CN105238757A - 用诱导性多能干细胞诱导制备造血干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用诱导性多能干细胞诱导制备造血干细胞的方法,包括:获取诱导性多能干细胞和小鼠骨髓基质细胞;将诱导性多能干细胞和小鼠骨髓基质细胞于O2体积分数1~5%条件下共培养。采用本发明的上述方法,采用小鼠骨髓基质细胞构建造血细胞微环境,将其与诱导性多能干细胞共培养,通过共培养使细胞代谢中产生细胞信号蛋白、细胞因子等,从而实现将诱导性多能干细胞诱导分化成造血干细胞;并且控制诱导的过程在低氧条件进行,可以加强细胞的自分泌能力,分泌物的量增加以后可以使上述诱导效果进一步加强,更利于细胞的分化,具有更高的细胞转化率。
Description
技术领域
本发明属于造血干细胞制备技术领域,具体涉及一种用诱导性多能干细胞诱导制备造血干细胞的方法。
背景技术
血液肿瘤治疗中,最常用的方法是放疗/化疗,通过放/化疗可杀死肿瘤细胞或异常克隆细胞,终止其无限增殖;同时,在治疗中加大放/化疗剂量,可最大限度杀灭肿瘤细胞,增加肿瘤杀灭的效果;但增大放/化疗剂量的同时也会加重对造血功能、免疫功能的损伤。所以血液肿瘤化疗/放疗之后,一般都需要对引起的造血功能损伤进行修复和治疗。造血功能损伤分为造血细胞损伤和造血微环境损伤,后者损伤严重程度远远大于前者,且更加持久甚至不可逆转,这是影响患者继续接受后续治疗的主要因素。
造血细胞和造血微环境的损伤修复比较好的方法细胞移植,将正常功能的造血干细胞(或者是祖细胞,祖细胞属于成体干细胞,是一种未分化的多能或专能干细胞)移植至损伤部位,自行生长分化从而对损伤部位进行补充和修复。但是制备所需要的造血干细胞,多采用iPS细胞(inducedpluripotentstemcell,诱导性多能干细胞,其具有多能干细胞的特性,并具有多种分化潜能)进行体外诱导制备。采用iPS细胞在体外分化制备的造血干细胞,是自身体细胞重编程而来的,不存在异体免疫排斥的问题。
现有以iPS细胞分化为造血干/祖细胞的方法是细胞因子单层诱导,即以iPS细胞在体外培养中用造血干细胞的细胞因子诱导其分化。但是这一方法在实施中,诱导过程不是在人体内调控和特定环境下进行,有一部分细胞的分化方向并不是完全造血干细胞进行,也有一些细胞虽然分化具有造血干细胞的性质、但是还会同时带有一些其他的性状,同时还有一部分细胞分化程度低或者是不分化,达不到造血干细胞的程度;所以这一方法制备造血干细胞的诱导率不高,能得到较为适合的造血干细胞的数量比较少;而且要进行大量培养,细胞因子在现阶段在诱导物中是属于价格最昂贵的,所以在产效收益上该方法无法满足规模实施的可行性。
发明内容
本发明实施的目的在于克服现有造血干细胞大量制备的缺陷,提供一种用诱导性多能干细胞诱导制备造血干细胞的方法。
为了实现上述发明目的,本发明实施例的技术方案如下:
一种用诱导性多能干细胞诱导制备造血干细胞的方法,包括如下步骤:
获取诱导性多能干细胞和小鼠骨髓基质细胞;
将所述诱导性多能干细胞和小鼠骨髓基质细胞于O2体积分数1~5%条件下共培养。
采用本发明的上述方法,采用小鼠骨髓基质细胞构建造血细胞的模拟骨髓微环境,将其与诱导性多能干细胞共培养,通过共培养使细胞代谢中产生细胞信号蛋白、细胞因子等,从而实现对诱导性多能干细胞诱导分化成造血干细胞;并且控制诱导的过程在低氧条件进行,可以加强细胞的自分泌能力,分泌物的量增加以后可以使上述诱导效果进一步加强,更利于诱导性多能干细胞的分化,具有更高的细胞转化率。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
本发明实例提出一种用诱导性多能干细胞诱导制备造血干细胞的方法,方法步骤包括:
S10,获取诱导性多能干细胞和小鼠骨髓基质细胞;
S20,将步骤S10获取的诱导性多能干细胞和小鼠骨髓基质细胞于含O2量1~5%(体积分数)环境下共培养。
本发明的上述造血干细胞的制备方法,采用小鼠骨髓基质细胞构建诱导性多能干细胞的诱导基质。骨髓基质细胞是骨髓中的一类多能干细胞,在骨髓组织中对骨髓血系细胞起支持诱导作用,又因其来自于骨髓基质,因而称其为“骨髓基质细胞。而根据对骨髓内环境的分析和研究,骨髓基质的重要功能是造血系统提供的微环境,对造血系统起支持作用。骨髓基质的重要细胞组成就是骨髓基质细胞,而小鼠骨髓基质细胞源于小鼠骨髓基质,其表面表达envgp70抗原,在形态学、表型及功能上有吞噬细胞的特征,更容易对其他细胞产生相互作用,利于诱导。所以本案中的采用小鼠骨髓基质细胞构建造血细胞微环境,将其与诱导性多能干细胞共培养,通过共培养使细胞代谢中产生细胞信号蛋白、细胞因子等,从而实现对诱导性多能干细胞实现诱导。
同时,共培养的过程在含O2量1~5%(体积分数)环境下进行,相比通常培养的空气氛围(空气中含O2量21%),低氧环境培养更加会接近于体内代谢的情况;在多种研究和报道中,正常生理状态下人体内的氧浓度一般是2%~9%,骨髓质和骨髓中的氧浓度更低一些,基本上只有1%左右,所以本案中采用含O2量1~5%的低氧环境进行诱导培养,一方面是为了使细胞的诱导环境能更加贴合于体内造血干细胞生成环境。而且在反复实施后,低氧条件下小鼠骨髓基质细胞培养过程中其生产出的细胞因子的量有明显的提升,研究发现低氧环境下,原因可能是在低氧的条件下,细胞自分泌的功能自身会增强,导致在聚集培养过程中细胞因子的浓度得到提高,而有利于细胞表型的维持,是自身更加适于低氧下的生长和繁殖。
因此采用本案的上述方式进行共培养,以小鼠骨髓基质细胞诱导种子细胞诱导性多能干细胞向造血干细胞分化,其构建的诱导环境是模拟的细胞骨髓微环境,而不是单纯的细胞因子化学环境,通过细胞间的通信和相互作用,更加利于分化表型的形成;同时,在共培养的过程中,在对诱导性多能干细胞的诱导分化的过程中,分化的过程起重要作用可能不是细胞因子,而是一些胞间物质,所以本案的共培养中小鼠骨髓基质细胞分析的很多细胞因子之外的代谢物质能对现有的细胞因子诱导的不足进行弥补;并且在低氧环境下进行诱导,通过加强细胞的自分泌能力,分泌物的量增加以后可以使上述诱导效果进一步加强,更利于诱导性多能干细胞的分化。
在本发明的上述实施方式中,细胞生长和诱导的过程中,培养中由于采用的是低氧诱导,可能会影响细胞的呼吸过程,不能完全的进行有氧代谢;代谢的过程中培养液中的乳酸含量相比通常培养的方式中增加的更快,较大浓度的乳酸一方面会酸化培养环境,同时还会抑制细胞的生长;因此相比通常的培养,本案中需要进一步加快换液,以避免乳酸大量积累。基本上实施中按照20~30h/次进行即可。
同时,在本案的共培养中采用mTeSRr培养基,mTeSRr培养基是商品化的无饲养层培养基,也是一种不含血清的完全细胞培养基,可以直接购买获得。其不含有细胞因子的成分,一方面相比其他含有细胞生长因子的培养基可以避免导致出现非造血干细胞的诱导;另一方面在于其中含有一些蛋白成分可以对细胞的胞间蛋白进行补充,加强诱导过程中的细胞通信。
进一步在细胞共培养的过程中,小鼠骨髓基质细胞自身的代谢和自分泌是形成诱导环境的主体,步骤S20在实施的过程中按照,诱导性多能干细胞和小鼠骨髓基质细胞的数量比为1:3~6进行共培养。在实施中,小鼠骨髓基质细胞较少时,诱导的效力非常低,直接持续到培养至10d左右时,其诱导分化声称的造血干细胞的量不多;而如果进一步增加小鼠骨髓基质细胞的数量至比较多的,共培养体系中诱导性多能干细胞自身的生长和分化处于竞争性劣势,反倒小鼠骨髓基质细胞自身快速大量扩增,造成诱导性多能干细胞的生长分化受到抑制;因此在反复实施对比之后,本案优选采用上述比例范围下进行实施。
同时上述步骤S20实施至基本上诱导分化生成造血干细胞的程度基本稳定之后,还可以增加步骤S30,将步骤S20诱导之后生成的造血干细胞用含有造血干细胞的典型细胞因子的培养基进行增强诱导。这些典型细胞因子就是现有通常的诱导方法中采用的细胞因子:SCF(stemcellfactor、干细胞因子)、VEGF(vascularendothelialgrowthfactor、血管内皮生长因子)、IL-6(白介素-6)、TPO(血小板生成素)、EPO(红细胞生成素)、G-CSF(粒细胞集落刺激因子)、GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)。当然本案中这几种主要都是与造血干细胞的功能和表型形成相关的细胞因子,所以本案中采用这些来做最后的增强诱导。方式可以直接采用将步骤S20诱导性多能干细胞诱导之后形成的细胞用含上述细胞因子的培养基进行培养即可。当然,本次步骤S30增强诱导时间不需要进行很长时间,因为步骤S20实施到共培养结束之后,虽然可能在某些表型或者细胞特性上不是非常完全,其本身已经是造血干细胞。所以步骤S30增强补充诱导的培养的时间5~10h即可,不需要太长时间;这一过程中的培养基可以采用适当的无血清培养基即可。同时,上述步骤S30实施的过程中,不完全需要上述SCF、VEGF、IL-6、TPO、EPO、G-CSF、GM-CSF全部的细胞因子,选择3~5种即可。
采用本发明的上述方法,采用小鼠骨髓基质细胞构建造血细胞的模拟骨髓微环境,将其与诱导性多能干细胞共培养,通过共培养使细胞代谢中产生细胞信号蛋白、细胞因子等,从而实现将诱导性多能干细胞诱导分化成造血干细胞;并且控制诱导的过程在低氧条件进行,可以加强细胞的自分泌能力,分泌物的量增加以后可以使上述诱导效果进一步加强,更利于诱导性多能干细胞的分化。
为使本发明的上述实施的技术细节和过程方法能更易于本领域技术人员的理解和实施参考,同时凸显出本发明的性能和品质,以下通过具体的实施例进行举例说明。
实施例1
S11,获取iPS细胞并进行传代:
将购于中科院广州生物医药与健康研究院的iPS细胞株UC013,使用无饲养层的培养方式进行培养,具体可以参考如下:
采用细胞培养板作为培养器材,将细胞培养板中的培养孔用含有1WT%Matrigel(基底膜基质胶,BD公司)的DMEM/F12培养基浸泡1h后,用微量移液器移除含有1WT%Matrigel的DMEM/F12培养基,该培养空后续待用;
然后挑去适量的上述iPS细胞样品和mTeSRr培养基于上述待用的培养板的培养孔内接种混合培养,培养至细胞融合度80%时,收获细胞;并将收获的细胞用0.5mmol/L的EDTA-胰蛋白酶消化3~5min后,按照传代比1:8于培养瓶中传代,每天观察细胞的生长情况。由于ips细胞比较容易分化,当发现有细胞分化时,可以在显微镜下用拉细的巴氏吸管小心刮起分化的克隆团,然后更换培养基即可将除去分化细胞,培养至细胞密度60%时终止培养,收获ips细胞。
S12,获取OP9小鼠骨髓基质细胞(购自上海通派生物科技有限公司)并进行扩增,将购买的冻存的细胞进行复舒之后,加入适量培养液后按照约1×109/L(细胞个数/体积)浓度接种于添加有10WT%胎牛血清的MEM培养基的培养瓶中培养,并收获细胞;
将上述扩增之后收获的OP9小鼠骨髓基质细胞按传代比例1:8于10cm培养皿中传代,细胞维持在37℃、5%CO2饱和湿度环境培养,培养至细胞密度80%左右时停止。
S21,在步骤S12的OP9小鼠骨髓基质细胞培养至细胞密度80%时,用吸引器将培养皿中的培养基换成mTeSRr培养基(mTeSRTM1|STEMCELLTECHNOLOGIES公司);
然后按照iPS细胞与OP9小鼠骨髓基质的细胞数量比为1:4的比例添加步骤S11收获的iPS细胞;
摇匀后放入培养箱进行培养,培养箱中的培养条件控制2%O2、4%CO2;94%N2;
培养至第2天以后,每隔一天换液一次,同时观察分化细胞的形态变化。
S22,在步骤S20的共培养至第7~8d时终止培养,用PBS洗两遍,先用胶原酶消化细胞,30min,加入3ml的0.25WT%胰酶放置于37℃培养箱中消化20min,观察细胞克隆飘起,用含血清的培养基终止消化后,用巴氏吸管将细胞吹打为单细胞悬液后收集在15ml离心管中300g、5min离心后分离收集细胞;
S23,将步骤S22中的细胞用加入1ml流式缓冲液制成细胞悬液,细胞悬液使用40um细胞筛网将没有消化成单细胞的细胞团块过滤掉,将过滤后的细胞悬液首先加入100ul的FCRblock4℃放置10min,然后加入100ul的CD34MicroBeads标记细胞,实验注意避光操作以免影响分离效果,4℃放置30min后加入10ml流式缓冲液,300g5min离心后用吸引器吸取上清,加入500ul流式缓冲液重悬,备用;
S24,使用MACS的柱子(即磁化细胞分离器分离法中常用于细胞分离的柱子)分离细胞,首先加入1ml流式缓冲液于柱子中,平衡柱子;
然后将步骤S23最后得到的重悬的细胞悬液用流式缓冲液稀释至102~103个/mL细胞浓度,待柱子平衡完成之后加入稀释后的单细胞悬液;
悬液滴完后用1ml流式缓冲液冲洗柱子3遍,标记细胞在通过置于磁场中的分离柱时,CD34-细胞被洗脱除去CD34+细胞被吸附在磁场中;
S25,将分离柱移出磁场,加入1ml流式缓冲液,加压洗脱CD34+细胞,收集组分为CD34+细胞于15ml离心管中,300g、5min离心后收集细胞;
S30,将步骤S25收集到的细胞按照1:2的比例用含有50ng/ml的VEGF、40ng/ml的G-CSF和60ng/ml的GM-CSF的无血清培养基继续培养8h后,收获细胞。
上述过程全部完成之后收集到的即是形状比较稳定的造血干细胞,为了进一步统计其诱导培养的分化率,继续进行如下步骤:
S41,将步骤S30培养后的培养液离心后弃去上层培养液,然后用PBS洗两遍,再用胶原酶消化细胞30min,然后加入3ml0.25WT%胰酶放置于37℃培养箱中消化20min,观察细胞克隆飘起,用含血清的培养基终止消化后,用巴氏吸管将细胞吹打为单细胞悬液后收集在15ml离心管中300G5min离心后用吸引器吸取上清,加入1ml流式缓冲液吹打均匀为细胞悬液。
S42,抗体孵育:将步骤S41的细胞悬液使用40um细胞筛网将没有消化成单细胞的细胞团块过滤掉,细胞悬液经过滤网过滤后,首先加入FCRblock4℃10min,用标记好的1.5mlEP管每管加入200ul细胞悬液,根据标记每管加入1ul抗体APC-TR1-85、CD34-PE-CY5.5、CD43-FITC、CD31-PE,单标和混合抗体。注意避光操作,4℃15min后用加入1ml流式缓冲液洗掉。300G5min离心后用吸引器吸取上清液加入200ul流式缓冲液重悬。
S43,检测:流式细胞仪开机后首先清洗流式,上样后调节机子的电压和荧光补偿,然后进行检测,流失数据使用flowJO7.6.1分析,并计算分化率。
同时为了验证上述步骤S43检测得到的效果,采用常规的细胞因子单层诱导收获的细胞作为对比,对比的结果如下:
CD34+CD31+CD43+的比例 | 5d(%) | 6d(%) | 7d(%) | 8d(%) |
本发明 | 2.2 | 4.6 | 6.9 | 9.7 |
现有细胞因子单层诱导方法 | 1.8 | 2.6 | 3.4 | 5.8 |
从上表的分化率的结果上基本上可以看出本案方法的细胞分化的程度,相比现有的细胞因子单层诱导收获的细胞分化的数量要高。
同时,为了进一步验证造血干细胞的分化情况,继续采用CD34+细胞集落形成实验进行验证,具体实施过程如下:
S51,细胞收集:将步骤S30获得的细胞用PBS洗两遍,先用胶原酶消化细胞30min,然后加入3ml0.25%胰酶放置于37℃培养箱中消化20min,观察细胞克隆飘起,用含血清的培养基终止消化后,用巴氏吸管将细胞吹打为单细胞悬液后收集在15ml离心管中300G5min离心后用吸引器吸取上清,加入1ml流式缓冲液吹打均匀为细胞悬液。
S52,孵育磁珠:细胞悬液使用40um细胞筛网将没有消化成单细胞的细胞团块过滤掉,细胞滤网过滤后的细胞悬液首先加入100ulFCRblock4℃放置10min,然后加入100ulCD34MicroBeads标记细胞,实验注意避光操作以免影响分离效果,4℃放置30min后加入10ml流式缓冲液,300G5min离心后用吸引器吸取上清,加入500ul流式缓冲液重悬;
S53,使用MACS的柱子分离细胞,首先加入1ml流式缓冲液于柱子中,平衡柱子;
然后将步骤S52最后得到的重悬的细胞悬液用流式缓冲液稀释至102~103个/mL细胞浓度,待柱子平衡完成之后加入稀释后的单细胞悬液;
悬液滴完后用1ml流式缓冲液冲洗柱子3遍,标记细胞在通过置于磁场中的分离柱时,CD34-细胞被洗脱除去CD34+细胞被吸附在磁场中;
S54,阳性细胞收集:
将分离柱移出磁场,加入1ml流式缓冲液,加压洗脱CD34+细胞,收集组分为CD34+细胞于15ml离心管中,用台盼兰染色计数活细胞。
常规的细胞因子单层诱导收获的细胞按照上述步骤S51~S54的过程作为对比,计数结果对比的结果如下:
CD34+ | 5d | 6d | 7d | 8d |
本发明 | 11.5×104 | 19.6×104 | 28.7×104 | 41.6×104 |
细胞因子单层诱导方法 | 3.1×104 | 4.2×104 | 5.5×104 | 9.2×104 |
整体上对比可以看出,本案的造血干细胞的分化的数量和形状的成熟稳定性上,都比现有的细胞因子单层诱导收获细胞要高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包括在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种用诱导性多能干细胞诱导制备造血干细胞的方法,其特征在于,包括如下步骤:
获取诱导性多能干细胞和小鼠骨髓基质细胞;
将所述诱导性多能干细胞和小鼠骨髓基质细胞于O2体积分数为1~5%条件下共培养。
2.如权利要求1所述的用诱导性多能干细胞诱导制备造血干细胞的方法,其特征在于,所述共培养的细胞接种中,按照所述诱导性多能干细胞和小鼠骨髓基质细胞的数量比1:3~6进行。
3.如权利要求1或2所述的用诱导性多能干细胞诱导制备造血干细胞的方法,其特征在于,
所述共培养中采用培养基为mTeSRr培养基。
4.如权利要求1或2所述的用诱导性多能干细胞诱导制备造血干细胞的方法,其特征在于,
所述共培养过程中按照20~30h/次进行培养基换液。
5.如权利要求1或2所述的用诱导性多能干细胞诱导制备造血干细胞的方法,其特征在于,将所述诱导性多能干细胞和小鼠骨髓基质细胞于O2体积分数1~5%条件下共培养步骤之后,还包括:
将所述诱导性多能干细胞进行共培养之后的细胞,用造血干细胞因子进行增强诱导;其中,所述造血干细胞因子为SCF、VEGF、IL-6、TPO、EPO、G-CSF、GM-CSF中的3~5种。
6.如权利要求5所述的用诱导性多能干细胞诱导制备造血干细胞的方法,其特征在于,
所述增强诱导的时间为5~10h。
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