CN114317431A - 一种促进人造血干/祖细胞向红系分化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种促进人造血干/祖细胞向红系分化的方法。所述方法为提供人造血干/祖细胞培养的低氧环境或者模拟低氧环境的药物。本发明发现低氧具有加速红系分化的作用，可克服现有技术分化效率低的缺点，低氧是多种干细胞的微环境，发明人首次发现其在体外促进红系分化中的作用，该作用可应用于治疗严重创伤、血液病、免疫缺陷综合征和恶性肿瘤等疾病，有助于缓解患者的贫血症状。
Description
技术领域
本发明属于干细胞分化技术领域，具体涉及一种促进人造血干/祖细胞向红系分化的方法。
背景技术
红细胞成分输血是严重创伤、血液病、免疫缺陷综合征和恶性肿瘤等疾病得以有效治疗的重要保障。目前，临床使用的红细胞等血制品主要源于捐献者志愿献血；然而，世界各国仍面临着血制品供需不平衡、血液相容性差及病原微生物污染等多重挑战。因而，在捐献者志愿献血之外找到更为充足、安全、经济的血液替代来源将会极大改善目前的困境。近年来，干细胞技术的发展使得体外诱导包括人脐带血、骨髓和外周血等来源的造血干/祖细胞分化为红细胞的方法逐渐被建立起来；脐带血等来源的造血干/祖细胞具有极强的自我更新和多向分化潜能，能在特定培养条件下遵循体内红系细胞发育规律，经历造血祖细胞-红系祖细胞-红系前体细胞(原红细胞至晚红细胞)等多个发育阶段，逐级定向分化形成脱核的红细胞，这使得大量制备成熟红细胞等血液成分用于临床成为可能，可提供一个潜在的优质血液替代来源以满足未来的临床需求。然而目前己有的诱导方法在红细胞分化效率方面远未达到临床应用的要求。
造血干/祖细胞自我更新、增殖和多向分化潜能的维持需要一定的微环境，在干细胞研究领域称之为干细胞微环境或者“stem cell niche”，包括支持干细胞的细胞组分和非细胞组分。不同干细胞有着不同的微环境，而低氧却是诸多干细胞微环境的共有组分。对于HSPCs来说，低氧也是其所处的一种微环境。发明人研究发现，低氧微环境对造血干/祖细胞的自我更新及多向分化潜能等具有重要调控作用，这为在体外模拟造血干/祖细胞生存的低氧微环境，优化在体外诱导造血干/祖细胞红系分化提供了理论依据和技术支撑。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种可加速人源造血干/祖细胞向红系分化的诱导方法。
一种促进人造血干/祖细胞向红系分化的方法，所述方法为提供人造血干/祖细胞培养的低氧环境或者模拟低氧环境的药物。
所述低氧环境为氧含量低于3％。
所述模拟低氧环境的药物为FG-4592，COCl2、去铁胺中的一种或几种。
所述模拟低氧环境的药物还含有一种或多种药学上可接受的辅料或载体。
所述辅料或载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂中的一种或几种。
所述模拟低氧环境的药物制成的剂型选自片剂、胶囊剂、泡腾片、颗粒剂、散剂、分散片、口服液、丸剂或注射剂。
所述造血干/祖细胞来源于脐带血、骨髓或外周血。
所述方法获得的红细胞在制备治疗创伤、血液病、免疫缺陷综合征、恶性肿瘤、贫血病的药物中的应用。
所述血液病主要包括：再生障碍性贫血、地中海型贫血、镰刀型细胞贫血症、骨髓增生异常综合征、紫癜及溶血症等。
本发明所提供低氧条件或化学药物，可以仅以低氧作为一种干预条件，也可以低氧与模拟低氧的化学药物组合使用，还可以将两种或多种其他化学药物联用来促进体外红系分化。
本发明的有益效果：本发明发现低氧具有加速红系分化的作用，可克服现有技术分化效率低的缺点。低氧是多种干细胞的微环境，发明人首次发现其在体外促进红系分化中的作用，该作用可应用于治疗严重创伤、血液病、免疫缺陷综合征和恶性肿瘤等疾病，有助于缓解患者的贫血症状。
附图说明
图1是采用qPCR方法检测所诱导红系细胞在常氧(Normoxia)或低氧(Hypoxia)条件下培养不同时间点红系分化标记分子γ-globin及β-globin的mRNA表达水平。
图2是采用Western blot方法检测所诱导红系细胞在常氧(N)或低氧(H)条件下培养不同时间点γ-globin及β-globin的蛋白表达水平。
图3是采用流式细胞术方法检测所诱导红系细胞在常氧(Nor)或低氧(Hyp)条件下培养不同时间点CD71+/CD235a+细胞比例的变化情况。。
图4是采用姬姆萨染色法获得的所诱导红系细胞在常氧(Nor)或低氧(Hyp)条件下培养不同时间后细胞形态的变化情况。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中所用的二氧化碳培养箱购自美国Thermo Fisher公司，产品型号：3131，序列号：300158130；对比例中所用的二氧化碳培养箱购自美国Thermo Fisher公司，产品型号：3111，序列号：300205034。
实施例1：促进人脐带血来源造血干/祖细胞向红系分化的方法
1.低氧浓度设定
(1)所用二氧化碳培养箱O2浓度设置为3％；
(2)造血干/祖细胞的处理：造血干/祖细胞在复苏后在常氧条件下扩增7天，随后分别在常氧条件和低氧条件下向红系细胞诱导分化11天；
(3)对照组(对比例)：对照组所用二氧化碳培养箱默认设置氧浓度(即为大气氧浓度，约20％)。
2.造血干/祖细胞的培养
扩增培养基(EM)包含：StemSpan SFEM培养基(货号：09650)及50ng/ml rhSCF(货号：300-07)，100ng/ml rhTPO(货号：300-18)，100ng/ml rhFlt3-Ligand(货号：300-19)，50ng/ml rhIL-3(货号：200-03)和100ng/ml rhIL-6(货号：200-06)。StemSpan SFEM培养基购自加拿大STEMCELL Technologies公司，上述细胞因子均购自美国PeproTech公司。
红系分化培养基(EDM，即EDM3)包含：IMDM培养基(美国Sigma Aldrich公司，货号：16529)及3U/ml rhEPO(PeproTech,100-64)，2mM L-Glutamine(货号：G7513)，330μg/mlhuman holo-Transferrin(货号：T4132)，10μg/ml human insulin(货号：I9278)，2U/mlheparin(货号：07980)and 5％inactivated human serum(货号：H3667)。IMDM培养基、L-Glutamine、human holo-Transferrin、human insulin和human serum购自美国SigmaAldrich公司，rhEPO购自美国PeproTech公司，heparin购自加拿大STEMCELL Technologies公司。
I期红系分化培养基(EDM1)由EDM添加100ng/ml rhSCF，5ng/ml rhIL-3and 1μMdexamethasone(货号：D4902)所组成.Dexamethasone购自美国Sigma Aldrich公司。II期红系分化培养基(EDM2)由EDM添加100ng/ml rhSCF所组成。
(1)复苏冻存在-80℃的人脐带血来源的造血干/祖细胞(HSPCs)，将细胞分种在培养孔中，加入适量预热的扩增培养基(EM)，放入37℃、5％CO2的培养箱中培养7天；第2天换新鲜培养液，之后隔天换液。
(2)在复苏后第8天，将扩增后的HSPCs接种在新的培养皿中，加入I期诱导分化培养基(EDM1)后分别于常氧(normoxia，20％O2，对比例)和低氧(hypoxia，3％O2，实施例)条件下继续培养7天，接种密度为3×105个细胞/ml，每3天更换一次培养基。
(3)诱导分化7天后，更换II期诱导分化培养基(EDM2)，接种密度为8×105个细胞/ml，继续于常氧(normoxia，20％O2，对比例)和低氧(hypoxia，3％O2，实施例)条件下培养4天便可获得部分脱核红系细胞。
(4)诱导11天后，更换III期诱导分化培养基(EDM3)，继续于常氧(normoxia，20％O2，对比例)和低氧(hypoxia，3％O2，实施例)条件下培养便可获得更高比例的脱核红系细胞。
实施例2：qPCR实验
按照常规方法在不同时间点收集并裂解所获取细胞，提取RNA后进行qPCR分析，检测红系标志分子γ-globin及β-globin的mRNA表达变化。实验所用引物序列如表1所示：
表1
结果如图1所示，当HSPCs经诱导分化后，随着分化时间延长，红系标志分子γ-globin及β-globin在mRNA水平上的表达逐渐增加；与常氧对照组相比，低氧明显促进了γ-globin及β-globin在mRNA水平上的表达。
实施例3：Western Blot实验
按照常规方法在不同时间点收集并裂解所获取细胞，提取蛋白后进行蛋白免疫印迹分析，检测红系标志分子γ-globin及β-globin的表达变化。
实验所用抗体如表2所示：
表2
结果如图2所示，当HSPCs经诱导分化后，随着分化时间延长，红系标志分子γ-globin及β-globin在蛋白水平上的表达逐渐增加；与常氧对照组相比，低氧明显促进了γ-globin及β-globin在蛋白水平上的表达。
实施例4：流式细胞术
按照常规方法在不同时间点收集细胞，在APC-anti-CD235a/FITC-anti-CD71抗体混合液中孵育30min(常温、摇床)后上机检测CD71/CD235a表达情况。CD71及CD235a均为红系细胞的膜表面标志物，CD71+/CD235a+细胞比例代表红系细胞分化程度。FITC-anti-CD71抗体(货号：555536)购自美国BD Biosciences,公司，APC-anti-CD235a(货号：17-9987-41)购自美国Thermo Fisher Scientific公司。
流式细胞术实验的结果显示，随着分化进程，CD71+/CD235a+细胞比例逐渐升高，低氧实验组的CD71+/CD235a+细胞比例明显高于常氧组(图3)。
实施例5：
按照常规方法在不同时间点收集细胞，将细胞离心至载玻片上，根据姬姆萨染色试剂盒(货号：G1021)说明书对细胞进行染色，观察细胞形态变化。姬姆萨染色试剂盒购自中国Solarbio公司。
图4为所诱导红系细胞在常氧(Nor)或低氧(Hyp)条件下培养不同时间后细胞形态变化的统计结果，如在诱导分化的第11天，低氧组成熟红细胞比例显著高于常氧组。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (8)
1.一种促进人造血干/祖细胞向红系分化的方法，其特征在于，所述方法为提供人造血干/祖细胞培养的低氧环境或者模拟低氧环境的药物。
2.根据权利要求1所述促进人造血干/祖细胞向红系分化的方法，其特征在于，所述低氧环境为氧含量低于3％。
3.根据权利要求1所述促进人造血干/祖细胞向红系分化的方法，其特征在于，所述模拟低氧环境的药物为FG-4592，COCl2、去铁胺中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述促进人造血干/祖细胞向红系分化的方法，其特征在于，所述模拟低氧环境的药物还含有一种或多种药学上可接受的辅料或载体。
5.根据权利要求4所述促进人造血干/祖细胞向红系分化的方法，其特征在于，所述辅料或载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述促进人造血干/祖细胞向红系分化的方法，其特征在于，所述模拟低氧环境的药物制成的剂型选自片剂、胶囊剂、泡腾片、颗粒剂、散剂、分散片、口服液、丸剂或注射剂。
7.根据权利要求1所述促进人造血干/祖细胞向红系分化的方法，其特征在于，所述造血干/祖细胞来源于脐带血、骨髓或外周血。
8.权利要求1所述方法获得的红细胞在制备治疗创伤、血液病、免疫缺陷综合征、恶性肿瘤、贫血病的药物中的应用。
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