CN111358810B - 一种用于辅助贫血治疗的复合物及其制备方法 - Google Patents

一种用于辅助贫血治疗的复合物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于辅助贫血治疗的复合物及其制备方法，所述复合物由红系祖细胞和MSC的外泌体组成。与传统的直接输注红细胞相比，红系祖细胞在体内的分化更完全，使用方便，不会占用日益紧张的成分血资源，减轻社会的医疗负担；使用MSC的外泌体作为MSC部分功能的替代，可把MSC用于其他重症疾病的治疗，不但兼顾了成本，也更全面的利用生物资源，简便安全和高效；红系祖细胞与MSC外泌体的配合对贫血辅助治疗提供了长效的红细胞来源，对于贫血辅助治疗具有较好的效果。另外，对于很多非病理性贫血人群，可避免直接输注红细胞导致过度医疗，更避免了由反复直接输注红细胞引起的去铁治疗等，节省患者的花费，具有重要的医用前景。

Description

一种用于辅助贫血治疗的复合物及其制备方法
技术领域
本发明属于细胞技术领域，涉及一种用于辅助贫血治疗的复合物及其制备方法。
背景技术
贫血(anemia)是身体不良状态或疾病而导致的症状，主要表现为：外周血的红细胞容量低于正常值的临床综合征，是指在一定容积的循环血液内红细胞计数血红蛋白量以及红细胞压积均低于人群的正常标准。红细胞是把氧运输到全身各组织器官的血液细胞，贫血使氧携带运输作用受到直接影响，从而使组织器官产生缺氧的一系列表现，如常见的皮肤粘膜苍白等，是轻症贫血的典型表现；当脑细胞缺氧时，轻者感头昏，注意力不集中，记忆力差；重者可出现嗜睡或昏迷。为了代偿贫血时机体组织器官供氧量的不足，导致心脏增加跳动次数及搏出量，可引起心慌、胸闷、气短，因此长期的贫血会使心脏负荷加重，心脏肥厚扩大，可致淤血及心力衰竭。根据WHO的统计，全球约有30亿人患有不同程度的贫血，每年因患贫血引致各类疾病而死亡的人数上千万。而中国的贫血人口概率高于西方国家，因此更需要更多有效的贫血辅助治疗方式。
目前，对于严重的贫血性疾病的临床治疗，如地中海贫血，再生障碍性贫血等，需要定期输注红细胞或者进行造血干细胞移植。地中海贫血的患者，由于要定期输注大量红细胞，不但对成分血需求巨大，而且还需要定期进行去铁治疗，对患者本身有着重大的经济负担和精神压力。而对于轻症的贫血症状，更是一直缺乏有效的治疗方法，因此轻症贫血患者日常工作和生活均受到长期的负面影响。
造血干细胞具有构建人体造血的功能，可以自我更新并分化为各类血细胞的前体细胞，最终分化成血小板、红细胞和白细胞等成体血液细胞。在红细胞方向，造血干细胞可分化为红系祖细胞(Erythroid progentitor cell,EryPC)，然后进一步分化为成熟的红细胞，实现机体的氧气运输功能。
随着科研的不断深入，2010年，Arvind等证实，造血干细胞在体外定向诱导分化为红系祖细胞后输注回机体，红系祖细胞可与骨髓基质细胞有效地相互作用，提高了红系祖细胞在体内的存活率和增加了后期成熟比例，也就是说红系祖细胞的分化在体内比在体外培养更完全，因此输注红系祖细胞并在体内的成熟过程可视为一种新的治疗方法，能更有效的缓解了临床输血的需求和减轻患者的精神压力，尤其对于轻症贫血，有积极的临床意义。
外泌体(exosome)在近年的研究中陆续发现其临床治疗的重要价值。外泌体最早的研究报道是1983年，在绵羊网织红细胞中发现了含有RNA和蛋白质成分的小膜泡(30-150nm)结构，1987年Johnstone将其命名为外泌体。目前，在世界各国科学家的广泛研究得出的结论，由于外泌体蕴含了来源细胞的RNA和蛋白质，可部分行使其来源细胞的功能和作用。
MSC(Mesenchymal stem cell，间充质干细胞)是来自于中胚层的干细胞，在2000年后开始广泛用于临床试验，用于辅助造血植入，治疗糖尿病等代谢性疾病等。在MSC扩增培养，收集细胞用于临床，而细胞培养基中含有大量的外泌体，富集提取后可以实现MSC的部分效果。
因此MSC在扩增培养过程中所产生的外泌体，可以通过一系列操作收集，并与红系祖细胞组合，构成辅助贫血治疗的复合细胞成分制剂，该制剂为长效制剂。由于该复合细胞成分制剂是活性制剂，可以在机体内更长的时间范围内发挥效能，红系祖细胞逐渐分化成熟为红细胞，同时MSC的外泌体可以辅助造血，从而更有效地对贫血性疾病提供辅助治疗。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种辅助贫血治疗的长效复合细胞成分制剂的方法，该方法制备过程简单、可靠且重复性好，污染可能性低，兼顾了制备成本的经济性和操作安全性，为临床应用提供了更可靠的支持。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种用于辅助贫血治疗的复合物，所述复合物由红系祖细胞和MSC外泌体组成。
造血干细胞可分化为巨核祖细胞、红系祖细胞(EryPC)等，而红系祖细胞为活性细胞，在机体内分化为红细胞的分化完全程度比在体外分化更好，因此对贫血性疾病而言，输注红系祖细胞比直接输注红细胞具有更大的灵活性和可操作性。MSC的制备过程耗时长久且成本高，MSC在支持移植后的造血植入，在治疗代谢性疾病以及运动系统疾病方面具有明确的医疗价值，是重要细胞资源。MSC的外泌体含有的RNA和蛋白质，可部分行使MSC的医学功能，可以辅助红系祖细胞在体内的分化。
作为本发明的优选实施方式，所述复合物中，所述红系祖细胞与所述MSC外泌体的比例为4*105个：0.36～0.72μg。
培养4*105个MSC的所收集的培养基分离获得的外泌体为0.36～0.72μg。
作为本发明的优选实施方式，所述红系祖细胞由脐带血造血干细胞定向分化培养制得。
作为本发明的优选实施方式，所述红系祖细胞的制备包含如下步骤：将脐带血造血干细胞接种于红系祖细胞诱导培养基，连续培养21天，在第7天和第14天加入50％原始体积的红系祖细胞诱导培养基。
作为本发明的优选实施方式，所述的红系祖细胞诱导分化培养过程中使用的培养基为含有白皮杉醇、人白细胞介素-3(IL-3)、人干细胞生长因子(SCF)、促红细胞生成素(EPO)和地塞米松(DEX)的造血干细胞培养基。
更优选地，所述的红系祖细胞诱导培养基中，白皮杉醇、人白细胞介素-3、人干细胞生长因子、促红细胞生成素和地塞米松的终浓度分别为5μmol/L、20ng/mL、100ng/mL、1.5U/mL和1nM。
作为本发明的优选实施方式，所述MSC外泌体由脐带组织制备的MSC分泌得到。
作为本发明的优选实施方式，所述MSC外泌体制备方法为：
(1)处理脐带组织得到原代细胞，通过Fasgrow培养基培养制得原代MSC；
(2)扩增培养所述原代MSC至第四代，通过超高速离心即可收集得到培养基中的MSC外泌体。
所述Fasgrow培养基购于杭州百通公司。一般地，脐带在采集后24小时内进行组织原代处理，在T25培养瓶中加入Fasgrow培养基，放入37℃、5％CO2培养箱培养12天左右，直至每个T25培养瓶有3～4个500个细胞左右的集落，即获得原代(P0代)MSC。传代时，按1:6的比例传代到T75培养瓶中，连续培养四天后获得P1代MSC，后面可按1:8的比例再传代。当传代次数过多时，细胞干性消失，因此选择传代至第P4代收集培养基中外泌体。
本发明还要求保护用于辅助贫血治疗的药物组合物，所述组合物包括所述的复合物。
作为本发明的优选实施方式，所述药物组合物还包括药学上可接收的辅料或载体。
本发明提供了一种由红系祖细胞和MSC外泌体形成的复合物，红系祖细胞与MSC外泌体的配合，为贫血辅助治疗提供了长效的红细胞来源，对于贫血辅助治疗具有较好的效果。此外，本发明相对于现有技术具有如下的优点：1)本发明使用了具有细胞活性的红系祖细胞，对于传统的红细胞输注而言，红系祖细胞在体内的分化更完全，使用方便，而且不会占用日益紧张的成分血资源；2)本发明使用MSC的外泌体，在MSC的制备完成后，对MSC培养基通过超高速离心等方法获得，使用MSC培养基中获得的外泌体便可以把更有临床价值的MSC用于治疗其他重症疾病，从而兼顾了成本，更全面的利用生物资源，简便安全和高效。另外，对于很多非病理性贫血人群，可避免直接输注红细胞导致的过度医疗，也避免了由反复直接输注红细胞导致需要去铁治疗，节省患者的花费，具有重量的医用前景。
附图说明
图1为MSC外泌体的流式检测结果。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种用于辅助贫血治疗的复合物，所述复合物由红系祖细胞和MSC外泌体组成。
实施例2
脐带血采自健康产妇孕婴，经检测乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒、艾滋、巨细胞病毒、支原体、衣原体、G-6PD和地贫均为阴性。标本自采集到运回血库的运输温度保持在4～8℃，24小时内运输到脐带血库。
制备脐带血造血干细胞：从采集运输到库在24小时内的新鲜健康人脐带血，经过离心后去除红细胞和脐血浆，采集中间层富含CD34+造血干细胞的单个核细胞层，即为所述脐带血造血干细胞。
不立即进行诱导分化时，可加入细胞保护液(所述细胞保护液为含有体积百分比为55％二甲基亚砜(DMSO)和体积百分比为5％低分子右旋糖酐(地塞米松tran)的注射用水溶液。)，程控降温，冷冻于液氮中保存；使用时，取脐带血造血干细胞解冻复苏，加3倍体积左右的生理盐水重悬洗涤，离心力200g，离心8分钟，细胞沉淀即为脐带血造血干细胞。
制备红系祖细胞：将脐带血造血干细胞接种于红系祖细胞诱导培养基中，连续培养21天，在第7天和第14天加入50％原始体积的红系祖细胞诱导培养基。
所述红系祖细胞诱导培养基为含有终浓度为5μmol/L白皮杉醇(储存溶液为10mmol/L，现配现用)、20ng/mL人白细胞介素-3、100ng/mL人干细胞生长因子、1.5U/mL促红细胞生成素和1nM地塞米松的造血干细胞培养基；所述造血干细胞培养基为购于STEMCELL公司的Stemspan培养基。培养温度为37℃，二氧化碳浓度为5％。
MSC外泌体由脐带组织制备的MSC分泌得到：处理脐带组织得到原代细胞，在T25培养瓶中加入Fasgrow培养基(购于杭州百通公司)，培养12天左右，直至每个T25培养瓶有3～4个500个细胞左右的集落，获得原代(P0)MSC；把脐带MSC从T25培养瓶中消化下来，按1:6的比例传代到T75培养瓶中，放入37℃、5％CO2培养箱培养，获得P1MSC；连续培养四天，再传代，接种到T175培养瓶；培养传代至P4，收集P4培养基，通过超高速离心，得到MSC外泌体。
进一步鉴定培养得到的红系祖细胞及MSC外泌体：
①红系祖细胞的形态学分析及细胞计数：将培养的细胞在倒置显微镜观察细胞状态并拍照，根据显微镜下观察的细胞形态：第一天，脐带血造血干细胞，形态较为单一，呈分散状态，细胞饱圆，胞体透亮。第七天，与第一天相比，细胞数量明显增加，形态出现分化，部分细胞体积略有缩小，颜色加深，出现部分红色聚团，呈较紧密聚集状排列。第十四天，细胞数量大幅增加，形态出现明显分化，只有≤35％是分散状胞体透亮的造血干/祖细胞，超过一半为分化的红系祖细胞，出现明显的成簇聚集，红色团状细胞团明显增多。第二十一天，细胞数量持续大幅增加，形态出现明显分化，只有<15％是分散状胞体透亮的造血干/祖细胞，其余为分化形成的红系祖细胞，明显的成簇聚集，红色团状细胞团遍布目镜范围，红色细胞明显比第十四天增加更多。
②红系祖细胞流式细胞仪的表型测定：分别取培养后第一天、第七天、第十四天、第二十一天的细胞，进行细胞计数和CD71+的检测。结果如表1：
表1红系祖细胞培养过程的CD71+流式检测
Figure BDA0002395210580000061
Figure BDA0002395210580000071
③通过流式检测鉴定MSC外泌体，结果如表2。
表2MSC外泌体检测结果
Figure BDA0002395210580000072
实施例3
溶血性贫血动物模型：24只健康SD大鼠，按体重随机分为对照组、MSC外泌体治疗组、EryPC治疗组和MSC外泌体+EryPC组。
采用乙酰苯肼腹腔注射法制备实验性贫血大鼠模型，治疗前通过全自动细胞计数仪检测外周血红细胞计数(RBC)、白细胞计数(WBC)、血小板计数(PLT)和血红蛋白(HGB)等血象参数。然后采用静脉输注进行动物模型治疗：对照组输注4mL生理盐水，MSC外泌体治疗组输注含有MSC的等量生理盐水溶液(即含有培养4*105个MSC的培养基所分离获得的外泌体的生理盐水溶液)，EryPC治疗组输注含有EryPC的等量生理盐水溶液(即含有4*105个EryPC的生理盐水溶液)，MSC外泌体+EryPC治疗组输注等量的含有MSC外泌体和EryPC(即含有培养2*105个MSC的培养基所分离获得的外泌体及培养2*105个EryPC的生理盐水溶液)的生理盐水溶液。治疗后第7天再检测SD大鼠的RBC、WBC、PLT、HGB等参数。
治疗前的贫血动物模型血象参数及治疗后结果如表3。
表3贫血动物模型实验结果
Figure BDA0002395210580000073
Figure BDA0002395210580000081
根据上表结果，在贫血性动物模型中，RBC(红细胞计数)是衡量治疗效果最重要的参数，MSC外泌体+EryPC组与EryPC组之间没有明显差异，均明显高于MSC外泌体组；而在WBC和HGB方面，MSC外泌体+EryPC组、EryPC组与MSC外泌体组之间也没有明显差异；PLT方面，MSC外泌体组＞MSC外泌体+EryPC组＞EryPC组。
综合结果，MSC外泌体+EryPC组在RBC的恢复方面与EryPC组效果很接近，PLT方面比EryPC组高了29％。另外，由于MSC外泌体是在MSC培养完成后的培养基中分离获得，成本非常低廉，而且对作为临床资源的MSC不会产生任何负面影响，与红系祖细胞搭配使用便有效支持贫血辅助治疗，使相同数量的红系祖细胞可以提供更多临床使用的可能。因此，MSC外泌体+EryPC组具有实质性的临床意义。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (7)

1.一种用于辅助贫血治疗的复合物，其特征在于，所述复合物由红系祖细胞和MSC外泌体组成；
所述红系祖细胞由脐带血造血干细胞定向分化培养制得，所述红系祖细胞的制备包含如下步骤：将脐带血造血干细胞接种于红系祖细胞诱导培养基，连续培养21天，在第7天和第14天加入50％原始体积的红系祖细胞诱导培养基；
所述复合物中，所述红系祖细胞与所述MSC外泌体的比例为4*105个：0.36～0.72μg。
2.如权利要求1所述复合物，其特征在于，所述的红系祖细胞诱导分化培养过程中使用的红系祖细胞诱导培养基为含有白皮杉醇、人白细胞介素-3、人干细胞生长因子、促红细胞生成素和地塞米松的造血干细胞培养基。
3.如权利要求2所述所述复合物，其特征在于，所述的红系祖细胞诱导培养基中，白皮杉醇、人白细胞介素-3、人干细胞生长因子、促红细胞生成素和地塞米松的终浓度分别为5μmol/L、20ng/mL、100ng/mL、1.5U/mL和1nM。
4.如权利要求1所述复合物，其特征在于，所述MSC外泌体由脐带组织制备的MSC分泌得到。
5.如权利要求4所述复合物，其特征在于，所述MSC外泌体制备方法为：
(1)处理脐带组织得到原代细胞，通过Fasgrow培养基培养制得原代MSC；
(2)扩增培养所述原代MSC至第四代，通过超高速离心即可收集得到培养基中的MSC外泌体。
6.一种用 于辅助贫血治疗的药物组合物，其特征在于，包括如权利要求1所述的复合物。
7.如权利要求6所述药物组合物，其特征在于，还包括药学上可接收的辅料或载体。
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