CN103747674A - 器官运输和/或储存的数据记录,包含生物标记物和事件信息 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及器官的离体灌注方法。本发明的方法包括形成数据记录,其中所述数据记录包括涉及一种或多种生物标记物的一个或多个定性和/或定量关系的信息,以及当运输和/或储存所述器官时发生的事件。所述数据记录可被上传到数据库中。所述数据记录还可以包括与移植结果相关的数据或可以与此交叉参考的信息。
Description
发明背景
发明领域
本发明涉及灌注一种或多种器官,以监视、维持和/或恢复器官的活力,和/或运输和/或储存所述器官的方法。本发明具体涉及用于器官和组织保存的方法和组合物,并且可以包括用组合物灌注一种或多种器官、组织等(下文称之为“器官”)以在移植之前和/或移植期间维持、保持或提高所述器官的活力的方法。
相关技术的描述
低温是器官和组织保存的所有有用方法的基石,并且已经证明,在冷暴露期间,通过直接控制细胞的胞外环境并且间接控制胞内环境能最有效应用。为了优化保存,细胞胞外环境的传统控制基于不同策略,这些策略包括静态冷冻储存(或灌流保存),或低温连续灌注。这些策略需要不同方法进行细胞外环境的介入控制以优化保存,从而使实施这些策略所使用的解决方案的不同设计要素也最优化。
介入控制的一种这样的策略是通过机器灌注来保存器官,在有或没有计算机控制的情况下,这已经可以在不同温度下实现。例如,参见美国专利号5,149,321、5,395,314、5,584,804、5,709,654和5,752,929,通过引用这些专利纳入本文。用于评估机器灌注器官的活力的可用技术已经成为限制器官更广泛使用的一个关键因素。
然而,这样的机器灌注方法与诸如冷灌流储存或保存的传统方法相比有显著改进,传统方法只是基于这样的前提,即温度降低到接近于但不低于冰点(0℃)显著程度下阻止了对支持新陈代谢的需求,并且通过物理方法而不是新陈代谢方法可以维护胞内或胞外隔室之间的水和离子的正确分布。这样的传统方法只是通过使用通常称为“胞内”解决方案(由于在某些方面它们与胞内液体相似)的多种灌流或器官清洗解决方案操纵胞外环境以消除化学电势梯度来尝试阻止或限制细胞变化。
考虑缺血、再灌注、缺氧以及低温对细胞的伤害效应,加上各种现有器官保存解决方案经验证的功效,在储存解决方案的设计中许多重要的特性已显现出来。这些特性包括,例如,使低温诱导细胞膨胀最小化;防止间质空间扩张(在灌注期间特别重要);限制离子失衡;防止胞内酸中毒;防止来自自由基的伤害;提供在再灌注期间用于高能磷酸盐化合物再生的底物。本发明通过引入改善胞外环境的介入控制的策略和方法对已知方法进行改进,该策略和方法是通过监测一种或多种待移植器官的一种或多种预定生物标志物(可以是化学物,诸如指示供体器官的伤害、损害和/或健康运作的化学物或物质)。
发明概述
本发明针对使用灌注液的器官(和/或组织)灌注(诸如离体灌注),该灌注液设计成以要求的效果来调节器官,使其在植入时,已经给予所述灌注液的所述器官不太可能经历移植物功能延迟恢复(delayed graftfunction)、缺血/再灌注伤害的有害影响,包括可伤害器官或受体的炎症反应和/或其它有害反应。
本发明通过向处理器上传编译的数据而形成数据记录,编译的数据包括:涉及(1)在器官转运器、灌注设备、盒子、以及器官诊断设备中的至少一个装置中保存、运输和/或储存器官时,一种或多种预定生物标志物的一个或多个定性和/或定量的关系;以及(2)在器官转运器、灌注设备、盒子、以及器官诊断设备中的至少一个装置中运输和/或储存器官时发生的事件和/或条件的数据,以及涉及所述器官移植结果的数据;以及根据数据记录,使用同一处理器或不同处理器来确定保存条件(包括维持和/或恢复器官的活力)和/或至少一个设备或不同设备的运输参数,用于维护至少一个其它器官的活力。
本发明还针对监视、维持和/或恢复在器官转运器、灌注设备、盒子、以及器官诊断设备中的至少一个装置中的至少一个器官的活力的方法,该方法包括:监测数据,这些数据包括的信息涉及:(1)在器官转运器、灌注设备、盒子、以及器官诊断设备中的至少一个装置中运输和/或储存器官时,一种或多种预定生物标志物的一个或多个定性和/或定量的关系,以及(2)在器官转运器、灌注设备、盒子、和/或器官诊断设备中的至少一个中存在至少一个器官时发生的事件和/或条件,以形成数据记录;以及通过有线或无线方式将器官转运器、灌注设备、盒子、和/或器官诊断设备中的至少一个连接到网络,并且向数据库上传数据记录。
本发明还描述在器官转运器、灌注设备、盒子、和/或器官诊断设备中的至少一个装置中运输、保存和/或储存至少一个器官的方法,所述方法包括:根据(至少部分根据)器官保存、运输和/或储存的数据记录,调节用于运输和/或储存至少一个器官的至少一个设备的保存(可以包括维持和/或恢复器官的活力)、运输和/或储存参数,数据记录包括:与下列有关的信息:(1)在器官转运器、灌注设备、盒子、和/或器官诊断设备中的至少一个装置中保存、运输和/或储存至少一个相同的或不同的器官时,所监测的一种或多种预定生物标志物的定性和/或定量关系;以及(2)在至少一个相同的或不同的装置中运输和/或储存至少一个相同的或不同的器官时发生的事件,其中信息与结果数据进行交叉参考,所述结果数据与运输和/或储存的至少一个相同的或不同的器官的植入结果相关。
本发明也针对灌注器官以监测、维持和/或恢复器官的活力和/或运输和/或储存器官的方法。更具体地,本发明的方法通过在低温温度(低温灌注模式)、中常温温度、近常温温度、常温温度(常温灌注模式),上述灌注模式的一个或多个(或两个或更多个)的预定时间间隔,和/或响应一种或多种预定生物标志物(和/或一种或多种预定生物标志物的预定定性和/或定量关系的存在)的检测来选择上述一个或多个灌注温度,来灌注器官而监测、维持和/或恢复器官活力。
附图简述
从下述实施例的详细说明连同附图,本发明的这些和其它方面以及优点将会变得显而易见,其中:
图1是按照本发明的器官灌注设备;
图2是图1的设备的示意图;
图3是图1的设备的电路图;
图4是相对于ALT得到的结果的图示,并且比较对照和彼此之间,显示12-14℃和4-6℃氧组的ALT值是显著不同的;以及
图5A-F是在新鲜对照肝脏(红色),4-6℃下12小时的HMP肝脏±O2的测试以及12-14℃下12小时的含O2肝脏常温灌注3小时后收集的样本的离体检测结果的图示。A)显示IL-8,B)白蛋白,C)总胆汁产量,D)β-半乳糖苷酶,E)TNF-α以及F)LDH。表达数据为在每个实验组中4个肝脏的和6个对照肝脏中的平均值±1SE(标准偏差),*和#分别表示通过t-检验和单因素方差分析,p<0.05。
发明详述
本发明涉及方法学,所述方法学用于改进胞外环境(以及间接地改善胞内环境)的介入控制的策略和方法,所述介入控制是通过选择和监测可能存在于待移植器官中的预定生物标志物(诸如当正在通过机器灌注保存器官时),并且将数据与移植结果进行比较(或收集数据以便与将来移植结果进行比较)和/或相关联,在移植之前或期间优化保存,并且维持、维护或改善器官的活力。
本发明的方法还用于增加用于移植的供体器官的可用性和质量,使得更多病人获得具有较佳临床结果的移植。本发明的这些方法是通过使用临床可使用的、便携式机器灌注设备以及可靠地保存人类器官到24小时的器官保存方法来实现的。除了提高供体器官的可用性和质量之外,本发明的方法与使用本发明的方法而延长的储存时间一起,可实现更长的与供体更好匹配的受体之间的运输距离,从而获得改善的受体结果。
本发明的方法通过任选地当通过机器灌注处理和/或保存器官时监测所述器官特异性的生物标记物来改善已知用于机器灌注的器官的活性评价的方法,所述生物标记物可包括灌注的小分子、大分子(生物化学和药学组分)和/或生物学物质。在一些实施方式中,在例如各个离体预定的泵时间间隔下(例如连续或每5、10、15或30分钟、每小时和/或每天)进行所述评价。在一些实施方式中,可以采用本发明的方法来确保所述生物标记物完全和彻底在所述器官中分布和/或所述化合物在所述器官中细胞或亚细胞水平上的接受性或其效果。
本发明还描述通过引入小分子、大分子和/或生物物质(可能是相应器官的预定生物标志物和/或其影响预定生物标志物)而进一步改善灌注保存方法以及解决方案,其设计成以移植所述器官后所要求的效果在整个器官中传送所述小分子、大分子和/或生物物质的分布来调理器官(离体),要求的效果是在移植后,已经给予小分子、大分子和/或生物物质的所述器官不太可能经历移植物功能延迟恢复,包括炎症反应的缺血/再灌注伤害的有害效应,和/或其它可能伤害器官或受体的有害反应,包括突发或增强来自具有降低移植物和/或受体短期和/或长期健康以及正常功能潜力的受体免疫反应。在一些实施方式中,在灌注解决方案中包含如此的小分子、大分子和/或生物物质,所述方案可有效衰减、避免和/或消除各种破坏性途径,诸如破坏性途径,诸如缺血和再灌注伤害的有害效应带来的破坏性途径。
在本发明的方法中,可以在一个或多个温度下保持器官达到预定时间量,以便在移植之前和/或移植期间优化维持、维护或改善器官活力的方法。例如,对于已经评估并且超过预定活力指数阈值的器官或组织,可以使用主要用低温温度的本发明方法,以减少器官代谢,降低能量要求,延迟储藏高能量磷酸盐的消耗和乳酸的累积,以及阻滞与供血破坏相关的形态与功能的恶化。另一方面,可以选择用于特定器官的方法,该方法首先使用中-常温到常温温度以提高器官和/或组织的活力,直到得到符合预定活力指数阈值的器官和/或组织(这因器官而异),此后可以使用低温温度减少器官代谢,降低能量要求,延迟储藏高能量磷酸盐的消耗和乳酸的累积,以及阻滞与供血破坏相关的形态与功能的恶化。
本发明的方法可以以多种方式来维持和/或恢复器官活力,如通过在低温、常温、中-常温或近-常温温度下用充氧药液灌注器官来恢复器官中由热缺血损伤时间和/或缺氧减少的高能核苷酸(例如,三磷酸腺苷(ATP))水平和酶水平。为了符合预定活力指数阈值,维持、恢复以及改善器官活力的最优灌注液方案/治疗和/或温度模式可以随器官的不同而变化,并且可取决于接受的供体器官的条件或状态(例如,差异包括心脏跳动的供体对心脏不跳动的供体以及器官离开身体的时间量)。
本发明也涉及收集数据,所述数据包括与下列各项相关的信息:(1)当在器官转运器、灌注设备、盒子、和/或器官诊断设备中的至少一个装置中运输和/或储存器官时,一种或多种预定生物标志物的一个或多个定性和/或定量关系(可以是例如在另一种生物标志物存在或不存在下一种或多种生物标志物的存在或不存在、或一种或多种生物标志物对一种或多种其它生物标志物的水平的比值,诸如一种或多种生物标志物相对于一种或多种其它生物标志物的定量比值,例如浓度比值)(这个数据可以包括或可以不包括一种或多种预定生物标志物对诸如温度、灌注压力等灌注参数或条件的关系);以及(2)在器官转运器、灌注设备、盒子、和/或器官诊断设备中至少一个中存在至少一个器官时发生的事件和/或条件,以形成数据记录。可以使用这样的数据来构建和/或创建信息数据库,这些信息可以后续用作调节用于至少一个器官的运输和/或储存的至少一个装置的保存(包括维持和/或恢复器官活力)、运输和/或储存参数的基础。
在一些实施方式中,作为用于调节保存(包括维持和/或恢复器官活力)、运输和/或储存参数的基础的数据源白先前记录的数据,同一供体器官获得这些数据,所述同一供体器官的移植结果已经与该器官保存、运输和/或储存期间得到的数据相关联。
在一些实施方式中,可以使用数据记录中的信息来选择一种或多种生物标志物,并且如果可用的话,则确定所述一种或多种生物标志物的最优浓度范围。然后,一旦获得供体器官并且评估器官的预定生物标志物,则根据包含在数据记录中的信息可以确定供体器官的最有效的恢复和保存方法。例如,根据初始检测到的预定生物标志物,可以作出哪个初始保存策略对于维持或改善器官活力最有利的判定;例如,是否应该立刻用充氧药液对器官进行灌流,或是否应该在常温和/或低温温度下实施含特定化学物或生物标志物的溶液的灌注(或在体内(对于心脏跳动供体)或体外实施)。本发明的方法中编译数据记录的使用可以防止损坏供体器官,并通过使最多数量的器官保持适于移植,改进可用于移植的供体器官的数量和质量。
可以使用本文所述的方法来保护或防止哺乳动物的供体组织和/或器官的损伤,诸如由于组织缺氧、缺血或再灌注伤害引起的损伤。此外,可以使用本文所述的方法来恢复已受到损伤(诸如由于组织缺氧、缺血或再灌注伤害引起的损伤)。
在一些实施方式中,可以采用常温处理来恢复器官的活力,任选地在器官已经静态地和/或在灌注下经受低温温度之后。这样的初始低温暴露是可能发生的,例如,在采集之后的器官的运输和/或储存期间。所述处理也适用于最终会在低温条件下储存和/或运输的器官。换言之,能够在冷储存和/或运输之前对器官施加所述处理。
在常温灌注模式中,可以通过响应于传感器(该传感器设置在置于器官中的管子的末端)而控制气动加压药液储器,从而提供器官灌注总压力,其可以与提供灌注压力细调谐的步进马达/三角阀或管夹阀一起使用,防止过量增压和/或提供紧急截流(emergency flow cut-off)。另外,可以直接用诸如滚压式血泵或蠕动泵之类的泵来灌注器官,其具有适当的泵控制和/或足够的失效保护控制器以防止可能由于系统故障而发生的器官过量增压。充分消除过量增压防止和/或减少对血管内皮和对器官组织的总体损伤。
在一些实施方式中,例如,可以通过自动地监测一种或多种“生物标志物”来监测器官活力指数。例如,术语“生物标志物”是指任何小分子、大分子和/或生物物质,这些任何小分子、大分子和/或生物物质是由器官和/或组织产生的和/或引入器官和/或组织的或是存在于器官中的,能够提供对器官状态的认识(如适于移植和/或不适于移植的状态)。在一些实施例中,“监测一种或多种生物标志物”可以包括,例如,监测成分的稳定性(如供体器官产生的激素和/或其它化学物或其水平(浓度));监测引入捐助者器官或另外存在于器官中的诸如小分子、大分子和/或生物物质之类的成分的稳定性;监测器官的代谢和/或代谢速率的稳定性;监测氧消耗率和/或氧消耗速率的稳定性;监测葡萄糖浓度和/或葡萄糖浓度的稳定性;监测葡萄糖的消耗/消耗速率;监测乳酸的产生;监测乳酸的浓度;监测pH和/或pH的稳定性;监测pO2和/或pO2的稳定性;监测pCO2和/或pCO2的稳定性;监测pH2和/或pH2的稳定性;监测钙水平和/或钙水平的稳定性;监测器官阻力(压力/流);监测T/GST水平;监测T蛋白水平;监测碱过量;监测预定分子、物质或成分的吸收的速率或程度;监测器官或组织暴露于其中的一种或多种分子、成分或物质的提取或滤取;监测天然存在于器官中的一种或多种分子、成分或物质的提取或滤取;鉴定和/或监测天然或添加的物质的代谢物的存在;监测分子、物质和/或代谢物的浓度的器官控制;监测一种或多种分子、成分或物质的组织结合和积累或其速率;监测一种或多种分子、成分或物质的组织清除和消除或其速率;监测功能流出物(可取决于器官或组织)的组成,诸如肾脏尿液、肝胆汁、肺粘液或包括胰腺外分泌消化酶的流出物;监测分泌性产物,诸如释放到灌注流出物的激素;其中包括,和/或监测液体和/或组织中的上述的一种或多种的组合,所述液体诸如已经通过组织灌注的和/或收集的液体,或所述组织诸如已经从供体器官和/或组织收集的组织切片。
在一些实施方式中,一个或多个定性和/或定量关系可以是一种或多种上述生物标志物的水平相对于对照或一种或多种其它生物标志物的比值。在一些实施方式中,一个或多个定性和/或定量关系可以是一种或多种上述生物标志物的水平相对于对照或一种或多种其它生物标志物的比值,所述一种或多种其它生物标志物通过标准添加方法包括于所述灌注液中。在一些实施方式中,一个或多个定性和/或定量关系可以是一种或多种上述生物标志物的水平相对于对照或一种或多种其它生物标志物的比值,并且包括该比值与关于一个或多个灌注参数或条件(如温度或灌注压力)的信息的关系。
在一些实施方式中,本发明的方法包括定量、确定和/或计算一种或多种上述生物标志物与一种或多种其它生物标志物以及和/或关于一个或多个关于灌注参数或条件(如温度或灌注压力)的信息之间的关系。术语“确定”可以指,例如,已经暴露于器官的灌注液样本的定量或定性分析和/或器官本身的样本的定量或定性分析。“确定”也表示生物标志物之间的检测或定量相互作用,如两种之间结合的检测。相对于生物标志物,这里使用“监测”是指实施一种或多种生物标志物的定量检测,或实施所述生物标志物的定性检测。例如,在一些实施方式中,监测可以包括简单测量或简单监测来自生物标志物的荧光强度,或通过使用多波长和任选地计算一种或多种生物标志物的测量值之间的比值(其后可以任选地用比值来确定的生物标志物的浓度)来测量生物标志物的光学特性的变化或变化量。
可以使用各种已知的检测器、传感器和监测装置来监测上述生物标志物。此外,检测器、传感器和监测装置可以包括压力传感器、pH检测器、氧传感器以及流量计。
可以将相对于上述生物标志物获取的数据与涉及移植结果的数据相关联,以建立信息的数据记录或数据库,所述数据记录或数据库可以作为开发/调整/定制方法的基础,用来:(1)优化保存和/或(2)维持、维护或改善移植之前或移植期间器官的活力。例如,数据记录数据中的信息可以与涉及系统经历的条件的数据,尤其是检测到的和监测的器官和灌注液经历的条件(如从压力传感器、温度传感器、pH检测器、氧传感器和/或流量计收集到的数据)耦联。然后可以将检测到的数据与已经与移植结果相关联的编译数据进行比较。
在一些实施方式中,在器官转运器、灌注设备、盒子、以及器官诊断设备中的至少一个装置中运输和/或储存器官时,收集与一种或多种预定生物标志物的一个或多个定性和/或定量关系相关的信息,并且用于填充数据库。这样的定性和/或定量关系可以包括,例如,在用氧灌注肝之后,与肝酶释放、胆汁、白蛋白分泌的浓度和/或丰度(相对于氧浓度)相关的定性和/或定量信息,然后可以将其与移植结果相关联。这样的定性和/或定量关系还可以包括例如与不灌注外源性氧的肝相比,与肝酶释放、胆汁、白蛋白分泌的浓度和/或丰度相关的信息,这可与移植结果相关联。
在一些实施方式中,本发明的方法包括编译关于潜在的生物标志物的监测信息的数据库。可以根据其用作相应器官和/或所述器官条件的潜在生物标志物的能力对存在于组织中和/或分泌的各种分子进行筛选。这样的筛选过程可以包含在移植之前使用基因表达和蛋白分泌概况分析,并且将它们与离体和体内结果相关联。例如对于肝脏,在灌注期间和之后,在频繁的时间间隔中收集测试样本,并且可以在样本上执行包括优先终点测试(prioritized end point assay)的一系列测试,来测量代谢性酸中毒和低血糖、胆汁产生、库普弗细胞激活以及窦性内皮细胞功能障碍。还可以至少部分地根据包括肝受体脑病和凝血障碍评估的体内研究选择本发明的生物标志物。
在一些实施方式中,本发明的方法可以包括在器官获取之前或之后,进行数据库调查以选择或确定特定器官的合适生物标志物。在一些实施方式中,合适生物标志物可以是通过上述筛选过程鉴定的用于相应器官和/或所述器官条件的潜在生物标志物中之一。在一些实施方式中,预定生物标志物的选择组的初始评估与标准范围(根据包含在数据库中和/或数据记录中的编译的信息对相应获得的器官建立的标准范围)进行比较。在一些实施方式中,根据储存/保存/移植的器官的特性来选择需要监测的预定生物标志物组。在一些实施方式中,根据储存/保存/移植的器官的特性来评估的预定生物标志物的初始组。
在一些实施方式中,至少部分根据器官是否来自心脏跳动供体或心脏不跳动供体来选择评估的预定生物标志物的初始组。在一些实施方式中,至少部分根据器官是否来自心脏跳动供体或心脏不跳动供体来选择需要监测的预定生物标志物组。在一些实施方式中,至少部分根据在获得器官之前所述器官是否是病态的或受损伤的来选择评估的预定生物标志物初始组。在一些实施方式中,至少部分根据在器官获得之前所述器官是否是病态的或受损伤的来选择需要监测的预定生物标志物组。
在一些实施方式中,本发明的方法可以包括实施编译数据记录和/或数据库的数据库调查以选择或确定合适的灌注方法(如灌注液组成)和/或运输条件以便增强或减弱至少一种或多种生物标志物的水平使得观察到的生物标志物水平在所述生物标志物的预定标准范围内。在一些实施方式中,本发明的方法可以包括实施数据库调查以确定特定生物标志物的预定标准范围。例如,可以把这样的调查限制于在与正在储存/保存/移植的器官相似情况(例如,其中包括,缺血性损伤的时间、心脏跳动供体与心脏不跳动供体、供体预先存在的损伤或疾病、血型和/或各种生理条件)下获得的器官。
在一些实施方式中,至少部分根据包含在数据库中的信息来选择特定生物标志物组(两种或更多种)的预定标准范围(与特定生物标志物组的两个或更多个成员之间的定性和/或定量关系的标准范围一起)。在一些实施方式中,正在监测的预定生物标志物组的水平(和特定生物标志物组的一个或多个成员之间的定性和/或定量关系)与这样的生物标志物的标准范围(以及为所述特定生物标志物组的定性和/或定量关系而建立的标准范围)进行比较,所述这样的生物标志物的标准范围是根据包含在数据库和/或数据记录中的编译信息为相应获得的器官而建立的。
在一些实施方式中,(至少部分)根据正在监测的一种或多种预定生物标志物的定性和/或定量关系(这可以根据一个或多个因素,诸如特定生物标志物的浓度、或特定生物标志物对不同生物标志物的非检测水平的单纯的检测水平)来选择保存和/或维持、维护或改善所述器官的活力的器官治疗决策或具体策略(如灌注液组成,其可以是许多灌注液溶液的组合)。
例如,(至少部分)根据定性和/或定量关系选择保存和/或维持、维护或改善所述器官的活力的器官治疗决策和/或特定策略,其可以包括如何有效地使用肝灌注装置(如具有氧合能力的一种装置)的决策。具体地,可以使用至少部分基于数据库得到的信息的决策来确定对于如低温机器灌注之类的机器灌注是否需要的独立的肝动脉和门静脉灌注,或是否可能需要肝的动脉和静脉两种循环系统的灌注。
本发明的方法还可以包括一些步骤,所述步骤用于监测肝功能的预定生物标志物,并且可以使用来自数据的信息,以便作出器官治疗决策和/或特定策略(如灌注液组成,其可以是许多灌注液溶液的组合),用于至少部分根据预定生物标志物的定量和/或定性关系来保存和/或维持、维护或改善所述器官的活力。例如,指示通过氧合诱导的氧化损伤的生物标志物存在的检测(或这些生物标志物的预定水平,其水平可以取决于相应器官的特性)可能需要用含有效量的抗氧化剂的灌注液的氧的灌注,以便减少和/或消除氧化损伤的风险。
在一些实施方式中,可以使用包括微处理器的控制系统来产生实时器官活力指数,所述器官活力指数基于从数据记录收集的信息以及其与通过待移植的供体器官的检测器、传感器以及监测装置记录的数据的比较。
所述控制系统还可以包括用于控制所述灌注液和所述器官中至少一个温度的热控制器。所述热控制器可以通过控制TED来控制一个或多个医疗液储器以及器官容器的温度。可以将温度传感器连接到控制器以实现监测和控制。
在一些实施方式中,经由静脉离开器官或组织而恢复之后,可以测定流出物,如来自胰腺的胰岛素和胰高血糖素、来自肝的白蛋白和葡萄糖、来自肺的氧和二氧化碳或来自肾的肌酸酐。在心脏和小肠中,也可以监测如心跳和蠕动之类的运动反应的检测。
可以考虑上述鉴定的各种测量到的生物标志物来提供器官活力指数。所述指数可以是器官特异性的,或可以适用于各种器官。指数将监测的参数编译成用于作出器官治疗决策和决定是否移植所述器官的诊断总结。可以自动地产生所述指数,并且提供给医师。
在一些实施方式中,根据特定器官治疗决定以及关于是否移植所述器官的决定,可以在低温灌注、近-常温灌注、或中-常温灌注或其组合之前和/或之后进行常温灌注。在从供体摘除所述器官之前,还可以在体内和体外使用这样的灌注条件。
例如,在一些实施例中,当所述器官治疗方案不产生具有预定活力水平的器官,因此已经确定所述器官不适于移植时,则可以使用低温灌注来减小器官的代谢速率以允许所述器官保存延长的时间,使得所述器官可用于进一步的医学研究和测试。
在一些实施方式中,可以通过来自具有低压头的中间罐(intermediarytank)的压力把药液送到所述器官中,因此而避免了器官的过量增压。另一方面,在一些实施方式中,如果合适的话,可以使用重力使药液从中间罐送到所述器官中。另一方面,可以直接从泵灌注所述器官,诸如滚压式血泵或蠕动泵,其具有合适的泵控制和/或足够的故障-安全控制器,以防止所述器官的过量增压,尤其是系统误操作引起的。基本上排除过量增压防止或减少对器官的血管内皮以及器官组织整体的损伤,尤其在低温温度下当器官通过血管收缩来保护其自己的能力较弱时。在恢复过程、保存过程和/或移植过程的任一阶段期间,还可以通过一种或多种生物标志物来监测所述器官的活力,如通过监测器官阻力(压力/流量)和/或已经灌注器官和/或收集的药液中预定化学物的水平。
本发明的方法可以包括控制系统,其用于通过在灌注模式和控制参数之间选择而自动控制一个或多个器官的灌注。自动灌注可以基于系统中检测到的条件或手动输入的参数。可以基于从编译数据记录得到的信息,对系统预编程或在使用期间编程。
本发明的方法可以利用灌注设备,所述设备可以用于如肾之类的各种器官,还可用于如肝之类具有多重血管结构(例如,肝的肝脏和门脉血管系统)的更复杂的器官。应该理解,使用本发明的方法的器官和/或组织可以是任何类型的器官和/或组织,如肾、心、肝、肺或胰腺,例如,并且所述器官可以来自任何物种,如人或其它动物。
图1显示示例性器官灌注设备1。图2是图1的设备的示意图。所述设备1可以至少部分受微处理器控制,并且是气动致动的。图3示意性地显示微处理器150连接到所述设备1的传感器、阀、热电单元和泵。可以配置微处理器150和设备1,并且优选能够进一步连接到计算机网络以提供数据共享,例如,跨局域网或跨互联网。
所述器官灌注设备1能够同时在常温、近-常温、中-常温和低温温度(下文称为常温、近-常温、中-常温和低温灌注模式)下灌注一个或多个器官。可以用与所使用的药液兼容的材料来形成或覆盖所有的药液接触表面,如无血栓形成的材料。如图1所示,所述设备1包括外壳2,外壳2包括可以是半透明的前盖4,以及储器进入门3。所述设备可以具有一个或多个控制和显示区域5a、5b、5c、5d,用于监测和控制灌注。
如图2中示意性地显示,密封在外壳2中的是储器10,储器10可以包括三个储液罐15a、15b、17。其中两个储液罐15a、15b可以是标准的一升输液袋,每个具有相应的压力绑带(pressure cuff)16a、16b。可以提供压力源20使之对压力绑带16a、16b加压。压力源20优选是气动的,并且可以是经由气管26、26a、26b提供至少10LPM外部绑带致动的车载压缩机单元21,如图2所示。然而,本发明不限于使用车载压缩机单元,可以使用任何合适的压力源,例如压缩气体(例如,空气、CO,、氧、氮等)罐(未示出),如用于内部加压的在100psi或更大时具有1.5升的罐体积。另一方面,可以使用内部加压储液罐(未示出)。在一些实施例中,储液罐15a、15b、17可以是通过重力提供灌注液或通过压缩气体加压的瓶或其它合适的刚性储器。
在气管26上提供气阀22-23,以允许控制由车载压缩机单元21提供的压力。在气管26a、26b上分别提供防倒流阀24a、24b。可以分别在气管26a、26b上提供压力传感器P5、P6以将那里的条件传到微处理器150,如图3所示。可以提供具有传感器的灌注、诊断和/或运输设备以监测特定设备中的灌注液压力和流量来检测特定设备中的故障,诸如压力升高到器官维护的合适水平之上。可以提供气阀GV1和GV2以释放来自绑带16a、16b的压力。可以将气阀GV1和GV2中的一个或两者排放到大气中。可以提供经由管18a、18b与储液罐15a、15b连通的气阀GV4,以通过管18从储液罐15a、15b排放空气。可以配置具有过滤器和/或检查阀的管18、18a、18b、26、26a和/或26b,以防止生物材料进入管中或防止进一步沿液体路径前进。可以使用检查阀和/或过滤器来防止生物材料在多个器官灌注配置中离开一个器官灌注管组,而转移到后续的器官管组。在使用之后,在细菌和病毒之类的生物材料保留在灌注设备中的情况下,还可以使用检查阀和/或过滤器来防止此类生物材料在灌注设备的后续使用中从器官转移到器官。检查阀和/或过滤器防止与气体和/或排放线路中与回流相关的污染问题。例如,这些阀可以被配置作为抗回流阀以防止回流。第三储液罐17优选通过经由气阀GV2从压力绑带之一释放的压力加压。
如果需要的话,还可以在本发明的方法中,在诸如器官活力指数之类的诊断数据的产生中使用器官诊断设备。所述器官诊断设备可以包括如传感器和温度控制器之类的器官灌注设备的特性,以及盒子式接口特性,并且提供灌注系统中输入和输出液体的分析。在一些实施方式中,所述器官诊断设备可以是简化的灌注设备,其在直列式灌注的单通道中提供诊断数据。
本发明的方法还可以包括器官盒子的使用,所述器官盒子允许在用于灌注、储存、分析和/或运输器官的设备之间轻易安全地移动所述器官。可以配置器官盒子以在运输、恢复、分析和储存,包括转运器、灌注设备和器官诊断设备之间的转换期间,提供不间断的无菌条件以及有效的传热。
本发明的方法还可以包括器官转运器的使用,所述器官运输允许长距离的器官转运器。对于包括诸如肝、肺、肾、肠、心、胰腺、脾脏、睾丸、胎盘、胸腺、动脉、静脉、淋巴结、骨骼、骨骼肌、男性或女性生殖器官、或内分泌/外分泌腺,例如,包括肾上腺等的腺器官和组织的各种器官或组织,都可以使用器官转运器。所述器官转运器可以包括诸如传感器和温度控制器之类的器官灌注设备的特性,以及盒子式接口特性。
在本发明的方法中,可以把灌注设备、转运器、盒子以及器官诊断设备连成网,以允许远程管理、跟踪和监测器官或储存中或运输中的器官的位置、生物标志物、治疗和诊断参数。可以使用信息系统来编译器官运输和储存的历史数据,并且用医院和美国共享网络(UNOS)数据提供关于供体和受体的交叉参考。可以把收集到的数据编译在数据库中,并且与结果数据相关联,以允许生物标志物的检查、选择,以及生物标志物和灌注条件参数的标称范围的评估。
与本发明的方法一起使用的溶液或药液可以是天然液体,如血,或其它合成液体,例如,可以是简单的晶体溶液,或可以是用适当的氧运载体增强的溶液。在一些实施方式中,所述溶液或药液可以包括小分子、大分子和/或生化成分、药物成分和/或生物物质中的至少一种(如对一种或多种对预定生物标志物有影响的这些实体中的一个或多个),可以通过用至少一种分子、成分或物质混合所述溶液的第一部分(可以是药液和/或基本灌注溶液)可以产生第一混合溶液来制备所述溶液和药液。在一些实施方式中,通过器官或组织灌注第一混合溶液来影响一种或多种预定生物标志物(如通过增加、减少或维持相应预定生物标志物的浓度)。在一些实施方式中,还可以用第一混合溶液相似的方法制备的第二混合溶液、第三混合溶液、第四混合溶液等(可以单独地灌注,或与第一溶液组合灌注)来灌注通过器官或组织。在一些实施方式中,第二混合溶液、第三混合溶液、第四混合溶液、第五混合溶液中的一个或多个可以与第一混合溶液相同(在引入器官或组织之前),但是维持在不同的温度下。
在一些实施方式中,第二混合溶液、第三混合溶液、第四混合溶液、第五混合溶液中的一个或多个可以与第一混合溶液不同,或是包括相应一种分子、成分和/或物质(包含在第一混合溶液中)的不同的浓度,和/或包括比第一混合溶液更多或更少的成分。在一些实施方式中,在任何上述混合溶液之前或之后,还可以灌注不包括所述分子、成分或物质的一个或多个溶液和/或药液通过器官或组织;或者通过在用相同或不同溶液灌注之前、之后或期间通过简单地把器官或组织浸泡在溶液中,可以使器官或组织静态地暴露于本发明的一个或多个溶液中。
在一些实施方式中,可以通过本领域普通技术的人员已知的方法,如通过使用已知的氧合器,来增加所述溶液中任何一个的O2含量,补充所述溶液中任何一个的O2含量,和/或把O2含量引入本发明所述的溶液中的任何一个。例如,可以将用于灌注器官的O2溶解在液体中,然后作为气体/液体溶液给予所述器官。在一些实施方式中,氧合的选择和/或最优化可以使用不需要罐装气体的氧合器。例如,本发明的方法可以将压缩气体游离氧合系统(compressed gas-free oxygenation system)用于灌注和/或运输装置。
另一方面,可以在环境空气或一种或多种其它气体中溶解O,(或任何其它需要的气体N2、H2、CO2、CO、水蒸气),然后作为气体/气体混合物给予所述器官(用气体或用气体/气体混合物在本文中也被称作“加气灌注(persufflation)”)。在美国专利申请公开号2010/0330547中描述了示例性加气灌注装置或方法,其全文通过引用纳入本文。
在一些实施方式中,可以通过压力调整器把氧供给耦合到氧合器。氧合器附着于包括器官的储器或容器的侧面。相似地,气泡去除器可以附着于包括器官的容器。气泡去除器还可以独立于包括器官的容器,或组合到包括器官的容器或所述设备的另一部分中。
在一些实施方式中,例如,所述氧运载体可以是经洗涤的稳定化血红细胞、交联的血红蛋白、PEG化(Pegolated)血红蛋白或氟碳基乳液。在一些实施方式中,可以包括至少一种分子、成分或物质的溶液或药液还可以含有在生理环境中已知能减少过氧化或自由基损伤的抗氧化剂以及已知有助于器官保护的特定试剂。在一些实施方式中,对于常温模式,可以使用充氧的例如基于交联的血红蛋白的碳酸氢盐的包括至少一种分子、成分或物质的溶液,而对于低温模式,可以使用不充氧的例如简单的晶体溶液的溶液,如可以包括至少一种分子、成分或物质的用抗氧化剂增强的溶液。在一些实施方式中,可以设计或选择在任何温度模式中使用的溶液或药液(可以包括旨在调节器官和/或组织的至少一种小分子或大分子、成分或物质)以减少或另外防止所述器官或组织中的损伤或伤害,如洗去或损伤器官的血管内皮。
对于低温灌注模式,以及对于灌流和/或静态储存,在美国专利号6,492,103中公开了可以添加至少一种分子、成分或物质的示例性溶液,其公开全文在此通过引用纳入本文。在Hassanein的美国专利号6,046,046中也公开了可以在灌注溶液(可以包括旨在调节器官和/或组织的至少一种小分子或大分子、成分或物质)中使用的添加剂的例子,其公开的全文通过引用纳入本文。还可以使用其它合适的溶液和材料。
在一些实施方式中,可以通过将旨在调节所述器官和/或组织的一种或多种小分子或大分子、成分或物质纳入到已知系统和溶液而实现本发明的方法,所述已知系统和溶液,如购白Organ Recovery Systems的KPS-1TM和SPS-1TM,和/或Brasile和Taylor专利中所教导的(Brasile的美国专利号5,643,712;5,699,793;5,843,024;以及Brasile等人的美国专利号5,599,659;5,702,881;Taylor的美国专利号5,405,742和5,514,536,其全文通过引用纳入本文),对于器官获取、保存和移植过程的不同阶段要求完全不同的组合物。
另一方面,本发明方法的实现可以通过将旨在调节所述器官和/或组织的一种或多种小分子或大分子、成分或物质纳入到一种或两种(或任选地更多种)基本组合物中(如Taylor的美国专利号6,994,954和6,492,103中公开的基本组合物,其全文通过引用纳入本文),和通过在一种或多种所述基本组合物添加多种不同的添加剂产生特定组合物,这些特定组合物对于器官或组织的获取、保存和移植的特定阶段都是有用的。在一些实施方式中,可以将基本溶液和添加剂(例如,包括旨在调节所述器官和/或组织的小分子或大分子、成分或物质)储存在单独包装或药盒中的单个容器中。在一些实施方式中,在上述溶液和/或组合物中可以存在足够量的至少一种分子、成分或物质以保证完整的补覆盖和基本消除细胞损伤。
包括旨在调节所述器官和/或组织的一种或多种小分子或大分子、成分或物质的基本配方可以包括一种设计,所述设计考虑了可以对应用的全部或需要的子集标准化的生物物理和最小生物化学成分。然后可以使用这样的溶液作为载剂的一系列添加“混合物”,包括旨在调节所述器官和/或组织的一种或多种小分子或大分子、成分或物质,以得到溶液系统,其中每个可以在器官保存、运输和移植期间的各个阶段中使用,根据不同的需求最优化。在一些实施方式中,在基本溶液中可以存在足够量的至少一种分子、成分或物质以保证完整的补覆盖,并且基本消除了细胞损伤。
在一些实施方式中,用于热缺血时间-器官保存的溶液可以包括将至少一种分子、成分或物质(可以是或可以不是相同的分子、成分或物质)添加到,例如,一种或多种以下溶液中:低温灌流/净化溶液、低温灌注液/维持溶液、常温灌注液/拯救溶液和/或再植入前灌流/漂洗溶液。在一些实施方式中,在移植过程之前和/或移植过程期间,可以将包括至少一种分子、成分或物质(可以是或可以不是相同的分子、成分或物质)的上述溶液中的一种或多种灌注通过供体器官。
例如,示例性实施方式可以包括将至少一种分子、成分或物质(如预定生物标志物或已知影响预定生物标志物的分子)添加到以下基本溶液中:
胞内基本溶液:冷储存的最小要求包括冷冻保存溶液。(下面)表2中给出这样的溶液的示例性配方。
胞外基本溶液:胞浆样电解质作为最优化的“常温”灌注必需的携氧分子和其它基材的基础。
示例性实施方式可以包括,例如,将至少一种分子、成分或物质添加到以下基本加添加溶液中:
净化溶液=胞外基本溶液加净化添加剂(“混合物”),设计成主要净化除去准备中的血管的血,用于保存。
维护溶液=胞内基本溶液加细胞保护添加剂(“混合物”),设计成保护和维持冷储存期间的细胞稳定性。理想地,这将应用于静态冷储存和冷机器灌注两者。
拯救溶液=胞外基本溶液加拯救添加剂(“混合物”),用于对近常温灌注。
漂洗溶液=胞外基本溶液加漂洗添加剂(“混合物”),设计成在再植入之前冲洗不需要的保存分子。这可以设计成与在保存阶段之前移除红细胞和其它血成分的净化溶液实现不同的作用。
低温溶液=浓缩的胞内基本溶液加渗透或不渗透的低温保护添加剂,用于细胞和组织的零度以下保存。对于低温溶液的实施方式,胞内基本溶液与单独使用和与大多数其它的添加剂联用相比,优选浓缩至3×到4×强度。这促进了它与添加的抗冻保护化合物的组合。
在一些实施方式中,在正在以有效的和/或足够的量灌注的溶液和/或组合物中存在至少一种分子,从而确保所述分子完全覆盖所述器官或组织,和/或使预定生物标志物的水平返回到适于移植的器官的标准范围之内。在一些实施方式中,正在以有效的和/或足够的量灌注的溶液和/或组合中存在至少一种成分或物质,以:(1)确保所述器官或组织的完全补覆盖(例如,器官或组织响应所述成分或物质产生的实体),以及(2)基本防止和/或完全防止细胞损伤。在一些实施方式中,通过以有效的和/或足够量的灌注技术给予至少一种分子、成分或物质以确保用所述成分或物质将所述器官或组织完全覆盖,和/或使预定生物标志物的浓度返回到适于移植的器官的标准范围内。在一些实施方式中,通过以有效的和/或足够的量的灌注技术给予至少一种成分,以(1)确保所述成分完全覆盖器官或组织,以及(2)基本防止和/或完全防止细胞损伤。
在一些实施方式中,本发明的方法包括在预定的时间间隔用一种或多种本发明所述的溶液(所述溶液可以包括至少一种分子、生物标志物、成分或物质)灌注器官或组织(下文也称之为“供体器官”)。例如,本文使用的“溶液”包括任何溶液,如基本灌注溶液,除非另外具体地限定。在一些实施方式中,将多种不相同的溶液灌注到供体器官中,其中灌注到供体器官中的至少一种溶液包含影响至少一种生物标志物的至少一种分子、成分或物质,例如,通过增加或减少生物标志物的浓度(或水平)来影响。在一些实施方式中,在移植过程之前和/或移植期间将多种不相同的溶液灌注到供体器官中。在一些实施方式中,灌注到器官中的每种溶液可以包含相同的分子、成分或物质。
在一些实施方式中,将多种不同溶液灌注到供体器官中且灌注到所述器官中的不同溶液中每一种包含与包含在其它溶液中的小分子或大分子、成分或物质(会影响不同的生物标志物,例如,诸如通过增加或减少生物标志物的浓度来影响)不同的小分子或大分子、成分或物质(旨在影响不同的生物标志物,例如,通过增加或减少生物标志物的浓度来影响)。在一些实施方式中,灌注到所述器官中的至少一种溶液包含第二种小分子或大分子、成分或物质和/或第三、第四、第五种等,它们彼此不同,和/或与任何其它溶液中的小分子或大分子、成分或物质的组合不同。
在一些实施方式中,在供体器官发生任何冷却之前向供体器官引入和/或灌注溶液,在所述溶液中包括对预定生物标志物的浓度或外观/出现可能有影响或可能没有影响的至少一种分子、成分或物质。在一些实施方式中,在将供体器官冷却到预定温度之前(如将所述器官冷却到温度低于约15℃之前,或将所述器官冷却到温度低于约10℃之前,或将所述器官冷却到温度低于约5℃之前,或将所述器官冷却到温度低于约0℃之前)引入和/或灌注供体器官的溶液中包括至少一种分子、成分或物质。
在一些实施方式中,在将供体器官维持在中温和/或常温的预定温度范围时,如从约10℃到约37℃,或从约15℃到约37℃,或从约20℃到约37℃,或从约20℃到约30℃,或从约20℃到约25℃时,仅引入或灌注供体器官的溶液中可以包括对预定生物标志物的浓度或外观/出现可能有影响或可能没有影响的至少一种分子、成分或物质。
在一些实施方式中,在将器官维持在低温和/或中温的预定温度范围时,如从约0℃到约20℃,或从约10℃到约20℃,或从约10℃到约15℃,或从约0℃到约15℃,或从约0℃到约10℃,或从约0℃到约5℃,或在小于0℃的温度时,仅引入和/或灌注供体器官的溶液中可以包括对预定生物标志物的浓度或外观/出现可能有影响或可能没有影响的至少一种分子、成分或物质。
在一些实施方式中,在将供体器官冷却之后,如已经将器官冷却到低于约15℃的温度之后,或已经将器官冷却到低于约10℃的温度之后,或已经将器官冷却到低于约5℃的温度之后,或已经将器官冷却到低于约0℃的温度之后,引入和/或灌注供体器官的溶液中可以包括对预定生物标志物的浓度或外观/出现可能有影响或可能没有影响的至少一种分子、成分或物质。
在一些实施方式中,所述供体器官不暴露于对预定生物标志物的浓度或外观/出现可能有影响或可能没有影响的小分子或大分子、成分或物质中,直到已经将所述器官冷却到预定温度,如低于约20℃的温度,或低于约10℃的温度,或从约0℃到约10℃的温度,或低于约0℃的温度。在这样的实施方式中,在用不含旨在调节所述器官和/或组织(如上所述)的小分子或大分子、成分或物质的一个或多个保存溶液灌注供体器官使供体器官冷却之后,初始引入和/或灌注通过供体器官的溶液中包括至少一种分子、成分或物质。例如,在将供体器官冷却之后(如通过用不含旨在调节所述器官和/或组织的小分子或大分子、成分或物质的不同保存溶液灌注所述供体器官)到低于约15℃的温度,或在已经将所述器官冷却到低于约10℃的温度之后,或在已经将所述器官冷却到低于约5℃的温度之后,或在已经将所述器官冷却到低于约0℃的温度之后,初始引入和/或灌注供体器官的溶液中包括至少一种分子、成分或物质。在另外的实施方式中,在将供体器官冷却之前,用含旨在调节器官和/或组织的至少一种小分子或大分子、成分或物质的溶液灌注所述器官。
在一些实施方式中,在重新升温过程期间,例如,如在器官已经冷却之后发生的重新升温过程,如器官已经冷却到预定温度之后,引入和/或灌注通过供体器官的溶液中可以包括对预定生物标志物的浓度或外观/出现可能有影响或可能没有影响的至少一种分子、成分或物质。
在一些实施方式中,在已经将器官冷却到预定温度之后发生的重新升温过程期间,初始引入和/或灌注通过供体器官的溶液中可以包括对预定生物标志物的浓度或外观/出现可能有影响或可能没有影响的至少一种分子、成分或物质。在特定的实施方式中,供体器官不暴露于旨在调节所述器官和/或组织的小分子或大分子、成分或物质,直到所述供体器官经历发生在器官已经冷却到预定温度(如低于约20℃的温度、或低于约10℃的温度、或从约0℃到约10℃的温度、或低于约0℃的温度)之后的重新升温过程。在一些实施方式中,所述供体器官不暴露于旨在调节所述器官和/或组织的小分子或大分子、成分或物质中,直到发生重新升温过程,并且在重新升温过程期间用包括至少一种分子、成分或物质的溶液灌注所述器官,同时使所述供体器官维持在从约0℃到约37℃的温度下,如从约10℃到约37℃的温度、或从约20℃到约37℃的温度。
在一些实施方式中,所述溶液包含至少一种分子、成分或物质的有效量,以保护组织免受损伤。在一些实施方式中,所述溶液包含至少一种分子、成分或物质的有效量,以防止或基本防止移植物功能延迟恢复、缺血/再灌注损伤的有害影响,包括炎症反应和/或其它可能伤害器官或受体的有害反应。在一些实施方式中,所述溶液包含至少一种分子、成分或物质的有效量,以防止或基本防止移植物功能延迟恢复、缺血/再灌注损伤的有害影响,包括炎症反应和/或其它可能伤害器官或受体的有害反应,这包括突发或加强来自受体的具有降低移植物和/或受体的短期和/或长期健康和正常功能潜力的免疫反应。
在一些实施方式中,对预定生物标志物的浓度或外观/出现可能有影响或可能没有影响的至少一种分子、成分或物质占溶液总重量的约0.000001%到约0.5%(此处和整个说明书中使用的术语溶液是指基本灌注溶液),如基本灌注溶液总重量的约0.00001%到约0.1%,或基本灌注溶液总重量的约0.0005%到约0.05%。在一些实施方式中,溶液(如上所述,这可以是基本灌注溶液)中可以存在量大于约0.01μg/ml的(如量大于约0.1μg/ml的、或量大于约1μg/ml的、或量大于约10μg/ml的、或量大于约200μg/ml的)对预定生物标志物的浓度或外观/出现可能有影响或可能没有影响的至少一种分子、成分或物质。在一些实施方式中,溶液(如上所述,这可以是基本灌注溶液)中可以存在量从约0.01μg/ml到约500μg/ml的(如量从约0.1μg/ml到约150μg/ml的、或量从约1μg/ml到约100μg/ml的、或量从约10μg/ml到约50μg/ml的)对预定生物标志物的浓度或外观/出现可能有影响或可能没有影响的至少一种分子、成分或物质。
在一些实施方式中,可以将包括对预定生物标志物的浓度或外观/出现可能有影响或可能没有影响的至少一种分子、成分或物质的上述溶液灌注到器官或组织中直到所述器官或组织中存在至少一种分子、成分或物质的要求剂量(如有效的剂量),以防止和/或保护组织免受损伤。在一些实施方式中,可以将包括对预定生物标志物的浓度或外观/出现可能有影响或可能没有影响的至少一种分子、成分或物质的上述溶液灌注到器官或组织中直到在所述器官或组织中存在至少一种分子、成分或物质的均匀分布,其理想效果是在移植后,给予了至少一种分子、成分或物质的器官不太可能经历移植物功能延迟恢复、缺血/再灌注伤害的有害效应,如炎症反应和/或其它可能伤害器官或受体的有害反应,包括突发或增强来自具有降低对移植物和/或受体短期和/或长期健康以及正常功能潜力的受体的免疫反应。
在一些实施方式中,通过以有效量灌注来给予至少一种分子、成分或物质以防止和/或保护组织免受损伤。在一些实施方式中,通过以有效量灌注来给予至少一种分子、成分或物质以防止和/或基本防止移植物功能延迟恢复、缺血/再灌注伤害的有害效应,包括炎症反应和/或其它可能伤害器官或受体的有害反应。在一些实施方式中,通过以有效量灌注来给予至少一种分子、成分或物质以防止或基本防止移植物功能延迟恢复、缺血/再灌注伤害的有害效应,包括炎症反应和/或其它可能伤害器官或受体的有害反应(包括突发或增强具有降低对移植物和/或受体短期和/或长期健康以及正常功能潜力的受体的免疫反应)。
在一些实施方式中,如需要在灌注期间可以任何方式作出对存在于溶液中的至少一种分子、成分或物质的浓度的改变,如通过逐步改变、或梯度改变,其中各成分浓度逐渐增加到要求的浓度、或减小到要求的浓度、或减小到从正在灌注的溶液中消除的点。
在一些实施方式中,本文所述的方法利用HMP和HBS以及与PFC氧合的优点的技术组合来产生混合技术,所述混合技术解决具有全氟化合物层的静态冷储存方法的问题。作为乳液传送PFC的基线介质或灌注液的选择也要求考虑在低温条件下,对相应细胞(例如,胰腺细胞、心肌细胞等)保存的最优化选择是什么。为此,本发明包括包含设计成低温血液代用品的至少一种分子、成分或物质的保存溶液的制备。
作为保存介质的低温血液代用品:传统上,已经开发了多种器官保存溶液。Brasile的美国专利号5,643,712、5,699,793、5,843,024以及Brasile等人的美国专利号5,599,659、5,702,881,描述用于组织和器官的单独的复苏和保存溶液,其全文通过引用纳入本文。Brasile的专利公开了可以添加至少一种分子、成分或物质的组合,如果需要的话,可以用于本发明的方法中。
Taylor等人已经配制和评估称为HypothermosolTM-净化(HTS-P)和HypothermosolTM-维持(HTS-M)的两种溶液。这些溶液的一些方面描述于Taylor的美国专利号5,405,742和5,514,536,两者的公开内容通过引用全文纳入本文。Taylor的专利公开了可以添加至少一种分子、成分或物质的组合,如果需要的话,可以用于本发明的方法中。
溶液例如家族溶液的保护特性(描述于Taylor的美国专利号6,492,103和6,994,954,标题为“System for organ and tissue preservation andhypothermic blood substitution(用于器官和组织保存以及低温血液替代的系统)”,其公开内容通过引用全文纳入本文)可以用于本发明的方法中。在一些实施方式中,如需要Unisol可以与旨在调节所述器官和/或组织的至少一种小分子或大分子、成分或物质混合,并且除了细胞保护添加剂之外,Unisol也可以用作乳化PFC以明显地增加其氧输送能力的载剂溶液。
在一些实施方式中,所述灌注溶液可以是设计成在最低温度(<10℃)低温暴露中“维持”细胞完整性的高血钾“胞内型”溶液。在一些实施方式中,这样的溶液可以包括旨在调节所述器官和/或组织的至少一种小分子或大分子、成分或物质。
在一些实施方式中,可以通过添加如细胞保护剂之类的小分子或大分子生物标志物来补充这些基线灌注液的组合物。例如,这样的生物标志物可以是显示低温保存功效的添加剂,并且因此在机器灌注期间它们很可能对供体器官保存的质量具有正面影响,如抗氧化剂、抗细胞凋亡剂和营养因子。
抗氧化剂:作为各种组织伤害(尤其是微血管伤害)的介导物,氧自由基(ODFR)已经是注意的焦点。在冷储存期间,有可能增加伤害性自由基的产生,应理解的是,所产生的细胞损伤可能不完全在低温下发生。相反地,存在愈来愈多的证据表明在重新升温和再灌注时,经由正规血液供应再引入的氧合提供了进一步氧化应激的有力推动因素。主要的途径是通过酶驱动自由基反应的刺激,如参与ATP分解代谢产物与分子氧的交互作用的黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶系统。血管内皮细胞被认为对于通过所谓的“呼吸爆发”机制产生的自由基引入的这种类型的伤害是特别脆弱的。但是,低浓度分子氧,如溶解在器官保存溶液中的那些氧,可以在延长储存期间充分支持自由基的产生。因此,没有抗氧化剂的适当平衡,作为在低温期间发生的反应和过程的结果,冷暴露可能提供了组织损伤的逐渐发展。在供体细胞和器官中作为这样的反应和过程的结果而出现的分子(或生物标志物)的存在构成可以通过本发明的方法监测的一种形式的生物标志物(这样的生物标志物可以包括在低温和/或其它条件期间发生的反应和过程的结果而产生的分子,所述其它条件可以损伤用于移植的组织或器官或使之不适于移植)。
在一些实施方式中,可以存在足够量的抗氧化剂生物标志物来基本消除细胞损伤和/或氧化应激。
当细胞使用多种修复机制从作为自由基活动的结果而发生的损伤中恢复时,细胞存活取决于在储存/激活过程期间补救途径是否不堪重负或是否到达了不可逆的损坏点以致细胞死亡变得不可避免。因此,在一些实施方式中,在低温和常温两种条件下,选择抗氧化剂及其量来规避氧化应激和再灌注伤害。示例性抗氧化剂生物标志物可以包括二丁酰基-cAMP(db-cAMP)、α-生育酚(维生素E)、TroloxTM、以及低温加上EDTA和维生素E两者。
抗细胞凋亡剂:虽然已报道了已知导致坏死细胞死亡的许多多样化的应激会在多种细胞中诱发细胞凋亡,最近才开始显现出低温作为程序化细胞死亡的可能刺激物的作用。现在已经证实,在由低温和超低温保存两者的严酷条件而诱发的细胞死亡中,细胞凋亡起到了不可或缺的作用。更具体地,已经确定细胞凋亡与迟发性细胞死亡(DOCD)直接相关,其定义为与冷暴露相关的死亡,在重新升温后并不立刻显著,但在暴露后恢复周期中继续。对低温诱发的DOCD负责的致病细胞凋亡和坏死途径的最近研究已经确定多个细胞凋亡途径的贡献,包括受体和线粒体-诱发的细胞凋亡。对于这些途径、它们的进展以及它们的诱发应激的研究已经开始促进通过调整保存下(低温和超低温两者)的细胞的细胞反应和分子反应来提高保存功效的新方法。
目前已报道,在保存介质中特定凋亡蛋白酶抑制剂的纳入显著提高多种细胞和组织的生存率。此外,对于从有或没有冷冻保护剂的标准胞外-型培养基到特别设计的胞内-型保存溶液(如UnisolTM或其先导Hypothermoso1)的运载体介质的改造研究已经显示出保存功效重大提高。
可以从拥有已识别的抗氧化活性的生物标记物中选择抗-细胞凋亡生物标志物,并且因此表明了抗-细胞凋亡活性。例如,还原性谷胱甘肽在两个配方中是作为多面分子(这还已知为在细胞凋亡的调整中完成自然的角色)的成分,而已经显示米酵菌酸(BA)为细胞凋亡期间形成的线粒体通透性转换(PT)孔的强效抑制剂。此外,BA可以抑制受Bax(促凋亡蛋白85)影响的细胞色素c释放。已经显示出BA(PT的稳定的抑制剂)在病毒感染之后增加细胞活力和蛋白产生水平。对于胱冬酶的抑制,多种化合物已经显示出对培养中的哺乳动物细胞是有效的。其它示例性的化合物包括:P35(它对大量胱冬酶给于不可逆的抑制)以及Z-VAD.fmk(或其最新的广谱对应物,Q-VD-OPH),它有能力抑制内在途径和外在途径。
营养因子:在非常低的温度下许多细胞信号途径保持活性,并且可以受到给予营养因子的影响。营养因子耗竭打乱了细胞功能的许多方面,并且众所周知其在多种培养细胞中诱发细胞凋亡和细胞死亡。通过在冷储存期间而不仅由在重新升温和再灌注期间存在的与所述组织互相作用来影响冷缺血性损伤,营养因子补充(TFS)导致肾储存中显著改善的结果。例如,可以使用的示例性营养因子生物标志物包括胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、表皮生长因子(EGF)、牛嗜中性粒细胞肽-1(BNP-1),也称为bactenecin98,P物质(SP)(它对于多种细胞类型具有促有丝分裂的效果并且刺激眼部细胞系中的DNA合成),EGF(一种多肽生长因子,它的效果可以与其它生长因子和细胞因子相加或协同利用),以及胰岛素样多肽生长因子(IGF),如IGF-1。
在器官获取、储存和/或移植期间增加传送到组织的氧以及PFC的作用:开发出所述“维持”溶液,并且在温度范围7-10℃测试,所述温度范围确证了如果通过连续灌注维持充分O2供应,能重新建立ATP逆转。例如,已经建议了多个研究,在如肝之类的器官的低温保存期间,氧供给是必需的。
在0-2℃冷冻保存器官(如传统静态冷冰保存)期间腺嘌呤核苷酸的快速耗尽可以提示低温严重削弱了线粒体功能。在灌注期间可能需要维持O2水平以保证最高级的供体器官,并且在本发明的方法中使用PFC可以使得这能够实现。
PFC是所有或大部分氢原子用氟取代(即全氟化碳)的烃。其有两倍的水密度,和用于溶解呼吸道气体的高容量。PFC中溶解氧的溶解度比血液或水高约25倍。根据亨利定律,PFC释放氧的能力不受温度显著影响,使其理想用于低温器官保存期间的氧输送。近期的证明也支持这个观点:在用于系统氧合的腹膜灌注应用中需要全氟化碳的气体溶解和气体卸载特性,因为当用单独盐水溶液作为灌注液时,不能获得相同的效果。
在一些实施例中,所述PFC可以拥有一种或多种以下品质:(1)溶解大量的许多种气体的能力;(2)可以传送这些气体使之在整个距离上扩散;(3)是无毒的;(4)是生物上惰性的;(5)室温下的生物稳定液体。在一些实施方式中,可以选择具有约1.5-2.0g/mL的密度以及氧和二氧化碳的高可溶性的PFC。
在一些实施方式中,为了如保存和运输等多个原因,可以将供体组织冷却到足够的温度以减弱代谢,如从约15℃到约-20℃的温度,如从约10℃到约-10℃,或从约10℃到约0℃的温度。在一些实施方式中,冷却速率可以从约0.5℃/分钟到约5℃/分钟。在一些实施方式中,可以从约1℃/分钟到约20℃/分钟,如从约6℃/分钟到约15℃/分钟的冷却速率来冷冻和/或冷却所述供体组织。
在一些实施方式中,在所述供体组织升温期间,供体组织的冷却速率与快速升温速率偶联(如上述冷却速率乘以至少1.5的一个因数,如范围从1.5到10的一个因数,如2、或3、或4、或5的一个因数)。在一些实施方式中,可以通过直接浸没在热介质(如渗透缓冲介质)中而实现供体组织的升温。
表3中列出可以使用的其它添加剂的例子,虽然还可以使用许多其它的添加剂。
表1中总结了对于临床器官保存程序可以向其中添加至少一种分子、成分或物质的示例性溶液。
表1.临床器官保存程序的溶液设计策略
表2.统一的溶液系统胞内基本溶液(高钾)的配方
表3.用于保存介质的示例性生化和药物添加剂
与包括HypothermosolTM的已知技术相比,在本发明方法的组合物和系统的设计中,已经纳入了成分及其相应浓度的组合中的大量改进。
以下展示了胞内基本溶液和胞外基本溶液的示例性水性制剂,在该制剂中可以添加至少一种分子、成分或物质(以及其它添加剂)。所述制剂基本可以包含所列出的大致量。
示例性胞内基本溶液
离子
40-80mM Na+:
50-90mM K+:
0.01-0.1mM Ca++:
5-25mM Mg++:
20-40mM C1-;
pH缓冲液
1-5mM H2P04:
3-7mM HCO3;
25-50mM HEPES:
不透性溶质
25-50mM乳糖酸盐;
10mM-1M蔗糖;
15-30甘露醇;
1-10葡萄糖;
50-100葡萄糖酸盐;
胶体
6%葡聚糖40;
药物
0.1-2mM腺苷;和
1-5mM谷胱甘肽。
高钾示例性胞内基本溶液离子
62.5mM Na+;
70.0mM K+:
0.05mM Ca++;
15.0mM Mg++:
30.1mM C1-:
pH缓冲液
2.5mM H2PO4:
5.0mM HCO3:
35.0mM HEPES:
不透性溶质
30.0mM乳糖酸盐;
15.0mM蔗糖;
25.0mM甘露醇;
5.0mM葡萄糖;
70.0mM葡萄糖酸盐;
胶体
6%葡聚糖40;
药物
2.0mM腺苷;和
3.0mM谷胱甘肽。
这种示例性胞内基本溶液具有350的渗透压(mOsm/Kg);约7.6的H;以及约2100的[K+][C1-]。
低钾示例性胞内基本溶液
离子
100-150mM Na+:
15-40mM K+:
0.01-0.1mM Ca++:
5-25mM Mg++:
20-40mM C1-;
pH缓冲液
1-5mM H2PO4:
3-7mM HCO3:
25-50mM HEPES:
不透性溶质
25-50mM乳糖酸盐;
10mM-1M蔗糖;
15-30mM甘露醇;
1-10mM葡萄糖;
50-100mM葡萄糖酸盐;
胶体
6%葡聚糖40;
药物
0.1-2mM腺苷;和
1-5mM谷胱甘肽。
示例性低钾胞内溶液
离子
125mM Na+:
25.0mM K+:
0.05mM Ca++;
15.0mM Mg++:
30.1mM C1-:
pH缓冲液
2.5mM H2PO4:
5.0mM HCO3:
35.0mM HEPES:
不透性溶质
30.0mM乳糖酸盐;
15.0mM蔗糖;
25.0mM甘露糖;
5.0mM葡萄糖;
70.0mM葡萄糖酸;
胶体
6%葡聚糖40;
药物
2.0mM腺苷;和
3.0mM谷胱甘肽。
示例性胞外基本溶液
离子
120-160mM Na+:
3-9mM K+:
1-3mM Ca++:
1-10mM Mg++:
100-150mM C1-:
1-10mM(SO4)2-;
pH缓冲液
1-3mM H2PO4:
20-30mM HCO3:
5-15mM HEPES:
不透性溶质
5-10mM葡萄糖;
胶体
6%葡聚糖40;
药物
0.1-2mM腺苷;和
1-5mM谷胱甘肽。
示例性胞外基本溶液
离子
141.2mM Na+;
6.0mM K+;
1.5mM Ca++:
5.0mM Mg++:
122.0mM C1-;
1.0mM SO4 -;
pH缓冲液
1.2mM H2PO4;
25.0mM HCO3;
25.0mM HEPES:
不透性溶质
5.0mM葡萄糖;
胶体
6%葡聚糖40;
药物
1.0mM腺苷;和
3.0mM谷胱甘肽。
这种示例性胞外基本溶液具有315的渗透压(mOsm/Kg);约7.5的pH;以及约732的[K+][C1-]。
如上所述,根据溶液的最终使用(用于连续的、或间歇的器官灌注的灌注液),用于器官保存的溶液的策略设计已经不同。作为独特方法,本发明的方法是为了改进机器灌注保存技术而开发的,其包括将至少一种分子、成分或物质添加到本文所述的各种溶液中。已经尝试在基本溶液(包括旨在调节所述器官和/或组织的至少一种小分子或大分子、成分或物质)的配方中组合有效溶液(如低温溶液)的主要特性,并且可能的话,其中包括旨在调节器官和/或组织的小分子或大分子、成分或物质的成分,其可以实现已经选择的多个作用。例如,可以将包括至少一种分子、成分或物质的胞外基本溶液与各种不同的添加剂组合以形成净化溶液、器官拯救溶液、植入前漂洗液等。该策略使机器灌注保存过程的固有品质最高。
本发明的方法包括向需要的供体器官给予有效量的本文所述的一种或多种组合物,来影响预定生物标志物的存在或丰度。可以向所述组织或器官直接给予所述组合物。
例如,本文所述的方法还可以包括以下步骤:用有效量的脂质乳液接触所述组织或器官以避免在灌注期间对器官的损伤,同时监测、维持和/或恢复所述器官的活力以及保存所述器官用于储存和/或运输,如通过逆转抑制所述组织或器官的代谢的两亲化合物的影响。一般而言,在被移植到主体中之前,可以将所述组织或器官与脂质乳液接触。另外,可以在移植到主体中之后发生所述组织或器官与脂质乳液的接触。当然,在植入过程期间、以及之前、植入到主体期间或之后,可以将所述组织或器官与脂质乳液接触。
在一些实施方式中,合适的溶液可以包含可逆代谢抑制剂,以在从正常体内循环移除器官时保护组织和器官不受酸中毒、氧化损伤、缺血和再灌注伤害的影响。可逆意味着通过用第二化合物或组合物接触所述组织或器官,所述组织或器官上的化合物或组合物的代谢抑制活性可以被抑制或去除。可逆代谢抑制剂可以包括两亲化合物,其通过脂质乳液的去除或失活而实现逆转。在一些实施方式中,所述两亲代谢抑制剂是局部麻醉剂。示例性局部麻醉剂可以拥有产生麻醉剂亲脂性的脂肪侧链,并且能够透过细胞膜。示例性麻醉剂包括,但是不局限于,布比卡因、左布比卡因、依替卡因、罗哌卡因和丁卡因。
用有效量的这些可逆代谢抑制剂处理的器官和/或组织可以承受严重缺氧,例如,因为损伤的动脉灌注,而不发生预期的组织酸中毒。在一段时间之后,例如,通过给予脂质输注,可以逆转所述组织或器官上的局部麻醉剂的代谢和其它效果。在一些实施方式中,脂质输注适于注射并且包括如此大小的脂质滴,这些脂质滴可以越过毛细血管床而不会限制血液流动。例子包括豆油或其它来源的甘油三酯的乳液。
在一些实施方式中,所述方法还包括以下步骤:给予有效量的脂质乳液,来逆转所述组织或器官上的两亲剂(例如,亲脂性局部麻醉剂)的作用。可以在本发明的方法中使用的示例性脂质乳液包括美国专利号5,286,728、5,585,399、7,560,486以及美国专利申请公开号2002/0094949、2004/0038891和2006/0166182,其全文通过引用纳入本文。
例如,可以在灌注溶液药盒中提供灌注溶液,可售的包装优选包含保持灌注的第一温度模式的第一灌注溶液的至少一个第一容器,以及包含保持灌注的第二温度模式(可以与或可以不与第一温度模式的温度相同)的第二且不同的灌注溶液的至少一个第二容器,任选地,图2所述的盒子10。
所述第一灌注溶液可以包含如上所述的至少一种氧运载体。任选地,所述第二灌注溶液可以是非充氧的,和/或可以包含根据信息选择的至少一种生物标志物,所述信息涉及:(1)当从器官转运器、灌注设备、盒子、以及器官诊断设备中的至少一个装置中保存、运输和/或储存至少一个相同的或不同的器官时,监测的一种或多种预定生物标志物的一个或多个定性和/或定量关系,以及(2)当在至少一个相同或不同的装置中运输和/或储存至少一个相同或不同的器官时发生的事件,其中所述信息与涉及运输和/或储存的至少一个相同或不同的器官的移植结果的结果数据进行交叉参考。
在一些实施方式中,可以配制这样的溶液使其包含不超过5mM的溶解的丙酮酸盐。同样,可以配置第一容器和第二容器使之可操作地连接到灌注机器,作为与所述灌注机器的灌注液导管流体连通的灌注液储器。此外,第一容器和第二容器之一可以是可压缩的,以向其中的灌注溶液提供压力。此外,第一容器和第二容器中的至少一个可以包括作为所包含灌注溶液输出通道的第一开口以及作为压缩气体进入容器的通道的第二开口。所述包装可以是一个盒子,所述盒子配置成可操作地连接到灌注机器,使得盒子中第一容器和第二容器与灌注液导管或灌注机器的管子以流体连通的方式连接。
在其它实施方式中,所述灌注溶液药盒可以包含保持用于在第一温度下灌注的第一灌注溶液的至少一个第一容器,以及保持低于第一温度的第二温度下灌注的第二且不同的灌注溶液的至少一个第二容器。在一些实施方式中,(至少部分)根据信息选择第一温度和第二温度,所述信息涉及:(1)当从器官转运器、灌注设备、盒子、以及器官诊断设备中的至少一个装置中保存、运输和/或储存的至少一个相同或不同的器官时,监测的一种或多种预定生物标志物的一个或多个定性和/或定量关系,以及(2)当在至少一个相同或不同的装置中运输和/或储存至少一个相同或不同的器官时发生的事件,其中将所述信息与涉及运输和/或储存的至少一个相同或不同的器官的移植结果的结果数据进行交叉参考。
此外,如果需要的话,第一灌注溶液和/或第二灌注溶液可以包含(至少部分)根据信息选择的至少一种生物标志物,所述信息涉及:(1)当从器官转运器、灌注设备、盒子、以及器官诊断设备中的至少一个装置中保存、运输和/或储存的至少一个相同的或不同的器官时,监测的一种或多种预定生物标志物的一个或多个定性和/或定量关系,以及(2)当在至少一个相同或不同的装置中运输和/或储存至少一个相同或不同的器官时发生的事件,其中将信息与涉及运输和/或储存的至少一个相同或不同的器官的移植结果的结果数据进行交叉参考。在一些实施方式中,所述第二溶液包含不超过5mM的溶解的丙酮酸盐。如上述,可以配置第一容器和第二容器使之可操作地连接到灌注机器,如灌注液储器与所述灌注机器的灌注液导管流体连通。此外,第一容器和第二容器之一是可压缩的,以向其中的灌注溶液提供压力。此外,第一容器和第二容器中的至少一个可以包括作为所包含灌注溶液输出通道的第一开口以及作为压缩气体进入容器的通道的第二开口。所述包装可以是一个盒子,所述盒子配置成可操作地连接到灌注机器,用于盒子中第一容器和第二容器与灌注液导管或灌注机器的管子以流体连通方式连接。
通过与储器10进行热传递交换的第一热电单元30a使储器10中的药液达到预定温度。
温度传感器T3将储器10中的温度传递到微处理器150,微处理器150调节热电单元30a以维持储器10中要求的温度和/或在控制和显示区域5a上显示温度以便手动调节。或者优选地,当要运输器官灌注装置时,可以利用已知的低温流体换热器设备来冷却低温灌注液储器中的药液。
提供支撑盒子65的器官箱40,如图2所示。在转运器中的传感器可以检测转运器中盒子的存在,并且依赖于传感器,可以从可能与盒子65一体的条形码或射频或其它智能标记读出器官的身份。这允许自动识别和跟踪所述器官,并且帮助监测和控制监管链。可以把全球定位系统添加到转运器和/或盒子65中,以促进对所述器官的跟踪。在运输过程中,可以通过硬件连接到局域网或通过无线通信使转运器通过接口连接到计算机网络。这个接口能够实现实时跟踪和显示灌注参数、血管阻力以及器官鉴定以及转运器和盒子位置,或捕获这些以供将来分析。
可以使用各种已知数据结构和信息连接辅助可能在器官移植之前、期间和之后有益的整个通信和数据传递。可以把灌注设备、转运器、盒子、以及器官诊断设备连网,以允许远程管理、跟踪和监测所述器官或正在储存或运输的器官的位置以及治疗和诊断参数。可以使用信息系统来编译器官运输和储存的历史数据,并且用医院和UNOS数据提供关于供体和受体的交叉参考。系统还可以提供结果数据,以允许进一步开发和选择相对于移植结果的生物标志物和灌注参数。
数据记录可以包括有关供体的信息,其可以在从供体取得器官的位置输入。还可以从灌注、诊断或转运器设备中直接取得,以监测器官状态和位置。可以将各种类型的信息组合成子-记录或子-目录,以辅助数据管理和传送。可以将所有的子-记录组合以形成总移植记录,可以由医师、科学家或其它机构传播或获取所述记录,以便跟踪和监测目的。
在一些实施方式中,转运器可以把许多或全部灌注过程数据、生物标志物数据以及转运器事件自动记录到内部数据库中。每个盒子的射频或条形码标记标签等允许转运器参考对每个器官唯一的数据。当转运器到达对接端口时,转运器可以通过LAN将数据上传到主数据库计算机中。任何时候当转运器连接到LAN时,转运器还可以提供实时状态。还可以用无线通信设定配置转运器,以在运输期间提供实时数据传送。还可以将灌注设备连接到LAN,并且可以连续和实时进行数据上传。所述数据可以与UNOS数据交叉参考,以利用关于器官识别、供体情况、供体后勤、受赠者后勤和受体结果的UNOS数据。可以在互联网上显示和获取数据,以实现从任意地点进行监测。
在灌注中,可以通过图2所示的、与器官箱40进行热传递交换的第二热电单元30b,将诊断和/或转运器设备、器官浴槽冷却到预定温度。另外,当要运输器官灌注装置时,能够利用如冰和水浴槽或低温流体换热器设备之类的热传递装置来冷却储器10中的药液。例如,在器官箱40中的温度传感器T2将器官60的温度传递给微处理器150,微处理器150调节热电单元30b,以维持要求的器官温度和/或在控制和显示区域5c显示温度以便手动调节。
在本发明的方法中,可以利用传统的药液袋和管子连接。所有的管子可以是一次性的、容易替换和可互换的。此外,可以用与所使用的药液兼容的材料来形成或涂覆所有管子,如无血栓形成的材料。可以用传统方法将管子连接到所述器官,例如,用缝线。所述管子可以包括管唇,以便连接到所述器官上。另外,插管可以与器官座(organ chair)联用或不与器官座连接使用。然而,具体的方法和连接取决于待灌注的器官的类型。
可以安装气泡检测系统以检测灌注液中的气泡。优选使用空气传感器和传感器板。传感器的输出激活除泡系统(如开电磁阀(open solenoidvalve)),以在引入器官之前从灌注液流排除气泡。像这个系统中的所有传感器和检测器那样,可以把气泡检测器设置在根据系统的特定参数或设计特性为有效的系统中的任何点。例如,可以将气泡检测器和除泡系统BD设置在三角阀205和压力传感器P1之间,如图1所示。
示例性氧合器可以是包括亲水涂层低孔隙率透氧膜的两级氧合器。一部分药液可以传输到传感器以便检测可以指示器官的活力的液体特性和生物标志物水平。这样的传感器与微处理器150进行通信,并且允许自动或人工评估器官的活力。在一些实施例中,根据传输的药液的pH水平,将如100%氧和95/5%氧/二氧化碳之类的两种气体之一置于膜的对侧。另一方面,可以提供将流出药液泵出器官箱40并且在返回浴槽之前通过传感器的另一个泵(未示出),或可以将活力传感器设置在灌注的溶液可以通过的任何管子上。在一些实施方式中,可以在已知的独立诊断设备和/或分析仪中分析所述液体特性。
可以使用检测到的药液特性和对生物标志物的监测来分析和确定器官的活力。可以分析单个的特性,或可以分析多个特性,以确定各种因子的效果。可以通过捕获所述器官的静脉流出来测量特性,并且将它与灌注液流入进行化学比较。可以直接捕获和测量静脉流出,或可以测量器官浴槽以在一个时间段上进行比较而提供液体特性的粗略估计。
在一些实施方式中,可以提供器官活力指数,其考虑了上面识别的多种监测的生物标志物中的一种或多种。所述器官活力指数可以是器官特异性的,或可以适用于各种器官。所述器官活力指数可以将监测的参数和生物标志物编译成可用于作出器官治疗决定和判定是否移植所述器官的诊断内容。可以自动(实时)产生器官活力指数,并且提供给医师。可以经由与灌注设备、转运器、盒子和/或器官诊断设备的连接而通过计算机产生所述器官活力指数。可以将如供体特定信息之类的另外的信息输入到在灌注设备、转运器、盒子和/或器官诊断设备现场处的一台计算机,或可以输入到远程计算机并且连接到灌注设备等。在一些实施方式中,可以从如局域网或互联网之类的计算机网络得到所述器官活力指数,用于快速比较、远程分析和数据储存。
所述器官活力指数提供每个生物标志物的测量值和正常范围。例如,在约5℃下,正常pH可以从7.00到8.00,如从7.25到7.75,或从7.50到7.60,而碱过量可以在从-10到-40的范围内,如从-15到-30,或从-20到-25。通过用选中的造成生物标志物值或测量值返回到预定可接受的正常范围内的灌注液灌注供体器官或组织,能够使正常范围外的测量值恢复为在保存期间和/或运输期间适于移植的器官的特征值。
所述指数还可以提供识别信息,如供体的年龄、性别、血型、以及任何扩展的标准;器官信息,如器官采集日期和时间、热缺血时间、冷缺血时间以及血管阻力;设备信息,如流速、泵已经运行的耗费时间和压力;以及其它识别,如UNOS数和主治医师。如果需要的话,所述指数还可以提供温度校正。
可以使用已知的器官诊断系统、传感器、活检方法以及分析方法来监测一种或多种生物标志物。这样的系统、传感器、活检方法以及分析方法可以使用计算机和分析仪。已知的器官评估仪可以同时连接到计算机和分析仪。示例性器官诊断系统可以与合适的显示器一起提供,以显示所述系统和器官的状态。器官评估仪可以具有灌注液箱和器官箱。任选地,连接所述分析仪与器官评估仪。示例性器官诊断系统提供器官的分析,并且可以与控制系统微处理器连接,并且可以快速地产生器官活力指数。
可以通过编程的单程灌注的流和温度以及直列自动分析产生所述器官活力指数。可以在多程系统中实施分析,虽然单程系统的有益方面在于可以用有限数量的传感器来配置系统,并且仅需要足够的灌注液来实施所述分析。单程灌注还允许具有已知和预定化学的灌注液流入器官。这增加了可以传送的灌注液的类型和含量的灵活性,可以按过程中的具体分析来定制和修改。
示例性器官评估仪可以具有灌注液箱以及器官箱。可以任选地隔绝器官箱,并且可以包括可拆卸的或可以是铰接的盖子。可以配置这样的器官箱以接受含有器官的盒子,任选地无需打开盒子或破坏盒子内部的无菌性。
在一些实施方式中,根据本发明的方法可以利用如上述的设备来灌注器官,以维持、监测和/或恢复器官的活力和/或运输和/或储存所述器官。器官活力的保存是成功的器官移植的一个关键因素。在从供体身体中摘除器官期间和/或储存和/或运输到受赠者身体期间,由于供体身体的疾病或伤害,用于移植的器官经常被剥夺氧(称为缺血)达较长时间。
本发明的方法利用有能力检测和监测一种或多种生物标志物(如至少两种、三种、四种、五种……十种生物标志物)的灌注、诊断和/或转运器设备。在一些实施方式中,一种或多种生物标志物的监测提供数据,这些数据可以与关于相同或不同生物标志物的数据库中编译的信息比较,以致根据在预定范围之外的任何相应的生物标志物测量值,可以(以实时)操纵和调节要移植的器官的最优细胞化学。一种或多种预定生物标志物的监测及其定性和/或定量关系可以向运输和/或保存供体器官的人发出警告,在如细胞死亡、对器官的缺血损害和/或再灌注伤害之类的不可逆的损伤发生之前,可能需要特定的灌注液来修复器官和恢复器官活力。另外,在监测、维持和/或恢复器官活力和保存用于储存和/或运输的器官时,在作出器官适于移植的决定之前或之后,所述供体器官可以暴露于设计成用于调节器官的含一种或多种生物标志物的灌注液,其效果是在移植后,给予所述灌注液的所述器官不太可能经历移植物功能延迟恢复、缺血/再灌注伤害的有害效应,包括炎症反应和/或其它可能伤害器官或受体的有害反应,包括突发或增强来自受体的降低移植物和/或受赠者短期和/或长期的健康以及正常功能的潜力的免疫反应。本发明的这样的方法可以防止细胞凋亡或程序性细胞死亡。此外,在由特定设备控制的条件下,通过灌注、诊断和/或转运器设备在器官中这样的生物标志物的灌注和分布可以中断、减少和/或逆转细胞凋亡。
在一些实施方式中,按照本发明的方法,可以通过机械的、物理的、化学的或遗传操纵和/或修饰离体处理器官或组织以治疗疾病和/或治疗损伤和/或增强所述器官或组织的特性。可以从第一身体摘除器官或组织的样本,在第一身体外修饰、处理和/或分析,并且返回到第一身体,或移植到第二身体。本发明的方法的优势在于它们延长了可以离体处理器官的时间,例如,延长了数小时或甚至数天或数周。
在一些实施方式中,可以使用本发明的方法向器官或组织提供含化学物和/或生物标志物的特定的溶液,或可以用来实施特定的处理,包括用含化学物和/或生物标志物的特定溶液冲洗或洗涤器官或组织。可以在从患者身上摘除并且在实施了需要的过程之后要返回到患者身上的组织或器官上实施离体处理。离体处理包括但是不限于对已经遭受一段时间的缺血和/或缺氧(apoxia)的组织或器官的处理。离体处理可以包括在器官上实施外科技术,如切割和缝合器官,例如,摘除坏死的组织。可以在体内组织或器官上实施的任何外科或其它处理技术也可以在离体的组织或器官上实施。例如,可以看到这样的离体处理的益处在于,在使用放疗或化疗治疗出现在器官中或其上的肿瘤时,在治疗期间防止病人的其它部分受到外源放疗或化疗。本发明的灌注和转运器设备还提供额外的时间,供医师在组织或器官上实施特定技术之前、期间和/或之后维持所述组织或器官。
器官移植的另一个考虑是为防止器官排异反应而可向受体给药的程度。在器官移植中,其它离体技术包括修饰器官以避免其激活受赠者的免疫系统以防止或减少器官排异反应,并且在器官移植之前、期间和/或之后限制或避免抑制受赠者免疫系统的需求,为的是增加受赠者对移植器官耐受度。例如,器官的修饰能促进受赠者身体将移植的器官识别为白体的。可以使用本发明的方法向器官传送生物标志物(如化学化合物、自然或修饰的抗体、免疫毒素、干细胞如间充质干细胞等),并且可以辅助所述器官吸附、吸收或代谢这样的物质,以增加所述器官不被排异的可能性。也可以通过阻断、杀死、消耗和/或防止同种异体刺激(a11ostimulatory)细胞(树突状细胞、过客白细胞、抗原呈递细胞等)成熟来屏蔽这些物质,使得受体的免疫系统不识别它或另外识别所述器官是白体的。可以在即将移植之前处理器官,或可以在移植前数小时、数天、数周预处理器官。
例如,还可以向器官或组织提供如修饰的或未修饰的免疫球蛋白、类固醇之类的生物标志物和/或含聚乙二醇(PEG)和如谷胱甘肽之类的抗氧化剂的溶液以屏蔽器官或治疗在冷冻保存和/或器官或组织移植期间内膜增生的病变。通过本发明的灌注、诊断和/或转运器设备向器官或组织提供这些溶液。
可以连同上述技术和方法和/或连同其它的技术和方法一起使用本发明的方法,以实施对于器官或组织的研究。由于可以在生理参数处或接近生理参数处维持和/或分析所述器官或组织,所以可以为离体器官或组织上的各种治疗和/或物质的效果而测试器官。可以使用本发明的方法将含有生物标志物的液体灌注通过器官,同时监测所述器官和所述组织流出,以分析所述器官的条件和/或确定各种处理对其效果。
在一些实施方式中,可以自动地同时控制灌注液流和温度调节以便使结果最优化。这样的自动控制允许对操作期间的灌注条件作出快速和可靠的响应。自动流控制可以基于从系统测量得到的参数,包括灌注液流速率、流出器官的灌注液pH、器官进口压力或如预选择流速率或在灌注液模式之间切换的定时的程序。在一些实施方式中,所述流控制是基于流入到所述器官的灌注液的压力监测的。自动流控制的益处包括维持正确的氧合和pH控制,同时在连续的流或受控制的间断流下操作。
已知的交互控制程序可以实现所述自动控制。可以预先储存所述参数供用户选择,或在系统操作期间由用户编程。优选在编程的通用计算机上执行所述控制程序。
可以在任何时候手动地调节控制系统,或设置成按照默认设置。所述系统包括逻辑电路,以防止操作者设置会降低器官活力的参数。如上所述,对于顺序的低温和/或常温灌注,所述系统还可以在手动模式下操作,以及对于顺序的低温和/或常温灌注,可以在计算机控制的模式下操作。
对于包括人类儿童或小器官和大型或成体器官的哺乳类器官都可使用上述方法,可以按需要修改盒子和/或相应地修改压力和流速率。如上所述,可以按特定器官或器官大小的形状和尺寸来配置器官盒子。
实施例
如上所述,可以监测的潜在生物标志物之一是氧的水平(可以通过例如,监测pO2和/或pO2的稳定性、氧消耗速率和/或氧消耗速率的稳定性对其进行评估)。氧的水平有助于许多其它可以监测的生物标志物,如器官的代谢和/或代谢速率的稳定性;监测葡萄糖浓度和/或葡萄糖浓度的稳定性;监测葡萄糖的消耗/消耗速率;监测乳酸的产生;监测乳酸浓度;监测pH口/或pH稳定性等。
选择氧作为生物标志物并且因此在灌注期间监测氧水平和/或氧合是基于以下的事实,即构成代谢激活的生化过程仍然活跃,虽然水平低得多。对于如肝之类的器官,当温度处于从约0到约42℃的范围内时,温度每下降10℃,组织氧消耗可以降低至少5%。甚至当温度处于从约4到约6℃的范围内时,在低温机器灌注期间可以使用连续供氧以维持器官的活力,因为在4-6℃下可以持续存在约7%的器官代谢活性。
在冰上的可接受保存时间持续短限制了用于移植的肝的可用性(虽然本实施例涉及肝,但是在本发明的方法中也可以使用它器官)。对于当前临床肝移植,虽然存在24小时的冷缺血时间的限制,但是外科医师偏好更短的周期,优选地<12小时,以降低移植物功能延迟的发生率。这具有数个负面结果:(1)它限制了肝的可用性,因为这将获得器官的地理区域限制到了受体附近的区域;(2)它产生了对移植团队的压力,其本身不鼓励大力追求可用的器官;(3)短的保存时间不能提供足够时间来评估来自边缘供体的肝和可以扩大供体库规模的新介入措施;(4)即使静态冷保存时间短,也对于移植物还存在持续的负面影响;以及(5)可能最重要的,在小地理面积中使用肝导致供体和受体的匹配不是最佳的。
如果可以以更长时间来运输肝,则可以实施更佳的HLA配对,因为我们能对供体与较大的可能受体库进行配对。通常,相对于所有的移植,对于要移植的器官来说,器官有活力的时间越长,发现更好的配对的机会越高,这也会产生更好的患者治疗结果。
下列研究使用从南卡罗来纳医科大学的猪供体得到的肝。在本实施例中使用改良的LifePort肾转运器平台,并且做出如下所述的修改。以下的实施例证明了,根据氧消耗水平测量,总的组织活力显著提高,并且丙氨酸氨基转移酶水平大大地低于SCS肝。设计肝转运器(LTR)使之能够维持猪肝至少24小时。根据以下实验设计LTR,其具有许多临床成功的肾转运器(KTR)特性(表4)。所述KTR是用电或电池供电的、低温灌注肾运输装置。可以在整个储存和运输期间内,在保持无菌的双密封的、灭菌的、单次使用的、一次性盒子/管组中支持所述器官。被动地绝缘的无泄漏冰浴槽提供冷却液源。热从灌注液储器和器官盒子的壁传导到冰浴槽中,使之控制在要求的温度范围内。微处理器控制器维持选择的肾灌注压力,并且管理KTR运行。压力、温度和其它传感器允许控制器维持适当的运行,并且如果检测到故障,就向用户发出声音警告。显示的数据包括灌注液温度和流速、动脉压力(收缩压、平均值和舒张压),以及计算的肾阻力。在阶段I中对台式原型作了几个修改,包括盒子和一次性管组的设计。
下图(表4)给出LTR的示例性规格与市场上现有的KTR的规格的比较,并且描述了可以用来使LifePoft肾转运器与每项要求吻合的修改。
表4.示例性肝转运器规格
所述LTR维持了原始肾转运器的结构,电子配置以及软件包装。可能需要对泵控制修改,从而当温度超过设计的原始规格时防止软件关闭。例如,通过用与27KΩ电阻值等效的电阻代替热敏电阻可以实现这点。
对于猪肝,比较在4-6℃和12-14℃下充氧HMP肝功能的比较结果。用Belzer溶液冲洗所有的肝,并且在运输和研究准备期间在冰上放置2小时。在HMP之后,在12小时的HMP中平均肝重量保持相对恒定(±2.2%)。流出溶质(Na+、K+和Ca++)随灌注时间的变化很小。单个12-14℃HMP肝在22小时处展现出Ca++尖峰。平均乳酸盐水平低于4.5mmol/L。在长期HMP期间,在灌注液进入肝时,在4-6℃和12-14℃的HMP组中的活性氧合分别产生范围为271-359和60-319mmHg的平均pO2。pCO2水平分别逐渐增加到13.9和25.2mmHg的平均值(p<0.05)。在实验HMP测试结束时,在常温电路中测试肝。在离体测试期间,HMP处理的肝立刻发挥功能,并且展示出出色的胆汁产生。
与对照相比较,在两个12小时HMP组(p<0.05)中观察到显著较少的因子V产生、较高的吲哚菁绿清除率和较低的血尿素氮浓度。在HMP组中,减少的因子V是仅有的比新鲜对照差的功能。在HMP组中,ICG清除率更好。与对照相比,在所有的HMP组中,胆红素动力学受到干扰,然而,在12小时HMP组中得到的峰值浓度没有很大的不同,而22小时12-14℃HMP组明显小于对照组(p<0.05)。组织病理学检查未见差异。在常温灌注测试期间,所有组出现水肿和受困的红细胞(trappederythrocyte),这表明在HMP和/或再灌注期间添加血管收缩和再灌注伤害抑制剂会有较大的益处。
图4的研究证明,与所有其它组中<100U/L相比,在无氧的HMP(200U/L)之后的常温血灌注期间,ALT在统计上有显著增加(图4,对于所有的比较,T测试和ANOVA,p<0.05)。
对于4-6℃和12-14℃充氧组,ALT值分别显著增加和显著减少。ALT值的减少可能由于12-14℃HMP期间与4-6℃HMP相比的较高代谢速率引起的ALT的分泌。相对于新鲜肝和/或带氧的HMP肝,观察到胆汁产生、LDH、TNF-α、IL-8、β-gal和白蛋白的显著变化(图5)。仅一例中,TNF-α在即使HMP充氧组中也是明显不同的(图5E)。实施的研究表示在所有的研究组中,TNF-α水平从获取开始随时间降低,并且SCS和HMP±O2肝都显示出相似的降低。
本发明的方法中,通过使用不需要罐装气体的氧合器来完成氧合。例如,可以用LTR中无压缩气体的电化学氧浓度系统来实践本发明的方法。
实验设计-使用4组每组5只的动物(总共20头猪)作为肝供体。实验组程序的次序是随机的。在组1中,使用采用罐装气体的静脉循环的300mmHg目标pO2来研究5个对照的12小时4-6℃HMP肝。使用电化学氧收集器在100、200和300mmHg的目标pO2下研究在组3-4中的12小时HMP肝。选择从以下所述的测试(相对于监测的生物标志物)产生等效于或优于对照的总结果的最低的目标pO2将来用于这个类型的器官。
材料与方法
肝获取:对于器官收集,从重25-30kg的远交猪中分离肝脏。对动物称重量,并且用氯胺酮(22mg/kg)、乙酰丙嗪(1.1mg/kg)和阿托品(0.05mg/kg)的混合物肌肉内预先麻醉所述动物。在建立ECG之后,对猪进行插管,并且进行1.5-2%的异氟烷麻醉。用肝素(400IU/kg,静脉内)对猪进行抗凝。从胸骨顶部到耻骨沿中线切开。打开胸腔,以允许到达并钳住胸部的背主动脉和下腔静脉。腹背主动脉插管之后切开隔膜上方的下腔静脉。猪将在麻醉下放血安乐死,用3L乳酸林格(Ringers)灌注肝。小心地摘除肝、称重、插管并且在冰上在UW溶液中SCS达2小时。然后用乳酸林格冲洗,然后放置在转运器盒子中用于灌注。收集供体的肝素化血液,用于在保存后常温评估期间的灌注液中使用。
低温机器灌注:完全预先装配LTR并且准备接受所述肝。这个研究将使用Belzer机器灌注溶液,这种溶液当前在临床上用于肾灌注,现在用作肝离体低温灌注溶液。在准备好LTR之后,在低温稳态下(4-6℃)输送灌注溶液,并且建立压力方案。使具有传入流量回路管和溶液过滤器的器官盒子就位。使用一次性20μm无菌过滤器以维持灌注液无菌,并且保留剩余红细胞。根据测试的具体目标在4-6℃和恒定压力下通过门静脉和肝动脉对肝进行连续灌注12小时或更长时间,分别产生0.4和0.1ml/分钟/g肝的流速。我们的经验是恒定流量系统导致灌注期间更均匀的流动模式。通过LTR电子控制器和计算机集成系统,以实时监测和记录器官浴槽的温度、灌注压力以及流速。在进入肝之前,医药等级100%O,与灌注溶液平衡以升高其pO2到300mmHg。在灌注期间,如果需要的话,丢弃使用过的过滤器,用新过滤器来替换。每个实验之后,用新的流动回路管替换全部流动回路管。在实验之间,仔细清理器官盒子和灌注溶液储器并进行灭菌。在灌注之前和之后要记录肝的重量。
离体常温肝评估:灌注回路包括转运器、儿童热交换器-氧合器以及不含血液过滤器的蠕动泵系统。设置热交换器以将灌注液维持在37℃。混合气体(氧和空气)以维持CO,和O,的生理分压(一般,1份氧对3份空气)。用于分离的灌注系统的灌注液是2.5L含有25-30%经洗涤红细胞的Krebs-Henseleit缓冲液。在再灌注之前填装回路,并且将pH和pCO2调节到正常生理范围。然后将肝放置在所述灌注回路中,测试>3小时。转运器允许恒定压力的设置,并且调节流体到要求的压力。门静脉(PV)中的压力设为15mmHg而肝动脉(HA)中的压力设为65mmHg。通常通过PV的流速为1ml/分钟/g肝,而通过HA的流速为0.25ml/分钟/g肝。立刻分析灌注液样品的pCO2、pO2、pH和渗透压,并且在液态氮中将样品冷冻以用于其它分析。根据菲克定理(Fick's principle)计算氧消耗。每30分钟收集样品。
分析技术
分析分为3类:(A)用于监测在低温灌注期间实验HMP的那些分析;(B)预期提供与对照的静态储存的肝相比的成功标准的分析;(C)可以提供关于肝损伤和合成功能的其它重要信息的肝酶、细胞因子和功能分析。比较对照与12小时HMP±O2两个B组分析(β-Gal和胆汁产生)以及三个C组分析(LDH、ALT和IL-8)的收集的数据已经证明不含氧合的12小时HMP的显著差异(图5)。
A组:普通生化分析:进行这些分析来确定灌注期间是否需要介入。对于pCO2、pO2、pH和渗透压的偏离可能需要介入以改变氧合、缓冲或电解质。在将肝放入器官浴槽之前从器官浴槽收集基线灌注液样品。将使用Bioprofile400机器进行pCO2、pO2、电介质(Na+、K+、Ca++、NH4 ++)以及代谢物(乳酸盐、葡萄糖、谷胺酰胺、谷氨酸)的分析。
B组:评估移植物保存质量的临界终点分析:
1)代谢性酸中毒和低血糖,
2)胆汁产生:将测量胆汁产生和吲哚菁绿分泌(Koneru,B.,Leevy,C.,Klein,K.和Zweil,P.在肝供体的评估中吲哚菁绿的清除(Clearance ofindocyanine green in the evaluation of liver donors).Transplantation,58:729-731,1994;Tsubono,T.,Todo,S.和Jabbour,N.在原位移植肝受体中的吲哚菁绿消除测试(Indocyanine green elimination test in orthotopic liver recipients).Hepatology,24:1165-1171,1996,其全文通过引用纳入本文)。在灌注液中预先混合10mg/L的吲哚菁绿。第一小时中每15分钟,随后常温再灌注期间每半小时收集胆汁并称重,用UV-可见光分光光度计(Beckman DU640,加利福尼亚州福特顿(Fullerton,CA))测量吲哚菁绿分泌(780nm)来测试胆汁。
3)库普弗细胞激活:使用特定底物,4-甲基伞形(methylumbelliferyl)-半乳糖苷,对15-30分钟时间间隔得到的样品用荧光计测量β-半乳糖苷酶水平,并且检测4-甲基伞形酮的形成。
4)肝窦内皮细胞功能:临床上和实验上广泛使用透明质酸(HYA)清除来评估内皮细胞损伤(Rao,P.,Bronsther,O.,Pinna,A.,Demetris,A.,Snyder,J.,Fung,J.和Starzl,T.在临床肝移植中透明质酸流出物的水平预测早期移植物功能(Prediction of early graft function by effluent levels ofhyaluronic acid in clinical liver transplantation).Transpl Proc,25:2141-2142,1993;Sudo,Y.S.,Takaya,S.,Kobayashi,M.,Fukuda,A.,Harada,O.,Suto,T.,Onozuka,N.和Suzuki,S.在来自心脏不跳动供体的原位肝移植中使用透明质酸和三磷酸腺苷评估移植物活性(Assessment of graft viability usinghyaluronic acid and adenosine triphosphate in orthotopic liver transplantationfrom non-heart-beating donors).Transplantation Proceedings,32:2114-2115,2000,其全文通过引用纳入本文)。由于移植冷保存伤害与内皮细胞损伤有关,因此肝窦内皮细胞的评估是保存后的移植物功能的重要指示。评估HYA摄入。灌注液中包括150ug的HYA/L,使用酶联结合蛋白检测试试剂盒(科罗拉多州西敏寺的Corgenix有限公司(Corgenix Inc.Westminster,CO))在重新加热的第一小时期间以15分钟的时间间隔评估清除,对于其余的评估时间,以30分钟的时间间隔评估清除。
C组)其它分析:肝酶、乳酸脱氢酶和丙氨酸转氨酶是常用的肝细胞损伤的指示物。在机器灌注保存期之后和重新加热期间,使用比色法诊断试剂盒(美国密苏里州圣路易斯市的西格玛公司(Sigma,St.Louis,MO))测定两种酶。另外,在使用建立的方法的再灌注期间,将使用以下的肝功能分析:因子V产生(Adham,M.,Peyrol,S.,Chevallier,M.,Ducerf,C.,Vernet,M.,Barakat,C.,De,L.R.E.,Taibi,A.,Bizollon,T.,Rigal,D.,Pouyet,M.和Baulieux,J.分离的灌注的猪肝:在灌注期间和灌注后6小时的活性评估(The isolated perfused porcineliver:assessment of viability during and after six hours of perfusion).Transpl Int,10:299-311,1997;Russo,F.,Bassanello,M.,Senzolo,M.,Cillo,U.和Burra,P.在肝移植后功能性和形态学移植物监测(Functional and morphological graftmonitoring after liver transplantation).Clin Chim Acta,310:17-23,2001;Fischer,L.,Sterneck,M.和Rogiers,X.用于急性肝衰竭的肝移植(Liver transplantationfor acute liver failure).Eur J Gastroenterol Hepatol,11:985-990,1999,其全文通过引用纳入本文)、总胆红素(Adham,(上述);Krenn,C.,Schafer,B.,Berlakovich,G.,Steininger,R.,Steltzer,H.和Spiss,C.通过吲哚菁绿动力学评估的肝移植后移植物丧失功能的监测(Detection of graft nonfunction after livertransplantation by assessment of indocyanine green kinetics).Anesthesia andAnalgesia,87:34-36,1998,其全文通过引用纳入本文)和尿素产生(Ohtake,1991),使用西格玛试剂盒。此外,可以使用本文中的ELISA分析来评估包括IL-8的细胞因子。
还收集组织活检标本,用2%的Sorenson缓冲的戊二醛溶液固定约2小时,然后处理用于光学显微镜观察。对于凋亡细胞的检测,将用苏木精、曙红、甲苯胺蓝和ApoptagTM进行常规光学显微镜染色。在肝组织部分的计算机化图像上定性评估组织病理学。对每个样品进行至少三次完整成像,并且使用半定量4+标准来确定细胞凋亡和病理变化的相对程度。根据我们的经验,肝维持pH的能力对于灌注期间的正常功能是很重要的。对选择的样品使用电子显微镜。
具体目标2:评估充氧HMP期间抗氧化剂、代谢底物和血管扩张剂的Vasosol配方是否有益处。由12小时HMP来评估含有或不含Vasosol的Belzers机器灌注液。我们还把这些研究延长到超过12小时以确定可能保留离体功能的HMP持续期。
在HMP期间添加外源性氧可能有氧化损伤的风险。本发明的方法可以使用Vasosol配方。除了抗氧化剂以外,该溶液还含有血管扩张剂和代谢底物。每升Vasosol的配方如下:
L-前列腺素E1-500ug/mL2小瓶;硝酸甘油-50mg/10mL;N-乙酰半胱氨酸-0.002g/10mL,最小体积10mL;L-精氨酸-2.00g/20mL,最小体积10mL;α-酮戊二酸-0.002g/10mL,最小体积10mL。
筛选可以预测器官功能的新生物标志物。
在每个HMP实验的开始和结束时以及离体常温评估期间,收集组织活检和灌注液。RNA分析集中在与再灌注伤害和热休克相关联的标志物上。要研究的灌注液中的生物标志物的例子包括在文献中看到的更宽范围的炎症的生物标志物(如白介素和TNF-α)、热休克蛋白以及再灌注伤害生物标志物。例如,在最近的文章中,“用于预测肾移植结果的机器灌注灌注液生物标志物的价值(The Value of Machine Perfusion Perfusate Biomarkers for Predicting KidneyTransplant Outcone)”(Moers,2010),其全文通过引用纳入本文,作者总结:肾HMP期间的增加的GST、NAG或H-FABP浓度是调节移植后受体管理的指示。这项研究第一次显示灌注液生物标志物测量不必定导致器官废弃。在本发明的方法中,允许(至少部分)根据正在监测的一种或多种预定生物标志物的定性和/或定量关系(这可以根据一个或多个因素,如特定生物标志物的浓度、或特定生物标志物对不同生物标志物的非检测水平的单纯的检测水平)来选择保存和/或维持、维护或改善所述器官的活力的器官治疗决策或具体策略(如灌注液组成,其可以是许多灌注液溶液的组合),以至于可以修复有疑问的器官,或使它的活力恢复到适合于移植的状态。
材料与方法
将在RNAlater(凯杰公司(Qiagen))中储存组织活检24小时,然后冷冻储存用于未来RNA分离。组织样品和灌注液样品都在-80℃下储存于我们的组织库中的直到处理。该实验将补充具体目标1中利用的那些来评估器官功能。使用酶联免疫吸附分析(ELISA)来实施新标志分析。从肝活检中离析RNA样品。然后使用提取的RNA以使用基于Affymetrix基因芯片的差异基因表达分析以及平行测序来建立基因表达指纹档案。
实验设计-在本目标的过程中,总共使用了36头重25-30kg的成年本地约克郡农场猪,18头用于肝采摘,18头作为肝受体。从移植手术前一天开始从受体收集每日血液样本,并且实施上述的所有分析。在移植之前、再灌注之后的1小时以及在每个实验结束时,实施组织学和组织化学的肝活检。还保存血清和活检样本,用于包括通过早期目标的结果指导的基因芯片的分析。
材料和方法
移植器官采摘:从重25-30kg的远交猪中分离肝脏。对动物称重,并且用氯胺酮(22mg/kg)、乙酰丙嗪(1.1mg/kg)和阿托品(0.05mg/kg)的混合物肌肉内预先麻醉所述动物。在建立ECG之后,对猪进行插管,并且进行1.5-2%的异氟烷麻醉。用肝素(400IU/kg,静脉内)对猪进行抗凝。从剑突到耻骨沿中线切开。分割镰状、左三角以及胃肝韧带。从腹膜割除猪肝(portohepatic)直到到胰腺的水平。这使门静脉和肝动脉暴露。猪将在麻醉下放血安乐死。肝用约3L的冰冷却的乳酸林格溶液原位冲洗。从肾上腺皮层的水平向头部方向通过隔膜使得尾部上腔静脉与其腹膜附着点分开割除充分长度的血管以方便灌注装置管子的附着。然后分割和连接胆总管、肝动脉、门静脉、上腔静脉。在运输到实验室(用于将来评估)的期间,将肝储存在+4℃的UW溶液中。
器官移植:以与上述移植器官供体动物和器官植入方法相似的方式准备受体。使用一组移植功能血液生物标志物对移植受体进行免疫抑制和日常研究。使用一组移植功能血液生物标志物以及7天凝血分析对移植受体进行免疫抑制和日常研究。除了以前描述的BioProfile400分析和ELISA之外,使用Piccolo普通化学盘(Piccolo General Chemistry disc)的分析包括ALT、白蛋白、碱性磷酸酶、淀粉酶、天冬氨酸转氨酶、葡萄糖、总胆红素、总蛋白、尿素氮以及尿酸。将使用组织化学、常规组织学和基因分析来评估活检。在安乐死后研究总结时评估总体病理学,特别注意脑病。通过上传到处理器,可以使用从上述任何实验中收集到的数据以形成数据记录,编译的数据包括:在器官转运器、灌注设备、盒子、以及器官诊断设备中的至少一个装置中保存、运输和/或储存器官时涉及一种或多种生物标志物的一个或多个定性和/或定量关系的数据;以及在器官转运器、灌注设备、盒子、以及器官诊断设备中的至少一个装置中运输和/或储存器官时发生的事件,以及涉及所述器官的移植结果的数据。此后,使用相同的处理器或不同的处理器,根据所述数据记录,可以确定至少一个装置或不同装置的运输、储存和/或保存参数,用于维持至少一个其它器官的活力。
尽管已经结合本文所述具体实施方式对本发明进行了描述,但很明显,本领域技术人员不难进行多种替代、改良和变化。因此,以本文所述的本发明实施方式应为说明性,而非限制性。在不背离本发明的精神和范围下,可进行各种变动。
Claims (15)
1.一种确定用于维持在器官转运器、灌注设备、盒子、以及器官诊断设备中的至少一个装置中的至少一个器官的活力的参数的方法,其特征在于,所述方法包括:
通过将编译的数据上传到处理器而形成数据记录,所述编译的数据包括:
在器官转运器、灌注设备、盒子、以及器官诊断设备中的至少一个装置中保存、运输和/或储存器官时涉及一种或多种生物标志物的一个或多个定性和/或定量关系的数据;以及在器官转运器、灌注设备、盒子、以及器官诊断设备中的至少一个装置中运输和/或储存器官时发生的事件,以及
涉及所述器官的移植结果的数据;和
根据所述数据记录,使用相同的处理器或不同的处理器来确定至少一个装置或不同装置的运输参数,用于维持至少一个其它器官的活力。
2.一种监测、维持和/或恢复在器官转运器、灌注设备、盒子、以及器官诊断设备中的至少一个装置中的至少一个器官的活力的方法,所述方法包括:
监测数据,所述数据包括的信息涉及:在器官转运器、灌注设备、盒子、以及器官诊断设备中的至少一个装置中保存、运输和/或储存至少一个器官时,一种或多种预定生物标志物的一个或多个定性和/或定量的关系,以及在器官转运器、灌注设备、盒子和/或器官诊断设备中的至少一个中存在至少一个器官时发生的事件;以及
通过有线或无线方式将器官转运器、灌注设备、盒子和/或器官诊断设备中的至少一个连接到网络,并且向数据库上传所述数据记录。
3.一种在器官转运器、灌注设备、盒子和/或器官诊断设备中的至少一个装置中运输和/或储存的至少一个器官的方法,所述方法包括:
根据器官运输和/或储存的数据记录,调节用于运输和/或储存至少一个器官的至少一个装置的运输和/或储存参数,所述数据记录包括:
与下列有关的信息:在器官转运器、灌注设备、盒子和/或器官诊断设备中的至少一个装置中保存、运输和/或储存至少所述的一个相同的或不同的器官时,所测定的一个或多个预定生物标志物的定性和/或定量关系,以及在至少一个相同的或不同的装置中运输和/或储存所述的至少一个相同的或不同的器官时发生的事件,其中所述信息与结果数据进行交叉参考,所述结果数据与运输和/或储存的所述至少一个相同的或不同的器官的移植结果有关。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法,其特征在于,所述方法还包括:
产生所述的至少一个其它器官的器官活力指数。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法,其特征在于,所述方法还包括:
将所述数据传送到存储器装置,其中在把转运器、灌注设备、盒子、以及器官诊断设备中的至少一个连接到网络之前将所述数据记录传送到所述存储器装置中。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法,其特征在于,所述方法还包括从所述数据库经由连接到所述数据库的相同网络或不同网络对所述数据记录进行显示、获取以及上传中的至少一项。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法,其特征在于,所述方法还包括:
将所述数据记录传送到远程位置,用于对所述的至少一个器官进行管理、跟踪、监测以及诊断中的至少一项。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法,其特征在于,用无线通信设置来配置转运器、灌注设备、盒子以及器官诊断设备中的至少一个来提供实时数据传送。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法,其特征在于,所述方法还包括:
产生至少一个器官的第一器官活力指数;以及
根据所述第一器官活力指数作出器官治疗的决定,和/或将所述第一器官活力指数与由至少一个相同或不同器官产生的第二器官活力指数进行比较。
10.如权利要求3所述的方法,其特征在于,从数据库计算机中得到所述数据记录,尤其是实时地在至少一个装置上对至少一个器官进行至少管理、跟踪、监测和诊断之一的数据库计算机。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法,其特征在于,用无线通信设置配置所述的至少一个设备以提供实时数据传送。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法,其特征在于,所述方法还包括:
传播所述数据记录;在无线网络上接收所述数据记录;将所述数据记录储存在数据库中;在如局域网和万维网中至少一个的网络上发送所述数据记录;经由网络显示、获取和/或下载所述数据记录。
13.如上述权利要求中任一项所述的方法,其特征在于,通过监测一种或多种生物标志物,尤其是通过监测以下在所述器官中或通过所述器官的灌注的液体中的一种或多种生物标志物,得到涉及一种或多种生物标志物的一个或多个定性和/或定量关系的数据或信息,所述生物标志物是:
成分或分子,尤其,引入供体器官或另外存在于所述器官中的小分子、大分子和/或生物物质的稳定性;所述器官的代谢和/或代谢速率的稳定性;所述器官的氧消耗速率和/或所述器官的氧消耗速率的稳定性;葡萄糖浓度和/或葡萄糖浓度的稳定性;所述器官的葡萄糖消耗和/或消耗速率;所述器官的乳酸产生;乳酸盐浓度;pH和/或pH的稳定性;pO2和/或pO2的稳定性;pCO2和/或pCO2的稳定性;pH2和/或pH2的稳定性;钙水平和/或钙水平的稳定性;器官阻力(压力/流量);监测T/GST水平;T蛋白水平;预定分子或物质的吸收速率和/或吸收程度;来自所述器官的一种或多种分子的提取或浸出;天然存在于所述器官中的分子或物质;来自所述器官一种或多种分子的清除和消除;和/或上述任何组合。
14.如权利要求1-12所述的方法,其特征在于,所述生物标志物是由所述器官和/或组织产生的,和/或引入所述器官和/或组织中的或另外存在于所述器官中的任意小分子、大分子和/或生物物质。
15.如上述权利要求中任一项所述的方法,其特征在于,所述的一个或多个定性和/或定量关系包括以下的至少一个:
另一种生物标志物存在与否的情况下,一种生物标志物的存在与否,
一种或多种生物标志物的水平与一种或多种其它生物标志物的水平的比值,如相对于一种或多种其它生物标志物的一种或多种生物标志物的量比,尤其是一种或多种预定生物标志物的浓度比,
在器官转运器、灌注设备、盒子以及器官诊断设备中的至少一个装置中运输和/或储存器官时,一种或多种预定生物标志物与如温度、灌注压力之类的灌注参数或条件的关系,以及
在器官转运器、灌注设备、盒子和/或器官诊断设备中的至少一个中存在至少一个器官时发生的事件和/或条件。
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