CN107872954A - 在低温下保存细胞、组织或器官的方法 - Google Patents

在低温下保存细胞、组织或器官的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于在重度低温下保存优选人类细胞、组织或器官的方法，其包含如下步骤，在所述步骤期间将所述细胞、组织或器官保持在中度低温以及优选低氧和/或高二氧化碳氛围下，然后将所述细胞、组织或器官放置在重度低温下。

Description

在低温下保存细胞、组织或器官的方法
本发明涉及一种用于中期和长期保存细胞、组织或器官的新方法。更具体地，该方法旨在用于保存移植物，直到它们移植在接受者中。
背景技术
迄今为止，低温保存是用于中期和长期保存造血细胞移植物的唯一可用的方法。实际上，在未冷冻并且在4℃的温度下，观察到，在保存仅3天后，移植物中所含的祖细胞的数量和功能能力急剧降低(Hechler等人,1996)。
然而，低温保存具有显著的缺点，特别是融化期间可能会凝集或因存在低温保护剂而引起过敏反应的风险。此外，该方法不适用于所有细胞类型。
以前的研究显示，通过改变培养物的氛围条件，特别是通过降低氧气浓度和提高二氧化碳浓度能改善CD34+造血干细胞在4℃下的短期保存(Vlaski等人，2014)。虽然是显著的，但这些改善仍然不足以确保在4℃下长期保存时细胞并且特别是祖细胞的存活和功能能力的维持。
最佳方法将允许在不冷冻的情况下在低温条件下长期保存移植物，并由此简化移植流程和程序，同时改善在接受者中获得的结果。
发明内容
发明人已显示，将细胞在中度低温以及低氧和/或高二氧化碳氛围下预温育，然后将细胞保存在重度低温下，使得可以大幅改善所述细胞的存活和增殖能力，特别是在干细胞的情况下。
因此，根据第一方面，本发明涉及一种用于在重度低温下保存动物细胞、优选人类细胞的体外或离体方法，其包含如下步骤：将所述细胞维持在中度低温以及低氧和/或高二氧化碳氛围下约12至约72小时，然后将所述细胞保存在重度低温下。
可以将细胞保存在温度为约1℃至约12℃、优选约4℃的重度低温下。
可以将细胞维持在温度为约20℃至约35℃、优选约30℃的中度低温下。
可以将细胞维持在中度低温以及低氧和/或高二氧化碳氛围下约24至约48小时，优选约48小时。
低氧氛围可以包含约0.5％至约10％O2，优选约5％O2。
高二氧化碳氛围可以包含约5％至约20％二氧化碳，优选约9％二氧化碳。
优选地，将细胞维持在中度低温以及低氧和高二氧化碳氛围下。
根据本发明方法保存的细胞可以是皮肤细胞、软骨细胞、骨细胞、内皮细胞、肌肉细胞、神经细胞、视网膜细胞、胰腺细胞、血细胞或能够分化成这些细胞的干细胞或祖细胞。
这些细胞可以特别地被组织成组织，所述组织优选选自：皮肤、角膜、肌腱、骨组织、血管、神经、心脏瓣膜、羊膜、软骨组织、朗格罕氏岛(islet of Langerhans)和肌肉组织；或被组织成完整或部分器官，所述器官优选选自：肾脏、肝脏、心脏、脐带、胎盘、肠、肺和胰腺。
优选地，保存的细胞是造血干细胞、间充质干细胞或其组合，优选造血干细胞。
根据另一方面，本发明还涉及一种试剂盒，其包含细胞保存介质；用于接收细胞、组织或器官和细胞保存介质的第一无菌容器；用于在包含细胞、组织或器官的第一容器中产生低氧和/或高二氧化碳氛围的装置；以及任选地，用于将第一容器和/或细胞、组织或器官维持在受控温度下的第二容器。
或者，试剂盒可以包含用于接收细胞、组织或器官和细胞保存介质的无菌容器，所述无菌容器含有低氧和/或高二氧化碳氛围，所述无菌容器任选地用细胞保存介质预填充。
根据另一方面，本发明还涉及本发明的试剂盒用于实施本发明的方法(即用于在重度低温下保存动物细胞)的用途。
附图说明
图1：胎盘血CD34+细胞。相对于t＝0的活细胞得率。空气：21％O2和0.01％CO2；HH：9％CO2和5％O2；低氧：5％O2和0.001CO2；高二氧化碳：20％O2和20％CO2。*：p<0.5；**：p<0.01；***：p<0.001。
图2：胎盘血CD34+细胞。相对于t＝0的克隆形成性祖细胞得率。空气：21％O2和0.01％CO2；HH：9％CO2和5％O2；低氧：5％O2和0.001CO2；高二氧化碳：20％O2和20％CO2。*：p<0.5；**：p<0.01；***：p<0.001。
图3：人类间充质细胞。相对于t＝0的活细胞得率。空气：21％O2和0.01％CO2；HH：9％CO2和5％O2；低氧：5％O2和0.001CO2；高二氧化碳：20％O2和20％CO2。*：p<0.5；**：p<0.01；***：p<0.001。
图4：人类间充质细胞。相对于t＝0的克隆形成性祖细胞得率。空气：21％O2和0.01％CO2；HH：9％CO2和5％O2；低氧：5％O2和0.001CO2；高二氧化碳：20％O2和20％CO2。*：p<0.5；**：p<0.01；***：p<0.001。
图5：FDCPmix细胞。相对于t＝0的活细胞得率。空气：21％O2和0.01％CO2；HH：9％CO2和5％O2；低氧：5％O2和0.001CO2；高二氧化碳：20％O2和20％CO2。*：p<0.5；**：p<0.01；***：p<0.001。
具体实施方式
在先前的研究中，本发明的发明人观察到，相对于暴露于空气，低氧和高二氧化碳改善了造血干细胞的保存(Jeanne等人,2009；Ivanovic等人,2010；Vlaski等人,2014)。
在本申请的实验部分中，发明人已经显示，相对于直接放置在4℃下，将干细胞在中度低温(30℃)下预温育2天，然后将所述干细胞转移至4℃非常显著地改善了这些细胞的存活和祖细胞的功能能力。当将预温育与低氧和/或高二氧化碳氛围组合时，获得的结果全部更加显著。在三种不同的细胞类型(即，CD34+造血细胞、间充质细胞和FDCPmix细胞系的细胞)上得到验证的这些结果表明，该方法可以用于改善低温下细胞、组织或器官的保存，特别是用于移植。
因此，根据第一方面，本申请涉及一种用于在重度低温下保存动物细胞的体外或离体方法，其包含如下步骤：将所述细胞短时间维持在中度低温下，然后将所述细胞保存在重度低温下。
本发明方法的目的在于当将动物细胞在不进行冷冻的情况下保存在重度低温下时改善其保存。如本文所用，术语“重度低温”指高于0℃并且低于15℃的温度。优选地，此术语指如下的温度：约1℃至约12℃，即约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12℃，优选约1℃至约8℃，并且特别是约2℃至约8℃。更特别优选地，重度低温对应于约1℃至约6℃、优选约4℃的温度。
如本文所用，术语“约”是指指定值的±5％、优选指定值的±2％的值的范围。例如，“约20”包括20±5％，或19至21。应了解，前面有术语“约”的值也必须被认为其被具体描述在本申请中。例如，表述“约1℃至约12℃的温度”也必须被认为描述了“1℃至12℃的温度”。同样，表述“约4℃的温度”也必须被认为描述了“4℃的温度”。
在放置在重度低温下之前，将细胞短时间维持在中度低温下。如本文所用，术语“中度低温”指约20℃至约35℃的温度，即约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35℃的温度，优选约25℃至约32℃的温度，更优选约27℃至约32℃的温度。更特别优选地，中度低温对应于约30℃的温度。
在本发明的方法中，将细胞放置在中度低温下约12小时至约72小时，优选约24小时至约60小时或约36小时至约60小时，然后放置在重度低温下进行更长期的保存。优选地，中度低温的阶段持续约24小时至约48小时，特别优选约48小时。
根据优选实施方式，在中度低温下的步骤后，立即将细胞放置在重度低温下。
在本发明的方法中，可以将细胞在使用之前长期保存在重度低温下，例如数天至数月。具体地，可以将细胞保存在重度低温下超过24小时，特别是1天至120天，优选1天至1个月，更优选1天至15天，并且更特别优选5天至10天。
通过本发明的方法保存的细胞优选是从动物或供体、优选哺乳动物并且特别优选人类获得的细胞。具体地，在移植的情况下，这些细胞可以用于随后施用于接受者。
根据优选实施方式，细胞在被放置在中度低温之前既不冷冻也不经受重度低温的条件。优选地，在从供体获得后最多4小时内，将细胞放置在中度低温下。特别优选地，在获得后立即(即，在获得后一小时内)将细胞放置在中度低温下。
在保存之前，可以对细胞进行各种分析，如血清学、HLA分型和表型、形态学(特别是在被组织成组织或器官的细胞的情形下)或细菌学检查。
如实验部分所示，在中度低温下的初步步骤足以改善细胞的保存。然而，根据某些优选实施方式，将该步骤与调整培养物的氛围条件以产生低氧、高二氧化碳或低氧/高二氧化碳氛围，优选低氧/高二氧化碳氛围相组合。
低氧氛围是相对于空气中通常为20至21％的O2浓度包含降低的O2浓度的氛围。如本文所用，术语“低氧氛围”指包含少于10％O2的氛围。因此，低氧氛围可以包含例如约0.5％至约10％O2，即约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10％。根据某些优选实施方式，低氧氛围包含约1％至约5％O2。特别优选地，低氧氛围包含约5％O2。在低氧氛围中，二氧化碳浓度优选对应于环境空气的二氧化碳浓度，即约0.05％。气体混合物的其余部分一般由二氧化氮组成。
高二氧化碳氛围是相对于空气中通常低于0.05％的二氧化碳浓度包含增加的二氧化碳浓度的氛围。如本文所用，术语“高二氧化碳氛围”优选指包含超过5％CO2的氛围。因此，高二氧化碳氛围可以包含例如约5％至约20％CO2，即约5、6、7、8、9、10、11、13、14、15、16、17、18、19或20％。根据某些优选实施方式，高二氧化碳氛围包含约5％至约10％CO2，优选在约6％或7％至约10％CO2之间。根据其它优选实施方式，高二氧化碳氛围包含约6％至约20％CO2，优选约9％至约20％CO2。特别优选地，高二氧化碳氛围包含约9％CO2。在高二氧化碳氛围中，O2浓度优选对应于环境空气的O2浓度，即约20-21％。气体混合物的其余部分一般由二氧化氮组成。
低氧/高二氧化碳氛围是相对于环境空气中的通常浓度包含降低的O2浓度和增加的二氧化碳浓度的氛围。更具体地，如本文所用，术语“低氧/高二氧化碳氛围”指包含少于10％O2并且超过5％CO2的氛围。优选的O2和CO2值范围如上文针对低氧和高二氧化碳条件所定义的。特别优选地，低氧/高二氧化碳氛围包含约5％O2和约9％CO2。气体混合物的其余部分一般由二氧化氮组成。
这些特定气体混合物各自可以通过本领域技术人员公知的方法，特别是借助于可从各种供应商获得的氛围受控的温育室获得。
通过本发明的方法保存的细胞可以是希望在重度低温下保存的任何动物细胞。
优选地，细胞是哺乳动物细胞，并且特别优选是人类细胞。
根据优选实施方式，细胞是要移植到接受者中的细胞，优选从供体获得。供体和接受者可以是相同个体(自体移植物)或不同个体(同种异体移植物)。
细胞可以是分离的细胞或被组织成组织或器官的细胞。
根据一个实施方式，保存的细胞是分离的细胞。这些细胞可以选自例如：皮肤细胞、软骨细胞、骨细胞、内皮细胞、肌肉细胞、神经细胞、视网膜细胞、胰腺细胞、血细胞或能够分化成这些细胞的干细胞或祖细胞。
干细胞可以是多能干细胞(能够分化成生物体的所有细胞类型)、专能干细胞(能够分化成各种组织的细胞类型)或单能干细胞(能够分化成单个组织的细胞类型)。祖细胞是能够分化成单个组织的各种细胞类型的细胞。其可能是寡能性(能够分化成少数细胞类型，例如CFU-GEMM祖细胞)、双能性(能够分化成两种细胞类型，例如CFU-GM祖细胞)或单能性(能够分化为单一细胞类型，例如CFU-G、CFU-M、CFU-MK、BFU-E和CFU-E祖细胞)的。与祖细胞不同，干细胞具有真正的自我更新能力和大得多的增殖能力。
在一个实施方式中，干细胞是选自胚胎干细胞的多能干细胞、专能成人祖细胞(MAPC)或诱导型多能干细胞。
胚胎干细胞源自于胚泡的内细胞团，并且能够形成生物体的所有组织(中胚层、内胚层、外胚层)，包括生殖细胞。胚胎干细胞的多能性可以通过标志物例如转录因子OCT4和NANOG以及表面标志物例如SSEA3/4，Tra-1-60和Tra-1-81的存在来评估。可以在不破坏胚胎的情况下获得胚胎干细胞，其中例如使用Chung等人(2008)描述的技术从胚胎取出胚胎干细胞。在一个特定实施方式中并且出于合法或伦理的原因，胚胎干细胞是非人类胚胎干细胞。一般来说，根据一个特定实施方式，根据本发明方法保存的细胞不是人类胚胎干细胞。
专能成人祖细胞可以像胚胎干细胞一样分化成来自三个胚胎层中的任一个的细胞，并表达转录因子OCT4和NANOG。这些细胞可以从各种器官、特别是从骨髓分离到(Schwartz等人,2002)。
诱导型多能干细胞(iPSC)是通过分化的体细胞的遗传重编程获得的多能细胞。除了与胚胎干细胞类似的形态以及自我更新的潜力和多能性外，iPSC还表现出表观遗传重编程，其中总体组蛋白甲基化和基因表达谱与胚胎干细胞非常接近。特别地，这些细胞是多能性标志物，特别是碱性磷酸酶染色以及NANOG、SOX2、OCT4和SSEA3/4蛋白的表达阳性的。用于获得诱导型多能干细胞的方法是本领域技术人员公知的，并且被特别描述在Yu等人(2007)；Takahashi等人(2007)；和Nakagawa等人(2008)的文章中。
在另一个实施方式中，干细胞是专能干细胞。专能干细胞的非限制性实例包括能够分化成血细胞和免疫细胞(即白细胞、红细胞和血小板)的造血干细胞，特别是表达CD34抗原的造血干细胞，或能够分化成软骨细胞、骨细胞(成骨细胞)和脂肪细胞的间充质干细胞。可以使用本领域技术人员已知的任何技术(例如使用免疫磁性系统或过滤系统)从骨髓中分离CD34+造血干细胞和间充质干细胞。
在另一个实施方式中，干细胞是单能干细胞。单能干细胞的非限制性实例包括皮肤、肝脏和肠粘膜的干细胞。
根据一个优选实施方式，保存的细胞是或含有干细胞，优选造血或间充质干细胞或其组合。特别优选地，保存的细胞是造血干细胞。
在某些实施方式中，保存的细胞可以被组织成组织或器官。
可以根据本发明方法保存的组织的非限制性实例包括皮肤、角膜、肌腱、骨组织、血管、神经、心脏瓣膜、羊膜、软骨组织、朗格罕氏岛和肌肉组织。
根据本发明方法保存的器官可以是完整的，例如完整的肾脏或肝脏，或部分的，例如部分肝脏。可以根据本发明方法保存的器官的非限制性实例包括肾脏、肝脏、心脏、脐带、胎盘、肠、肺和胰腺。
在本发明的方法中，可以将细胞、组织或器官保存在任何适合的介质中，优选液体介质。有众多适合于保存细胞、组织或器官的介质。本领域技术人员可以根据要保存的细胞、组织或器官的类型容易地选择适合的介质。这种介质例如被描述在国际专利申请WO2014/057220、WO 2014/120014、WO 2012/129538、WO 2011/159359、WO 06/052133、WO 97/33978和WO 00/02572中。许多供应商还销售适合的介质，例如HP01和HP02(来自Macopharma)、Stem Alpha A和Stem Alpha S3(来自Stem cell)或Viaspan(威斯康星大学溶液(University of Wisconsin solution))。
所述介质优选可以在不刺激细胞增殖的情况下使细胞存活。
本发明方法的一个优点在于其不需要在保存介质中使用低温保护剂。保存介质可以被直接注入，特别是在移植造血干细胞的情况下，或在施用前需要洗涤移植物。
在器官或组织的情形下，可以将它们浸没在适合的体积中以完全覆盖。
在使用细胞之前，特别是在移植的情况下，可以进行各种测试以检查移植物的质量，例如在对造血移植物进行质量控制的情况下进行的凋亡的测量或粒细胞/巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)或粒细胞/巨噬细胞集落形成细胞(CFC-GM)祖细胞的克隆形成性测试。
另一方面，本申请还涉及一种试剂盒。
根据第一实施方式，所述试剂盒包含：
-细胞保存介质，
-用于接收细胞、组织或器官和细胞保存介质的第一无菌容器，和
-用于在包含细胞、组织或器官的第一容器中产生低氧和/或高二氧化碳氛围的装置。
任选地，第一无菌容器可以用细胞保存介质预填充。
在将细胞、组织或器官放置在第一容器中之后，可以在第一容器中产生低氧和/或高二氧化碳氛围。
根据一个特定实施方式，所述容器包含允许气体交换的入口和出口，并且使用用于产生低氧和/或高二氧化碳氛围的装置将所需的氛围注入所述容器中。然后，关闭所述入口和出口以将细胞、组织或器官维持在所述氛围下。用于产生低氧和/或高二氧化碳氛围的装置优选是加压装置，如气瓶。
根据另一个特定实施方式，可以将包含细胞、组织或器官的无菌容器放置在允许产生低氧和/或高二氧化碳氛围的氛围受控的温育室中。
根据第二实施方式，试剂盒可以包含用于接收细胞、组织或器官和细胞保存介质的无菌容器，所述无菌容器含有低氧和/或高二氧化碳氛围。任选地，所述无菌容器可以用细胞保存介质预填充。
本发明的试剂盒还可以包含用于将第一容器和/或细胞、组织或器官维持在受控温度下的第二容器。
该第二容器优选在获得细胞、组织或器官后立即将所述细胞、组织或器官维持在中度低温下。接着，可以使用该相同容器将细胞、组织或器官放置在重度低温下。或者，可以在将细胞、组织或器官放置在重度低温下时将所述细胞、组织或器官移到新容器中。
细胞保存介质可以是下文所述并且适合于要保存的细胞、组织或器官的任何保存介质。
本发明的试剂盒特别适合于在移植的情况下从供体到接受者的细胞、组织或器官的运输和保存。
任选地，试剂盒还可以包含其它容器，例如用于接收用于确定血型的来自供体的血液样品的容器，或用于接收用于HLA分型的脾脏或神经节样品的容器。
本发明还涉及上述试剂盒用于实施本发明的方法的用途。
本说明书中引用的所有参考文献以引用的方式并入本申请中。本发明的其它特征和优点将在阅读以下说明性非限制性实施例后变得更加明显。
实施例
实施例1：胎盘血CD34+细胞
材料和方法
在用免疫磁性系统分离后，将CD34+细胞在37℃下，在干细胞因子(SCF；100ng/mL)、促血小板生成素(20ng/mL)和IL-3(1ng/mL)的存在下，以约105个细胞/毫升的浓度在HP01介质(Macopharma)中以培养物温育过夜。该介质在不刺激CD34+细胞增殖的情况下确保其存活。将该培养物分到8个不透气烧瓶中(每种氛围条件2个：i)空气(21％O2、0.01％CO2)；ii)低氧/高二氧化碳(HH)(9％CO2、5％O2)；iii)低氧(5％O2、0.001％CO2)；iv)高二氧化碳(20％O2和20％CO2))。将所有烧瓶在37℃下放置过夜(约16小时)，接着在37℃下在根据前述条件所述的改变的氛围下放置1小时。将每种条件一个烧瓶直接放置在+4℃下13天，将另一个烧瓶放置在30℃下2天，接着放置在+4℃下11天(共13天)。在该阶段结束时，将细胞在37℃下加热2小时，并且通过分析膜联蛋白V表达和碘化丙啶固定来评估活力/凋亡，并通过半固体培养物中集落形成能力的功能测试进行评估(Duchez等人,2013)。
结果
图1显示未经受凋亡的活细胞的得率。该图中呈现的结果显示，当将细胞直接放置在+4℃的重度低温下并在空气中保存13天时，所有活细胞都损失了。
另一方面，如果将悬浮液在+4℃下直接转移到低氧/高二氧化碳氛围，则13天后，约10％的细胞存活。如果将细胞在中度低温(30℃)下预温育2天，则低氧/高二氧化碳的该正面作用翻4倍。
单独的低氧与30℃下预温育的组合适度地改善了细胞存活，而在没有该预温育的情况下，单独的低氧没有正面作用。
单独的高二氧化碳在有或没有预温育的情况下都是有益的，但在有中度低温下预温育的情况下，其作用高6倍。
对于克隆形成性祖细胞，在所研究的条件下获得相当类似的结果(图2)。因此，这些数据清楚地显示，高二氧化碳和低氧与中度低温下预温育的组合可观地改善了胎盘血的CD34+细胞以及克隆形成性祖细胞的存活。观察期(13天)非常长，并且细胞和祖细胞的存活水平(40至65％)超过了所有预期。
实施例2：间充质细胞
材料和方法
在该实施例中并且为了清楚起见，仅考虑能够形成粘附性纤维母细胞样细胞集落(CFU-F)的间充质细胞(MC)。
将先前冷冻的由人类骨髓产生的间充质细胞(用于在移植前骨髓过滤的过滤器上保留的细胞)融化，在37℃和5％CO2下在9个烧瓶中培养(αMEM、10％FCS、βFGF(1ng/mL)、L-谷氨酰胺(2mM)、0.5％青霉素-链霉素)，并且扩增至汇合。接着将烧瓶在37℃下如下排气：i)空气(21％O2、0.01％CO2)；ii)低氧/高二氧化碳(HH)(9％CO2、5％O2)；iii)低氧(5％O2、0.001CO2)；iv)高二氧化碳(20％O2和20％CO2)(每种条件2个烧瓶；第9个烧瓶用于分析活力/凋亡和低温保存前的克隆形成性测试)。对于每种条件，将第一烧瓶直接放置在+4℃下且在4℃下保存5天，并且将第二烧瓶维持在30℃下48小时，接着在4℃下维持3天。5天后，将细胞在37℃下加热2小时并且进行分析(通过CFU-F培养物获得活力/凋亡和克隆形成能力，参见实施例1)。
结果
如图3所示，在中度低温下48小时的阶段大大改善了间充质细胞的存活，甚至是在空气中，其中如果将细胞在空气中在+4℃下温育5天，所有细胞会死亡。
低氧/高二氧化碳改善了直接放置在+4℃下的MC的存活，并且该作用因30℃下的阶段而翻3倍。
通过中度低温下的阶段，低氧和高二氧化碳各自分别确保MC的最大维持(约70％)。对于MSC(CFU-F)，获得了相当类似的结果(图4)。
实施例3：FDCPmix细胞系的细胞
材料和方法
在37℃和5％CO2下，在补充有20％马血清和8％WEHI条件培养基(白介素-3来源)的RPMI培养基中扩增FDCPmix细胞。接着在以下条件下将细胞分成每种条件2个烧瓶：i)空气(21％O2、0.01％CO2)；ii)低氧/高二氧化碳(HH)(9％CO2、5％O2)；iii)低氧(5％O2、0.001CO2)；iv)高二氧化碳(20％O2和20％CO2)。所遵循的方案与实施例2中对于间充质细胞的方案相同。
结果
在没有中度低温下的阶段(直接在+4℃下)的情况下，在空气中和在低氧/高二氧化碳条件下，FDCPmix细胞的维持不良。
另一方面，低氧/高二氧化碳或单独的高二氧化碳与中度低温下的阶段的组合提供了约60％FDCPmix细胞的非常好的维持(图5)。
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Claims (17)

1.一种用于在重度低温下保存动物细胞、优选人类细胞的体外或离体方法，其包含如下步骤：将所述细胞维持在中度低温以及低氧和/或高二氧化碳氛围下约12至约72小时，然后将所述细胞保存在重度低温下。
2.根据权利要求1所述的方法，其中将所述细胞保存在温度为约1℃至约12℃、优选约4℃的重度低温下。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述细胞维持在温度为约20℃至约35℃的中度低温下。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述细胞维持在温度为约27℃至约32℃的中度低温下。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述细胞维持在温度为约30℃的中度低温下。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述细胞维持在中度低温以及低氧和/或高二氧化碳氛围下约24至约48小时，优选约48小时。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述细胞保存在重度低温下超过24小时。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述细胞保存在重度低温下1至15天。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述低氧氛围包含约0.5％至约10％O2，优选约5％O2。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述高二氧化碳氛围包含约0.5％至约20％二氧化碳，优选约9％二氧化碳。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述细胞维持在中度低温以及低氧和高二氧化碳氛围下。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞是皮肤细胞、软骨细胞、骨细胞、内皮细胞、肌肉细胞、神经细胞、视网膜细胞、胰腺细胞、血细胞或能够分化成这些细胞的干细胞或祖细胞。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞被组织成组织，所述组织优选选自：皮肤、角膜、肌腱、骨组织、血管、神经、心脏瓣膜、羊膜、软骨组织、朗格罕氏岛和肌肉组织；或被组织成完整或部分器官，所述器官优选选自：肾脏、肝脏、心脏、脐带、胎盘、肠、肺和胰腺。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞是造血干细胞、间充质干细胞或其组合，优选造血干细胞。
15.一种试剂盒，其包含细胞保存介质；用于接收细胞、组织或器官和所述细胞保存介质的第一无菌容器；用于在包含所述细胞、组织或器官的所述第一容器中产生低氧和/或高二氧化碳氛围的装置；以及任选地，用于将所述第一容器和/或所述细胞、组织或器官维持在受控温度下的第二容器。
16.一种试剂盒，其包含用于接收细胞、组织或器官和所述细胞保存介质的无菌容器，所述无菌容器含有低氧和/或高二氧化碳氛围，所述无菌容器任选地用细胞保存介质预填充。
17.一种根据权利要求15或16所述的试剂盒的用途，其用于根据权利要求1至14中任一项所述的方法保存动物细胞。
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