EA026459B1

EA026459B1 - Способ экспансии ex vivo кроветворных клеток человека

Info

Publication number: EA026459B1
Application number: EA201500099A
Authority: EA
Inventors: Наталья Васильевна Петёвка; Елена Викторовна Васина; Виктория Сергеевна Костюнина
Priority date: 2014-11-27
Filing date: 2014-11-27
Publication date: 2017-04-28
Also published as: EA201500099A1

Abstract

Изобретение относится к области клеточной биотехнологии. Предложен способ экспансии ex vivo кроветворных клеток пуповинной или периферической крови на монослое культуры стромальных клеток костного мозга. Сокультивирование проводят в бессывороточной среде с ростовыми факторами при 37°С во влажной атмосфере воздуха с 5% СОв течение 5-6 дней. Изобретение позволяет увеличить количество кроветворных стволовых клеток и миелоидных предшественников до 20-80 раз, 20-50% которых ассоциированы с монослоем. Способ позволяет сохранить и умножить кроветворные клетки с характеристиками долговременно и кратковременно репопулирующих костный мозг без изменения соотношения субпопуляций предшественников миелоидного ряда. Высокая жизнеспособность культур, а также исключение реагентов и клеток ксеногенного происхождения позволяют использовать способ в клинической практике.

Description

Изобретение относится к области клеточной биотехнологии, а более конкретно к способу экспансии ех νίνο кроветворных клеток, и может быть использовано как в научных целях, так и в медицине для восстановления кроветворения у пациентов после высокодозной химиотерапии.

Трансплантацию кроветворных клеток проводят пациентам с гематологическими и онкологическими заболеваниями для восстановления кроветворения после высокодозной химиотерапии. Источником трансплантата могут быть костный мозг, периферическая кровь после мобилизации стволовых клеток, а также пуповинная кровь. Наличие стволовых кроветворных клеток в трансплантате подтверждается содержанием клеток, одновременно экспонирующих поверхностные кластеры дифференцировки СЭ34 и СЭ45. или содержанием клеток, способных к колониеобразованию ίη νίΐτο в полужидкой среде (колониеобразующие единицы, КОЕ). При этом положительным прогностическим фактором приживления трансплантата является наличие в нем не менее 2х 10⁶ 0034-положительных (СЭ34+) клеток в расчете на килограмм веса пациента. Низкое содержание С.О34' клеток в трансплантате приводит к длительному периоду постхимиотерапевтической цитопении и связанным с ней опасным для жизни пациентов осложнениям. В то время как основным ограничителем для использования кроветворных клеток костного мозга являются показатели иммунологической совместимости, для таких источников как пуповинная кровь, а в ряде случаев и аутологичная периферическая кровь, главным ограничителем остается недостаток кроветворных клеток в заготовленном трансплантате.

Проблему можно преодолеть размножением (экспансией) кроветворных клеток в условиях ех νίνο. При этом технология экспансии должна обеспечивать оптимальное сохранение и пропорциональное умножение популяций 0034' кроветворных клеток (как недифференцированных, так и более поздних кроветворных предшественников всех миелоидных ростков кроветворения), способных к миграции в костный мозг, ассоциации со стромальным микроокружением и полноценному восстановлению кроветворения.

Известен ряд публикаций, в которых описаны способы увеличения ех νίνο количества кроветворных клеток в суспензионной культуре с использованием сочетаний стимуляторов и ингибиторов клеточного деления и дифференцировки [1, 2]. В данных способах для регуляции пролиферации и дифференцировки кроветворных клеток используют большое количество дорогостоящих рекомбинантных факторов, многие из которых (1Ь-3, 1Ь-11, С-С8Р, СМ-С8Р) стимулируют не только деление клеток, но и их преждевременное созревание, что снижает их потенциал восстановления кроветворения. Главным недостатком экспансии кроветворных клеток в суспензионной культуре (без использования стромального монослоя) является отсутствие сигналов к синтезу молекул адгезии, необходимых для последующего приживления клеток в костном мозге после трансплантации [3].

Известны способы экспансии кроветворных клеток костного мозга с использованием монослоя стромальных клеток, поддерживающего кроветворение. Авторами ίίη§ Ό., Ροη5еса А.У., А1аке1 N. показано, что поверхность стромального монослоя является главным местом пролиферации кроветворных клеток костного мозга ίη νίΐτο, тогда как компартмент под слоем стромальных клеток имитирует нишу для сохранения ранних неделящихся стволовых клеток [4]. Теми же авторами показано, что кроветворные клетки, ассоциированные с монослоем стромальных клеток, экспрессируют более высокий уровень молекул адгезии и имеют более подходящие для трансплантации характеристики (более высокую миграционную способность и способность к самовоспроизведению, меньшую дифференцированность) [3].

Известен способ экспансии кроветворных клеток с использованием монослоя стромальной клеточной линии ксеногенного происхождения, в котором экспансию С.О34' клеток пуповинной крови человека производят в бессывороточной среде, где для формирования монослоя используют линию стромальных клеток костного мозга мыши 0Р9 [5].

Известен также способ экспансии кроветворных клеток с использованием монослоя клеток человека не костно-мозгового происхождении, в котором для поддержания экспансии С.О34' клеток костного мозга использованы кадаверные эндотелиальные клетки головного мозга человека [6]. В известном способе за семь дней культивирования только 10% кроветворных клеток ассоциировалось с монослоем. Во всех вышеперечисленных способах для получения стромального монослоя использовали ксеногенную телячью эмбриональную сыворотку, которая является источником чужеродных антигенов, способствующих развитию патологических иммунных реакций после трансплантации.

Среди известных источников стромальных клеток для формирования монослоя наиболее привлекательными являются мезенхимные стромальные клетки костного мозга (МСК КМ) человека. МСК КМ являются частью естественного микроокружения кроветворных клеток, взаимодействие с ними позволяет сохранить целевые рецепторы адгезии и хоуминга. Существуют методы экспансии кроветворных клеток в присутствии монослоя МСК КМ, однако в большинстве способов для его получения также используют ксеногенную телячью эмбриональную сыворотку или сыворотку крови лошади [3, 4, 7-9]. В некоторых случаях, чтобы избежать при длительном сокультивировании избыточной пролиферации стромальных клеток монослоя, его предварительно облучают [9] или обрабатывают антимитогенами [10], что приводит к невозможности дальнейшего клинического использования кроветворных клеток, оставшихся ассоциированными с монослоем после экспансии.

Экспансия во всех вышеперечисленных способах суспензионного культивирования или сокульти- 1 026459 вирования на стромальном монослое длится от 7 до 14 дней. После длительной экспансии большинство кроветворных клеток теряет способность к ассоциации со стромальным монослоем. В работе КоЪшкоп N. [8] при общем увеличении СЭ34' клеток пуповинной крови в 8 раз только 1% кроветворных клеток был ассоциирован с монослоем МСК КМ. Кроме того, культивирование свыше 7 дней способствует смещению субпопуляционного состава миелоидных предшественников в сторону увеличения предшественников гранулоцитарно-моноцитарного ряда и относительного уменьшения эритроидных и мегакариоцитарных предшественников [10, 11].

Таким образом, известные способы экспансии кроветворных клеток способствуют утере необходимых молекул адгезии на большей их части, смещению субпопуляционного состава предшественников миелопоэза либо используют клеточные линии или сыворотки ксеногенного происхождения.

Известен способ экспансии мононуклеарных клеток пуповинной крови в присутствии монослоя мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани до достижения монослоя, добавление суспензии пкМНК к монослою ММСК, культивирование в течение 72 ч при концентрации О₂ в среде 5%, отбор непрекрепленных пкМНК и замену среды, продолжение культивирования ММСК с прикрепившимися к ним пкМНК в течение 7 дней при концентрации О₂ в среде 5% [12].

Полученные по этому способу ассоциированные с МСК жировой ткани мононуклеары пуповинной крови содержат менее 40% СИ34+ клеток, не охарактеризованы по их общему приросту, составу миелоидных предшественников, имеют низкую жизнеспособность (78±15%) и культивированы в присутствии сыворотки ксеногенного происхождения, что может препятствовать их клиническому применению.

Задачей предполагаемого изобретения является создание способа эффективной сбалансированной экспансии кроветворных клеток без использования реагентов ксеногенного происхождения, при котором ассоциированная с монослоем стромальных клеток субпопуляция будет максимально сохранена и приумножена.

Поставленная задача решается тем, что способ экспансии ех νίνο кроветворных клеток человека включает предварительное культивирование стромальных клеток из костного мозга пациента в питательной среде с 5% сыворотки крови человека группы ΑΒ(ΐν) до монослоя, добавление к монослою суспензии СИ34+ клеток крови, совместное культивирование в бессывороточной среде с комбинацией факторов роста 8СР (50-100 нг/мл), РИ3-лиганд (РИ3Ь) (50-100 нг/мл), ТРО (20-30 нг/мл) или 8СР (50-100 нг/мл), РИ3Ь (50-100 нг/мл), 1Ь-3 (5-15 нг/мл) в течение 3-х дней при 37°С и 5% СО₂, добавление половинного объема бессывороточной среды с факторами роста и продолжение сокультивирования в течение 1-2 дней, добавление половины первоначального объема бессывороточной среды и культивирования в течение 1 дня, открепление ассоциированных кроветворных и стромальных клеток и объединение их с неприкрепленными клетками. В качестве источника СИ34+ клеток крови используется периферическая или пуповинная кровь человека. В качестве источника стромальных клеток используются мезенхимные стромальные клетки, эндотелиальные клетки, коммитированные в остеогенном направлении мезенхимные стромальные клетки либо смесь вышеуказанных популяций клеток костного мозга.

Использование для получения стромального монослоя любых адгезивных клеток костного мозга, а еще лучше смеси клеток, полученных различными методами, стимулирует сохранение на кроветворных клетках целевых молекул адгезии, с помощью которых кроветворные клетки смогут закрепиться в костно-мозговой нише. Экспериментально нами установлено, что при использовании МСК КМ, полученных различными способами, высокий процент (20-50%) кроветворных клеток ассоциирует с монослоем после их 20-40-кратной экспансии. Добавление факторов 8СР и РД3-лиганда стимулирует активность тирозинкиназ, способствует пролиферации стволовых кроветворных клеток в культуре. Тромбопоэтин (ТРО) или интерлейкин-3 (1Ь-3) в комбинации с 8СР и Р113Ь также синергично стимулируют пролиферацию кроветворных клеток. Синергичный эффект производят также ростовые факторы, секретируемые стромальными клетками монослоя, что позволяет ограничиться в данном способе добавлением комбинации всего трех факторов. Экспериментально определено, что добавление комбинации данных факторов в вышеуказанных концентрациях на 0-й и 3-й день сокультивирования приводит к пропорциональной пролиферации ранних и более поздних олиго-, би- и унипотентных предшественников миелоидного ростка кроветворения, в том числе и способных к ассоциации со стромальным микроокружением, по истечении 5-6 дней. Также подтверждено, что добавление бессывороточной среды без факторов роста за день до прекращения культивирования увеличивает пролиферацию клеток за счет разбавления накопленных метаболитов и пополнения питательных веществ. Способ не включает использование реагентов ксеногенного происхождения, что позволяет применять его в клинической практике.

На фиг. 1 представлен внешний вид совместной культуры СИ34+ клеток периферической крови и аутологичных МСК КМ человека на третий (А) и шестой (Б) дни. Видны темные веретеновидные МСК КМ и темные круглые кроветворные клетки, ассоциированные с МСК КМ, а также светлые круглые неприкрепленные кроветворные клетки.

На фиг. 2 представлено распределение (%) бурстобразующих единиц эритроцитов (БОЕ-Э), колониеобразующих единиц гранулоцитов (КОЕ-Г), макрофагов (КОЕ-М), бипотентных колониеобразующих единиц гранулоцитов-макрофагов (КОЕ-ГМ) и олигопотентных колониеобразующих единиц эритроцитов, гранулоцитов, моноцитов и мегакариоцитов (КОЕ-ГЭММ) среди неприкрепленных и ассоциирован- 2 026459 ных со стромальным монослоем клеток периферической крови после шести дней экспансии.

На фиг. 3 представлен субпопуляционный состав уни-, би- и олигопотентных предшественников миелоидного ряда, выявленный КОЕ-тестом в объединенной популяции неприкрепленных и ассоциированных со стромальным монослоем клеток периферической крови после экспансии в сравнении с аналогичным составом предшественников костного мозга, не подвергавшихся экспансии. Числовые значения отражают усредненное процентное содержание бурстобразующих и колониеобразующих единиц эритроцитов (БОЕ-Э+КОЕ-Э), колониеобразующих единиц гранулоцитов (КОЕ-Г), макрофагов (КОЕ-М), бипотентных колониеобразующих единиц гранулоцитов-макрофагов (КОЕ-ГМ) и олигопотентных колониеобразующих единиц эритроцитов, гранулоцитов, моноцитов и мегакариоцитов (КОЕ-ГЭММ).

На фиг. 4 представлен дот-плот анализ распределения кластеров дифференцировки СИ34 и СГО41 на неприкрепленных (А) и ассоциированных с МСК КМ (Б) кроветворных клетках периферической крови, после экспансии.

На фиг. 5 представлено содержание КОЕ мегакариоцитов в фракциях клеток периферической крови до и после экспансии.

На фиг. 6 представлен дот-плот анализ распределения кластеров дифференцировки СГО34 и СГО45 на клетках образца пуповинной крови до (А) и после экспансии (Б).

На фиг. 7 представлен дот-плот анализ распределения кластеров дифференцировки СИ34 и СГО38 на неприкрепленных (Б) и ассоциированных со стромальным монослоем (В) кроветворных клетках пуповинной крови после экспансии в сравнении с распределением до экспансии (А).

На фиг. 8 представлены бурстобразующие эритроидные колонии (БОЕ-Э) и смешанные колонии олигопотентных миелоидных предшественников гранулоцитов, эритроицитов, моноцитов и мегакариоцитов (КОЕ-ГЭММ), полученные в результате ЬТСЧС-теста кроветворных клеток пуповинной крови, ассоциированных со стромальным монослоем.

Осуществление способа.

Все процедуры (действия) проводят в стерильных условиях.

В качестве источника клеток для монослоя используют мезенхимные стромальные клетки (МСК), эндотелиальные клетки, коммитированные в остеогенном направлении МСК, либо смесь вышеуказанных популяций клеток костного мозга. Культуру эндотелиальных клеток получают по протоколу МагйиРапигс/ [13], коммитированные в остеогенном направлении МСК, как описано в работе Космачевой С.М. [14]. Все перечисленные методы получения культур стромальных клеток выполняются с модификацией: вместо телячьей эмбриональной сыворотки используют 5% сыворотки крови человека группы ΑΒ(ΐν), полученной как описано Игнатенко С.И., 2012 [15]. Стромальные клетки после первого субкультивирования рассевают для получения монослоя в питательной среде с добавлением 5% сыворотки крови человека группы ΑΒ(ΐν). Перед внесением кроветворных клеток питательную среду меняют на бессывороточную среду 31ст3раи Н3000 (81стСс11 Тсс1то1ощс5. Канада) или другую, предназначенную для культивирования кроветворных клеток, в количестве 200 мкл/см² Обогащенную СИ34+ клетками фракцию получают из лейкоцитарного концентрата или мононуклеарной фракции периферической либо пуповинной крови человека с помощью набора для положительной иммуномагнитной сепарации (ЕавуЗср 81стСс11 ТесЬио1од1С5, Канада, или МАСЗ, Му11сиу1 Вю1сс, Германия) согласно инструкции производителя с модификациями: вместо 2% телячьей эмбриональной сыворотки используют сывороточный альбумин человека в концентрации 0,5%. Оценку эффективности сепарации и экспансии проводят после подсчета клеток и исследования экспрессии поверхностных маркеров СГО34 и СИ45 методом проточной цитометрии.

На монослой стромальных клеток костного мозга высевают полученные после сепарации СИ34+ клетки пуповинной крови в концентрации 5 тыс. клеток/см² или периферической крови в концентрации 10 тыс. клеток/см². Сокультивирование проводят при 37°С и 5% СО2 в бессывороточной среде с добавлением комбинации факторов роста ЗСР (50-100 нг/мл), Р113Ь (50-100 нг/мл), ТРО (20-30 нг/мл) или ЗСР (50-100 нг/мл), Р113Ь (50-100 нг/мл), 1Ь-3 (5-15 нг/мл). На 3 день добавляют ¹/2 от первоначального объема бессывороточной среды с факторами роста (100 мкл/см²) и продолжают культивирование 1-2 дня. На 4-5 день добавляют ¹/₂ (100 мкл/см²) от первоначального объема бессывороточной среды без факторов роста, и культивирование продолжают еще 1 день. Ассоциированные кроветворные и стромальные клетки открепляют с помощью 0,25%-ного раствора трипсин-ЭДТА Диуйгодси, США) и объединяют с неприкрепленными клетками.

Пример 1. Экспансия сх У1уо СИ34+ кроветворных клеток периферической крови на монослое аутологичных МСК пациента с множественной миеломой.

Культуру МСК различной степени зрелости получали параллельно двумя методами: прямой адгезией клеток разведенного в 5-10 раз питательной средой МЕМ-α аспирата цельного костного мозга и адгезией мононуклеарной фракции клеток костного мозга [16]. Стромальные клетки объединяли после первого субкультивирования и рассевали для получения монослоя.

Иммуномагнитную СИ34+ сепарацию лейкоконцентрата периферической крови пациента проводили с помощью набора ЕавуЗср производства 81стСс11 ТссЬио1одю5, содержание СИ34+ кроветворных клеток в клеточной смеси после сепарации составило 91%. Полученные СИ34+ кроветворные клетки пе- 3 026459 риферической крови высевали на монослой аутологичных МСК КМ в концентрации 10 т клеток/см² и культивировали в бессывороточной среде 81ет §рап (5>1етСе11 ТесИпо1од1е8) в присутствии факторов роста 8СР 100 нг/мл, РИ-3 Идапд 100 нг/мл и ТРО 25 нг/мл, 200 мкл/см². На 3 день добавляют ¹/₂ от первоначального объема бессывороточной среды с факторами роста, и продолжают культивирование 2 дня. На 5 день добавляют еще 100 мкл/см² бессывороточной среды без факторов роста, и культивирование продолжают еще 1 день. На фиг. 1 представлена фазово-контрастная микроскопия культуры на 3-й день перед повторным добавлением ростовой среды с факторами роста и на 6-й день.

К 6-му дню культивирования более 60% кроветворных клеток экспрессировало ί'Ό34. общее количество кроветворных клеток увеличилось в 18,5 раз, из них СЭ34' клеток в 13,4 раза. Около 41% кроветворных клеток были ассоциированы с монослоем МСК КМ. В табл. 1 представлено распределение поверхностных кластеров дифференцировки стволовых кроветворных клеток, полученное методом проточной цитометрии. Как видно из табл. 1, среди ассоциированых с монослоем МСК КМ кроветворных клеток было больше несущих маркеры стволовых в сравнении с неприкрепленными кроветворными клетками.

Таблица 1

Фенотип стволовых кроветворных клеток	Содержание клеток до экспансии, %	Содержание клеток в субпопуляциях после экспансии, %
неприкрепленные кроветворные клетки	кроветворные клетки, ассоциированные со стромальными
СО34⁺СЦ90*	0,1	0,19	0,42
СЦ34⁺СЦЗЗ'	0,28	0,5	8,5
СО34⁺СО38’	0,05	7	13

Пример 2. Экспансия ех νίνο СЭ34' кроветворных клеток периферической крови пациента с множественной миеломой на монослое МСК КМ здорового донора.

Экспансию СЭ34' клеток пациента с множественной миеломой проводили на монослое МСК КМ здорового донора. Субпопуляционный состав олиго-, би- и унипотентных предшественников миелоидного ряда исследовали методом колониеобразующего теста (КОЕ-тест) в полужидкой среде с цитокинами МеШоСиИ С1а881е Н4434 (§1етСе11 ТесЬпо1од1е8, Канада) в соответствии с инструкцией производителя. Состав и количество колониеобразующих единиц определяли среди кроветворных клеток пациента до и после экспансии.

Общее количество КОЕ после экспансии увеличивалось в 4,5 раза. Как неприкрепленные, так и ассоциированные с монослоем МСК КМ кроветворные клетки содержали в своем составе олиго-, би- и унипотентные предшественники миелоидного ряда, однако распределение отдельных типов предшественников в культуре было неравномерным (фиг. 2). Около 80% всех эритроидных предшественников находилось среди неприкрепленных клеток, в то время как 50% КОЕ-ГМ были ассоциированы с МСК КМ. В объединенной смеси неприкрепленных и ассоциированных с монослоем МСК КМ клеток субпопуляционный состав предшественников различных ростков кроветворения совпадал с исходным распределением КОЕ в костном мозге пациента (фиг. 3).

К 6-му дню экспансии количество ранних мегакариоцитарных предшественников с фенотипом ί'Ό34'ί'Ό41' увеличивалось в 72,1 раза, при этом среди ассоциированных с МСК КМ кроветворных клеток процент ί'Ό34'ί'Ό41' был в 5,7 раз выше (фиг. 4). Дополнительно содержание предшественников тромбоцитарного ростка кроветворения исследовали КОЕ-тестом в среде МедаСиИ (81етСе11 ТесЬио1ощех, Канада), предназначенной для детекции колоний мегакариоцитов. Содержание КОЕ мегакариоцитов среди кроветворных клеток, ассоциированных с МСК КМ, было больше, чем среди неприкрепленных кроветворных клеток (фиг. 5).

Как видно из примера 1 и 2 наряду с сохранением ранних недифференцированных клеток, заявляемый метод экспансии позволяет пропорционально умножить популяции ранних и более поздних олиго-, би- и унипотентных кроветворных предшественников всех миелоидных ростков кроветворения. Стромальный монослой является основным местом образования мегекариоцитарных предшественников, в то время как основной пул эритроидных предшественников обнаруживается среди неприкрепленных кроветворных клеток.

Пример 3. Экспансия ех νί\Ό кроветворных клеток пуповинной крови на монослое МСК КМ здорового донора.

Экспансию ί'Ό34' кроветворных клеток пуповинной крови проводили на монослое МСК КМ здорового донора в бессывороточной среде 81ет§раи с добавлением факторов роста 8СР 100 нг/мл, РИ-3 йдапд 100 нг/мл и ТРО 25 нг/мл так же, как в примере 1. К 6-му дню культивирования общее количество клеток увеличивалось в 42,7±10,4 раза, СЭ34' клеток в 29,4±14,2 раза и КОЕ в 53,4±28,1 раз (п=4), относительное содержание ί'Ό34' клеток уменьшалось (фиг. 6) в среднем с 74±18% до 45±12% (п=7). После экспансии 25% кроветворных клеток пуповинной крови ассоциировало с монослоем МСК КМ. Данная фракция содержала 24±20% от всех СЭ34' клеток (п=5) и 16±5% от всех КОЕ (п=5). Возрастало количе- 4 026459 ство кроветворных клеток, несущих кластеры дифференцировки, характерные для ранних стволовых клеток (СИ34+СИ38^-). Среди ассоциированных со стромальным монослоем кроветворных клеток их доля также была больше в сравнении с неприкрепленными кроветворными клетками (фиг. 7).

Клетки, способные к долговременному восстановлению кроветворения, выявляли ίη νίίτο в КОЕтесте после предварительного культивирования в среде Мус1оСиД (5>1стСс11 ТссНпо1од1С5. Канада), в течение 5 недель (стандартный ЬТС-1С-тест [17]). При анализе ЬТС-1С-тестом неприкрепленных кроветворных клеток после экспансии наблюдали образование мелких колоний гранулоцитарномакрофагального ростка. В популяции кроветворных клеток, ассоциированных с монослоем, кроме гранулоцитарно-макрофагальных выявлялись эритроидные и смешанные колонии КОЕ-ГЭММ (фиг. 8), что свидетельствует о сохранении в данной популяции ранних стволовых кроветворных клеток, долговременно репопулирующих костных мозг. Количество выявляемых в ЬТС-1С-тесте колоний на 1 тыс. кроветворных клеток до и после сокультивирования достоверно не отличалось и составляло в среднем 18±11,5 и 16,2±14,1 соответственно (η=3).

Экспансия кроветворных клеток пуповинной крови по описываемому способу способствовала сохранению высокой жизнеспособности как кроветворных клеток, так и МСК КМ (табл. 2). Количество клеток в апоптозе определялось методом проточной цитометрии по флуоресцентному окрашиванию клеток на Αηη-5 и 7ΆΆΌ. Содержание апоптотических клеток как в раннем (Αηη-5+ 7ΑΑΌ^-), так и в позднем апоптозе (Αηη-5'7ΑΑΌ+) было незначительным как среди МСК КМ, так и среди кроветворных клеток.

Таблица 2

Жизнеспособность клеток пуповинной крови и МСК КМ после шестидневного совместного культивирования

	МСК КМ	Пуповинная кровь
Живые клегки, %	92±6	97,6Ю,4
Ранний апоптоз, Απη⁺ 7ААО, %	4,ИЗ,4	1,810,8
Поздний апоптоз, Αηη⁺ 7ААО⁺, %	4,0±2,8	0,510,4

Таким образом, заявляемый способ экспансии кроветворных клеток на монослое стромальных клеток КМ позволяет решить поставленную задачу значительного прироста СИ34+ кроветворных клеток (10-43 раз) и колониеобразующих предшественников (5-80 раз) как пуповинной, так и периферической крови. Сохранение высокого удельного содержания ассоциированных со стромальным монослоем СИ34+ клеток и КОЕ при высоком их общем приросте и сохранении субпопуляционного состава отличает данный способ экспансии от способов, описанных ранее. Высокая жизнеспособность культур, а также исключение реагентов и клеток ксеногенного происхождения позволяет использовать способ в клинической практике.

Источники информации, принятые во внимание при оформлении заявки:

1. Патент РФ КИ 2360965, МПК С12И 5/08, опубл. 10.07.2009 г.

2. Патент США И8 7723106, МПК С12И 5/00, опубл. 25.05.2010 г.

3. Α1α1<Π Ν., ίίη§ И., Ми11сг К. с! а1.//Ехр НстаФ1, 2009, т. 37 (4), с. 504-513.

4. ίίη§ И., Рошсса Α.ν., Α1;·ι1<Π Ν. с! а1.//НастаФ1одюа, 2010, т. 95 (4), с. 542-550.

5. Патент РФ КИ 2469086, МПК Ο2Ν 5/0789, опубл. 19.12.2011 г.

6. Патент США И8 6642049, МПК Ο2Ν 5/0789, опубл. 04.11.2003 г.

7. Ис Ыта М., Мс№ссс I., КоЪшкоп 8.Ν. й а1.//N Εη§1 ί Мсй., 2012, т. 367 (24), с. 2305-2315.

8. КоЪшкоп δ.Ν., Ν§ ί., №и Т. с! аС/Воис Магго\у Татаркк, 2006, т. 37 (4), с.359-366.

9. УашадисЫ М., Нйауата Ρ., ΙΚ-ιηπί М. с! а1.//Ехр НстаФ1, 2001, т. 29 (2), с. 174-182.

10. Петевка Н.В., Гончарова Н.В., Северин И.Н. и др.//Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, 2012, т. 7 (1), с. 40-48.

11. Воиоп ί., Эа/су В., СаППо! С. с! а1. // Тгаи8&8юи, 2006, т. 46 (11), с.1934-1942.

12. Патент РФ КИ 2525143, МПК Ο2Ν 5/02, 5/07, опубл. 10.08.2014 г.

13. МаПт-Ратис/ ί., НоГтам М., νаη Дсп В1ддс1ааг М. с! а1. // №1Шгс ргоФсок, 2012, т. 7 (9), с. 17091715.

14. Космачева С.М., Данилкович Н.Н., Щепень А.В. и др.//Клеточные технологии в биологии и медицине, 2013, т. 4, с. 210-216.

15. Игнатенко С.И., Космачева С.М., Гончарова Н.В. // Медицина, 2012, т. 4, с. 90-92.

16. Игнатенко С.И., Космачева С.М., Петевка Н.В., Потапнев М.П. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, 2010, т. 5 (3), с. 30, 31.

17. Нитаη Ьо^-Тсгт Си1ίи^с-Iи^ί^аί^ηд Сс11 (ЬТС-1С). Άδδау Тсс1ипса1 Маш иа1.//Ьίίр://№№№.δίстсс11.сοт/си/ТссЬи^са1-Ксδοи^ссδ/άЪ5а9/28412_1ίс_^с-Н.аδрx.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ экспансии ех νίνο кроветворных клеток человека, включающий предварительное культивирование стромальных клеток из костного мозга пациента в питательной среде с 5% сыворотки крови человека группы АБ(1У) до монослоя, добавление к монослою суспензии СЭ34' клеток крови, совместное культивирование в бессывороточной среде с комбинацией факторов роста 8СР (50-100 нг/мл), ΡΐΐЗЫдаиб (50-100 нг/мл), ТРО (20-30 нг/мл) или §СР (50-100 нг/мл), РИ-ЗЫдаиб (50-100 нг/мл), 1Ь-3 (5-15 нг/мл) в течение 3-х дней при 37°С и 5% СО₂, добавление половинного объема бессывороточной среды с факторами роста и продолжение сокультивирования в течение 1-2 дней, добавление половины первоначального объема бессывороточной среды и продолжение культивирования в течение 1 дня, открепление ассоциированных кроветворных и стромальных клеток и объединение их с неприкрепленными клетками.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве источника СИ34+ клеток крови используют периферическую кровь человека.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве источника СИ34+ клеток крови используют пуповинную кровь человека.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве стромальных клеток используют мезенхимные стромальные клетки, эндотелиальные клетки, коммитированные в остеогенном направлении мезенхимные клетки либо смесь вышеуказанных популяций клеток костного мозга.