CN101981181B - 由iPS细胞制备血小板的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种通过体外培养体系由iPS细胞有效地制备成熟巨核细胞、血小板等血细胞的方法。本发明提供一种将iPS细胞播种于饲养层细胞上，在适于造血前体细胞分化诱导的条件下培养而得到的、内含造血前体细胞的网状结构物。另外，提供将该网状结构物中内含的造血前体细胞在适于血细胞分化诱导的条件下进一步培养，从而产生各种血细胞的方法。进一步，提供不通过网状结构物而产生各种血细胞，特别是巨核细胞和血小板的方法。

Description

由iPS细胞制备血小板的方法
技术领域
本发明涉及一种由iPS细胞(诱导性多潜能干细胞)制备血小板的方法。
背景技术
对于以白血病为代表的血液相关疾病的治疗，使必要量的血细胞稳定地扩增、供给，对于治疗是非常重要的，因此迄今为止由许多研究者尝试了造血干细胞或造血前体细胞的有效扩增的研究。在血细胞中，巨核细胞是血小板前体细胞(proplatelet)进而言之是产生血小板的细胞，在治疗上占有重要的位置。
在血细胞中，血小板是血液凝固(止血)所必需的细胞，因此在白血病、骨髓移殖、抗癌治疗等中血小板的需求极高。迄今为止，一直采用由捐献者献血而获取的方法来供给血小板。然而，利用来自捐献者的献血而采取的方法由于长期的捐献者不足、无法冷冻所获取的血小板等，而难以实现稳定的血小板供给。另外，除了利用来自捐献者的献血而采取的方法以外，尝试了给予患者TPO的方法、由脐带血或骨髓细胞分化巨核细胞的方法等，但是给予患者TPO的方法由于在给予TPO后产生对TPO的抗体而使其无效，因而该方法尚未实用化。进而，采用由脐带血或骨髓细胞分化巨核细胞的方法也只能够得到极少数成为巨核细胞来源的造血干细胞，因此仍不是适于提供稳定的血小板的方法。
近年来，作为在生物体外制备血小板的方法，报告使由ES细胞诱导的造血干细胞或造血前体细胞有效地向巨核细胞和血小板分化的方法等。Eto等人明确了通过将小鼠ES细胞与OP9基质细胞一起共培养从而分化诱导成巨核细胞(非专利文献1)。Fujimoto等人报道了采用与Eto等人同样的方法确认诱导的血小板(非专利文献2)。另外，还有由猴子的ES细胞成功分化诱导出巨核细胞的报道(非专利文献3)；也有由人的ES细胞成功分化诱导出巨核细胞的报道(非专利文献4)。但是，无论哪种方法都没有确认血小板的释放。另外，即使在确立了由ES细胞取得血小板的方法是可用于临床的程度的情况下，在通过输血将由ES细胞诱导的血小板用于患者时(特别是在初次输血未发现问题，但同一患者多次接受输血的情况下)，仍然存在人白血球型抗原(HLA)适合性的问题。
iPS细胞(诱导性多潜能干细胞)也称作人工多能性干细胞或诱导多能性干细胞，是通过向成纤维细胞等的体细胞导入多种转录因子基因，获得与ES细胞相同的分化多能性的细胞。
根据Yamanaka等人，小鼠的iPS细胞以在维持分化多能性中重要的Nanog基因的表达为指标，通过向小鼠成纤维细胞导入Oct3/4、So×2、Klf4、c-Myc的4种基因，初次得到确立(非专利文献5)。之后也有报告通过同样的方法确立小鼠iPS细胞(非专利文献6、非专利文献7)。进一步，为了克服iPS细胞的癌化问题，有报告只以c-Myc基因以外的3种基因(Oct3/4、So×2、Klf4)就可以确立iPS细胞(非专利文献8)。
另一方面，对于人的iPS细胞，Thomson等人将OCT3/4、SO×2、NANOG、LIN28导入人的成纤维细胞，确立iPS细胞(非专利文献9)。另外，Yamanaka等人将OCT3/4、SO×2、KLF4、c-MYC导入人的成纤维细胞，同样地确立iPS细胞(非专利文献10)。
非专利文献1：Eto等，Proc.Acad.Sci.USA2002，99：12819-12824。
非专利文献2：Fujimoto等，Blood 2003，102：4044-4051。
非专利文献3：Hiroyama等，Exp.Hematol.2006，34：760-769。
非专利文献4：Gaur等，J Thromb Haemost.2005，4：436-442。
非专利文献5：Okita等，Nature 2007，448：313-317。
非专利文献6：Wernig等，Nature 2007，448：318-324。
非专利文献7：Maherali等，Cell Stem Cell2007，1：55-70。
非专利文献8：Nakagawa等，Nat Biotechnol2008，26：101-106。
非专利文献9：Yu等，Science 2007，318：1917-1920。
非专利文献10：Takahashi等，Cell 2007，131：861-872。
发明内容
本发明人已经确立了由ES细胞有效地取得巨核细胞和血小板的方法，但在使用ES细胞时，使用的ES细胞不同，巨核细胞和血小板的诱导效率也不同。如果能早期进行巨核细胞和血小板的诱导效率优异的ES细胞的选定，则可以实现巨核细胞和血小板取得效率的稳定化，使效率进一步提高，但现实情况是，难以发现至最终得到巨核细胞、血小板为止优异的ES细胞。
因此，本发明人鉴于上述情况，首先，以确立由iPS细胞取得巨核细胞和血小板的方法为课题，进而，以确立可以稳定化巨核细胞和血小板的取得效率的方法为课题。
此次，发明人为了解决上述课题，经过深入地研究，尝试由iPS细胞诱导巨核细胞和血小板，确立其诱导方法。在该诱导中，在iPS细胞中，发现源自相同批次的细胞具有异种特性，尝试由该异种细胞群落选择可以早期有效地诱导巨核细胞和血小板的细胞。结果，发现表现出一定特征的细胞克隆，例如形成更多网状结构的克隆的巨核细胞、血小板的诱导效率优异，通过选择该细胞进行分化诱导，可以稳定且有效地诱导巨核细胞或血小板。
即，本发明涉及由iPS细胞制备巨核细胞和血小板的方法，具体的是，涉及以下(1)～(16)。
(1)本发明的第1方式为，“一种内含造血前体细胞的网状结构物，其是将源自人的iPS细胞播种于饲养层细胞(フイ一ダ一細胞)上，在适于造血前体细胞分化诱导的条件下培养而得到的”。
(2)本发明的第2方式为，“上述(1)所述的网状结构物，其中，所述适于造血前体细胞分化诱导的条件是在VEGF存在下培养14～17天”。
(3)本发明的第3方式为，“上述(1)或(2)所述的网状结构物，其特征在于，所述饲养层细胞是C3H10T1/2细胞或OP9细胞”。
(4)本发明的第4方式为，“一种产生血细胞的方法，其中，选择上述(1)～(3)中任一项所述的网状结构物的产生能力高的iPS细胞克隆，将形成该iPS细胞克隆产生的网状结构物的隔壁的细胞与造血前体细胞分离，将得到的造血前体细胞播种于饲养层细胞上，在适于血细胞分化诱导的条件下培养，而产生血细胞”。
(5)本发明的第5方式为，“上述(4)所述的方法，其特征在于，所述血细胞是巨核细胞和血小板”。
(6)本发明的第6方式为，“上述(5)所述的方法，其中，所述适于血细胞分化诱导的条件是在TPO存在下培养7～9天”。
(7)本发明的第7方式为，“上述(5)所述的方法，其中，所述适于血细胞分化诱导的条件是在TPO、SCF和肝素存在下培养7～9天”。
(8)本发明的第8方式为，“采用上述(5)～(7)中任一项所述的方法产生的巨核细胞和/或血小板”。
(9)本发明的第9方式为，“一种血液制剂，其以采用上述(5)～(7)中任一项所述的方法产生的血小板为有效成分”。
(10)本发明的第10方式为，“一种产生血细胞的方法，通过将源自小鼠的iPS细胞进行液体培养，在胚状体内部形成造血前体细胞，进一步培养该胚状体，而产生血细胞”。
(11)本发明的第11方式为，“上述(10)所述的方法，其特征在于，所述血细胞是巨核细胞和血小板”。
(12)本发明的第12方式为，“上述(10)或(11)所述的方法，进一步培养所述胚状体的期间是5～7天”。
(13)本发明的第13方式为，“上述(10)～(12)中任一项所述的方法，进一步培养所述胚状体的条件是在TPO和SCF存在下培养3～5天”。
(14)本发明的第14方式为，“采用上述(10)～(13)中任一项所述的方法产生的巨核细胞和/或血小板”。
(15)本发明的第15方式为，“一种血液制剂，其以采用上述(10)～(13)中任一项所述的方法产生的血小板为有效成分”。
(16)本发明的第16方式为，“一种试剂盒，用于通过上述(4)～(7)和上述(10)～(13)中任一项所述的方法制备血小板”。
本发明通过使用源自iPS细胞(特别是人iPS细胞)的巨核细胞和血小板的诱导方法，与使用ES细胞时相比，可以稳定且有效地诱导巨核细胞和血小板。
根据本发明的方法，由于可以制备保持了需要输血等的患者的基因特征的、患者专用的血细胞，因此可以克服人白血球型抗原(HLA)的适合性问题。另外，可以避免在临床现场由有问题的自身以外的HLA型血液的混入导致的产生抗血小板抗体。
另外，如果使用本发明的方法，则可以在生物体外有效地取得期望的血细胞。特别是，对于人，可以比较大量且有效地进行特定个人专用的血小板的产生。
而且，如果使用本发明的方法，则可以实现以血小板为有效成分的血液制剂的稳定的供给。
附图说明
图1是表示由小鼠iPS细胞诱导血小板的过程的示意图。
图2表示将源自小鼠iPS细胞的作为培养第10天的血小板前体细胞的巨核细胞进行细胞离心后，进行吉姆萨染色(A)和通过Alexa488-毒伞素、DAPI、抗CD41抗体和抗GPIbα抗体进行免疫染色(利用Alexa647的双染色法)(B)的结果。(B)的CD41表示CD41阳性细胞的染色图像，GPIbα表示GPIbα的阳性细胞的染色图像。
图3表示源自小鼠iPS细胞的培养第14天的血小板前体的相差显微镜图像(A)和利用Alexa647将通过Alexa488-毒伞素、抗CD41抗体和抗GPIbα进行免疫染色(B)进行双染色的结果。(B)的CD41/F-肌动蛋白表示利用抗CD41抗体(Alexa647、红)/Alexa488(绿)-毒伞素进行双重染色的结果，GPIbα/F-肌动蛋白表示利用抗GPIbα抗体(Alexa647、红)/Alexa488(绿)-毒伞素进行双重染色的结果。
图4表示由小鼠iPS细胞培养第14天诱导的血小板的电子显微镜图像。
图5表示利用流式细胞仪分析源自小鼠iPS细胞的培养第10天(上图)和培养第14天(下图)的细胞的结果。
图6观察源自小鼠iPS细胞的血小板对于凝血酶的形态变化。回收培养第14天的上清液，用纤维蛋白原涂布添加至培养皿后，加入血小板活性刺激药(凝血酶)进行刺激(上图)。示出利用凝血酶将由iPS细胞制作的血小板完全伸展可以有助于稳定血栓的形态(下图)。结果示出利用抗AIIb抗体(利用Alexa647的2次染色)和Alexa488-毒伞素的染色图像(下图)。
图7表示由人iPS细胞(201B6株)形成Sac结构物，进一步诱导巨核细胞和血小板的过程。上图表示培养过程的示意图，下面的各照片表示在培养过程中诱导的iPS-Sac、巨核细胞。下面的照片由左起分别表示培养第0天的未分化状态的iPS细胞(利用相差显微镜的观察图像)、由iPS细胞诱导的iPS-Sac(培养后第17天的观察图像)、巨核细胞(培养第23～24天吉姆萨染色后的观察图像)。
图8表示iPS-sac的免疫染色图像。iPS-sac与ES-sac相同，由CD31阳性、VEGF-R2阳性的内皮细胞构成。
图9表示比较人iPS细胞克隆之间的iPS-sac诱导效率的结果。测量含有培养第15天的血细胞前体细胞的Sac的数量(图的纵轴)。即使是源自相同批次的皮肤的人iPS细胞株(TkDA3-1、2、4、5、9、20)也发现分化能力有差别。TkDA3-1、2、4、5、9、20(在东京大学建立)是由源自相同的皮肤细胞的4因子(Oct3/4、So×2、Klf4、c-Myc)制成的人iPS细胞，TkDN4-M(在东京大学建立)是由源自皮肤细胞的3因子(除c-Myc以外)制成的人iPS细胞，201B6、201B7(在京都大学建立)是由源自皮肤细胞的4因子制成的人iPS细胞、253G1、253G4(在京都大学建立)是由源自皮肤细胞的3因子制成的人iPS细胞。另外，KhES-3是作为对照使用的血细胞分化能力高的人ES细胞株。
图10表示由图9所示的iPS细胞中使用Sac形成能力不同的克隆，分析血小板诱导能力的结果。
图11是源自人ES细胞和人iPS细胞的造血前体细胞的表面抗原分析结果。比较源自人ES细胞(上段)的血液前体细胞和源自分化能力高的TkDN4-M(3因子：中段)、TkDA3-4(4因子：中段)的血液前体细胞。作为未分化的血液/血管内皮的共通标记的CD31阳性/CD34阳性细胞的频率和作为巨核细胞前体细胞的标记的CD34阳性/CD41a阳性细胞与ES细胞同样地表达。
图12是源自人iPS细胞的血细胞集落的分析。播种于甲基纤维素半固体培养基，比较源自TkDN4-M(3因子)、TkDA3-4(4因子)的血液前体细胞的血细胞分化能力。左图是代表性的各血细胞系的吉姆萨染色图像。右图表示集落形成细胞的频率(纵轴为源自1×104血细胞前体细胞的集落数)。只有TkDA3-4形成母细胞状集落(左图的右下图)，但分化为其它血细胞的能力相同。
图13表示用流式细胞仪分析培养后第17～18天的培养液中的浮游细胞成分的结果。X轴为CD41a，Y轴分别为CD42b、CD42a、CD9。由左侧开始表示KhES-3(人ES细胞)、253G4(3因子人iPS细胞)、TkDN4-M(3因子人iPS细胞)、TkDA3-4(4因子人iPS细胞)。与源自人ES细胞的巨核细胞相同地表达作为成熟巨核细胞标记的CD42a、CD42b。
图14表示源自人iPS细胞的血小板的表面抗原分析结果。使用流式细胞仪分析培养第24天释放至培养上清液中的血小板。X轴为CD41a，Y轴分别为CD42b、CD42a、CD9。由左侧开始表示末梢血血小板、源自KhES-3(人ES细胞)的血小板、源自253G4(3因子人iPS细胞)的血小板、源自TkDN4-M(3因子人iPS细胞)的血小板、源自TkDA3-4(4因子人iPS细胞)的血小板。与源自末梢血的血小板相同地，表达作为血小板重要功能分子的CD41a、CD42a、CD9。另一方面，对于CD42b，源自人ES细胞和人iPS细胞的血小板一部分表达降低(上段图)。
图15表示源自巨核细胞的血小板释放形态的观察图像。用Alexa488结合抗CD41a抗体将培养后第17～18天后的浮游细胞染色，利用荧光显微镜进行观察(右图)。左图是通过使用差分干涉测量法的明视野的观察图像。
图16表示源自人末梢血、人ES细胞和人iPS细胞的血小板和源自人iPS细胞的巨核细胞的电子显微镜图像。在源自人ES细胞和人iPS细胞的血小板中，与末梢血相同地保持含有各种血小板的生理活化物质的颗粒或血小板的微管结构。
图17表示源自人iPS细胞的血小板的功能分析(内向外的信号)的结果。上图：代表性的FACS图像。源自人iPS细胞的血小板(下段)与源自人ES细胞的血小板(上段)相同地，通过生物体内重要的血小板活化物质ADP而确认整合蛋白的活化(PAC1抗体阳性血小板增加)。下图：与源自人ES细胞的血小板(白色棒图)相同地，源自人iPS细胞的血小板(黑色棒图)由低浓度的ADP(5μM)反应，反应以用量依赖性地增加。还确认与作为其它活性物质的凝血酶的反应。无激动剂：无ADP的结果。
具体实施方式
本发明的实施方式之一为，将iPS细胞播种于饲养层细胞上，在适于造血系细胞分化诱导的条件下培养而得到的、内含造血前体细胞的网状结构物(sac)。由于该网状结构物中造血前体细胞被浓缩而存在，因此能够在活体外有效地分化诱导各种血细胞。此处所谓“网状结构物”，是源自ES或iPS细胞的立体的囊状(在内部伴有空间)结构体，以内皮细胞集团等方式形成，在内部含有血液前体细胞。对于网状结构物的详细内容，例如参照TAKAYAMA等，BLOOD 2008，111：5298-5306。在此所谓“iPS细胞”，也称为人工多能性干细胞或诱导多能性干细胞，是通过向成纤维细胞等的体细胞导入多种转录因子基因，获得与ES细胞相同的分化多能性的细胞。其中，作为获得分化多能性所必需的转录因子基因，例如，已知Nanog、Oct3/4、So×2、Klf4、c-Myc、Lin28等。在这些基因中，通过以Oct3/4、So×2、Klf4、c-Myc的组合，Oct3/4、So×2、Nanog、Lin28的组合，Oct3/4、So×2、Klf4的组合将选择的基因导入成纤维细胞等的体细胞，可以建立iPS细胞。在本发明使用的iPS细胞不论其建立方法，除了用上述导入基因的方法建立的细胞以外，还可以是通过导入与上述不同的基因的建立方法、通过使用蛋白质或低分子化合物等的建立方法得到的iPS细胞。
另外，作为“饲养层细胞”，只要是有助于ES细胞或iPS细胞分化诱导的细胞就可以使用，可以使用例如小鼠胚胎成纤维细胞、优选C3H10T1/2细胞株、OP9细胞等。使用“饲养层细胞”时，例如可以照射放射线等来抑制细胞的增殖。
作为iPS细胞的培养条件，可以选择适合于用于制备网状结构物(以下，也称为iPS-Sac)的条件。该培养条件根据使用的iPS细胞的生物种类而异。列举一个例子，在源自人的iPS细胞的情况中，作为培养基，使用添加了最终浓度为15％的FBS的IMDM，在其它无血清情况下还可以使用添加了适当增殖因子和补充物等的培养基。进而，为了有效地由源自人的iPS细胞形成网状结构物，例如可以添加VEGF 0～100ng/ml左右、更优选20ng/ml左右。另外，作为培养环境，根据使用的iPS细胞的不同而不同，但例如可以使用5％CO2、36～38℃、优选37℃的条件。直至形成网状结构物的培养期间根据使用的iPS细胞的不同而不同，但例如由播种到饲养层细胞上开始，大约14～17天后可以确认其存在。
形成的网状结构物形成滤胞状结构，由作为中胚叶细胞的标记之一的Flk1(fetal liver kinase 1)、CD31、CD34或UEA-I凝集素(Ulex europaeus.agglutinin-1)阳性细胞构成隔壁。在该网状结构物的内部，造血前体细胞以浓缩的状态存在。将由存在于网状结构物内部的造血前体细胞分化诱导各种血细胞时，必须从构成隔壁的细胞等分离造血前体细胞。该分离优选采用物理方法进行。例如，通过流通过灭菌后的筛状器具(例如细胞滤器等)，可以将隔壁细胞和造血前体细胞分离。
本发明进一步的实施方式是，由从网状结构物分离的造血前体细胞产生各种血细胞的方法。将所得的造血前体细胞播种到饲养层细胞上，在适于所需血细胞分化诱导的条件下进行培养。此处所谓“适于血细胞分化诱导的条件”，根据目标血细胞的种类，可以列举例如添加TPO、IL-1α、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-11、EPO、GM-CSF、SCF、G-CSF、Flt3配体、肝素等中的任意一个或它们中的2种以上的组合的条件。在分化诱导巨核细胞和血小板时，例如可以在TPO(10～200ng/mL，优选100ng/mL左右)存在下，或者在TPO(10～200ng/mL，优选100ng/mL左右)、SCF(10～200ng/mL，优选50ng/mL左右)和肝素(10～100U/mL，优选25U/mL左右)存在下，培养7～15天左右。作为培养环境，只要是适于在活体外进行血细胞的分化诱导的环境即可，例如，在5％ CO2、36～38℃、优选37℃的条件下实施培养。
另外，由iPS细胞特别是源自人的iPS细胞产生巨核细胞、血小板时，上述网状结构物的产生效率根据iPS细胞克隆而异，因此预先选择网状结构物产生效率高的iPS细胞克隆，由该iPS细胞克隆产生的网状结构物产生巨核细胞、血小板等的各种血细胞，由此可以更有效地制备多种血细胞(参考图9)。其中，作为网状结构物产生效率“高”的iPS细胞克隆，可以选择网状结构物的形成数例如为每1×105细胞10以上，优选为15以上的克隆。
本发明的其它实施方式是，由来自小鼠iPS细胞形成胚状体(含有分化诱导的中胚叶系未分化细胞的细胞集团)，进一步诱导巨核细胞和血小板的方法。在小鼠ES细胞情况中，不与OP9细胞等的饲养层细胞进行共同培养也能形成胚状体，向中胚叶系未分化细胞分化诱导。在小鼠iPS细胞的情况中，在与小鼠ES细胞的情况相同的条件下可以诱导中胚叶系未分化细胞。作为此时的培养条件，例如，作为培养基，根据使用的iPS细胞而异，但可以使用添加了FBS、人铁传递蛋白等的IMDM，加入了其它适当补充物等的培养基。另外，作为培养环境，根据使用的iPS细胞而异，但例如可以使用5％CO2、36～38℃、优选37℃的条件。直至形成胚状体的培养期间根据iPS细胞的不同而异，但例如大约6～9天后可以确认其存在。
接着，在适合于胚状体分化诱导血细胞的条件下进行培养，可以诱导巨核细胞和血小板。此处所谓“适于血细胞分化诱导的条件”，可以列举例如添加TPO、IL-1α、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-11、EPO、GM-CSF、SCF、G-CSF、Flt3配体、肝素等中的任意一个或它们中的2种以上的组合的条件。在分化诱导巨核细胞和血小板时，例如可以将TPO(10～200ng/mL)、SCF(1～200ng/mL)、IL-6(1～100ng/mL左右)、IL-11(1～100ng/mL左右)等单独或适当组合，在适当的时期添加至培养基。由胚状体开始培养后，约3～5天后诱导巨核细胞，约7～9天后诱导血小板。作为培养环境，只要是适于在活体外进行血细胞的分化诱导的环境即可，例如，在5％CO2、36～38℃、优选37℃的条件下实施培养。
进一步，在本发明的实施方式中，包含用于制备血小板的试剂盒。在该试剂盒中，含有用于细胞培养的培养基、血清、增殖因子等的补充物(例如，TPO、SCF、肝素、IL-6、IL-11等)、抗生素等。此外，还含有例如在制备源自人的血小板中，用于确认在网状结构物中存在的标记的抗体(例如，针对Flk1、CD31、CD34、UEA-I凝集素的抗体)等。在试剂盒中所含的试剂、抗体等可在长期维持构成成分的有效活性、不由容器材质导致吸附且不会变质这样的任何种类的容器中供给。例如，密封的玻璃安瓿包含在氮气这样的中性且不反应性气体下包装了的缓冲液。安瓿是由玻璃、聚碳酸酯、聚苯乙烯等的有机聚合物、陶瓷、金属、或者用于保持试剂的常用的其它任何种适当的材料等构成的。
血小板由于对预防或改善白血病、骨髓移殖、抗癌剂治疗时的血小板减少有效，因此也可以将由本发明得到的血小板以制剂方式稳定地供给。由本发明的方法产生的血小板通过回收由巨核细胞释放的富含血小板的培养液部分(例如，在源自人的血小板情况中，iPS细胞培养后第22～28天左右)，使用白血球除去滤器(例如，可以由Terumo公司、旭化成医药公司等购入)等进行巨核细胞、其它血细胞的去除，可以除去血小板以外的成分，进行制备。当制备血液制剂时，考虑到血小板对保存是不稳定的因素等，还可以含有有助于使血小板稳定化的其他成分。使血小板稳定的条件可以选择在该技术领域的专家所周知的方法。更具体地说，所获取的血小板(源自人ES细胞的洗净后的血小板)例如可以采用以下的方法进行制剂化。
ACD-A溶液：FFP(fresh frozen plasma；由通过献血得到的全血液制成，含有白蛋白、凝固因子等血液成分以外的所有物质)以1∶10的比例配制，照射15-50Gy的放射线后在20-24℃振荡并保存。ACD-A溶液：用注射用水将柠檬酸钠22g/柠檬酸8g/葡萄糖22g整体调整到1L。
使用以上的方法时，作为血小板的浓度，优选例如1×109血小板/mL左右。
此外，预先添加GM6001(a broad-range hydroxamic acid-basedmetalloprotease inhibitor)(Calbiochem公司，La Jolla，CA，USA)时，能够预防伴随着冷冻保存和室温保存中发生的血小板功能分子GPIb-V-IX、GPVI切断的不活化。本发明人等采用该方法确认能够预防与小鼠ES细胞来源血小板相关的不活化。另外，作为使用人血小板的与该血小板不活化相关的机理的参考论文，请参照Bergmeier，W et al.，Cir Res 95：677-683，2004和Gardiner，EE et al.，J Thrombosis and Haemostasis，5：1530-1537，2007。
此外，收纳含有血小板制剂容器优选玻璃这样的避免活化血小板的材质。
实施例
以下给出实施例进一步详细说明，但本发明并不受实施例的任何限定。
1.源自小鼠iPS细胞的巨核细胞和血小板的诱导
1-1.小鼠基质细胞株OP9细胞的培养
OP9细胞在添加了15％FBS、2mM的L-谷氨酰胺、100U青霉素、0.1mg/mL链霉素的α-最小必需培养基(α-MEM；Invitrogen/GIBCO)中传代培养。培养基每天更换，为了使细胞形态不发生变化，将由元代培养至传代培养数为30次以内的细胞用于实验。
1-2.小鼠Nanog-iPS细胞的培养
使用添加了15％FBS、300μg/mL人铁传递蛋白(Sigma)、4.5mM单硫代甘油(Sigma)、50μg/mL抗坏血酸(Sigma)、0.1mM 2-巯基乙醇(Invitrogen/GIBCO)、2mM L-谷氨酰胺、100U青霉素、0.1mg/mL链霉素的Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium(IMDM；Invitrogen/GIBCO)在培养皿中(Sterilin美国)培养Nanog-iPS细胞(Nature，448，313-317(2007))(京都大学、山中伸弥博士提供)。在10cm培养皿中相对于10mL培养液为2×105个细胞数的条件下开始培养，尝试形成胚状体。
1-3.巨核细胞、血小板的诱导
将培养第6～7天产生的胚状体用0.25％胰蛋白酶处理后，在融合的OP9细胞上以形成1×105个/孔的方式重新播种，在添加了20ng/ml小鼠TPO(peprotec)、10ng/ml SCF的αMEM中进行培养(图1)。
培养10天后，诱导CD41+GPIbα+成熟巨核细胞(图2和图5的上图)，进一步，继续培养，培养14天后，诱导CD41+GPIbα+血小板(图3和图5下图)。这样诱导的血小板具有与源自末梢血的血小板相同的形态特征(图4)。
在此，对得到的血小板的功能进行讨论。将释放了血小板的培养上清液添加至用纤维蛋白原涂布了的培养皿中，用凝血酶进行刺激(图6上图)，血小板表现出特征性的细胞伸展(图6下图)。由该结果可知，通过本发明的方法，可以由小鼠iPS细胞诱导具备与生物体内血小板相同特征的血小板。
2.源自人iPS细胞的巨核细胞和血小板的诱导
2-1.网状结构物(iPS-Sacs)的制备
在本实施例使用的细胞株201B6(在皮肤细胞中导入Oct3/4、Klf4、So×2和c-Myc的细胞株，Cell，131，861-872(2007))和253G1(在皮肤细胞中导入Oct3/4、Klf4和So×2的细胞株，NatureBioteh.，26，101-106(2008))由京都大学山中伸弥博士提供。而且，使用TkDA3-1、TkDA3-2、TkDA3-4、TkDA3-5、TkDA3-9、TkDA3-20(东京大学新建立的细胞株(在皮肤细胞中导入Oct3/4、Klf4、So×2和c-Myc的细胞株)和TkDN4-M(在皮肤细胞中导入Oct3/4、Klf4和So×2的细胞株，东京大学建立)。另外，饲养层细胞使用由筑波理研BioResourcecenter提供的源自小鼠胎儿细胞、C3H10T1/2细胞株，或者使用大阪大学医学部，仲野徹教授提供的OP9细胞株。在进行分化实验前一天，在0.1％明胶涂布化培养皿中以形成6×105/10cm培养皿的密度的方式播种C3H10T1/2细胞，，在分化实验当天，为了终止C3H10T1/2细胞的增殖，进行50Gy放射线照射，用作饲养层细胞。另外，在将OP9细胞用作饲养层细胞时，在分化实验前一天进行50Gy的放射线照射，重新播种后使用。
人iPS细胞是在添加了15％FBS(JRH BIOSCIENCES，美国)、2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)、ITS补充物(10μg/ml胰岛素、5.5mg/ml铁传递蛋白、5ng/ml亚硒酸钠)(Sigma)、50μg/mL抗坏血酸(Sigma)、0.45mMMTG(Sigma)、20ng/ml VEGF(R&D systems)的IMDM(IMDM；Invitrogen/GIBCO)中，播种于OP9细胞或C3H10T1/2细胞上进行培养。
培养后，在15～17天前后确认大量的在内部含有血细胞状细胞的网状结构物(图7，iPS-Sac)。
iPS细胞克隆例如尽管使用4因子进行建立，但由于是异种(heterogeneity)的细胞株，因此即使由相同的皮肤细胞作成，分化能力也各种各样。因此，在人iPS细胞的情况下，通过事先筛选(例如，选择形成更多的网状结构物的克隆等)，可以选择适宜于分化的克隆，可以容易地选择更有效地分化诱导血细胞系细胞的克隆(参见图9)。实际上，由图9所示的iPS细胞中选择Sac形成能力不同的克隆，比较血小板诱导能力。具体的是，使用1×105细胞的iPS细胞(TkDA3-4、TkDN4-M和253G1)和ES细胞(KhES3)，测算最终得到的血小板数量(图10)。图10表明，Sac形成能力高的iPS细胞(TkDA3-4、TkDN4-M)容易形成含有大量血液前体细胞的Sac，最终的血小板数也增加。
2-2.集落分析
对网状结构物中的造血前体细胞的细胞表面分子进行研究可知，作为未分化的血液/血管内皮的共通标记的CD31阳性/CD34阳性细胞的频率与ES细胞相同，对于作为巨核细胞前体细胞的标记的CD34阳性/CD41a阳性细胞，也与ES细胞的情况同样地表达(图11)。另外，对于集落形成能力，与人ES细胞相同(图12)，在由4因子产生的人iPS细胞株TkDA3-4中，观察到母细胞状集落(blast-like，图12)，暗示癌化(白血病化)的危险。
2-3.巨核细胞/血小板的诱导
接着，使用P-1000移液管，在相位差显微镜下挑出网状结构物，使用70μm细胞滤器，将血细胞和网状结构物分离。重新将血细胞以2～3×104/孔播种到在6孔板上准备的放射线照射后的C3H10T1/2细胞(6×105/6孔板1片)上，进一步在添加了15％FBS(JRH BIOSCIENCES，美国)、2mML-谷氨酰胺(Invitrogen)、ITS补充物(10μg/ml胰岛素、5.5mg/ml铁传递蛋白、5ng/ml亚硒酸钠)(Sigma)、50μg/ml抗坏血酸(Sigma)、0.45mMMTG(Sigma)、100ng/ml人TPO(peprotec)、50ng/ml SCF和25U/ml肝素的IMDM(IMDM；Invitrogen/GIBCO)中培养，诱导巨核细胞/血小板(图7、图8和图15)。
用流式细胞仪分析253G1(京都大学株)、201B6(京都大学株)、TkDA3-4(东京大学株)、TkDN4-M(东京大学株)细胞株培养后第23～24天的浮游细胞成分，研究细胞表面抗原的特征，观察巨核细胞、作为血小板特异性表面分子抗原的人CD41a(整合蛋白αIIb)和人CD42b(GPIbα)、CD42a(GPIX)、CD9阳性细胞(图13：巨核细胞，图14：血小板)。另外，还确认由巨核细胞释放血小板时表现出的形态特征(图15和图16)。
接着，对血小板活性物质导致的整合蛋白的活化进行研究，确认源自人iPS细胞的血小板(图17上图，下段)与源自人ES细胞的血小板(图17下图，上段)相同，由生物体内重要的血小板活化物质ADP引起整合蛋白的活化(PAC1抗体阳性血小板的增加)。另外，与源自人ES细胞的血小板(图17下图，白色棒图)相同，源自人iPS细胞的血小板(图17下图，黑色棒图)由低浓度的ADP(5μM)反应，反应以用量依赖性地增加。进一步，还确认与作为其它活性物质的凝血酶的反应(图17下图，6)。由这些结果可知，由iPS细胞制作的血小板发挥与源自人ES细胞的血小板相同的功能性。
由以上结果可知，通过本发明的方法，可以有效地由人iPS细胞诱导巨核细胞和血小板。
产业上的可利用性
根据本发明，可以提供能克服HLA适合性问题的血小板。因此，由于能够供给必须输血的患者专用的血小板，因此还可以解决由抗血小板抗体产生导致的血小板破坏等的问题。

Claims (5)

1.一种产生血细胞的方法，其中，将源自人的iPS细胞播种于饲养层细胞上，在适于造血前体细胞分化诱导的条件下培养而得到内含造血前体细胞的网状结构物，然后选择所述的网状结构物的产生能力高的iPS细胞克隆，将形成该iPS细胞克隆产生的网状结构物的隔壁的细胞与造血前体细胞分离，将得到的造血前体细胞播种于饲养层细胞上，在适于血细胞分化诱导的条件下培养，而产生血细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血细胞是巨核细胞和血小板。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述适于血细胞分化诱导的条件是在TPO存在下培养7～9天。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述适于血细胞分化诱导的条件是在TPO、SCF和肝素存在下培养7～9天。
5.一种试剂盒，用于通过权利要求1～4中任一项所述的方法制备血小板，含有用于细胞培养的培养基、血清、增殖因子、抗生素以及用于确认在网状结构物中存在的标记的抗体。
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