EA026459B1 - Method of ex vitro human hemopoietic cells expansion - Google Patents
Method of ex vitro human hemopoietic cells expansion Download PDFInfo
- Publication number
- EA026459B1 EA026459B1 EA201500099A EA201500099A EA026459B1 EA 026459 B1 EA026459 B1 EA 026459B1 EA 201500099 A EA201500099 A EA 201500099A EA 201500099 A EA201500099 A EA 201500099A EA 026459 B1 EA026459 B1 EA 026459B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- cells
- monolayer
- expansion
- serum
- blood
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области клеточной биотехнологии, а более конкретно к способу экспансии ех νίνο кроветворных клеток, и может быть использовано как в научных целях, так и в медицине для восстановления кроветворения у пациентов после высокодозной химиотерапии.The invention relates to the field of cell biotechnology, and more specifically to a method of expansion of ex νίνο hematopoietic cells, and can be used both for scientific purposes and in medicine to restore blood formation in patients after high-dose chemotherapy.
Трансплантацию кроветворных клеток проводят пациентам с гематологическими и онкологическими заболеваниями для восстановления кроветворения после высокодозной химиотерапии. Источником трансплантата могут быть костный мозг, периферическая кровь после мобилизации стволовых клеток, а также пуповинная кровь. Наличие стволовых кроветворных клеток в трансплантате подтверждается содержанием клеток, одновременно экспонирующих поверхностные кластеры дифференцировки СЭ34 и СЭ45. или содержанием клеток, способных к колониеобразованию ίη νίΐτο в полужидкой среде (колониеобразующие единицы, КОЕ). При этом положительным прогностическим фактором приживления трансплантата является наличие в нем не менее 2х 106 0034-положительных (СЭ34+) клеток в расчете на килограмм веса пациента. Низкое содержание С.О34' клеток в трансплантате приводит к длительному периоду постхимиотерапевтической цитопении и связанным с ней опасным для жизни пациентов осложнениям. В то время как основным ограничителем для использования кроветворных клеток костного мозга являются показатели иммунологической совместимости, для таких источников как пуповинная кровь, а в ряде случаев и аутологичная периферическая кровь, главным ограничителем остается недостаток кроветворных клеток в заготовленном трансплантате.Hematopoietic cell transplantation is performed for patients with hematological and oncological diseases to restore blood formation after high-dose chemotherapy. The bone marrow, peripheral blood after stem cell mobilization, and cord blood can be a source of transplant. The presence of hematopoietic stem cells in the transplant is confirmed by the content of cells that simultaneously exhibit surface differentiation clusters SE34 and SE45. or the content of cells capable of colony formation ίη νίΐτο in a semi-liquid medium (colony forming units, CFU). At the same time, the presence of at least 2 × 10 6 0034-positive (SE34 +) cells per kilogram of patient weight is a positive prognostic factor for graft engraftment. The low content of C. O34 'cells in the transplant leads to a long period of post-chemotherapeutic cytopenia and associated complications that are life-threatening for patients. While the main limiter for the use of hematopoietic bone marrow cells is immunological compatibility, for sources such as umbilical cord blood, and in some cases autologous peripheral blood, the main limiter is the lack of hematopoietic cells in the prepared transplant.
Проблему можно преодолеть размножением (экспансией) кроветворных клеток в условиях ех νίνο. При этом технология экспансии должна обеспечивать оптимальное сохранение и пропорциональное умножение популяций 0034' кроветворных клеток (как недифференцированных, так и более поздних кроветворных предшественников всех миелоидных ростков кроветворения), способных к миграции в костный мозг, ассоциации со стромальным микроокружением и полноценному восстановлению кроветворения.The problem can be overcome by reproduction (expansion) of hematopoietic cells under ex νίνο conditions. Moreover, the expansion technology should ensure optimal preservation and proportional multiplication of 0034 'hematopoietic cell populations (both undifferentiated and later hematopoietic precursors of all myeloid hematopoietic germs) capable of migration to the bone marrow, association with stromal microenvironment and full restoration of hematopoiesis.
Известен ряд публикаций, в которых описаны способы увеличения ех νίνο количества кроветворных клеток в суспензионной культуре с использованием сочетаний стимуляторов и ингибиторов клеточного деления и дифференцировки [1, 2]. В данных способах для регуляции пролиферации и дифференцировки кроветворных клеток используют большое количество дорогостоящих рекомбинантных факторов, многие из которых (1Ь-3, 1Ь-11, С-С8Р, СМ-С8Р) стимулируют не только деление клеток, но и их преждевременное созревание, что снижает их потенциал восстановления кроветворения. Главным недостатком экспансии кроветворных клеток в суспензионной культуре (без использования стромального монослоя) является отсутствие сигналов к синтезу молекул адгезии, необходимых для последующего приживления клеток в костном мозге после трансплантации [3].A number of publications are known that describe methods for increasing ex νίνο the number of hematopoietic cells in suspension culture using combinations of stimulators and inhibitors of cell division and differentiation [1, 2]. In these methods, a large number of expensive recombinant factors are used to regulate the proliferation and differentiation of hematopoietic cells, many of which (1L-3, 1L-11, C-C8P, CM-C8P) stimulate not only cell division, but also their premature maturation, which reduces their potential to restore blood formation. The main drawback of hematopoietic cell expansion in suspension culture (without using the stromal monolayer) is the lack of signals for the synthesis of adhesion molecules necessary for subsequent engraftment of cells in the bone marrow after transplantation [3].
Известны способы экспансии кроветворных клеток костного мозга с использованием монослоя стромальных клеток, поддерживающего кроветворение. Авторами ίίη§ Ό., Ροη5еса А.У., А1аке1 N. показано, что поверхность стромального монослоя является главным местом пролиферации кроветворных клеток костного мозга ίη νίΐτο, тогда как компартмент под слоем стромальных клеток имитирует нишу для сохранения ранних неделящихся стволовых клеток [4]. Теми же авторами показано, что кроветворные клетки, ассоциированные с монослоем стромальных клеток, экспрессируют более высокий уровень молекул адгезии и имеют более подходящие для трансплантации характеристики (более высокую миграционную способность и способность к самовоспроизведению, меньшую дифференцированность) [3].Known methods for the expansion of hematopoietic cells of the bone marrow using a monolayer of stromal cells that supports hematopoiesis. The authors ίίη§ Ό., Ροη5ес A.U., A1ake1 N. showed that the surface of the stromal monolayer is the main site of proliferation of hematopoietic cells of the bone marrow ίη νίΐτο, while the compartment under the stromal cell layer imitates a niche for preserving early non-dividing stem cells [4] . The same authors showed that hematopoietic cells associated with a monolayer of stromal cells express a higher level of adhesion molecules and have characteristics that are more suitable for transplantation (higher migration ability and self-reproduction ability, less differentiation) [3].
Известен способ экспансии кроветворных клеток с использованием монослоя стромальной клеточной линии ксеногенного происхождения, в котором экспансию С.О34' клеток пуповинной крови человека производят в бессывороточной среде, где для формирования монослоя используют линию стромальных клеток костного мозга мыши 0Р9 [5].A known method of expansion of hematopoietic cells using a monolayer of stromal cell line of xenogenic origin, in which C.O34 'expansion of human cord blood cells is performed in serum-free medium, where the mouse bone marrow stromal cell line 0P9 is used to form a monolayer [5].
Известен также способ экспансии кроветворных клеток с использованием монослоя клеток человека не костно-мозгового происхождении, в котором для поддержания экспансии С.О34' клеток костного мозга использованы кадаверные эндотелиальные клетки головного мозга человека [6]. В известном способе за семь дней культивирования только 10% кроветворных клеток ассоциировалось с монослоем. Во всех вышеперечисленных способах для получения стромального монослоя использовали ксеногенную телячью эмбриональную сыворотку, которая является источником чужеродных антигенов, способствующих развитию патологических иммунных реакций после трансплантации.There is also known a method for the expansion of hematopoietic cells using a monolayer of human cells of non-bone marrow origin, in which cadaver endothelial cells of the human brain are used to maintain the expansion of C. O34 'bone marrow cells [6]. In the known method for seven days of cultivation, only 10% of hematopoietic cells were associated with a monolayer. In all of the above methods, xenogenic calf embryonic serum was used to obtain a stromal monolayer, which is a source of foreign antigens that contribute to the development of pathological immune reactions after transplantation.
Среди известных источников стромальных клеток для формирования монослоя наиболее привлекательными являются мезенхимные стромальные клетки костного мозга (МСК КМ) человека. МСК КМ являются частью естественного микроокружения кроветворных клеток, взаимодействие с ними позволяет сохранить целевые рецепторы адгезии и хоуминга. Существуют методы экспансии кроветворных клеток в присутствии монослоя МСК КМ, однако в большинстве способов для его получения также используют ксеногенную телячью эмбриональную сыворотку или сыворотку крови лошади [3, 4, 7-9]. В некоторых случаях, чтобы избежать при длительном сокультивировании избыточной пролиферации стромальных клеток монослоя, его предварительно облучают [9] или обрабатывают антимитогенами [10], что приводит к невозможности дальнейшего клинического использования кроветворных клеток, оставшихся ассоциированными с монослоем после экспансии.Among the known sources of stromal cells for the formation of a monolayer, the most attractive are mesenchymal stromal bone marrow cells (MSC CM) of a person. MSCs KM are part of the natural microenvironment of hematopoietic cells, interaction with them allows you to save the target adhesion and homing receptors. There are methods for the expansion of hematopoietic cells in the presence of a monolayer of MSC KM, however, in most methods, xenogenic calf fetal serum or horse blood serum is also used to obtain it [3, 4, 7-9]. In some cases, in order to avoid a prolonged co-cultivation of excessive proliferation of stromal cells of a monolayer, it is preliminarily irradiated [9] or treated with antimitogens [10], which leads to the impossibility of further clinical use of hematopoietic cells remaining associated with the monolayer after expansion.
Экспансия во всех вышеперечисленных способах суспензионного культивирования или сокульти- 1 026459 вирования на стромальном монослое длится от 7 до 14 дней. После длительной экспансии большинство кроветворных клеток теряет способность к ассоциации со стромальным монослоем. В работе КоЪшкоп N. [8] при общем увеличении СЭ34' клеток пуповинной крови в 8 раз только 1% кроветворных клеток был ассоциирован с монослоем МСК КМ. Кроме того, культивирование свыше 7 дней способствует смещению субпопуляционного состава миелоидных предшественников в сторону увеличения предшественников гранулоцитарно-моноцитарного ряда и относительного уменьшения эритроидных и мегакариоцитарных предшественников [10, 11].The expansion in all of the above methods of suspension cultivation or co-cultivation on the stromal monolayer lasts from 7 to 14 days. After prolonged expansion, most hematopoietic cells lose their ability to associate with the stromal monolayer. In the work of Könchkop N. [8], with a total increase in CE34 'of cord blood cells by 8 times, only 1% of hematopoietic cells was associated with a monolayer of MSC CM. In addition, cultivation of more than 7 days contributes to a shift in the subpopulation composition of myeloid progenitors towards an increase in granulocyte-monocyte precursors and a relative decrease in erythroid and megakaryocytic precursors [10, 11].
Таким образом, известные способы экспансии кроветворных клеток способствуют утере необходимых молекул адгезии на большей их части, смещению субпопуляционного состава предшественников миелопоэза либо используют клеточные линии или сыворотки ксеногенного происхождения.Thus, the known methods for the expansion of hematopoietic cells contribute to the loss of the necessary adhesion molecules in most of them, the displacement of the subpopulation composition of myelopoiesis precursors, or cell lines or serums of xenogenic origin are used.
Известен способ экспансии мононуклеарных клеток пуповинной крови в присутствии монослоя мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани до достижения монослоя, добавление суспензии пкМНК к монослою ММСК, культивирование в течение 72 ч при концентрации О2 в среде 5%, отбор непрекрепленных пкМНК и замену среды, продолжение культивирования ММСК с прикрепившимися к ним пкМНК в течение 7 дней при концентрации О2 в среде 5% [12].A known method of expansion of umbilical cord blood mononuclear cells in the presence of a monolayer of multipotent mesenchymal stromal adipose tissue cells until a monolayer is achieved, adding a suspension of pcMNA to the MMSC monolayer, culturing for 72 hours at a concentration of 2 in an environment of 5%, selecting non-attached pcMNAs and replacing the medium, continued cultivation MMSCs with pcMNAs attached to them for 7 days at a concentration of O 2 in the medium of 5% [12].
Полученные по этому способу ассоциированные с МСК жировой ткани мононуклеары пуповинной крови содержат менее 40% СИ34+ клеток, не охарактеризованы по их общему приросту, составу миелоидных предшественников, имеют низкую жизнеспособность (78±15%) и культивированы в присутствии сыворотки ксеногенного происхождения, что может препятствовать их клиническому применению.The umbilical cord blood mononuclear cells obtained with this method associated with MSCs of adipose tissue contain less than 40% SI34 + cells, are not characterized by their overall growth, the composition of myeloid precursors, have low viability (78 ± 15%) and are cultured in the presence of serum of xenogenic origin, which may inhibit their clinical use.
Задачей предполагаемого изобретения является создание способа эффективной сбалансированной экспансии кроветворных клеток без использования реагентов ксеногенного происхождения, при котором ассоциированная с монослоем стромальных клеток субпопуляция будет максимально сохранена и приумножена.The objective of the proposed invention is to provide a method for efficient balanced expansion of hematopoietic cells without the use of reagents of xenogenic origin, in which the subpopulation associated with a monolayer of stromal cells will be maximally preserved and multiplied.
Поставленная задача решается тем, что способ экспансии ех νίνο кроветворных клеток человека включает предварительное культивирование стромальных клеток из костного мозга пациента в питательной среде с 5% сыворотки крови человека группы ΑΒ(ΐν) до монослоя, добавление к монослою суспензии СИ34+ клеток крови, совместное культивирование в бессывороточной среде с комбинацией факторов роста 8СР (50-100 нг/мл), РИ3-лиганд (РИ3Ь) (50-100 нг/мл), ТРО (20-30 нг/мл) или 8СР (50-100 нг/мл), РИ3Ь (50-100 нг/мл), 1Ь-3 (5-15 нг/мл) в течение 3-х дней при 37°С и 5% СО2, добавление половинного объема бессывороточной среды с факторами роста и продолжение сокультивирования в течение 1-2 дней, добавление половины первоначального объема бессывороточной среды и культивирования в течение 1 дня, открепление ассоциированных кроветворных и стромальных клеток и объединение их с неприкрепленными клетками. В качестве источника СИ34+ клеток крови используется периферическая или пуповинная кровь человека. В качестве источника стромальных клеток используются мезенхимные стромальные клетки, эндотелиальные клетки, коммитированные в остеогенном направлении мезенхимные стромальные клетки либо смесь вышеуказанных популяций клеток костного мозга.The problem is solved in that the method of expansion of ex νίνο human blood-forming cells involves pre-culturing stromal cells from the patient’s bone marrow in a nutrient medium with 5% of human blood serum of group ΑΒ (ΐν) to a monolayer, adding a suspension of SI34 + blood cells to the monolayer, co-culturing in serum-free medium with a combination of growth factors 8СР (50-100 ng / ml), РИ3-ligand (РИ3Ь) (50-100 ng / ml), TPO (20-30 ng / ml) or 8СР (50-100 ng / ml) , RI3 (50-100 ng / ml), 1b-3 (5-15 ng / ml) for 3 days at 37 ° C and 5% CO 2, the addition is half volume of serum-free medium with growth factors and co-cultivation continued for 1-2 days, adding half the original volume of serum-free medium and culturing for 1 day, detach associated hematopoietic and stromal cells, and their association with unattached cells. Human peripheral or cord blood is used as a source of SI34 + blood cells. As a source of stromal cells, mesenchymal stromal cells, endothelial cells, osteogenically committed mesenchymal stromal cells, or a mixture of the above populations of bone marrow cells are used.
Использование для получения стромального монослоя любых адгезивных клеток костного мозга, а еще лучше смеси клеток, полученных различными методами, стимулирует сохранение на кроветворных клетках целевых молекул адгезии, с помощью которых кроветворные клетки смогут закрепиться в костно-мозговой нише. Экспериментально нами установлено, что при использовании МСК КМ, полученных различными способами, высокий процент (20-50%) кроветворных клеток ассоциирует с монослоем после их 20-40-кратной экспансии. Добавление факторов 8СР и РД3-лиганда стимулирует активность тирозинкиназ, способствует пролиферации стволовых кроветворных клеток в культуре. Тромбопоэтин (ТРО) или интерлейкин-3 (1Ь-3) в комбинации с 8СР и Р113Ь также синергично стимулируют пролиферацию кроветворных клеток. Синергичный эффект производят также ростовые факторы, секретируемые стромальными клетками монослоя, что позволяет ограничиться в данном способе добавлением комбинации всего трех факторов. Экспериментально определено, что добавление комбинации данных факторов в вышеуказанных концентрациях на 0-й и 3-й день сокультивирования приводит к пропорциональной пролиферации ранних и более поздних олиго-, би- и унипотентных предшественников миелоидного ростка кроветворения, в том числе и способных к ассоциации со стромальным микроокружением, по истечении 5-6 дней. Также подтверждено, что добавление бессывороточной среды без факторов роста за день до прекращения культивирования увеличивает пролиферацию клеток за счет разбавления накопленных метаболитов и пополнения питательных веществ. Способ не включает использование реагентов ксеногенного происхождения, что позволяет применять его в клинической практике.The use of any adhesive bone marrow adhesive cells to obtain a stromal monolayer, or even better a mixture of cells obtained by various methods, stimulates the preservation of target adhesion molecules on hematopoietic cells, with which hematopoietic cells can be fixed in the marrow niche. We experimentally found that when using MSCs CM obtained in various ways, a high percentage (20-50%) of hematopoietic cells associates with a monolayer after their 20-40-fold expansion. The addition of 8CP and RD3 ligand factors stimulates the activity of tyrosine kinases and promotes the proliferation of hematopoietic stem cells in culture. Thrombopoietin (TPO) or interleukin-3 (1L-3) in combination with 8CP and P113b also synergistically stimulate the proliferation of hematopoietic cells. The synergistic effect is also produced by growth factors secreted by the stromal cells of the monolayer, which allows us to confine ourselves to this method by adding a combination of only three factors. It was experimentally determined that the addition of a combination of these factors in the above concentrations on the 0th and 3rd day of co-cultivation leads to proportional proliferation of early and later oligo-, bi- and unipotent precursors of the myeloid hematopoiesis, including those capable of association with stromal microenvironment, after 5-6 days. It is also confirmed that the addition of serum-free medium without growth factors the day before the termination of cultivation increases cell proliferation by diluting accumulated metabolites and replenishing nutrients. The method does not include the use of reagents of xenogenic origin, which allows its use in clinical practice.
На фиг. 1 представлен внешний вид совместной культуры СИ34+ клеток периферической крови и аутологичных МСК КМ человека на третий (А) и шестой (Б) дни. Видны темные веретеновидные МСК КМ и темные круглые кроветворные клетки, ассоциированные с МСК КМ, а также светлые круглые неприкрепленные кроветворные клетки.In FIG. Figure 1 shows the appearance of a co-culture of SI34 + peripheral blood cells and autologous MSCs of human CM on the third (A) and sixth (B) days. Dark spindle-shaped MSC KM and dark round hematopoietic cells associated with MSC KM are visible, as well as light round unattached hematopoietic cells.
На фиг. 2 представлено распределение (%) бурстобразующих единиц эритроцитов (БОЕ-Э), колониеобразующих единиц гранулоцитов (КОЕ-Г), макрофагов (КОЕ-М), бипотентных колониеобразующих единиц гранулоцитов-макрофагов (КОЕ-ГМ) и олигопотентных колониеобразующих единиц эритроцитов, гранулоцитов, моноцитов и мегакариоцитов (КОЕ-ГЭММ) среди неприкрепленных и ассоциирован- 2 026459 ных со стромальным монослоем клеток периферической крови после шести дней экспансии.In FIG. 2 shows the distribution (%) of burst-forming units of red blood cells (PFU-E), colony-forming units of granulocytes (CFU-G), macrophages (CFU-M), bipotent colony-forming units of granulocyte-macrophages (CFU-GM) and oligopotent colony-forming units of red blood cells, granulocytes monocytes and megakaryocytes (CFU-HEMM) among unattached and associated with stromal monolayer of peripheral blood cells after six days of expansion.
На фиг. 3 представлен субпопуляционный состав уни-, би- и олигопотентных предшественников миелоидного ряда, выявленный КОЕ-тестом в объединенной популяции неприкрепленных и ассоциированных со стромальным монослоем клеток периферической крови после экспансии в сравнении с аналогичным составом предшественников костного мозга, не подвергавшихся экспансии. Числовые значения отражают усредненное процентное содержание бурстобразующих и колониеобразующих единиц эритроцитов (БОЕ-Э+КОЕ-Э), колониеобразующих единиц гранулоцитов (КОЕ-Г), макрофагов (КОЕ-М), бипотентных колониеобразующих единиц гранулоцитов-макрофагов (КОЕ-ГМ) и олигопотентных колониеобразующих единиц эритроцитов, гранулоцитов, моноцитов и мегакариоцитов (КОЕ-ГЭММ).In FIG. Figure 3 shows the subpopulation composition of uni-, bi-, and oligopotent precursors of the myeloid series, revealed by the CFU test in the combined population of peripheral blood cells that were not attached and associated with the stromal monolayer after expansion compared with the same composition of bone marrow precursors that did not undergo expansion. Numerical values reflect the average percentage of burst-forming and colony-forming units of red blood cells (PFU-E + CFU-E), colony-forming units of granulocytes (CFU-G), macrophages (CFU-M), bipotent colony-forming units of granulocyte macrophages (CFU-GM) and oligopotent colony forming units of red blood cells, granulocytes, monocytes and megakaryocytes (CFU-HEMM).
На фиг. 4 представлен дот-плот анализ распределения кластеров дифференцировки СИ34 и СГО41 на неприкрепленных (А) и ассоциированных с МСК КМ (Б) кроветворных клетках периферической крови, после экспансии.In FIG. Figure 4 shows a dot-raft analysis of the distribution of SI34 and CGO41 differentiation clusters on non-attached (A) and peripheral blood-forming hematopoietic cells associated with MSC CM (B), after expansion.
На фиг. 5 представлено содержание КОЕ мегакариоцитов в фракциях клеток периферической крови до и после экспансии.In FIG. Figure 5 shows the CFU content of megakaryocytes in the peripheral blood cell fractions before and after expansion.
На фиг. 6 представлен дот-плот анализ распределения кластеров дифференцировки СГО34 и СГО45 на клетках образца пуповинной крови до (А) и после экспансии (Б).In FIG. Figure 6 shows the dot-raft analysis of the distribution of the differentiation clusters CGO34 and CGO45 on cells of a cord blood sample before (A) and after expansion (B).
На фиг. 7 представлен дот-плот анализ распределения кластеров дифференцировки СИ34 и СГО38 на неприкрепленных (Б) и ассоциированных со стромальным монослоем (В) кроветворных клетках пуповинной крови после экспансии в сравнении с распределением до экспансии (А).In FIG. Figure 7 shows a dot-raft analysis of the distribution of SI34 and CGO38 differentiation clusters on loose (B) and associated with the stromal monolayer (C) hematopoietic cord blood cells after expansion compared with the distribution before expansion (A).
На фиг. 8 представлены бурстобразующие эритроидные колонии (БОЕ-Э) и смешанные колонии олигопотентных миелоидных предшественников гранулоцитов, эритроицитов, моноцитов и мегакариоцитов (КОЕ-ГЭММ), полученные в результате ЬТСЧС-теста кроветворных клеток пуповинной крови, ассоциированных со стромальным монослоем.In FIG. Figure 8 shows burst-forming erythroid colonies (PFU-E) and mixed colonies of oligopotent myeloid precursors of granulocytes, erythrocytes, monocytes and megakaryocytes (CFU-HEMM), obtained as a result of the LTSC test of hematopoietic cord blood cells associated with stromal monolayer.
Осуществление способа.The implementation of the method.
Все процедуры (действия) проводят в стерильных условиях.All procedures (actions) are carried out under sterile conditions.
В качестве источника клеток для монослоя используют мезенхимные стромальные клетки (МСК), эндотелиальные клетки, коммитированные в остеогенном направлении МСК, либо смесь вышеуказанных популяций клеток костного мозга. Культуру эндотелиальных клеток получают по протоколу МагйиРапигс/ [13], коммитированные в остеогенном направлении МСК, как описано в работе Космачевой С.М. [14]. Все перечисленные методы получения культур стромальных клеток выполняются с модификацией: вместо телячьей эмбриональной сыворотки используют 5% сыворотки крови человека группы ΑΒ(ΐν), полученной как описано Игнатенко С.И., 2012 [15]. Стромальные клетки после первого субкультивирования рассевают для получения монослоя в питательной среде с добавлением 5% сыворотки крови человека группы ΑΒ(ΐν). Перед внесением кроветворных клеток питательную среду меняют на бессывороточную среду 31ст3раи Н3000 (81стСс11 Тсс1то1ощс5. Канада) или другую, предназначенную для культивирования кроветворных клеток, в количестве 200 мкл/см2 Обогащенную СИ34+ клетками фракцию получают из лейкоцитарного концентрата или мононуклеарной фракции периферической либо пуповинной крови человека с помощью набора для положительной иммуномагнитной сепарации (ЕавуЗср 81стСс11 ТесЬио1од1С5, Канада, или МАСЗ, Му11сиу1 Вю1сс, Германия) согласно инструкции производителя с модификациями: вместо 2% телячьей эмбриональной сыворотки используют сывороточный альбумин человека в концентрации 0,5%. Оценку эффективности сепарации и экспансии проводят после подсчета клеток и исследования экспрессии поверхностных маркеров СГО34 и СИ45 методом проточной цитометрии.As a source of cells for the monolayer, mesenchymal stromal cells (MSCs), endothelial cells committed in the osteogenic direction of MSCs, or a mixture of the above populations of bone marrow cells are used. The endothelial cell culture is obtained according to the Magyi Rapigs / protocol [13], committed in the osteogenic direction of MSCs, as described in the work of S. Kosmacheva. [14]. All of the above methods for obtaining stromal cell cultures are performed with the modification: instead of calf embryonic serum, 5% of human blood serum of group ΑΒ (ΐν), obtained as described by Ignatenko SI, 2012 [15], is used. After the first subculture, the stromal cells are seeded to obtain a monolayer in a nutrient medium with the addition of 5% human serum of group ΑΒ (ΐν). Before the introduction of hematopoietic cells, the nutrient medium is changed to serum-free medium 31st3 rai Н3000 (81stСс11 Тсс1to1oshchs.5. Canada) or another, intended for the cultivation of hematopoietic cells, in an amount of 200 μl / cm 2 The fraction enriched with SI34 + cells is obtained from a leukocyte concentrate or a mononuclear fraction of peripheral blood or using a kit for positive immunomagnetic separation (EavuZsr 81stSs11 Tesbio1od1C5, Canada, or MASZ, Mu11siu1 Vu1ss, Germany) according to the manufacturer's instructions with modi atsiyami: instead of 2% fetal calf serum using human serum albumin in a concentration of 0.5%. Evaluation of the effectiveness of separation and expansion is carried out after cell counting and study of the expression of surface markers SGO34 and SI45 by flow cytometry.
На монослой стромальных клеток костного мозга высевают полученные после сепарации СИ34+ клетки пуповинной крови в концентрации 5 тыс. клеток/см2 или периферической крови в концентрации 10 тыс. клеток/см2. Сокультивирование проводят при 37°С и 5% СО2 в бессывороточной среде с добавлением комбинации факторов роста ЗСР (50-100 нг/мл), Р113Ь (50-100 нг/мл), ТРО (20-30 нг/мл) или ЗСР (50-100 нг/мл), Р113Ь (50-100 нг/мл), 1Ь-3 (5-15 нг/мл). На 3 день добавляют 1/2 от первоначального объема бессывороточной среды с факторами роста (100 мкл/см2) и продолжают культивирование 1-2 дня. На 4-5 день добавляют 1/2 (100 мкл/см2) от первоначального объема бессывороточной среды без факторов роста, и культивирование продолжают еще 1 день. Ассоциированные кроветворные и стромальные клетки открепляют с помощью 0,25%-ного раствора трипсин-ЭДТА Диуйгодси, США) и объединяют с неприкрепленными клетками.On a monolayer of bone marrow stromal cells, umbilical cord blood cells obtained after separation of SI34 + are sown at a concentration of 5 thousand cells / cm 2 or peripheral blood at a concentration of 10 thousand cells / cm 2 . Co-cultivation is carried out at 37 ° C and 5% CO2 in serum-free medium with the addition of a combination of growth factors ZSR (50-100 ng / ml), P113b (50-100 ng / ml), TPO (20-30 ng / ml) or ZSR ( 50-100 ng / ml), P113b (50-100 ng / ml), 1b-3 (5-15 ng / ml). On day 3, add 1/2 of the initial volume of serum-free medium with growth factors (100 μl / cm 2 ) and continue cultivation for 1-2 days. At 4-5 day add 1/2 (100 l / cm 2) from the original volume of serum-free medium without growth factors and culturing was continued for another 1 day. Associated hematopoietic and stromal cells are unfastened with 0.25% trypsin-EDTA solution Diuigodsi, USA) and combined with unattached cells.
Пример 1. Экспансия сх У1уо СИ34+ кроветворных клеток периферической крови на монослое аутологичных МСК пациента с множественной миеломой.Example 1. The expansion of cx Y1uo SI34 + hematopoietic cells of peripheral blood on a monolayer of autologous MSCs of a patient with multiple myeloma.
Культуру МСК различной степени зрелости получали параллельно двумя методами: прямой адгезией клеток разведенного в 5-10 раз питательной средой МЕМ-α аспирата цельного костного мозга и адгезией мононуклеарной фракции клеток костного мозга [16]. Стромальные клетки объединяли после первого субкультивирования и рассевали для получения монослоя.MSC culture of various maturity was obtained in parallel by two methods: direct adhesion of cells diluted 5-10 times with nutrient medium MEM-α whole bone marrow aspirate and adhesion of the mononuclear fraction of bone marrow cells [16]. Stromal cells were combined after the first subculture and scattered to obtain a monolayer.
Иммуномагнитную СИ34+ сепарацию лейкоконцентрата периферической крови пациента проводили с помощью набора ЕавуЗср производства 81стСс11 ТссЬио1одю5, содержание СИ34+ кроветворных клеток в клеточной смеси после сепарации составило 91%. Полученные СИ34+ кроветворные клетки пе- 3 026459 риферической крови высевали на монослой аутологичных МСК КМ в концентрации 10 т клеток/см2 и культивировали в бессывороточной среде 81ет §рап (5>1етСе11 ТесИпо1од1е8) в присутствии факторов роста 8СР 100 нг/мл, РИ-3 Идапд 100 нг/мл и ТРО 25 нг/мл, 200 мкл/см2. На 3 день добавляют 1/2 от первоначального объема бессывороточной среды с факторами роста, и продолжают культивирование 2 дня. На 5 день добавляют еще 100 мкл/см2 бессывороточной среды без факторов роста, и культивирование продолжают еще 1 день. На фиг. 1 представлена фазово-контрастная микроскопия культуры на 3-й день перед повторным добавлением ростовой среды с факторами роста и на 6-й день.The immunomagnetic SI34 + separation of the patient’s peripheral blood leukoconcentrate was carried out using the Evav3Sp kit manufactured by 81stCc11 TccLio1ode5; the SI34 + content of hematopoietic cells in the cell mixture after separation was 91%. The obtained SI34 + hematopoietic cells of peripheral blood were plated on a monolayer of autologous MSC KM at a concentration of 10 t cells / cm 2 and cultured in serum-free medium 81 et §rap (5> 1etCe11 TesIpo1od1e8) in the presence of growth factors 8СР 100 ng / ml, РИ- 3 Idapd 100 ng / ml and TPO 25 ng / ml, 200 μl / cm 2 . On day 3, add 1/2 of the original volume of serum-free medium with growth factor, and the culture is continued for 2 days. On day 5, add another 100 μl / cm 2 serum-free medium without growth factors, and cultivation is continued for another day. In FIG. Figure 1 shows phase contrast microscopy of the culture on the 3rd day before re-adding the growth medium with growth factors and on the 6th day.
К 6-му дню культивирования более 60% кроветворных клеток экспрессировало ί'Ό34. общее количество кроветворных клеток увеличилось в 18,5 раз, из них СЭ34' клеток в 13,4 раза. Около 41% кроветворных клеток были ассоциированы с монослоем МСК КМ. В табл. 1 представлено распределение поверхностных кластеров дифференцировки стволовых кроветворных клеток, полученное методом проточной цитометрии. Как видно из табл. 1, среди ассоциированых с монослоем МСК КМ кроветворных клеток было больше несущих маркеры стволовых в сравнении с неприкрепленными кроветворными клетками.By the 6th day of cultivation, more than 60% of hematopoietic cells expressed ί'Ό34. the total number of hematopoietic cells increased by 18.5 times, of which CE34 'cells by 13.4 times. About 41% of hematopoietic cells were associated with a monolayer of MSC KM. In the table. Figure 1 shows the distribution of surface clusters of differentiation of hematopoietic stem cells obtained by flow cytometry. As can be seen from the table. 1, among hematopoietic CM associated with the MSC monolayer, there were more stem-bearing markers in comparison with unattached hematopoietic cells.
Таблица 1Table 1
Пример 2. Экспансия ех νίνο СЭ34' кроветворных клеток периферической крови пациента с множественной миеломой на монослое МСК КМ здорового донора.Example 2. The expansion of ex νίνο СЭ34 'hematopoietic cells of the peripheral blood of a patient with multiple myeloma on the monolayer of MSC KM healthy donor.
Экспансию СЭ34' клеток пациента с множественной миеломой проводили на монослое МСК КМ здорового донора. Субпопуляционный состав олиго-, би- и унипотентных предшественников миелоидного ряда исследовали методом колониеобразующего теста (КОЕ-тест) в полужидкой среде с цитокинами МеШоСиИ С1а881е Н4434 (§1етСе11 ТесЬпо1од1е8, Канада) в соответствии с инструкцией производителя. Состав и количество колониеобразующих единиц определяли среди кроветворных клеток пациента до и после экспансии.The expansion of SE34 'cells of a patient with multiple myeloma was carried out on a monolayer of MSC KM healthy donor. The subpopulation composition of the oligo-, bi-, and unipotent precursors of the myeloid series was studied by the colony forming test (CFU test) in a semi-liquid medium with cytokines MESHOCII Cla881e H4434 (§1етСе11 Теспо1од1е8, Canada) in accordance with the manufacturer's instructions. The composition and number of colony forming units was determined among the patient's hematopoietic cells before and after expansion.
Общее количество КОЕ после экспансии увеличивалось в 4,5 раза. Как неприкрепленные, так и ассоциированные с монослоем МСК КМ кроветворные клетки содержали в своем составе олиго-, би- и унипотентные предшественники миелоидного ряда, однако распределение отдельных типов предшественников в культуре было неравномерным (фиг. 2). Около 80% всех эритроидных предшественников находилось среди неприкрепленных клеток, в то время как 50% КОЕ-ГМ были ассоциированы с МСК КМ. В объединенной смеси неприкрепленных и ассоциированных с монослоем МСК КМ клеток субпопуляционный состав предшественников различных ростков кроветворения совпадал с исходным распределением КОЕ в костном мозге пациента (фиг. 3).The total number of CFU after expansion increased by 4.5 times. Both unattached and associated with the MSC monolayer KM hematopoietic cells contained oligo-, bi- and unipotent precursors of the myeloid series, but the distribution of certain types of precursors in the culture was uneven (Fig. 2). About 80% of all erythroid precursors were among unattached cells, while 50% of CFU-GM were associated with KMC MSCs. In the combined mixture of CM cells unattached and associated with the MSC monolayer, the subpopulation composition of the precursors of various hematopoietic cells coincided with the initial distribution of CFU in the patient’s bone marrow (Fig. 3).
К 6-му дню экспансии количество ранних мегакариоцитарных предшественников с фенотипом ί'Ό34'ί'Ό41' увеличивалось в 72,1 раза, при этом среди ассоциированных с МСК КМ кроветворных клеток процент ί'Ό34'ί'Ό41' был в 5,7 раз выше (фиг. 4). Дополнительно содержание предшественников тромбоцитарного ростка кроветворения исследовали КОЕ-тестом в среде МедаСиИ (81етСе11 ТесЬио1ощех, Канада), предназначенной для детекции колоний мегакариоцитов. Содержание КОЕ мегакариоцитов среди кроветворных клеток, ассоциированных с МСК КМ, было больше, чем среди неприкрепленных кроветворных клеток (фиг. 5).By the 6th day of expansion, the number of early megakaryocytic precursors with the ί'Ό34'ί'Ό41 'phenotype increased by 72.1 times, while the percentage of ί'Ό34'ί'Ό41' associated with MSC CM was 5.7 times higher (Fig. 4). In addition, the content of platelet precursors of hematopoiesis was studied using the CFU test in MedCuI medium (81Cet11Tecioecochem, Canada), designed to detect megakaryocyte colonies. The CFU content of megakaryocytes among hematopoietic cells associated with KMC MSCs was higher than among unattached hematopoietic cells (Fig. 5).
Как видно из примера 1 и 2 наряду с сохранением ранних недифференцированных клеток, заявляемый метод экспансии позволяет пропорционально умножить популяции ранних и более поздних олиго-, би- и унипотентных кроветворных предшественников всех миелоидных ростков кроветворения. Стромальный монослой является основным местом образования мегекариоцитарных предшественников, в то время как основной пул эритроидных предшественников обнаруживается среди неприкрепленных кроветворных клеток.As can be seen from examples 1 and 2, along with the preservation of early undifferentiated cells, the claimed expansion method allows you to proportionally multiply the population of early and later oligo-, bi- and unipotent hematopoietic precursors of all myeloid hematopoietic growths. The stromal monolayer is the main site of formation of megekaryocytic precursors, while the main pool of erythroid progenitors is found among unattached hematopoietic cells.
Пример 3. Экспансия ех νί\Ό кроветворных клеток пуповинной крови на монослое МСК КМ здорового донора.Example 3. The expansion of ex νί \ Ό hematopoietic cells of umbilical cord blood on a monolayer of MSC KM healthy donor.
Экспансию ί'Ό34' кроветворных клеток пуповинной крови проводили на монослое МСК КМ здорового донора в бессывороточной среде 81ет§раи с добавлением факторов роста 8СР 100 нг/мл, РИ-3 йдапд 100 нг/мл и ТРО 25 нг/мл так же, как в примере 1. К 6-му дню культивирования общее количество клеток увеличивалось в 42,7±10,4 раза, СЭ34' клеток в 29,4±14,2 раза и КОЕ в 53,4±28,1 раз (п=4), относительное содержание ί'Ό34' клеток уменьшалось (фиг. 6) в среднем с 74±18% до 45±12% (п=7). После экспансии 25% кроветворных клеток пуповинной крови ассоциировало с монослоем МСК КМ. Данная фракция содержала 24±20% от всех СЭ34' клеток (п=5) и 16±5% от всех КОЕ (п=5). Возрастало количе- 4 026459 ство кроветворных клеток, несущих кластеры дифференцировки, характерные для ранних стволовых клеток (СИ34+СИ38-). Среди ассоциированных со стромальным монослоем кроветворных клеток их доля также была больше в сравнении с неприкрепленными кроветворными клетками (фиг. 7).Expansion of ί'кров34 'hematopoietic blood cells was performed on a monolayer of MSC of a healthy donor KM in serum-free 81etgray media with the addition of growth factors 8СР 100 ng / ml, RI-3 adapd 100 ng / ml and TPO 25 ng / ml in the same way in example 1. By the 6th day of cultivation, the total number of cells increased by 42.7 ± 10.4 times, SE34 'cells by 29.4 ± 14.2 times and CFU by 53.4 ± 28.1 times (n = 4), the relative content of ί'Ό34 'cells decreased (Fig. 6) on average from 74 ± 18% to 45 ± 12% (n = 7). After expansion, 25% of hematopoietic cord blood cells associated with a monolayer of MSC KM. This fraction contained 24 ± 20% of all SE34 'cells (n = 5) and 16 ± 5% of all CFU (n = 5). The number of hematopoietic cells carrying differentiation clusters characteristic of early stem cells (SI34 + SI38 - ) increased. Among the hematopoietic cells associated with the stromal monolayer, their proportion was also greater in comparison with unattached hematopoietic cells (Fig. 7).
Клетки, способные к долговременному восстановлению кроветворения, выявляли ίη νίίτο в КОЕтесте после предварительного культивирования в среде Мус1оСиД (5>1стСс11 ТссНпо1од1С5. Канада), в течение 5 недель (стандартный ЬТС-1С-тест [17]). При анализе ЬТС-1С-тестом неприкрепленных кроветворных клеток после экспансии наблюдали образование мелких колоний гранулоцитарномакрофагального ростка. В популяции кроветворных клеток, ассоциированных с монослоем, кроме гранулоцитарно-макрофагальных выявлялись эритроидные и смешанные колонии КОЕ-ГЭММ (фиг. 8), что свидетельствует о сохранении в данной популяции ранних стволовых кроветворных клеток, долговременно репопулирующих костных мозг. Количество выявляемых в ЬТС-1С-тесте колоний на 1 тыс. кроветворных клеток до и после сокультивирования достоверно не отличалось и составляло в среднем 18±11,5 и 16,2±14,1 соответственно (η=3).Cells capable of long-term restoration of hematopoiesis were detected in КОη νίίτο in the CFU test after preliminary cultivation in the Mus1oCiD medium (5> 1CTc11 TccNpo1od1C5. Canada) for 5 weeks (standard LTC-1C test [17]). In the analysis of the LTS-1C test of unattached hematopoietic cells after expansion, the formation of small colonies of granulocyte-macrophage germ was observed. In the population of hematopoietic cells associated with a monolayer, in addition to granulocyte-macrophage, erythroid and mixed colonies of CFU-HEMM were detected (Fig. 8), which indicates the preservation of early stem hematopoietic cells in this population that repopulate bone marrow for a long time. The number of colonies detected in the LTS-1C test per 1,000 hematopoietic cells before and after co-cultivation did not significantly differ and averaged 18 ± 11.5 and 16.2 ± 14.1, respectively (η = 3).
Экспансия кроветворных клеток пуповинной крови по описываемому способу способствовала сохранению высокой жизнеспособности как кроветворных клеток, так и МСК КМ (табл. 2). Количество клеток в апоптозе определялось методом проточной цитометрии по флуоресцентному окрашиванию клеток на Αηη-5 и 7ΆΆΌ. Содержание апоптотических клеток как в раннем (Αηη-5+ 7ΑΑΌ-), так и в позднем апоптозе (Αηη-5'7ΑΑΌ+) было незначительным как среди МСК КМ, так и среди кроветворных клеток.The expansion of hematopoietic cells of umbilical cord blood by the described method contributed to maintaining high viability of both hematopoietic cells and MSCs KM (table. 2). The number of cells in apoptosis was determined by flow cytometry using fluorescence staining of cells at Αηη-5 and 7ΆΆΌ. The content of apoptotic cells in both early (Αηη-5 + 7ΑΑΌ - ) and late apoptosis (Αηη-5'7ΑΑΌ +) was insignificant both among MSCs and hematopoietic cells.
Таблица 2table 2
Жизнеспособность клеток пуповинной крови и МСК КМ после шестидневного совместного культивированияViability of cord blood cells and MSCs KM after six-day co-cultivation
Таким образом, заявляемый способ экспансии кроветворных клеток на монослое стромальных клеток КМ позволяет решить поставленную задачу значительного прироста СИ34+ кроветворных клеток (10-43 раз) и колониеобразующих предшественников (5-80 раз) как пуповинной, так и периферической крови. Сохранение высокого удельного содержания ассоциированных со стромальным монослоем СИ34+ клеток и КОЕ при высоком их общем приросте и сохранении субпопуляционного состава отличает данный способ экспансии от способов, описанных ранее. Высокая жизнеспособность культур, а также исключение реагентов и клеток ксеногенного происхождения позволяет использовать способ в клинической практике.Thus, the claimed method of expansion of hematopoietic cells on a monolayer of stromal CM cells allows us to solve the problem of a significant increase in SI34 + hematopoietic cells (10-43 times) and colony-forming precursors (5-80 times) of both umbilical and peripheral blood. Maintaining a high specific content of SI34 + cells and CFU associated with the stromal monolayer of SI34 + with their high overall growth and preservation of the subpopulation composition distinguishes this expansion method from the methods described previously. The high viability of the cultures, as well as the exclusion of reagents and cells of xenogenic origin, allows the use of the method in clinical practice.
Источники информации, принятые во внимание при оформлении заявки:Sources of information taken into account when filling out the application:
1. Патент РФ КИ 2360965, МПК С12И 5/08, опубл. 10.07.2009 г.1. RF patent KI 2360965, IPC S12I 5/08, publ. 07/10/2009
2. Патент США И8 7723106, МПК С12И 5/00, опубл. 25.05.2010 г.2. US patent I8 7723106, IPC S12I 5/00, publ. May 25, 2010
3. Α1α1<Π Ν., ίίη§ И., Ми11сг К. с! а1.//Ехр НстаФ1, 2009, т. 37 (4), с. 504-513.3. Α1α1 <Π Ν., Ίίη§ I., Mi11sg K. s! A1 .// Exp NstaF1, 2009, v. 37 (4), p. 504-513.
4. ίίη§ И., Рошсса Α.ν., Α1;·ι1<Π Ν. с! а1.//НастаФ1одюа, 2010, т. 95 (4), с. 542-550.4. ίίη§ I., Roshssa Α.ν., Α1; · ι1 <Π Ν. from! A1 .// NastaF1odyua, 2010, v. 95 (4), p. 542-550.
5. Патент РФ КИ 2469086, МПК Ο2Ν 5/0789, опубл. 19.12.2011 г.5. RF patent KI 2469086, IPC Ο2Ν 5/0789, publ. 12/19/2011
6. Патент США И8 6642049, МПК Ο2Ν 5/0789, опубл. 04.11.2003 г.6. US patent I8 6642049, IPC Ο2Ν 5/0789, publ. November 4, 2003
7. Ис Ыта М., Мс№ссс I., КоЪшкоп 8.Ν. й а1.//N Εη§1 ί Мсй., 2012, т. 367 (24), с. 2305-2315.7. Is Yta M., Ms #sss I., Kooshkop 8.Ν. th a1 .// N Εη§1 ί Msy., 2012, v. 367 (24), p. 2305-2315.
8. КоЪшкоп δ.Ν., Ν§ ί., №и Т. с! аС/Воис Магго\у Татаркк, 2006, т. 37 (4), с.359-366.8. KoЪškop δ.Ν., Ν§ ί., No. and T. s! a / Vois Maggo \ y Tatarkk, 2006, v. 37 (4), pp. 359-366.
9. УашадисЫ М., Нйауата Ρ., ΙΚ-ιηπί М. с! а1.//Ехр НстаФ1, 2001, т. 29 (2), с. 174-182.9. Uashadisy M., Nyauata Ρ., ΙΚ-ιηπί M. s! A1 .// Exp NstaF1, 2001, v. 29 (2), p. 174-182.
10. Петевка Н.В., Гончарова Н.В., Северин И.Н. и др.//Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, 2012, т. 7 (1), с. 40-48.10. Petevka N.V., Goncharova N.V., Severin I.N. et al. // Cell Transplantology and Tissue Engineering, 2012, v. 7 (1), p. 40-48.
11. Воиоп ί., Эа/су В., СаППо! С. с! а1. // Тгаи8&8юи, 2006, т. 46 (11), с.1934-1942.11. Voiop ί., Ea / su V., Sappo! S. s! a1. // Tgai8 & 8ui, 2006, v. 46 (11), pp. 1934-1942.
12. Патент РФ КИ 2525143, МПК Ο2Ν 5/02, 5/07, опубл. 10.08.2014 г.12. RF patent KI 2525143, IPC Ο2Ν 5/02, 5/07, publ. 08/10/2014
13. МаПт-Ратис/ ί., НоГтам М., νаη Дсп В1ддс1ааг М. с! а1. // №1Шгс ргоФсок, 2012, т. 7 (9), с. 17091715.13. MaPt-Ratis / ί., NoGtam M., νаη ДСП В1ддс1ааг M. s! a1. // No. 1Shgs rgoFsok, 2012, v. 7 (9), p. 17091715.
14. Космачева С.М., Данилкович Н.Н., Щепень А.В. и др.//Клеточные технологии в биологии и медицине, 2013, т. 4, с. 210-216.14. Kosmacheva S.M., Danilkovich N.N., Shchepen A.V. et al. // Cell technologies in biology and medicine, 2013, v. 4, p. 210-216.
15. Игнатенко С.И., Космачева С.М., Гончарова Н.В. // Медицина, 2012, т. 4, с. 90-92.15. Ignatenko S.I., Kosmacheva S.M., Goncharova N.V. // Medicine, 2012, v. 4, p. 90-92.
16. Игнатенко С.И., Космачева С.М., Петевка Н.В., Потапнев М.П. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, 2010, т. 5 (3), с. 30, 31.16. Ignatenko S.I., Kosmacheva S.M., Petevka N.V., Potapnev M.P. // Cell transplantology and tissue engineering, 2010, v. 5 (3), p. 30, 31.
17. Нитаη Ьо^-Тсгт Си1ίи^с-Iи^ί^аί^ηд Сс11 (ЬТС-1С). Άδδау Тсс1ипса1 Маш иа1.//Ьίίр://№№№.δίстсс11.сοт/си/ТссЬи^са1-Ксδοи^ссδ/άЪ5а9/28412_1ίс_^с-Н.аδрx.17. Nita n L0-Tcrt Cu1ίu ^ c-Iu ^ ί ^ aί ^ ηd Cc11 (LTC-1C). Άδδau Т Tss1ipsa1 Mash ia1. // Lίίr: //№№№.δίstss11.cot/si/Tssiu ^ sa1-Ksδοi^ssδ/άЬ5а9/28412_1ίс_^с-Н.аδрx.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA201500099A EA026459B1 (en) | 2014-11-27 | 2014-11-27 | Method of ex vitro human hemopoietic cells expansion |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA201500099A EA026459B1 (en) | 2014-11-27 | 2014-11-27 | Method of ex vitro human hemopoietic cells expansion |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201500099A1 EA201500099A1 (en) | 2016-05-31 |
| EA026459B1 true EA026459B1 (en) | 2017-04-28 |
Family
ID=56080142
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201500099A EA026459B1 (en) | 2014-11-27 | 2014-11-27 | Method of ex vitro human hemopoietic cells expansion |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| EA (1) | EA026459B1 (en) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2469086C1 (en) * | 2011-12-19 | 2012-12-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научный центр "Научно-исследовательский институт органических полупродуктов и красителей" ФГУП "ГНЦ "НИОПИК" | Method for expansion of cd34+ hematopoietic cells |
-
2014
- 2014-11-27 EA EA201500099A patent/EA026459B1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2469086C1 (en) * | 2011-12-19 | 2012-12-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научный центр "Научно-исследовательский институт органических полупродуктов и красителей" ФГУП "ГНЦ "НИОПИК" | Method for expansion of cd34+ hematopoietic cells |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ИГНАТЕНКО С.И. и др. Применение AB[IV] - сыворотки для наращивания мультипо-тентных мезенхимных стромальных клеток человека. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, 2010, т. V, № 3, с. 30, 31 * |
| КУЛЕМИНА О.В. и др. Ex vivo экспансия гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови и костного мозга при сокультивировании с мезенхимными стволовыми клетками. Цитология, 2011, т. 53, № 9, с. 736, 737 * |
| ПЕТЁВКА Н.В. и др. Пролиферация и дифференцировка предшественников миелоидного ростка кроветворения пуповинной крови человека при экспансии in vitro. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, 2012, т. VII, № 1, с. 40-48 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA201500099A1 (en) | 2016-05-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ratajczak et al. | Adult murine bone marrow-derived very small embryonic-like stem cells differentiate into the hematopoietic lineage after coculture over OP9 stromal cells | |
| Sandstrom et al. | Effects of CD34+ cell selection and perfusion on ex vivo expansion of peripheral blood mononuclear cells | |
| Huang et al. | Three-dimensional co-culture of mesenchymal stromal cells and differentiated osteoblasts on human bio-derived bone scaffolds supports active multi-lineage hematopoiesis in vitro: Functional implication of the biomimetic HSC niche | |
| US8546141B2 (en) | Method for preparation of platelet from iPS cell | |
| Ehring et al. | Expansion of HPCs from cord blood in a novel 3D matrix | |
| KR20150126943A (en) | Methods and materials for hematoendothelial differentiation of human pluripotent stem cells under defined conditions | |
| US8278101B2 (en) | Stem cell bioprocessing and cell expansion | |
| CN102367435B (en) | Preparation of human platelet-rich plasma and application of same in isolation and culture of human mesenchymal stem cells | |
| WO2021049617A1 (en) | Serum-free medium not containing albumin and suited for culturing human hematopoietic stem cells, and albumin-free culturing method | |
| CN105713879B (en) | Culture system for umbilical cord blood hematopoietic stem cell amplification and application thereof | |
| US20230106769A1 (en) | Serum-free medium and culturing method suited for culturing blood cells such as human hematopoietic stem cells | |
| JPWO2008041370A1 (en) | A structure encapsulating hematopoietic progenitor cells from ES cells, and a method for preparing blood cells using the structure. | |
| CN102643784A (en) | Expansion system in vitro for hematopoietic stem/progenitor cell | |
| Li et al. | Decellularized Wharton jelly matrix: a biomimetic scaffold for ex vivo hematopoietic stem cell culture | |
| JP4706208B2 (en) | Method for producing hematopoietic stem cells | |
| KR20050042046A (en) | Method of amplifying hematopoietic stem cells | |
| KR101753557B1 (en) | Culture medium composition for promoting stem cell proliferation and methods for culturing stem cell | |
| KR20140063861A (en) | Method for the ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells | |
| RU2525143C1 (en) | METHOD FOR CORD BLOOD MONONUCLEAR CELLS (cbMNC) EXPANSION ex vivo IN PRESENCE OF MULTIPOTENT MESENCHYMAL STROMAL CELLS (MMSCS) | |
| AU2016296920A1 (en) | CD34+CD41dim megakaryocytes progenitors and uses thereof for producing proplatelet-bearing MKs and/or platelets | |
| Romanov et al. | Human umbilical cord mesenchymal stromal cells support viability of umbilical cord blood hematopoietic stem cells but not the “stemness” of their progeny in co-culture | |
| Scheding et al. | Effective ex vivo generation of granulopoietic postprogenitor cells from mobilized peripheral blood CD34+ cells | |
| RU2628092C1 (en) | Method for obtaining of msc-associated non-differentiated hemopoietic precursor cells with cd34+/cd133+ phenotype | |
| TW202242096A (en) | Culture medium compositions for expanding and maintaining the self-renewal ability and differentiation potential of hematopoietic stem cells and uses thereof | |
| EA026459B1 (en) | Method of ex vitro human hemopoietic cells expansion |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM RU |
|
| NF4A | Restoration of lapsed right to a eurasian patent |
Designated state(s): BY KZ RU |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): BY |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): KZ RU |