CN102754642B - 一种原始间充质干细胞储存转运的方法 - Google Patents
一种原始间充质干细胞储存转运的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102754642B CN102754642B CN201110106595.5A CN201110106595A CN102754642B CN 102754642 B CN102754642 B CN 102754642B CN 201110106595 A CN201110106595 A CN 201110106595A CN 102754642 B CN102754642 B CN 102754642B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- mesenchymal stem
- stem cells
- suspension
- initial mesenchymal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种原始间充质干细胞的储存转运方法，生长处于融合状态的原始间充质干细胞收集后，用含二甲基亚砜、人脐血血清和抗生素的DMEM-F12冷冻培养基冷冻原始间充质干细胞，低温储存，在原始间充质干细胞使用前进行细胞复融，原始间充质干细胞保存液进行保存，保持固定的细胞浓度、低温运送至使用单位进行应用，此方法规范了原始间充质干细胞储存转运的流程，使原始间充质干细胞在到达使用单位之前保持在相同的活力状态，节约了时间、人力、物力、财力，经此方法储存转运的原始间充质干细胞无生物污染、无杂质污染、免疫学检查均为阴性，适合原始间充质干细胞移植应用和进行再研究。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物材料在使用过程中的储存转运的方法，特别涉及原始间充质干细胞的储存转运方法。
背景技术
干细胞移植治疗诸如心脏病、神经疾病、血液病等许多疑难疾病，已经成为目前干细胞研究的热点，也成为临床治疗疑难疾病的一种方法，干细胞研究和临床应用是一个多学科、多单位、多部门共同协调完成的一项重大复杂工作，目前干细胞的培养已日趋成熟，干细胞的治疗应用也已经研究很深，然而一项大的干细胞临床研究和一项普及面广泛的干细胞治疗，需要多方合作，需要有独立的细胞制备单位提供细胞，独立的细胞移植单位进行细胞移植，并且细胞制备单位和细胞移植单位之间有一定的空间距离，要使细胞制备单位和细胞移植单位在工作中充分衔接，使细胞移植达到最佳的效能，就要有能达到标准的规范的细胞储存运输流程，需要储存运输的原始干细胞是经体外长时间培养，经过多次消化、传代、洗涤处理后的一种干细胞，其储存、转运、细胞使用都有着非常严格的要求，目前在干细胞的储存运输方面还没有形成统一的规范流程，使各研究单位之间、各细胞移植单位之间由于对细胞储存运输的不规范统一产生很大的差别，所以现在需要解决的问题是在原始间充质干细胞的基础研究和临床应用上需要找到一种规范的原始间充质干细胞储存和转运方法，这种方法要能达到原始间充质干细胞储存时间无论长短、转运距离无论多远，当原始间充质干细胞从制备单位到达目的单位在进行原始间充质干细胞移植使用前，原始间充质干细胞的质量、活力、安全指标均达到最佳相同的状态。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种原始间充质干细胞储存运输的方法，按本发明方法储存运输的原始间充质干细胞在应用和研究时其细胞活力均能达到90%以上，无细菌污染、无支原体污染、无杂质污染，缩短了细胞准备的时间，需要使用时可即时获得。
实现本发明目的的技术方案为，制备好的原始间充质干细胞通过冷冻储存、复融、低温运输、进行应用。原始间充质干细胞进行冷冻储存、复融、低温运输的方法为：将处于对数生长期、细胞生长状态处于融合阶段的原始间充质干细胞进行消化、中和、洗涤、收集细胞，计数，计算细胞活力，细菌学检测，免疫学检测。向收集的细胞中缓慢加入含有二甲基亚砜浓度为5～15％，含人脐血血清10～20%、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml冷冻储存液，并使冷冻储存液与细胞充分混匀形成冷冻储存细胞悬液，将冷冻储存细胞悬液转移入冻存管中，每支冻存管内分装1～2ml冷冻储存细胞悬液，将冻存管管口密封。在冻存管上做好标记，包括标本来源编号、细胞代数、冻存方案、冻存日期、操作人员等相关信息；将冻存管置于装有异丙醇的冻存盒中，放置于-70～-85℃低温冰箱，等待时间大于等于5小时后将冻存管移入含有液氮的液氮罐中储存；再将装有细胞的冻存管置于干冰中运送至细胞复融实验室，置于液氮罐内存放；在细胞复融实验室将恒温水浴箱温度调节至37～41℃，从液氮中取出冻存管，立即投入恒温水浴箱中轻轻晃动，直至冻存管中的固体变为液体状态，此为细胞悬液；打开冻存管盖子，将细胞悬液移至含有冷生理盐水的离心管中，使用生理盐水再冲洗冻存管内部，冲洗液均移入盛装细胞悬液的离心管中，在离心管中使用移液管轻轻吹打混匀细胞悬液，将细胞悬液离心，弃上清夜；再向离心管中加入生理盐水，重新悬浮细胞，并使用移液管吹打细胞悬液混匀，将细胞悬液离心，弃上清夜，留下细胞沉淀；向细胞沉淀内加入细胞保存液并分装为临床应用的间充质干细胞制剂；检查细胞活率及细菌、内毒素、支原体；将细胞浓度调节至1×105～1×107/ml，移入无菌管或转运袋中，使用2～8℃恒温保温箱在时间小于等于12小时内运输至使用单位，进行应用。
用于被储存运输的原始间充质干细胞的来源包括由脐带、脐带华通胶、骨髓、脐带血、外周血、脂肪提取制备的原始间充质干细胞。
冷冻储存液为DMEM-F12，其中含二甲基亚砜5～15％、含人脐血血清10～20%、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml。
作为优化，含有细胞冻存管的冻存盒放置于低温冰箱的温度为-70～-85℃，进入下一工序。
作为优化，含细胞悬液的冻存管在低温冰箱中的时间不低于5小时，进入下一工序。
作为优化，复融时恒温水浴箱温度调节至37～41℃，进入下一工序。
作为优化，悬浮细胞用的生理盐水为0.9%氯化钠溶液，进入下一工序。
作为优化，将细胞运送到使用单位的时间不大于12小时。
对于按本发明上述方法冷冻储存、复融、低温运输的细胞在临床应用和研究之前表现出以下技术特征：① 细胞活力不低于90%，细胞体积均一性；② 细菌检查阴性、支原体检查阴性、内毒素检查阴性、杂质检查阴性；③ 乙肝表面抗原检测阴性，丙肝抗体检测阴性，梅毒抗体检测阴性，艾滋病抗体检测阴性。
原始间充质干细胞来源广泛，使用范围越来越大，上术检查的结果表明本发明储存运输的原始间充质干细胞在使用之前能达到活力高，无生物学污染，无杂质污染，无传染性污染，符合《中国生物制品规程》的相关要求。上述技术特征可以作为本发明方法所储存运输的原始间充质干细胞产品合格标准。
按本发明方法储存运输的原始间充质干细胞在运送到使用单位使用之前，无论细胞储存时间长短，无论细胞的转运距离多远，原始间充质干细胞的质量、活力均达到最佳并保持在相同状态，比本单位单独制备获取原始间充质干细胞进行使用和研究节约了大量的时间、人力、物力和财力。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1～6
以下列举6个实施例，本发明的实施方法并不限于这6种。对于实施过程中部分可选择的实验材料的选用、部分可调整的工艺技术参数的实际应用，以及各实施例所得成品部分检测指标列表如下：
综合上表所列内容，按本发明方法，原始间充质干细胞的储存运输工艺步骤如下：
（一）材料选取：将处于对数生长期、细胞生长状态处于融合阶段的来源于脐带、脐带华通胶、骨髓、脐带血、外周血、脂肪任何一种的原始间充质干细胞进行消化、中和、洗涤、收集细胞，计数，计算细胞活力，并进行细菌、支原体、内毒素、杂质、乙肝表面抗原、丙肝抗体、梅毒抗体、艾滋病抗体检测。
（二）储存原始间充质干细胞：向收集的细胞中缓慢加入含有二甲基亚砜浓度为5～15％冷冻储存液，并使冷冻储存液与细胞充分混匀形成冷冻储存细胞悬液，将冷冻储存细胞悬液转移入冻存管中，每支冻存管内分装1～2ml冷冻储存细胞悬液，将冻存管管口密封。在冻存管上做好标记，包括标本来源编号、细胞代数、冻存方案、冻存日期、操作人员等相关信息；将冻存管置于装有异丙醇的冻存盒中，放置于-70～-85℃低温冰箱，等待时间大于等于5小时后将冻存管移入含有液氮的液氮罐中储存。
其中冷冻储存液中二甲基亚砜浓度优先选择10％；低温冰箱优先选用的的温度为-82℃；将装有细胞悬液的冻存管移入液氮罐之前在低温冰箱中存放的时间优先选20小时。
（三）运输原始间充质干细胞：将装有原始间充质干细胞的冻存管置于干冰中运送至细胞复融实验室，置于液氮罐存放，将恒温水浴箱温度调节至37～41℃，从液氮中取出冻存管，立即投入恒温水浴箱中轻轻晃动，直至冻存管中的固体变为液体状态，此为细胞悬液； 打开冻存管盖子，将细胞悬液移至含有冷生理盐水的离心管中，使用生理盐水再冲洗冻存管内部，冲洗液均移入盛装细胞悬液的离心管中，在离心管中使用移液管轻轻吹打混匀细胞悬液，将细胞悬液离心，弃上清夜；再向离心管中加入生理盐水，重新悬浮细胞，并使用移液管吹打细胞悬液混匀，将细胞悬液离心，弃上清夜，留下细胞沉淀；向细胞沉淀内加入细胞保存液并分装为适合应用的间充质干细胞制剂。
将细胞浓度调节至1×105～1×107/ml，移入无菌管或转运袋中，使用2～8℃恒温保温箱在时间小于等于12小时内运输至使用单位，进行应用。
对各实施例所获得的原始间充质干细胞分别进行检测，检测项目包括：
1.细胞活力检测：细胞的活力不低于90%。
2. 安全指标检测：对各实施例所获得的原始间充质干细胞分别进行安全指标检测，包括①细菌培养；②病毒检测；③支原体检测；④内毒素检测；⑤杂质检测；⑥乙肝表面抗原检测；⑦丙肝抗体检测；⑧梅毒抗体检测；⑨艾滋病抗体检测。所有批次该九项检测均为阴性。
以上检测结果表明按本发明方法进行储存转运的原始间充质干细胞是安全可靠的，并能使细胞在使用之前达到相同的状态，适用各种情况对原始间充质干细胞的使用要求。
Claims (3)
1.一种原始间充质干细胞储存转运的方法，其特征在于，它是采用以下工艺方法储存转运的：将处于对数生长期、细胞生长状态处于融合阶段的间充质干细胞进行收集，向收集的细胞中缓慢加入冷冻保存液，冷冻保存液成份为DMEM-F12，其中含二甲基亚砜5％～15％、含人脐血血清10～20%、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml，并使冷冻保存液与细胞充分混匀形成冷冻保存细胞悬液，将冷冻保存细胞悬液转移入冻存管中，每支冻存管内分装1～2ml冷冻保存细胞悬液，将冻存管管口密封置于装有异丙醇的冻存盒中，放置于-70℃～-85℃低温冰箱，等待时间大于等于5小时后将冻存管移入含有液氮的液氮罐中储存；将恒温水浴箱温度调节至37℃～41℃，从液氮中取出冻存管立即投入恒温水浴箱中轻轻晃动，直至冻存管中的固态变为液体状态；将此液态细胞悬液移至含有冷生理盐水的离心管中，混匀细胞悬液，离心收集细胞，加入细胞保存液并分装为临床应用的间充质干细胞制剂；检查细胞活率及细菌、内毒素、支原体；进行免疫学检查；将细胞浓度调节至1×105～1×107/ml，移入无菌管或转运袋中，使用2～8℃恒温保温箱在时间小于等于12小时内运输至使用单位，进行应用。
2.根据权利要求1所述的原始间充质干细胞的储存转运方法，其特征在于，间充质干细胞来源于脐带、脐带华通胶、骨髓、脐带血、外周血、脂肪任何一种材料。
3.根据权利要求1所述的原始间充质干细胞的储存转运方法，其特征在于，复融时将复融后的细胞悬液移至冷生理盐水中。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110106595.5A CN102754642B (zh) | 2011-04-27 | 2011-04-27 | 一种原始间充质干细胞储存转运的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110106595.5A CN102754642B (zh) | 2011-04-27 | 2011-04-27 | 一种原始间充质干细胞储存转运的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102754642A CN102754642A (zh) | 2012-10-31 |
| CN102754642B true CN102754642B (zh) | 2014-04-16 |
Family
ID=47049488
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201110106595.5A Active CN102754642B (zh) | 2011-04-27 | 2011-04-27 | 一种原始间充质干细胞储存转运的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102754642B (zh) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR3035407B1 (fr) | 2015-04-23 | 2022-06-17 | Francais Du Sang Ets | Procede de conservation de cellules, tissus ou organes en hypothermie |
| CN105586309B (zh) * | 2016-02-06 | 2019-01-25 | 福建省银丰干细胞工程有限公司 | 一种获得安全、有效的脐带间充质干细胞的方法 |
| WO2019199230A1 (en) * | 2018-04-09 | 2019-10-17 | Cellresearch Corporation Pte. Ltd. | A method of transporting mesenchymal stem cells by means of a cell culture medium and a method of administering stem cells to wounds |
| CN108865984A (zh) * | 2018-06-22 | 2018-11-23 | 安徽 | 一种脐带间充质干细胞的制备和提取方法 |
| CN111345285A (zh) * | 2020-04-24 | 2020-06-30 | 湖南南华爱世普林生物技术有限公司 | 一种不含免疫源性的脐带间充质干细胞冻存液及方法 |
| CN112522190A (zh) * | 2020-12-08 | 2021-03-19 | 山东省齐鲁干细胞工程有限公司 | 一种脐带组织高成活率的储运方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101451124A (zh) * | 2008-12-10 | 2009-06-10 | 戴育成 | 人脐带间充质干细胞创面涂抹剂的制备和储存应用方法 |
| CN101974484A (zh) * | 2010-11-03 | 2011-02-16 | 江苏省北科生物科技有限公司 | 一种人脐带间充质干细胞的制备方法 |
-
2011
- 2011-04-27 CN CN201110106595.5A patent/CN102754642B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101451124A (zh) * | 2008-12-10 | 2009-06-10 | 戴育成 | 人脐带间充质干细胞创面涂抹剂的制备和储存应用方法 |
| CN101974484A (zh) * | 2010-11-03 | 2011-02-16 | 江苏省北科生物科技有限公司 | 一种人脐带间充质干细胞的制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 骨髓细胞低温保存20年后细胞活力探讨;黄友章等;《第六届全国低温生物医学及器械学术大会论文集》;20090917;60-61 * |
| 黄友章等.骨髓细胞低温保存20年后细胞活力探讨.《第六届全国低温生物医学及器械学术大会论文集》.2009,60-61. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102754642A (zh) | 2012-10-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102754642B (zh) | 一种原始间充质干细胞储存转运的方法 | |
| CN102106342B (zh) | 一种间充质干细胞的保存方法和培养方法 | |
| CN102550542B (zh) | 用于脂肪干细胞的无血清冻存液及脂肪干细胞库的建立 | |
| Haack-Sørensen et al. | Development of large-scale manufacturing of adipose-derived stromal cells for clinical applications using bioreactors and human platelet lysate | |
| CN101451124B (zh) | 人脐带间充质干细胞创面涂抹剂的制备和储存应用方法 | |
| Dessels et al. | Comparison of human platelet lysate alternatives using expired and freshly isolated platelet concentrates for adipose-derived stromal cell expansion | |
| CN106244532A (zh) | 人源脐带间充质干细胞的制备方法 | |
| CN105713871A (zh) | 一种人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法 | |
| CN105462919A (zh) | 一种从脐带华通氏胶组织中分离提取hUC-MSC的方法 | |
| CN104839146B (zh) | 组合物及其用途、胎盘保存制剂及其制备方法 | |
| Uhrig et al. | Improving cell recovery: freezing and thawing optimization of induced pluripotent stem cells | |
| Chen et al. | Microwell perfusion array for high-throughput, long-term imaging of clonal growth | |
| CN109706115A (zh) | 一种小鼠骨髓间充质干细胞细胞系的构建方法 | |
| Smith et al. | Human umbilical cord mesenchymal stromal cell isolation, expansion, cryopreservation, and characterization | |
| CN105238756A (zh) | 一种脐带血单核细胞的制备方法 | |
| CN104988112A (zh) | 一种sd大鼠胸主动脉平滑肌细胞的分离和培养方法 | |
| CN105420185A (zh) | 一种从脐带外层羊膜组织中分离提取hUC-MSC的方法 | |
| Čamernik et al. | Human skeletal muscle-derived mesenchymal stem/stromal cell isolation and growth kinetics analysis | |
| Laurent et al. | GMP tiered cell banking of non-enzymatically isolated dermal progenitor fibroblasts for allogenic regenerative medicine | |
| Jensen | In vitro culture of Plasmodium parasites | |
| Roseti et al. | Standard operating procedure for the good manufacturing practice-compliant production of human bone marrow mesenchymal stem cells | |
| CN105018422B (zh) | 一种人脐带间充质干细胞规模化制备的方法 | |
| Jansen et al. | Transportation of peripheral blood progenitor cell products: effects of time, temperature and cell concentration | |
| CN106754667A (zh) | 一种围产期间充质干细胞二次分离培养方法 | |
| Tatsumi et al. | Protocols for isolation and evaluation of muse cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |