JPWO2009122747A1 - iPS細胞からの血小板の調製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
血球細胞のなかでも血小板は血液凝固(止血)に必須の細胞であるため、白血病、骨髄移植、抗癌治療などにおいて、血小板の需要は極めて高い。これまでに、血小板は、ドナーからの献血により採取する方法により供給されてきた。しかし、ドナーからの献血により採取する方法では、慢性的なドナー不足や、採取した血小板を凍結することができないことなどから、安定に血小板を供給することが困難である。また、ドナーからの献血により採取する方法以外に、TPOを患者に投与する方法、臍帯血又は骨髄細胞から巨核球を分化させる方法などが試みられたが、TPOを患者に投与する方法は、TPOの投与後TPOに対する無力化抗体が産生されてしまうため、この方法は、実用化には至っていない。さらに、臍帯血又は骨髄細胞からの巨核球分化による方法も、巨核球のソースとなる造血幹細胞を極めて少数しか得ることができないため、安定した血小板の提供に適した方法ではない。
マウスのiPS細胞は、Yamanakaらによって、分化万能性の維持に重要なNanog遺伝子の発現を指標にし、マウス線維芽細胞へOct3/4、Sox2、Klf4、c−Mycの4つの遺伝子を導入することにより、初めて樹立された(非特許文献5)。その後も同様の方法によるマウスiPS細胞の樹立が報告されている(非特許文献6、非特許文献7)。さらに、iPS細胞の癌化の問題を克服するために、c−Myc遺伝子以外の3つの遺伝子(Oct3/4、Sox2、Klf4)のみでも、iPS細胞の樹立が可能であることが報告された(非特許文献8)。
一方、ヒトのiPS細胞に関しては、Thomsonらが、ヒトの線維芽細胞にOCT3/4、SOX2、NANOG、LIN28を導入してヒトiPS細胞を樹立した(非特許文献9)。また、Yamanakaらは、OCT3/4、SOX2、KLF4、c−MYCをヒトの線維芽細胞に導入して、同じくiPS細胞を樹立した(非特許文献10)。
そこで、本発明者らは、上記事情に鑑み、第一にiPS細胞から巨核球及び血小板を取得する方法を確立することを課題とし、さらには、巨核球及び血小板の取得効率を安定化し得る方法を確立することを課題とする。
すなわち、本発明は、iPS細胞から巨核球及び血小板を調製する方法に関し、具体的には、以下の(1)〜(16)に関する。
(1)本発明の第1の態様は、「ヒト由来のiPS細胞をフィーダー細胞上に播き、造血前駆細胞の分化誘導に適した条件で培養して得られる、造血前駆細胞を内包するネット様構造物」である。
(2)本発明の第2の態様は、「前記造血前駆細胞の分化誘導に適した条件が、VEGF存在下、14〜17日間培養することである上記(1)に記載のネット様構造物」である。
(3)本発明の第3の態様は、「前記フィーダー細胞がC3H10T1/2細胞、又はOP9細胞であることを特徴とする上記(1)又は(2)に記載のネット様構造物」である。
(4)本発明の第4の態様は、「上記(1)乃至(3)のいずれかに記載のネット様構造物の産生能力の高いiPS細胞クローンを選択し、該iPS細胞クローンが産生するネット様構造物の隔壁を形成する細胞と造血前駆細胞を分離し、得られた造血前駆細胞をフィーダー細胞上に播き、血球細胞の分化誘導に適した条件で培養し、血球細胞を産生する方法」である。
(5)本発明の第5の態様は、「前記血球細胞が巨核球及び血小板であることを特徴とする上記(4)に記載の方法」である。
(6)本発明の第6の態様は、「前記血球細胞の分化誘導に適した条件が、TPO存在下、7〜9日間培養することである上記(5)に記載の方法」である。
(7)本発明の第7の態様は、「前記血球細胞の分化誘導に適した条件が、TPO、SCF及びHeparin存在下、7〜9日間培養することである上記(5)に記載の方法」である。
(8)本発明の第8の態様は、「上記(5)乃至(7)のいずれかに記載の方法により産生された巨核球及び/又は血小板」である。
(9)本発明の第9の態様は、「上記(5)乃至(7)のいずれかに記載の方法により産生された血小板を有効成分とする血液製剤」である。
(10)本発明の第10の態様は、「マウス由来のiPS細胞を液体培養することで、胚様体の内部に造血前駆細胞を形成させ、該胚様体をさらに培養して、血球細胞を産生する方法」である。
(11)本発明の第11の態様は、「前記血球細胞が巨核球及び血小板であることを特徴とする上記(10)に記載の方法」である。
(12)本発明の第12の態様は、「前記胚様体をさらに培養する期間が、5〜7日間である上記(10)又は(11)に記載の方法」である。
(13)本発明の第13の態様は、「前記胚様体をさらに培養する条件が、TPO及びSCFの存在下、3〜5日間培養することである上記(10)乃至(12)のいずれかに記載の方法」である。
(14)本発明の第14の態様は、「上記(10)乃至(13)のいずれかに記載の方法により産生された巨核球及び/又は血小板」である。
(15)本発明の第15の態様は、「上記(10)乃至(13)のいずれかに記載の方法により産生された血小板を有効成分とする血液製剤」である。
(16)本発明の第16の態様は、「上記(4)乃至(7)及び上記(10)乃至(13)のいずれかに記載の方法により血小板を調製するためのキット」である。
また、「フィーダー細胞」として、ES細胞やiPS細胞の分化誘導に寄与する細胞であればいずれも使用可能であり、例えば、マウス胚線維芽細胞、好ましくは、C3H10T1/2細胞株、OP9細胞などを用いることができる。「フィーダー細胞」を用いるときには、例えば、放射線を照射するなどして、細胞の増殖を抑止しておくのがよい。
また、iPS細胞、特にヒト由来のiPS細胞から巨核球、血小板を産生させる場合、上記ネット様構造物の産生効率がiPS細胞クローンによって異なるため、ネット様構造物の産生効率の高いiPS細胞クローンを予め選択し、該iPS細胞クローンの産生するネット様構造物から、巨核球や血小板などの各種血球細胞を産生することで、より効率的に多くの血球細胞を調製することができる(図9を参照のこと)。ここで、ネット様構造物の産生効率の「高い」iPS細胞クローンとして、ネット様構造物の形成数が、例えば、1×105細胞あたり10以上、好ましくは15以上のクローンを選択することができる。
ACD−A液:FFP(fresh frozen plasma;献血で得られた全血液から調整したもの、アルブミン、凝固因子など血液成分以外のものをすべて含む)を1:10の比率で調整し、15−50Gyの放射線照射後に20−24℃にて振とうしながら保存する。ACD−A液;クエン酸ナトリウム22g/クエン酸8g/ブドウ糖22gを注射用水で全体を1Lとするように調整する。
以上の方法を使用する場合、血小板の濃度としては、例えば、1×109血小板/mL程度が望ましい。
また、GM6001(a broad−range hydroxamic acid−based metalloprotease inhibitor) (Calbiochem社、La Jolla,CA,USA)を添加しておくと、冷凍保存および室温保存中に起きる血小板機能分子GPIb−V−IXやGPVIの切断に伴う不活化を予防できる。本発明者らは、この方法により、マウスES細胞由来血小板に関し不活性化の予防が可能であることを確認している。なお、ヒト血小板を使用したこの血小板不活性化に関する機序の参考論文として、Bergmeier,W et al.,Cir Res 95:677−683,2004及び Gardiner,EE et al.,J Thrombosis and Haemostasis,5:1530−1537,2007を参照のこと。
なお、血小板を含む製剤を収納する容器は、ガラスのように血小板を活性化する材質のものを避けるのが好ましい。
1−1.マウスストロマ細胞株OP9細胞の培養
OP9細胞は15% FBS、2mM L−グルタミン、100U ペニシリン、0.1mg/mL ストレプトマイシンを添加した、α−Minimum Essential Medium(α−MEM;Invitrogen/GIBCO)で継代培養した。培地は一日ごとに交換し、細胞の形質を変化させない為に、初代培養から継代培養数30回以内の細胞を実験に用いた。
Nanog−iPS細胞(Nature,448,313−317(2007))(京都大学、山中伸弥博士より供与を受けた)を、15% FBS、300μg/mL ヒトトランスフェリン(Sigma)、4.5mM モノチオグリセロール(Sigma)、50μg/mL アスコルビン酸(Sigma)、0.1mM 2−メルカプトエタノール(Invitrogen/GIBCO)、2mM L−グルタミン、100U ペニシリン、0.1mg/mL ストレプトマイシンを添加したIscove’s Modified Dulbecco’s Medium(IMDM;Invitrogen/GIBCO)を用いてペトリ皿(Sterilin、米国)で培養した。10cmペトリ皿に10mLの培養液に対して2×105個の細胞数で培養を開始し、胚様体形成を試みた。
培養6〜7日目に産生された胚様体は0.25% トリプシンで処理した後、コンフルエントなOP9細胞上に、1×105個/ウェルとなるように播き直し、20ng/ml マウス TPO(peprotec)、10ng/ml SCFを添加したαMEM中で培養を行った(図1)。
培養10日後には、CD41+GPIbα+の成熟巨核球が誘導され(図2及び図5上図)、さらに、培養を継続した培養14日後には、CD41+GPIbα+の血小板が誘導された(図3及び図5下図)。このようにして誘導された血小板は、末梢血由来の血小板と同様の形態的特徴を有していた(図4)。
2−1.ネット様構造物(iPS−Sacs)の調製
本実施例で使用した細胞株、201B6(皮膚細胞にOct3/4,Klf4,Sox2及びc−Mycを導入したもの、Cell,131,861−872(2007))及び253G1(皮膚細胞にOct3/4,Klf4及びSox2を導入したもの、Nature Biotech.,26,101−106(2008))は、京都大学、山中伸弥博士より供与を受けた。さらに、TkDA3−1、TkDA3−2、TkDA3−4、TkDA3−5、TkDA3−9、TkDA3−20(東京大学で新しく樹立した株で(皮膚細胞にOct3/4,Klf4,Sox2及びc−Mycを導入したもの)及びTkDN4−M(皮膚細胞にOct3/4,Klf4及びSox2を導入したもの;東京大学樹立)を使用した。また、フィーダー細胞は、マウス胎児由来細胞、C3H10T1/2細胞株をつくば理研BioResource centerより供与を受けて使用し、又はOP9細胞株を大阪大学医学部、仲野徹教授から供与を受けて使用した。分化実験を行う前日に、0.1% ゼラチンコート化ディッシュにC3H10T1/2細胞を6×105/10cm ディッシュの密度となるように播き、分化実験の当日に、C3H10T1/2細胞の増殖を止めるため50Gyの放射線照射を行い、フィーダー細胞として用いた。また、OP9細胞株をフィーダー細胞として使用する場合には、分化実験の前日に50Gyの放射線照射を行い、播き直しを行った後に使用した。
培養後、15〜17日前後に内部に血球様細胞を含んだネット様構造物が多数確認された(図7、iPS−Sac)。
iPS細胞株クローンは、例えば、4因子を使用して樹立しているにもかかわらず、ヘテロ(heterogeneity)な細胞株であることから、同一の皮膚細胞から作成しても分化能力は様々であった。従って、ヒトiPS細胞の場合、事前のスクリーニング(例えば、より多くのネット様構造物を形成するクローンを選択するなど)により分化に適したクローンを選択することが可能で、より効率的に血球系細胞を分化誘導するクローンを容易に選択することが可能となる(図9参照)。実際に、図9に示されるiPS細胞の中からSac形成能の異なるクローンを選択して血小板誘導能を比較した。具体的には、iPS細胞(TkDA3−4、TkDN4−M及び253G1)及びES細胞(KhES3)を1×105細胞用い、最終的に得られる血小板の数を計測した(図10)。図10より、Sac形成能の高いiPS細胞(TkDA3−4、TkDN4−M)は、血液前駆細胞を多く含むSacを形成しやすく、最終的な血小板数も増えることが示唆された。
ネット様構造物中の造血前駆細胞の細胞表面分子について調べたところ、未分化な血液/血管内皮の共通マーカーとされるCD31陽性/CD34陽性細胞の頻度がES細胞と同様であり、巨核球前駆細胞のマーカーとされるCD34陽性/CD41a細胞についても、ES細胞の場合と同様に発現していることが分かった(図11)。また、コロニー形成能については、ヒトES細胞と同様であり(図12)、4因子によるヒトiPS細胞株TkDA3−4では芽球様コロニー(blast−like、図12)が観察され、ガン化(白血病化)の危険が示唆された。
次に、P−1000 ピペットを用いて、位相差顕微鏡下でネット様構造物をピックアップし、70μm セルストレイナーを用いて、血球細胞とネット様構造物を分離した。新たに、6ウェルプレートに用意した放射線照射済みのC3H10T1/2細胞(6×105/6ウェルプレート1枚)上に血球細胞を2〜3×104/ウェルで播き、15% FBS(JRH BIOSCIENCES、米国)、2mM L−グルタミン(Invitrogen)、ITSサプリメント(10μg/ml インスリン、5.5mg/ml トランスフェリン、5ng/ml 亜セレン酸ナトリウム)(Sigma)、50μg/ml アスコルビン酸(Sigma)、0.45mM MTG(Sigma)、100ng/ml ヒトTPO(Peprotec)、50ng/ml SCF及び25U/ml Heparinを添加したIMDM(IMDM;Invitrogen/GIBCO)中でさらに培養し、巨核球/血小板を誘導した(図7、図8及び図15)。
次に、血小板活性化物質によるインテグリンの活性化について検討したところ、ヒトiPS細胞由来血小板(図17上パネル、下段)は、ヒトES細胞由来血小板(図17下パネル、上段)同様、生体内の重要な血小板活性化物質ADPによりインテグリンの活性化(PAC1抗体陽性血小板の増加)を認めた。また、ヒトES細胞由来血小板(図17下パネル、白い棒グラフ)同様、ヒトiPS細胞由来血小板(図17下パネル、黒い棒グラフ)は低濃度のADP(5μM)から反応し、用量依存的に反応が増加した。さらに、他の活性化物質であるトロンビンへの反応も確認できた(図17下パネル、6)。これらの結果から、iPS細胞から作製された血小板は、ヒトES細胞由来血小板と同様に機能性を発揮することが明らかとなった。
以上の結果から、本発明の方法により、ヒトiPS細胞から巨核球及び血小板を効率的に誘導できることが明らかとなった。
Claims (16)
- ヒト由来のiPS細胞をフィーダー細胞上に播き、造血前駆細胞の分化誘導に適した条件で培養して得られる、造血前駆細胞を内包するネット様構造物。
- 前記造血前駆細胞の分化誘導に適した条件が、VEGF存在下、14〜17日間培養することである請求項1に記載のネット様構造物。
- 前記フィーダー細胞がC3H10T1/2細胞、又はOP9細胞であることを特徴とする請求項1又は2に記載のネット様構造物。
- 請求項1乃至3のいずれかに記載のネット様構造物の産生能力の高いiPS細胞クローンを選択し、該iPS細胞クローンが産生するネット様構造物の隔壁を形成する細胞と造血前駆細胞を分離し、得られた造血前駆細胞をフィーダー細胞上に播き、血球細胞の分化誘導に適した条件で培養し、血球細胞を産生する方法。
- 前記血球細胞が巨核球及び血小板であることを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 前記血球細胞の分化誘導に適した条件が、TPO存在下、7〜9日間培養することである請求項5に記載の方法。
- 前記血球細胞の分化誘導に適した条件が、TPO、SCF及びHeparin存在下、7〜9日間培養することである請求項5に記載の方法。
- 請求項5乃至7のいずれかに記載の方法により産生された巨核球及び/又は血小板。
- 請求項5乃至7のいずれかに記載の方法により産生された血小板を有効成分とする血液製剤。
- マウス由来のiPS細胞を液体培養することで、胚様体の内部に造血前駆細胞を形成させ、該胚様体をさらに培養して、血球細胞を産生する方法。
- 前記血球細胞が巨核球及び血小板であることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 前記胚様体をさらに培養する期間が、5〜7日間である請求項10又は11に記載の方法。
- 前記胚様体をさらに培養する条件が、TPO及びSCFの存在下、3〜5日間培養することである請求項10乃至12のいずれかに記載の方法。
- 請求項10乃至13のいずれかに記載の方法により産生された巨核球及び/又は血小板。
- 請求項10乃至13のいずれかに記載の方法により産生された血小板を有効成分とする血液製剤。
- 請求項4乃至7および請求項10乃至13のいずれかに記載の方法により血小板を調製するためのキット。
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