CN1630716A - 人胚胎干细胞衍生的造血细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种从胚胎干细胞产生造血细胞系细胞的系统。在造血原性细胞因子和本公开内容中所列的其它因子存在下进行分化。获得的细胞群显著富含CD45阳性细胞，该标记是有自我更新功能的早期造血前体细胞的标记。在分化过程中，掺入骨形态发生蛋白增强了细胞群形成次生代集落的能力。由于胚胎干细胞的强大复制能力，提供了造血细胞重要的新商业来源。

Description

人胚胎干细胞衍生的造血细胞
技术领域
本发明一般涉及细胞生物学、胚胎干细胞和细胞分化。更具体的，本发明提供了具有造血能力、用于药物开发和移植治疗的分化细胞。
相关申请的引用
本申请要求2001年12月7日提交的美国临时申请号60/338,979的优先权。在先申请在此完整引入以供参考。
背景
白血病是具有严重预后的造血细胞癌症。美国白血病协会估计在1998年，美国有28700人被诊断出白血病。最近10年来，在用异体或自身造血干细胞联合放疗或化疗治疗白血病上取得了很大的进展。自身移植也用于治疗晚期乳癌、卵巢癌和前列腺癌。干细胞移植目前正在临床测试中测试其对严重的、有生命危险的自身免疫疾病的治疗作用。
不幸的是，常常不能得到合适的造血干细胞用于治疗这些病况。另一供体的异体细胞匹配困难，因而导致需要开发自身移植物，该移植物的治疗细胞衍生自病人自身的骨髓。自身供给需要时间，来准备用于移植的足够的细胞，常常有癌细胞通过施用的细胞重新引入病人的危险。
进行了大量的研究，来确定存在于人血和骨髓中，据信不断补充了对造血系统干细胞特征的了解。Gunsilius等(Biomed.Pharmacother.55：186，2001)提供了一个综览。美国专利5,750,397报道了人造血干细胞的培养物为CD34阳性，能从人骨髓样品中产生、增殖和分化。美国专利5,192,553报道了胎儿和血液新生干祖细胞的分离。美国专利5,635,386报道了调节人造血细胞培养物中特定细胞系的方法。欧洲专利出版号EP 455,482A3报道了一个缺乏CD38但表达CD34的人祖细胞亚组。
Vaziri等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：9857，1994)报道了由于人造血干细胞老化引起的端粒DNA丧失。Chiu等(Geron Corporation；Stem Cells14：239，1996)描述了来自成人骨髓的造血祖细胞中端粒酶活性的差异表达。Gaffney等(Blood 91：1662，1998)报道了Flt-3配体和骨髓基质衍生的因子对原代人CD34阳性骨髓祖细胞的影响。Koller等(J.Hematother.5：449，1995)比较了Flt-3配体与c-kit作为体外造血细胞扩展的刺激剂。
Bhatia等(Proc.Natl.Acad.Sci.94：5320，1997)报道了能再次增加免疫缺陷小鼠的原始人造血细胞。Bhatia等(Nature Med.4：1038，1998)报道了一类具有SCID再增活力的人造血细胞。Gallacher等(Blood 96：1，2000)报道了新循环性人胚胎血干细胞的分离。国际专利出版物WO 99/23205报道了一群基本均质的、CD34阴性和Lin阴性的人造血干细胞。Karanu等(J.Exp.Med.192：1365，2000)报道了作为造血干细胞生长因子的Motch配体Jagged-1。Bhatia等(J.Exp.Med.189：1139，1999)报道了骨形态发生蛋白调节人造血干细胞的发育过程。Karanu等(Blood 97：1960，2001)报道了Delta-2和Delta-4的功能是原始人造血细胞的有丝分裂调节剂。Bhardwaj等(Nature Immunol 2：172，2001)报道了音速刺猬(sonic hedgehog)因子能诱导人造血细胞增殖。
已鉴别了人骨髓和脐带血的重要造血祖细胞，并发现了体外操纵它们的有效方法。但是这些细胞在整个捐赠的人细胞群仅占很低的百分数仍然是一个问题。
另一种来源是早期胚胎组织分离的多能细胞。最近已开发了，用于分离和培养人ES细胞的技术(Thomson等，Science 282：114，1998；美国专利号6,090,622和6,200,806)。国际专利出版物WO 99/20741和WO 01/51616(Geron Corp.)提供了无饲养细胞培养物中灵长类衍生的原干细胞培养方法和材料，这种培养方便制备这些细胞及其衍生物，用于人的治疗。
Li等(Blood 15：98，2001)；美国专利6,280,718(Wisconsin)和Kaufman等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：10716，2001b)报道了使人多能干细胞分化成造血品系的细胞的最初尝试。必须与小鼠骨髓细胞或卵黄囊内皮细胞一起共同培养，从而产生具有造血细胞标记的细胞。
为了使得胚胎干细胞衍生的造血细胞能够进入商用，需要开发新的方法，该方法不需要与基质细胞共同培养，从而提供了与来自骨髓的细胞相比显著改善的产率。
发明概述
本发明提供一种有效生产灵长动物细胞的系统，所述细胞是由多能细胞分化成的造血细胞谱系的细胞。本文描述了相当富含造血祖细胞的细胞群。而造血祖细胞又可以分化成红细胞系、粒细胞系、单核细胞系、巨核细胞系和淋巴细胞系细胞集落。本公开内容中描述的组合物、方法和技术具有各种应用前景，包括药物筛选和各种临床治疗形式。
本发明的实施方式之一是一群在培养物中增殖，具有一定的造血细胞特征的细胞。细胞群是通过分化灵长动物多能干细胞(pPS)获得的，示范性的pPS细胞是人胚胎干细胞建立的细胞系。包括其中至少1％细胞是CD45阳性的，具有其它下列造血细胞的特征性标记，并具有少部分未分化的pPS细胞。细胞群可以高接种效率在对造血细胞集落形成单位(CFU)甲基-纤维素试验形成集落，从而当重新在第二个CFU试验中接种时，形成次生集落。当注射到NOD-SCID小鼠中时，细胞可形成循环性红细胞、粒细胞、单核细胞、巨核细胞或淋巴样细胞。包括基因改造过，表达异源的用于基因治疗，或延长细胞复制能力的基因的细胞。
本发明的另一个实施方式是一群人造血细胞，具有本文公开所述的至少一种特征，例如：至少20％细胞可表达内源基因产生的CD34；至少约2％细胞可表达内源基因产生的CD45；或其中细胞以高接种效率在CFU实验中形成集落。这包括用任何方法制备得到的人细胞组合物，但不限于人多能干细胞分化，或任何其它不涉及用特异性抗体(例如抗-CD34抗体)或其等价物细胞分离的方法。
本发明的另一个实施方式是一种通过分化pPS细胞制备造血细胞的方法。例如，可从无饲养细胞培养物收集pPS细胞，然后通过形成胚状体(embryoid body)或其它方法引发分化途径。然后可将引发的细胞与造血细胞生长因子的混合物一起培养，从而获得在CFU实验中形成集落的细胞。造血细胞生长因子的混合物可包含下列造血细胞分化因子的一种或多种：干细胞因子(SCF)、FLT-3配体、IL-3、IL-6、G-CSF、音速刺猬(sonic hedgehog)或其它本公开列出的细胞因子，还可能与骨形态发生蛋白，例如BMP-4联合。通常不需要与外源基质细胞或任何含有不同基因组的细胞共培育。可用该方法产生造血细胞祖细胞，或成熟的造血细胞，例如红细胞样细胞、粒细胞、单核细胞、巨核细胞或淋巴样细胞。
本发明的另一个实施方式是一种筛选能调节造血细胞功能的化合物的方法。将该化合物与本发明的细胞群混合，并监测所致的细胞群中细胞的任何表型或代谢上的改变。
本发明还提供了一种可诱导免疫耐受的系统。给予病人衍生自多能(pPS)细胞的端粒化细胞群，可赋予病人对第二种细胞群的免疫耐受性，从而使缺陷组织功能再生。示范性的hPS细胞是人胚胎干(hES)细胞或其等价物，例如可以从人胚泡获得的细胞。第一种细胞群一般是与第二种细胞群MHC相容的，可能衍生自同样的hPS细胞系。该方法可用于提高组织，例如肝细胞、神经元、少突神经胶质细胞和其它神经胶质细胞、心肌细胞、成骨细胞、间充质细胞、造血细胞、激素分泌性细胞，如胰岛细胞和软骨细胞的移植效率。
将在下面的描述中进一步阐明本发明的这些和其它实施方式。
附图说明
图1显示了未分化人胚胎干细胞的流式细胞计数分析。门控用活力(7AAD阴性；栏i)和大小(ii)选拣，然后筛拣未分化ES细胞群中的造血细胞表面标记(iii-vi)的表达。这些细胞都不表达人造血细胞标记CD45，仅1.2％是CD34阳性的(原始人造血细胞的一种标记)。
图2显示了通过分化hES细胞的H系获得的造血细胞的流式细胞计数分析。通过将hES细胞条带在含有20％FBS的培养基中培养成聚集体10天，引发分化。然后在含有造血细胞生长因子(HGF，是SCF，Flt-3配体、IL-3、IL-6和G-CSF)，含有或不含骨形态发生蛋白4(BMP-4)的无血清培养基(SF)中培养细胞。CD45标记可鉴定造血细胞祖细胞。
图3是流程图，其中hES细胞的H1品系分化成造血细胞祖细胞。在含FCS的培养基中分化后，在集落形成(CFU)实验中，将整个培养物(左)或单个胚状体(右)置于含干细胞因子、GM-CSF、IL-3和EPO的甲基纤维素中。用流式细胞计数确定形成的集落的造血细胞表型，并在第二次CFU实验中传代。
图4显示了根据图3左侧流程图从整个胚状体培养物获得的造血细胞。当分析整个CFU实验(A)时，有83-86％为CD45染色，肯定了造血细胞的存在。B栏显示了形态学评估结果。20,000个输入细胞形成了47个集落，接种效率为1/425。C栏显示的集落是挑出用于标记分析的，其中81-92％的细胞是CD45阳性，73％是CD13阳性。
图5显示了根据图3右侧的流程从分离的胚状体形成的造血细胞。在CFU实验中鉴定了红细胞样、粒细胞和巨噬细胞的集落。用流式细胞计数分析两个红细胞集落，发现其中93％是血型糖蛋白阳性。
图6显示了当从图3所示的CFU实验挑选两个集落，在第二次CFU实验中再接种的情况。A栏显示了自含有82,500个细胞的原代粒细胞集落衍生出的不同次生集落(下文显示了每个集落类型的数目)。此次生集落具有粒细胞、巨噬细胞、红细胞样细胞和GEMM集落(造血细胞类型的混合物)的特征。具有高水平的CD45和CD13表达，但CD34和CD14水平低。将另一个原代粒细胞集落(12,500个细胞)在次生CFU实验(B栏)中传代，并形成14个集落，都具有单核细胞特征。
图7显示了脐带血单核细胞(CBMC)和未分化hES细胞系H1、H7和H9上主要组织相容性复合物(MHC)I类和II类的表达。灰线表示MHC染色；实线表示抗体对照。未分化的hES细胞是MHC I类阳性，但不是MHC II类阳性-即使用干扰素γ处理过(插入)。
图8显示了混合的淋巴细胞反应中未分化hES细胞的效果。在A栏，hES细胞不能刺激异体移植的外周血或脐带血单核细胞增殖。B栏中，全部三种hES细胞都不能刺激增殖，即使之前通过单核细胞耗竭富集过相应T细胞群。在C栏，通过与IFN-γ一起培养，提高MHC I类表达制备hES细胞，但仍然不能刺激T细胞的增殖。
图9显示hES细胞还能抑制第三方的抗原递呈细胞刺激的混合淋巴细胞反应。在A栏，当用异体移植的树突状细胞(DC)刺激T细胞时，观察到剧烈的增殖应答。在培养物中加入人成纤维细胞影响很小，但加入未分化的hES细胞即消除了该反应。在B栏，显示抑制效果依赖于MLR中存在的hES细胞数量。少至3×104hES细胞即能显著抑制该反应。
图10显示了将细胞注射到免疫缺陷型Prk-/-SCID小鼠中所产生的应答。MBA-1基质细胞和胎儿单核细胞都能够诱导粒细胞渗透应答，但未分化的hES细胞没有观察到任何效果。
图11显示了将细胞注射入野生型CD-1小鼠产生的应答。注射仅含内毒素的PBS在注射位点引起了淋巴细胞和粒细胞渗出。然而，注射载体和hES细胞完全消除了白细胞浸润(右)，而MBA-1细胞不能抑制浸润(插入)。未分化的hES细胞在这种情况下明显不能诱导排斥反应，而且防止注射位点的宿主细胞浸润，显示了抑制炎症的能力。
图12显示了在形成胚状体后，翌日在细胞因子和/或BMP-4中培养hPS细胞获得的造血细胞的表型和功能特征。细胞因子提高了总的细胞产率，并且相当大的提高了CD45阳性细胞和产生CFU的细胞的比例。
图13显示了次生CFU的结果，强调了在最初分化过程中BMP-4的重要性。用BMP-4(和或不和细胞因子)制备的造血细胞产生高比例的次生集落。这证明在BMP-4存在下，分化性hES细胞产生具有可观自身更新能力的造血祖细胞。
图14显示了一种在分化过程中跟踪细胞表型和功能的动力学方案的结果。第15天出现CD45阳性细胞，在第22天有更大的增加。第15天时产生集落的能力很高，而在第22日该能力的增加不显著。在这些情况下，前15天代表了指导造血细胞分化的细胞因子和BMP的关键窗口。
发明详述
本发明解决了如何从多能干细胞进行有效分化，产生大量人造血细胞的问题。
已发现人胚胎干细胞可以以非特异性方式引发分化，然后在分化因子的混合物中培养引发的细胞，诱导沿造血细胞分化途径分化。不同的生长因子组合能有效促进造血细胞分化。特别有效的组合包括干细胞因子(SCF)、Flt-3配体、IL-3、IL-6和G-CSF。在该混合物中培养一段合适的时间，可产生可观富集的造血前体细胞群，其中各种造血细胞谱系是多能的，并且在培养物中活跃增殖。该造血前体细胞可以通过与SCF、GM-SCF、IL-3和促红细胞生成因子一起培养，沿着骨髓分化途径下游进一步分化。
与Kaufman等(见上)报道的不同，本文的公开内容认为在进行上述细胞的衍生中，与基质细胞共培养并不是必需的。
相反，用本文公开的技术，可以产生造血细胞表型相当富集的分化细胞群。通过在分化混合物中同时加入细胞因子和骨形态发生蛋白4(BMP-4)，获得了含有8％CD45阳性细胞(多能造血细胞标记)和22％CD34阳性细胞(原始造血祖细胞标记)的细胞群。值得注意的是，5％以上的细胞同时是CD45和CD34阳性的。CD45标记的存在与CFU试验中测定的活性集落形成细胞相关联。胚胎干细胞衍生的造血细胞以非常高的接种效率产生集落。
该发现是重要的，因为它提供了看来比任何目前的来源，包括外周血、成年人骨髓或甚至脐带血，可获得的造血祖细胞都要多的造血细胞群。用细胞因子分化的起始的1×105hES细胞群得到至少约137个造血祖细胞，与人脐带血(182)或外周血中活动的骨髓祖细胞(249)相当。由于人胚胎干细胞可导致无限增殖，本发明提供了一种可产生不限量的造血祖细胞-和定型成为造血细胞亚型之一的子代，或分化成成熟的红血细胞或白细胞的系统。
下面的公开内容提供了关于生产和测试本发明的造血细胞的信息。还提供了有关这些细胞如何用于研究、药物开发和治疗管理血液相关异常的说明。
定义
就本发明的目的而言，除非另外说明，术语“造血细胞”指任何来自造血细胞途径的细胞。这些细胞表达包括造血祖细胞、定型的能复制或形成集落的细胞、以及完全分化的细胞的造血细胞谱系特有的一些已接受的形态学特征和表型标记(下文例证)。
“造血祖细胞”、“造血前体细胞”或“造血干细胞”是能够产生完全分化的造血细胞和具有自我更新的能力的细胞。典型的，它在体外单独培养不能产生胚胎胚层子代，除非以某些形式分化或重新程序化过。
就细胞个体发育而言，形容词“分化的”是相对而言的。与对照细胞相比，术语“分化细胞”是进展到发育路径下游的细胞。因此，多能胚胎干细胞可分化成谱系限制的前体细胞，例如多能造血祖细胞，它能形成红细胞样细胞、粒细胞、单核细胞、巨核细胞和淋巴样细胞系之一的细胞。这些祖细胞还可以进一步分化成自我更新性的细胞，定型形成这四种造血细胞系之一的细胞。这些细胞进而可以进一步分化成终末的分化细胞，发挥其特征性作用，可能或可能不保留进一步的增殖能力。红细胞样细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、血小板、以及淋巴细胞是终末分化的细胞的例子。
“分化剂”在本文中指化合物集合中的一种，用于本发明培养系统产生属于造血细胞系的分化细胞(包括前体细胞和终末分化细胞)的化合物。对该化合物的作用方式没有限定。例如，所述分化剂辅助分化的过程可以是通过诱导或辅助表型改变、促进具有特定表型的细胞生长或抑制其它细胞的生长，或与其它分化剂通过未知的机制协同作用。
原型“灵长动物多能干细胞”(pPS细胞)是来自受精后任何时间的胚前、胚胎或胎儿组织的多能细胞，其特征是能够在合适的条件下产生数种不同细胞类型的子代，它们来自全部三个胚层(内胚层、中胚层、外胚层)的，这可根据标准试验例如在8-12周龄SCID小鼠内形成畸胎瘤的能力来确定。该术语包括各种类型的已建立的干细胞系和根据上述方式获自多能原代组织的细胞。
pPS细胞的定义包括各种类型的胚胎细胞，例如人胚胎干细胞(hES)，见Thomson等(Science 282：1145，1998)；其它灵长动物的胚胎干细胞，例如恒河猴干细胞(Thomson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：7844，1995)，绒猴干细胞(Thomson等，Biol.Reprod.55：254，1996)和人胚胎生殖(hEG)细胞(Shamblott等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13726，1998)。该术语还包括其它类型的多能细胞。包括能产生所有三个生发层的衍生物、子代的任何灵长动物细胞，不论它们是来自胚胎组织、胎儿组织还是其它来源。pPS细胞最好不要来自恶性来源。通常希望(但非必须)此类细胞核型正常。
当细胞群中大部分干细胞及其后代衍生物显示明显区别于胚胎或成人的分化细胞的未分化细胞形态特征时，就称pPS细胞培养物为“未分化的”。本领域技术人员很容易识别未分化pPS细胞，一般在二维显微镜下表现为具有高核/胞质比和明显核仁的细胞集落。应理解的是，细胞群内非未分化细胞的集落通常被临近的分化细胞所包围。
“饲养细胞”指一种类型的细胞，当与另一种类型的细胞共培养时，可为第二种类型的细胞提供可生长环境。某些类型的pPS细胞可用原代小鼠胚胎成纤维细胞，无限增殖的小鼠胚胎成纤维细胞或分化自hES细胞的人成纤维细胞样细胞来支持。如果pPS分裂后细胞已生长了至少一个周期，期间没有加新鲜饲养细胞来支持其生长，则称pPS细胞群为“基本无”饲养细胞。
术语“胚状体”与“聚集体”同义，指已分化和未分化细胞的聚集体，出现在pPS细胞在单层培养物中过度生长或悬浮培养中维持。胚状体是不同细胞类型(通常源自不同胚层)的混合物，可根据形态学标准区别和可用免疫细胞化学方法检测细胞标记。
“生长环境”指感兴趣的细胞增殖、分化或成熟的体外环境。此类环境的特征包括培养细胞的培养基，可能存在的任何生长因子或分化诱导因子，以及可能存在的支持结构(例如固体表面上的基质)。
当用任一合适的人工手段将一段聚核苷酸转移到某细胞内，或该细胞是遗传了多核苷酸的原来改变的细胞的后代时，则称细胞为“遗传改变的”或“转染的”细胞，或“遗传转化的”细胞。多核苷酸通常包含编码感兴趣的蛋白质的可转录序列，使细胞能在提高的水平上表达蛋白质。如果改变的细胞的子代有相同的变化，则称遗传改变为“可遗传的”。
通用技术
分子遗传学和基因工程中的通用方法可参见“Molecular Cloning：A laboratoryManual”(Sambrook等，Cold Spring Harbor)；“Gene Transfer Vectors for MammalianCells”(Miller & Calos编)和“Current Protocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel等，Wiley & Sons)。细胞生物学、蛋白质化学和抗体技术可参见“Current Protocolsin Protein Sceince”(J.E.Colligan等，Wiley & Sons)；“Current Protocols in CellBiology”(J.S.Bonifacino等，Wiley & Sons)和“Current Protocols in Immunology”(J.E.Colligan等，Wiley & Sons)。试剂、克隆载体和基因操作所用的试剂盒可向例如BioRad、Stratagene、Invitrogen、ClonTeck和Sigma-Aldrich Co.等厂商购买。
细胞培养方法可参见最新版的“Culture of Animal Cells：A Manual of BasicTechnique”(R.I.Freshney编，Wiley & Sons)；General Techniques of CellCulture(M.A.Harrison & I.F.Rae.，Cambridge Univ.Press)和“Embryonic StemCells：Methods and Protocols”(K.Turksen等，Humana Press)。组织培养物和试剂可向Gibco/BRL、Nalgene-Nunc International，Sigma Chemical Co.和ICNBiomedicals等厂商购买。
与本公开有关的具体文献包括Blood Cell Biochemistry，Plenum Pub.Corp.和Kluwer Academic Publishers；M.R.Koller & B.Palsson编，PrimaryHematopoietic Cells(Human Cell Culture，Vol.4)，Kluwar Academic Publishers，1999；Molecular Biology of Hematopoiesis and Treatment of MyeloproliferativeDisease：第11次研讨会，Bormio，1998年6月(Acta Haematologica 101/2)，N.G.Abraham等编，S.Karger Publishing，1999；The Essential Dracula，B.Stoker，L.Wolf & C.Bing，Penguin Putnam，1993；和Hematopoiesis：A DevelopmentalApproach，L.I.Zon编，第一版，Oxford University Press，2001。
干细胞来源
本发明可用各种干细胞来实施。其中，适用于本发明的有妊娠后形成组织的灵长动物多能干细胞(pPS)，或妊娠期任何时间的胚泡或胚胎组织。非限定性例子是胚胎干细胞或胚胎生殖细胞的原代培养物或已建立的细胞系，详见后文。
本发明也以直接用原代胚胎或胎儿组织来实施，即直接由能够产生造血细胞的原代细胞衍生获得造血细胞，而无需先建立未分化细胞系。在一些情况下，本发明的几个方面可以用脐带血、胎盘或一些成年组织的多能细胞来产生。
胚胎干细胞
胚胎干细胞可自灵长动物的胚泡分离获得(美国专利5,843,780；Thomson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：7844，1995)。人胚胎干细胞(hES)可由人胚泡细胞制得，方法参见Thomson等(美国专利6,200,806；Science 282：1145，1998；Curr.Top.Dev.Biol.，38：133ff，1998)和Reubinoff等，Nature Biotch.18：399，2000)。与hES相当的细胞包括它们的多能衍生物，例如原始外胚层样(EPL)细胞，参见WO01/51610(Bresagen)。
hES细胞可由人植入前胚胎制备。或者，也可用体外授精(IVF)的胚胎，还使单细胞人胚胎扩增到胚泡阶段(Bongso等，Hum Reprod 4：706，1998)。可在G1.2和G22.培养基中将胚培养至胚泡阶段(Gardner等，Fertil.Steril.69：84，1998)。通过与链霉蛋白酶(Sigma)的短暂接触从发育的胚泡中除去透明带(zonapellucida)。内细胞团通过免疫手术分离获得，手术中，胚泡与兔抗人脾细胞抗血清的1∶50稀释液接触30分钟，然后在DMEM中洗涤三次，每次5分钟，然后与豚鼠补体(Gibco)的1∶5稀释液接触3分钟(Solter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72：5099，1975)。DMEM中再洗涤2次后，从完整细胞团(ICM)中用移液管小心去除裂解的滋养外胚层细胞，然后将ICM接种在mEF饲养细胞层上。
9至15天后，通过与含1mM EDTA的无钙、无镁的磷酸盐缓冲液(PBS)接触，或分散酶或胰蛋白酶接触，或用微量移液管机械分离，将由内细胞团衍生的生长物分散成小块；然后，再接种在新鲜培养基中的mEF上。用微量移液管挑出含有未分化形态的正在生长的单集落，机械分散，再平板培养。ES样形态的特征是：集落致密，显著的高核/质比，核仁明显。然后，通过胰蛋白酶消化，Dulbecco′s PBS(含2mM EDTA)处理，IV型胶原酶(约200U/ml，Gibco)处理或用微量移液管挑选单个集落，使所得ES细胞每隔1至2周常规分散一次。最佳集落块大小约为50-100细胞。
胚胎生殖细胞
人胚胎生殖(hEG)细胞可由距最后一次月经后约8-11周时采集的人胎材料中的原始生殖细胞来制备。合适的制备方法参见Shamblott等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13726，1998和美国专利6,090,622。
简而言之，处理性腺嵴形成不聚集的细胞。EG的生长培养基是DMEM，4500mg/L D-葡萄糖，2200mg/L mM NaHCO3；15％ES级(ES合格的)胎牛血清(BRL)；2mM谷氨酰胺(BRL)；1mM丙酮酸钠(BRL)；1000-2000U/ml人重组白血病抑制因子(LIF，Genzyme)；1-2ng/ml人重组bFGF(Genzyme)和10μM毛喉素(10％的DMSO溶液)。由亚汇合的饲养细胞层(例如STO细胞，ATCC No.CRL1503)制备的96孔组织培养板，在无LIF、bFGF和毛喉素的改良EG生长培养基中培养3天，然后用5000rad的γ-辐射灭活。在每孔中加入约2ml原代生殖细胞(PGC)。在EG生长培养基中培养7-10天后进行第一次传代，将每孔中的培养物转移到24孔培养板的孔中，后者预先用辐照过的STO小鼠成纤维细胞制备过。培养细胞，每日更换新鲜培养基，直至观察到符合EG细胞的细胞形态，一般需7-30天或1-4代。
非分化状态下pPS细胞的增殖
采用促进增殖但不促进分化的培养条件，可使pPS细胞可在培养物中持续繁殖。例如采用含血清的ES培养基，其中含80％DMEM(例如敲除DMEM，Gibco)，20％确定成分的胎牛血清(FBS，Hyclone)或代血清(WO98/30679)，1％非必需氨基酸，1mM L-谷氨酰胺和0.1mM β-巯基乙醇。临用前，加入4ng/ml人bFGF(WO99/20741，Geron Corp.)。
通常将ES细胞培养在一层饲养细胞上，饲养细胞一般为衍生自胚组织或胎组织的成纤维细胞。从怀孕13天的CF1小鼠收集胚胎，转移到2ml胰蛋白酶/EDTA中，然后小心切碎，37℃温育5分钟。加入10％FBS，使碎片沉淀，细胞在90％DMEM、10％FBS和2mM谷氨酰胺中增殖。为了制备饲养细胞层，辐照细胞以抑制增殖，但允许其合成支持ES细胞的因子(约4000radγ-辐射)。用0.5％明胶包被培养板过夜，每孔接种375,000辐射过的mEF，并在接种5小时到4天使用。在接种pPS细胞之前用新鲜hES培养基置换该培养基。
Geron的科学家发现，既使不用饲养细胞也可将pPS细胞维持于非分化状态。无饲养细胞培养的条件包括合适的培养基质，尤其是胞外基质，例如Matrigel或层粘连蛋白。pPS细胞以＞15,000个细胞/cm2(最佳是90,000cm2-170,000cm2)接种。通常，在细胞完全分散前终止酶解(例如，用IV胶原酶处理约5分钟)。然后将约10-2000个细胞左右的细胞块不再进一步分散直接接种在基质上。另外，在板达到汇合之前，可通过用0.5mM EDTA的PBS溶液温育5分钟，不用酶收集细胞。从培养容器中洗下后，将细胞铺在新的培养物中，不用进一步分散。
用含有支持细胞增殖但不支持分化的因子的营养培养基来支持无饲养细胞培养物。可通过在培养基中培养分泌此类因子的细胞，将这类因子引入培养基中，例如辐照过的(约4000rad)原代小鼠胚胎成纤维细胞、端粒化的小鼠成纤维细胞或衍生自pPS细胞的成纤维细胞样细胞。可条件化培养基，例如在无血清培养基(例如补充了20％代血清和4ng/ml bFGF的KO DMEM)中以约5-6×104/cm2的密度接种饲养细胞。已条件化1-2天的培养基进一步补充bFGF，然后用于支持1-2天的pPS细胞培养物。此外，还可加入其它因子，来帮助增殖而不分化，例如FGF-2或FGF-4受体的配体，c-kit(例如干细胞因子)的配体，与gp130相关受体的配体、胰岛素、转铁蛋白、脂类、胆固醇、核苷、丙酮酸和还原剂如β-巯基乙醇。无饲养细胞培养法的其它特征可参见国际专利出版物WO01/51616和Xu等，Nat.Biotechnol.19：971，2001中所述。
显微镜下，ES细胞呈高核/质比，核仁明显，形成的集落致密，细胞连接看不清楚。灵长动物ES细胞可表达阶段特异性胚胎抗原(SSEA)3和4，以及可用抗体测知的标记Tra-1-60和Tra-1-81(Thomson等，Science 282：1145，1998)。小鼠ES细胞可用作SSEA-1的阳性对照和SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81的阴性对照。SSEA-4也存在于人胚胎性癌(hEC)细胞上。pPS的体外分化不表达SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81，但提高了SSEA-1的表达，这也见于hEG细胞。
制备造血细胞及其衍生物的材料和方法
可通过在特殊的、能够富集具有所需表型的细胞(通过所需细胞生长，或者抑制或杀死其它细胞类型)的生长环境中，培养、分化或重新对干细胞程序控制，获得本发明的造血细胞。这些方法可用于许多类型的干细胞，包括前面所述的灵长类多能干细胞。
当从已建立的pPS细胞谱系衍生时，本发明的细胞群和分离的细胞与衍生出它们的细胞系具有相同的基因组。这意味着除了核型异常外，在pPS细胞和造血细胞之间的染色体DNA有90％以上是相同的，如果造血细胞是通过正常有丝分裂过程从未分化的细胞系获得的，这是不言而喻的。用重组方法处理过，以引入转基因或敲除一个内源基因的造血细胞也还是被认为与衍生出它们的细胞系具有相同的基因组，因为所有没有操作的基因元件都被保留了。
分化过程的引发
虽然对于本发明造血细胞的衍生不是必需的，发现进行衍生的一种有效方法是以非特异性方式引发分化。一种方法是导致pPS细胞形成胚状体或聚集体：例如，通过使供体pPS细胞培养物过度生长，或在具有低粘着性基质的培养容器中悬浮培养pPS细胞，从而形成胚状体。从培养物收集未分化的pPS细胞，分离成簇，然后将它们铺在非粘附细胞培养板上，在支持分化的培养基中培养(实施例1)。在该方法的一个变化形式中，从未分化的细胞培养物中以条状剥下pPS细胞，然后在分化培养基中培养，聚集形成圆形的细胞团块(实施例2)。
收回抑制分化的因子(例如可能存在于培养pPS细胞的条件培养基中)是分化过程的一部分。在某些情况下，逐渐回收这些因子，例如通过使用较低密度的饲养细胞调节的培养基是有益的(实施例3)。以非特异方式分化pPS细胞的其它方法是已知的，而且也适合引发产生造血细胞的过程：例如，通过在培养基中加入视黄酸(RA)或二甲亚砜(DMSO)；通过从培养细胞的常规胞外介质中回收(WO01/51616)，或形成原始外胚层样细胞(Rathjen等，J.Cell Sci.112：601，1999)。
驱动向造血细胞分化
为了将培养物引向造血细胞途径，在造血细胞分化因子混合物中培养未分化的或引发的pPS细胞。各因子单独或联合可以指导细胞沿造血细胞途径下游分化，导致生长出有造血细胞表型的细胞，抑制其它细胞类型的生长，或以另一种形式富集造血细胞：实施本发明不需要知道作用机制。
造血细胞因子组合的例子包括：干细胞因子(SCF)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-6(IL-6)、粒细胞-集落-刺激因子(G-CSF)-单独或与骨形态发生蛋白，例如BMP-2、BMP-4或BMP-7组合。SCF通过c-kit配体介导的二聚化诱导胞内信号，它是与血小板衍生的生长因子(PDGF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-SCF)、Flt-3配体和血管内皮生长因子(VEGF)受体有关的受体酪氨酸激酶。其它感兴趣的因子包括刺猬蛋白(SHH)、Delta-1、Jagged-1和促血小板生成素(TPO)。如实施例9和10所示，看来细胞因子能促进CD45表型(造血前体细胞)的形成，而骨形态发生蛋白能促进具有自我更新能力的前体细胞扩增。
通常合用至少两种、三种或三种以上这样的因子来建立分化混合物。优选人蛋白，但也可使用物种同源物和变体。读者可以用能结合相同受体或刺激相同信号转导途径的其它配体，例如受体特异性抗体来替换任意的这些因子。另外，可在培养基中加入其它成分，以中和其它因子(这些因子可能存在，以驱动沿不同途径下游分化)的效果。一个例子是神经生长因子的抗体，据信它帮助最大程度减少沿神经原性分化方向的细胞损失。以能支持所需细胞群扩增的营养培养基，例如含有牛清蛋白、胰岛素和转铁蛋白的无血清培养基(SF)配制分化混合物。
未分化或已引发的pPS细胞在因子混合物中培养足够的时间，使得所需表型出现。选择营养培养物是重要的，因为某些配方更支持分化过程。在培养基中加入胎牛血清(或其等价物)增强造血细胞分化因子的活性，比仅含清蛋白和激素的简单混合物高得多。在某些情况下，对此种培养物的好处超过支持造血细胞增殖的纤连蛋白等底物。
与先前的预测相反，发现在没有共同培养的基质细胞情况下，可高效的进行pPS细胞到造血细胞的分化。因此，本发明包括一种形成造血细胞的方法，该方法中在没有含基因组的细胞(至少直到在细胞群的大部分中出现造血表型以前)的情况下，培养分化的pPS细胞子代。这意味着在培养物中没有同种异型或异种细胞，例如饲养细胞、基质细胞或其它能提供分化因子或支持基质的细胞。然而，允许在该培养基中包括这些细胞，作为该方法的辅助手段，除非明显被排除。可促进分化过程的细胞包括从人骨髓分离的原代基质细胞，和MS-5小鼠基质细胞系的细胞。
用本发明的技术，可从pPS细胞衍生出具有携带祖细胞表型的造血细胞群，而这种祖细胞表型的比例是无先例的。SHH、BMP-4、SCF、IL-3、Flt-3L和IL-6的不同组合能够诱导表型和功能性造血祖细胞。在实施例3-5中，通过培养胚状体10天，然后在含有100-300ng/ml的SCF和Flt-3L、10-50ng/mlIL-3、IL-6和G-CSF、100ng/mL SHH和5-100ng/mL BMP-4(全都在含有20％胎牛血清的培养基中或含有清蛋白、转铁蛋白和胰岛素的无血清培养基中)的环境中接种，引发pPS细胞分化。8-15天后，造血细胞出现，其中8％CD45阳性、22％CD34阳性、5.6％对于两种标记都是阳性的。当在CFU试验中测试时，接种效率是350个中有一个，具重复性。在实施例9和10中，在胚状体形成后翌日，在培养基中加入细胞因子和BMP-4，然后在15-22日后进一步增加CD45阳性细胞的比例。BMP-4的存在使得用户能够获得细胞群，其中每个原代CFU形成4、10或更多的次生CFU，表明自身更新性造血祖细胞存在。
pPS衍生的造血细胞的进一步成熟
根据上面的描述获得了含有高比例的祖细胞pPS衍生的造血细胞，这对于治疗弥散性造血细胞不足和体外研究造血细胞分化具有特别的意义。本发明还包括可用于治疗特定病况和某些体外药物筛选应用的更成熟的细胞群。
有两种方法可获得本发明的成熟造血细胞。在一种方法中，通过在含有合适的成熟因子的培养基中培养，进一步分化上面获得的造血细胞群。在另一种方法中，以非特异性方式引发分化的细胞群被直接进入成熟步骤。
所用的促成熟细胞因子视最终的细胞类型而定。如实施例4所述，可通过在含有SCF、GM-CSF、IL-3和促血小板生成素(EPO)的环境中培养，从胚状体产生造血细胞集落。这驱动培养物朝骨髓细胞衍生，得到含有约66％的红细胞样细胞集落、约19％单核细胞集落、和约15％粒细胞集落的培养物。可用的其它因子包括粒细胞的G-CSF、单核细胞的M-CSF、淋巴样细胞的IL-2和IL-4、巨核细胞的TPO和红细胞样细胞的EPO。
造血细胞的特征
可根据许多表型标准特征分析细胞。这些标准包括但不限于显微镜观察形态特征、检测或定量表达的细胞标记、体外可测定的功能性标准、和灌注入宿主动物后的行为。
表型标志：
未分化的hES细胞：SSEA-4、Oct-4
原始造血细胞：CD34、AC133、c-kit、CD38。
成熟多能造血细胞：CD45
红细胞样细胞：血型糖蛋白A
早期骨髓细胞：CD33
单核细胞：CD14、CD64、HLA II类
粒细胞：CD13、CD15
淋巴样细胞：CD19、免疫球蛋白(B细胞)、CD3(T细胞)
巨核细胞：CD56
可用任何合适的免疫学技术，例如细胞表面标记的流式免疫细胞化学，或胞内或细胞表面标记的免疫组织化学(例如固定细胞或组织切片)，来检测组织特异性标记。Gallacher等，Blood 96：1740，2000提供了详细的流式细胞计数分析的方法。如果在标准免疫细胞化学或流式细胞计数中，任选在细胞固定后，和任选使用标记的二抗或其它偶联物放大标记后，显著可检测量的抗体与细胞表面的抗原结合，定义细胞表面抗原的表达为阳性。
还可通过Northern印迹分析、斑点印迹杂交分析或通过反转录酶引发的聚合酶链式反应(RT-PCR)，用序列特异性探针，以标准扩增方法在mRNA水平检测组织特异性基因产物的表达。见美国专利号5,843,780。该公开文献中列出的具体标记的序列数据可从公共数据库，例如GenBank中获得。
本发明的一些实施例涉及的造血细胞中至少5％、10％、20％或40％CD34阳性；1％、2％、5％或10％CD45阳性(或与CD34双阳性)；50％、70％或90％为CD14、CD14、CD19阳性；和不到5％、1％或0.2％以下对SSEA-4阳性或Oct-4阳性。这些特征的不同组合可存在于特定的细胞群中。
功能性特征
可用功能标准确定本发明的细胞的特征。见T.A.Bock(Stem Cells 15Suppl 1：185，1997)对于造血祖细胞的实验系统回顾。
常用的复制性造血细胞测试是这些细胞在集落形成(CFU)试验中形成集落的能力。经典试验是Till和McCulloch(Ser.Haematol 5：15，1972)的脾集落形成试验。现在，集落形成试验通常在补充有生长因子的甲基纤维素基质中进行。除了另有特别要求外，本文所指的CFU试验是如实施例2所述进行的。
一旦形成集落，可通过形态标准对其进行评估并分类成爆发集落形成单位-红细胞样细胞(BFU-E)、集落形成单位-粒细胞-巨噬细胞(CFU-GM)、集落形成单位-巨核细胞(CFU-M)、集落形成单位-红细胞样细胞(CFU-E)和可产生全部4种细胞类型的多能集落(CFU-GEMM)。接种效率是输入细胞对形成集落之比。根据本发明的方法制备的造血细胞可具有大于1/2000、1/500，在某些情况下大于1/100的接种效率。
可根据这些细胞的已知特征确定最终分化的细胞的功能标准：例如，巨噬细胞吞噬颗粒、递呈抗原或响应合适的细胞因子的能力；粒细胞和血小板释放合适的介质的能力；和淋巴细胞在混合淋巴细胞反应中，响应受过辐射的同种异体刺激细胞的增殖能力。
动物模型实验
对造血细胞在临床中具有可观兴趣是由于细胞群重建宿主动物的造血系统的能力。可用几种完全建立的动物模型测试重建。
可在经过基因改造，预防异植体排斥的小鼠中评估造血活性细胞的重建。特别推荐的是NOD/SCID小鼠，它含有非肥胖性糖尿病(NOD)基因型，与具有重度联合免疫缺损(SCID)的小鼠杂交。Larochelle等，Nat.Med.2：1329，1996；Dick等，Stem Cells 15：199，1997；和Vormoor等，J.Hematother.2：215，1993描述了该模型的用途。简单说，对小鼠进行亚致死辐照，然后通过尾静脉注射约3-4×106CD34阳性细胞。8周后，从股、胫或髂嵴收集骨髓细胞，进行表面表型和CFU试验分析，证明用施用的人细胞重建。由于重建产生了嵌合现象和一定程度的免疫耐受，可在较不严重受损的免疫系统，例如(为了增加精确性)未辐照的NOD/SCID小鼠、常规SCID小鼠、裸鼠和有免疫能力的小鼠中测试该造血细胞。
可在其它动物模型中对造血能力进行进一步的临床前研究。合适的大型动物异植体模型是绵羊，利用其胎儿骨髓中胎儿免疫力未成熟和发育空间使得可移植造血干细胞，而不需要条件化骨髓。这避免了与辐照、化疗或遗传缺陷性宿主有关的可能基质异常。在该模型中，人干细胞在骨髓中定居并持续多年，能够多谱系分化，显示对人细胞因子的应答性，并保留移植到次代受体的能力。见Zanjani等，Int.J.Hematol.63：179，1996；和Zanjani等，J.Clin.Invest.Med.93：1051，1994。C.E.Dunbar，J.Intern.Med.249：329，2001和Donahue等，Hum.Gene Ther.12：607，2001提供了灵长类模型。还可在非人灵长类中，用匹配的非人pPS细胞制备物测试本发明的细胞群能否分化成造血细胞。见Thomson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：7844，1995；和Thomson等，Bio.Reprod.55：254，1996。
造血细胞的基因修饰
本发明的造血细胞具有显著的增殖能力。如需要，可通过提高细胞中的端粒酶反转录酶(TERT)水平，或提高内源基因的转录，或引入转基因进一步增强其复制能力。特别合适的是国际专利申请WO98/14592中的人端粒酶(hTERT)的催化成分。Bodnar等，Science 279：348，1998和Jiang等，Nat.Genet.21：111，1999描述了人细胞中端粒酶的转染和表达。可根据标准方法，通过RT-PCR、端粒酶活性(TRAP分析)、hTERT的免疫细胞化学染色、或复制能力评估基因改变的细胞的hTERT表达。还考虑了无限增殖细胞的其它方法，例如用编码myc、SV40大T抗原或MOT-2的DNA转化细胞(美国专利5,869,243，国际专利申请WO97/32972和WO01/23555)。
根据本发明的方法制备的细胞群显著没有未分化的pPS细胞。如需要，可体外制备本发明的细胞，或进一步处理以除去未分化的细胞，或保护避免体内成为回复体。从细胞群中消除未分化干细胞的一种方法是用一种载体转染细胞群，其中效应基因在一启动子控制下，该启动子导致在未分化细胞中优先表达-例如TERT启动子或OCT-4启动子。效应基因可以是指导细胞分拣的报道基因，例如绿色荧光蛋白。效应物可以直接裂解细胞，编码例如毒素或凋亡的介体，例如天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Shinoura等，Cancer GeneTher.7：739，2000)。效应基因可以使得细胞对外源药剂，例如抗体或前药的毒性效果敏感。一个例子是单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)基因，它导致表达它的细胞对更昔洛韦敏感(WO 02/42445)。或者，效应物可以导致细胞表面表达一种外源决定簇，该决定簇能使任何回复成未分化表型的细胞对体内天然存在的抗体敏感(GB 0128409.0)。
本发明的细胞可以经基因改造而增强它们参与组织再生的能力，或对受到治疗的个体传递治疗性基因。用所需基因的已知编码序列，与组成型或在造血细胞中特别活跃的启动子操纵性连接，设计载体。下文描述了基因治疗中转基因的用途。
造血前体细胞及其衍生物的用途
本发明提供了一种产生大量红细胞样细胞、粒细胞、单核细胞、巨核细胞和淋巴样细胞系的造血前体细胞和造血细胞的方法。这些细胞群可用于许多重要的研究、开发和商业目的。
本发明的细胞可用于制备一种cDNA文库，该文库相对不含有在其它细胞系细胞中优势表达的cDNA。本发明的分化细胞还可用于根据标准方法制备对造血前体细胞的标记及其衍生物具有特异性的单克隆或多克隆的抗体。
特别感兴趣的是本发明的组合物可用于造血细胞病理学的药物开发、临床治疗、和在其它类型移植治疗中诱导选择性免疫耐受。
药物筛选
本发明的造血细胞可用于筛选能影响造血前体细胞及其各种子代的特性的因子(例如溶剂、小分子药物、肽、多核苷酸)或环境条件(例如培养条件或操作条件)。
在一些应用中，用pPS细胞(未分化或加入分化样式)筛选促使造血细胞成熟，或促使这样的细胞在长期培养物中增殖或维持的因子。例如，可通过将其加入不同孔的细胞中，然后测定其导致的表型改变，根据所需的进一步培养和细胞用途的标准来测试候选的成熟因子或生长因子。
本发明的其它筛选应用涉及测试药物组合物对造血细胞生长、发育或毒性的潜在影响。进行这类筛选是因为要设计对造血细胞具有药物疗效的化合物，或者是因为要设计对与造血系统有不良副作用的化合物。
读者一般可参考标准教科书“In vitro Methods in PharmaceuticalResearch”，Academic Press，1997，和美国专利5,030,015。候选药物化合物活性的评估一般涉及将本发明的分化的细胞与候选化合物单独混合或与其它药物混合。本研究者可通过测定该化合物引起的细胞形态、标记表型、或功能活性的任何改变(与未处理的细胞或用惰性化合物处理的细胞相比)，然后将该化合物的作用与观察到的改变相关联。
可首先通过对细胞活力、存活、形态和某些标记和受体的表达的影响来测定细胞毒性。可通过测定DNA合成或修复来确定药物对染色体DNA的作用。[3H]-胸腺嘧啶或BrdU掺入法，尤其是在细胞周期中不定时间的掺入，或高于细胞复制所需的水平是与药效一致的。不良影响还包括用中期涂布法确定的姐妹染色单体交换的异常速率。读者可参考A.Vickers(“In vitro Methods inPharmaceutical Research”，Academic Press，1997”pp.375-410)的进一步详述。
可用任何标准试验观察表型或造血细胞活性，评估细胞功能的影响。包括对表型标记的分析和衡接触药物导致的各种表型平衡中的变化。还包括前述集落形成试验和重建试验。
造血细胞重建
本发明还提供了用造血前体细胞或其衍生物恢复需要该治疗的病人体内的造血功能。
可用造血祖细胞群和衍生的细胞群治疗急性或慢性造血功能紊乱。这些病况包括先天或后天的红细胞样细胞、粒细胞、巨噬细胞、巨核细胞、或淋巴样细胞谱系的基因缺陷，不健全的造血能力导致的贫血、再生障碍性贫血、脊髓发育不良综合征、偶尔接触辐射、和有生命危险的自身免疫性疾病，例如狼疮。
特别感兴趣的是治疗癌症，例如白细胞、淋巴瘤和某些化疗敏感的和转移活跃的实性肿瘤，例如骨髓瘤和乳癌。病人经历骨髓烧蚀辐射(1200cGy)或用环磷酰胺、塞替哌或依托泊甙等药物的化疗，然后用本发明的造血细胞重建。预先培养大量的这些细胞的能力节约了自体骨髓移植的时间限制，并消除了由于自身细胞制备物中残留的肿瘤细胞重新引入肿瘤的危险。
只要可能，待给予细胞的组织相容性和待治疗病人的组织相容性相匹配是有益的。相同的匹配、或在HLA-A、HLA-B，和HLA-DR座位匹配的细胞是优选的。大获得型pPS细胞衍生的造血细胞祖细胞库，尤其是HLA等位基因纯合子细胞使得匹配更容易。当不能得到精确匹配时，在一个或两个I类或II类基因座的匹配也是有帮助的。在某些这样的情况下，进一步操纵细胞可帮助最大程度减少移植物抗宿主疾病(GVHD)-例如给予去除了T细胞的细胞群(例如用针对CD2、CD3或CD4的抗体去除T细胞)。
通常将要施用的造血细胞以无菌等渗缓冲液配制成浓缩细胞悬液。融化冷藏或低温保藏的袋装干细胞，并以20-50ml等份通过中央静脉导管灌注。粗略的说，每公斤3.5×106CD3阳性细胞的剂量可能是合适的，视CFU试验接种效率而定。在重度骨髓抑制后，嗜中性细胞计数可能下降到100个细胞/微升以下，而输液依赖性血小板减少症低于10000/微升，病人应补充血小板和匹配的红细胞。移植物首先出现在约7-21日，其标志是在血液中观察到嗜中性粒细胞和早期的造血细胞重建。一旦移植确立，造血细胞重建是迅速的，在14-28天出现足够的嗜中性粒细胞(1000/微升)和血小板(20,000/微升)。生长因子，例如G-CSF和GM-CSF可增强治疗效果。
标准教科书，例如Textbook of Internal Medicine，第三版，W.N.Kelley编，Lippincott-Raven，1997提供了造血细胞及其前体在临床医学中应用的一般方法；具体的参考文献可见例如Hematopoietic Stem CellTransplantation，A.D.Ho等编，Marcel Dekker，2000；Hematopoietic CellTransplantation，E.D.Thomas等编，Blackwell Science Inc.，1999；Hematopoietic Stem Cell Therapy，E.D.Ball，J.Lister & P.Law，ChurchillLivingstone，2000。
临床治疗中造血干细胞的应用是正在进展的领域，对于临床医师来说可存在其它用途。本发明的细胞的用途和剂量的最终责任由主治医师负责。
基因治疗
本发明的细胞不仅可用于重建造血功能，还可以用于矫正或补充其它可通过基因治疗而改善的缺陷。造血细胞作为基因表达的储存库，具有一些优点：它们可在整个体内循环和持续再生。细胞可以在施用前体外基因修饰并测试，避免了对病人施用基因载体的不确定性。
为了进行本发明的基因治疗，可用含有治疗性编码区(在组成型或造血细胞特异性启动子控制下)的转基因，以能建立稳定修饰的技术；例如反转录病毒或慢病毒载体，或通过同源重组修饰所述细胞。修饰可以在造血细胞的增殖性培养物上进行，也可以在pPS细胞未分化时进行修饰，然后分化。然后评估细胞的造血功能和转基因的表达。
在充分测试后，对需要基因治疗的病人施用细胞，然后对其进行生物化学和临床监测缺陷的矫正。当组合物与要治疗的个体HLA相容时，不需要在治疗之前对病人进行重度骨髓抑制，如果病人自身的细胞和基因改变的细胞的混合物提供了表达治疗基因的充足储存库。
见Murdoch等(FASEB J.15：1628，2001)描述了造血干细胞作为子宫基因治疗的新目标。一般文献包括Stem Cell Biology and Gene Therapy，P.J.Quesenberry等编，John Wiley & Sons，1998；和Blood CellBiochemistrytherapy：Hematopoiesis and Gene Therapy(Blood CellBiochemistry，卷8)，L.J.Fairbairn & N.G.Testa编，Kluwar AcademicPublishers，1999。这些参考文献讨论了干细胞作为基因治疗载体的治疗可能性；基因治疗的传递系统和示范性临床应用。
在再生医学中诱导特异性免疫耐受的细胞组合物
本发明的细胞还可以诱导对特定组织类型的免疫耐受，用于准备与病人不匹配的同种异体移植物的移植。所选择的耐受细胞应与同种异体移植物具有相同的组织相容性标记，在用一类能使病人所需要的细胞功能再生的细胞治疗之前或之中施给病人。导致的免疫耐受随后减少了同种异体移植物急性或慢性排斥的危险。
有效的细胞组合含有两种成分：第一类细胞用于诱导免疫耐受；第二类细胞用于再生所需的功能。可从pPS细胞和其它来源衍生出各种临床上有用的细胞类型，用于再生性医学。
例如，可根据国际专利出版物WO 01/18804和申请PCT/US02/19477(GeronCorporation)中所述的方法从pPS细胞产生神经细胞。在含有一种或多种神经营养因子和一种或多种有丝分裂原的培养基中培养未分化的pPS细胞或胚状体细胞，产生一群细胞，其中至少约60％细胞表达A2B5、聚唾液酰基NCAM、或Nestin，至少能在培养物中倍增20次。示范性的有丝分裂原是EGF、碱性FGF、PDGF和IGF-1。示范性的神经营养因子是NT-3和BDNF。然后让正在增殖的细胞通过与不含有丝分裂原的神经营养因子一起培养，经过终末分化。可产生含有高比例酪氨酸羟化酶阳性细胞的细胞群，这是产多巴胺神经元的特征。
可通过将pPS细胞作为细胞聚集体悬浮培养在含有有丝分裂原(例如FGF)，和少突神经胶质细胞分化因子(例如三碘甲腺原氨酸、硒和视黄酸)中产生少突神经胶质细胞。然后将细胞铺在固体表面，除去视黄酸，扩增细胞群。可通过铺在聚-L-赖氨酸上，除去所有的生长因子进行终末分化。可获得90％以上的细胞都是GalC阳性的细胞群。
可用pPS根据美国专利6,458,589和PCT出版物WO 01/81549(GeronCorporation)所述的方法产生肝细胞。在组蛋白脱酰酶抑制剂存在下培养未分化的pPS细胞。在示范性方法中，用1％DMSO(4天)，然后2.5mM组蛋白脱酰酶抑制剂正丁酸酯引发分化。可将获得的分化细胞在含正丁酸酯DMSO加生长因子(例如EGF)，肝细胞生长因子和TGF-α的肝细胞培养基中培养4天使其成熟。
可根据PCT/US02/22245中提供的方法从pPS细胞产生心肌细胞或心肌细胞前体。在含有影响DNA甲基化的心脏营养因子，例如5-氮胞苷的生长环境中培养pPS细胞。然后将细胞群的其它细胞通过密度离心与自发性收缩的细胞分开。其它处理步骤可包括在含有肌酸、卡尼汀或氨基乙磺酸的培养基中培养细胞。
可用PCT/US02/20998中所述的方法从pPS细胞产生成骨细胞及其祖细胞。在含有成骨因子(例如骨形态发生蛋白，特别是BMP-4、人TGF-β受体的配体、或人维生素D受体的配体)的培养基中分化pPS衍生的间充质细胞。可通过在例如活化素A、烟酰胺等因子和其它美国专利申请60/338,885中列出的其它因子中培养pPS细胞及其衍生物，产生分泌胰岛素或其它胰脏激素的细胞。可通过和美国专利申请60/339,043中列出的分化因子的有效组合一起，以微聚集体培养pPS细胞，产生软骨细胞或其祖细胞。
为了诱导对要植入同种异体移植受体体内的这些分化细胞的耐受，用“耐受”细胞(能导致对同种异体移植细胞较低的炎症或免疫学反应的细胞)预先处理或共处理病人，例如可通过注射位点的白细胞浸润、抗体或MLR活性的诱导、或同种异体移植细胞的存活时间增加测定的。当目的是促进同种异型特异性耐受时，所选耐受性细胞应是与同种异体移植细胞“MHC相容”。这意味着至少耐受细胞与同种异体移植细胞在A、B或C基因座处至少有一个相同的MHC I类单元型。更优选相匹配，即耐受细胞携带有同种异型移植物的A单元型和/或B单元型之一或两者。在不能精确匹配时，可通过建立来自不同谱系的MHC相容性细胞混合物，制备含有同种异体移植细胞群多种单元型的耐受性细胞。还可以通过从同一pPS细胞系衍生两种细胞群，将耐受细胞基因裁剪成同种异体移植细胞。
在本发明的一个实施例中，耐受性细胞是如上所述获得的pPS衍生的造血细胞，携带一种或多种特征性表型或功能特征。特别感兴趣的造血细胞群，是含有或可以产生免疫调节性T细胞、树突细胞及其前体，或能在施用后形成免疫嵌合性的细胞。另一实施例中，用于诱导免疫耐受的细胞(或其一部分)仍然具有未分化pPS细胞的特征。如实施例6-8所示，未分化的pPS细胞常常缺乏明显的MHC II类抗原。它们能够活跃的抑制炎症反应和同种异体移植及异种免疫反应(针对其自身，和针对第三方的刺激性细胞)。
在某些情况下，担心未分化的pPS细胞或早期祖细胞可能在施用后以失控方式生长或分化，产生恶性肿瘤或其它不良增生物。处理该担心有几种解决方法。一种方法是对未分化的细胞装配一个自杀基因(例如胸腺嘧啶激酶)，使得前药更昔洛韦对细胞具有毒性(WO 02/42445)。诱导耐受后，可通过施用该前药从个体中剔除未分化的pPS细胞。另一种方法是将未分化pPS细胞灭活到一定程度，使其不再能够在体内增殖，但仍然可以具有免疫抑制所需的活性(实施例7和8)。未分化的pPS细胞可通过辐照(约1000-3000 Rads)或用丝裂霉素c或其它灭活性化疗、交联、或烷基化剂处理，事先灭活，以抑制或预防细胞分裂。
本节所述的细胞组合物为再生医学提供了一种重要的新系统。国际专利出版物WO 02/44343提供了几种啮齿类和非人灵长类模型，用于评估耐受性方案的存活率和随后的组织再生。
通过施用第一群细胞，以诱导对第二群细胞的耐受，对人个体进行治疗。为了帮助平息局部炎症，可对接受再生性同种异型移植物的同一部位给予所述耐受性细胞。或者，为了帮助产生造血细胞嵌合体，可系统性给予该耐受性细胞。可通过在单向混合的淋巴细胞反应中，用同种异体移植细胞作为刺激剂，测试病人的血液淋巴细胞，以确定是否有耐受诱导(实施例7)。增殖应答降低显示了成功的耐受诱导。可通过评估循环单核细胞的HLA型和造血细胞表面标记评价受体的造血嵌合性。
同时或随后对病人施用相容的神经元、少突神经胶质细胞、肝细胞、心肌细胞、间充质细胞、成骨细胞、激素分泌性细胞、软骨细胞、造血细胞或一些其它的细胞类型以治疗其疾病。在该过程后，病人受到必需的支持护理，并用合适的生物化学标记和临床标准监测其功能的改进。
对于本公开中描述的任何治疗目的，本发明的造血或免疫耐受性细胞通常是以药物组合物的形式提供的，其中含有用于人给药的在充分无菌的条件下制备的等渗赋形剂。可独立包装并销售有效的细胞组合，或采用置于药盒中的独立容器形式，或可以互相混合(为了同时对同一位点给药)。本发明还包括制造、销售或使用过程中的细胞组。细胞组含有本文所述的两种或多种细胞群的任意组合，例如但不限于一类分化的pPS-衍生的细胞(造血细胞、神经细胞等)联合未分化的pPS细胞或其它分化的细胞类型，有时具有相同基因组或MHC单元型。该组中的各细胞类型可包装在一起，或装在同一设备的不同容器中，或在不同位置，处于同一企业，或有商业关系的不同企业控制下。
对于细胞组合物的药物制剂的基本原则，读者可以参考G.Morstyn &W.Sheridan编，Cell Therapy：Stem Cell Transplantation，Gene Therapy，and Cellular Immunotherapy，Cambridge University Press，1996。用于药物销售和使用的本发明的产品可任选的包装在合适的容器或药盒中，配有用于所需目的，例如重建血液功能、基因治疗或免疫耐受诱导的说明书。
下列实施例提供了本发明具体实施方式的非限制性说明。
实施例
实施例1：胚胎干细胞的无饲养细胞繁殖
将未分化的人胚胎干细胞(hES)的已建立细胞系维持在基本无饲养细胞的培养环境中。
事先按照标准方法(WO 01/51616)用分离的原代小鼠胚胎成纤维细胞(mEF)制备条件培养基。
在Matrigel包被的平板上传代hES培养物。接种后约一周，培养物变得汇合，可以传代。在这些条件下维持培养物超过180天，并持续显示ES样形态。hES集落表达SSEA-4、Tra-1-60、Tra-1-81和碱性磷酸酶，如免疫化学评估的，但集落之间的分化的细胞不表达。通过将集落用于产生特定细胞类型的已建立的方法，确定了多能性。
实施例2：未分化的hES细胞培养物中缺乏造血细胞表型
用流式细胞计数和集落形成试验(CFU)分析H1 hES细胞系中未分化的细胞，以确定处于未分化状态的造血细胞的特征。
用胰蛋白酶-EDTA(1％胰蛋白酶、2％EDTA，Gibco)在室温下10分钟，或细胞分离缓冲液(CDB)37℃10分钟(EDTA和高盐，Gibco)处理从无饲养细胞培养物中收集细胞。离心沉淀收集细胞，重新悬浮在含有10％ FCS的IMDM(Iscove改良Dulbecco培养基)中，然后滤过85微米的尼龙筛。将其重新悬浮在含有3％ FCS的200微升PBS中，在室温下与2微升抗体保温15分钟。洗涤细胞两次，用15微升/ml 7AAD(Immunotech)在室温下染色15分钟。
图1显示了结果。活细胞(门控7AAD阴性；i栏)进一步用大小(ii)门控筛选，以分析未分化ES细胞群中造血细胞表面标记(iii-vi)的表达。基于培养基对照，排除150以下的具有正向散射特征的细胞。根据各图顶部标出的独立试验个数(n)，细胞百分数表示成平均值±SEN。
用基于各目的同种型对照(插页)划分的四象限分析未分化H1(A，B)和H9细胞(C，D)的各人造血细胞标记(iii-vi)的表达。没有细胞表达人造血细胞标记CD45，仅1.2％是CD34阳性(原始人造血细胞的标记，栏iii)。分析了这些细胞的其它原始造血细胞标记，包括c-kit(iv)、CD38(v)和AC133(v)的表达。事实上没有细胞表达CD38，但22-33％是c-Kit阳性，13-52％是AC133阳性。12-38％表达MHC I类抗原(HLA-A，B和C)(vi)。
如下进行CFU试验。收集未分化的细胞，将2×105台盼蓝阴性细胞接种在含有50ng/ml SCF、10ng/ml GM-CSF(Novartis)、10ng/ml IL-3(Novartis)和3U/ml EPO(Amgen)的MethocultTM H4230甲基纤维素(StemCellTechnologies Inc.，Vancouver BC)中。在该生长因子混合物中加入25ng/mlBMP-4和300ng/ml Flt-3L，没有提高未分化hES细胞系中所测到的造血细胞克隆形成性祖细胞。培养物在37℃、5％CO2，湿润空气中培育，并监测集落形成达40天。用形态特征(如红细胞系)和微红色指示的血红蛋白可区别集落的亚型。结果见表1。
表1：未分化hES细胞的CFU能力
hES细胞系 CFU阳性孔 CFU数 CFU亚型
H9(n＝3) 1/6 ＝16.6％ 3 红细胞样
H1(n＝4) 0/9 ＝0％ 0 (无)
H1谱系的未分化hES细胞在4个独立试验，9个独立的孔中不能产生造血细胞集落。用未分化的H9细胞获得类似结果，除了在一个试验中形成了3个小的红细胞样集落。
实施例3：与造血细胞分化因子一起培养的hES细胞的造血细胞表型
在该实验中，hES细胞的H9谱系分化成造血祖细胞，用流式细胞计数评估表型。
用巴斯德吸管横切汇合细胞的6孔板的孔径，直到形成聚集的细胞，形成hES细胞条带。将每条条带悬浮在非条件性培养基中(含有20％FCS的KODMEM)，培养10天。此时，培养物含有细胞圆球，在下面的实施例中称作胚状体。许多细胞如形态学标准和台盼蓝染色评估那样不是活的细胞。
收集胚状体，分散并接种在粘附性组织培养皿或纤连蛋白包裹的皿中。培养基是BIT培养基(BSA、胰岛素和转铁蛋白；StemCell Technologies，Vancouver BC)，补充有0.1mM β-巯基乙醇、2mM L-谷氨酰胺和下列重组人生长因子：300mM干细胞因子(SCF，Amgen)，300ng/ml Flt-3配体(Flt-3L，R &D Systems，Minneapolis，MN)，50ng/ml G-CSF(Amgen)，10ng/ml I1-3(Novartis，Dorval QC)和10ng/ml IL-6(R & D Systems)。分化后，用流式细胞计数评估H9细胞对造血细胞表面标记的表达。
图2比较了未分化的hES细胞及其衍生物上检测到的细胞表面标记。用于正确评估流式细胞计数数据的门控策略包括排除小于150的正向散射特征确定的碎片(栏Ai)，用活力染料7AAD排除死亡和濒死的细胞，该染色的阳性定义为那些要排除的细胞(栏Aii)，和用按同种型对照(插页)划分四象限。百分数已基于同种型对照进行了校正。未分化细胞不具有CD45，0.1％细胞是CD34阳性(栏A iv)。35％未分化的H9细胞表达AC133(栏A v)。从AC133阳性和CD34阴性的骨髓中分离出的原始造血细胞能重新建立免疫缺陷小鼠的细胞群。
下面显示在不存在(栏B)或存在(栏C)BMP-4的情况下与SF+HGF一起，培养分化细胞的分析。在分化后，0.9％细胞表达CD45，原始表面标记CD34从0.1％增加到1.5％(栏B iv)。没有细胞同时表达两种标记。AC133阳性细胞从35％减少到14％(栏B v)。在这些无血清培养物中加入BMP-4得到与未分化的hES细胞类似比例的CD45阳性细胞(0.3％)和CD34阳性细胞(0.2％)。然而，在BMP-4存在下分化再次减少了AC133的表达(10％栏C iv)。
实施例4：分化的hES细胞的造血细胞集落形成
图3显示了评估从hES细胞的H1谱系分化的细胞的造血能力的流程。在mEF制备的条件培养基中，以常用密度的一半培养，传代3次，引发分化。然后细胞条在KO DMEM+20％FCS中培养，如前形成胚状体。此时，收集孔(含有胚状体细胞和死细胞)中的所有内容物或分离单个胚状体，排除死细胞。用CFU试验(如实施例2中所述进行，含有或不含BMP-4几乎观察不到影响)评估收集的细胞。然后用流式细胞计数评估CFU试验得到的细胞的表面表型。
图4显示了结果。左上角的显微照片显示了CFU试验中典型培养物孔的外观(放大100倍)。该培养物含有能大量增殖的细胞，和使人联想起巨噬细胞、粒细胞和红细胞样祖细胞的各种形态特征。深色的小块是试验培养物中的死细胞。卵形高亮区显示的是血红蛋白化的一簇细胞(红色)，说明是红细胞样细胞。
合并CFU培养物，用针对血型糖蛋白A(表示红血细胞前体)；CD45(表示造血细胞)；CD34、CD38和AC133(都表示原始人造血细胞)；和CD19(表示B淋巴细胞)的一抗染色。CD45阳性染色(83-86％)确认了造血细胞的存在(栏A i和ii)。血型糖蛋白A(4％)的阳性染色确认了红细胞样细胞的存在(栏A i)。如预期的，血型糖蛋白A阳性的细胞不对CD45染色。早期造血祖细胞占了该培养物的一小部分，因为0.7％是CD34阳性而0.2％是AC133阳性。CFU培养物中排除了CD19阳性细胞(B淋巴细胞)，具有小百分数的CD33阳性细胞(0.9％)。CD33是髓样途径中早期细胞的标记，与淋巴样谱系不同。由于CFU试验针对形成髓样祖细胞，不奇怪没有观察到淋巴样细胞。
试验培养物中的CFU亚型如栏B所示。培养物中总输入20,000细胞，总CFU计数是47，意味着需要形成一个单集落所需的平均数目(接种效率)是1/425。
还对单个挑出的确定亚型的集落进行了流式细胞计数分析。选择两个集落，它们都具有栏C中绘出的粒细胞形态(放大50倍)。集落如粒细胞集落预期的那样，是81-92％CD45阳性(栏Ci和iv)，73％CD13阳性(栏Ci)。低水平的CD15说明它位于发育的髓细胞阶段的造血细胞层次。还发现了原始标记，例如CD34和c-kit在该集落中以6％和12％存在，而不表达AC133。
为了确定胚状体单独的祖细胞分布，从分化培养物中分离得到单个胚状体，如前进行CFU试验。在各试验中总共放置了50,000个分化的细胞，在评估之前培养11天。
图5显示了结果。存在几种CFU亚型：红细胞样细胞(放大100倍)、粒细胞(放大100倍)和巨噬细胞(放大200倍)。基于培养物中祖细胞总数的定量评估(77个集落)揭示了朝红细胞样谱系的倾向，接种效率为649个输入细胞中有1个(栏B)。用流式细胞分析两个红细胞样集落，发现93％是血型糖蛋白A阳性。
实施例5：次生集落形成
在最后一个实施例中的CFU试验中挑取单集落，并在次生CFU试验中将它们重新接种，测试次生祖细胞的存在。基于整个内含物分化方案进行CFU试验的两个原始集落，和分离的胚状体分化方案的两个集落，分别在次生CFU试验中接种传代。
图6显示了结果。整个内含物方案的两个粒细胞集落在次生试验中形成了许多集落。
栏A显示了衍生自82,500个细胞的一个原代集落的不同次生集落，显示了粒细胞、巨噬细胞、红细胞样细胞集落和GEMM集落(粒细胞、红细胞样细胞、巨噬细胞和巨核细胞类型的混合物)。集落数目如下所示。收集次生集落，并合并用于流式细胞计数。有高水平CD45表达(45％，表示造血非红细胞样细胞)，但是CD34水平低(栏Av)。次生试验中的细胞是CD13阳性(35％；栏A vi)，与衍生出它的原代集落一样。CD14(表示单核细胞)表达低(2％，栏A vii)。血型糖蛋白A阳性细胞仅占合并的试验培养物的小部分(1.2％；栏A viii)，但如形态学标准评估的，清楚存在红细胞样祖细胞。
栏B显示了从不同的原代粒细胞集落(由12,500个细胞组成)获得的次生集落。总共获得14个次生集落，全都是巨噬细胞样集落。整个CFU试验群的流式细胞计数显示，细胞是50％CD45阳性，0.7％CD34阳性，57％CD13阳性，表示存在单核细胞或粒细胞类型。
显示次生集落形成，表示最初的细胞是原始祖细胞，具有比原始CFU试验中形成骨髓细胞的集落的典型增殖能力更高。
实施例6：未分化的hES细胞上MHC表达的特征确定
人组织上MHC抗原的表达决定了体外和体内同种异体特异性T细胞应答的结果。MHC II类主要在骨髓衍生的细胞和胸腺表皮上表达。它将抗原递呈给免疫系统，以引发特异性免疫应答。相反，MHC I类几乎在所有哺乳动物细胞上表达。它在免疫系统的效应臂上起作用，当宿主细胞被组织不相容或含有外源基因的病毒感染时，可被特异性T淋巴细胞识别。
通过免疫染色和流式细胞计数分析未分化hES细胞上的MHC表达。用于这些研究的hES细胞系是：H1(传代36-45)、H7(传代37-43)和H9(传代31-40)。使用了下列抗体：HLA-A、B、C；HLA-DP、DQ、DR(BD-Pharmingen)。细胞和抗体一起在0℃保温，洗涤，并用二碘化丙锭对染。在FACScanTM或FACScaliburTM流式细胞计数(Becton Dickinson)上进行流式细胞计数分析。
图7显示了结果。灰线表示MHC抗体染色；实线表示同种型对照。H1、H7和H9 hES细胞系都表达MHC I类(n＝26)，人胎儿脐带血单核细胞也是一样(CBMC；n＝4)。hES细胞没有可检测的MHC II类(第二个峰)。最后栏中的插入显示用50-100单位γ干扰素(IFN)处理hES细胞仍然不能诱导可检测的MHC II类表达。
实施例7：培养物中未分化hES细胞的免疫抑制
在混合淋巴细胞反应(MLR)中测定hES细胞诱导同种异体T细胞增殖的能力。发现hES细胞系不能诱导原代人T细胞的同种异体反应性，即使用IFN-γ刺激后。
用Ficoll-HypaqueTM密度梯度(Amersham Pharmacia)离心从肝素化的血液中分离外周血单核细胞(PBMC)，重新悬浮在含有10％ FBS的RPMI 1640培养基中。或者，为了富集T淋巴细胞，将分离的细胞在37℃保温2小时，收集未粘附的细胞，冷冻在60％AIM-V、30％胎牛血清(FBS)、10％DMSO中备用。将剩余的粘附的细胞在含有10ng/ml的人重组GM-CSF和10ng/ml IL-4(R&DSystems)的AIM-V中培养7天，制备树突细胞(DC)。混合淋巴细胞反应如下进行：辐照刺激物细胞(DC，3000rad；BJ成纤维细胞，3000Rad；或hES细胞系，1000Rad)，然后将1×105-1×102个细胞置于96孔圆底平板的AIM-V培养基中。以每孔1×105的浓度加入反应物PBMC或T细胞，将平板在AIM-V中培养5天。然后各孔加入[3H]胸苷(1μCi每孔)培育16-20小时，收集并计数。
图8显示了结果(来自3个献血者的多个孔的平均刺激指数±SEM)。hES细胞不能诱导PBMC应答细胞中的同种异体T细胞增殖，而用PBMC作为刺激细胞时观察到显著的T细胞增殖。类似的，用胎儿血单核细胞作为反应细胞，当用hES细胞作为刺激细胞时，没有观察到显著的增殖(栏A)。当用富含T细胞的(耗竭单核细胞)的PBMC作为应答细胞时，也观察到hES细胞系H1、H7和H9缺乏对T细胞的刺激能力(栏B)。与IFN-γ一起保温导致MHC I类表达的显著上调(插入∶灰线＝未处理的hES细胞；虚线＝IFN-γ处理的细胞；黑线＝各同种型对照)。然而，通过与IFN-γ一起培养增加了MHC表达所制备的hES细胞系H1和H9还是不能刺激T细胞增殖(栏C)。在相关实验中，通过与IFN-γ一起培养制备人包皮成纤维细胞，使其能更好的刺激T细胞。
进行了抑制实验，以确定未分化的hES细胞是否能活跃的调节对第三方的刺激细胞的同种异体-MHC应答。将应答T细胞(1×105)与不同数量的受过辐照的人成纤维细胞和hES细胞一起培养0-2小时。随后，每孔加入1×104个受过辐照的树突细胞。培养5天后，加入[3H]胸苷脉冲细胞16-20小时，洗涤和计数。
图9显示了结果(平均值±SEM)。hES细胞废除了同种异体树突状细胞激发的T细胞增殖。当PBMC和同种异体专门(professional)抗原递呈细胞以10∶1的比例共培养时，检测到强烈的增殖反应。然而，在这些共培养物中加入任何未分化的hES细胞系，即强烈抑制了T细胞体外增殖(栏A)。加入相等数目的人成纤维细胞没有抑制效果(栏A)。递次减少hES细胞数目导致抑制效果的逐步丧失，显示hES细胞抑制混合淋巴细胞反应的同种异体活化是剂量依赖性的(栏B)。hES细胞：T细胞比为1∶1-1∶3抑制了MLR。
实施例8：体内未分化的hES细胞没有同种异体刺激作用。
通过测试hES细胞刺激体内细胞免疫应答的能力进一步评估了未分化hES细胞的免疫原性。
在免疫缺陷型Prk-/-SCID小鼠的肌肉内注射2-5×105未分化的hES细胞、胎儿单核细胞或MBA-1新巨核细胞系。48-72小时后，固定组织，包埋，并在低温恒温器上切片。保存每份第二张切片用于苏木精和曙红(H&E)染色。在H&E染色的切片中放大1000倍，通过形态特征鉴定白细胞的存在(以盲法进行分析；R＞0.97)。
图10显示了该实验的结果。MBA-1细胞和单核脐带细胞都能诱导Prk-/-SCID小鼠中的粒细胞渗出反应。相反，在注射了未分化hES细胞的动物注射位点没有观察到粒细胞渗出。
图11显示了用野生型免疫活性CD-1小鼠随后进行的实验结果。与Prk-/-SCID小鼠不同，注射含有内毒素的PBS载体在注射位点诱导淋巴细胞和粒细胞渗出(左下图)。然而，同时注射载体和hES细胞完全消除了白细胞渗出(右下图)。注射重新悬浮在相同载体中的MBA-1细胞不能抑制白细胞渗出(插入)。
该研究得到两个结论。首先，hES细胞不能在免疫缺陷或免疫活性小鼠中引发针对自身的应答。这提示它们应该能抑制异种免疫应答。将细胞施给异种宿主原理上比将其施给同种异体的人将引起更剧烈的反应，因为抗原不匹配水平高得多。第二，hES细胞还能显著抑制对内毒素反应的非抗原特异性炎症应答中出现的非特异性渗出。
如本文前面提到的，未分化的hES细胞同时活跃抑制免疫和炎症反应，这是临床治疗的重要意义。
实施例9：BMP促进hES细胞衍生的造血祖细胞自我更新
在下面的一系列试验中，用改良的分化时间线从hES获得造血细胞。
用胶原酶IV处理无饲养细胞培养物中的未分化的hES细胞，并从Matrigel基质上以条状刮下。然后将它们转移到低吸附的平板中，在含有20％未热灭活的FBS的分化培养基中过夜，形成胚状体。翌日将培养基更换为含有造血细胞因子(300ng/ml SCF；300ng/ml Flt-3配体、10ng/ml IL-3、10ng/mlIL-6和50ng/mL G-CSF)；或BMP-4(50ng/ml)；或同时加入细胞因子和BMP-4。继续在同一分化培养基中继续对照培养，而不加入任何因子。每3天更换培养基。
图12显示了总细胞计数和获得的CD45阳性造血祖细胞数。还显示了每105输入细胞获得的原代CFU数目。细胞因子相对于对照，可观的提高了CD45阳性细胞(p＜0.02)和CFU(p＜0.001)的产率。根据这些标准，含或不含细胞因子时，BMP-4的效果都可忽略不计。
图13显示了次生CFU的结果，强调BMP-4的重要性。在对照条件下，从hES细胞衍生出的造血祖细胞的自我更新是不常见的事件，仅在6％原代CFU中发生(左栏)。相反，用细胞因子处理分化中的hES细胞使得所有被检测的原始CFU中提高到21％有自我更新能力。虽然当用细胞因子分化细胞时，祖细胞的自我更新频率提高对照或细胞因子衍生的造血祖细胞的自我更新数量级都是最小的，平均在每个原代CFU中仅有0.5和0.3个次生CFU(右栏)。当同时用细胞因子和BMP-4分化hES细胞时，36％的原代CFU产生次生CFU。在细胞因子和BMP-4存在下分化的hES细胞产生的单个原代CFU产生每个原代CFU达4个次级CFU，比对照或单独用细胞因子处理自我更新的数量级大了8倍。虽然用BMP-4处理分化的hES细胞不能提高造血特异性超过基线能力以上(实施例2和3)，本实施例中显示BMP-4影响了原代造血祖细胞的自我更新能力。在BMP-4存在下，50％以上产生的原代CFU能自我更新(左栏)，每个原代CFU平均能形成10个次级CFU(右栏)，在自我更新能力上比对照或细胞因子分化细胞提高了20倍。
为了比较hES衍生的造血祖细胞和已知来源的定型造血组织之间祖细胞自我更新的频率和数量级，以相同方式测试了从人脐带血样本产生的原代CFU的自我更新能力(右栏，插入)。当单独测试时，脐带血衍生的原始CFU不能产生次级祖细胞。然而，当合并多个原代集落，观察到祖细胞以每个原代CFU0.5个次生集落的频率自我更新。与BMP-4存在下分化性hES细胞衍生的造血祖细胞相比，这显示定型造血组织自我更新性祖细胞的珍贵。
这些结果显示，在BMP-4存在下分化性hES细胞产生具有卓越自我更新能力的造血祖细胞。
实施例10：祖细胞诱导的动力学
在该实施例中，进一步检测了造血细胞分化的动力学。从胚状体形成后翌日开始，将细胞与HGF细胞因子和BMP-4一起培养。在不同时间从培养物中采集细胞样品，分析CD45和原代CFU。
图14显示了结果，用细胞因子加BMP-4培养的第3、7和10天未观察到造血细胞。第15和22天，CD45阳性细胞的频率可观的上升。在第7和10天，CFU试验中克隆产生的效率低至1/15000，但在第15天上升到1/262。在第15和22天之间克隆产生效率的提高无统计学显著性，提示第15-22天之间定型造血细胞的增殖伴随着分化和祖细胞功能的丧失。
本文提出了针对hES细胞造血细胞分化的概念性模型。该模型仅仅是为了增强读者的理解；不是为了要不必要的限制本发明。
hES细胞产生造血细胞子代似乎是分两个阶段进行的-一是造血细胞因子引发程序控制的诱导期，然后是定型造血细胞的增殖期。细胞因子诱导了能多谱系成熟的定型造血祖细胞，以CD45标记为代表。在对照条件下，hES细胞自发分化产生的少量定型造血祖细胞能在次生CFU试验中自我更新，并因此可以最终分化。因此，控制hES细胞分化的内在程序不能产生用细胞因子和BMP-4处理所诱导的维持能力。
结果显示BMP-4(单独或联合细胞因子)对获自hES细胞的造血祖细胞的频率或总数没有作用。然而，在BMP-4存在下hES细胞的衍生产生了具有更高自我更新能力的特异性造血祖细胞。BMP-4可以在发育前14天内起作用，刺激负责祖细胞更新的长期程序。
本领域技术人员读者应理解作为常规优化，本发明可被修改，但不脱离本发明的思路或权利要求规定的范围。
在法律允许包括以下多重引用权利要求的情况下本发明的实施方案：
1.培养物中增殖异种分化的细胞群，其特征在于，该细胞群具有以下一个或多个特征：
·至少1％细胞是CD45阳性，
·至少20％是CD34阳性，
·至少70％是CD13阳性，
·至少10％是AC133阳性。
2.如权利要求1所述的细胞群，其特征在于，所述细胞群是通过分化灵长类多能干细胞获得的。
3.两种细胞群，其特征在于，包括权利要求2的细胞群和衍生出该细胞群的未分化的pPS细胞系。
4.任一前述权利要求所述的细胞群，其特征在于，至少5％细胞同时是CD34阳性和CD45阳性。
5.任一前述权利要求所述的细胞群，其特征在于，该细胞群含有不到1％的未分化灵长类多能干细胞。
6.任一前述权利要求所述的细胞群，其特征在于，该细胞群在造血细胞集落形成单位试验中以至少约1/1000的接种效率形成集落。
7.任一前述权利要求所述的细胞群，其特征在于，次生CFU试验中再接种时，从CFU试验收集的集落形成次生集落。
8.任一前述权利要求所述的细胞群，其特征在于，当注射入NOD-SCID小鼠时，形成循环性红细胞样细胞、粒细胞和单核细胞。
9.任一前述权利要求所述的细胞群，其特征在于，当注射入NOD-SCID小鼠时，形成淋巴样细胞。
10.任一前述权利要求所述的细胞群，其特征在于，该细胞群经过基因改造能表达异源基因。
11.任一前述权利要求所述的细胞群，其特征在于，所述灵长类多能干细胞是人胚泡分离的细胞的子代。
12.任一前述权利要求所述的细胞群，其特征在于，所述灵长类多能干细胞是人胚胎干细胞。
13.一种使灵长类多能干细胞分化成具有造血能力的细胞群的方法，其特征在于，该方法包括步骤：
在基本无任何具有不同基因型的细胞但含有造血细胞生长因子混合物的培养环境中，培养未分化的pPS细胞，然后从该培养环境中收集至少1％CD45阳性的细胞群或在造血细胞集落形成试验中以至少约1/1000的接种效率形成集落的细胞群。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，分化包括形成胚状体或细胞聚集体。
15.如权利要求13-14所述的方法，其特征在于，分化包括在低密度条件培养基中培养。
16.如权利要求13-15所述的方法，其特征在于，造血细胞生长因子的混合物含有至少下列两种：干细胞因子(SCF)、Flt-3配体、IL-3、IL-6和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，在分化开始12天内用所述造血细胞生长因子培养细胞。
18.如权利要求13-17所述的方法，其特征在于，在用造血细胞生长因子混合物培养的同时或随后用骨形态发生蛋白培养分化的细胞。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，在用所述造血细胞生长因子培养之后用骨形态发生蛋白4培养细胞。
20.如权利要求13-19所述的方法，其特征在于，用该方法获得的细胞具有权利要求1-12任一所述的分化细胞的特征。
21.如权利要求13-20所述的方法，其特征在于，该方法可用于产生造血祖细胞、红细胞样细胞、粒细胞、单核细胞、巨核细胞或淋巴样细胞。
22.一种获得权利要求1-12所述的分化细胞群的方法，其特征在于，包括分化性灵长类多能干细胞。
23.如权利要求13-22任一所述的方法，其特征在于，所述灵长类多能干细胞是人胚泡分离的细胞的子代。
24.如权利要求13-23任一所述的方法，其特征在于，所述灵长类多能干细胞是人胚胎干细胞。
25.通过进一步分化权利要求1-12中所述的分化细胞群产生的红细胞、成红细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、巨核细胞、血小板或淋巴细胞。
26.一种筛选化合物调节造血细胞功能的能力的方法，其特征在于，该方法包括将化合物与权利要求1-12任一所述的分化细胞群混合，测定由于与化合物混合所导致的细胞群的任何表型或代谢改变，并将所述改变与该化合物调节造血细胞功能的能力相关联。
27.一种用于治疗人或动物个体的药物组合物，其特征在于，该组合物含有权利要求1-12任一所述的，或用权利要求13-24任一所述的方法获得的分化的细胞群。
28.权利要求1-12所述的，或用权利要求13-24任一所述的方法获得的分化的细胞群的用途，其特征在于，用于制备重建人体造血功能的药物。
29.权利要求1-12所述的，或用权利要求13-24任一所述的方法获得的分化的细胞群的用途，其特征在于，用于制备人基因治疗的药物。
30.权利要求1-12所述的，或用权利要求13-24任一所述的方法获得的分化的细胞群的用途，其特征在于，用于制备使人与该药物中的细胞MHC相容的细胞耐受的药物。
31.一种药物组合物，其特征在于，含有包装在一起，或分装在独立容器中的第一群细胞，所述第一群细胞是配制成适合人给药的权利要求1-12任一所述的分化的细胞群，或灭活的未分化的灵长类多能干细胞；和第二群细胞，所述第二群细胞是与第一群细胞MHC相容的分化的细胞。
32.如权利要求31所述的药物组合物，其特征在于，在对个体施用该组合物后，第一群细胞可抑制个体针对第二群细胞的炎症反应。
33.如权利要求31-32所述的药物组合物，其特征在于，对个体施用第一群细胞后赋予个体对第二群细胞的免疫耐受。
34.如权利要求31-33所述的药物组合物，其特征在于，未分化的pPS细胞是通过辐照或用丝裂霉素c处理灭活的人胚胎干细胞。
35.如权利要求31-34所述的药物组合物，其特征在于，所述第一和第二群细胞是衍生自人胚胎干细胞的相同细胞系。
36.如权利要求31-35所述的药物组合物，其特征在于，第二群细胞是肝细胞、神经元、少突胶质细胞、心肌细胞、成骨细胞、间充质细胞、造血细胞、胰岛细胞、软骨细胞或这些细胞类型任一的谱系限制性前体细胞。

Claims (36)

1.在培养物中增殖的一种分化的细胞群，其特征在于，该细胞群具有以下一个或多个特征：
·至少1％细胞是CD45阳性，
·至少20％是CD34阳性，
·至少70％是CD13阳性，
·至少10％是AC133阳性。
2.如权利要求1所述的细胞群，其特征在于，所述细胞群是通过分化灵长类多能干细胞获得的。
3.两种细胞群，其特征在于，包括权利要求2所述的细胞群和衍生该细胞群的未分化的pPS细胞系。
4.如权利要求1所述的细胞群，其特征在于，至少5％细胞同时为CD34阳性和CD45阳性。
5.如权利要求1所述的细胞群，其特征在于，该细胞群含有1％以下未分化的灵长类多能干细胞。
6.如权利要求1所述的细胞群，其特征在于，该细胞群在造血细胞集落形成单位试验中以至少约1/1000的接种效率形成集落。
7.如权利要求6所述的细胞群，其特征在于，在次生CFU试验中再接种时，从CFU试验收集的集落形成次生集落。
8.如权利要求1所述的细胞群，其特征在于，当注射入NOD-SCID小鼠时，该细胞群可形成循环性红细胞样细胞、粒细胞和单核细胞。
9.如权利要求1所述的细胞群，其特征在于，当注射入NOD-SCID小鼠时，该细胞群可形成淋巴样细胞。
10.如权利要求1所述的细胞群，其特征在于，该细胞群经过基因改造，表达异源基因。
11.如权利要求1所述的细胞群，其特征在于，所述灵长类多能干细胞是人胚泡分离的细胞的子代。
12.如权利要求1所述的细胞群，其特征在于，所述灵长类多能干细胞是人胚胎干细胞。
13.一种使灵长类多能干细胞分化成具有造血能力的细胞群的方法，其特征在于，该方法包括步骤：
在基本无任何具有不同基因型的细胞，但含有造血细胞生长因子混合物的培养环境中培养未分化的pPS细胞，然后从培养环境中收集至少1％CD45阳性的细胞群或在造血细胞集落形成试验中以至少约1/1000的接种效率形成集落的细胞群。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，分化包括形成胚状体或细胞聚集体。
15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，分化包括在低密度条件培养基中培养。
16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，造血细胞生长因子的混合物含有至少下列两种：干细胞因子(SCF)、Flt-3配体、IL-3、IL-6和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，在分化开始12天内用所述造血细胞生长因子培养细胞。
18.如权利要求13所述的方法，其特征在于，在用造血细胞生长因子混合物培养的同时或随后用骨形态发生蛋白培养分化的细胞。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，在用所述造血细胞生长因子培养之后用骨形态发生蛋白4培养细胞。
20.如权利要求13所述的方法，其特征在于，用该方法获得的细胞具有权利要求1所述的分化的细胞的特征。
21.如权利要求13所述的方法，其特征在于，该方法用于产生造血祖细胞、红细胞样细胞、粒细胞、单核细胞、巨核细胞或淋巴样细胞。
22.一种获得权利要求1所述的分化细胞群的方法，其特征在于，包括分化灵长类多能干细胞。
23.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述灵长类多能干细胞是人胚泡分离的细胞的子代。
24.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述灵长类多能干细胞是人胚胎干细胞。
25.通过进一步分化权利要求1中所述的分化细胞群产生的红细胞、成红细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、巨核细胞、血小板或淋巴细胞。
26.一种筛选化合物调节造血细胞功能的能力的方法，其特征在于，该方法包括将化合物与权利要求1所述的分化细胞群混合，测定由于与该化合物混合所导致的细胞群的任何表型或代谢改变，并将所述改变与该化合物调节造血细胞功能的能力相关联。
27.一种用于治疗人或动物个体的药物组合物，其特征在于，该组合物含有权利要求1所述的，或用权利要求13所述的方法获得的分化的细胞群。
28.权利要求1所述的，或用权利要求13所述方法获得的分化的细胞群的用途，其特征在于，用于制备重建人体造血功能的药物。
29.权利要求1所述的，或用权利要求13所述方法获得的分化的细胞群的用途，其特征在于，可用于制备人基因疗法的药物。
30.权利要求13所述的分化的细胞群，或未分化的经过灭活的灵长类多能干细胞群的用途，其特征在于，可用于制备使人与该药物中的细胞MHC相容的细胞耐受的药物。
31.一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有包装在一起或分装在独立容器中的第一群细胞，所述第一群细胞是配制成适合人给药的权利要求13所述的分化的细胞群，或灭活的未分化灵长类多能干细胞；和第二群细胞，所述第二群细胞是与第一群细胞MHC相容的分化的细胞。
32.如权利要求31所述的药物组合物，其特征在于，个体给予组合物后，第一群细胞可抑制个体针对第二群细胞的炎症反应。
33.如权利要求31所述的药物组合物，其特征在于，对个体施用第一群细胞后可赋予该个体对第二群细胞的免疫耐受。
34.如权利要求31所述的药物组合物，其特征在于，未分化的pPS细胞是通过辐照或用丝裂霉素c处理灭活的人胚胎干细胞。
35.如权利要求31所述的药物组合物，其特征在于，所述第一和第二群细胞衍生自人胚胎干细胞的相同细胞系。
36.如权利要求31所述的药物组合物，其特征在于，第二群细胞是肝细胞、神经元、少突胶质细胞、心肌细胞、成骨细胞、间充质细胞、造血细胞、胰岛细胞、软骨细胞或这些细胞类型任一的谱系限制性前体细胞。
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