JP5597904B2 - 多能性幹細胞からの血液細胞分化に関する培養方法 - Google Patents

Description

本発明は血液細胞へ分化させるための細胞培養方法に関する。より具体的には、本発明は、血液前駆細胞へ分化し得る細胞を血液前駆細胞に分化させ、さらに、血液細胞にまで分化させるための細胞培養法に関する。

血液関連疾患の治療に際し、各種血液細胞の必要量を安定に供給することは、非常に重要なことである。これまでは、主として、ドナーによる献血により採取される血液から、各種血液細胞を調製し、手術などの治療に用いてきた。しかしながら、慢性的なドナー不足のため、十分な量の血液細胞を必要な時に迅速に確保することは容易なことではなかった。特に、血液凝固（止血）に必須の細胞である血小板は、白血病、骨髄移植、抗癌治療などにおいて、必須の細胞であるにもかかわらず、ドナーから採取した血小板を凍結して保存することができないため、安定供給のための有効な手段に対するニーズは極めて高いものである。
最近では、ドナーからの提供に依存せずに、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞から、生体外において、各血液細胞を調製する試みもさかんに行われるようになり、その実用化に注目が集まっている。例えば、Ｔａｋａｙａｍａらは、ヒトＥＳ細胞から血小板を産生することに成功したことを報告している（特許文献１及び非特許文献１）。また、同様にｉＰＳ細胞からも血小板の調製が可能なことも開示されている（特許文献２）。

生体外において、多能性幹細胞から血液細胞を調製する方法が開発されたことにより、今後の医療の現場において使用される各種血液細胞の多くが、多能性幹細胞から調製されることになり、慢性的な血液細胞不足も容易に解消されるとの期待も生じている。しかし、これまでに報告されているｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞からの血液細胞の調製法では、調製される血液細胞の量が少なく、手術などの治療に必要とされる量を確保するのは難しいのが現状である。従って、血液細胞への分化を何らかの方法により促進させるべく、そのため、従来法の改良を行う必要がある。

細胞の分化誘導を行う場合、生体内と生体外で大きく異なる条件の１つとして、酸素濃度を挙げることができる。生体外において、細胞の分化誘導を行う場合、各前駆細胞を大気酸素環境より低い酸素濃度下で培養等を行い、分化誘導をしている例がいくつか報告されている（非特許文献２〜非特許文献５、特許文献３〜特許文献５）。例えば、これまでに、軟骨に分化し得る細胞を低酸素条件下で培養して軟骨分化を行う方法（特許文献３）、未分化中枢神経系細胞（特許文献４）又は神経冠幹細胞（特許文献５）を低酸素条件下で培養する方法、ＥＳ細胞を低酸素濃度で培養後、大気酸素濃度で培養し、心筋細胞へ分化させる方法（非特許文献５）などが報告されている。しかしながら、血液細胞への分化に対する低酸素濃度の影響について詳細に報告されている例は未だに存在していない。

ＷＯ２００８／０４１３７０ ＷＯ２００９／１２２７４７ 特開２００３−１２５７８７ ＷＯ００／２９５５０ ＷＯ００／２９５４９

Ｔａｋａｙａｍａら，Ｂｌｏｏｄ，１１１：５２９８−５３０６ ２００８ Ｋｅｎｎｅｄｙら，Ｂｌｏｏｄ，１０９：２６７９−２６８７ ２００７ Ｐｒａｄｏ−Ｌｏｐｅｚら，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２８：４０７−４１８ ２０１０ Ｍａｒｔｉｎ−Ｒｅｎｄｏｎら，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２５：１００３−１０１２ ２０１０ Ｂａｕｗｅｎｓら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．，９０：４５２−４６１ ２００５

本発明者らは、すでに、多能性幹細胞から血液前駆細胞を取得し、さらに、各種血液細胞にまで分化させる方法を確立しているが、この方法によって調製される血液細胞の量は少なく、治療等に使用する量として十分であるとまではいえない状況にある。
そこで、本発明は、上記事情に鑑み、より大量かつ安定的なインビトロにおける血液細胞の調製法の確立を目指し、血液前駆細胞への新規な分化誘導方法の提供、並びに、該方法で製造される血液前駆細胞及び該血液前駆細胞から分化誘導される各種血液細胞の提供を目的とする。

発明者らは、多能性幹細胞から血液前駆細胞を誘導する工程において、細胞培養を、一定期間、低酸素分圧下で行ったところ、誘導された血液前駆細胞の数が大気酸素分圧下のみで培養を行った場合と比較して増大することを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１６）に関する。
（１）血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞へ分化し得る細胞を酸素分圧が上昇する環境において細胞培養する工程を含む、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
（２）前記酸素分圧が上昇する環境が、低酸素分圧下において細胞培養する工程を含む環境である、上記（１）に記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
（３）前記低酸素分圧が０．１〜１０％である上記（２）に記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
（４）前記低酸素分圧が、該分圧下で培養を行った場合、他の分圧下での培養と比較して低酸素応答性の遺伝子が発現する酸素分圧であることを特徴とする、上記（２）又は（３）に記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
（５）前記低酸素分圧において細胞培養開始から一定期間細胞培養を行った後、より高い酸素分圧下でさらに細胞培養を行う上記（２）乃至（４）のいずれかに記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
（６）前記一定期間が、４〜１０日間である上記（５）に記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
（７）前期一定期間が、ＫＤＲ陽性、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陽性を示す細胞が出現するまでである上記（５）又は（６）に記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
（８）前記より高い酸素分圧下に変える時期が、中内胚葉誘導の指標となる遺伝子が発現する時期、血液前駆細胞誘導の指標となる遺伝子の発現が開始される時期、分化増殖性サイトカインの指標となる遺伝子の発現が開始される時期、又は、血液細胞誘導の指標となる遺伝子の発現が開始される時期であることを特徴とする上記（５）乃至（７）のいずれかに記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
（９）前記より高い酸素分圧が、酸素分圧１１〜３０％である上記（５）乃至（８）のいずれかに記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
（１０）前記血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞へ分化し得る細胞が、多能性幹細胞である上記（１）乃至（９）のいずれかに記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
（１１）前記血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞がネット様構造又は胚様体から取得されることを特徴とする上記（１）乃至（１０）のいずれかに記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
（１２）前記細胞培養を行う培地中にＶＥＧＦを添加しないことを特徴とする上記（１）乃至（１１）のいずれかに記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
（１３）上記（１）乃至（１２）のいずれかに記載の方法で製造される血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞。
（１４）上記（１３）に記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞をさらに培養して製造される血液細胞。
（１５）上記（１４）に記載の血液細胞を含む医薬製剤。
（１６）上記（１）に記載の製造方法を使用することを特徴とする血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞への分化を促進又は阻害する物質のスクリーニング方法。

本発明によれば、従来法と比較して、分化誘導される血液前駆細胞、赤血球前駆細胞並びに血液細胞の数を増大させることが可能となる。

本発明によれば、所望の数の血液前駆細胞、赤血球前駆細胞又は血液細胞を取得するための培養期間を短縮することが可能となる。

本発明によれば、従来、効率的な血液前駆細胞の誘導のために必要であったＶＥＧＦを使用することなく、血液前駆細胞を調製することができる。

本発明によれば、血液分化能力の高い血液前駆細胞、赤血球前駆細胞を得ることができる。

低酸素分圧下での培養が血液細胞分化に与える効果。縦軸は、培養後に生じた血液細胞の数である。（１）は、１４日間２１％酸素分圧で培養した結果を、（２）は、７日間５％酸素分圧で培養した後２１％酸素分圧で７日間培養した結果、（３）は、１４日間５％酸素分圧で培養した結果である。（１）（２）及び（３）の全ての実験は、２０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦの存在下で行った。使用した細胞は、ｉＰＳ細胞（ＴｋＣＢ７−４株）。 血液前駆細胞（ＨＰＣ；ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）への分化に対する低酸素培養の効果を示す。ＨＰＣへの分化に対する低酸素培養の効果をフローサイトメトリーを使用して検討した。（１）は、１４日間２１％酸素分圧で培養した結果を、（２）は、７日間５％酸素分圧で培養した後２１％酸素分圧で７日間培養した結果、（３）は、１４日間５％酸素分圧で培養した結果である。使用した細胞は、ｉＰＳ細胞（ＴｋＣＢ７−４株）。 血液前駆細胞への分化に対する低酸素培養の効果について、コロニーアッセイにより検討した結果である。（１）は、１４日間２１％酸素分圧で培養した結果を、（２）は、７日間５％酸素分圧で培養した後２１％酸素分圧で７日間培養した結果である。ｎ、ｍ、Ｅ、Ｍ及びｂｌａｓｔは、各々、好中球、マクロファージ、赤芽球、巨核球、幼若血球のことである。文字の組合せは、各文字に対応する細胞が混在することを示す（例えば、ｎｍは、好中球とマクロファージが混在することを示す）。また、縦軸は、１×１０^４個の血液細胞に由来するコロニー数を表す。グラフ中に示す数字はミックスコロニーの数である。使用した細胞は、ｉＰＳ細胞（ＴｋＣＢ７−２株）。 血液前駆細胞への分化に対する低酸素培養の効果について、ＣＤ３４陽性細胞数をカウントすることで評価した結果である。ここでは、多能性幹細胞として、ＥＳ細胞（ＫｈＥＳ３株）を使用した。（１）は、ＶＥＧＦ存在下、７日間５％酸素分圧で培養した後２１％酸素分圧で７日間培養した結果、（２）は、ＶＥＧＦ存在下、１４日間２１％酸素分圧で培養した結果、（３）は、ＶＥＧＦ非存在下、１４日間２１％酸素分圧で培養した結果である。縦軸は、（３）の結果をして得られたＣＤ３４陽性細胞の数を１とした場合のＣＤ３４陽性細胞数の結果である。 赤血球系細胞への分化に対する低酸素培養の効果について、フローサイトメトリーを使用して検討した結果である。（１）は、１４日間２１％酸素分圧で培養した結果を、（２）は、７日間５％酸素分圧で培養した後２１％酸素分圧で７日間培養した結果、（３）は、１４日間５％酸素分圧で培養した結果である。（１）（２）及び（３）の全ての実験は、２０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦの存在下で行った。使用した細胞は、ｉＰＳ細胞（ＴｋＣＢ７−４株）。 多能性幹細胞から得られる各種血液細胞数に対する低酸素培養の効果を調べた結果を示す。Ａ及びＢは赤血球細胞、Ｃは巨核球細胞、Ｄは血小板について検討した。なお、ＡはＥＳ細胞（ＫｈＥＳ−３株）に由来する血球細胞、Ｂ〜ＤはｉＰＳ細胞（ＴｋＣＢ７−２株）に由来する血球細胞の細胞数である。（１）は、１４日間２１％酸素分圧で培養し、赤血球分化培養した結果を、（２）は、７日間５％酸素分圧で培養した後２１％酸素分圧で７日間培養し、その後赤血球分化培養した結果である。 低酸素分圧下で培養したＨＰＣのβグロビン鎖陽性率につい検討した結果を示す。ＡはＥＳ細胞（ＫｈＥＳ−３株）に由来する赤血球、ＢはｉＰＳ細胞（ＴｋＣＢ７−２株）に由来する赤血球に関するβグロビン鎖陽性細胞の割合である。（１）は、１４日間２１％酸素分圧で培養し、赤血球分化培養した結果を、（２）は、７日間５％酸素分圧で培養した後２１％酸素分圧で７日間培養し、赤血球分化培養した結果である。また、Ｃは赤血球細胞をＤＡＰＩと抗ヒトヘモグロビン抗体（左図）又は抗ヒトβグロビン抗体（右図）で二重染色した結果である。 低酸素培養によるＶＥＧＦ代替性に関する検討結果。Ａは、培養後に生じた血球数をカウントした結果を、Ｂは、培養後に生じた細胞のフローサイトメトリーの結果を示す。（１）は、ＶＥＧＦ存在下、１４日間２１％酸素分圧で培養した結果、（２）は、ＶＥＧＦ非存在下、７日間５％酸素分圧で培養した後２１％酸素分圧で７日間培養した結果を示す。使用した細胞は、ｉＰＳ細胞（ＴｋＣＢ７−４株）。 低酸素培養によるＶＥＧＦ代替性について、コロニーアッセイにより検討した結果である。Ａは、ｉＰＳ細胞のＴｋＣＢ７−４株、Ｂは、ｉＰＳ細胞のＴｋＣＢ８−３株、Ｃは、ＥＳ細胞のＫｈＥＳ３株を用いた結果である。（１）は、ＶＥＧＦ存在下、１４日間２１％酸素分圧で培養した結果、（２）は、ＶＥＧＦ非存在下、７日間５％酸素分圧で培養した後２１％酸素分圧で７日間培養した結果を示す。ｎ、ｍ、Ｅ、Ｍ及びｂｌａｓｔは、各々、好中球、マクロファージ、赤芽球、巨核球、幼若血球のことである。文字の組合せは、各文字に対応する細胞が混在することを示す（例えば、ｎｍは、好中球とマクロファージが混在することを表す）。Ａの縦軸は、５×１０^３個の血液細胞に由来するコロニー数を表し、Ｂの縦軸は、１×１０^４個の血液細胞に由来するコロニー数を表し、Ｃの縦軸は、１×１０^５個のＥＳ細胞に由来するコロニー形成細胞数を表す。グラフ中に示す数字はミックスコロニーの数である。 １％酸素分圧下での培養の効果について検討した。ＶＥＧＦ非存在下、（１）は、７日間５％酸素分圧で培養した後２１％酸素分圧で７日間培養した結果、（２）は、７日間１％酸素分圧で培養した後２１％酸素分圧で７日間培養した結果である。縦軸は、培養開始時のＥＳ細胞数（１×１０^５）あたりの血球コロニー数を表す。使用した細胞は、ＥＳ細胞（ＫｈＥＳ３株）。 １％酸素分圧下での培養の効果について検討した。ＶＥＧＦ存在下において２１％酸素分圧下で１４日間培養した場合（１）、ＶＥＧＦ非存在下において５％酸素分圧下で７日間培養後、２１％酸素分圧下で７日間培養した場合（２）、ＶＥＧＦ非存在下において１％酸素分圧下で７日間培養後、２１％酸素分圧下で７日間培養した場合（３）に生じる血液前駆細胞について、コロニーアッセイを行った結果を示す。ｎ、ｍ、Ｅ、Ｍ及びｂｌａｓｔは、各々、好中球、マクロファージ、赤芽球、巨核球、幼若血球のことで、文字の組合せは、各文字に対応する細胞が混在することを示す。縦軸は、培養開始時のＥＳ細胞数（１×１０^５）あたりの血球コロニー数を表し、グラフ中の数字はミックスコロニーの数を示す。使用した細胞は、ＥＳ細胞（ＫｈＥＳ３株）。 低酸素分圧下での培養からより高い酸素分圧下での培養へ切り替えるタイミングに関する検討結果。Ａは、５％酸素分圧下、Ｂは、１％酸素分圧下で実験を行った。縦軸は、Ｎ−を１とした場合の、全血液細胞数の相対値である。横軸の、Ｌ４−、Ｌ７−、Ｌ１０−は、培養開始後４日、７日、１０日目に低酸素環境から２１％酸素分圧下に切り替えた結果である。また、Ｌ１４は、終始低酸素培養を行った。Ｎ−は終始２１％酸素分圧下で培養を行った。全ての培養において、ＶＥＧＦは添加しなかった。 酸素分圧変化に伴う、中内胚葉誘導の指標となる遺伝子（Ｔ）の発現変化の検討結果。縦軸は、ＧＡＰＤＨの発現に対する相対的な発現を示す。また、Ｌ７は培養開始後７日目に低酸素分圧下（５％酸素分圧）から大気酸素分圧下（２１％酸素分圧）に切り替えた場合、また、Ｌ１４は、終始低酸素分圧下（５％酸素分圧）で培養を行った場合である。遺伝子発現は、培養８日目に調べた。 酸素分圧変化に伴う、血液前駆細胞誘導の指標となる遺伝子（ＴＡＬ−１（Ａ）、ＫＤＲ（Ｂ）及びＣＤＲ３４（Ｃ））の発現変化の検討結果。縦軸は、ＧＡＰＤＨの発現に対する相対的な発現を示す。Ｌ７及びＬ１４は図１３の説明と同じ。遺伝子発現は、培養１０日目に調べた。 酸素分圧変化に伴う、サイトカインの指標となる遺伝子（ＶＥＧＦ（Ａ）及びＥＰＯＲ（Ｂ））の発現変化の検討結果。縦軸は、ＧＡＰＤＨの発現に対する相対的な発現を示す。Ｌ７及びＬ１４は図１３の説明と同じ。ＶＥＧＦの発現は培養１４日目に、ＥＰＯＲの発現は培養８日目に調べた。 酸素分圧変化に伴う、血液細胞誘導の指標となる遺伝子（ＣＤ４１ａ（Ａ）及びＧｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ−Ａ（Ｂ））の発現変化の検討結果。縦軸は、ＧＡＰＤＨの発現に対する相対的な発現を示す。Ｌ７及びＬ１４は図１３の説明と同じ。遺伝子発現は培養１４日目に調べた。 酸素分圧変化に伴う、低酸素応答性遺伝子（ＨＩＦ２ａ）の発現変化の検討。縦軸は、ＧＡＰＤＨの発現に対する相対的な発現を示す。また、Ｎ−は終始２１％酸素分圧下で培養を行った場合で、Ｌ７は図１３の説明と同じ。遺伝子発現は培養７日目に調べた。

本発明の実施形態の１つは、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞へ分化し得る細胞を酸素分圧が上昇する環境において細胞培養する工程を含む、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞への分化方法、あるいは、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞へ分化し得る細胞を低酸素分圧下において細胞培養する工程を含む、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法である。
また、本発明の他の実施形態は、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞へ分化し得る細胞を低酸素分圧下において細胞培養する工程を含む、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞への分化方法、あるいは、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞へ分化し得る細胞を低酸素分圧下において細胞培養する工程を含む、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法である。
ここで、「血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞へ分化し得る細胞」とは、特に限定するものではなく、例えば、多能性幹細胞（ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞など）、あるいは、多能性幹細胞と血液前駆細胞の間の分化段階にある細胞であればいずれの細胞であってもよく、好ましくは、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である。

本発明で使用されるＥＳ細胞は、特に限定されるものではなく、一般的には、胚盤胞期の受精卵をフィーダー細胞と共に一緒に培養し、増殖した内部細胞塊由来の細胞をばらばらにして、さらに、植え継ぐ操作を繰り返し、最終的にＥＳ細胞株として樹立することができる。このように、ＥＳ細胞は受精卵から取得するものである。その他、例えば、脂肪組織、絨毛膜絨毛、羊水、胎盤、精巣細胞など、受精卵以外の細胞、組織から取得され、ＥＳ細胞類似の特徴を持ち、分化多能性を有するＥＳ細胞様の細胞であってもよい。

また、本発明で使用されるｉＰＳ細胞は、体細胞（例えば、線維芽細胞や血液細胞など）へ分化多能性を付与する数種類の転写因子（以下、ここでは「分化多能性因子」と称する）遺伝子を導入することにより、ＥＳ細胞と同等の分化多能性を獲得した細胞であれば、如何なる由来の細胞であってもよい。分化多能性因子としては、すでに多くの因子が報告されており、限定はしないが、例えば、Ｏｃｔファミリー（例えば、Ｏｃｔ３／４）、ＳＯＸファミリー（例えば、ＳＯＸ２、ＳＯＸ１、ＳＯＸ３、ＳＯＸ１５及びＳＯＸ１７など）、Ｋｌｆファミリー（例えば、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２など）、ＭＹＣファミリー（例えば、ｃ−ＭＹＣ、Ｎ−ＭＹＣ、Ｌ−ＭＹＣなど）、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８などを挙げることができる。ｉＰＳ細胞の樹立方法については、多くの文献が発行されているので、それらを参考にすることができる（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｃｅｌｌ ２００６，１２６：６６３−６７６；Ｏｋｉｔａら，Ｎａｔｕｒｅ ２００７，４４８：３１３−３１７；Ｗｅｒｎｉｇら，Ｎａｔｕｒｅ ２００７，４４８：３１８−３２４；Ｍａｈｅｒａｌｉら，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２００７，１：５５−７０；Ｐａｒｋら，Ｎａｔｕｒｅ ２００７，４５１：１４１−１４６；Ｎａｋａｇａｗａら，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００８，２６：１０１−１０６；Ｗｅｒｎｉｇら，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２００８，１０：１０−１２；Ｙｕら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００７，３１８：１９１７−１９２０；Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｃｅｌｌ ２００７，１３１：８６１−８７２；Ｓｔａｄｔｆｅｌｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００８ ３２２：９４５−９４９などを参照のこと）。

本発明により分化又は製造される血液前駆細胞とは、ＣＤ３４⁻（ＣＤ３４陰性）、ＣＤ３４^＋（ＣＤ３４陽性）、Ｌｉｎ⁻（ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ４１、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｂ、または、ＣＤ２３５ａ陰性）、ＣＤ３８⁻（ＣＤ３８陰性）、ＣＤ９０^＋（ＣＤ９０陽性）、ＣＤ４９ｆ^＋（ＣＤ４９ｆ陽性）、ＶＥＧＦＲ２^＋（ＶＥＧＦＲ２陽性）、ＣＤ３１^＋（ＣＤ３１陽性）、ＣＤ４３^＋（ＣＤ４３陽性）、ＣＤ３４^＋／ＣＤ４５^＋（ＣＤ３４陽性、かつ、ＣＤ４５陽性）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ弱陽性、あるいは、Ｈｏｅｃｈｓｔ陰性／弱陽性ののうち、単独、あるいは複数のマーカーの組み合わせで特徴付けられる造血系の細胞の事である。また、本発明により分化又は製造される赤血球前駆細胞とは、ＣＤ７１^＋（ＣＤ７１陽性）、ＧＰＡ（Glycophorin A）^＋（ＧＰＡ陽性）、ＧＰＡ^＋／ＣＤ４１^＋（ＧＰＡ陽性／ＣＤ４１陽性）あるいは、ＧＰＡ（Glycophorin A）^＋／ＣＤ４５^＋（ＧＰＡ陽性／ＣＤ４５陽性）として、特徴付けられる造血系の細胞のことである。また、本発明により分化又は製造される巨核球、血小板とは、ＣＤ４１^＋（ＣＤ４１陽性）、ＣＤ４２ｂ^＋（ＧＰＡ陽性）、ＣＤ４１^＋／ＣＤ４２ｂ^＋（ＣＤ４１陽性／ＣＤ４２ｂ陽性）、あるいは、ＧＰＡ⁻／ＣＤ４１^＋（ＧＰＡ陰性／ＣＤ４１陽性）として特徴付けられる造血系の細胞の事である。

本発明で使用される「細胞」が由来する動物は、ヒト及び非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、イヌ、ネコ、トリなど）であり特に限定はされないが、特に好ましくは、ヒトである。

本発明において、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞を分化誘導するために行う細胞培養の条件のうち酸素分圧条件以外の条件については、当業者により選択可能な如何なる条件を使用してもよく、例えば、「血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞へ分化し得る細胞」としてＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞を使用する場合、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞を分化誘導する過程において、ネット様構造物又は胚様体が形成されるような条件などを培養条件の例として使用することができる。

ここで、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞から調製される「ネット様構造物」とは、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞由来の立体的な嚢状（内部に空間を伴うもの）構造体で、内皮細胞集団などで形成され、内部に血液前駆細胞及び赤血球前駆細胞を含むもののことである。ネット様構造物の詳細については、例えば、ＴＡＫＡＹＡＭＡら，ＢＬＯＯＤ ２００８，１１１：５２９８−５３０６、を参照のこと。
ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞からネット様構造物が形成される培養条件とは、用いるＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞によって異なるが、例えば、培地としては、最終濃度１５％のＦＢＳを添加したＩＭＤＭを用い、その他無血清の場合においても適宜増殖因子およびサプリメント等を加えたものを使用することができる。なお、従来法では、ネット様構造物を効率的に形成させるために、ＶＥＧＦ（０〜１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、２０ｎｇ／ｍｌ程度）を加えて培養を行っているが、本発明で開示されるように低酸素環境下での培養を行う場合には、ＶＥＧＦを添加しなくても、ＶＥＧＦを添加した場合と同等の効果を得ることができる。酸素分圧以外の培養の環境としては、用いるＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞の種類によって異なるが、例えば、５％ ＣＯ_２、３６〜３８℃、好ましくは３７℃の条件を用いることができる。ネット様構造物が形成されるまでの培養期間は、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞の種類によって異なるが、フィーダー細胞上に播いてから、１４〜１６日間程度である。形成されたネット様構造物は、濾胞状構造になっており、内部には、血液前駆細胞及び赤血球前駆細胞が濃縮された状態で存在している。ネット様構造物の内部に存在する血液前駆細胞及び赤血球前駆細胞は、物理的な手段、例えば、滅菌済みの篩状器具（例えば、セルストレイナーなど）に通すことにより、分離することができる。このようにして得られる血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞は、さらに培養して、各種血液細胞へ分化させることができる。

また、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞から血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞を培養する条件（酸素分圧以外の条件）として、胚様体と呼ばれる内胚葉、中胚葉、外胚葉の分化細胞を含む細胞塊が形成されるような条件を使用することも可能である。その条件としては、用いるＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞によって異なるが、例えば、培地としては、最終濃度１５％のＦＢＳ、トランスフェリンなどを添加したＩＭＤＭを用い、その他適宜増殖因子およびサプリメント等を加えたものを使用することができる。また、酸素分圧以外の培養環境としては、用いるＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞の種類によって異なるが、例えば、５％ ＣＯ_２、３６〜３８℃、好ましくは３７℃の条件を用いることができる。

本発明において、「酸素分圧が上昇する環境」とは培養中に酸素分圧が上昇する条件を備えた環境を意味する。この環境は人工的に作り出された環境であってよい。「酸素分圧が上昇する」とは低酸素分圧の範囲において酸素分圧が上昇してもよいし、より高い酸素分圧の範囲において酸素分圧が上昇してもよい。また低酸素分圧からより高い酸素分圧へ移行するような範囲において酸素分圧が上昇してもよい。培養中に酸素分圧が上下に変動するような環境であっても、一時的に酸素分圧が上昇するような環境は、本発明の「酸素分圧が上昇する環境」である。
本発明における「低酸素分圧」とは、例えば、酸素分圧０．１％〜１０％、好ましくは、１％〜５％、より好ましくは５％程度のことである。あるいは、低酸素応答性の遺伝子が発現する酸素分圧を「低酸素分圧」として選択してもよい。ここで、低酸素応答性遺伝子とは、例えば、ＨＩＦ２α、ＨＩＦ１α、ＨＩＦ３α、ＨＩＦ１β、ＧＬＵＴ−１、ｐ２１、ｐ５７、ＦｏｘＯ、Ｎｏｔｃｈ１、ＶＥＧＦ、ＡＢＣＧ２／Ｂｃｒｐ−１、ＣＸＣＲ４、ＰＤＫ−１、ｃ−Ｋｉｔなどが挙げられる。

本発明における「発現」とは、例えば、遺伝子が転写されてｍＲＮＡが合成されること、遺伝子のｍＲＮＡが翻訳されてタンパク質となること、あるいは遺伝子のタンパク質が機能を発揮することである。

また、血液前駆細胞へ分化し得る細胞から血液前駆細胞を分化誘導又は製造するために行う細胞培養において、全工程を低酸素分圧下にしてもよいが、血液前駆細胞へ分化し得る細胞の培養開始から、例えば、ＫＤＲ^＋、ＣＤ３４^＋、ＣＤ４３^＋を示す細胞が出現するまでの期間を低酸素分圧下で培養し、その後、より高い酸素分圧、例えば大気酸素分圧２１％の酸素分圧下で培養することが好ましい。例えば、ヒトＥＳ細胞又はヒトｉＰＳ細胞からネット様構造物を形成させる条件で培養を行う場合、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞の培養開始から、１〜１０日間、好ましくは、４〜８日間、より好ましくは、７日間程度、低酸素分圧下（例えば、酸素分圧５％程度）で培養を行い、その後、より高い酸素分圧下で培養することが好ましい。

あるいは、低酸素分圧からより高い酸素分圧に切り替えるタイミングは、特定の遺伝子の発現変化を指標にして決定してもよい。特定の遺伝子としては、限定はしないが、例えば、中内胚葉誘導の指標となる遺伝子、血液前駆細胞誘導の指標となる遺伝子、分化増殖性サイトカインの指標となる遺伝子、又は、血液細胞誘導の指標となる遺伝子を挙げることができる。例えば、中内胚葉誘導の指標となる遺伝子が発現するタイミングの前後で酸素分圧を低酸素から大気酸素へ切り替える事が望ましい。また、血液前駆細胞誘導の指標となる遺伝子、分化増殖性サイトカインの指標となる遺伝子、及び血液細胞誘導の指標となる遺伝子は、その発現が始まる前後までに酸素分圧を低酸素から大気酸素へ切り替えることが望ましい。
前述の中内胚葉誘導の指標となる遺伝子とは、Ｔ、ＳＯＸ−１７、ＧＡＴＡ−４、ＨＮＦ−３β、ＧＳＣ、Ｃｅｒ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、Ｍｉｘｌ１、ＦＧＦ４ ＣＤ４８、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ−６、ＣＸＣＲ４、ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、ＯＴＸ２、Ｎｏｄａｌなどが挙げられる。前述の血液前駆細胞誘導の指標となる遺伝子とは、ＴＡＬ−１、ＫＤＲ、ＣＤ３４、ＣＸＣＲ４、ｃ−Ｋｉｔ、ＲＵＮＸ−１、ＧＡＴＡ−１、ＧＡＴＡ−２、ＣＤ４３、ＥＴＶ−２、Ｔｉｅ−２、ＣＤ３１、ＣＬＯＵＤＩＮ５、Ｓｃａ−１などが挙げられる。前述の分化増殖性サイトカインの指標となる遺伝子とは、ＶＥＧＦ、ＥＰＯＲ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＢＭＰ４、ＦＧＦ−２、ＦＬＴ−１、Ａｎｇ−１、ＳＤＦ−１、ＳＣＦなどが挙げられる。前述の血液細胞誘導の指標となる遺伝子とは、ＣＤ４１、Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ−Ａ、ｃ−ＭＰＬ、Ｒｈ抗原、α４インテグリン、ＫＬＦ−１、ＢＣＬ−１１Ａ、ＣＤ４５、β−Ｇｌｏｂｉｎ、α−Ｇｌｏｂｉｎ、ε−Ｇｌｏｂｉｎ、γ−Ｇｌｏｂｉｎなどが挙げられる。

ここで、「より高い酸素分圧」とは、血液前駆細胞へ分化し得る細胞の培養開始時の酸素分圧（低酸素分圧）よりも高い酸素分圧であり、例えば、１１％〜３０％程度の酸素分圧、より好ましくは、１５％〜２５％程度の酸素分圧である。特に、「より高い酸素分圧」とは、大気酸素分圧２１％程度が好ましい。

本発明の他の実施形態は、本発明の方法により製造される血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞をさらに培養し、各種血液細胞を分化誘導又は製造する方法である。
血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞から様々な血液細胞を分化誘導する方法は、当該技術分野において、多くの方法が公知になっており（例えば、Ｍｉｈａｒａｄａら，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００６，２４：１２５５−１２５６；Ｑｉｕら，Ｂｌｏｏｄ ２００８，１１１：２４００−２４０８；Ｍａら，ＰＮＡＳ ２００８，１０５：１３０８７−１３０９２；Ｌｕら，Ｂｌｏｏｄ ２００８，１１２：４４７５−４４８４；Ｂａｅｋら，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２００９，１１：２２８５―２２９５；Ｌａｐｉｌｌｏｎｎｅら，ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ２０１０，ｄｏｉ：１０．３３２４）、当業者であれば容易に選択し、実施することができる。
例えば、本発明の方法により製造された血液前駆細胞から、成熟巨核球細胞、さらに、血小板を製造する場合、その培養条件として、ＴＰＯ、ＩＬ−１α、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＥＰＯ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３リガンド、Ｈｅｐａｒｉｎなどのいずれか又はこれらのうちの２つ以上を組合せて添加した条件を挙げることができる。より具体的に、成熟巨核球細胞及び血小板を分化誘導する条件として、例えば、ＴＰＯ（１０〜２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ程度）の存在下で、あるいは、ＴＰＯ（１０〜２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ程度）、ＳＣＦ（１０〜２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ程度）及びＨｅｐａｒｉｎ（１０〜１００Ｕ／ｍＬ、好ましくは２５Ｕ／ｍｌ程度)の存在下で、７〜１５日間程度培養する条件を例示することができる。培養環境としては、インビトロで血球系細胞の分化誘導を行うにあたり適した環境であればよいが、例えば、５％ ＣＯ_２、３６〜３８℃、好ましくは３７℃の条件下で培養を実施してもよい。

また、本発明の方法により製造された赤血球前駆細胞から、成熟赤血球細胞を分化誘導するために適した条件とは、例えば、ＴＰＯ、ＩＬ−１α、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１１，ＥＰＯ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３リガンド、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ、Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ、Ｈｅｐａｒｉｎなどのいずれか又はこれらのうちの２つ以上を組合せて添加した条件を挙げることができる。より具体的に、赤血球細胞を分化誘導する条件として、ＥＰＯ（２〜１００Ｕ／ｍＬ、好ましくは１０Ｕ／ｍＬ程度）の存在下で、あるいは、ＥＰＯ（２〜１００Ｕ／ｍＬ、好ましくは１０Ｕ／ｍＬ程度）、ＳＣＦ（１０〜２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ程度）、ＴＰＯ（５〜２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ程度）の存在下で、７〜２５日間程度培養する条件を例示することができる。培養環境としては、インビトロで血球系細胞の分化誘導を行うにあたり適した環境であればよいが、例えば、５％ ＣＯ_２、３６〜３８℃、好ましくは３７℃の条件下で培養を実施してもよい。

また、本発明によって製造される各種血液細胞は、製剤の形態で安定に供給することも可能である。本発明の方法によって、例えば、血小板を製造し、これを製剤化する場合、血小板が豊富に存在する培養液の画分を回収し、白血球除去フィルターなどを使用して、巨核球細胞、その他、血小板以外の血球系細胞成分を除去して、調製することができる。血液製剤を調製するにあたっては、血小板又は赤血球細胞の安定化に資する他の成分を含有せしめることもできる。このような安定化に資する成分は、当該技術分野の専門家において周知のものを選択することが可能である。

より具体的には、取得した血小板は、例えば、以下の方法により製剤化することができる。
ＡＣＤ−Ａ液：ＦＦＰ（ｆｒｅｓｈ ｆｒｏｚｅｎ ｐｌａｓｍａ；献血で得られた全血液から調整したもの、アルブミン、凝固因子など血液成分以外のものをすべて含む）を１：１０の比率で調整し、１５−５０Ｇｙの放射線照射後に２０−２４℃にて振とうしながら保存する。ＡＣＤ−Ａ液；クエン酸ナトリウム２２ｇ／クエン酸８ｇ／ブドウ糖２２ｇを注射用水で全体を１Ｌとするように調整する。
以上の方法を使用する場合、血小板の濃度としては、例えば、１×１０^９血小板／ｍＬ程度が望ましい。
また、ＧＭ６００１（ａ ｂｒｏａｄ−ｒａｎｇｅ ｈｙｄｒｏｘａｍｉｃ ａｃｉｄ−ｂａｓｅｄ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を添加しておくと、冷凍保存および室温保存中に起きる血小板機能分子ＧＰＩｂ−Ｖ−ＩＸやＧＰＶＩの切断に伴う不活化を予防できる。本発明者らは、この方法により、マウスＥＳ細胞由来血小板に関し不活性化の予防が可能であることを確認している。なお、ヒト血小板を使用したこの血小板不活性化に関する機序の参考論文として、Ｂｅｒｇｍｅｉｅｒ，Ｗ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒ Ｒｅｓ ９５：６７７−６８３，２００４及び Ｇａｒｄｉｎｅｒ，ＥＥ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，５：１５３０−１５３７，２００７を参照のこと。
なお、血小板を含む製剤を収納する容器は、ガラスのように血小板を活性化する材質のものを避けるのが好ましい。

また、本発明により、例えば、赤血球細胞を製造し、これを製剤化する場合、以下のように行うことができる。
培養上清を遠心後濃縮した濃厚赤血球液にＭＡＰ液（組成は以下参照）を加えて調製し、１５−５０Ｇｙの放射線照射後に２〜６℃で保存する。
以上の方法を使用する場合、赤血球の濃度としては、例えば、１×１０^１０赤血球／ｍＬ程度が望ましい。取得した赤血球は、赤血球保存用添加液 （ＭＡＰ液）として、例えば、Ｄ−マンニトール（１４．５７ｇ）、アデニン（０．１４ｇ）、結晶リン酸二水素ナトリウム（０．９４ｇ）、クエン酸ナトリム（１．５０ｇ）、クエン酸（０．２０ｇ）、ブドウ糖（７．２１ｇ）、塩化ナトリム（４．９７ｇ）を、注射用水を加えて溶かし、全量を１０００ｍｌとしたものを使用することができる。
その他、赤血球の製剤化に適当と思われる公知の方法を適宜選択することは、当業者において容易なことである。

さらに、本発明の実施形態には、本発明の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の分化方法又は製造方法を使用することを特徴とした、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞への分化を促進又は阻害する物質のスクリーニング方法が含まれる。具体的には、本発明の方法として実施される細胞の培養工程において、適当な時期に、適当な期間、培地中に候補となる分化促進物質又は分化阻害物質を添加し、得られる血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の数を測定し、対照として行われる実験（候補物質を加えず同じ培養工程を行う）との比較により、該促進物質又は阻害物質の効果を評価することができる。対照の実験から得られる血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の数よりも多ければ、促進物質であり、少なければ阻害物質として評価することができる。

以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、実施例は、あくまでも本発明の一部の態様を示すものであって、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。

＜材料及び方法＞
１．細胞と試薬
ヒトｉＰＳ細胞は、山中４因子（ＯＣＴ３／４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ｃ−ＭＹＣ）の導入によって樹立したＴｋＣＢ７−２、ＴｋＣＢ７−４、ＴｋＣＢ８−３を用いた。ｉＰＳ細胞の維持培養は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ Ｈａｍ Ｆ−１２ ｍｅｄｉｕｍ（ＳＩＧＭＡ）に、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２０％ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ）、及び５ｎｇ／ｍＬ 塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；Ｕｐｓｔａｔｅ）を加えた培地を使用した。ｉＰＳ細胞は、放射線照射（５０Ｇｙ）したマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）上にて培養し、３日おきに継代して未分化状態を維持した。また、フィーダー細胞として使用したマウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞は、Ｅａｇｌｅ ｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、１０％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミンを加えて培養した。
分化培地は、Ｉｓｃｏｖｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ｍｅｄｉｕｍ（ＳＩＧＭＡ）に、１０μｇ／ｍＬ ヒトインスリン、５．５μｇ／ｍＬ ヒトトランスフェリン、５ｎｇ／ｍＬ 亜セレン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、０．４５ｍＭ α−モノチオグリセロール（ＳＩＧＭＡ）、５０μｇ／ｍＬ アスコルビン酸（ＳＩＧＭＡ）、及び１５％ ｈｉｇｈｌｙ ｆｉｌｔｅｒｅｄ ＦＢＳ （Ｃｅｌｌｅｃｔ Ｇｏｌｄ； ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を加えて使用し、これに、ヒト血管内皮細胞増殖因子（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加、又は、未添加で行った。
以上の培養はＣＯ_２インキュベーターＨＥＲＡ ＣＥＬＬ １５０ｉ（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用いて３７℃、５％ ＣＯ_２下で実施した。
また、ＥＳ細胞については、ＫｈＥＳ３株を用い、ｉＰＳ細胞と同じ条件で、維持培養及び分化等を行った。

２．ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞由来のネット様構造物（以下、ｉＰＳ−Ｓａｃ又はＥＳ−Ｓａｃ）の作製
本実施例において行ったネット様構造物を調製するための培養工程について以下に説明する（詳細は、ＴＡＫＡＹＡＭＡら，ＢＬＯＯＤ ２００８，１１１：５２９８−５３０６を参照のこと）。
事前に、５０Ｇｙの放射線照射を行ったＣ３Ｈ１０Ｔ１／２を１００−ｍｍディッシュに用意し、ヒトｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞を１×１０^５ずつ分化培地にて播種した。窒素ガスを注入して酸素濃度を大気酸素（２１％ Ｏ_２）と低酸素（５％又は１％ Ｏ_２）としたＣＯ_２インキュベーター内で、１〜１４日の間で適宜期間を設定し培養を行った。低酸素で培養した細胞は、その後大気酸素条件へ移すか、そのまま培養を続け、計１４日間の培養を行い、ｉＰＳ−Ｓａｃ又はＥＳ−Ｓａｃを作製した。

３．ｉＰＳ−Ｓａｃ又はＥＳ−Ｓａｃからの血液細胞の回収
ｉＰＳ−Ｓａｃ又はＥＳ−Ｓａｃをディッシュから剥がして破砕し、３％ ＦＢＳを含むＰＢＳに懸濁した後、４０μｍセルストレイナー（ＢＤ）を通過させた。通過した溶液を４４０×ｇ、１０分間遠心分離して血液細胞を回収し、細胞数をカウントした。

４．フローサイトメトリー解析
細胞表面抗原の発現は、フローサイトメトリー（ＭｏＦｌｏ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で解析した。細胞は、ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）結合−抗ＣＤ３４抗体、ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）結合−抗ＣＤ４２ｂ抗体、Ａｌｅｘａ４０５結合−抗ＣＤ４５抗体、ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）結合−抗ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ（グリコフォリン）Ａ抗体、ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）結合−抗ＣＤ４１ａ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて染色した。

５．血液前駆細胞（ＨＰＣ；ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）のコロニーアッセイ
ｉＰＳ−Ｓａｃ又はＥＳ−Ｓａｃから回収したＨＰＣ、５−１０×１０^３を５０ｎｇ／ｍｌ トロンボポイエチン（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加したＭｅｔｈｏ Ｃｕｌｔ ＧＦ Ｈ４４３４（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に懸濁した後、３５ｍｍディッシュへ播種した。ＣＯ２インキュベーター内で１３−１４日間培養し、生じたコロニーをピックアップした。コロニーは、シャンドン サイトスピン ４（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）にて８００ｒｐｍ、１分間遠心し、Ｈｅｍａｃｏｌｏｒ Ｒａｐｉｄ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｓｍｅａｒ （ＭＥＲＣＫ）によって染色して観察した。

６．成熟赤血球の免疫染色
ｉＰＳ−Ｓａｃ又はＥＳ−Ｓａｃから回収したＨＰＣを成熟赤血球へと分化させ、シャンドン サイトスピン４にて遠心してスライドグラスへ貼り付けた。これを４％パラホルムアルデヒドで固定後、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で透過処理してから、スキムミルクでブロッキングを行った。一次抗体として、抗ヒトヘモグロビン抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、抗ヒトβグロビン抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と赤血球を反応させ、二次抗体として、Ａｌｅｘａ４８８結合−抗ヤギ抗体及びＡｌｅｘａ５４６結合−抗マウス抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で封入して、共焦点顕微鏡ＦＶ１０００（オリンパス）で観察した。βグロビン鎖陽性細胞率は、（βグロビン鎖陽性細胞数／ヘモグロビン陽性細胞数）×１００で算出した。

７．リアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現解析
ｉＰＳ−Ｓａｃ又はＥＳ−ＳａｃをＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて処理し、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを精製した。ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを合成し、Ｒｏｃｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で解析した。内部標準遺伝子として、ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）を使用した。
Ｔ、ＴＡＬ−１、ＫＤＲ、ＣＤ３４、ＶＥＧＦ、ＥＰＯＲ、ＣＤ４１ａ、Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ−Ａ、ＨＩＦ２α、ＧＡＰＤＨの各遺伝子のプライマー配列は、下記の通りである。
T:forward; gctgtgacaggtacccaacc（配列番号１）
T:reverse; catgcaggtgagttgtcagaa（配列番号２）
TAL-1:forward; ctatgagatggagattactgatggtc（配列番号３）
TAL-1:reverse; gtgtggggatcagcttgc（配列番号４）
KDR:forward; gaacatttgggaaatctcttgc（配列番号５）
KDR:reverse; cggaagaacaatgtagtctttgc（配列番号６）
CD34:forward; gtgaaattgactcagggcatc（配列番号７）
CD34:reverse; cccctgtccttcttaaactcc（配列番号８）
VEGF:forward; ccttgctgctctacctccac（配列番号９）
VEGF:reverse; ccacttcgtgatgattctgc（配列番号１０）
EPOR:forward; ttggaggacttggtgtgtttc（配列番号１１）
EPOR:reverse; agcttccatggctcatcct（配列番号１２）
CD41a:forward; gagacacccatgtgcagga（配列番号１３）
CD41a:reverse; agctggggcacacatacg（配列番号１４）
Glycophorin-A:forward; gacacatatgcagccactcct（配列番号１５）
Glycophorin-A:reverse; atgatgggcaagttgtaccc（配列番号１６）
HIF2α:forward; gacatgaagttcacctactgtgatg（配列番号１７）
HIF2α:reverse; gcgcatggtagaattcatagg（配列番号１８）
GAPDH: forward; aacagcctcaagatcatcagc（配列番号１９）
GAPDH: reverse; ttggcaggtttttctagacgg（配列番号２０）

＜結果＞
１．血液細胞への分化に対する低酸素培養の効果
ｉＰＳ細胞（ＴｋＣＢ７−４）を分化培地に播種した後、１４日間大気酸素分圧下（２１％）で培養した場合（図１（１））、７日間低酸素分圧下（５％）で培養後、７日間大気酸素分圧下（２１％）で培養した場合（図１（２））、１４日間低酸素分圧下（５％）で培養した場合（図１（３））の各々について、ｉＰＳ−Ｓａｃ内に生じた血液細胞の数をカウントした。その結果、７日間の低酸素分圧下での培養を行った後、７日間の大気酸素分圧下で培養した場合に、生じた血液細胞の数が最も多かった（図１（２））。この結果から、ｉＰＳ細胞を低酸素分圧下で培養を開始し、一定期間低酸素分圧下で培養することで、形成される血球数を増加できることが分かった。

２．血液前駆細胞（ＨＰＣ；ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）への分化に対する低酸素培養の効果
ＨＰＣへの分化に対する低酸素培養の効果について検討を行った。ヒトｉＰＳ細胞を、大気酸素分圧下（２１％）で１４日間（図２（１））、低酸素分圧下（５％）で７日間培養後、大気酸素分圧下（２１％）で７日間（図２（２））、低酸素分圧下（５％）で１４日間培養（図２（３））し、各々、ｉＰＳ−Ｓａｃ内に生じた細胞について、血液前駆細胞のマーカーであるＣＤ３４及びＣＤ４５が共に陽性の細胞の比率をフローサイトメトリーにより測定した。その結果、血液前駆細胞の比率は、一定期間低酸素分圧下での培養することで、向上することが分かった（図２（２））（図２（３））。

次に、血液前駆細胞への分化に対する低酸素培養の効果について、ＨＰＣのコロニーアッセイにより検討を行った。
ｉＰＳ細胞（ＴｋＣＢ７−２）により形成されたｉＰＳ−Ｓａｃより回収した血液細胞を、１×１０^４播種し、培養後に生じたコロニー数をカウントし、各コロニー中に存在する血液細胞の種類（ｎ（好中球）、ｍ（マクロファージ）、Ｅ（赤芽球）、Ｍ（巨核球）、ｂｌａｓｔ（幼若血球））を観察した。その結果、低酸素分圧下（５％）で７日間培養後、大気酸素分圧下（２１％）で７日間（図３（２））培養した場合、大気酸素分圧下（２１％）で１４日間（図２（１））培養した場合に比べて、形成されるコロニー数が増加していた。さらに、４種類の血液細胞の全てが含まれるミックスコロニー（ｍｉｘ）は、造血幹細胞／血液前駆細胞を含むことの指標となるものであるが、このミックスコロニーも低酸素分圧下での培養を行った場合の方が多く形成された（図３；大気酸素分圧下での培養では１８個であったのに対し、低酸素分圧下での培養を行うと３４個であった。）。

ＥＳ細胞（ＫｈＥＳ３）からＨＰＣへの分化に対する低酸素培養の効果についても検討を行った。ＥＳ細胞を、低酸素分圧下（５％）で７日間培養後、大気酸素分圧下（２１％）で７日間（図４（１））（＋ＶＥＧＦ）、大気酸素分圧下（２１％）で１４日間（＋ＶＥＧＦ）（図４（２））、大気酸素分圧下（２１％）で１４日間（−ＶＥＧＦ）（図４（３））培養を行った後、ＥＳ−Ｓａｃ内に生じたＣＤ３４陽性の細胞数を、カウントした。その結果、ＥＳ細胞を用いた場合において、低酸素分圧下での培養を行うことで血液前駆細胞の数が増加することが分かった（図４の（１）と（２）を比較。縦軸は、大気酸素分圧下（２１％）で１４日間（−ＶＥＧＦ）培養した場合の血液前駆細胞数を１とした場合の相対数）。
以上のことから、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞などの多能性幹細胞から血液前駆細胞を分化させる場合、低酸素分圧下における培養過程を含めることで、生じる血液前駆細胞の数を増加できることが明かとなった。

３．赤血球系細胞への分化に対する低酸素培養の効果
赤血球前駆細胞への分化に対する低酸素培養の効果について検討を行った。ヒトｉＰＳ細胞を、大気酸素分圧下（２１％）で１４日間（図５（１））、低酸素分圧下（５％）で７日間培養後、大気酸素分圧下（２１％）で７日間（図５（２））、低酸素分圧下（５％）で１４日間培養（図５（３））し、各々、ｉＰＳ−Ｓａｃ内に生じた細胞について、赤血球前駆細胞のマーカーであるＧＰＡ陽性かつＣＤ４５陰性の細胞の比率をフローサイトメトリーにより測定した。その結果、赤血球前駆細胞の比率は、７日間の低酸素分圧下での培養を行った後、７日間の大気酸素分圧下で培養した場合に、最も大きくなることが分かった（図５（２））。
このように、多能性幹細胞から赤血球系細胞の分化させる場合においても、低酸素分圧下における培養が効果的であることが示された。

４．低酸素培養による各種血液細胞の増幅効果
酸素分圧を５％（７日間培養）から２１％（７日間培養）へ切り替えて作製したＨＰＣを成熟赤血球、巨核球、血小板へと分化させ、培養酸素分圧の最適化による末梢血液細胞の増幅効果を確認した。
その結果、１×１０^５ ＥＳ細胞（ＫｈＥＳ−３）あたり得られる成熟赤血球数は、２１％酸素分圧を用いて作製した場合と比べて約２．２倍となり（図６Ａ）、ｉＰＳ細胞（ＴｋＣＢ７−２）では約５倍となった（図６Ｂ）。さらに巨核球／血小板分化では、１×１０^５ ｉＰＳ細胞あたり得られる巨核球数は約４．４倍であり（図６Ｃ）、血小板数は２．８倍に増加した（図６Ｄ）。以上のことから、本技術は、各種血液細胞を多能性幹細胞から作製する際に有効であることが示された。

５．赤血球細胞のβグロビン鎖陽性率に対する低酸素培養の効果
酸素分圧を５％（７日間培養）から２１％（７日間培養）へ切り替えて作製したＨＰＣを成熟赤血球へと分化させ、赤血球成熟度の指標となるβグロビン鎖陽性細胞率を測定した。
その結果、ＥＳ細胞（ＫｈＥＳ−３）では、２１％酸素分圧を用いて作製したＨＰＣを分化させて得られた赤血球のβグロビン鎖陽性細胞率は１９．５％であるが（図７Ａ（１））、５％酸素分圧から２１％酸素分圧への切り替えを用いて作製したＨＰＣを分化させて得た赤血球のβグロビン鎖陽性細胞率は３７．３％であり（図７Ａ（２））、赤血球成熟度が向上していた。同様にｉＰＳ細胞（ＴｋＣＢ７−２）では、２１％酸素分圧を用いて作製したＨＰＣを分化させて得られた赤血球のβグロビン鎖陽性細胞率は３１．３％であるが（図７Ｂ（１））、５％酸素分圧から２１％酸素分圧への切り替えを用いて作製したＨＰＣを分化させて得た赤血球のβグロビン鎖陽性細胞率は５１．２％であった（図７Ｂ（２））。
以上のことから、本技術を用いることで、成熟度の高い末梢血液細胞を作製することが可能であると分かった。

６．低酸素培養によるＶＥＧＦ代替性に関する検討
多能性幹細胞からネット様構造体を経て、血液細胞を効率よく分化させるには、ＶＥＧＦを添加することが望ましい。そこで、血液細胞を効率よく分化させＶＥＧＦの効果を、低酸素培養により代替することができるか検討を行った。
ｉＰＳ細胞（ＴｋＣＢ７−４）を、ＶＥＧＦ存在下で１４日間大気酸素分圧下（２１％）にて培養した場合（図８Ａ（１））、ＶＥＧＦ非存在下で、７日間低酸素分圧下（５％）で培養後、７日間大気酸素分圧下（２１％）で培養した場合（図８Ａ（２））について、ｉＰＳ−Ｓａｃ内に生じた血液細胞の数をカウントした。その結果、ＶＥＧＦを添加せずに低酸素分圧下において培養した場合の方が、若干多く血液細胞が生じていた。
次に、ｉＰＳ−Ｓａｃ内に生じた細胞について、血液前駆細胞のマーカーであるＣＤ３４及びＣＤ４５が共に陽性の細胞の比率をフローサイトメトリーにより測定した結果、血液前駆細胞の比率は、ＶＥＧＦを添加せずに低酸素分圧下において培養した場合の方がやや大きかった（図８Ｂ）。
さらに、低酸素培養のＶＥＧＦ代替性について、コロニーアッセイにより検討を行った。ｉＰＳ細胞（ＴｋＣＢ７−４（図９Ａ）及びＴｋＣＢ８−３（図９Ｂ））より回収した血液細胞を、５×１０^３（ＴｋＣＢ７−４（図９Ａ））又は１×１０^４（ＴｋＣＢ８−３（図９Ｂ））播種し、コロニーアッセイを行った。その結果、ＶＥＧＦ非存在下にて低酸素分圧下（５％）で７日間培養後、大気酸素分圧下（２１％）で７日間培養した場合（図９Ａ（２）及びＢ（２））の方が、ＶＥＧＦ存在下において大気酸素分圧下（２１％）で培養した場合（図９Ａ（１）及びＢ（１））よりも、形成されるコロニー数が増加し、また、ミックスコロニーの数も増加していた。
さらに、ＶＥＧＦ存在下において、ＥＳ細胞を酸素分圧を５％から２１％へ切り替えて得られた血液細胞は、ＶＥＧＦ非存在下の場合と比べて、形成されるコロニー数が多くなる傾向が認められた（図９Ｃ）。
以上のことから、低酸素培養は、ＶＥＧＦの効果を代替するとともに、さらにＶＥＧＦとの組み合わせによっても血液前駆細胞数を増加させ、血液分化能力の高い血液前駆細胞を生み出す事が示された。

７．１％酸素分圧下での培養の効果
ＶＥＧＦ非存在下において、低酸素分圧下（５％）で７日間培養後、大気酸素分圧下（２１％）で７日間培養した場合（図１０（１））と、より低い低酸素分圧下（１％）で７日間培養後、大気酸素分圧下（２１％）で７日間培養した場合（図１０（２））において、同数のＥＳ細胞から形成される血球コロニー数を比較した。その結果、５％酸素分圧下で培養した場合の方が、血球コロニー数は多く形成され、血液前駆細胞が多数得ることができた。
そこで、次に、１％低酸素分圧下において生じる血液前駆細胞の血液細胞への分化能力について、生じるミックスコロニーの数を指標に検討した。ＶＥＧＦ存在下において大気酸素分圧下（２１％）で１４日間培養した場合（図１１（１））、ＶＥＧＦ非存在下において低酸素分圧下（５％）で７日間培養後、大気酸素分圧下（２１％）で７日間培養した場合（図１１（２））、さらに、ＶＥＧＦ非存在下において低酸素分圧下（１％）で７日間培養後、大気酸素分圧下（２１％）で７日間培養した場合（図１１（３））において、ＣＤ３４^＋細胞を各々から同数回収し、コロニーアッセイを行った。その結果、１％酸素分圧下で培養を開始した場合に、コロニー数が最も多く得られ、ミックスコロニーの数も一番多く出現していた（全期間の大気酸素分圧下で培養した場合の約５倍、５％酸素分圧下で培養を開始した場合の約２．６倍）。この結果から、より低い酸素分圧下（例えば、１％程度）で細胞培養を開始すると、血液細胞への分化能のより高い血液前駆細胞を作製することができる。

８．低酸素環境から大気酸素環境への切り替えのタイミングに関する検討
ＥＳ細胞（ＫｈＥＳ３株）を、低酸素分圧下（５％（図１２Ａ）又は１％（図１２Ｂ））で４日間、７日間、１０日間培養後、残りの期間を大気酸素分圧下で培養したもの、全期間（１４日間）を低酸素分圧下で培養したもの、全期間（１４日間）を大気酸素分圧下で培養したもの、各々について培養後に生じた血球数をカウントした。その結果、低酸素分圧下における培養期間が７日間の場合に生じる血球数は最も多く、さらに低酸素分圧下における培養期間を長くすると、血球の形成効率は低下することが分かった（図１２Ａ及びＢのＬ７）。従って、低酸素分圧下での培養７日目頃に大気酸素分圧下での培養に切り替えると最も効率よく血液細胞を分化させることができ、長くても、低酸素分圧下の培養１０日間程度で、大気酸素分圧下での培養に切り替えることが望ましいといえる。

９．低酸素分圧下での培養条件における遺伝子発現変化の検討
ＥＳ細胞（ＫｈＥＳ−３）を１４日間低酸素分圧下（５％）で培養した場合（５％Ｌ１４）と、７日間低酸素分圧下（５％）で培養後、大気酸素分圧下（２１％）で培養した場合（５％Ｌ７）の遺伝子発現変化をリアルタイムＰＣＲにて分析した。
５％Ｌ１４と比べて、５％Ｌ７は、培養８日目に中内胚葉誘導の指標となる遺伝子（例えば、Ｔ）（図１３）の発現が増加していた。その後Ｔ遺伝子の発現は、酸素分圧にかかわらず培養８日目以降徐々に低下していた。
また、培養８日目以降には血液前駆細胞誘導の指標となる遺伝子（例えば、ＴＡＬ−１（図１４Ａ）、ＫＤＲ（図１４Ｂ）、ＣＤ３４（図１４Ｃ））、サイトカインの指標となる遺伝子（例えば、ＶＥＧＦ（図１５Ａ）、ＥＰＯＲ（図１５Ｂ））、及び血液細胞誘導の指標となる遺伝子（例えば、ＣＤ４１ａ（図１６Ａ）、Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ−Ａ（図１６Ｂ））の発現が増加していた。これら遺伝子の発現は、その後培養１４日目まで増加を続け、一貫して５％Ｌ７が高い発現傾向を示していた。
また、酸素分圧を変化させる前の培養７日目において、大気酸素（２１％Ｎ）と低酸素（５％Ｌ７）を比較した結果、低酸素応答性の遺伝子（例えば、ＨＩＦ２α）の発現が上昇していた（図１７）。
以上の結果より、これらの遺伝子の発現は酸素分圧に伴って変化し、酸素分圧の切り替え時期や、使用する酸素分圧を決める際の指標とすることができると分かった。

本発明は、生体外において血液細胞を効率よく分化させる方法を提供するものである。本発明により、十分な量の血液細胞を生体外で容易に供給することが可能となるため、本発明は、医療等の分野の発展に大きく貢献するものである。

Claims (8)

1. 血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞へ分化し得る細胞を、酸素分圧が０．１％〜１０％である環境においてＫＤＲ陽性を示す細胞が出現するまで培養を行った後、より高い酸素分圧下でさらに培養を行う工程を含む、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
2. 血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞へ分化し得る細胞を、該細胞の培養を行う培地中にＶＥＧＦを添加しない条件下で、酸素分圧が０．１％〜１０％である環境において４〜１０日間培養を行った後、より高い酸素分圧下でさらに培養を行う工程を含む、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
3. 血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞へ分化し得る細胞を、該細胞の培養を行う培地中にＶＥＧＦを添加しない条件下で、酸素分圧が０．１％〜１０％である環境において、ＫＤＲ陽性、ＣＤ３４陽性又はＣＤ４３陽性を示す細胞が出現するまで培養を行った後、より高い酸素分圧下でさらに培養を行う工程を含む、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
4. 血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞へ分化し得る細胞を、該細胞の培養を行う培地中にＶＥＧＦを添加しない条件下で、酸素分圧が０．１％〜１０％である環境において、中内胚葉誘導の指標となる遺伝子が発現する時期、血液前駆細胞誘導の指標となる遺伝子の発現が開始される時期、分化増殖性サイトカインの指標となる遺伝子の発現が開始される時期、又は、血液細胞誘導の指標となる遺伝子の発現が開始される時期まで培養を行った後、より高い酸素分圧下でさらに培養を行う工程を含む、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
5. 前記より高い酸素分圧が、酸素分圧１１〜３０％である請求項１乃至４のいずれかに記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
6. 前記血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞へ分化し得る細胞が、多能性幹細胞である請求項１乃至５のいずれかに記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
7. 前記血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞がネット様構造又は胚様体から取得されることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
8. 請求項１乃至７のいずれかに記載の製造方法を使用することを特徴とする血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞への分化を促進又は阻害する物質のスクリーニング方法。