CN106119200A - 涉及由多能干细胞向血细胞分化的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供有效率的向血细胞进行分化的方法。具体而言，本发明通过在体外由ES细胞或iPS细胞等多能干细胞制备血细胞时在低氧分压下进行培养，使向造血祖细胞或红系祖细胞等分化的效率增大，使最终得到的所需血细胞的数目增大。

Description

涉及由多能干细胞向血细胞分化的培养方法
本申请是申请号为201180034111.9、申请日为2011年9月9日、发明名称为“涉及由多能干细胞向血细胞分化的培养方法”的发明申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及用于向血细胞分化的细胞培养方法。更具体而言，本发明涉及使能够向造血祖细胞进行分化的细胞分化成造血祖细胞、进而分化成血细胞的细胞培养法。
背景技术
在治疗血液相关疾病时，稳定地供给各种血细胞的必要量是非常重要的。迄今为止，主要由通过供体献血而采集的血液来制备各种血细胞，用于手术等的治疗。然而，由于慢性的供体不足，因此不容易在必要时迅速确保充分量的血细胞。特别是，血液凝固(止血)所必需的细胞即血小板虽然在白血病、骨髓移植、抗癌治疗等中是必需的细胞，但是无法将从供体采集到的血小板进行冷冻保存，因此对用于稳定供给的有效方法的需求是极其高的。
最近，也在积极进行在不依赖于来自供体的提供的情况下由ES细胞、iPS细胞等多能干细胞在生物体外制备各血细胞的尝试，其实用化备受重视。例如，Takayama等报告了成功地从人ES细胞产生血小板的情况(专利文献1及非专利文献1)。此外，还公开了同样地也可从iPS细胞制备血小板的情况(专利文献2)。
通过开发出在生物体外由多能干细胞制备血细胞的方法，从而今后的医疗现场中使用的各种血细胞中的大多数可由多能干细胞制备，从而产生对容易地解决慢性血细胞不足的期待。然而，迄今为止所报告的由iPS细胞或ES细胞制备血细胞的方法中，现状是制得的血细胞的量少而难以确保手术等治疗所认为必要的量。因此，应当利用某种方法促进向血细胞的分化，因此，有必要对现有方法进行改良。
作为在进行细胞分化诱导时生物体内与生物体外存在很大不同的条件之一，可举出氧浓度。已报告了在生物体外进行细胞分化诱导时在比大气氧环境低的氧浓度下将各祖细胞进行培养等而进行分化诱导的几个例子(非专利文献2～非专利文献5，专利文献3～专利文献5)。例如，迄今为止，报告了将能够分化成软骨的细胞在低氧条件下进行培养而进行软骨分化的方法(专利文献3)、将未分化中枢神经细胞(专利文献4)或神经嵴干细胞(专利文献5)在低氧条件下进行培养的方法、将ES细胞在低氧浓度下培养后在大气氧浓度下培养而使之向心肌细胞分化的方法(非专利文献5)等。然而，对于低氧浓度对向血细胞进行分化的影响，尚未存在被详细报告的前例。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:WO2008/041370
专利文献2:WO2009/122747
专利文献3:日本特开2003-125787
专利文献4:WO00/29550
专利文献5:WO00/29549
非专利文献
非专利文献1:Takayama等，Blood，111:5298-5306 2008
非专利文献2:Kennedy等，Blood，109:2679-2687 2007
非专利文献3:Prado-Lopez等，Stem Cells，28:407-418 2010
非专利文献4:Martin-Rendon等，Stem Cells，25:1003-1012 2010
非专利文献5:Bauwens等，Biotechnol Bioeng.，90:452-461 2005
发明内容
本发明人等已经确立了由多能干细胞取得造血祖细胞、进而使之分化成各种血细胞的方法，但是利用该方法制得的血细胞的量少，处于作为用于治疗等的量不能说是充分的状况。
因此，本发明鉴于上述情况，以确立更大量且稳定地在体外制备血细胞的方法为目标，目的在于提供向造血祖细胞进行分化诱导的新型方法，以及提供由该方法制得的造血祖细胞及从该造血祖细胞分化诱导的各种血细胞。
发明人等在由多能干细胞诱导造血祖细胞的工序中，在一定期间在低氧分压下进行细胞培养，结果发现经诱导的造血祖细胞的数目比仅在大气氧分压下进行培养时增大，从而完成本发明。
即，本发明涉及以下(1)～(16)。
(1)一种造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，包括以下工序:将能够向造血祖细胞或红系祖细胞进行分化的细胞在氧分压上升的环境中进行细胞培养。
(2)根据上述(1)所述的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，其中，所述氧分压上升的环境是包括在低氧分压下进行细胞培养的工序的环境。
(3)根据上述(2)所述的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，其中，所述低氧分压为0.1～10％。
(4)根据上述(2)或(3)所述的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，其特征在于，所述低氧分压是如下的氧分压:在该分压下进行培养时，与在其它分压下的培养相比，低氧应答性的基因表达。
(5)根据上述(2)～(4)中任一项所述的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，其中，在所述低氧分压下由细胞培养开始进行一定期间的细胞培养后，在更高的氧分压下进一步进行细胞培养。
(6)根据上述(5)所述的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，其中，所述一定期间为4～10天。
(7)根据上述(5)或(6)所述的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，其中，所述一定期间是到呈现KDR阳性、CD34阳性、CD43阳性的细胞出现为止。
(8)根据上述(5)～(7)中任一项所述的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，其特征在于，改变至所述更高的氧分压下的时期是成为中内胚层诱导的指标的基因表达的时期、成为造血祖细胞诱导的指标的基因的表达开始的时期、成为分化增殖性细胞因子的指标的基因的表达开始的时期、或者成为血细胞诱导的指标的基因的表达开始的时期。
(9)根据上述(5)～(8)中任一项所述的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，其中，所述更高的氧分压为11～30％的氧分压。
(10)根据上述(1)～(9)中任一项所述的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，其中，能够向所述造血祖细胞或红系祖细胞进行分化的细胞为多能干细胞。
(11)根据上述(1)～(10)中任一项所述的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，其特征在于，所述造血祖细胞或红系祖细胞是从网状结构或拟胚体取得的。
(12)根据上述(1)～(11)中任一项所述的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，其特征在于，在进行所述细胞培养的培养基中不添加VEGF。
(13)一种造血祖细胞或红系祖细胞，是由上述(1)～(12)中任一项所述的方法制得的。
(14)一种血细胞，是将上述(13)所述的造血祖细胞或红系祖细胞进一步培养而制得的。
(15)一种医药制剂，包含上述(14)所述的血细胞。
(16)一种筛选促进或阻碍向造血祖细胞或红系祖细胞进行分化的物质的方法，其特征在于，使用上述(1)所述的制备方法。
根据本发明，与现有方法相比，可使被分化诱导的造血祖细胞、红系祖细胞以及血细胞的数目增大。
根据本发明，可缩短用于取得所需数目的造血祖细胞、红系祖细胞或血细胞的培养期间。
根据本发明，可在不使用以往为了有效率地诱导造血祖细胞而必需的VEGF的情况下制备造血祖细胞。
根据本发明，可获得血液分化能力高的造血祖细胞、红系祖细胞。
附图说明
图1为低氧分压下的培养赋予血细胞分化的效果。纵轴为在培养后产生的血细胞数。(1)为在21％氧分压下培养14天的结果，(2)为在5％氧分压下培养7天后在21％氧分压下培养7天的结果，(3)为在5％氧分压下培养14天的结果。(1)、(2)及(3)的全部实验是在存在20ng/ml的VEGF的条件下进行的。使用的细胞为iPS细胞(TkCB7-4株)。
图2表示低氧培养对向造血祖细胞(HPC；hematopoietic progenitor cell)的分化的效果。使用流式细胞仪来研究低氧培养对向HPC进行分化的效果。(1)为在21％氧分压下培养14天的结果，(2)为在5％氧分压下培养培养7天后在21％氧分压下培养7天的结果，(3)为在5％氧分压下培养14天的结果。使用的细胞为iPS细胞(TkCB7-4株)。
图3为利用集落培养研究低氧培养对向造血祖细胞进行分化的效果的结果。(1)为在21％氧分压下培养14天的结果，(2)为在5％氧分压下培养7天后在21％氧分压下培养7天的结果。n、m、E、M及blast分别为中性粒细胞、巨噬细胞、成红细胞、巨核细胞、幼稚血细胞(幼若血球)。文字组合表示与各文字对应的细胞混合存在(例如，nm表示中性粒细胞与巨噬细胞混合存在)。此外，纵轴表示来自于1×104个血细胞的集落数。图中所示的数字为混合集落数。使用的细胞为iPS细胞(TkCB7-2株)。
图4为通过计算CD34阳性细胞数来评价低氧培养对向造血祖细胞进行分化的效果的结果。其中，作为多能干细胞，使用ES细胞(KhES3株)。(1)为在存在VEGF的条件下在5％氧分压下培养7天后在21％氧分压下培养7天的结果，(2)为在存在VEGF的条件下在21％氧分压下培养14天的结果，(3)为在不存在VEGF的条件下在21％氧分压下培养14天的结果。纵轴是将(3)的结果得到的CD34阳性细胞数设为1时的CD34阳性细胞数的结果。
图5为使用流式细胞仪研究低氧培养对向红细胞系细胞进行分化的效果的结果。(1)为在21％氧分压下培养14天的结果，(2)为在5％氧分压下培养7天后在21％氧分压下培养7天的结果，(3)为在5％氧分压下培养14天的结果。(1)、(2)及(3)的全部实验是在存在20ng/ml的VEGF的条件下进行的。使用的细胞为iPS细胞(TkCB7-4株)。
图6表示调查低氧培养对由多能干细胞得到的各种血细胞数的效果的结果。A及B对红细胞进行研究，C对巨核细胞进行研究，D对血小板进行研究。应予说明，A为来自ES细胞(KhES-3株)的血细胞，B～D为来自iPS细胞(TkCB7-2株)的血细胞的细胞数。(1)为在21％氧分压下培养14天并进行红细胞分化培养的结果，(2)为在5％氧分压下培养7天后在21％氧分压下培养7天、然后进行红细胞分化培养的结果。
图7表示对在低氧分压下培养的HPC的β球蛋白(globin)链阳性率进行研究的结果。A为与来自ES细胞(KhES-3株)的红细胞相关的β球蛋白链阳性细胞的比例，B为与来自iPS细胞(TkCB7-2株)的红细胞相关的β球蛋白链阳性细胞的比例。(1)为在21％氧分压下培养14天并进行红细胞分化培养的结果，(2)为在5％氧分压下培养7天后在21％氧分压下培养7天并进行红细胞分化培养的结果。此外，C为将红细胞用DAPI与抗人血红蛋白抗体(左图)或抗人β球蛋白抗体(右图)进行二重染色的结果。
图8为涉及低氧培养的VEGF代替性的研究结果。A表示计算培养后产生的血细胞数的结果，B表示培养后产生的细胞的流式细胞仪结果。(1)表示在存在VEGF的条件下在21％氧分压下培养14天的结果，(2)表示在不存在VEGF的条件下在5％氧分压下培养7天后在21％氧分压下培养7天的结果。使用的细胞为iPS细胞(TkCB7-4株)。
图9为利用集落培养研究低氧培养的VEGF代替性的结果。A为使用iPS细胞的TkCB7-4株的结果，B为使用iPS细胞的TkCB8-3株的结果，C为使用ES细胞的KhES3株的结果。(1)表示在存在VEGF的条件下在21％氧分压下培养14天的结果，(2)表示在不存在VEGF的条件下在5％氧分压下培养7天后在21％氧分压下培养7天的结果。n、m、E、M及blast分别为中性粒细胞、巨噬细胞、成红细胞、巨核细胞、幼稚血细胞。文字组合表示与各文字对应的细胞混合存在(例如，nm表示中性粒细胞与巨噬细胞混合存在)。A的纵轴表示来自5×103个血细胞的集落数，B的纵轴表示来自1×104个血细胞的集落数，C的纵轴表示来自1×105个ES细胞的形成集落的细胞数。图中所示的数字表示混合集落数。
图10对在1％氧分压下培养的效果进行研究。在不存在VEGF的条件下，(1)为在5％氧分压下培养7天后在21％氧分压下培养7天的结果，(2)为在1％氧分压下培养7天后在21％氧分压下培养7天的结果。纵轴表示以培养开始时的ES细胞数(1×105)计的血细胞集落数。使用的细胞为ES细胞(KhES3株)。
图11对在1％氧分压下培养的效果进行研究。表示对于在存在VEGF的条件下在21％氧分压下培养14天的情况(1)下、在不存在VEGF的条件下在5％氧分压下培养7天后在21％氧分压下培养7天的情况(2)下、在不存在VEGF的条件下在1％氧分压下培养7天后在21％氧分压下培养7天的情况(3)下所产生的造血祖细胞，进行集落培养的结果。n、m、E、M及blast分别为中性粒细胞、巨噬细胞、成红细胞、巨核细胞、幼稚血细胞，文字组合表示与各文字对应的细胞混合存在。纵轴表示以培养开始时的ES细胞数(1×105)计的血细胞集落数，图中的数字表示混合集落数。使用的细胞为ES细胞(KhES3株)。
图12是与由在低氧分压下培养向在更高氧分压下培养转变的时机相关的研究结果。A是在5％氧分压下进行实验的，B是在1％氧分压下进行实验的。纵轴为在将N-设为1时的全血细胞数的相对值。横轴的L4-、L7-、L10-是在培养开始后第4天、第7天、第10天从低氧环境转变到21％氧分压下的结果。此外，L14是始终进行低氧培养。N-是始终在21％氧分压下进行培养。对于全部培养，未添加VEGF。
图13为伴随着氧分压变化的、作为中内胚层诱导的指标的基因(T)的表达变化的研究结果。纵轴表示相对于GAPDH表达的相对表达。此外，L7是在培养开始后第7天从在低氧分压下(5％氧分压)转变到大气氧分压下(21％氧分压)的情况，此外，L14为始终在低氧分压下(5％氧分压)进行培养的情况。在培养第8天调查了基因表达。
图14为伴随着氧分压变化的、作为造血祖细胞诱导的指标的基因(TAL-1(A)、KDR(B)及CDR34(C))的表达变化的研究结果。纵轴表示相对于GAPDH表达的相对表达。L7及L14与图13的说明相同。在培养第10天调查了基因表达。
图15为伴随着氧分压变化的、作为细胞因子的指标的基因(VEGF(A)及EPOR(B))的表达变化的研究结果。纵轴表示相对于GAPDH表达的相对表达。L7及L14与图13的说明相同。在培养第14天调查了VEGF的表达，在培养第8天调查了EPOR的表达。
图16为伴随着氧分压变化的、作为血细胞诱导的指标的基因(CD41a(A)及血型糖蛋白-A(GlycophorinA)(B))的表达变化的研究结果。纵轴表示相对于GAPDH表达的相对表达。L7及L14与图13的说明相同。在培养第14天调查了基因表达。
图17为伴随着氧分压变化的、低氧应答性基因(HIF2a)的表达变化的研究。纵轴表示相对于GAPDH表达的相对表达。此外，N-为始终在21％氧分压下进行培养的情况，L7与图13的说明相同。在培养第7天调查了基因表达。
具体实施方式
本发明的实施方式之一是包括将能够向造血祖细胞或红系祖细胞进行分化的细胞在氧分压上升的环境下进行细胞培养的工序的向造血祖细胞或红系祖细胞进行分化的方法，或者包括将能够向造血祖细胞或红系祖细胞进行分化的细胞在低氧分压下进行细胞培养的工序的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法。
此外，本发明的其它实施方式是包括将能够向造血祖细胞或红系祖细胞进行分化的细胞在低氧分压下进行细胞培养的工序的向造血祖细胞或红系祖细胞进行分化的方法，或者包括将能够向造血祖细胞或红系祖细胞进行分化的细胞在低氧分压下进行细胞培养的工序的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法。
在此，“能够向造血祖细胞或红系祖细胞进行分化的细胞”并没有特别限定，例如只要是多能干细胞(ES细胞、iPS细胞等)或者处于多能干细胞与造血祖细胞之间的分化阶段的细胞，就可以为任意细胞，优选为ES细胞或iPS细胞。
本发明中使用的ES细胞并没有特别限定，一般而言，可将囊胚期的受精卵与饲养细胞一起培养，将来自经增殖的内部细胞团块的细胞打散，进而，反复进行传代培养操作，最终建立ES细胞株。由此可见，ES细胞是从受精卵的取得的。除此以外，例如，也可以是从脂肪组织、绒毛膜绒毛、羊水、胎盘、睾丸细胞等除受精卵以外的细胞、组织取得且具有与ES细胞类似的特征的具有分化多能性的ES细胞样细胞。
此外，本发明中使用的iPS细胞只要是通过向体细胞(例如，成纤维细胞、血细胞等)导入赋予分化多能性的多种转录因子(以下，在此称为“分化多能性因子”)基因而获得与ES细胞同等的分化多能性的细胞，就可为任意来源的细胞。作为分化多能性因子，已经报告多种因子，没有限定，例如可举出Oct家族(例如，Oct3/4)、SOX家族(例如，SOX2、SOX1、SOX3、SOX15及SOX17等)、Klf家族(例如，Klf4、Klf2等)、MYC家族(例如，c-MYC、N-MYC、L-MYC等)、NANOG、LIN28等。关于iPS细胞的建立方法，已发表了多篇文献，因此可将它们作为参考(例如，参照Takahashi等，Cell 2006，126:663-676；Okita等，Nature 2007，448:313-317；Wernig等，Nature 2007，448:318-324；Maherali等，Cell Stem Cell 2007，1:55-70；Park等，Nature 2007，451:141-146；Nakagawa等，Nat Biotechnol 2008，26:101-106；Wernig等，Cell Stem Cell 2008，10:10-12；Yu等，Science 2007，318:1917-1920；Takahashi等，Cell 2007，131:861-872；Stadtfeld等，Science 2008322:945-949等)。
本发明分化或制备的造血祖细胞是用CD34-(CD34阴性)、CD34+(CD34阳性)、Lin-(CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD10、CD14、CD16、CD19、CD20、CD24、CD41、CD45、CD56、CD66b、或者CD235a阴性)、CD38-(CD38阴性)、CD90+(CD90阳性)、CD49f+(CD49f阳性)、VEGFR2+(VEGFR2阳性)、CD31+(CD31阳性)、CD43+(CD43阳性)、CD34+/CD45+(CD34阳性，且CD45阳性)、Rhodamine弱阳性，或者Hoechst阴性/弱阳性中的单个标记或多个标记的组合被赋予特征的造血系细胞。此外，本发明分化或制备的红系祖细胞是以CD71+(CD71阳性)、GPA(血型糖蛋白A)+(GPA阳性)、GPA+/CD41+(GPA阳性/CD41阳性)或者GPA(血型糖蛋白A)+/CD45+(GPA阳性/CD45阳性)的方式被赋予特征的造血系细胞。此外，本发明分化或制备的巨核细胞、血小板是以CD41+(CD41阳性)、CD42b+(GPA阳性)、CD41+/CD42b+(CD41阳性/CD42b阳性)、或者GPA-/CD41+(GPA阴性/CD41阳性)的方式赋予特征的造血系细胞。
本发明中使用的“细胞”的来源动物为人及非人动物(例如，小鼠、大鼠、牛、马、猪、羊、猴、狗、猫、鸟等)，并没有特别限定，但是特别优选为人。
在本发明中，关于为了分化诱导造血祖细胞或红系祖细胞而进行的细胞培养的条件中的除了氧分压条件以外的条件，可使用可由本领域技术人员进行选择的任意条件，例如，在使用ES细胞或iPS细胞来作为“能够向造血祖细胞或红系祖细胞进行分化的细胞”时，在分化诱导造血祖细胞或红系祖细胞的过程中，可使用形成网状结构物或拟胚体这样的条件等作为培养条件的例子。
在此，从ES细胞或iPS细胞制得的“网状结构物”是来自ES细胞或iPS细胞的立体囊状(内部伴随空间的结构)结构体，由内皮细胞集团等形成，且内部包含造血祖细胞及红系祖细胞。关于网状结构物的详细情况，例如可参照TAKAYAMA等，BLOOD 2008，111:5298-5306。
从ES细胞或iPS细胞形成网状结构物的培养条件根据所用的ES细胞或iPS细胞不同而异，例如，作为培养基，使用添加了最终浓度15％的FBS的IMDM，除此以外，在没有血清情况下，也可使用添加了适当增殖因子及添加剂等的培养基。应予说明，在现有方法中，为了有效率地形成网状结构物，添加VEGF(0～100ng/ml，更优选20ng/ml左右)进行培养，但在如本发明所公开的低氧环境下进行培养时，即使不添加VEGF，也可获得与添加了VEGF时同等的效果。作为除了氧分压以外的培养环境，根据所用的ES细胞或iPS细胞的种类不同而异，例如可使用5％CO2、36～38℃优选37℃的条件。到形成网状结构物为止的培养期间根据ES细胞或iPS细胞的种类不同而异，从在饲养细胞上播种开始，为14～16天左右。形成的网状结构物成为滤胞状结构，在内部，造血祖细胞及红系祖细胞以浓缩的状态存在。在网状结构物的内部存在的造血祖细胞及红系祖细胞可通过物理手段例如通过已灭菌的筛状器具(例如，细胞过滤器等)来分离。可将由此得到的造血祖细胞或红系祖细胞进一步培养而使之向各种血细胞进行分化。
此外，作为从ES细胞或iPS细胞培养造血祖细胞或红系祖细胞的条件(除氧分压以外的条件)，也可使用形成被称作拟胚体的包含内胚层、中胚层、外胚层的分化细胞的细胞团块的条件。作为该条件，因所用ES细胞或iPS细胞不同而异，例如，作为培养基，可使用添加了最终浓度15％的FBS、转铁蛋白等的IMDM，除此以外，可使用加入了适当增殖因子及添加剂等的培养基。此外，作为除了氧分压以外的培养环境，因所用ES细胞或iPS细胞的种类不同而异，例如，可使用5％CO2、36～38℃优选37℃的条件。
在本发明中，“氧分压上升的环境”是指具备培养中氧分压上升的条件的环境。该环境可以是人工制造出来的环境。“氧分压上升”可以为在低氧分压的范围内氧分压上升，也可为在更高的氧分压的范围内氧分压上升。此外，也可在从低氧分压向更高的氧分压转移的范围内氧分压上升。即使为培养中氧分压上下变动的环境，氧分压暂时上升的环境也为本发明的“氧分压上升的环境”。
本发明中的“低氧分压”，例如为氧分压0.1％～10％，优选为1％～5％，更优选为5％左右。或者，也可将低氧应答性基因表达的氧分压选择作为“低氧分压”。在此，低氧应答性基因例如可举出HIF2α、HIF1α、HIF3α、HIF1β、GLUT-1、p21、p57、FoxO、Notch1、VEGF、ABCG2/Bcrp-1、CXCR4、PDK-1、c-Kit等。
就本发明中的“表达”而言，例如是指转录基因而合成mRNA、翻译基因的mRNA而形成蛋白质，或者基因的蛋白质发挥功能。
此外，在为了从能够向造血祖细胞进行分化的细胞分化诱导或制备造血祖细胞而进行的细胞培养中，可将全部工序在低氧分压下进行，但是优选将从培养能够向造血祖细胞进行分化的细胞开始到例如显示KDR+、CD34+、CD43+的细胞出现为止的期间在低氧分压下进行培养，然后在更高的氧分压、例如大气氧分压21％的氧分压下进行培养。例如，在由人ES细胞或人iPS细胞形成网状结构物的条件下进行培养时，优选从培养ES细胞或iPS细胞开始在低氧分压下(例如，氧分压5％左右)培养1～10天、优选4～8天、更优选7天左右，然后在更高的氧分压下培养。
或者，由低氧分压转变到更高的氧分压的时机可将特定基因的表达变化作为指标而决定。作为特定基因，没有限定，例如，可举出作为中内胚层诱导的指标的基因、作为造血祖细胞诱导的指标的基因、作为分化增殖性细胞因子的指标的基因、或者作为血细胞诱导的指标的基因。例如，优选在作为中内胚层诱导的指标的基因表达的时机的前后将氧分压从低氧向大气氧转变。此外，就作为造血祖细胞诱导的指标的基因、作为分化增殖性细胞因子的指标的基因及作为血细胞诱导的指标的基因而言，优选在其开始表达前后为止将氧分压从低氧向大气氧转变。
上述作为中内胚层诱导的指标的基因可举出T、SOX-17、GATA-4、HNF-3β、GSC、Cer1、Nodal、FGF8、Mixl1、FGF4CD48、DKK4、FGF17、GATA-6、CXCR4，c-Kit、CD99、OTX2、Nodal等。上述作为造血祖细胞诱导的指标的基因可举出TAL-1、KDR、CD34、CXCR4、c-Kit、RUNX-1、GATA-1、GATA-2、CD43、ETV-2、Tie-2、CD31、CLOUDIN5、Sca-1等。上述的作为分化增殖性细胞因子的指标的基因可举出VEGF、EPOR、EPO、TPO、BMP4、FGF-2、FLT-1、Ang-1、SDF-1、SCF等。上述的作为血细胞诱导的指标的基因可举出CD41、血型糖蛋白-A、c-MPL、Rh抗原、α4整合素(integrin)、KLF-1、BCL-11A、CD45、β-球蛋白、α-球蛋白、ε-球蛋白、γ-球蛋白等。
在此，“更高的氧分压”是比开始培养能够向造血祖细胞进行分化的细胞时的氧分压(低氧分压)高的氧分压，例如，是11％～30％左右的氧分压，更优选为15％～25％左右的氧分压。“更高的氧分压”特别优选21％左右的大气氧分压。
本发明的其它实施方式为将由本发明的方法制备的造血祖细胞或红系祖细胞进一步培养而分化诱导或制备各种血细胞的方法。
就由造血祖细胞或红系祖细胞分化诱导各种血细胞的方法而言，在该技术领域中公知有很多方法(例如，Miharada等，Nat Biotechnol 2006，24:1255-1256；Qiu等，Blood2008，111:2400-2408；Ma等，PNAS 2008，105:13087-13092；Lu等，Blood 2008，112:4475-4484；Baek等，Transfusion 2009，11:2285-2295；Lapillonne等，haematologica 2010，doi:10.3324)，本领域技术人员可容易进行选择并实施。
例如，在由根据本发明的方法制得的造血祖细胞制备成熟巨核细胞、进而制备血小板时，作为其培养条件，可举出添加TPO、IL-1α、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-11、EPO、GM-CSF、SCF、G-CSF、Flt3配体、肝素等中的任一种或组合其中的两种以上的条件。更具体而言，作为分化诱导成熟巨核细胞及血小板的条件，例如可例示如下条件:在TPO(10～200ng/mL、优选100ng/mL左右)的存在下，或者在TPO(10～200ng/mL，优选100ng/mL左右)、SCF(10～200ng/mL，优选50ng/mL左右)及肝素(10～100U/mL，优选25U/ml左右)的存在下，培养7～15天左右。作为培养环境，只要是在体外进行血细胞系细胞的分化诱导时适合的环境即可，例如可在5％CO2、36～38℃优选37℃的条件下实施培养。
此外，由根据本发明的方法制备的红系祖细胞分化诱导成熟红细胞的适当条件，例如可举出添加TPO、IL-1α、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-11、EPO、GM-CSF、SCF、G-CSF、Flt3配体、IGF-I、IGF-II、地塞米松、氢化可的松、米非司酮、肝素等中的任一种或组合其中的两种以上的条件。更具体而言，作为分化诱导红细胞的条件，可例示如下条件:在EPO(2～100U/mL，优选10U/mL左右)的存在下，或者在EPO(2～100U/mL，优选10U/mL左右)、SCF(10～200ng/mL，优选50ng/mL左右)、TPO(5～200ng/mL，优选20ng/mL左右)的存在下，培养7～25天左右。作为培养环境，只要是在体外进行血细胞系细胞的分化诱导时适合的环境即可，例如，可在5％CO2、36～38℃优选37℃的条件下实施培养。
此外，由本发明制备的各种血细胞也能够以制剂的方式稳定供给。根据本发明的方法，例如，制备血小板并将其进行制剂化时，可回收丰富存在血小板的培养液的部分，使用白细胞除去过滤器等，除去巨核细胞以及除血小板以外的血细胞系细胞成分而进行制备。在制备血液制剂之际，也能够含有有助于血小板或红细胞的稳定化的其它成分。这种有助于稳定化的成分可选择该技术领域的专家所公知的成分。
更具体而言，取得的血小板例如可通过以下方法进行制剂化。
ACD-A液:将FFP(新鲜冷冻血浆(fresh frozen plasma)；从由献血得到的全血进行调整而得，含有除白蛋白、凝固因子等血液成分以外的所有成分)以1:10的比率进行调整，在照射15-50Gy的放射线后于20-24℃边振荡边保存。将ACD-A液；柠檬酸钠22g/柠檬酸8g/葡萄糖22g用注射用水以整体为1L的方式进行调整。
在使用以上方法时，作为血小板的浓度，例如，优选1×109血小板/mL左右。
此外，若预先添加GM6001(a broad-range hydroxamic acid-basedmetalloprotease inhibitor，广泛范围的异羟肟酸金属蛋白酶抑制剂)(Calbiochem公司，La Jolla，加利福尼亚州，美国)，则可预防冷冻保存及室温保存中发生的与血小板功能分子GPIb-V-IX、GPVI的切断相伴的失活。本发明人等确认了利用该方法，可预防来自小鼠ES细胞的血小板的失活。应予说明，作为与使用了人血小板的该血小板失活相关的机制的参考论文，可参照Bergmeier，W et al.，Cir Res 95:677-683，2004及Gardiner，EE et al.，JThrombosis and Haemostasis，5:1530-1537，2007。
应予说明，收纳包含血小板的制剂的容器优选避免像玻璃这样的使血小板活化的材质。
此外，根据本发明，例如，在制备红细胞并将其制剂化时，可如下进行。
在将培养上清离心后浓缩而得的增稠红细胞液中加入MAP液(组成参照以下)来制备，在照射15-50Gy的放射线后于2～6℃保存。
在使用以上方法时，作为红细胞的浓度，例如，优选1×1010红细胞/mL左右。取得的红细胞可使用例如加入注射用水将D-甘露醇(14.57g)、腺嘌呤(0.14g)、磷酸二氢钠晶体(0.94g)、柠檬酸钠(1.50g)、柠檬酸(0.20g)、葡萄糖(7.21g)、氯化钠(4.97g)进行溶解并使总量为1000ml而得的溶液作为红细胞保存用添加液(MAP液)。
除此以外，本领域技术人员容易对被认为适于红细胞制剂化的公知方法进行适当选择。
另外，在本发明的实施方式中，包括以使用本发明的造血祖细胞或红系祖细胞的分化方法或制备方法为特征的、促进或阻碍向造血祖细胞或红系祖细胞进行分化的物质的筛选方法。具体而言，在作为本发明的方法而实施的细胞的培养工序中，在适当的时期，以适当的期间在培养基中添加作为候补的分化促进物质或分化阻碍物质，测定得到的造血祖细胞或红系祖细胞的数目，通过与作为对照而进行的实验(不添加候补物质地进行同样的培养工序)进行比较，可评价该促进物质或阻碍物质的效果。若比由对照实验得到的造血祖细胞或红系祖细胞的数目多，则为促进物质，若少，则可评价为阻碍物质。
以下示出实施例来进一步详细说明，但是实施例毕竟示出本发明的一部分方式，本发明不受实施例任何限定。
实施例
<材料和方法>
1.细胞与试剂
人iPS细胞使用通过导入山中4因子(OCT3/4、KLF4、SOX2、c-MYC)而建立的TkCB7-2、TkCB7-4、TkCB8-3。iPS细胞的维持培养使用在Dulbecco改良Eagle培养基和Ham F-12培养基(SIGMA)中加入0.1mM非必需氨基酸(Invitrogen)、2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)、20％knockout血清替代品(Invitrogen)、0.1mM 2-巯基乙醇(SIGMA)、及5ng/mL碱性成纤维细胞增殖因子(bFGF；Upstate)而成的培养基。将iPS细胞在经放射线照射(50Gy)的小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)上进行培养，每隔3天进行传代而维持未分化状态。此外，作为饲养细胞使用的小鼠C3H10T1/2细胞是在Eagle基础培养基(Invitrogen)中加入10％牛胎儿血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺而培养的。
分化培养基是在Iscove改良Dulbecco培养基(SIGMA)中加入10μg/mL人胰岛素、5.5μg/mL人转铁蛋白、5ng/mL亚硒酸钠(SIGMA)、2mM L-谷氨酰胺、0.45mMα-单硫代甘油(SIGMA)、50μg/mL抗坏血酸(SIGMA)、及15％高过滤FBS(Cellect Gold；ICN Biomedicals)而使用的，对其添加人血管内皮细胞增殖因子(R&D Systems)或者未添加地进行。
以上的培养是使用CO2培养箱HERA CELL 150i(Thermo SCIENTIFIC)在37℃、5％CO2下实施的。
此外，对于ES细胞，使用KhES3株，以与iPS细胞相同的条件进行维持培养及分化等。
2.来自iPS细胞或ES细胞的网状结构物(以下，iPS-Sac或ES-Sac)的制作
对于在本实施例中进行的用于制备网状结构物的培养工序进行以下说明(详细情况参照TAKAYAMA等，BLOOD 2008，111:5298-5306)。
事先将进行了50Gy的放射线照射的C3H10T1/2准备在100-mm培养皿中，将人iPS细胞或ES细胞在每个分化培养基中播种1×105。在注入氮气而使氧浓度为大气氧(21％O2)与低氧(5％或1％O2)的CO2培养箱内，在1～14天之间设定适当期间而进行培养。在低氧下培养的细胞随后移至大气氧条件，或者原样继续培养，进行共计14天的培养，制作成iPS-Sac或ES-Sac。
3.从iPS-Sac或ES-Sac回收血细胞
将iPS-Sac或ES-Sac从培养皿中剥离并破碎，在包含3％FBS的PBS中混悬后，使之通过40μm细胞过滤器(BD)。将通过的溶液以440×g离心分离10分钟，回收血细胞，计算细胞数。
4.流式细胞仪解析
细胞表面抗原的表达是用流式细胞仪(MoFlo，Beckman Coulter)解析的。将细胞用藻红蛋白(PE)结合-抗CD34抗体、藻红蛋白(PE)结合-抗CD42b抗体、Alexa405结合-抗CD45抗体、别藻蓝蛋白(APC)结合-抗血型糖蛋白(glycophorin)A抗体、别藻蓝蛋白(APC)结合-抗CD41a抗体(BD Biosciences)进行染色。
5.造血祖细胞(HPC；hematopoietic progenitor cell)的集落培养
将从iPS-Sac或ES-Sac回收的HPC 5-10×103混悬在添加了50ng/ml血小板生成素(R&D systems)的Metho Cult GF H4434(Stem Cell Technologies)中后，向35mm培养皿中进行播种。在CO2培养箱内培养13-14天，挑选生成的集落。将集落用Shandon Cytospin 4(Thermo SCIENTIFIC)以800rpm离心1分钟，利用Hemacolor快速血液涂片染色液试剂(MERCK)染色，进行观察。
6.成熟红细胞的免疫染色
使从iPS-Sac或ES-Sac回收的HPC向成熟红细胞分化，用Shandon Cytospin 4进行离心，向载玻片进行贴附。将其用4％多聚甲醛固定后，用0.1％TritonX-100进行透过处理，然后用脱脂牛奶进行封闭。使作为一次抗体的抗人血红蛋白抗体(Bethyl Laboratories)、抗人β球蛋白抗体(Santa Cruz Biotechnology)与红细胞进行反应，用作为二次抗体的Alexa488结合-抗山羊抗体及Alexa546结合-抗小鼠抗体(Invitrogen)进行染色。用VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI(Vector Laboratories)封入，用共聚焦显微镜FV1000(Olympus)进行观察。β球蛋白链阳性细胞率是以(β球蛋白链阳性细胞数/血红蛋白阳性细胞数)×100算出的。
7.利用实时PCR进行的基因表达解析
用RNeasy Mini Kit(QIAGEN)将iPS-Sac或ES-Sac进行处理，精制Total RNA。将RNA进行逆转录，合成cDNA，用罗氏通用探针(Roche Applied Science)通过7900HT快速实时PCR系统(Applied Biosystems)进行解析。作为内标基因，使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。
T、TAL-1、KDR、CD34、VEGF、EPOR、CD41a、血型糖蛋白-A、HIF2α、GAPDH的各基因的引物序列如下所述。
T:forward；gctgtgacaggtacccaacc(序列号1)
T:reverse；catgcaggtgagttgtcagaa(序列号2)
TAL-1:forward；ctatgagatggagattactgatggtc(序列号3)
TAL-1:reverse；gtgtggggatcagcttgc(序列号4)
KDR:forward；gaacatttgggaaatctcttgc(序列号5)
KDR:reverse；cggaagaacaatgtagtctttgc(序列号6)
CD34:forward；gtgaaattgactcagggcatc(序列号7)
CD34:reverse；cccctgtccttcttaaactcc(序列号8)
VEGF:forward；ccttgctgctctacctccac(序列号9)
VEGF:reverse；ccacttcgtgatgattctgc(序列号10)
EPOR:forward；ttggaggacttggtgtgtttc(序列号11)
EPOR:reverse；agcttccatggctcatcct(序列号12)
CD41a:forward；gagacacccatgtgcagga(序列号13)
CD41a:reverse；agctggggcacacatacg(序列号14)
血型糖蛋白-A:forward；gacacatatgcagccactcct(序列号15)
血型糖蛋白-A:reverse；atgatgggcaagttgtaccc(序列号16)
HIF2α:forward；gacatgaagttcacctactgtgatg(序列号17)
HIF2α:reverse；gcgcatggtagaattcatagg(序列号18)
GAPDH:forward；aacagcctcaagatcatcagc(序列号19)
GAPDH:reverse；ttggcaggtttttctagacgg(序列号20)
<结果>
1.低氧培养对向血细胞进行分化的效果
对于将iPS细胞(TkCB7-4)播种在分化培养基后在大气氧分压下(21％)培养14天的情况(图1(1))、在低氧分压下(5％)培养7天后在大气氧分压下(21％)培养7天的情况(图1(2))、在低氧分压下(5％)培养14天的情况(图1(3))的各种情况，计算在iPS-Sac内生成的血细胞数。其结果是，在低氧分压下进行7天的培养后在大气氧分压下培养7天时，生成的血细胞数最多(图1(2))。由该可结果可知，通过在低氧分压下开始培养iPS细胞并在低氧分压下培养一定期间，可增加所形成的血细胞数。
2.低氧培养对向造血祖细胞(HPC；hematopoietic progenitor cell)进行分化的效果
针对低氧培养对向HPC进行分化的效果进行研究。将人iPS细胞在大气氧分压下(21％)培养14天(图2(1))、在低氧分压下(5％)培养7天后在大气氧分压下(21％)培养7天(图2(2))、在低氧分压下(5％)培养14天(图2(3))，对于各自的在iPS-Sac内生成的细胞，利用流式细胞仪测定作为造血祖细胞的标记的CD34及CD45均为阳性的细胞的比率。其结果可知，通过在低氧分压下培养一定期间，造血祖细胞的比率提高(图2(2))(图2(3))。
接着，对于低氧培养对向造血祖细胞进行分化的效果，利用HPC的集落培养进行研究。
将从由iPS细胞(TkCB7-2)形成的iPS-Sac中回收的血细胞播种1×104，计算培养后生成的集落数，观察在各集落中存在的血细胞的种类(n(中性粒细胞)、m(巨噬细胞)、E(成红细胞)、M(巨核细胞)、blast(幼稚血细胞))。其结果是，在低氧分压下(5％)培养7天后在大气氧分压下(21％)培养7天(图3(2))时，与在大气氧分压下(21％)培养14天(图2(1))的情况相比，形成的集落数增加。进而，包含全部4种血细胞的混合集落(mix)成为包含造血干细胞/造血祖细胞的指标，在低氧分压下进行培养时也较多地形成该混合集落(图3；在大气氧分压下培养时为18个，与此此相对，在低氧分压下进行培养时为34个)。
对于低氧培养对从ES细胞(KhES3)向HPC进行分化的效果也进行了研究。将ES细胞在低氧分压下(5％)培养7天后在大气氧分压下(21％)培养7天(图4(1))(+VEGF)、在大气氧分压下(21％)培养14天(+VEGF)(图4(2))、在大气氧分压下(21％)培养14天(-VEGF)(图4(3))，然后计算在ES-Sac内生成的CD34阳性细胞数。其结果可知，在使用ES细胞时，通过在低氧分压下进行培养，造血祖细胞数增加(比较图4的(1)与(2)。纵轴为将在大气氧分压下(21％)培养14天(-VEGF)时的造血祖细胞数设为1时的相对数)。
由以上情况可清楚，在从iPS细胞或ES细胞等多能干细胞分化造血祖细胞时，通过包括在低氧分压下的培养过程，可增加产生的造血祖细胞数。
3.低氧培养对向红细胞系细胞进行分化的效果
对于低氧培养对向红系祖细胞进行分化的效果进行了研究。将人iPS细胞在大气氧分压下(21％)培养14天(图5(1))、在低氧分压下(5％)培养7天后在大气氧分压下(21％)培养7天(图5(2))、在低氧分压下(5％)培养14天(图5(3))，对于各自的在iPS-Sac内生成的细胞，利用流式细胞仪测定作为红系祖细胞的标记的GPA阳性且CD45阴性的细胞的比率。其结果可知，在进行了7天的低氧分压下的培养后在大气氧分压下培养7天时，红系祖细胞的比率变得最大(图5(2))。
由此，在从多能干细胞分化红细胞系细胞时，也显示出在低氧分压下的培养是有效果的。
4.低氧培养带来的各种血细胞的扩增效果
使将氧分压从5％(培养7天)转变到21％(培养7天)而制得的HPC分化成成熟红细胞、巨核细胞、血小板，确认了培养氧分压最优化带来的末梢血细胞的扩增效果。
其结果是，每1×105ES细胞(KhES-3)所得到的成熟红细胞数与使用21％氧分压而制得的情况相比成为约2.2倍(图6A)，iPS细胞(TkCB7-2)时则成为约5倍(图6B)。另外，在巨核细胞/血小板分化中，每1×105iPS细胞所得到的巨核细胞数约为4.4倍(图6C)，血小板数增加至2.8倍(图6D)。如上所述，本技术显示出从多能干细胞制作各种血细胞时是有效的。
5.低氧培养对红细胞的β球蛋白链阳性率的效果
使将氧分压从5％(培养7天)转变到21％(培养7天)而制得的HPC分化成成熟红细胞，测定作为红细胞成熟度的指标的β球蛋白链阳性细胞率。
其结果是，在ES细胞(KhES-3)中，使使用21％氧分压制得的HPC分化而得到的红细胞的β球蛋白链阳性细胞率为19.5％(图7A(1))，但是使采用从5％氧分压到21％氧分压的转变制得的HPC分化而得到的红细胞的β球蛋白链阳性细胞率为37.3％(图7A(2))，红细胞成熟度提高。同样在iPS细胞(TkCB7-2)中，使使用21％氧分压制得的HPC分化而得到的红细胞的β球蛋白链阳性细胞率为31.3％(图7B(1))，但是使采用从5％氧分压到21％氧分压的转变制得的HPC分化而得到的红细胞的β球蛋白链阳性细胞率为51.2％(图7B(2))。
如上可知，通过使用本技术，可制作成熟度高的末梢血细胞。
6.与由低氧培养所致的VEGF代替性相关的研究
要从多能干细胞经过网状结构体而效率良好地分化血细胞，优选添加VEGF。因此，对于是否能够效率良好地分化血细胞而利用低氧培养来代替VEGF的效果进行了研究。
对于将iPS细胞(TkCB7-4)在VEGF存在下在大气氧分压下(21％)培养14天的情况(图8A(1))，在VEGF不存在下在低氧分压下(5％)培养7天后在大气氧分压下(21％)培养7天的情况(图8A(2))，计算在iPS-Sac内中生成的血细胞数。其结果是，不添加VEGF地在低氧分压下进行培养的情况，稍微多地生成血细胞。
接着，对于在iPS-Sac内生成的细胞，利用流式细胞仪测定作为造血祖细胞的标记的CD34及CD45均为阳性的细胞的比率，结果造血祖细胞的比率在不添加VEGF地在低氧分压下进行培养的情况下稍大(图8B)。
进而，对于低氧培养的VEGF代替性，利用集落培养进行了研究。将由iPS细胞(TkCB7-4(图9A)及TkCB8-3(图9B))回收的血细胞播种5×103(TkCB7-4(图9A))或1×104(TkCB8-3(图9B))，进行集落培养。其结果是，在VEGF不存在下在低氧分压下(5％)培养7天后在大气氧分压下(21％)培养7天(图9A(2)和B(2))时，与在VEGF存在下在大气氧分压下(21％)培养时(图9A(1)和B(1))相比，所形成的集落数增加，此外，混合集落数也增加。
进而，确认在VEGF存在下由ES细胞将氧分压从5％转变到21％而得到的血细胞，与VEGF不存在的情况相比，有所形成的集落数变多的倾向(图9C)。
如上所述，低氧培养显示出代替VEGF的效果，而且通过与VEGF组合也显示出使造血祖细胞数增加，产生血液分化能力高的造血祖细胞。
7.1％氧分压下培养的效果
在VEGF不存在下，对于在低氧分压下(5％)培养7天后在大气氧分压下(21％)培养7天的情况(图10(1))和在更低的低氧分压下(1％)培养7天后在大气氧分压下(21％)培养7天的情况(图10(2))，比较由同样数目的ES细胞形成的血细胞集落数。其结果是，在5％氧分压下进行培养时，可形成多的血细胞集落数，大量得到造血祖细胞。
因此，接着，对于在1％低氧分压下产生的造血祖细胞向血细胞进行分化的能力，以所产生的混合集落数为指标进行研究。对于在VEGF存在下在大气氧分压下(21％)培养14天的情况(图11(1))、在VEGF不存在下在低氧分压下(5％)培养7天后在大气氧分压下(21％)培养7天的情况(图11(2))、以及在VEGF不存在下在低氧分压下(1％)培养7天后在大气氧分压下(21％)培养7天的情况(图11(3))而言，从各个情况中回收相同数目的CD34+细胞，进行集落培养。其结果是，在1％氧分压下开始培养时，可得到最多的集落数，混合集落数也最多地出现(是整个期间大气氧分压下培养时的约5倍，是5％氧分压下开始培养时的约2.6倍)。由该结果可知，若在更低的氧分压下(例如，1％左右)开始细胞培养，则可制成向血细胞分化的能力更高的造血祖细胞。
8.关于从低氧环境转变到大气氧环境的时机的研究
将ES细胞(KhES3株)在低氧分压下(5％(图12A)或1％(图12B))培养4天、7天、10天后将余下的期间在大气氧分压下进行培养，将整个期间(14天)在低氧分压下进行培养，将整个期间(14天)在大气氧分压下进行培养，对于上述各情况分别计算培养后生成的血细胞数。其结果可知，在低氧分压下的培养期间为7天时产生的血细胞数最多，进而若延长在低氧分压下的培养期间，则血细胞的形成效率下降(图12A及B的L7)。因此，若在低氧分压下的培养的第7天左右转变到在大气氧分压下培养，则可使血细胞效率最高地进行分化，即使延长，也可以说优选在低氧分压下的培养10天左右转变到大气氧分压下的培养。
9.低氧分压下的培养条件的基因表达变化的研究
利用实时PCR将ES细胞(KhES-3)在低氧分压下(5％)培养14天时(5％L14)，以及在低氧分压下(5％)培养7天后在大气氧分压下(21％)培养时(5％L7)的基因表达变化进行分析。
与5％L14相比，5％L7在培养第8天作为中内胚层诱导的指标的基因(例如，T)(图13)的表达增加。然后，T基因的表达与氧分压无关地在培养第8天以后缓缓下降。
此外，在培养第8天后作为造血祖细胞诱导的指标的基因(例如，TAL-1(图14A)、KDR(图14B)、CD34(图14C))、作为细胞因子的指标的基因(例如，VEGF(图15A)、EPOR(图15B))、及作为血细胞诱导的指标的基因(例如，CD41a(图16A)、血型糖蛋白-A(图16B))的表达增加。这些基因的表达到之后培养第14天为止持续增加，5％L7均显示出高的表达倾向。
此外，在使氧分压变化前的培养第7天，比较大气氧(21％N)与低氧(5％L7)的结果是，低氧应答性的基因(例如，HIF2α)的表达上升(图17)。
由以上结果可知，这些基因的表达伴随着氧分压而变化，可作为确定氧分压的转变时期、所使用的氧分压时的指标。
产业上的可利用性
本发明提供了在生物体外效率良好地分化血细胞的方法。根据本发明，可容易地在生物体外供给充分量的血细胞，因此本发明对医疗等领域的发展作出很大贡献。

Claims (16)

1.一种造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，包括以下工序:将能够向造血祖细胞或红系祖细胞进行分化的细胞在氧分压上升的环境中进行细胞培养。
2.根据权利要求1所述的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，其中，所述氧分压上升的环境是包括在低氧分压下进行细胞培养的工序的环境。
3.根据权利要求2所述的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，其中，所述低氧分压为0.1～10％。
4.根据权利要求2或3所述的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，其特征在于，所述低氧分压是如下的氧分压:在该分压下进行培养时，与在其它分压下的培养相比，低氧应答性的基因表达。
5.根据权利要求2～4中任一项所述的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，其中，在所述低氧分压下从细胞培养开始进行一定期间的细胞培养后，在更高的氧分压下进一步进行细胞培养。
6.根据权利要求5所述的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，其中，所述一定期间为4～10天。
7.根据权利要求5或6所述的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，其中，所述一定期间是到呈现KDR阳性、CD34阳性、CD43阳性的细胞出现为止。
8.根据权利要求5～7中任一项所述的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，其特征在于，改变至所述更高的氧分压下的时期是成为中内胚层诱导的指标的基因表达的时期、成为造血祖细胞诱导的指标的基因的表达开始的时期、成为分化增殖性细胞因子的指标的基因的表达开始的时期、或者成为血细胞诱导的指标的基因的表达开始的时期。
9.根据权利要求5～8中任一项所述的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，其中，所述更高的氧分压为11～30％的氧分压。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，其中，能够向所述造血祖细胞或红系祖细胞进行分化的细胞为多能干细胞。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，其特征在于，所述造血祖细胞或红系祖细胞是从网状结构或拟胚体取得的。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的造血祖细胞或红系祖细胞的制备方法，其特征在于，在进行所述细胞培养的培养基中不添加VEGF。
13.一种造血祖细胞或红系祖细胞，是由权利要求1～12中任一项所述的方法制得的。
14.一种血细胞，是将权利要求13所述的造血祖细胞或红系祖细胞进一步培养而制得的。
15.一种医药制剂，包含权利要求14所述的血细胞。
16.一种筛选促进或阻碍向造血祖细胞或红系祖细胞进行分化的物质的方法，其特征在于，使用权利要求1所述的制备方法。
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