II分子的表面表达的缺乏通过破坏编码单独HLA-I/II分子的基因，或者通过破坏编码B2M(β2微球蛋白，即所有HLA-I复合体分子的共同组分)的基因，或者通过破坏编码CIITA(II类主要组织相容性复合体反式激活蛋白，即控制所有HLA-II基因表达的关键转录因子)的基因来实现。在具体实施方案中，细胞缺乏一种或多种HLA-I和/或HLA-II分子的表面表达，或者表达的此类分子的水平下降(或者至少)50、60、70、80、90、100％(或其中可导出的任何范围)。在一些实施方案中，HLA-I或HLA-II不在γδT细胞中表达，因为该细胞通过基因编辑来操纵。在一些实施方案中，所涉及的基因编辑是CRISPR-Cas9。代替Cas9，可能涉及CasX或CasY。锌指核酸酶(ZFN)和TALEN，以及Cpf1是其他基因编辑技术，所有这些均可以采用。在其他实施方案中，γδT细胞包含一种或多种不同的siRNA或miRNA分子，这些分子旨在降低HLA-I/II分子、B2M和/或CIITA的表达。
在一些实施方案中，本发明的γδT细胞包含重组载体或者来自引入细胞中的重组载体的核酸序列。在某些实施方案中，重组载体是或者曾经是病毒载体。在另一些实施方案中，病毒载体是或者曾经是慢病毒、逆转录病毒、腺相关病毒(AAV)、疱疹病毒或腺病毒。应当理解，某些病毒载体的核酸整合到宿主基因组序列中。
在一些实施方案中，本发明的γδT细胞在生长和分化期间设置在选定的培养基条件中(例如，不设置在包含动物血清的培养基中)。在另一些实施方案中，γδT细胞被或者曾经被冷冻。在一些实施方案中，γδT细胞先前被冷冻，并且使先前冷冻的细胞在室温下稳定至少一小时。在一些实施方案中，γδT细胞先前被冷冻，并且使先前冷冻的细胞在室温下稳定至少1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、24、30或48小时(或其中任何可导出的范围)。在某些实施方案中，溶液中的γδT细胞或γδT细胞群包含右旋糖、一种或多种电解质、白蛋白、葡聚糖、和/或DMSO。在另一个实施方案中，细胞处于无菌、无热原(nonpyogenic)和等渗的溶液中。
在涉及多个细胞的实施方案中，γδT细胞群可以包含、至少包含或至多包含约102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015个细胞或更多(或其中可推导的任何范围)，在一些实施方案中，该细胞是工程化γδT细胞。在一些情况下，细胞群包含至少约106-1012个工程化γδT细胞。在一些实施方案中，预期具有这些数量的细胞群产生自单批次细胞，而不是合并批次的单独产生的细胞的结果。
在具体实施方案中，存在T细胞群，该T细胞群包含：包含编码γδT细胞受体和胸苷激酶自杀基因产物的一种或多种外源性核酸的克隆γδT细胞，其中克隆γδT细胞被工程化成不表达功能性β-2微球蛋白(B2M)和/或II类主要组织相容性复合体或反式激活蛋白(CIITA)，并且其中细胞群为至少约106-1012个总细胞，并且包含至少约102-106个工程化γδT细胞。在某些情况下，细胞在溶液中冷冻。
多个实施方案涉及制备γδT细胞或细胞群的方法，特别是其中一些或全部细胞是克隆性的群体。在某些实施方案中，细胞群包含如下细胞：其中至少或至多50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％(或其中可推导的任何范围)的细胞是克隆的，即，群体中与另一个细胞衍生自同一祖先细胞的细胞的百分比。在其他实施方案中，细胞群包含由来自于、至少来自于或至多来自于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、7、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100种(或其中可推导的任何范围)不同的亲本细胞的细胞构成的细胞群。
提供了用于制备、制作、制造以及使用工程化γδT细胞和γδT细胞群的方法。在实施方案中，方法包括以下步骤中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个：获得多能细胞；获得造血祖细胞；获得能够变成一个或多个造血细胞的祖细胞；获得能够变成γδT细胞的祖细胞；使用一种或多种细胞表面标志物从混合细胞群中选择细胞；从细胞群中选择CD34+细胞；从细胞群中分离CD34+细胞；使CD34+与CD34-细胞彼此分离；基于CD34以外或之外的细胞表面标志物，对细胞进行选择；将编码γδT细胞受体(TCR)的一种或多种核酸引入细胞中；用编码γδT细胞受体(TCR)的病毒载体感染细胞；用编码γδT细胞受体(TCR)的一种或多种核酸转染细胞；用编码γδT细胞受体(TCR)的表达构建体转染细胞；将编码γδT细胞受体(TCR)的外源性核酸整合到细胞的基因组中；将编码自杀基因产物的一种或多种核酸引入细胞中；用编码自杀基因产物的病毒载体感染细胞；用编码自杀基因产物的一种或多种核酸转染细胞；用编码自杀基因产物的表达构建体转染细胞；将编码自杀基因产物的外源性核酸整合到细胞的基因组中；将编码一种或多种多肽的一种或多种核酸和/或用于基因编辑的核酸分子引入细胞中；用编码一种或多种多肽的病毒载体和/或用于基因编辑的核酸分子感染细胞；用编码一种或多种多肽的一种或多种核酸和/或用于基因编辑的核酸分子转染细胞；用编码一种或多种多肽的表达构建体和/或用于基因编辑的核酸分子转染细胞；整合编码一种或多种多肽的外源性核酸和/或用于基因编辑的核酸分子；编辑细胞的基因组；编辑细胞的启动子区；编辑γδTCR基因的启动子和/或增强子区；消除一个或多个基因的表达；消除分离的人CD34+细胞中一种或多种HLA-I/II基因的表达；将一种或多种用于基因编辑的核酸转染到细胞中；培养分离或选择的细胞；扩增分离或选择的细胞；培养针对一种或多种细胞表面标志物选择的细胞；培养分离的表达γδTCR的CD34+细胞；扩增分离的CD34+细胞；在产生或扩增γδT细胞的条件下培养细胞；在人工胸腺类器官(ATO)系统中培养细胞以产生γδT细胞；在无血清培养基中培养细胞；在ATO系统中培养细胞，其中ATO系统包含含有表达Notch配体的所选定基质细胞群的3D细胞聚集体，以及无血清培养基。在一个实施方案中，特别地预期可以排除一个或多个步骤。
在一些实施方案中，存在制备克隆γδT细胞群的方法，该方法包括：a)从人外周血细胞(PBMC)中选择CD34+细胞；b)引入编码人γδT细胞受体(TCR)的一种或多种核酸；c)消除分离的人CD34+细胞中的一种或多种HLA-I/II基因的表面表达；以及d)培养表达γδTCR的分离的CD34+细胞(例如在人工胸腺类器官系统中)以产生γδT细胞。典型地，ATO系统包含含有表达Notch配体的选定基质细胞群的3D细胞聚集体，以及无血清培养基。
可以用于创建工程化γδT细胞的多能细胞包括CD34+造血祖干细胞。细胞可来自于外周血单个核细胞(PBMC)、骨髓细胞、胎儿肝细胞、胚胎干细胞、脐带血细胞、诱导多能干细胞(iPS细胞)或它们的组合。在一些实施方案中，该方法包括分离CD34-细胞或者分离CD34-和CD34+细胞。虽然实施方案涉及进一步操纵CD34+细胞，但CD34-细胞可用于创建γδT细胞。因此，在一些实施方案中，CD34-细胞后续被使用，并且可以为此目而储存。
某些方法涉及在将一种或多种核酸引入细胞中之前在培养基中培养选定的CD34+细胞。培养细胞可以包括将选定的CD34+细胞与包含一种或多种生长因子的培养基一起温育。在一些实施方案中，一种或多种生长因子包含c-kit配体、flt-3配体、和/或人血小板生成素(TPO)。在另一些实施方案中，培养基包括c-kit配体、flt-3配体和TPO。在一些实施方案中，关于每种生长因子或任何和所有这些特定生长因子的总和，一种或多种生长因子的浓度为约5ng/ml至约500ng/ml。培养基中单一生长因子或生长因子的组合的浓度可以为约、至少约或至多约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、410、420、425、430、440、441、450、460、470、475、480、490、500(或可推导的任何范围)ng/ml或μg/ml或更大。
在典型的实施方案中，核酸可以包含编码如本文所讨论的γ-TCR和/或δ-TCR的核苷酸序列。在某些实施方案中，一种核酸编码TCR的γ链和δ链两者。在一些实施方案中，另一种核酸可以包含编码α-TCR和/或β-TCR多肽、和/或一种或多种iNKT TCR多肽的核酸序列。在额外的实施方案中，核酸还包含编码自杀基因产物的核酸序列。在一些实施方案中，引入选定CD34+细胞中的核酸分子编码TCR和自杀基因产物。在其他实施方案中，方法还涉及将编码自杀基因产物的核酸引入选定的CD34+细胞中，在这种情况下，与编码TCR基因中的至少一种的核酸不同的核酸分子编码自杀基因产物。
如上所讨论，在一些实施方案中，γδT细胞不在细胞表面上表达HLA-I和/或HLA-II分子，这可以通过破坏编码β-2-微球蛋白(B2M)、反式激活蛋白(CIITA)或HLA-I和HLA-II分子的基因的表达来实现。在某些实施方案中，方法涉及消除分离的人CD34+细胞中一种或多种HLA-I/II分子的表面表达。在特定实施方案中，消除表达可以通过细胞的基因组DNA的基因编辑来实现。一些方法包括将对应于B2M或CIITA的CRISPR和一种或多种向导RNA(gRNA)引入细胞中。在特定实施方案中，CRISPR或一种或多种gRNA通过电穿孔或脂质介导的转染而转染到细胞中。因此，方法可以涉及通过用编码CRISPR和一种或多种gRNA的一种或多种核酸转染细胞而将CRISPR和一种或多种gRNA引入细胞中。在一些实施方案中，可以采用不同的基因编辑技术。
类似地，在一些实施方案中，将编码TCR受体的一种或多种核酸引入细胞中。这可以通过用重组载体转染或感染细胞来完成，重组载体可以或者可以不是如本文所讨论的病毒载体。在一些实施方案中，外源性核酸可以掺入细胞的基因组中。
在一些实施方案中，细胞在无细胞培养基中培养。在某些实施方案中，无血清培养基还包含外部添加的抗坏血酸。在特定实施方案中，方法涉及添加抗坏血酸培养基。在另一些实施方案中，无血清培养基还包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15种或所有16种(或其中可推导的范围)以下外部添加的组分：FLT3配体(FLT3L)、白介素7(IL-7)、干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)、IL-2、IL-4、IL-6、IL-15、IL-21、TNF-α、TGF-β、干扰素-γ、干扰素-λ、TSLP、胸腺五肽、多效生长因子或中期因子。在额外的实施方案中，无血清培养基包含一种或多种维生素。在一些情况下，无血清培养基包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12种以下维生素(或其中可导出的任何范围)：包含生物素、DLα生育酚醋酸酯、DLα生育酚、维生素A、氯化胆碱、泛酸钙、泛酸、叶酸烟酰胺、吡哆醇、核黄素、硫胺素、肌醇、维生素B12或其盐。在某些实施方案中，培养基包含或者至少包含生物素、DLα生育酚醋酸酯、DLα生育酚、维生素A或其组合或盐。在额外的实施方案中，无血清培养基包含一种或多种蛋白质。在一些实施方案中，无血清培养基包含1、2、3、4、5、6种或更多种(或其中可推导的任何范围)的以下蛋白质：白蛋白或牛血清白蛋白(BSA)、BSA的一部分、过氧化氢酶、胰岛素、转铁蛋白、超氧化物歧化酶或其组合。在其他实施方案中，无血清培养基包含1、2、3、4、5、7、8、9、10或11种以下化合物：皮质酮、D-半乳糖、乙醇胺、谷胱甘肽、L-肉碱、亚油酸、亚麻酸、孕酮、腐胺、亚硒酸钠或三碘-I-甲状腺原氨酸或其组合。在另一些实施方案中，无血清培养基包含补充剂、无异源(xeno-free)/>补充剂、GS21TM补充剂或其组合。在额外的实施方案中，无血清培养基包含或者进一步包含氨基酸、单糖、和/或无机离子。在一些方面，无血清培养基包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13种以下氨基酸：精氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸或缬氨酸或其组合。在其他方面，无血清培养基包含1、2、3、4、5或6种以下无机离子：钠、钾、钙、镁、氮或磷或其组合或盐。在额外的方面，无血清培养基包含1、2、3、4、5、6或7种以下元素：钼、钒、铁、锌、硒、铜或锰或其组合。
在一些方法中，细胞在人工胸腺类器官(ATO)系统中培养。ATO系统涉及三维(3D)细胞聚集体，它是细胞的聚集体。在某些实施方案中，3D细胞聚集体包含表达Notch配体的选定基质细胞群。在一些实施方案中，3D细胞聚集体通过在物理基体或支架上使CD34+转导的细胞与选定基质细胞群混合而创建。在另一些实施方案中，方法包括对CD34+转导的细胞和基质细胞进行离心，以形成置于物理基体或支架上的细胞沉淀。在某些实施方案中，基质细胞表达Notch配体，即完整、部分或经修饰的DLL1、DLL4、JAG1、JAG2或其组合。在另一些实施方案中，Notch配体是人Notch配体。在其他实施方案中，Notch配体是人DLL1。
本公开的方法可以产生包含至少1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017、1×1018、1×1019、1×1020或1×1021个(或其中任何可导出的范围)可以表达标志物或具有高或低水平的特定标志物的细胞的细胞群(例如，经由分化和/或扩增步骤)。细胞群数量可以是在不采用基于标志物表达的细胞分选或者不采用基于γδT细胞标志物表达的细胞分选或者不采用基于T细胞标志物表达的细胞分选的情况下实现的细胞群数量。在一些实施方案中，细胞群大小可以是在不采用基于抗原与异源靶向性元件如CAR、TCR、BiTE或其他异源肿瘤靶向剂的结合的细胞分选的情况下实现的细胞群大小。此外，所实现的细胞群可以包含至少1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017、1×1018、1×1019、1×1020或1×1021个(或其中任何可导出的范围)细胞，该细胞在特定时间段内，如至少、至多或确切地10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41天或7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30周(或其中任何可导出的范围)的时间段内制备。
在一些实施方案中，方法中所用的饲养细胞包含CD34-细胞。这些CD34-细胞可以来自选择用于CD34+细胞的相同细胞群。在额外的实施方案中，可以使细胞激活。在某些实施方案中，方法包括使γδT细胞激活。在具体实施方案中，将γδT细胞用ZOL激活和扩增。可以将细胞与ZOL一起温育或培养，以便激活和扩增它们。在一些实施方案中，将饲养细胞用ZOL脉冲。
细胞可以立即使用，或者它们可储存以备将来使用。在某些实施方案中，将用于创建γδT细胞的细胞冷冻，而在一些实施方案中，可以将所产生的γδT细胞冷冻。在一些方面，细胞处于包含右旋糖、一种或多种电解质、白蛋白、葡聚糖和DMSO的溶液中。在其他实施方案中，细胞处于无菌、无热原和等渗的溶液中。在一些实施方案中，工程化γδT细胞衍生自造血干细胞。在一些实施方案中，工程化γδT细胞衍生自G-CSF动员的CD34+细胞。在一些实施方案中，细胞衍生自未患癌症的人患者的细胞。在一些实施方案中，细胞不表达内源性TCR。
由一个生产周期产生的细胞数量可以为约、至少约或至多约102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015个细胞或更多(或其中可导出的任何范围)，其在一些实施方案中为工程化γδT细胞。在一些情况下，细胞群包含至少约106-1012个工程化γδT细胞。在一些实施方案中，预期具有这些数量的细胞群产生自单批次细胞，而不是合并批次的单独产生的细胞的结果——即，来自单个生产周期。在一些实施方案中，将细胞群冷冻并然后解冻。细胞群可用于创建工程化γδT细胞，或者它们可以包含工程化γδT细胞。
在一些实施方案中，方法包括将一种或多种额外的核酸引入细胞群中，这些细胞可能或可能没有先前被冷冻和解冻。这种用途提供了创建现成γδT细胞的优势之一。在特定实施方案中，一种或多种额外的核酸编码一种或多种治疗性基因产物。治疗性基因产物的实例包括至少以下项：1.抗原识别分子，例如CAR(嵌合抗原受体)和/或TCR(T细胞受体)；2.共刺激分子，例如CD28、4-1BB、4-1BBL、CD40、CD40L、ICOS；和/或3.细胞因子，例如IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-9、IL-15、IL-12、IL-17、IL-21、IL-23、IFN-γ、TNF-α、TGF-β、G-CSF、GM-CSF；4.转录因子，例如T-bet、GATA-3、RORγt、FOXP3和Bcl-6。包括治疗性抗体，如嵌合抗原受体、单链抗体、单体、人源化抗体、双特异性抗体、单链FV抗体或它们的组合。
在一些实施方案中，存在通过包括以下的方法产生的工程化γδT细胞：a)从人外周血细胞(PBMC)中选择CD34+细胞；b)用包含生长因子如c-kit配体、flt-3配体和人血小板生成素(TPO)等的培养基来培养CD34+细胞；c)用包含编码γ-TCR、δ-TCR、胸苷激酶和报告基因产物的核酸序列的慢病毒载体转导选定的CD34+细胞；d)将针对β2微球蛋白(B2M)和/或CTIIA的Cas9和gRNA引入选定的CD34+细胞中，以消除B2M或CTIIA的表达；e)将转导的细胞与表达外源性Notch配体的辐照的基质细胞系一起培养2-10周，以在3D聚集体细胞培养物中扩增γδT细胞；f)选择缺乏B2M和/或CTIIA表达的γδT细胞；以及g)将选定的γδT细胞用辐照的饲养细胞培养。
在特定实施方案中，由转导的细胞(例如HSPC)产生的γδT细胞被进一步修饰成具有一种或多种特征，包括使细胞适于同种异体使用，或者比如果细胞未进一步修饰成具有一个或多个特征更适于同种异体使用。本公开可根据期望涵盖适于同种异体使用的UHSC-γδT细胞。在一些实施方案中，HSC-γδT细胞是非同种异体反应性的并且表达外源性γδTCR。这些细胞可用于“现成”细胞疗法，并且不需要使用患者自身的γδT细胞或其他细胞。因此，当前的方法提供了更具成本效益、更低劳动密集型的细胞免疫疗法。
在具体实施方案中，HSC-γδT细胞被工程化为HLA阴性，以实现安全和成功的同种异体移植，而不引起移植物抗宿主病(GvHD)以及被宿主免疫细胞排斥(HvG排斥)。在具体实施方案中，同种异体HSC-γδT细胞不表达内源性TCR并且不引起GvHD，因为转基因γδTCR基因的表达通过等位排斥来阻断内源性TCR的重组。在特定实施方案中，同种异体UHSC-γδT细胞不在细胞表面表达HLA-I和/或HLA-II分子，并抵抗宿主CD8+和CD4+T细胞介导的同种异体移植物消减和sr39TK免疫原靶向性消减。因此，在某些实施方案中，工程化γδT细胞不表达表面HLA-I或-II分子，这是通过破坏编码与HLA-I/II表达相关的蛋白质(包括但不限于β-2-微球蛋白(B2M)、主要组织相容性复合体II反式激活蛋白(CIITA)或HLA-I/II分子)的基因实现的。在某些情况下，HLA-I或HLA-II不在γδT细胞表面表达，因为这些细胞通过可以涉及或可以不涉及CRISPR-Cas9的基因编辑来操纵。
在其中γδT细胞被修饰成表现出任何种类的一种或多种特征的情况下，γδT细胞可以包含来自引入细胞中的重组载体的核酸序列。载体可以是非病毒载体，如质粒，或病毒载体，如慢病毒、逆转录病毒、腺相关病毒(AAV)、疱疹病毒或腺病毒。
本发明的γδT细胞在其产生之前、期间或之后可以或可以不暴露于一种或多种特定条件。在特定情况下，细胞未或未曾暴露于包含动物血清的培养基。可以将细胞冷冻。细胞可以存在于包含右旋糖、一种或多种电解质、白蛋白、葡聚糖、和/或DMSO的溶液中。其中存在细胞的任何溶液可以为无菌、无热原和等渗的溶液。细胞可以通过任何合适的方式激活和扩增，如用例如ZOL激活。
本公开的方面涉及人细胞，该人细胞包含以下项的i)外源性表达或活性抑制剂；或ii)基因组突变：β2微球蛋白(B2M)、CIITA、TRAC、TRBC1或TRBC2中的一种或多种。在一些实施方案中，细胞包含基因组突变。在一些实施方案中，基因组突变包含细胞的基因组中一种或多种内源性基因的突变，其中一种或多种内源性基因包含B2M、CIITA、TRAC、TRBC1或TRBC2基因。在一些实施方案中，突变包含功能丧失的突变。在一些实施方案中，抑制剂是表达抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂包含抑制性核酸。在一些实施方案中，抑制性核酸包含siRNA、shRNA、miRNA或反义分子中的一种或多种。在一些实施方案中，细胞包含活性抑制剂。在一些实施方案中，在修饰后，细胞缺乏B2M、CIITA、TRAC、TRBC1或TRBC2蛋白中的一种或多种的任何可检测表达。在一些实施方案中，细胞包含B2M的抑制剂或基因组突变。在一些实施方案中，细胞包含CIITA的抑制剂或基因组突变。在一些实施方案中，细胞包含TRAC的抑制剂或基因组突变。在一些实施方案中，细胞包含TRBC1的抑制剂或基因组突变。在一些实施方案中，细胞包含TRBC2的抑制剂或基因组突变。在一些实施方案中，至少90％的编码B2M、CIITA、TRAC、TRBC1、和/或TRBC2的基因组DNA缺失。在一些实施方案中，至少或至多5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99或100％(或其中可导出的任何范围)的编码B2M、CIITA、TRAC、TRBC1、和/或TRBC2的基因组DNA缺失。在其他实施方案中，在基因组DNA中进行缺失、插入、和/或取代。在一些实施方案中，细胞是人干细胞或祖细胞的后代。
可以通过任何合适的方式对修饰为HLA阴性的UHSC-γδT细胞进行遗传修饰。可以通过本领域已知的方法引入本公开的遗传突变，例如CIITA和/或B2M基因中的那些。在某些实施方案中，工程化核酸酶可用于引入外源性核酸序列以对本文提及的任何细胞进行遗传修饰。基因组编辑或工程化核酸酶的基因组编辑(genome editing with engineerednucleases，GEEN)是其中使用人工工程化核酸酶或“分子剪刀”将DNA插入、替换或从基因组中移除的一种类型的基因工程。核酸酶在基因组中期望的位置处创建特定的双链断裂(DSB)，并利用细胞的内源机制来修复由同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)的自然过程所诱导的断裂。非限制性工程化核酸酶包括锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas9系统，以及工程化大范围核酸酶再工程化的归巢核酸内切酶。本领域已知的任何工程化核酸酶均可用于方法和组合物的某些方面。
在其中工程化γδT细胞包含一种或多种自杀基因以后续根据需要消减的情况下，自杀基因可以为任何合适的种类。本公开的γδT细胞可以表达例如可基于酶的自杀基因产物。自杀基因产物的实例包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、胞嘧啶脱氨酶(CD)、羧肽酶G2、细胞色素P450、亚麻苦苷酶、β-内酰胺酶、硝基还原酶(NTR)、羧肽酶A或诱导型半胱天冬酶9。因此，在特定情况下，自杀基因可以编码胸苷激酶(TK)。在特定情况下，TK基因是病毒TK基因，如单纯疱疹病毒TK基因。在特定实施方案中，将自杀基因产物用底物如更昔洛韦、喷昔洛韦或它们的衍生物激活。
在一些实施方案中，工程化γδT细胞能够成像或以其他方式检测。在特定情况下，细胞包含编码多肽的外源性核酸，该多肽具有可以标记以供成像的底物，并且成像可以为荧光的、放射性的、比色的等等。在特定情况下，通过正电子发射断层扫描检测细胞。至少在某些情况下，细胞表达sr39TK基因，即正电子发射断层扫描(PET)报告基因/胸苷激酶基因，其允许利用PET成像追踪这些遗传修饰细胞并通过sr39TK自杀基因功能消除这些细胞。
本公开涵盖工程化γδT细胞群。在特定方面，γδT克隆细胞包含编码γδT细胞受体的外源性核酸并且缺乏一种或多种HLA-I或HLA-II分子的表面表达。γδT细胞可以包含编码自杀基因的外源性核酸，包括基于酶的自杀基因，如胸苷激酶(TK)。TK基因可以为病毒TK基因，如单纯疱疹病毒TK基因。在群体的细胞中，可以将自杀基因用底物如更昔洛韦、喷昔洛韦或它们的衍生物激活。细胞可以包含编码多肽的外源性核酸，该多肽具有可以标记以供成像的底物，并且在一些情况下，自杀基因产物是具有可以标记以供成像的底物的多肽。在具体方面，自杀基因为sr39TK。在γδT细胞群的特定情况下，γδT细胞包含来自引入细胞中的重组载体如病毒载体(至少包括慢病毒、逆转录病毒、腺相关病毒(AAV)、疱疹病毒或腺病毒)的核酸序列。
在某些实施方案中，γδT细胞群的细胞可以或可以未曾暴露于，或正暴露于一种或多种特定条件。在某些情况下，例如，群体的细胞未暴露于或者未曾暴露于包含动物血清的培养基。群体的细胞可以冷冻或可以不冷冻。在一些情况下，群体的细胞处于包含右旋糖、一种或多种电解质、白蛋白、葡聚糖、和/或DMSO的溶液中。该溶液可以包含右旋糖、一种或多种电解质、白蛋白、葡聚糖和DMSO。细胞可以处于无菌、无热原和等渗的溶液中。在特定情况下，γδT细胞已被激活，如用ZOL激活。在具体方面，细胞群包含至少约102-106个克隆细胞。在一些情况下，细胞群可以包含至少约106-1012个总细胞。
在特定实施方案中，存在gamma delta(γδ)T细胞群，该γδT细胞群包含：包含编码γδT细胞受体和胸苷激酶自杀基因的一种或多种外源性核酸的克隆γδT细胞，其中克隆γδT细胞被工程化成不表达功能性β-2微球蛋白(B2M)、主要组织相容性复合体II类反式激活蛋白(CIITA)、和/或HLA-I和HLA-II分子，并且其中细胞群为至少约106-1012个总细胞并且包含至少约102-106个克隆细胞。在一些情况下，使细胞在溶液中冷冻。
在特定实施方案中，UHSC-γδT细胞和/或其前体可特定地配制，并且/或者可以将它们在生成UHSC-γδT细胞的过程的任何阶段在特定培养基中培养(无论它们是否存在于体外ATO培养系统中)。可以将细胞以适于递送给受者而无有害效应的方式配制。
某些方面中的培养基可以使用用于培养动物细胞的培养基作为其基础培养基进行制备，如AIM V、X-VIVO-15、NeuroBasal、EGM2、TeSR、BME、BGJb、CMRL 1066、Glasgow MEM、Improved MEM Zinc Option、IMDM、Medium 199、Eagle MEM、αMEM、DMEM、Ham、RPMI-1640，以及Fischer的培养基中的任一者，以及它们的任何组合，但只要其可以用于培养动物细胞，培养基可以不特别限于此。特别地，培养基可以为无异源成分或化学成分确定的。
培养基可以为含血清或无血清培养基，或无异源成分培养基。从防止异种动物衍生的组分污染的角度来看，血清可以衍生自与一种或多种干细胞相同的动物。无血清培养基是指不含未经处理或未经纯化血清的培养基，因此可以包括具有经纯化血液衍生的组分或动物组织衍生的组分(如生长因子)的培养基。
培养基可以含有或可以不含有血清的任何替代品。血清的替代品可以包括适当地含有白蛋白(如富含脂质的白蛋白、牛白蛋白、白蛋白替代品，如重组白蛋白或人源化白蛋白、植物淀粉、葡聚糖和蛋白质水解产物)、转铁蛋白(或其他铁转运体)、脂肪酸、胰岛素、胶原前体、微量元素、2-巯基乙醇、3'-硫代甘油或其等同物的材料。血清的替代品可以通过例如国际公开No.98/30679(其全文并入本文)中所公开的方法进行制备。或者，为了更方便，可以使用任何市售材料。市售材料包括knockout血清替代品(KSR)、化学成分确定的脂质浓缩物(Gibco)和Glutamax(Gibco)。
在另一些实施方案中，培养基可以为适于细胞发育的无血清培养基。例如，培养基可以包含有效地用于由3D细胞聚集体产生T细胞的浓度的补充剂、无异源/>补充剂(可获得于万维网，thermofisher.com/us/en/home/technical-resources/media-formulation.250.html)、NS21补充剂(Chen等人,J Neurosci Methods,2008年6月30日；171(2):239–247，其全文并入本文中)、GS21TM补充剂(可获得于万维网，amsbio.com/B-27.aspx)或它们的组合。
表达包含表1中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:52)的多肽的细胞和/或其他γδT细胞可以通过一种或多种任何合适的方法产生。一种或多种方法可以利用一个或多个连续步骤对细胞进行一种或多种修饰，并且/或者利用一个或多个同时步骤对细胞进行一种或多种修饰。在具体实施方案中，细胞的起始来源被修饰成变得具有γδT细胞的功能，继之以向细胞增加一个或多个额外特征的一个或多个步骤，如成像的能力、和/或选择性杀伤的能力、和/或能够被同种异体使用的能力。在具体实施方案中，用于生成UHSC-γδT细胞的过程的至少部分发生在特定的体外培养系统中。特定体外培养系统的一个实例是允许特定细胞以高效率和高产率分化的系统。在具体实施方案中，体外培养系统是人工胸腺类器官(ATO)系统。
在特定情况下，UHSC-γδT细胞可以通过以下方式生成：1)对供体HSC进行遗传修饰以表达γδTCR(例如，经由慢病毒载体)并消除HLA-I/II分子的表达(例如，经由基于CRISPR/Cas9的基因编辑)；2)经由ATO培养在体外分化为γδT细胞，3)体外γδT细胞纯化和扩增，以及4)配制和冷冻保存和/或使用。
本公开的特定实施方案提供了制备克隆性gamma delta(γδ)T细胞群的方法，该方法包括：a)从人外周血细胞(PBMC)中选择CD34+细胞；b)引入编码人γδT细胞受体(TCR)的一种或多种核酸；c)消除分离的人CD34+细胞中的一种或多种HLA-I/II基因的表达；以及d)在人工胸腺类器官(ATO)系统中培养表达γδTCR的分离的CD34+细胞以产生γδT细胞，其中ATO系统包含含有表达Notch配体的选定基质细胞群的3D细胞聚集体以及无血清培养基。该方法可以进一步包括分离CD34-细胞。在替代实施方案中，采用除ATO系统之外的其他培养系统，如2-D培养系统或其他形式的3-D培养系统(例如，FTOC样培养物、基质胶(metrigel)辅助培养物)。
本公开的具体方面涉及新型三维细胞培养系统，以从分化较低的细胞(如胚胎干细胞、多能干细胞、造血干细胞或祖细胞、诱导多能干(iPS)细胞或干细胞或祖细胞)产生γδT细胞。可以利用来自各种资源的任何类型的干细胞，包括至少例如胎肝、脐带血和外周血CD34+细胞(G-CSF-动员的或非G-CSF-动员的)。
在特定实施方案中，该系统涉及使用无血清培养基。在某些方面，该系统使用适于细胞发育的无血清培养基来培养三维细胞聚集体。这样的系统产生足够量的UHSC-γδT细胞。在本公开的实施方案中，将3D细胞聚集体在包含胰岛素的无血清培养基中培养足以使干细胞或祖细胞在体外分化为UHSC-γδT细胞或UHSC-γδT细胞的前体的时间段。
细胞培养组合物的实施方案包括ATO 3D培养物，该培养物使用高度标准化无血清组分和基质细胞系，以利于来自人HSC的稳健且高度可再现的T细胞分化。在某些实施方案中，ATO中的细胞分化密切模拟内源性胸腺发生，并且与单层共培养物形成对照，支持功能性UHSC-γδT的有效阳性选择。3D培养组合物的某些方面使用无血清条件，避免使用人胸腺组织或专有支架材料，并有利于从源细胞中阳性选择和稳健地生成全功能的成熟人UHSC-γδT细胞。
可以将通过制备方法产生的细胞冷冻。所产生的细胞可以处于包含右旋糖、一种或多种电解质、白蛋白、葡聚糖和DMSO的溶液中。溶液可以为无菌、无热原和等渗的。
遗传修饰也可以引入某些组分以生成抗原特异性T细胞，并且模拟阳性和阴性选择。这些修饰的实例包括用编码抗原特异性T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的慢病毒载体转导HSC，以生成抗原特异性、等位基因排除的初始T细胞；用一种或多种基因转导HSC以指导谱系定向到专门淋巴样细胞。例如，用gamma delta(γδ)相关联的TCR转导HSC，以在ATO中生成功能性γδT细胞；用人MHC基因(例如人CD1d基因)转导ATO基质细胞系(例如MS5-hDLL1)，以增强ATO中TCR工程化或非工程化T细胞两者的阳性选择和成熟；并且/或者用抗原加上共刺激分子或细胞因子转导ATO基质细胞系，以增强ATO中CAR T细胞的阳性选择。
在产生工程化γδT细胞中，来自人外周血细胞(PBMC)的CD34+细胞可以通过引入一种或多种特定外源性基因并且通过敲除一种或多种特定内源性基因进行修饰。该方法可以进一步包括在将一种或多种核酸引入细胞中之前在培养基中培养选定的CD34+细胞。在一些情况下，培养可以包含将选定的CD34+细胞与包含一种或多种生长因子的培养基一起温育，并且一种或多种生长因子可以包含例如c-kit配体、flt-3配体和/或人血小板生成素(TPO)。生长因子可以处于或可以不处于特定浓度，如在约5ng/ml至约500ng/ml之间。
在特定方法中，待引入细胞中的一种或多种核酸是包含编码γ-TCR和δ-TCR(例如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:52)的核酸序列的一种或多种核酸。该方法可以包括将编码自杀基因的核酸引入选定细胞中。在具体方面，一种核酸编码γ-TCR和δ-TCR两者，或者一种核酸编码γ-TCR、δ-TCR以及自杀基因。自杀基因可以是基于酶的，如胸苷激酶(TK)，包括病毒TK基因，如来自单纯疱疹病毒TK基因的基因。可以将自杀基因用底物如更昔洛韦、喷昔洛韦或它们的衍生物激活。可以将细胞工程化成包含编码多肽的外源性核酸，该多肽具有可以标记以供成像的底物。在一些情况下，自杀基因产物是具有可以标记以供成像的底物的多肽，如sr39TK。
在制造工程化γδT细胞时，细胞可以存在于特定的无血清培养基中，包括包含外部添加的抗坏血酸的培养基。在具体方面，无血清培养基进一步包含外部添加的FLT3配体(FLT3L)、白介素7(IL-7)、干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、IL-2、IL-4、IL-6、IL-15、IL-21、TNF-α、TGF-β、干扰素-γ、干扰素-λ、TSLP、胸腺五肽、多效生长因子、中期因子或其组合。无血清培养基可以进一步包含维生素，包括生物素、DLα生育酚醋酸酯、DLα生育酚、维生素A、氯化胆碱、泛酸钙、泛酸、叶酸烟酰胺、吡哆醇、核黄素、硫胺素、肌醇、维生素B12或其组合或其盐。无血清培养基可以进一步包含一种或多种外部添加的(或不添加)蛋白质，如白蛋白或牛血清白蛋白、BSA的一部分、过氧化氢酶、胰岛素、转铁蛋白、超氧化物歧化酶或它们的组合。无血清培养基可以进一步包含皮质酮、D-半乳糖、乙醇胺、谷胱甘肽、L-肉碱、亚油酸、亚麻酸、孕酮、腐胺、亚硒酸钠或三碘-I-甲状腺原氨酸或其组合。无血清培养基可以包含补充剂、无异源/>补充剂、GS21TM补充剂或其组合。氨基酸(包括精氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸或缬氨酸，或其组合)、单糖、和/或无机离子(包括例如钠、钾、钙、镁、氮或磷或其组合或盐)可以存在于无血清培养基中。无血清培养基可以进一步包含钼、钒、铁、锌、硒、铜或锰或其组合。
本发明的另一些方面和实施方案在以下部分中讨论。
实施例
人Vγ9Vδ2TCR克隆、序列和基因递送载体
从健康供体外周血单个核细胞(PBMC)衍生的γδT(PBMC-γδT)细胞中克隆人Vγ9Vδ2TCR(本文称为γδTCR)。在以下讨论了本文所公开的方法的例示性工作实施方案以及γδTCR序列(例如，氨基酸序列和/或基因编码序列)和例示性γδTCR基因递送载体。
方法
人γδT细胞可以通过干细胞和祖细胞(例如CD34+HSC、ESC、iPSC)的γδTCR基因工程化，然后分化(体内或离体)为转基因γδT细胞而生成。
HSC是指人CD34+造血祖细胞和干细胞，其可以直接从脐带血或G-CSF动员的外周血中分离(CB HSC或PBSC)，或者可以衍生自胚胎或诱导多能干细胞(ES-HSC或iPS-HSC)。HSC可以经由载体依赖性或载体非依赖性基因递送方法，或者经由其他基因编辑方法(例如，CRISPR、TALEN、锌指等)进行基因工程化。
除了单克隆转基因γδTCR赋予的抗原特异性之外，HSC-γδT还可以进一步工程化成表达额外的靶向性分子，以增强其疾病靶向性能力。此类靶向性分子可以为嵌合抗原受体(CAR)、天然或合成受体/配体或其他。所得的CAR-γδT细胞则可以用于现成疾病靶向性细胞疗法。
除了单克隆转基因TCR赋予的抗原特异性之外，HSC-γδT还可以进一步工程化成表达额外的靶向性分子，以增强其疾病靶向性能力。此类靶向性分子可以为嵌合抗原受体(CAR)、天然或合成受体/配体或其他。所得的CAR-γδT细胞则可以用于现成疾病靶向性细胞疗法。
HSC-γδT细胞和衍生物还可以进一步工程化成过表达编码T细胞刺激因子的基因，或者破坏编码T细胞抑制因子的基因，从而导致功能增强的HSC-γδT细胞和衍生物。
用于HSC过继疗法的HSC-工程化γδT(HSC-γδT)细胞的体内生成
公开了γδTCR基因工程化HSC过继转移方法，该方法可以在体内生成HSC-γδT细胞，这些细胞可以为患者潜在提供终生供应的靶向疾病的工程化HSC-γδT细胞。
该程序包括1)人CD34+造血干细胞(HSC)的遗传修饰，以表达选定的γδTCR基因；2)将γδTCR基因工程化HSC过继转移到患者中；3)HSC-γδT细胞的体内生成；4)由于HSC的自我更新的持久性，这种方法可以潜在地用终身供应的HSC-γδT细胞保护患者。
用于现成细胞疗法的同种异体HSC工程化γδT(AlloHSC-γδT)细胞的离体生成
公开了离体分化培养方法以生成用于现成细胞疗法应用的AlloHSC-γδT细胞。
饲养物依赖性培养
该规程包括1)人CD34+造血干细胞(HSC)的遗传修饰，以表达选定的γδTCR基因；3)用饲养细胞(例如，人工胸腺类器官培养)离体生成AlloHSC-γδT细胞；3)分化的AlloHSC-γδT细胞的离体扩增。
无饲养物培养
产生规程包括1)人CD34+造血干细胞(HSC)的遗传修饰，以表达选定的TCR基因；2)在无饲养细胞的情况下离体分化AlloHSC-γδT细胞；以及3)分化的AlloHSC-γδT细胞的离体扩增。
应用
工程化γδT细胞可以用于靶向多种疾病，包括癌症和感染性疾病。
用于癌症的γδT细胞疗法
提供了用于治疗许多人类癌症的原理验证数据，包括血癌(例如，多发性骨髓瘤)和实体瘤(例如，卵巢癌、黑素瘤、前列腺癌、乳腺癌和肺癌)。用于感染性疾病的γδT细胞疗法
提供了靶向COVID-19的原理验证数据。
AlloHSC-γδT细胞培养方法的详细描述
HSC-γδT细胞的体内生成
在包被有纤维连接蛋白的无组织培养物处理的板中，使人CD34+HSC在含有重组人Flt3配体、SCF、TPO和IL-3的X-VIVO 15无血清造血细胞培养基中培养不超过48小时。通过将浓缩的慢病毒载体直接添加到培养基中，在24小时执行病毒转导。在大约48小时，收集CD34+细胞并经静脉内(i.v.)注射到已接受270拉德全身辐照的NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠中。将1-2个人胎儿或产后胸腺片段植入每只受者NSG小鼠的肾包膜之下。
AlloHSC-γδT细胞的饲养物依赖性离体生成
阶段1：AlloHSC-γδT细胞分化
在包被有纤维连接蛋白的烧瓶中，将新鲜或冷冻/解冻的CD34+HSC在干细胞培养基(基础培养基，补充有细胞因子混合物，包括IL-3、IL-7、IL-6、SCF、EPO、TPO、FLT3L以及其他)中培养12-72小时，然后添加TCR基因递送载体，并且再培养12-48小时。然后，在4-10周内，使TCR基因修饰的HSC在饲养物依赖性培养物(例如人工胸腺类器官培养物)中分化为AlloHSC-γδT细胞。人工胸腺类器官(ATO)按照先前建立的方案生成(Seet等人,CellStem Cell.2019年3月7日；24(3):376-389)。
阶段2：AlloHSC-γδT细胞扩增
在阶段2，将分化的AlloHSC-γδT细胞用TCR关联抗原(蛋白质、肽、脂质、磷抗原、小分子以及其他)或非特异性TCR刺激试剂(抗CD3/抗CD28抗体或抗体包被的珠、伴刀豆球蛋白A、PMA/离子霉素以及其他)刺激，并在T细胞培养基中扩增多至1个月。培养物可以补充有T细胞支持细胞因子(IL-2、IL-7、IL-15以及其他)。
AlloHSC-γδT细胞衍生物
在一些实施方案中，可以进一步工程化AlloHSC-γδT细胞以表达额外的转基因。在一个实施方案中，此类转基因编码疾病靶向性分子，如嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)和其他天然或合成受体/配体。在另一个实施方案中，此类转基因可以编码T细胞调节蛋白，如IL-2、IL-7、IL-15、IFN-γ、TNF-α、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、FOXP3以及其他。可以在各种培养阶段将转基因引入扩增后AlloHSC-γδT细胞或其祖细胞(HSC、新分化的AlloHSC-γδT细胞、扩增中的AlloHSC-γδT细胞)。
在一些实施方案中，可以使用基因编辑工具(CRISPR、TALEN、锌指以及其他)进一步工程化AlloHSC-γδT细胞以破坏选定的基因。在一个实施方案中，破坏的基因编码T细胞免疫检查点抑制剂(PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3以及其他)。这些负调控基因的缺乏可以增强AlloHSC-γδT细胞的对抗疾病能力，使得它们对疾病诱导的无反应性和耐受性具有抵抗力。
AlloHSC-γδT细胞的无饲养物离体生成
阶段1：AlloHSC-γδT细胞分化
在包被有纤维连接蛋白的烧瓶中，将新鲜或冷冻/解冻的CD34+HSC在干细胞培养基(基础培养基，补充有细胞因子混合物，包括IL-3、IL-7、IL-6、SCF、EPO、TPO、FLT3L以及其他)中培养12-72小时，然后添加TCR基因-递送载体，并且再培养12-48小时。
然后，在无饲养物情况下，在4-10周的时段内，使TCR基因修饰的HSC在分化培养基中分化为AlloHSC-γδT细胞。非组织培养物处理的板包被有AlloHSC-γδT培养包被材料(DLL-1/4、VCAM-1/5、纤维连接蛋白以及其他)。使CD34+HSC悬浮于扩增培养基(基础培养基，含有血清白蛋白、重组人胰岛素、人转铁蛋白、2-巯基乙醇、SCF、TPO、IL-3、IL-6、Flt3配体、人LDL、UM171和添加剂)，接种到板的包被孔中，并培养3-7天。扩增培养基每3-4天更新。然后，将细胞收集并悬浮于成熟培养基(基础培养基，含有血清白蛋白、重组人胰岛素、人转铁蛋白、2-巯基乙醇、SCF、IL-3、IL-6、IL-7、IL-15、Flt3配体、抗坏血酸和添加剂)中。成熟培养基每周更新1-2次。阶段2：AlloHSC-γδT细胞扩增
将分化的AlloHSC-γδT细胞用TCR关联抗原(蛋白质、肽、脂质、磷抗原、小分子以及其他)或非特异性TCR刺激试剂(抗CD3/抗CD28抗体或抗体包被的珠、伴刀豆球蛋白A、PMA/离子霉素以及人工APC)刺激，并在T细胞培养基中扩增多至1个月。培养物可以补充有T细胞支持细胞因子(IL-2、IL-7、IL-15以及其他)。
AlloHSC-γδT细胞衍生物
在一些实施方案中，可以进一步工程化AlloHSC-γδT细胞以表达额外的转基因。在一个实施方案中，此类转基因编码疾病靶向性分子，如嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)和其他天然或合成受体/配体。在另一个实施方案中，此类转基因可以编码T细胞调节蛋白，如IL-2、IL-7、IL-15、IFN-γ、TNF-α、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、FOXP3以及其他。可以在各种培养阶段将转基因引入扩增后AlloHSC-γδT细胞或其祖细胞(HSC、新分化的AlloHSC-γδT细胞、扩增中的AlloHSC-γδT细胞)。
在一些实施方案中，可以使用基因编辑工具(CRISPR、TALEN、锌指以及其他)进一步工程化AlloHSC-γδT细胞以破坏选定的基因。在一个实施方案中，破坏的基因编码T细胞免疫检查点抑制剂(PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3以及其他)。这些负调控基因的缺乏可以增强AlloHSC-γδT细胞的对抗疾病能力，使得它们对疾病诱导的无反应性和耐受性具有抵抗力。
在一些实施方案中，AlloHSC-γδT细胞或增强的AlloHSC-γδT细胞可以进一步工程化成使它们适于同种异体过继转移，由此适于充当现成细胞产品。在一个实施方案中，编码MHC分子的基因或MHC表达/展示调节分子[MHC分子、B2M、CIITA(II类转录激活因子控制MHCII类mRNA表达的诱导)等]。AlloHSC-γδT细胞上MHC分子表达的缺乏使得它们对同种异体宿主T细胞介导的消减有抗性。在另一个实施方案中，MHC-I类缺陷型AlloHSC-γδT细胞将进一步工程化成过表达HLA-E基因，这将赋予它们对宿主NK细胞介导的消减的抗性。
AlloHSC-γδT细胞及衍生物可以新鲜使用或冷冻保存以供进一步使用。此外，在AlloHSC-γδT细胞培养期间生成的各种中间细胞产品可以暂停进行冷冻保存、储存并恢复以继续产生。
新型特征和优点
与使用饲养物依赖性培养(例如ATO培养)生成AlloHSC-γδT细胞的方法相比，本发明提供了不需要饲养细胞的体外分化方法。这种新方法大大改善了用于人类应用的治疗性细胞的放大生产和GMP兼容制造过程。
细胞产品AlloHSC-γδT细胞展现出不同于其天然对应T细胞以及使用其他离体培养方法(例如ATO培养方法)生成的其对应T细胞的表型/功能，使得AlloHSC-γδT细胞成为独特的细胞产品。
AlloHSC-γδT细胞分化培养的独特特征包括：
1)它是离体且无饲养物的。
2)它不支持TCR V/D/J重组，因此没有随机重排的内源性TCR，由此没有GvHD风险。
3)它支持转基因AlloHSC-γδT细胞的同步分化，由此消除未分化祖细胞和其他旁观者免疫细胞谱系的存在。
4)因此，AlloHSC-γδT细胞产品包含同质且纯的单克隆TCR工程化T细胞群。没有逃逸的随机T细胞，没有其他免疫细胞谱系，且没有未分化的祖细胞。因此，不需要纯化步骤。
5)产率高。可以从健康供体的PBSC生成约1013个AlloHSC-γδT细胞(10,000-100,000剂)，并且可以从健康供体的CB HSC生成约1013个AlloHSC-γδT细胞(10,000-100,000剂)。
6)AlloHSC-γδT细胞-转基因TCR+内源性TCR-CD3+的独特表型。
(注意：AlloHSC-γδT细胞分化培养的这些独特特征使其不同于生成现成T细胞产品的其他方法，包括基于健康供体PBMC的T细胞培养、ATO培养以及其他)。
原理验证
已经执行了原理验证研究，显示出AlloHSC-γδT细胞的成功生成。进一步工程化AlloCAR-γδT细胞以额外表达BCMA CAR(AlloBCAR-γδT细胞产品)且连同白介素-15(IL-15)(Allo15BCAR-γδT细胞产品)也被证明是成功的。执行了实验性CMC、药理学、功效和安全性研究，从而分析这些细胞产品。
表1：克隆的γδTCR CDR3区的氨基酸序列
使用单细胞RT-PCR方法克隆人γδTCR基因(参见例如图1)。简而言之，将人γδT细胞由健康供体外周血单个核细胞(PBMC)扩增，并使用流式细胞术基于表面标志物的严格组合进行分选，门控为hCD3+Vγ9+Vδ2+(图1A和1B)。将单个细胞直接分选到含有细胞裂解缓冲液的PCR板中，然后使用一步RT-PCR经受TCR克隆，继之以Sanger测序分析(图1A)。如下所显示，鉴定了超过25对γδTCRγ9和δ2链基因。
/>
*G115是先前报道的Vγ9Vδ2TCR克隆(Allison 2001,Nature 411:820)。
例示性载体序列
pMNDW-G115 DNA序列：
TCRγ9(G115 CDR3)-T2A-TCRδ2(G115 CDR3)
/>
/>
/>
/>
/>
/>
pMNDW-γδ1DNA序列：
TCRγ9(γδ1 CDR3)-T2A-TCRδ2(γδ1 CDR3)
/>
/>
/>
/>
/>
/>
本文提及的所有出版物(例如PCT公开的国际申请号PCT/US19/36786和PCT/US2020/037486；美国专利申请序列号15/320,037；以及Zarin等人,Cell Immunol.2015年7月；296(1):70-5.doi:10.1016/j.cellimm.2015.03.007.Epub 2015，以上所列出的那些等)以引用方式并入，以公开和描述与引用的出版物相关的方面、方法和/或材料。本文描述或引用的许多技术和程序被本领域的技术人员充分地理解和普遍采用。
除非另有定义，否则本文使用的所有专门术语、符号以及其他科学术语或专门用语均旨在具有本发明所属领域的技术人员通常所理解的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考，本文定义了具有通常理解的含义的术语，并且本文所包括的此类定义不应必然解释为表示与本领域通常理解的显著差异。

Claims (25)

1.工程化细胞，其是经遗传修饰成含有至少一种外源性γδT细胞受体(γδTCR)核酸分子的细胞。
2.权利要求1所述的工程化细胞，其中所述细胞是多能干细胞、造血干细胞、造血祖细胞或免疫细胞。
3.权利要求1所述的工程化细胞，其中所述细胞是人细胞。
4.权利要求1所述的工程化细胞，其中所述γδTCR核酸分子是γδT细胞的T细胞受体的克隆，或者具有从所述γδT细胞的所述T细胞受体的序列修饰的序列。
5.权利要求1所述的工程化细胞，其中所述γδTCR核酸分子是人γδT细胞的T细胞受体的克隆，或者具有从所述人γδT细胞的所述T细胞受体的序列修饰的序列。
6.权利要求1所述的工程化细胞，其中所述γδTCR核酸分子包含从人γδT细胞受体获得的核酸序列。
7.权利要求1所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞缺乏外源性致癌基因。
8.权利要求1所述的工程化细胞，其中所述γδT细胞受体核酸分子编码SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:52中所示的至少一种氨基酸序列。
9.物质组合物，其包含用编码T细胞受体γ链多肽和/或T细胞受体δ链多肽的至少一种多核苷酸转导的工程化细胞，其中所述T细胞受体γ链多肽和/或所述T细胞受体δ链多肽包含SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:52中所示的至少一种氨基酸序列。
10.制备工程化功能性γδT细胞的方法，所述工程化功能性γδT细胞包含编码T细胞受体γ链多肽和/或T细胞受体δ链多肽的至少一种外源性核酸分子，所述方法包括：
用编码所述T细胞受体γ链多肽和所述T细胞受体δ链多肽的至少一种外源性核酸分子转导人造血干/祖细胞，使得由所述至少一种外源性核酸分子转导的人多能细胞表达由所述至少一种外源性核酸分子编码的包含γ链多肽和δ链多肽的T细胞受体；以及
使所述人造血干/祖细胞分化，以便生成所述工程化功能性γδT细胞。
11.权利要求10所述的方法，其中所述方法包括：
(a)在第一体外培养中，使转导的人造血干/祖细胞分化；以及进一步
(b)在第二体外培养中，使(a)的所述分化的细胞扩增。
12.权利要求11所述的方法，其中：
在不包含饲养细胞的培养基中培养所述造血干/祖细胞；并且/或者
在包含IL-3、IL-7、IL-6、SCF、MCP-4、EPO、TPO、FLT3L、和/或纤维连接蛋白中的一种或多种的培养基中培养所述造血干/祖细胞。
13.权利要求12所述的方法，其进一步包括在体外扩增用编码T细胞受体γ链多肽和/或T细胞受体δ链多肽的所述核酸分子转导的所述细胞。
14.权利要求10所述的方法，其进一步包括将用编码所述T细胞受体γ链多肽和/或所述T细胞受体δ链多肽的所述核酸分子转导的所述造血干/祖细胞移植到受试者中，以便在体内生成所述工程化细胞的克隆群体。
15.权利要求10所述的方法，其中所述工程化功能性γδT细胞包含表征为以下中的至少一者的基因表达谱：
HLA-I-低/阴性；
HLA-II-低/阴性；
HLA-E-阳性；以及
表达一种或多种免疫调节基因和/或自杀基因。
16.权利要求10所述的方法，其中：
所述外源性核酸分子包含在慢病毒表达载体中；并且/或者
所述方法进一步包括使所述转导的细胞与选择成有利于生长和/或分化的药剂进行接触。
17.权利要求16所述的方法，其中所述方法进一步包括将所述转导的细胞与外周血单个核细胞、抗原呈递细胞或人工抗原呈递细胞共培养。
18.权利要求10所述的方法，其中所述造血干/祖细胞包含CD34+造血干细胞或祖细胞。
19.权利要求10所述的方法，其中所述T细胞受体γ链多肽和/或所述T细胞受体δ链多肽包含SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:52中所示的至少一种氨基酸序列。
20.工程化功能性γδT细胞，其由权利要求10-19中任一项所述的方法产生。
21.治疗需要γδT细胞的受试者的方法，其包括向所述受试者施用权利要求1-9或20所述的细胞。
22.权利要求21所述的方法，其中所述γδT细胞通过用编码T细胞受体γ链多肽、T细胞受体δ链多肽、IL-15以及自杀基因的至少一种外源性核酸分子转导CD34+造血干细胞或祖细胞而生成。
23.权利要求22所述的方法，其中所述γδT细胞包含SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:52中所示的至少一种氨基酸序列。
24.权利要求21所述的方法，其中：
所述需要γδT细胞的受试者诊断患有癌症；或者
所述需要γδT细胞的受试者诊断患有病毒性、真菌性或原生动物性感染。
25.权利要求21所述的方法，其中所述T细胞受体γ链多肽和T细胞受体δ链多肽选自观察到靶向癌细胞或由病毒、真菌或原生动物感染的细胞的γδT细胞受体。
CN202180094700.XA 2020-12-28 2021-12-28 工程化γδT细胞及其制备和使用方法 Pending CN116887846A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063131170P 2020-12-28 2020-12-28
US63/131,170 2020-12-28
PCT/US2021/065349 WO2022147014A2 (en) 2020-12-28 2021-12-28 Engineered gamma delta t cells and methods of making and using thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116887846A true CN116887846A (zh) 2023-10-13

Family

ID=82219273

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180094700.XA Pending CN116887846A (zh) 2020-12-28 2021-12-28 工程化γδT细胞及其制备和使用方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20220211757A1 (zh)
EP (1) EP4267150A2 (zh)
JP (1) JP2024501020A (zh)
CN (1) CN116887846A (zh)
AU (1) AU2021416169A1 (zh)
CA (1) CA3205479A1 (zh)
WO (1) WO2022147014A2 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112023018844A2 (pt) * 2021-04-07 2023-10-10 Century Therapeutics Inc Composições e métodos para geração de células t gama-delta de células-tronco pluripotentes induzidas
DE102022132084A1 (de) 2022-12-02 2024-06-13 Horia Hulubei National Institute for R & D in Physics and Nuclear Engineering (IFIN-HH) Vorrichtung zum Porieren und zum Beladen von Zellen sowie Verfahren hierfür
DE102022132083A1 (de) 2022-12-02 2024-06-13 Horia Hulubei National Institute for R & D in Physics and Nuclear Engineering (IFIN-HH) Vorrichtung zum Porieren und zum Beladen von Zellen sowie Verfahren hierfür
DE102022132082A1 (de) 2022-12-02 2024-06-13 Horia Hulubei National Institute for R & D in Physics and Nuclear Engineering (IFIN-HH) Verfahren zur Herstellung von genetisch transfizierten und mit Nanopartikeln und/oder einem zytotoxischen Stoff beladenen immunokompetenten Zellen sowie immunokompetente Zellen und medizinische Zusammensetzung.

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2659217T3 (es) * 2012-03-28 2018-03-14 Gadeta B.V. Intercambio combinatorio de cadena receptora de célula T gamma 9 delta 2
US11154573B2 (en) * 2015-10-30 2021-10-26 The Regents Of The University Of California Methods of generating T-cells from stem cells and immunotherapeutic methods using the T-cells
CA3142947A1 (en) * 2019-06-12 2020-12-17 The Regents Of The University Of California Engineered off-the-shelf immune cells and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022147014A2 (en) 2022-07-07
WO2022147014A3 (en) 2022-08-18
AU2021416169A1 (en) 2023-07-13
AU2021416169A9 (en) 2024-02-08
US20220211757A1 (en) 2022-07-07
JP2024501020A (ja) 2024-01-10
CA3205479A1 (en) 2022-07-07
EP4267150A2 (en) 2023-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107922925B (zh) 用于自然杀伤细胞扩增的方法
Berger et al. Adoptive transfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates
US20220211757A1 (en) Engineered gamma delta t cells and methods of making and using thereof
CA2670433C (en) Adoptive transfer of cd8+ t cell clones derived from central memory cells
JP2021512621A (ja) Ｔ細胞を製造する方法
US20240182854A1 (en) Methods to Expand a T Regulatory Cell Master Cell Bank
CN114929864A (zh) 工程化的现成免疫细胞及其使用方法
Grupp et al. Adoptive cellular therapy
CN112512536A (zh) 基于干细胞工程化inkt细胞的现成细胞疗法
CA2940163C (en) Tscm cells and methods for use
KR20220095223A (ko) 조작된 조절 t 세포 생성
Kawai et al. Generation of highly proliferative, rejuvenated cytotoxic T cell clones through pluripotency reprogramming for adoptive immunotherapy
WO2022018262A1 (en) T-cells expressing immune cell engagers in allogenic settings
US8871510B2 (en) Methods for generating T lymphocytes from hematopoietic stem cells
WO2022059780A1 (ja) ｉＰＳ細胞を介する再生Ｔ細胞の製造方法
KR102030364B1 (ko) 멀티플렉스 CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 HLA 결핍 세포주로부터 제조된 인공항원제시세포 및 이의 용도
CA3213440A1 (en) A cell bank composed of ips cells for transfecting t cell receptor gene
TW202235094A (zh) 經回春的ｔ細胞之製造方法、包含彼之組成物、及彼之使用方法
EP2267118A1 (en) Method for production of transfected cell
US20230124097A1 (en) Engineering stem cell t cells with multiple t cell receptors
US20220228164A1 (en) Engineered antigen presenting cells
Vivien et al. The doubling potential of T lymphocytes allows clinical-grade production of a bank of genetically modified monoclonal T-cell populations
Wilson et al. Stem Cell-Derived Cell Therapy for Cancer
WO2024077159A1 (en) B cell lineages derived from pluripotent cells
WO2024077158A1 (en) Pluripotent stem cell-derived t cell populations and progenitors thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination