JP2023513632A - 血小板由来ミトコンドリア治療及び多能性細胞の生成方法 - Google Patents

Abstract

末梢血インスリン産生細胞を単離し、それらを成体末梢血由来ミトコンドリアに曝露することにより、成体ヒト末梢血細胞から多能性幹細胞を生成する方法。成体末梢血インスリン産生細胞（ＰＢ－ＩＰＣ）は、ペトリ皿など、正電荷を有する疎水性表面への付着によって成体末梢血から単離される。ＰＢ－ＩＰＣが単離されると、成体末梢血由来のミトコンドリアが、単離されたＰＢ－ＩＰＣに適用される。その後、ミトコンドリアは、ＰＢ－ＩＰＣに取り込まれ、ＰＢ－ＩＰＣの核に入り、これにより、細胞が再プログラムされ、ＰＢ－ＩＰＣが多能性幹細胞に変換され、三胚葉由来細胞が生じる。さらに、ＰＢ－ＩＰＣは、成体末梢血由来ミトコンドリアによる処置後、機能的ＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）様細胞を生じさせる。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年２月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／９７６，８３０号において優先権を主張するものであり、本出願は、全体を参照して本出願に組み込まれている。

ＥＦＳ－ＷＥＢにより提示された配列表の参照
内容物配列表「５７００ＮＰ＿ａｎｄ＿ＰＣＴ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５」ＡＳＣＩＩテキストファイルは、サイズが１，５９５ＫＢであり、２０２１年２月１５日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して明細書と共に電子出願されたものであり、その全体が参照により、本明細書に組み込まれる。

本発明は、一般に、医学的治療に関し、より具体的には、ヒト成体末梢血細胞を血小板由来ミトコンドリアで処置して、慢性病状の治療のための多能性細胞を生成することに関する。

これらに限定されないが、がん、アルツハイマー病、及び糖尿病など、多くの慢性病状は、毎日何百万人もの人々の健康に影響を与えているが、これらの状態の多くに利用できる治療は、ほとんど効果がないままである。糖尿病は、世界中で３億５０００万人以上が罹患している主要な公衆衛生上の懸念事項である。糖尿病の有病率は、インドでは人口の１２．１％、中国では１１．６％、米国では９．３％を超えており、世界中で約１０億人が前糖尿病と見なされており、正常血糖レベルよりも高い。糖尿病は、米国で６番目に多い死因であり、心臓病、脳卒中、腎臓病、失明、及び切断のリスクの増加と関連している。

１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）及び２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）の両方に共通する要因は、免疫系の機能不全である。Ｔ１Ｄは、膵島β細胞の自己免疫破壊及び免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、単球／マクロファージ（Ｍｏ／Ｍφ）、樹状細胞（ＤＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及びナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞など）の破壊を特徴とする。Ｔ２Ｄは、主にインスリン抵抗性及びインスリンの異常な産生を特徴とするが、軽度の慢性炎症も脂肪組織、肝臓、筋肉組織などの末梢組織で発生し、さらに疾患の一因となる。具体的には、研究では、Ｔ細胞がインスリン抵抗性の予想外のプロモーター及び制御因子であることが示されている。Ｔ細胞は、脂肪蓄積に対する炎症性マクロファージの動員を促進し、炎症性サイトカインが産生され、これにより、糖尿病となり得るインスリン抵抗性の発生が促進される。３０年超にわたる熱心な研究にもかかわらず、１型糖尿病及び２型糖尿病の治療法は両方とも、依然として定まっていない。これらの疾患の根底にある複数の免疫機能障害に同時に対処するには、局所的及び全身的なアプローチの両方による包括的な免疫調節が必要である。

インスリン産生細胞の欠損は、糖尿病患者にとって別の重大かつ一般的な問題である。インスリンの補充により、Ｔ１Ｄ患者に血糖を管理する手段が提供されるが、これは治療法ではなく、インスリンは、膵島β細胞破壊を引き起こす根底にある免疫機能不全に向けたものでない。糖尿病患者におけるインスリン産生細胞の不足を克服するために、膵臓及び膵島移植は、インスリン注射から独立するための治療の可能性を提供している。しかし、ドナーの不足及び免疫拒絶のリスクは、そのような移植の幅広い適用の可能性を著しく妨げる。したがって、Ｔ１Ｄにおける自己免疫の進行を止め、Ｔ２Ｄにおける複数の免疫機能障害を是正するのみでなく、インスリン産生β－細胞の不足を克服する糖尿病の治療法を見つけることへの切実な必要性及び切迫感が依然として存在する。

幹細胞の研究は、これらに限定されないが、糖尿病、アルツハイマー病、がん、及び円形脱毛症など、人生を変える特定の傷害及びヒトの疾患の治療に革命を起こす可能性を有する。現在までに、研究者は、様々な再生のための能力を有する複数の種類のヒト幹細胞の特徴を明らかにし、また、動物研究及びヒトでの臨床試験では、ヒトの疾患を治療するための幹細胞の翻訳能力が実証されている。

現在まで、機能的インスリン産生細胞または膵島細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏでの分化誘導により、胚性幹（ＥＳ）細胞及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）から生成されている。しかし、幹細胞生物学における近年の進歩により、ＥＳ細胞、ｉＰＳ、及びそれらの派生細胞も移植後に免疫拒絶反応を引き起こす可能性があることが認識されており、それらの臨床治療の可能性に挑戦している。したがって、移植された細胞及び／または細胞送達デバイスに対する免疫細胞による攻撃を回避する、及び細胞の生存性を維持するために十分に透過処理された栄養素を提供するための努力において、異なる生体材料によるカプセル化、ならびに半透膜及びカプセルの使用が、動物及びパイロット臨床試験により評価されている。しかし、線維症の形成、またはカプセル化細胞の死及びカプセル化デバイスの不良を引き起こすデバイスの周りの瘢痕化は、依然として主要な障害であり、最適な膜またはカプセルデバイスはまだ開発されていない。

３０年以上にわたり、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されている最も一般的な幹細胞療法は、造血細胞移植（ＨＣＴ）（造血幹細胞移植またはＨＳＣＴとしても知られている）である。ＨＣＴは、骨髄不全、悪性血液障害、遺伝子に基づく血液障害、及び自己免疫疾患の治療、ならびに化学療法後及び／または放射線後の細胞再生のために承認されている。しかし、いくつかの主要な制限により、同種ＨＣＴの幅広い臨床応用が制限されている。これらの制限には、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）完全一致、またはハプロ一致のドナーを特定することが困難であること；造血幹細胞（ＨＳＣ）の不足（これらは、すべての採取された細胞（≦１％）のすべての供給源間で、グリコシル化膜貫通タンパク質マーカーＣＤ３４によって同定されることが知られている）が含まれ、これらは、特に、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、日和見感染症、原疾患の再発、ならびに免疫抑制剤及び放射線に関連する毒性の発生によるものである。ＨＳＣの自家供給源により、一致及びＧＶＨＤの問題について対処するであろうが、生着は、ＣＤ３４⁺ＨＳＣの数の制限によって、依然として妨げられ得る。

臨床ＨＣＴの生着成功率は、移植時に、機能的ＣＤ３４⁺造血前駆細胞（ＨＰＣ）及びＨＳＣの数と相関するため、研究者らは、胚性幹（ＥＳ）細胞及び／または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を操作して、小分子による再プログラミングまたは転写因子のウイルス形質導入により、ＨＳＣを生成できるかについて評価した。これまでのところ、これらのアプローチは、治療用使用に十分な数の真の機能的ＨＳＣを生成できないこと、安全及び倫理的な懸念、ならびにＥＳまたはｉＰＳ誘導体に対する潜在的な免疫拒絶の問題によって制限されている。

再生医療のための自家幹細胞の使用は、他の幹細胞の使用よりも倫理的に許容可能であり、成功する可能性が高く、こうした治療法により、他の幹細胞（例えば、ＥＳまたはｉＰＳベースの治療）に関連する多くの免疫拒絶反応及び安全の懸念が回避されるであろう。必要とされているのは、再生医療において使用するための自家多能性細胞を生成する方法である。

これまで、本発明の利点及び特徴を有する医療用治療のために多能性細胞を生成するための方法は利用できなかった。

本発明は、末梢血インスリン産生細胞を単離し、それらを血小板由来ミトコンドリアに曝露することにより、成体ヒト末梢血細胞から多能性幹細胞を生成する方法を開示する。本発明の一態様では、成体末梢血インスリン産生細胞（ＰＢ－ＩＰＣ）は、正電荷を有する疎水性表面への付着を介して成体末梢血から単離される。ＰＢ－ＩＰＣが単離されると、血小板由来ミトコンドリアが単離されたＰＢ－ＩＰＣに適用される。その後、ミトコンドリアは、ＰＢ－ＩＰＣに取り込まれ、ＰＢ－ＩＰＣの核に入り、これにより、細胞が再プログラムされ、ＰＢ－ＩＰＣが多能性幹細胞に変換され、三胚葉由来細胞が生じる。

ＰＢ－ＩＰＣは、末梢血から容易に単離でき、無血清培地で拡張させて、骨髄の採取に必要な、痛みを伴う侵襲的手順が回避され得る。患者からの自己ＰＢ－ＩＰＣを出発物質として使用するミトコンドリア治療は、機能的自己ミトコンドリア誘導末梢血インスリン産生細胞（ｍｉＰＢ－ＩＰＣ）を大規模に生成し、異なる細胞系統を生じさせることができる。これらのｍｉＰＢ－ＩＰＣをＴ細胞、Ｂ細胞、単球／マクロファージ（Ｍφ）、顆粒球（Ｇｒ）、赤血球（Ｅｒ）、巨核球（ＭＫ）／血小板、網膜色素上皮（ＲＰＥ）、及び神経細胞など、高効率で複数の系統に分化させることは、ＰＢ－ＩＰＣミトコンドリア後再プログラミングの多能性を実証するものである。したがって、これらの細胞は、従来の幹細胞移植に関連する現在のボトルネックの解決策として非常に有望であり、診療所での患者の利益に大きな可能性を有する。

ＰＢ－ＩＰＣは、ヒトの末梢血を自然に循環し、膵島β細胞関連マーカーを示し、膵島への移動により高血糖を軽減する。本発明は、ｅｘ ｖｉｖｏ培養条件を最適化した後、診療所で潜在的に糖尿病を治療するために、患者自身から大量の自己インスリン産生細胞を生成するための新規アプローチを提供する。ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞からのインスリン産生細胞の生成とは対照的に、本発明の技術は、あらゆる倫理的問題及び免疫拒絶の危険なく、自己の血液からインスリン産生細胞を効率的に単離できる。さらに、ｍｉＰＢ－ＩＰＣの他の細胞系統への多能性分化は、糖尿病対象のみでなく、再生医療の全分野の治療に対応する。

本発明の別の態様では、ＰＢ－ＩＰＣは、本明細書においてミトコンドリア誘導ＣＤ３４＋ＨＳＣ（ｍｉＣＤ３４＋ＨＳＣ）と呼ばれる血小板由来ミトコンドリアで処置後、機能的ＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）様細胞を生じさせる。本発明のｍｉＣＤ３４＋ＨＳＣは、照射ＮＳＧマウスへの移植後１２週において、末梢血、脾臓、及び骨髄中で、これらに限定されないが、Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋）、Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）、単球／マクロファージ（ＣＤ１４＋）、顆粒球（ＣＤ６６ｂ＋）、赤血球系細胞（ＣＤ２３５ａ＋）、及び巨核球／血小板（ＣＤ４１ｂ＋）など、多系統血球を再構成することができる。これは、造血関連疾患を治療する可能性が高いことを強調している。

自己再生能力は、ＣＤ３４＋ＨＳＣの主要な特性の１つである。ｍｉＣＤ３４＋ＨＳＣは、自己再生能力は制限されるが、速やかな分化多能性の可能性を示し、これは、ミトコンドリアの再プログラミング、ＨＳＣ関連細胞表面マーカーの発現によるＰＢ－ＩＰＣのＣＤ３４＋ＨＳＣ様細胞への分化、及び主に分化能の多能性の改善を意味し、これらは、自己再生能力を有意に変化させることはない。

図は、本明細書の一部を構成し、本発明の様々な目的及び特徴を示す本発明の例示的な実施形態を含む。

末梢血インスリン産生細胞を血小板由来ミトコンドリアで処置することによって、多能性細胞分化を生成する方法を示す概略図であり、この方法は、本発明を具現化する。 照射ＮＳＧマウスへの移植後のミトコンドリア誘導ＣＤ３４＋造血幹細胞様細胞のｉｎ ｖｉｖｏ多分化のための本発明の一態様を具体化する方法及び動物プロトコルを示す概略図である。 膵島β細胞関連マーカーを有する成体末梢血からの末梢血由来インスリン産生細胞（ＰＢ－ＩＰＣ）の特徴を示すフローサイトメトリーグラフを示し、ゲートされたＬｉｎ１^-ＣＤ３４^-細胞が、ＣＤ４５、ＳＯＸ２、ＣＤ４５ＲＯ、及びＣＣＲ７を発現することを実証している（ｎ＝８）。 ＰＢ－ＩＰＣの表現型を示すフローサイトメトリーグラフを示し、ＣＤ１１７の発現が少なく、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、及びＣＤ６６ｂが発現していないことを示している。アイソタイプ一致ＩｇＧを対照として使用した（ｎ＝８）。 非処置組織培養ペトリ皿で２４時間培養後のアポトーシス（アネキシンＶ⁺）及び血液単球の壊死（７－ＡＡＤ⁺）を示す図である（ｎ＝５）。 フローサイトメトリー及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色による、一晩付着後の新たに単離されたＰＢ－ＩＰＣにおける細胞周期の分析を示す図である（ｎ＝５）。 健康なドナーから単離されたＰＢ－ＩＰＣにおける膵島β細胞関連マーカーのリアルタイムＰＣＲ分析を示す図である（ｎ＝５）。新たに単離されたヒト膵島は、陽性対照として使用した。 二重免疫染色による膵島β細胞関連転写因子ＭＡＦＡ及びインスリン副産物Ｃペプチドのフローサイトメトリーを示す図である（ｎ＝５）。 一晩付着させた後のＰＢ－ＩＰＣの表現型を決定するためのフローサイトメトリーを示す図である。４つの調製物から示される代表的なデータ。 インスリンプロモーター１－ＧＦＰトランスジェニックマウスのＰＢＭＣ中のＧＦＰ⁺細胞を示す蛍光顕微鏡画像である（ｎ＝３）。ＧＦＰ陽性マウス膵島は、陽性対照として使用した。 ｍｉＰＢ－ＩＰＣのＲＰＥ細胞への分化を示す位相差画像であり、細胞の色素沈着及び様々な長さの突起を有する（ｎ＝５）。 ＲＰＥ特異的マーカーを含む分化ＲＰＥ細胞の免疫染色を示す図である（ｎ＝３）。ヒト初代ＲＰＥ細胞は、陽性対照として使用した。マウスＩｇＧ及びウサギＩｇＧを核ＤＡＰＩ（青）染色と融合させ、陰性対照として使用した（挿入図）。未処置ｍｉＰＢ－ＩＰＣは、陰性対照として使用した（中央パネル）。 分化ＲＰＥ細胞による蛍光ビーズの食作用を示す図である（ｎ＝３）。 分化ＲＰＥ細胞及び未処置細胞におけるＣＤ３６発現のフローサイトメトリー分析を示す図である（ｎ＝３）。アイソタイプ一致ＩｇＧを陰性対照として使用した。 ｍｉＰＢ－ＩＰＣの神経細胞への分化を示す位相差画像である（ｎ＝５）。 ニューロン特異的マーカーであるシナプシンＩ及びチロシンヒドロキシラーゼを有する分化神経細胞の免疫染色を示す図である（ｎ＝３）。ＩｇＧ染色は、陰性対照として使用した（挿入図）。未処置ｍｉＰＢ－ＩＰＣは、陰性対照として使用した（上部パネル）。 通常のｍｉＰＢ－ＩＰＣ細胞培養における異なるサイズを有するｍｉＰＢ－ＩＰＣのコロニー形成を示す図である（ｎ＝５）。 未処置ＰＢ－ＩＰＣと比較したｍｉＰＢ－ＩＰＣ間のコロニー形成の潜在的な差異を示すグラフである。データは、５つの調製物からの平均±ＳＤとして表示される。 ＰＢ－ＩＰＣマーカーＣＤ３４^-ＣＤ４５⁺ＳＯＸ２⁺ＣＤ４５ＲＯ⁺ＣＣＲ７⁺を保持する単一コロニー由来細胞の表現型分析を示す図である（ｎ＝５）。 クローン分析を示す図である。単一のコロニーを分散させ、９６ウェルプレートに接種し、ウェルは、分化のためにマクロファージなどの異なる系列特異的誘導因子で処置した（左、蛍光ビーズの食作用、ｎ＝３）、ＲＰＥ細胞（中央、ｎ＝６）、及び神経細胞（右、ｎ＝９）。 腫瘍形成のないｍｉＰＢ－ＩＰＣ移植マウスにおける体重増加を示す図である。ＮＯＤ－ｓｃｉｄ ＩＬ－２Ｒγ^nullマウス（ｎ＝３）に、２ｘ１０⁷細胞／マウスの用量でｍｉＰＢ－ＩＰＣを接種した（ｓ．ｃ．，右下脇腹）。左下側腹部への同量の生理食塩水の注射は、対照として使用した。 三胚葉関連マーカー（外胚葉のニューロンマーカーシナプシンＩ、内胚葉の膵島β細胞マーカーインスリン、及び中胚葉のマクロファージマーカーＣＤ１１ｂ）によるコロニー分析画像である。ＩｇＧは、陰性対照として使用した（上部パネル）。代表的画像は、ｍｉＰＢ－ＩＰＣ群（下部パネル）の８つのコロニーのうちの１つ、及び対照ＰＢ－ＩＰＣ（中央パネル）の５つのコロニーのうちの１つからのものであった。 追加の三胚葉関連マーカー（外胚葉の神経細胞マーカーβＩＩＩチューブリン（Ｔｕｊ１）、内胚葉の肝細胞マーカーアルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、及び中胚葉の平滑筋アクチン（ＳＭＡ））を用いたコロニー分析画像である。ＩｇＧは、陰性対照として使用した（上部パネル）。代表的画像は、ｍｉＰＢ－ＩＰＣ群（下部パネル）の７つのコロニーのうちの１つ、及び対照ＰＢ－ＩＰＣ（中央パネル）の５つのコロニーのうちの１つからのものであった。 ミトコンドリア処置ＰＢ－ＩＰＣの核膜でのミトコンドリア（Ｍ）を示す透過型電子顕微鏡画像である。 核マトリックスの内側に位置し、形態学的に類似したミトコンドリア（矢印で示される）を細胞質中に有する核小体に近いミトコンドリアを示す透過型電子顕微鏡画像である。 未処置ＰＢ－ＩＰＣの超微細構造を示す図である。 赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）標識ミトコンドリアのＰＢ－ＩＰＣへの浸透を示す図である。ＰＢ－ＩＰＣをＲＦＰ標識ミトコンドリアで４時間処置した後、共焦点顕微鏡により細胞質に浸潤するＲＦＰ⁺ミトコンドリアが確定された（ｎ＝５）。ＲＦＰの分布＋核内のミトコンドリアは、矢印によって表した。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２標識核及び微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）画像（左）により、ＲＦＰ⁺ミトコンドリアは共存していた。 核に侵入したＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ標識ミトコンドリアを示す図であり、それらの共在が、共焦点顕微鏡によって示されている（ｎ＝５）。血小板から単離されたミトコンドリアを、無血清培地Ｘ－ＶＩＶＯ１５の存在下、３７℃、５％ＣＯ₂でＰＢ－ＩＰＣの精製核と４時間共培養した。 精製核の膜上でのＣＸＣＲ４の発現を示す図である（ｎ＝４）。 ＣＸＣＲ４リガンドＳＤＦ－１を提示するミトコンドリアを示す図である（ｎ＝４）。 ＣＸＣＲ４受容体アンタゴニストＡＭＤ３１００によるブロッキング実験を示す図である。精製ＰＢ－ＩＰＣ核は、ＡＭＤ３１００の有無にかかわらず、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ標識精製ミトコンドリアで処置した（３０μＭ、ｎ＝３）。等濃度の溶媒ＤＭＳＯを対照として使用した。４時間処理後、核をＰＢＳで２回洗浄し、フローサイトメトリー用に調製した。 血小板由来ミトコンドリア、ＰＢＭＣ由来ミトコンドリア、及びＰＢ－ＩＰＣ由来ミトコンドリアにおけるＳＤＦ－１の発現を示すフローサイトメトリーを示す図である。アイソタイプ一致ＩｇＧは、対照として使用した。データは、３つの実験の代表である。 血小板由来ミトコンドリア（Ｐｌｔ－Ｍｉｔｏ）とＰＢＭＣ由来ミトコンドリア（ＰＢＭＣ－Ｍｉｔｏ）との間のＳＤＦ－１発現レベルのグラフによる比較を示しており、顕著な差は有さないが、ＰＢ－ＩＰＣ－由来ミトコンドリア（ＰＢ－ＩＰＣ－Ｍｉｔｏ）でのＳＤＦ－１発現ははるかに低い。データは、平均±ＳＤを表す。ｎ＝３。 ＰＢ－ＩＰＣの核へのＰＢＭＣ由来ミトコンドリアの浸透を示す共焦点顕微鏡画像である。 エピジェネティッククロマチン修飾酵素関連遺伝子のリアルタイムＰＣＲアレイを示す図である。 ミトコンドリア処置後のＰＢ－ＩＰＣにおける４６個の示差的に発現する遺伝子を示すＲＮＡシーケンスヒートマップを示す図である。 ミトコンドリア処置後のＰＢ－ＩＰＣにおける３７個の上方制御遺伝子を示すＲＮＡシーケンスデータを示す図である。 ミトコンドリア処置後のＰＢ－ＩＰＣにおける９個の下方制御遺伝子を示すＲＮＡシーケンスデータを示す図である。 単離されたミトコンドリアの純度分析ヒストグラムを示す図である。ＭｉｔｏＴｒａｃｋ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ染色、抗シトクロムＣ、及び抗熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）など異なるマーカーを、フローサイトメトリーによって適用した。６０個の抗体は、ミトコンドリアマーカー、カルネキシンは、小胞体（ＥＲ）、ＧＭ１３０は、ゴルジ装置に使用した。アイソタイプ一致ＩｇＧを陰性対照として使用した（ｎ＝３）。 ｍｉＰＢ－ＩＰＣにおけるミトコンドリア処置後のＣＤ３４発現の上方制御を示す図である。データは、５つの実験の平均±ＳＤを表す。 全ｍｉＰＢ－ＩＰＣにおいてさらなる表面マーカーを有するゲートｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣ（破線矢印）の表現型特性を示す図である。アイソタイプ一致ＩｇＧは、対照として使用した。データは、５つの調製物からの代表的なものであった。 総ＰＢＭＣにおいて、追加のマーカーを有するゲートＣＤ３４⁺ＣＤ４５ＲＡ^-ＨＳＣ（下部）及び追加のマーカー（上部）を有するＣＤ３４⁺ＣＤ４５ＲＡ⁺細胞集団の表現型特性を示す図である（ｎ＝４）。アイソタイプ一致ＩｇＧは、対照として使用した。データは、４つの調製物のうちの１つからの代表的なものであった。 ｍｉＰＢ－ＩＰＣの生成からｍｉＰＢ－ＩＰＣの多能性細胞分化までの本発明のプロトコルを概説する概略フローチャートを示す図である。ｍｉＣＤ３４＋ＨＳＣは、それぞれｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ分化のために精製した。 ＦＬＴ－３リガンド、ＩＬ－２、及びＩＬ－７の存在下で３日間精製されたｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣのＴ細胞分化を（ｎ＝４）示す位相差画像である。未処置細胞を対照として使用した（左）。処置したＣＤ３４⁺ＨＳＣは、細胞クラスタ（星）及び細胞クラスタ（星）から放出されたいくつかの浮遊細胞（矢印）と共に、大幅な形態変化を示した。倍率：×２００。 対照ＰＢ－ＩＰＣ（左）及びミトコンドリアの存在下で処置されたＰＢ－ＩＰＣ（右）の形態を示す位相差画像である（ｎ＝４）。元の倍率＝ｘ２００ ヒトＴ細胞マーカーＣＤ４の発現が強く、ＣＤ８の発現が低いことを示すｚスタック共焦点画像を示す図である（ｎ＝４）。未処置ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣは、免疫染色の対照として使用した（左パネル）。 分化Ｔ細胞がＣＤ３⁺ＣＤ４⁺ＣＤ８^-ＣＤ３８⁺であることを示すフローサイトメトリーを示す図である（ｎ＝４）。未処置ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣは、対照として使用した（上部パネル）。 ゲートＣＤ３⁺及びＣＤ４⁺Ｔ細胞におけるＴ細胞受容体α／β（ＴＣＲαβ）の発現を示す図である（ｎ＝４）。 Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞サイトカインマーカーを使用した分化Ｔ細胞の細胞内染色を示す図である（ｎ＝３）。アイソタイプ一致ＩｇＧを対照として使用した。データは、３つの実験の平均±ＳＤとして表す。 ＰＭＡ及びイオノマイシンによる刺激後のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化Ｔ細胞におけるサイトカイン発現レベルの倍率変化を示す図である（ｎ＝３）。データは、平均±ＳＤを表す。 ５０ｎｇ／ｍＬ Ｍ－ＣＳＦによる３日間の処置後のｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣのマクロファージへの分化を示す図である。分化Ｍφは、マクロファージマーカーＣＤ１１ｂ及びＣＤ２０９を表示し、蛍光ビーズの食作用を呈した（ｎ＝４）。未処置ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣは、対照として使用した。 １００ｎｇ／ｍＬＧ－ＣＳＦ＋２５ｎｇ／ｍＬＦＬＴ－３Ｌで３日間処置後に、ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣを顆粒球に分化させ、その後の顆粒球マーカーＣＤ６６ｂのライト－ギムサ染色（左）及びフローサイトメトリー（ｎ＝４）を示す図である。未処置ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣは、対照として使用した。 成熟ＲＢＣ（矢印で示す）の位相差イメージング、及び成熟ＲＢＣ（矢印で示す）の典型的な形態でのライト－ギムサ染色によって示されるｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣの赤血球への分化を示す図である（ｎ＝４）。 フローサイトメトリー（ｎ＝４）による、ゲートＣＤ２３５ａ⁺細胞中の成熟ＣＤ４５^-ヘモグロビン⁺ＲＢＣの割合の分析を示す図である。 ＦＬＴ－３Ｌ＋ＴＰＯによる７日間の処置後におけるｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣの巨核球／血小板への分化を示し、ＣＤ４２⁺及び多核外観を示す図である（ｎ＝４）。 ＦＬＴ－３Ｌ＋ＴＰＯによる７日間の処置後の多倍体ＭＫ分析を示す図であり、ヒストグラム（中央）及びＭＫ／血小板マーカーＣＤ４２ａによるドットプロット（上部）により示した。健康ドナーからの正常血小板及びＴ細胞は、それぞれ核がない細胞（０Ｎ）及び１つの核を有する細胞（１Ｎ）の対照として使用した（下部）（ｎ＝４）。 ＦＬＴ－３Ｌ＋ＴＰＯで７日間処置後、複数の核（矢印で示す）を有する分化ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣを示すライト－ギムサ染色を示す図である（ｎ＝４）。 １２週におけるｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣ移植ＮＳＧマウスの末梢血、脾臓、骨髄におけるｈＣＤ４５⁺ｍＣＤ４５．１^-細胞の生着レベル（２００μＬ生理食塩水３×１０⁵細胞／マウス、すなわちｎ＝６）を示す図である。 照射ＮＳＧマウスへの生着後のｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣの表現型特徴を示す図である（２００μＬ生理食塩水中３ｘ１０⁵細胞／マウス、ｉ．ｖ．、ｎ＝５）。組織サンプルは、移植後１２週間で収集した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陽性死細胞を除外後、生細胞（ヒストグラム）のみを分析するためにゲーティングした。ゲートされたヒト白血球共通抗原ＣＤ４５陽性及びマウスＣＤ４５．１陰性の生細胞を分析した。代表的データは、同様の結果の３つの実験のうちの１つのものである。アイソタイプ一致ＩｇＧは、フローサイトメトリーの対照として使用した。 照射ＮＳＧマウスへの移植後１２週間でのｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣの多系列分化を示す図である。 １２週でのｍｉＣＤ３４⁺移植ＮＳＧマウスの赤血球再構成を示す図である（ｎ＝６）。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陽性死細胞を除外後、生細胞（ヒストグラム）のみを分析するためにゲーティングした。ＳＹＴＯ６０は、ＣＤ２３５ａ⁺有核赤血球系細胞を染色するために利用した。 照射ＮＳＧマウスにおける生着１２週間後のｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣの特徴を示す図である（ｎ＝５）。代表的データは、同様の結果の３つの実験のうちの１つのものである。ゲートヒトＣＤ４５陽性及びマウスＣＤ４５．１陰性の生細胞を分析した。アイソタイプ一致ＩｇＧは、フローサイトメトリーの対照として使用した。 １２週（上）及び１６週（下、ｎ＝３）でのＮＳＧマウスへの移植後のｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣの骨髄分化を示す図である。 フローサイトメトリーによる血小板由来ミトコンドリア上のＮｏｔｃｈリガンドの分析を示す図である（ｎ＝３）。 フローサイトメトリーによるＰＢ－ＩＰＣ上のＮｏｔｃｈ受容体の発現を示す図である。ＰＢ－ＩＰＣをミトコンドリアで７日間処置し、これをフローサイトメトリー用に収集した。未処置ＰＢ－ＩＰＣは、対照として使用した。ｎ＝３。 ＰＢ－ＩＰＣ（左）及びミトコンドリア（中央）及びミトコンドリア＋ＤＡＰＴ（右）の存在下で処置されたＰＢ－ＩＰＣの形態を示す位相差画像を示す図である。元の倍率＝ｘ２００ ミトコンドリア及び／またはＤＡＰＴによる処置後のＣＤ３４発現の上方制御を示す図である。ＤＡＰＴ処置ＰＢ－ＩＰＣを対照として使用した。ｎ＝４。データは、平均±ＳＤを表す。

Ｉ．導入及び環境
必要に応じて、本発明の詳細な態様が本明細書中に開示されるが、開示された態様は、様々なかつ代替の形態で具現化され得る発明の単なる例であることが理解されよう。したがって、本明細書に開示される具体的な構造的及び機能的詳細は、限定するものではなく、単に特許請求の範囲の根拠として、及び本発明を事実上任意の適切に詳細な構造で、多様に使用する方法を当業者に教示するための代表的な根拠としてのみ使用されるものと解釈されたい。

以下の説明では、便宜上、特定の専門用語を参考としてのみ使用し、限定するものではない。例えば、上、下、前、後、右、及び左は、言及されている図に向けられた本発明を指す。「内向き」及び「外向き」という言葉は、説明されている態様及びその指定された部分の幾何学的中心にそれぞれ向かう方向及びそこから離れる方向を指す。適切な場合、前方及び後方は、通常、進行方向を基準にする。この用語には、具体的に言及されている単語、その派生語、及び同様の意味の単語が含まれる。

ＩＩ．好ましい実施形態
本発明は、末梢血インスリン産生細胞（ＰＢ－ＩＰＣ）を単離し、それらを血小板由来ミトコンドリアに曝露することにより、成体ヒト末梢血細胞から多能性幹細胞を生成する方法を開示する。ＰＢ－ＩＰＣは、「末梢血幹細胞（ＰＢ－ＳＣ）」としても知られ、Ｚｈａｏら米国特許第８，８３５，１６３号によってさらに特徴が明らかになっており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。図１は、本発明のプロトコルの実施形態の概略図を示す。

ＰＢ－ＩＰＣは、ヒトの末梢血中に存在することが実証されており、独特の表現型（Ｌｉｎ１^-ＣＤ３４^-ＣＤ４５⁺ＣＤ４５ＲＯ⁺ＣＣＲ７⁺ＳＯＸ２⁺ＯＣＴ３／４⁺ＭＡＦＡ⁺Ｇｌｕｔ２⁺）を示す。例示的な実施形態では、成体ヒトの末梢血のサンプルが最初に得られ、遠心分離される。遠心分離後、末梢血由来単核細胞（ＰＢＭＣ）は、成体末梢血から単離される。次いで、ＰＢ－ＩＰＣは、正電荷を有する疎水性表面への付着を介してＰＢＭＣから単離される。好ましい実施形態では、ＰＢ－ＩＰＣは、いかなる他の成長因子も添加することなく、化学的に定義された無血清培養においてペトリ皿の疎水性底に付着させることによって、単離され、成長され、拡張される。しかし、代替実施形態では、他のデバイス及び／または疎水性表面を有する培地を利用して、ＰＢ－ＩＰＣを単離することができる。

例示的な実施形態では、成体ヒト末梢血血小板のサンプルが得られる。本発明の実施形態では、血小板サンプルは、単離されたＰＢ－ＩＰＣと同じ末梢血サンプルから、あるいは別の成体ヒト末梢血源から採取され得る。次いで、ミトコンドリアが、末梢血血小板から単離される。血小板由来ミトコンドリアは、本明細書に記載のとおり、または代替的ミトコンドリア単離方法によって単離され得る。

ＰＢ－ＩＰＣ及び血小板由来ミトコンドリアが単離されると、血小板由来ミトコンドリアが単離されたＰＢ－ＩＰＣに適用される。こうした処置時に、ミトコンドリアは、ＰＢ－ＩＰＣによって取り込まれ、これにより、細胞を再プログラムし、ＰＢ－ＩＰＣが多能性幹細胞に変換され、三胚葉由来細胞が生じる。ＰＢ－ＩＰＣに侵入時に、適用された血小板由来のミトコンドリアの一部がＰＢ－ＩＰＣの核に入り、細胞の再プログラミングに対応する。

ＰＢ－ＩＰＣの分化能は、血小板由来ミトコンドリアによる処置後に著しく増加し、これにより、三胚葉由来細胞となる。ミトコンドリア誘導ＰＢ－ＩＰＣ（ｍｉＰＢ－ＩＰＣ）は、それぞれ異なる誘導因子の存在下でＲＰＥ及び神経細胞への高い分化効率を示し、これにより、ミトコンドリア処置後のＰＢ－ＩＰＣの多能性が確認される。したがって、これらの細胞は、従来の幹細胞移植に関連する現在のボトルネックの解決策として非常に有望であり、診療所での患者の利益に大きな可能性を有する。

ＰＢ－ＩＰＣは、ヒトの末梢血中を自然に循環し、膵島β細胞関連マーカーを示し、化学ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘導糖尿病性マウスに移植後、膵島への移動により高血糖を軽減する。したがって、本発明は、診療所において自己免疫疾患を潜在的に治療するために、患者自身から大量の自己インスリン産生細胞を生成するための新規アプローチを提供する。ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞からのインスリン産生細胞の生成と比較して、本発明の技術は、あらゆる倫理的問題または免疫拒絶の危険なく、自己の血液からインスリン産生細胞を効率的に単離できる。さらに、ｍｉＰＢ－ＩＰＣの他の細胞系統への多能性分化は、自己免疫疾患対象のみでなく、再生医療の全分野に対して、これらの制限を回避するために、これまで満たされていない医療ニーズをもたらす。本発明の実施形態では、ｍｉＰＢ－ＩＰＣは、それぞれに適切なプロモーターに曝露した場合に、マクロファージ細胞、神経細胞、ＲＰＥ細胞、顆粒球細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、赤血球、巨核球細胞、血小板細胞、骨髄細胞、間質細胞、骨芽細胞、ケラチノサイト、毛包細胞、腺細胞、内皮細胞、角膜内皮細胞、心筋細胞、筋細胞、上皮細胞、肝細胞、腎臓細胞、膵島β細胞または他の細胞型に分化され得る。

代替的実施形態では、ＰＢＭＣ由来の（血小板由来ではない）ミトコンドリアが単離され、ＰＢ－ＩＰＣに適用される。処置時に、ＰＢＭＣ由来のミトコンドリアは、ＰＢ－ＩＰＣに侵入し、ＰＢ－ＩＰＣの核にも浸透し、細胞の再プログラミングに対応する。本発明のさらなる実施形態では、ミトコンドリアは、血漿、血清、またはヒト血液の他の部分から単離され、ＰＢ－ＩＰＣの治療に利用され得る。

本発明の別の態様では、ＰＢ－ＩＰＣは、本明細書においてミトコンドリア誘導ＣＤ３４＋ＨＳＣ（ｍｉＣＤ３４＋ＨＳＣ）と呼ばれる血小板由来ミトコンドリアで処置後、機能的ＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）様細胞を生じさせる。ミトコンドリア治療では、患者由来の自家ＰＢ－ＩＰＣを出発物質として使用し、機能的自家ミトコンドリア誘導ＣＤ３４⁺（ｍｉＣＤ３４⁺）造血幹細胞（ＨＳＣ）が大規模生成され、様々な血球系統が生じる。末梢血からのＰＢ－ＩＰＣの単離及び拡張は、疎水性表面を有する無血清培養培地を利用して行われ、これにより、骨髄の除去に必至の痛み及び侵襲的な処置が回避される。単離された血小板由来のミトコンドリアは、ＰＢ－ＩＰＣに適用され、ＰＢ－ＩＰＣに侵入し、次にＰＢ－ＩＰＣの核に侵入し、これにより、細胞の再プログラミングが可能になる。次に、ミトコンドリア誘導ＰＢ－ＩＰＣは、ＨＳＣ様分化のために血球プロモーターに更に曝露される。

本発明を実施する動物プロトコルを図２に示す。本発明のｍｉＣＤ３４＋ＨＳＣは、照射ＮＳＧマウスへの移植後、１２週において、末梢血、脾臓、及び骨髄において、これに限定されないが、Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋）、Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）、単球／マクロファージ（ＣＤ１４＋）、顆粒球（ＣＤ６６ｂ＋）、赤血球系細胞（ＣＤ２３５ａ＋）、及び巨核球／血小板（ＣＤ４１ｂ＋）など、多系統血球を再構成することができる。これは、造血関連疾患を本発明で治療する可能性が高いことを示している。

自己再生能力は、ＣＤ３４＋ＨＳＣの主要な特性の１つである。本発明のｍｉＣＤ３４＋ＨＳＣは、自己再生能力は制限されるが、速やかな分化多能性の可能性を示し、これは、ミトコンドリアの再プログラミング、ＨＳＣ関連細胞表面マーカーの発現によるＰＢ－ＩＰＣのＣＤ３４＋ＨＳＣ様細胞への分化、及び主に分化能の多能性の改善を意味し、これらは、自己再生能力を有意に変化させることはない。

ＩＩＩ．ｍｉＰＢ－ＩＰＣから多能性幹細胞を生成するための材料及び方法
Ａ．ＰＢ－ＩＰＣ細胞培養

ヒトバッフィーコート血液ユニット（ｎ＝４２；平均年齢４７．６４±１４．０７；年齢範囲１６歳～７３歳；２３人の男性及び１９人の女性）は、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ，ｈｔｔｐ：／／ｎｙｂｌｏｏｄｃｅｎｔｅｒ．ｏｒｇ／）から購入した。ヒトバッフィーコートは、最初に４０ｍＬの化学的に定義された無血清培養Ｘ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）に添加され、１０ｍＬピペットで完全に混合され、その後、末梢血由来単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離に使用した。ＰＢＭＣは、以前に記載の以下のとおり採取した；Ｚｈａｏら、「Ａ ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｃｙｔｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｕｂｓｅｔ ａｃｔｓ ａｓ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００３，１００，２４２６－２４３１，参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。単核細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳ（γ＝１．００７、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、バッフィーコート血液を単離し、その後、Ｒｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して赤血球を除去する。生理食塩水で３回洗浄後、ＰＢＭＣ全体を、化学的に定義された無血清培養Ｘ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）中、いかなる他の成長因子も添加することなく、１５０ｘ１５ｍｍのペトリ皿（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）に１ｘ１０⁶細胞／ｍＬ、２５ｍＬ／皿で播種し、３７℃、８％ＣＯ₂でインキュベートした。７日後、末梢血インスリン産生細胞（ＰＢ－ＩＰＣ）が成長し、ペトリ皿の疎水性底に付着することによって拡張した。結果として、ＰＢ－ＩＰＣ生理食塩水で３回洗浄し、すべての浮遊細胞を除去した。無血清ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）ｈＰＳＣ ＸＦ培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ）を添加し、３７℃、８％ＣＯ₂で継続細胞培養及び拡張を行った。拡張ＰＢ－ＩＰＣは、通常、７～１４日間の実験に適用した。ＰＢ－ＩＰＣは、無血清ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（商標登録）ｈＰＳＣ ＸＦ培養培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を含む未処置２４ウェルプレートまたはペトリ皿中で、３７℃及び８％ＣＯ₂で、７～１４日間、１００μｇ／ｍＬ血小板由来ミトコンドリアにより処置した。

Ｂ．血小板からのミトコンドリアの単離
ミトコンドリアは、製造業者の推奨プロトコルに従って、ミトコンドリア単離キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ，Ｐｒｏｄ：８９８７４）を使用して、末梢血（ＰＢ）血小板から単離した。成体ヒト血小板ユニット（ｎ＝１９）は、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ，ｈｔｔｐ：／／ｎｙｂｌｏｏｄｃｅｎｔｅｒ．ｏｒｇ／）から購入した。ミトコンドリアの濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して、タンパク質濃度を測定することにより決定した。単離したミトコンドリアをアリコート等分し、実験のための準備において、－８０℃の冷凍庫に保管した。

蛍光色素によるミトコンドリア染色では、ミトコンドリアをＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ ＦＭ（１００ｎＭ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で、３７℃で１５分間、製造業者の推奨プロトコルに従って標識化し、その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で、３０００ｒｐｍで、１５分間、２回洗浄した。

Ｃ．フローサイトメトリー
表面及び細胞内マーカーのフローサイトメトリー分析を行った。ＰＢ－ＩＰＣは、ＰＢＳ、２０００ｒｐｍで５分間洗浄した。ミトコンドリアは、ＰＢＳ、１２，０００ｇ、４℃で１０分間洗浄した。ＰＢ－ＩＰＣの核は、ＰＢＳで、５００ｇ、４℃で５分間洗浄した。サンプルは、ヒトＢＤＦｃブロック（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）と、室温で１５分間プレインキュベートし、その後、異なる抗体の染色のために直接アリコートに等分した。細胞は、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｂｒｅａ，ＣＡ，ＵＳＡ）の異なるマウス抗ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、例えば、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ４５ＲＯ、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、及び抗ＣＤ４２ａ、フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート抗 ＣＤ３４、抗ＣＣＲ７及び抗ＣＸＣＲ４；フィコエリトリン－Ｃｙ５．５（ＰＥ－Ｃｙ５．５）コンジュゲート抗ＣＤ１９、抗ＣＤ１１７及び抗ＳＯＸ２；フィコエリトリン－Ｃｙ７（ＰＥ－Ｃｙ７）コンジュゲート抗ＣＤ４１、抗ＣＤ１１ｂ及び抗ＣＤ４５；ＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ３４、抗ＣＸＣＲ４、及び抗ＣＤ４；ＡＰＣ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０コンジュゲート、抗ＣＤ６６ｂ及び抗ＣＤ８；パシフィックブルー（ＰＢ）コンジュゲート抗ＣＤ３８；クロームオレンジコンジュゲート抗ＣＤ１４と共にインキュベートした。ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）から、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒト系列カクテル１（Ｌｉｎ１）（ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８－Ｓｏｘ２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７コンジュゲートマウス抗ヒトＣペプチド及びインスリン抗体を購入した。ＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＭＡＦＡ抗体は、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（Ｓａｌｅｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入した。ＡＰＣコンジュゲートマウス抗ヒトＣＤ３６ ｍＡｂは、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。ＰＥコンジュゲート抗ヒトＧＬＵＴ２抗体は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）から購入した。マウス抗ＳＤＦ－１ポリクローナル抗体は、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入した。ｅＦｌｕｏｒ ６６０コンジュゲートラット抗ヒトＯＣＴ３／４及びアイソタイプ一致ＩｇＧ抗体は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入した。

表面染色では、細胞を室温で３０分間染色し、その後フロー分析の前に５分間、２０００ｒｐｍ、ＰＢＳで洗浄した。アイソタイプ一致マウス抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）は、すべてのフルオレセインコンジュゲートＩｇＧ ｍＡｂの陰性対照として機能した。細胞内染色のために、ＰｅｒＦｉｘ－ｎｃ キット（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）製造業者の推奨プロトコルに従って、細胞を固定し、透過処理した。染色後、最大１０色の同時読み取り用に３つのレーザー（４８８ｎｍ青、６３８赤、及び４０５紫レーザー）を備えたＧａｌｌｉｏｓ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、細胞を収集し、分析した。最終データは、Ｋａｌｕｚａ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ｋａｌｕｚａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ２．１、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して分析した。

マウス末梢血中のインスリン産生細胞を決定するために、ＭＩＰ－ＧＦＰトランスジェニックマウスは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）の承認動物プロトコルに従って試験した。ＭＩＰ－ＧＦＰトランスジェニックマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡ）から購入した。株名は、Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（Ｉｎｓ１－ＥＧＦＰ）１Ｈａｒａ／Ｊ（株番号：００６８６４）であった。

Ｄ．ｍｉＰＢ－ＩＰＣの網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の分化
ミトコンドリア誘導ＰＢ－ＩＰＣ（ｍｉＰＢ－ＩＰＣ）の多能性及び網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞分化（図１及び図４３）を判定するために、ｍｉＰＢ－ＩＰＣは、網膜色素上皮成長培地（Ｌｏｎｚａ）の存在下で、２４ウェル組織培養処置プレート、３７℃、５％ＣＯ₂で、８日間、複合サプリメント（Ｌ－グルタミン、ゲンタマイシン硫酸塩－アムホテリシン（ＧＡ－１０００）、及び基礎線維芽細胞成長因子を含む）で処置した。分化細胞は、例えば、マウス抗ヒトｍＡｂ ＲＰＥ６５、ＣＲＡＬＢＰ、ｃｌａｕｄｉｎ－１９及びウサギ抗ｔｉｇｈｔ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ１（ＺＯ－１）ポリクローナル抗体（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＣＯ，ＵＳＡ）などのＲＰＥ特異的マーカーを用いた免疫細胞化学によって、特徴を明らかにした。ヒト初代ＲＰＥ細胞は、Ｌｏｎｚａから購入し、陽性対照として使用した。アイソタイプ一致ＩｇＧは、免疫染色の陰性対照として使用した。機能分析のために、分化したＲＰＥ細胞中で、蛍光ラテックスビーズ（Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）の食作用を行わせた。食作用関連表面マーカーＣＤ３６は、フローサイトメトリーによって調べた。ＣＤ３６発現レベルは、Ｋａｌｕｚａソフトウェアバージョン２．１（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析後、平均蛍光強度によって定量化した。

Ｅ．ｍｉＰＢ－ＩＰＣの神経分化
ｍｉＰＢ－ＩＰＣの多能性及びこれらの神経細胞の分化（図１及び図４３）を判定するために、ｍｉＰＢ－ＩＰＣは、２４ウェル組織培養処置プレートで、３７℃、５％ＣＯ₂で、３～５日間、１００ｎｇ／ｍＬのニューロン成長因子（ＮＧＦ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びヒトニューロン幹細胞成長培地（ｉＸＣｅｌｌｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）で処置した。分化細胞は、マウス抗ヒトチロシンヒドロキシラーゼモノクローナル抗体（ｍＡｂ、クローンＬＮＣ１、カタログ＃ＭＡＢ３１８、１：１００希釈）及びウサギ抗シナプシンＩポリクローナル抗体（カタログ＃ＡＢ１５４３、１：１００希釈）（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、免疫細胞化学により特徴を明らかにした。ＦＩＴＣコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅロバ抗マウス二次抗体及びＣｙ３コンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅロバ抗ウサギ二次抗体は、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）から購入した。アイソタイプ一致ＩｇＧは、免疫染色の陰性対照として使用した。ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を含む封入剤で覆った後、細胞をＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ２倒立型台座上のＮｉｋｏｎ Ａ１Ｒ共焦点顕微鏡で撮影した。

Ｆ．コロニー分析
ｍｉＰＢ－ＩＰＣは、最初に無血清ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）ｈＰＳＣ ＸＦ培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、２４ウェル組織培養プレート中１ｘ１０⁴細胞／ｍＬ／ウェル、３７℃、８％ＣＯ₂培養条件で培養した。ｍｉＰＢ－ＩＰＣを２ヶ月培養後、個々のコロニーは、３ｍＬシリンジ（Ｎｉｐｒｏ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ，ＵＳＡ）が取り付けられたＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ採血セット（２１Ｇ ３／４” １２”）によって、倒立型顕微鏡下で採取し、９６ウェルプレートに接種させた。光学顕微鏡による検査では、ウェルの約８０％に単一のコロニーが含まれていることが示された。複数のコロニーを含むウェルは除外した。各単一コロニー（合計ｎ＝２１コロニー）をピペッティングによって手動で分散させ、分化誘導のために（コロニーのサイズに応じて）２～８ウェルに等分した（図１及び図４３）。単一コロニー由来細胞の異なる系統への分化は、それぞれ上記の条件を用いて調べた。

マクロファージ分化のために、３つのコロニー由来細胞をＭ－ＣＳＦ及びＨＳＣ－Ｂｒｅｗ ＧＭＰ基礎培地で２～３日間処置した。ＲＰＥ細胞分化のために、６つのコロニー由来細胞をＲｔＥＧＭ（商標）網膜色素上皮細胞成長培地キット（商標）（Ｌｏｎｚａ）で３～５日間処置した。神経細胞分化の場合、単一コロニー由来細胞（合計ｎ＝９コロニー）を９６ウェルプレート中、１００ｎｇ／ｍＬ神経成長因子（ＮＧＦ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びヒト神経幹細胞成長培地（ｉＸＣｅｌｌｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）で２～３日間処置した。それらの分化は、マクロファージ分化用の蛍光ラテックスビーズの食作用、ＲＥＰ細胞用のＲＰＥ６５免疫染色、及び神経細胞用のシナプシンＩ免疫染色などの系列特異的マーカーで評価した。未処置コロニー由来細胞を対照として使用した。さらに、それらの表現型を決定するために、単一コロニー由来細胞（ｎ＝３コロニー）を、白血球共通抗原ＣＤ４５、ＨＳＣマーカーＣＤ３４、ＥＳ細胞マーカーＳＯＸ２、及びメモリー細胞マーカーＣＤ４５ＲＯ及びＣＣＲ７を用いて、フローサイトメトリーによって試験した。アイソタイプ一致ＩｇＧは、フローサイトメトリーの対照として使用した。

ｍｉＰＢ－ＩＰＣの多能性分化を判定するために、外胚葉用のニューロンマーカーシナプシン、内胚葉用の膵島β細胞マーカーインスリン、及び中胚葉用のマクロファージマーカーＣＤ１１ｂなど、三胚葉関連マーカーを使用して、初期コロニー分析を実施した。さらに、三胚葉免疫細胞化学キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、外胚葉用のニューロンマーカーβＩＩＩチューブリン（Ｔｕｊ１）、内胚葉用の肝細胞マーカーα－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、及び中胚葉用の平滑筋アクチン（ＳＭＡ）を含む追加の三胚葉関連マーカーを備えるＨｕｍａｎ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｅｎｄｏｄｅｒｍ分析キットを使用して、さらなるコロニー分析を実施した。免疫染色のために、コロニーを固定し、２４ウェルプレートで透過処理し、その後上記のとおり免疫染色した。ＩｇＧは、陰性対照として使用した。

Ｇ．腫瘍形成アッセイ
ｍｉＰＢ－ＩＰＣの腫瘍形成の可能性を調べるために、Ｈａｃｋｅｎｓａｃｋ Ｍｅｒｉｄｉａｎ Ｈｅａｌｔｈで承認された動物プロトコルに従って、ｍｉＰＢ－ＩＰＣをＮＳＧマウスの右脇腹に皮下接種した（２ｘ１０⁷細胞／マウス、２００μＬ生理食塩水、Ｓ．Ｃ．、右下腹部、マウスｎ＝３）。等量の生理食塩水を左下脇腹に注入することを対照として用いた。腫瘍の形成及び体重は、週に１回１２週間モニターした。観察の終わりに、ｍｉＰＢ－ＩＰＣ処置マウスの肝臓、肺、脾臓、及び腎臓組織を検査し、腫瘍形成に関する組織病理学的検査のために収集した。

Ｈ．ＰＢ－ＩＰＣにおけるＲＦＰ標識ミトコンドリアの追跡
赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）標識ミトコンドリアのＰＢ－ＩＰＣへの浸透を直接調べるために、ＲＦＰ標識ミトコンドリアを、製造業者の推奨プロトコルに従って、ＣｅｌｌＬｉｇｈｔ（商標）Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ－ＲＦＰ ＢａｃＭａｍ２．０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で標識後、ＨＥＫ－２９３細胞株から精製した。ＰＢ－ＩＰＣは、初めに、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（商標登録）ｈＰＳＣ ＸＦ培養培地の１２ｍｍ Ｎｕｎｃ Ｇｌａｓｓ Ｂａｓｅ Ｄｉｓｈ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に播種した。１時間付着させた後、ＰＢ－ＩＰＣをＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地（Ｌｏｎｚａ）中の精製ＲＦＰ標識ミトコンドリアで処置した。４時間処置後、処置したＰＢ－ＩＰＣを、共焦点顕微鏡を用いて撮影した。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３，３４２は、生存細胞の核を染色するために適用した。

Ｉ．透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）
ミトコンドリアの核への浸透を測定するために、ＰＢ－ＩＰＣは、３７℃、８％ＣＯ₂、１２時間、１００μｇ／ｍＬ血小板由来ミトコンドリアで処置した。その結果、ミトコンドリア処置及び未処置ＰＢ－ＩＰＣを５００ｇｘ５分で採取し、透過型電子顕微鏡（ＡＭＴ－ＸＲ１１デジタルカメラ搭載Ｐｈｉｌｉｐｓ ＣＭ１２電子顕微鏡）分析を行うために、２．５％グルタルアルデヒド／４％パラホルムアルデヒドを含む０．１Ｍカコジル酸バッファで固定した。あるいは、精製された生存核をＨｏｅｃｈｓｔ３３，３４２で標識し、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ標識ミトコンドリアとインキュベートした。これらの相互作用は、共焦点顕微鏡下で直接観察され、撮影した。

Ｊ．ＣＸＣＲ４受容体アンタゴニストＡＭＤ３１００によるブロッキング実験
ＳＤＦ－１／ＣＸＣＲ４の作用が、ミトコンドリアの核への浸透に寄与したか否かを判断するために、ＣＸＣＲ４受容体アンタゴニストＡＭＤ３１００によるブロッキング実験を実施した。精製されたＰＢ－ＩＰＣの核は、ＡＭＤ３１００（３０μＭ）の有無にかかわらず、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄで標識された精製ミトコンドリアで処置した。等濃度の溶媒ＤＭＳＯを対照として使用した。４時間処置後、核をＰＢＳで２回洗浄し、フローサイトメトリー用に調製した。

Ｋ．定量的リアルタイムＰＣＲ
ミトコンドリアと核との相互作用を明らかにするために、ＰＢ－ＩＰＣの核は、製造業者の推奨プロトコルに従って、核単離キット（Ｓｉｇｍａ）を使用して単離した。ＰＢ－ＩＰＣの核を、１００μｇ／ｍＬの血小板由来ミトコンドリアで、３７℃、８％ＣＯ₂で４時間処置した。これにより、ミトコンドリア処置核及び未処置核を５００ｇｘ５分で収集し、電子顕微鏡のために、２．５％グルタルアルデヒド／４％パラホルムアルデヒドを含む０．１Ｍカコジル酸バッファで固定した。また、ＲＴ²ＰｒｏｆｉｌｅｒリアルタイムＰＣＲ Ａｒｒａｙを適用し、ヒトエピジェネティッククロマチン修飾酵素キット（９６－ｗｅｌｌ ｆｏｒｍａｔ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ミトコンドリアの直接遺伝子及びエピジェネティック調節を研究した。ＲＴ²ＰｒｏｆｉｌｅｒリアルタイムＰＣＲ Ａｒｒａｙは、製造業者の指示に従って使用した。データは、ＰｒｉｍｅＰＣＲアレイ分析ソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して分析した。

定量的リアルタイムＰＣＲによるヒト膵島β関連遺伝子マーカーの発現を検出するために、ＰＢ－ＩＰＣを６、１２、２４、４８、７２時間など異なる時点で付着させた後、培養血管から単離した。Ｑｉａｇｅｎキット（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、各サンプルから全ＲＮＡを抽出した。製造業者（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）の指示に従って、ｉＳｃｒｉｐｔ ｇＤＮＡ Ｃｌｅａｒ ｃＤＮＡ合成キットを使用して、全ＲＮＡから第１の鎖ｃＤＮＡを合成した。ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、次の条件下（９５℃で１０分間、次に９５℃で１５秒間の４０サイクル、及び６０℃で６０秒間）で、インスリン（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＭＡＦＡ、ＮＫＸ６．１及びＰＤＸ－１（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）などの膵島細胞関連マーカーを含む各遺伝子に対して、検証された遺伝子特異的ＰＣＲプライマーセットを使用して、各サンプルに対して３回リアルタイムＰＣＲを実行した。各遺伝子の発現レベルは、内部対照としてのβ－アクチンと比較して決定した。遺伝子発現を確認するために、リアルタイムＰＣＲ産物を、１．５％アガロースゲル電気泳動で調べた。

Ｌ．ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ）
ＲＮＡシーケンス（ＲＮＡ－ｓｅｑ）分析は、４つの調製物でミトコンドリア処置ＰＢ－ＩＰＣと未処置ＰＢ－ＩＰＣとの間で実施した。各サンプルの全ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎキット（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して抽出され、レーン当たり２ｘ１５０ｂｐ構成、単一インデックスのＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ（商標）６０００シーケンスシステム（Ｇｅｎｅｗｉｚ，Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ，ＵＳＡ）を使用して、標準ＲＮＡシーケンス及びプロファイリング遺伝子発現のためにドライアイスに入れてＧｅｎｅｗｉｚ（Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ，ＵＳＡ）に輸送した。

Ｍ．統計情報
データの統計分析は、両側対応スチューデントｔ検定によって実施し、未処置群と処置群との間の統計的有意性を決定した。値は、平均±ＳＤ（標準偏差）とした。

ＩＶ．ｍｉＰＢ－ＩＰＣから造血様幹細胞を生成するための材料及び方法
Ａ．ＰＢ－ＩＰＣ細胞培養
ヒトバッフィーコート血液ユニット（ｎ＝５１；平均年齢４８．９７±１４．１１；年齢範囲１８歳～７２歳；２４人の男性及び２７人の女性）は、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ，ｈｔｔｐ：／／ｎｙｂｌｏｏｄｃｅｎｔｅｒ．ｏｒｇ／）から購入した。±ヒトバッフィーコートは、最初に４０ｍＬの化学的に定義された無血清培養Ｘ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）に添加され、１０ｍＬピペットで完全に混合され、その後、末梢血由来単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離に使用した。その後、ＰＢＭＣを採取した。単核細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳ（γ＝１．００７，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）を使用して、バッフィーコート血液を単離し、その後、ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して赤血球を除去した。生理食塩水で３回洗浄後、ＰＢＭＣ全体を、化学的に定義された無血清培養Ｘ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）中、いかなる他の成長因子も添加することなく、１５０ｘ１５ｍｍのペトリ皿（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ，ＮＣ，ＵＳＡ）に１ｘ１０⁶細胞／ｍＬ、２５ｍＬ／皿で播種し、３７℃、８％ＣＯ₂でインキュベートした。７日後、ＰＢ－ＩＰＣは、成長して、ペトリ皿の疎水性底に付着することによって拡張した。その後、ＰＢ－ＩＰＣ生理食塩水で３回洗浄し、すべての浮遊細胞を除去した。次に、無血清ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）ｈＰＳＣ ＸＦ培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を添加し、３７℃、８％ＣＯ₂で引き続き細胞培養及び拡張を行った。拡張されたＰＢ－ＩＰＣは、７～１４日以内に実験に使用した。

Ｂ．血小板からのミトコンドリアの単離
ミトコンドリアは、製造業者の推奨プロトコルに従って、ミトコンドリア単離キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ，Ｐｒｏｄ：８９８７４）を使用して、末梢血（ＰＢ）血小板から単離した。成体ヒト血小板ユニット（ｎ＝１６；平均年齢３０．８１±８．６４；年齢範囲１６歳～４０歳；９人の男性及び７人の女性）は、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ，ｈｔｔｐ：／／ｎｙｂｌｏｏｄｃｅｎｔｅｒ．ｏｒｇ／）から購入した。ミトコンドリアの濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して、タンパク質濃度を測定することにより決定した。単離したミトコンドリアを等分し、実験のために、－８０℃の冷凍庫に保管した。

蛍光色素によるミトコンドリア染色では、ミトコンドリアをＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ ＦＭ（１００ｎＭ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で、３７℃で１５分間、製造業者の推奨プロトコルに従って標識化し、その後、ＰＢＳで、３０００ｒｐｍで、１５分間、２回洗浄した。

Ｃ．ＰＢ－ＩＰＣのｍｉＣＤ３４＋ＨＳＣへのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化
ＰＢ－ＩＰＣは、無血清ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（商標登録）ｈＰＳＣ ＸＦ培養培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ）を含む未処置２４ウェルプレートまたはペトリ皿中で、３７℃及び８％ＣＯ₂で、７～１４日間、１００μｇ／ｍＬ血小板由来ミトコンドリアにより処置した。現在のプロトコルによれば、ミトコンドリア誘導ＣＤ３４＋造血様幹細胞（ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣ）は、ミトコンドリア処置ＰＢ－ＩＰＣから、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＣＤ３４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ，カタログ＃１３０－０９７－０４７）を使用して、製造業者の指示に従って、免疫磁気ソーティングによって精製した。ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣの分化は、フローサイトメトリーによって特徴を明らかにした。

Ｄ．フローサイトメトリー
表面及び細胞内マーカーのフローサイトメトリー分析を行った。ＰＢ－ＩＰＣは、ＰＢＳ、２０００ｒｐｍで５分間洗浄した。ミトコンドリアは、ＰＢＳ、１２，０００ｇ、４℃で１０分間洗浄した。サンプルは、ヒトＢＤＦｃブロック（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）と、室温で１５分間プレインキュベートし、その後、異なる抗体の染色のために直接等分した。細胞を異なるマウス抗ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）とインキュベートした。表面染色では、細胞を室温で３０分間染色し、その後フロー分析の前に５分間、２０００ｒｐｍ、ＰＢＳで洗浄した。アイソタイプ一致マウス抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ，ＵＳＡ）は、すべてのフルオレセインコンジュゲートＩｇＧ ｍＡｂの陰性対照として使用した。ＳＹＴＯＴＭ６０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）をＣＤ２３５ａ（ＧＬＹ－Ａ）染色と組み合わせて、有核赤血球細胞を決定した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）による染色を使用して、フローサイトメトリー分析中に死細胞を除外した。細胞内染色のために、ＰｅｒＦｉｘ－ｎｃ キット（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）製造業者の推奨プロトコルに従って、細胞を固定し、透過処理した。染色後、最大１０色の同時読み取り用に３つのレーザー（４８８ｎｍ青、６３８赤、及び４０５紫レーザー）を備えたＧａｌｌｉｏｓ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、細胞を収集し、分析した。最終データは、Ｋａｌｕｚａ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン２．１（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して分析した。

細胞は、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｂｒｅａ，ＣＡ，ＵＳＡ）の異なるマウス抗ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、例えばＦＩＴＣ－コンジュゲート抗ＣＤ４５ＲＡ、抗ＩＦＮγ、抗ＣＤ４、抗ＣＤ２３５ａ、抗ＣＤ８及び抗－ＣＤ４２ａ；フィコエリトリン（ＰＥ）－コンジュゲート抗ＣＤ３４；ＰＥ－Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ－コンジュゲートＣＤ３；フィコエリトリン－Ｃｙ５（ＰＥ－Ｃｙ５）－コンジュゲート抗ＣＤ９０；フィコエリトリン－Ｃｙ５．５（ＰＥ－Ｃｙ５．５）－コンジュゲート抗ＣＤ１９；フィコエリトリン－Ｃｙ７（ＰＥ－Ｃｙ７）－コンジュゲート抗ＣＤ４９ｆ、抗ＣＤ１１ｂ及び抗ＣＤ４５；ＡＰＣ－コンジュゲート抗ＣＤ４；ＡＰＣ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００－コンジュゲート抗ＣＤ７１；ＡＰＣ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０－コンジュゲート抗ＣＤ７、抗ＣＤ６６ｂ及び抗－ＣＤ８；Ｐａｃｉｆｉｃ ｂｌｕｅ（ＰＢ）－コンジュゲート抗ＣＤ３８；Ｋｒｏｍｅ Ｏｒａｎｇｅ－コンジュゲート抗ＣＤ１４及び抗－１３５（ＦＬＴ３）－ＢＶ５１０と共にインキュベートした。ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）から、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－４８８－コンジュゲート抗ヒトチトクロムＣ；ＦＩＴＣ－コンジュゲート抗ＣＤ９０（ＴＨＹ１）及び抗ＣＤ１１Ｃ；ＢＶ５１０－コンジュゲート抗ＣＤ４５、ＰＥ－コンジュゲート抗ＩＬ４、抗ＩＬ５、抗ＢＡＨ１、抗ＩＬ１２；ＰＥ－ＣＦ５９４－コンジュゲート抗ＣＤ１０、ＢＶ４２１－コンジュゲート抗ＣＤ２０９及びＰＥ－コンジュゲート抗マウスＣＤ４５．１を購入した。ＦＩＴＣ－コンジュゲート抗ヒトＨｓｐ６０、抗ヒト ＴＣＲαβ、抗ヒトＮｏｔｃｈ１及び抗ヒトＮｏｔｃｈ２；ＰＥ－コンジュゲート抗ヒト Ｎｏｔｃｈ３、抗ヒト Ｄｌｌ１、抗ヒト Ｄｌｌ４及び抗ヒトＪａｇｇｅｄ２；ＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＮｏｔｃｈ４；フィコエリトリン－Ｃｙ７（ＰＥ－Ｃｙ７）－コンジュゲート抗ＴＣＲγδ及びＰａｃｉｆｉｃ ｂｌｕｅ（ＰＢ）－コンジュゲート抗ＣＤ３などの抗体は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。ＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＪａｇｇｅｄ１及びＰＥコンジュゲート抗ヒトＤｌｌ３ ｍＡｂは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）から購入した。ヘモグロビンβ／γ／δ（Ｈ－７６）ウサギポリクローナル抗体、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－５４６コンジュゲートカルネキシン及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－６４７コンジュゲートＧＭ１３０は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ，ＵＳＡ）から購入した。ＳＹＴＯＴＭ６０は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入した。

Ｅ．ｍｉＣＤ３４＋ＨＳＣの複数の分化
最初に、自動ＭＡＣＳ Ｐｒｏ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を介して、ヒト凍結乾燥ＣＤ３４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、製造業者の推奨プロトコルに従って、ｍｉＰＢ－ＩＰＣからｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣを精製した。精製ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣは、細胞分化のために、様々な誘導因子で処置した。

Ｔ細胞分化を試験するために、精製ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣ（１ｘ１０⁵細胞／ｍＬ）を、ＨＳＣ－Ｂｒｅｗ ＧＭＰ基礎培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の存在下、サイトカイン２５ｎｇ／ｍＬ ｈＦｌｔ３Ｌ及び２５ｎｇ／ｍＬ ｒｈＩＬ－７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）を添加して、３７℃、５％ＣＯ₂で、２４ウェル未処置プレートに播種した。３～７日間処理後、細胞を撮像し、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲα／β、ＣＤ３８、Ｔｈ１サイトカイン（ＩＬ－４及びＩＬ－５）及びＴｈ２サイトカイン（ＩＦＮ－γ及びＩＬ－１２）など、異なるＴ細胞マーカーを使用して、共焦点顕微鏡及びフローサイトメトリーによって分析した。未処置ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣは、陰性対照として使用した。健康なドナーからのＴ細胞は、陽性対照として使用した。組み合わせ免疫細胞化学のために、分化細胞を４％パラホルムアルデヒドを含む２４ウェルプレートで２０分間固定し、０．５％トリトンＸ－１００（Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）で５分間透過処理し、２．５％ウマ血清で非特異的結合をブロックし、その後ＦＩＴＣコンジュゲートマウス抗ヒトＣＤ４及びＣＤ８（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ，ＵＳＡ）で免疫染色した。ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を含む封入剤で覆った後、ＮＩＳ Ｅｌｅｍｅｎｔｓバージョン４．６０ソフトウェアを用いて、細胞をＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ２倒立型台座上のＮｉｋｏｎ Ａ１Ｒ共焦点顕微鏡で撮影した。

ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣからマクロファージへの分化のために、精製ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣ（１ｘ１０⁵細胞／ｍＬ）をＨＳＣ－Ｂｒｅｗ ＧＭＰ基礎培地の存在下、３７℃、５％ＣＯ₂で、２４ウェル未処置プレートで、５０ｎｇ／ｍＬ Ｍ－ＣＳＦ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）により処置した。２～３日間処置後、細胞は、食作用及びマクロファージマーカーＣＤ１１ｂ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ，ＵＳＡ）及びＣＤ２０９（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用したフローサイトメトリーにより分析した。未処置ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣは、陰性対照として使用した。分化マクロファージの機能を検出するために、蛍光ラテックスビーズ（Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）をＭ－ＣＳＦ処置及び未処置のｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣ培養物に添加した。ラテックスビーズとの４時間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。食作用を観察し、顕微鏡下で評価した。陽性細胞は、細胞あたり最低５個のビーズを有していた。

ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣを顆粒球に分化させるために、精製ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣ（１ｘ１０⁵細胞／ｍＬ）をＨＳＣ－Ｂｒｅｗ ＧＭＰ基礎培地の存在下、３７℃、５％ＣＯ₂で、２４ウェル未処置プレートで、２５ｎｇ／ｍＬ ｈＦｌｔ３Ｌ及び１００ｎｇ／ｍＬ Ｇ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で処置した。３～５日間の処置後、製造業者の指示に従って、細胞を撮像し、顆粒球マーカーＣＤ６６ｂを使用したフローサイトメトリー及びライト－ギムサ（Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）で染色することによって分析した。未処置ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣは、陰性対照として使用した。健康なドナーからのＰＢＭＣは、陽性対照として使用した。

ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣをＲＢＣに分化させるために、精製ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣ（１ｘ１０⁵細胞／ｍＬ）をＨＳＣ－Ｂｒｅｗ ＧＭＰ基礎培地の存在下、３７℃、５％ＣＯ₂で、２４ウェル未処置プレートで、２５ｎｇ／ｍＬ ｈＦｌｔ３Ｌ及び３ユニット／ｍＬ ＥＰＯ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）で処置した。５日間処置後、細胞を３ユニット／ｍＬのＥＰＯでさらに３～７日間再処置した。続いて、細胞を撮影し、赤血球マーカーＣＤ２３５ａ及びヘモグロビンを用いたフローサイトメトリーで分析した。未処置ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣは、陰性対照として使用した。細胞内フローサイトメトリーのために、すべての浮遊細胞を収集し、２７００ｇｘ１５分間で遠心分離した。最初に、Ｆｃ Ｂｌｏｃｋｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）で非特異的結合をブロック後、製造業者の推奨プロトコルに従って、ＰｅｒＦｉｘ－ｎｃキット（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、細胞を固定し、透過処理した。次に、細胞をウサギ抗ヒトヘモグロビンβ／γ／δポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚｅ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ，ＵＳＡ）と１：１００希釈で室温で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳ、２７００ｇｘで、１５分間洗浄した。次に、細胞を、マウス抗ヒトＣＤ２３５ａ－ＦＩＴＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ、ＵＳＡ）及びＣＤ４５－ＰＥ－ＣＹ７ ｍＡｂによる染色と組み合わせて、Ｃｙ５コンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅロバ抗ウサギ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）で３０分間標識した後、フローサイトメトリー分析を行った。

ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣを巨核球及び血小板に分化させるために、精製ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣ（１ｘ１０⁵細胞／ｍＬ）をＨＳＣ－Ｂｒｅｗ ＧＭＰ基礎培地の存在下、３７℃、５％ＣＯ₂で、２４ウェル未処置プレートで、２５ｎｇ／ｍＬ ｈＦｌｔ３Ｌ及び１００ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）で処置した。この３～７日間の処置後、細胞を撮影し、ＭＫ／血小板マーカーＣＤ４２ａ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、フローサイトメトリー用に収集した。未処置ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣは、陰性対照として使用した。倍数体化の分析のために、生存可能なＴＰＯ処置ｍｉＣＤ３４⁺細胞を最初にＣＤ４２ａ ｍＡｂ及びＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）で染色し、共焦点顕微鏡により撮像した。第二に、健康なドナー由来の成熟Ｔ細胞（１Ｎ）及び血小板（０Ｎ）を対照として使用して、製造業者の推奨プロトコルに従って、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）で染色後、分化ＣＤ４２ａ⁺ＭＫの倍数性をフローサイトメトリーで分析した。

ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣから顆粒球、ＲＢＣ、及び巨核球／血小板への分化を形態学的に判断するために、処置細胞及び未処置細胞上でライト－ギムサ染色を実施して、Ｎｉｋｏｎ ＥＣＬＩＰＳＥ Ｔｉ２倒立顕微鏡で観察し、撮像した

ＤＡＰＴブロッキング実験では、ＰＢ－ＩＰＣを、７～１４日間、無血清ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）ｈＰＳＣ ＸＦ培養培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ）を含む非組織培養処置２４ウェルプレートまたはペトリ皿中で、３７℃、８％ＣＯ₂で、１００μｇ／ｍＬミトコンドリア及び１０μＭＤＡＰＴ（Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ，カタログ＃Ｄ５９４２）により処置した。その後、処置ＰＢ－ＩＰＣ及び未処置ＰＢ－ＩＰＣを両方とも収集し、フローサイトメトリーによってＣＤ３４の発現を調べた。

Ｆ．動物研究及び照射ＮＳＧマウスへのｍｉＣＤ３４＋ＨＳＣの生着
動物実験はすべて、Ｈａｃｋｅｎｓａｃｋ Ｍｅｒｉｄｉａｎ Ｈｅａｌｔｈのｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの承認に従って行った。ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣの多能性特性を示すために、精製したｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣを照射ＮＯＤ／Ｌｔ－ｓｃｉｄ／ＩＬ２Ｒγ^null（ＮＳＧ）マウスに移植した。ＮＳＧマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡ）から購入し、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎの動物施設で、無菌条件下で繁殖し、維持した。

ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣの再増殖可能性を判断するために、１２～１６週齢のＮＳＧマウスにＲＳ－２０００照射器（Ｒａｄ Ｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｕｗａｎｅｅ，ＧＡ，ＵＳＡ）を使用して、２００ｃＧｙを照射した。Ｈａｃｋｅｎｓａｃｋ Ｍｅｒｉｄｉａｎ ＨｅａｌｔｈのＡｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＡＣＣ）によって承認されたプロトコルに従って、照射から２４時間後に、尾静脈（２００μＬ生理食塩水、すなわちｎ＝１０マウス）を介して、３ｘ１０⁵細胞／マウスで、ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣを照射ＮＳＧマウスに移植した。生理食塩水注射（２００μＬ）のみを対照として使用した（ｎ＝６マウス）。移植後、マウスは、週に２回、１６週間観察した。ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣの分化を調べるために、マウスを移植後１２週または１６週に屠殺し、フローサイトメトリー分析用に末梢血、脾臓、及び骨髄のサンプルを収集した。照射ＮＳＧマウスへの移植後のｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣの多系統分化を決定するために、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陽性死細胞を除外した後、異なるサンプルからの生細胞のみを分析用にゲーティングした。ゲートされたヒト白血球共通抗原ＣＤ４５陽性及びマウスＣＤ４５．１陰性の生細胞は、Ｔ細胞のＣＤ３及びＣＤ４；Ｂ細胞のＣＤ１９；巨核球／血小板のＣＤ４１ｂ；単球／マクロファージのＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、及びＣＤ１１ｃ；顆粒球のＣＤ６６ｂ；ならびに赤血球のＣＤ２３５ａなど、様々なヒト血球系統特異的表面マーカーを用いて特徴を明らかにするためにさらに分析した。ＳＹＴＯ６０は、ＣＤ２３５ａ⁺有核赤血球系細胞を染色するために利用した。Ｔ細胞集団を決定し、ＣＤ４⁺単球を除去するために、細胞サイズの差異を考慮することに加えて、抗ＣＤ３抗体を使用して、ＣＤ４⁺単球をゲーティングさせた。アイソタイプ一致ＩｇＧは、フローサイトメトリーの対照として使用した。

Ｇ．統計情報
統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８（バージョン８．０．１）ソフトウェアを使用して実行した。サンプルの正規性検定は、シャピロ・ウィルク検定を使用して評価した。データの統計分析は、両側対応スチューデントｔ検定を用いて実施し、未処置群と処置群との間の統計的有意性を決定した。ノンパラメトリックデータには、マン・ホイットニーのＵ検定を使用した。値は、っっっｄ平均±ＳＤ（標準偏差）とする。統計的有意性は、ｐ＜０．０５、両側として定義した。

本発明の特定の実施形態及び／または態様を示して説明してきたが、本発明はそれらに限定するものではなく、様々な他の実施形態及び態様を包含することを理解されたい。

以下の実施例は、特許請求される本発明をよりよく説明するために提供され、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。特定の材料が言及されている限りにおいて、これは単に例示を目的としており、本発明を限定することを意図するものではない。本発明の当業者は、発明能力を行使することなく、また本発明の範囲から逸脱することなく、同等の手段または反応物を開発することができる。

実施例１
成体末梢血由来ＰＢ－ＩＰＣは、ヒト膵島β細胞特異的マーカーを示す。
図３～１０には、膵島β細胞関連マーカーを有する成体末梢血由来の末梢血由来インスリン産生細胞（ＰＢ－ＩＰＣ）の特徴を示す。ＰＢ－ＩＰＣの特異的マーカーの特徴を明らかにするために、ＰＢ－ＩＰＣは、無血清培地でペトリ皿の疎水性プラスチック表面に付着する能力により、成体末梢血から精製した。フローサイトメトリーでは、ＰＢ－ＩＰＣが、Ｌｉｎ^-ＣＤ３４^-ＣＤ４５⁺ＳＯＸ２⁺ＣＤ４５ＲＯ⁺ＣＣＲ７⁺（図３）（白血球共通抗原ＣＤ４５、メモリー細胞マーカーＣＤ４５ＲＯ、及びＣＣＲ７、胚性幹（ＥＳ）細胞マーカーＳＯＸ２の発現など）の表現型を表示していることが実証され、ＣＤ１１７の発現が低かった。対照的に、ＰＢ－ＩＰＣは、ＨＳＣマーカーＣＤ３４及びＣＤ３８；Ｔ細胞マーカーＣＤ３、ＣＤ４、及びＣＤ８；Ｂ細胞マーカーＣＤ１９；顆粒球マーカーＣＤ６６ｂ；及びＭＫ／血小板マーカーＣＤ４１及びＣＤ４２ａ（図４）については、陰性であった。培養容器の疎水性表面に付着できなかったＣＤ１４⁺単球／マクロファージは、培養２４時間以内にアポトーシス及び／または壊死を起こした（図５）。さらに、フローサイトメトリー及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色による一晩付着後の新たに単離されたＰＢ－ＩＰＣの細胞周期を分析した。データは、０．９±０．５％の新たに単離されたＰＢ－ＩＰＣがＳ期に分布し、Ｇ₀／Ｇ₁期では９２．９４±２．７５％、Ｇ₂／Ｍ期では６．６８±２．２％であることを示した（図６）。これは、新たに単離されたＰＢ－ＩＰＣの細胞増殖の可能性が限られていることを示している。したがって、ＰＢ－ＩＰＣは、独特の表現型を示し、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）及び単球由来幹細胞（線維芽細胞様マクロファージ、ｆ－Ｍφと呼ばれる）とは異なる。

次に、ＰＢ－ＩＰＣのインスリン産生を分析した。ヒト膵島細胞を陽性対照群として使用したリアルタイムＰＣＲデータは、ＰＢ－ＩＰＣがインスリン及び転写因子（ＰＤＸ－１、ＮＫＸ６．１、及びＭＡＦＡ）ｍＲＮＡを含むヒト膵島β細胞特異的マーカーを発現することを明らかにした（図７）。速度論的分析により、これらの遺伝子マーカーは、無血清Ｘ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地の存在下でのＰＢ－ＩＰＣの２４時間のｅｘ ｖｉｖｏ培養内のほとんどのＰＢ－ＩＰＣサンプル中で安定していることが実証されたが、一部のマーカーは、消失するかまたは下方制御された。これは、血液ドナーの健康状態が異なる可能性があるためである。フローサイトメトリーにより、タンパク質レベルでＭＡＦＡ及びＣ－ペプチド（インスリン副産物）が発現している二重陽性細胞がさらに確認された（図８）。ＭＡＦＡは、インスリン発現に関与する唯一の膵島β細胞特異的活性化因子であり、グルコーストランスポーター２（ＧＬＵＴ２）は、ヒト膵島β細胞の表面マーカーであるため、さらに、上記のＰＢ－ＩＰＣマーカーとＥＳ細胞関連転写因子オクタマー結合タンパク質３／４（ＯＣＴ３／４）及びＳＲＹ－ｂｏｘ含有遺伝子２（ＳＯＸ２）の追加マーカーを組み合わせて、ＭＡＦＡ及びＧＬＵＴ２を使用して、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＰＢ－ＩＰＣの割合を分析した。ＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒト系統カクテル１（Ｌｉｎ１）（ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６）を適用して、Ｔ細胞、単球／マクロファージ、顆粒球、Ｂ細胞、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの既知の細胞系統を排除した。抗ヒト白血球共通抗原ＣＤ４５ｍＡｂを使用して、データ分析中に赤血球（ＲＢＣ）及び血小板の混入を除去した。ＭＡＦＡ（転写因子）及びＧＬＵＴ２（β細胞表面マーカー）を利用して、ＰＢ－ＩＰＣにおける膵島β細胞関連表現型を決定した。フローサイトメトリー分析は、０．００４５±０．００４のＬｉｎ¹－ＣＤ３４^-ＣＤ４５⁺ＣＤ４５ＲＯ⁺ＣＣＲ７⁺ＳＯＸ２⁺ＯＣＴ３／４⁺ＭＡＦＡ⁺Ｇｌｕｔ２⁺ＰＢ－ＩＰＣ細胞が新鮮なＦｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ単離ヒトＰＢＭＣ中に存在することを示した。一晩（１２時間）付着選択後、ＰＢ－ＩＰＣをＰＢＭＣから単離し、Ｌｉｎ１^-ＣＤ３４^-ＣＤ４５⁺ＣＤ４５ＲＯ⁺ＣＣＲ７⁺ＳＯＸ２⁺ＯＣＴ３／４⁺ＭＡＦＡ⁺Ｇｌｕｔ２＋の発現を伴う同じ表現型を示すことができる（図９）。また、ＧＦＰ陽性インスリン産生細胞は、インスリンプロモーター－緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）－トランスジェニックマウスの末梢血にもあることが判明した（株名：Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（Ｉｎｓ１－ＥＧＦＰ）１Ｈａｒａ／Ｊ、株番号：００６８６４）（図１０）。したがって、これらのデータは、本発明のアプローチによって単離できる末梢血中のＰＢ－ＩＰＣの存在を確立した。

実施例２
網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞へのミトコンドリア誘導ＰＢ－ＩＰＣ（ｍｉＰＢ－ＩＰＣ）のｅｘ ｖｉｖｏ分化
血小板は、ヒトゲノムＤＮＡを含まない除核細胞である。アフェレーシス血小板は、次の実験のため、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒから高純度で入手した（ＣＤ４１⁺ＣＤ４２⁺血小板＞９９％）。単離されたミトコンドリアの純度は、≧９０％であった。

網膜色素上皮（ＲＰＥ）は、視覚機能及び光受容体の完全性を根本的に支持する単層細胞である。ＲＰＥ細胞の機能不全及び損失は、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）の主な原因であり、失明につながる。ｍｉＰＢ－ＩＰＣが多能性であるか否かを判断するために、ＲＰＥ細胞への分化の試験を行った。図１１～図１４は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞へのミトコンドリア誘導ＰＢ－ＩＰＣ（ｍｉＰＢ－ＩＰＣ）の分化を示す。ＲＰＥ成長培地の存在下での８日間の複合サプリメント（Ｌ－グルタミン、硫酸ゲンタマイシン－アムホテリシン（ＧＡ－１０００）、及び塩基性線維芽細胞成長因子など）による治療は、９０％を超えるｍｉＰＢ－ＩＰＣを生じさせて、ＲＰＥ表現型を獲得した。このようなＲＰＥ表現型には、細胞質での色素沈着顆粒、様々な長さでの多数の細胞突起（図１１）、及び視覚サイクルタンパク質ＲＰＥ６５及び細胞レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）の発現が含まれる。さらに、初代ヒトＲＰＥ細胞（図１２、上）と同様に、ｔｉｇｈｔ ｊｕｎｃｔｉｏｎ関連膜タンパク質であるｃｌａｕｄｉｎ－１９及びＺｏｎｕｌａｒ ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ－１（ＺＯ－１）（図１２、下）が含まれていた。機能分析は、ヒトＲＰＥ細胞と同様に、蛍光ビーズの強力な食作用（図１３）及び食作用マーカーＣＤ３６の上方制御された発現（図１４）をもたらした。未処置細胞は、対照として使用し、これらの変化を示すことはできなかった。これらの結果は、ヒトＲＰＥ細胞の表現型を獲得した分化したＲＰＥ細胞を示した。

実施例３
神経細胞へのミトコンドリア誘導ＰＢ－ＩＰＣ（ｍｉＰＢ－ＩＰＣ）のｅｘ ｖｉｖｏ分化
ＲＰＥ細胞分化の誘導中に、いくつかの細長い神経様細胞が観察された。したがって、ｍｉＰＢ－ＩＰＣの神経細胞への分化能を調査した。図１５～１６は、ｍｉＰＢ－ＩＰＣの神経細胞への分化を示す。１００ｎｇ／ｍＬの神経細胞成長因子（ＮＧＦ）及びヒト神経幹細胞成長培地を２４ウェルプレートで２～３日間処置後、処置したｍｉＰＢ－ＩＰＣの９９％が、分岐を有する細長い軸索様突起を含む典型的な神経細胞の形態を示し、樹状突起を介して細胞間ネットワークを形成した（図１５）。二重免疫染色により、処置細胞の９９．１％が、ニューロン特異的マーカーであるシナプシンＩと、カテコールアミン（例えば、ドーパミン及びノルエピネフリンなど）の生合成のための律速酵素であるチロシンヒドロキシラーゼ（図１６）を発現したことが明らかになった。未処置細胞は、自発的分化のみを示した（＜３％）。これらのデータは、ｍｉＰＢ－ＩＰＣのアドレナリン神経細胞の分化能を示している。

実施例４
ｍｉＰＢ－ＩＰＣのクローン分析
ｍｉＰＢ－ＩＰＣの多能性をさらに決定するために、クローン分析を実施した。図１７～２３は、ｍｉＰＢ－ＩＰＣのクローン分析及びｍｉＰＢ－ＩＰＣの腫瘍形成についての試験を示す。ｍｉＰＢ－ＩＰＣのコロニー形成は、異なるサイズで観察され（図１７）、ｍｉＰＢ－ＩＰＣのコロニー形成の可能性は、未処置ＰＢ－ＩＰＣと比較して、ミトコンドリア処置後に著しく増加した（図１８）。ｍｉＰＢ－ＩＰＣのコロニー形成は、２４ウェルプレートでの２ヶ月の培養において、様々なサイズで生じた。ｍｉＰＢ－ＩＰＣは、最初に無血清ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）ｈＰＳＣ ＸＦ培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、２４ウェル組織培養プレート中１ｘ１０⁴細胞／ｍＬ／ウェル、３７℃、８％ＣＯ₂の培養条件で培養した。データは、５つの調製物からの平均±ＳＤとして表示される。フローサイトメトリーでは、これらのコロニーが、ＰＢ－ＩＰＣマーカーＣＤ４５⁺及びＣＤ３４^-（９４．７±４．２９％，ｎ＝３）、ＳＯＸ２⁺（７７．３８±１３．３４％）、及びＣＤ４５ＲＯ⁺及びＣＣＲ７⁺（９２．４±３．６％）（図１９）を保持していることが確認された。５個のコロニーを分散させ、９６ウェルプレートに接種した。マクロファージ分化のための５０ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦなど、神経細胞のための１００ｎｇ／ｍＬＮＧＦ、及び特定の条件培地を使用したＲＰＥ細胞など、異なる系統特異的誘導因子による治療後、様々な系統マーカーの特徴により、分化Ｍφの６２．０５±６．４３％が蛍光ビーズの食作用を呈し（図２０、左）、分化ＲＰＥ細胞の７５．６±４．８％が、ＲＰＥ６５陽性であり（図２０、中央）、分化神経細胞の９４．８±１．７％が、シナプシンＩ陽性であり（図２０、右）、それぞれ特徴的な形態を有することが実証された。未処置細胞は、最小の自発的分化を示した（＜５％）。これらのデータは、単一コロニー由来細胞が、マクロファージ、ＲＰＥ細胞、及び神経細胞など、様々な細胞系統を生じさせ得ることを示しており、これにより、ｍｉＰＢ－ＩＰＣの多能性が確認される。

追加の研究では、２ｘ１０⁷細胞／マウス（ｓ．ｃ．）の用量でｍｉＰＢ－ＩＰＣを移植後、腫瘍形成がないことが確認された。ｍｉＰＢ－ＩＰＣ移植マウスは、１２週間の追跡調査時に体重が増加し（図２１、ｎ＝３マウス）、組織検査（肺、肝臓、脾臓、及び腎臓）時に、明らかな腫瘍形成はなく、これは、ｍｉＰＢ－ＩＰＣ適用が安全であることを示している。

ｍｉＰＢ－ＩＰＣの多能性分化を判定するために、外胚葉用のニューロンマーカーシナプシン、内胚葉用の膵島β細胞マーカーインスリン、及び中胚葉用のマクロファージマーカーＣＤ１１ｂなど、三胚葉関連マーカーを使用して、コロニー分析を実施した。共焦点顕微鏡法は、ミトコンドリア未処置ＰＢ－ＩＰＣ由来コロニーよりもｍｉＰＢ－ＩＰＣ由来コロニーに分布する三胚葉陽性細胞が多いことを示した（図２２）。三胚葉免疫細胞化学キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、コロニー分析を、追加の三胚葉関連マーカー、例えば、外胚葉のニューロンマーカーベータＩＩＩチューブリン（Ｔｕｊ１）、内胚葉の肝細胞マーカーアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、及び中胚葉の平滑筋アクチン（ＳＭＡ）で繰り返した。データにより、ｍｉＰＢ－ＩＰＣ由来コロニーにおいて、自発的に分化した三胚葉陽性細胞が確認された（図２３）。陽性細胞の数は、ミトコンドリア未処置ＰＢ－ＩＰＣ由来のコロニー中では非常に少ないか、または陰性であった（図２３）。したがって、データは、ｍｉＰＢ－ＩＰＣの多能性を示した。

実施例５
ＰＢ－ＩＰＣの核へのミトコンドリアの浸透
ＰＢ－ＩＰＣにおける外因性血小板由来ミトコンドリアの作用を調査するために、図２４～３１に示すように、処置条件に従ってＰＢ－ＩＰＣの核に移動するミトコンドリアを電子顕微鏡により観察した。ミトコンドリアは、核膜を通過し（図２４）、核マトリックスの内側、核小体の近く（図２５）に位置し、細胞質内のミトコンドリアと同様の形状を有する（図２５、矢印で示す）ことが観察された。未処置ＰＢ－ＩＰＣでは、このような顕著な現象は見られなかった（図２６）。外因性ミトコンドリアのＰＢ－ＩＰＣの核への侵入をさらに確認するために、ＰＢ－ＩＰＣを、ＨＥＫ２９３細胞株から単離した赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）標識ミトコンドリアで処置した（図２７）。４時間処置後、共焦点顕微鏡で細胞質に浸潤するＲＦＰ⁺ミトコンドリアが確認された（図２７）。ミトコンドリアと核との間の相互作用を直接可視化するために、新たに精製したＰＢ－ＩＰＣ由来核を、単離したＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ標識ミトコンドリアで処置した。共焦点画像では、ミトコンドリアと核との直接的な相互作用が明らかになり、一部の標識ミトコンドリアが核に侵入した（図２８）。ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ染色、抗シトクロムＣ、及び抗熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）６０ｍＡｂなど、ミトコンドリアマーカーで染色することによる透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）及びフローサイトメトリーでの観察に基づいて、核内ミトコンドリアの頻度は、約１～３％であった。

次に、ミトコンドリアの核への移動の根底にある分子機構を調査した。フローサイトメトリーにより、核がケモカイン受容体ＣＸＣＲ４（間質細胞由来因子（ＳＤＦ）－１のリガンド）を示し（図２９）、ミトコンドリアが、ＳＤＦ－１を発現することが示された（図３０）。ＳＤＦ－１／ＣＸＣＲ４の作用が、ミトコンドリアの核への浸透に寄与したか否かを判断するために、ＣＸＣＲ４受容体アンタゴニストＡＭＤ３１００によるブロッキング実験を実施した。精製ＰＢ－ＩＰＣ核は、ＡＭＤ３１００の有無にかかわらず、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ標識精製ミトコンドリアで処置した。４時間の処置後、フローサイトメトリーでは、ＡＭＤ ３１００での処置後にＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ陽性核の割合が著しく減少したことが示された（図３１）。これは、ミトコンドリアが、ＳＤＦ－１とＣＸＣＲ４との間の化学誘引物質の相互作用を介して、核に侵入したことを示している。

さらに、ＰＢＭＣ由来ミトコンドリア（血小板由来ではない）も、２．０９±０．８７％の発生率で、ＰＢ－ＩＰＣの核を貫通できることが観察された。図３２～３４は、血小板由来ミトコンドリア、ＰＢＭＣ由来ミトコンドリア、及びＰＢ－ＩＰＣ由来ミトコンドリアの間でのＳＤＦ－１発現の比較を示す。フローサイトメトリーにより、ＰＢＭＣ由来ミトコンドリアは、血小板由来ミトコンドリアと同様のＳＤＦ－１発現レベルを示したが、ＰＢ－ＩＰＣ由来ミトコンドリアよりもはるかに高いことが明らかになった。ＰＢ－ＩＰＣを、３７℃、５％ＣＯ₂で、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ標識ＰＢＭＣ由来ミトコンドリア（１００μｇ／ｍｌ）で処置した。４～６時間処置後、細胞を観察し、ソフトウェアＮＩＳ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ バージョン４．６０を用いて、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ２倒立型台座上のＮｉｋｏｎ Ａ１Ｒ共焦点顕微鏡で撮像した。（図３２～３４）。ＰＢ－ＩＰＣの精製核に対するＣＸＣＲ４受容体アンタゴニストＡＭＤ３１００によるブロッキングの結果と合わせて、これらのデータは、ＳＤＦ－１／ＣＸＣＲ４この経路が、ミトコンドリアのＰＢ－ＩＰＣの核膜への移動に寄与し、これが、ＰＢ－ＩＰＣの核の透過につながることを示している。

実施例６
ミトコンドリアによる処置後のＰＢ－ＩＰＣの遺伝的及びエピジェネティック変化
ミトコンドリアが核内の発現を調節する機構を調べるために、精製されたＰＢ－ＩＰＣ由来の生存可能な核を、単離されたミトコンドリアにより、３７℃、５％ＣＯ₂で４時間処置し、転写の変化を、リアルタイムＰＣＲアレイによって評価した。データは、以下のエピジェネティッククロマチン修飾酵素関連遺伝子の著しい変化を明らかにした；ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（活性化転写因子－２（ＡＴＦ２）、リジンアセチルトランスフェラーゼ２Ｂ（ＫＡＴ２Ｂ）、ＫＡＴ５、及びＫＡＴ８）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（コアクチベーター関連アルギニンメチルトランスフェラーゼ１（ＣＡＲＭ１）、混合系統白血病タンパク質（ＭＬＬ）、ＭＬＬ３、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ５（ＰＲＭＴ５）、及びＰＲＭＴ６）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性関連ＳＥＴ（Ｓｕ（ｖａｒ）、Ｚｅｓｔｅ及びＴｒｉｔｈｏｒａｘのエンハンサー）ドメインタンパク質（ＡＳＨ１Ｌ（不在、低分子、またはホメオティック）様（ショウジョウバエ）、１Ａを含むＳＥＴドメイン（ＳＥＴＤ１Ａ）、及びＳＥＴＤ５）、ヒストンリン酸化（（オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）、ＡＵＲＫＣ、ｐ２１タンパク質活性化キナーゼ１（ＰＡＫ１）、及びリボソームタンパク質Ｓ６キナーゼポリペプチド３（ＲＰＳ６ＫＡ３））、ヒストンユビキチン化（ＤＡＺ相互作用タンパク質３（ＤＺＩＰ３）及びユビキチンコンジュゲート酵素Ｅ２Ｂ（ＵＢＥ２Ｂ））、ＤＮＡ及びヒストン脱メチル化酵素メチル－ＣｐＧ結合ドメインタンパク質２（ＭＢＤ２）、及びヒストン脱アセチル化酵素（ヒストン脱アセチル化酵素３（ＨＤＡＣ３）、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、及びＨＤＡＣ１１））（図３５）。

これらのデータは、核を貫通するミトコンドリアが、エピジェネティック調節及び遺伝的調節の両方に寄与し、ＰＢ－ＩＰＣの再プログラミングにつながることを示している。より差次的に発現する遺伝子を見つけるために、ミトコンドリア処置ＰＢ－ＩＰＣと未処置ＰＢ－ＩＰＣの間で、ＲＮＡシーケンス（ＲＮＡ－ｓｅｑ）分析を４つの調製物で行った（図３６）。結果は、ミトコンドリア処置ＰＢ－ＩＰＣでは、３７の遺伝子が著しく上方制御され（図３７、ｐ＜０．０５）、９の遺伝子が下方制御（図３８、ｐ＜０．０５）されたことを示した。ミトコンドリアによる処置後、ＰＢ－ＩＰＣでは、他の遺伝子（ｎ＝１５，３８８、遺伝子の９９．７％）に有意な変化はなかった。

実施例７
血小板由来ミトコンドリアによる処置後のミトコンドリア誘導ＰＢ－ＩＰＣ（ｍｉＰＢ－ＩＰＣ）のミトコンドリア誘導ＣＤ３４⁺－ＨＳＣ様細胞（ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣ）へのＥｘ Ｖｉｖｏ分化
高純度アフェレーシス血小板は、次の実験のため、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒから入手した（＞９９％、ＣＤ４１⁺ＣＤ４２⁺血小板）。図３９～４２は、血小板由来ミトコンドリアで処置後のＣＤ３４⁺ＨＳＣ様細胞へのＰＢ－ＩＰＣの分化を示す。血小板から単離されたミトコンドリアの純度を測定するために、ＭｉｔｏＴｒａｃｋ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ染色、抗シトクロムＣ、抗熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）など異なるマーカーを、フローサイトメトリーによって適用した。６０個の抗体は、ミトコンドリアマーカー、カルネキシンは、小胞体（ＥＲ）、ＧＭ１３０は、ゴルジ装置に使用された。フローサイトメトリーでは、単離されたミトコンドリアの９９％が、ＭｉｔｏＴｒａｃｋ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ、ＨＳＰ６０、及びシトクロムＣに対して陽性であることが示され、約５％のシトクロムＣ⁺カルネキシン⁺細胞及び４％のシトクロムＣ⁺ＧＭ１３０⁺が存在した（図３９）。二重陽性染色の結果は、ミトコンドリアとＥＲまたはゴルジ装置との相互作用及びコンジュゲートによってそれぞれ引き起こされている可能性がある。フローサイトメトリー分析は、単離されたミトコンドリアの純度が≧９０％であることを示した。（図３９）。自己由来または同種異系の末梢血から精製された血小板由来ミトコンドリアを調製し、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒで成体ドナーの血液サンプルから単離され、拡張されたＰＢ－ＩＰＣに対して処置した（ｎ＝５１；平均年齢４８．７６±１４．９７；年齢範囲、１８歳～７２歳；男性２４名、及び女性２７名）。特に、ＨＳＣマーカーＣＤ３４の発現は、ミトコンドリアで処置後、ＰＢ－ＩＰＣ中で上方制御された。２週間のミトコンドリア処置後のｍｉＰＢ－ＩＰＣの表現型分析は、ｍｉＰＢ－ＩＰＣ上のＣＤ３４の発現が０．７１％±０．２５％から１４．８％±３．１％に増加したという点で印象的であった（ｐ＝７．８８ｘ１０⁶、ｎ＝５）（図４０）。最適化された細胞マーカーパネルを使用して、ミトコンドリア誘導ＣＤ３４⁺（ｍｉＣＤ３４⁺）細胞が、ＣＤ３４⁺ＣＤ３８^-/lowＣＤ４５ＲＡ^-ＣＤ４９ｆ⁺ＣＤ９０⁺Ｆｌｔ３^-/lowＣＤ７⁺ＣＤ１０⁺ＣＤ７１⁺ＢＡＨ１^-/lowの表現型を示すこと（１４．８％±３．１％、ｎ＝５）が観察された。（図４１）。動員されていない健康ドナーからの通常の血液ＣＤ３４⁺ＣＤ４５ＲＡ^-ＣＤ９０⁺Ｆｌｔ３^-/lowＣＤ７⁺ＣＤ７１⁺ＨＳＣ（０．４９％±０．１９％，ｎ＝４）と比較して、ｍｉＣＤ３４⁺細胞は、ＣＤ３４⁺ＣＤ４５ＲＡ^-ＣＤ９０⁺Ｆｌｔ３^-/lowＣＤ７⁺ＣＤ７１⁺（１５．３％±２．９％，ｎ＝５，ｐ＜０．０１）と同様の表面マーカーを発現したが、より高いレベルのＣＤ１０（ヒトリンパ系前駆細胞を定義するマーカー）（９９．４％±０．３６％対２０．６％±３．１％，ｐ＜０．０１）、ＣＤ４９ｆ（ほとんどの幹細胞集団の一般的なバイオマーカー）（９８．８％±１．３％対１５．４％±２．９％，ｐ＜０．０１）、及び低いレベルのＢＡＨ－１（ヒト巨核球赤血球前駆細胞のマーカー）（０．５１％±０．２％対３２．５％±３．９％，ｐ＜０．０１）を発現した（図４１、図４２）。データは、ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣでのＣＤ７及びＣＤ１０（共通リンパ球前駆細胞（ＣＬＰ）細胞の表面マーカー）の共発現により、ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣが、リンパ球を生じさせる高い可能性を有することを示唆している。

実施例８
ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣのＴ細胞への分化
図４３～５０は、精製ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣのＴ細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化を示す。ｍｉＣＤ３４⁺細胞が幹細胞として機能するか否かを判定するために、それらをｍｉＰＢ－ＩＰＣから精製し、異なる誘導因子で処置した（図４３）。最初に、精製されたｍｉＣＤ３４⁺細胞を組換えＦＭＳ様チロシンキナーゼ（ＦＬＴ）－３リガンド、インターロイキン（ＩＬ）－２、及びＩＬ－７で３日間処置することにより、Ｔ細胞に分化する可能性を調べた。位相差顕微鏡法では、顕著な形態学的変化が明らかになり、分化したＴ細胞は、このサイトカイン処置群において、多数の細胞クラスタを有し、いくつかの細胞が上清に放出された（図４４、右）。対照群の細胞は平滑な表面を呈し、いかなる形態学的変化も示さなかった（図４４、左、及び図４５）。共焦点顕微鏡法では、分化細胞が、ヒトＴ細胞マーカーＣＤ４を強く発現し、ＣＤ８の発現が弱いことを示した（図４６）。フローサイトメトリーにより、ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣのＣＤ３⁺ＣＤ４⁺ＣＤ８^-ＣＤ３８⁺Ｔ細胞（割合７６．９３％±３．２１％（図４７，ｎ＝４）、ＣＤ３⁺ＣＤ４⁺ＴＣＲαβ⁺Ｔ細胞（８２．６５％±５．２％，ｎ＝３）（図４８）への分化がさらに確認された。Ｔ細胞機能マーカーによる細胞内染色は、これらのＴ細胞が、Ｔｈ１サイトカインＩＬ－１２（６５．３％±２０．１％，ｎ＝３）及びＴｈ２サイトカインＩＬ－４（２８．５％±９．９９％，ｎ＝３）及びＩＬ－５（５３．９％±１１．２％，ｎ＝３）を産生し、インターフェロン（ＩＦＮ）－γのレベルが非常に低い（０．６１％±０．３％，ｎ＝３）ことを示した（図４９）。追加の機能試験では、ホルボール１２－ミリスタート１３－アセタート（ＰＭＡ）及びイオノマイシンによる処置後、ＩＬ－４（ｐ＝０．００２５、ｎ＝３）、ＩＬ－５（ｐ＝０．００４９、ｎ＝３）、及びＩＬ－１２（ｐ＝０．０３７、ｎ＝３）などのサイトカインの有意に上方制御された発現レベルが確認された。ＩＮＦ－γのレベルは、顕著な変化を示さなかった（ｐ＝０．０８５、ｎ＝３）。データにより、分化したＴ細胞がＰＭＡ／イオノマイシンの刺激に応答したことが確認された（図５０）。高効率のＴ細胞の急速な分化では、ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣが、機能的かつ確定的な造血前駆細胞に変換されたことが明らかに示された。

実施例９
ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣの他の造血系統へのｅｘ ｖｉｖｏ分化
図５１～５７は、ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣのｅｘ ｖｉｖｏでの複数の分化を示している。分化の可能性をさらに調べるために、ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣをマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）で３日間処置すると、すぐに十分な間隔の付着細胞となった。機能分析により、Ｍ－ＣＳＦ処置ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣは、蛍光ラテックスビーズの強力な食作用を呈することが確認されたが（図５１、中央）、未処置細胞は、この効果に対してほとんど陰性であった（図５１、左）。フローサイトメトリーでは、細胞の３４．３％±４．３％が、ＣＤ１１ｂ⁺ＣＤ２０９⁺マクロファージ（Ｍφ）であり、約５３．６６％±３．８％がＣＤ１１ｂ⁺ＣＤ２０９^-マクロファージ（Ｍφ）であることが確認された（図５１、右）。対照的に、未処置ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣには、ＣＤ１１ｂ⁺ＣＤ２０９^-マクロファージが１５．２９％±１．５％のみ存在し、ＣＤ１１ｂ⁺ＣＤ２０９⁺マクロファージが０．４３％±０．１２％であった。

次に、ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）に誘導された。３日後、処置細胞の８１．１４％±３．７％が、顆粒球特異的マーカーＣＤ６６ｂを示し、ライト－ギムサ染色によって示された核－細胞質比の減少及び多葉核を示した（図５２）。しかし、未処置ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣは、ＣＤ６６ｂを発現できず、核と細胞質との比が大きい、大きな核を示した（図５２、ｎ＝４）。さらに、エリスロポエチン（ＥＰＯ）で５日間処置後、ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣは、赤血球系（Ｅｒ）系統マーカーＣＤ２３５ａに対して強く陽性の有核細胞になり、追加のＥＰＯ処置による核の排除を介して、ＲＢＣの成熟を促進し、特徴的な両凹面形状及び除核されたＲＢＣを示した。（図５３）。合計で４１．４％±１１．４６％の細胞が、最終的に除核ＣＤ２３５ａ⁺ＣＤ４５^-ヘモグロビン⁺ＲＢＣに分化した（図５４、ｎ＝４）。しかし、未処置細胞は、これらの分化を示すことができなかった、またはこれらのマーカーのバックグラウンドレベルのみ発現していた。さらにフローサイトメトリー分析により、成熟ＲＢＣ中ではヘモグロビンの発現レベルが増加し、ヘモグロビン⁺ＣＤ４５^-成熟ＲＢＣの平均蛍光強度が１３．６１±４．２９で増加し、ヘモグロビン⁺ＣＤ４５⁺未成熟ＲＢＣは、８．２９±１．６１（ｐ＝０．０４４、ｎ＝４）であったことが確認された。

また、血液凝固に重要なＭＫ及び血小板に対するｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣの関与を調べた。ＦＬＴ－３リガンド及びトロンボポイエチン（ＴＰＯ）により７日間処置後、ＣＤ４２⁺ＭＫの産生が得られ、典型的な倍数体化（ほとんど２Ｎ～７Ｎ）（図５５～５７）及び非有核ＣＤ４２⁺血小板形成（２１．３％±４．１％，ｎ＝４）（図５５～５６）を得て、ＭＫあたり９５±１７の血小板を得た。成熟ＣＤ４２⁺血小板の約５４％が、上清に放出された（図３Ｆ、ｎ＝４）。

実施例１０
ＮＳＧマウスへの移植後のｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣの他の造血系統へのｉｎ ｖｉｖｏ分化
多能性機能をさらに判定するために、精製ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣを照射された非肥満糖尿病（ＮＯＤ）／Ｌｔ－ｓｃｉｄ／ＩＬ２Ｒγ^null（ＮＳＧ）マウスに移植した（図２）。図５８～６３は、照射ＮＳＧマウスへの移植後のｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣの複数のｉｎ ｖｉｖｏ分化を示す。ｍｉＣＤ３４ＨＳＣ移植マウスの末梢血、脾臓、骨髄におけるヒトＣＤ４５⁺細胞のキメラ現象を、Ｔ細胞（ＣＤ３⁺ＣＤ４⁺）、Ｂ細胞（ＣＤ１９⁺）、単球（ＣＤ１４⁺）、顆粒球（ＣＤ６６ｂ⁺）、赤血球（ＣＤ２３５ａ⁺）、及び巨核球／血小板（ＣＤ４１ｂ⁺）を含む血球系特異的マーカーによるフローサイトメトリー分析を用いて、１２週間で検査した。照射ＮＳＧマウスへの移植後のｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣの多系統分化を決定するために、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陽性死細胞を除外した後、異なるサンプルからの生細胞のみを分析用にゲーティングした。ゲートされたヒト白血球共通抗原ＣＤ４５陽性及びマウスＣＤ４５．１陰性の生細胞は、Ｔ細胞のＣＤ３及びＣＤ４；Ｂ細胞のＣＤ１９；巨核球／血小板のＣＤ４１ｂ；単球／マクロファージのＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、及びＣＤ１１ｃ；顆粒球のＣＤ６６ｂ、ならびに赤血球のＣＤ２３５ａなど、様々な系統特異的表面マーカーを用いて特徴を明らかにするために分析した。ＳＹＴＯ６０は、ＣＤ２３５ａ＋有核赤血球系細胞を染色するために利用した。アイソタイプ一致ＩｇＧは、フローサイトメトリーの対照として使用した。

血液中のヒトＣＤ４５⁺細胞（９．９３％±９．６２％、ｐ＝０．０３５％）及び脾臓（２５．３７％±２１．８９％、ｐ＝０．０１８）の移植レベルは、生着後１２週間での骨髄（０．３３％±０．１５％）よりもはるかに高かった（図５８、ｎ＝６マウス）。ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣ由来ＣＤ３⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞は、移植後１２週間において、ヒトＣＤ４５⁺血球の５７．９２％±８．４９％で支配的な割合を維持し、血液中の他の移植細胞は、異なる割合であった。同様のデータ（ＣＤ３⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞の５９％±１３．５５％）が、ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣ移植マウスの脾臓細胞から得られた（図５９～６０、ｎ＝５マウス）。対照的に、骨髄中のｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣ由来ＣＤ３⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞の割合は、１２週で、４９．４５％±１４．０１％であり、ＣＤ１９⁺Ｂ細胞は、５．２４％±２．６８％、ＣＤ４１ｂ⁺巨核球／血小板は、４．３％±２．０％、ＣＤ１４⁺単球は、１．７１％±２．３６％、ＣＤ６６ｂ⁺顆粒球は、０．５１％±０．４６％、ＣＤ２３５ａ⁺ＳＹＴＯ６０⁺有核赤血球は、０．２２％±０．１３％、ＣＤ２３５ａ⁺ＳＹＴＯ６０^-除核赤血球は、０．０８％±０．０５％であった（図６１、ｎ＝６マウス）。ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣ移植マウスの末梢血におけるＣＤ１４⁺単球の割合は、２．１％±１．８１％であった。さらなるフローサイトメトリーでは、未分化ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣの一次表現型を検出できなかった。１２週において、ｍｉＣＤ３４ ＨＳＣ移植マウスの末梢血（０．０７％±０．０４％）、脾臓（０．０４％±０．０３％）、骨髄（０．０１％±０．０１％）には、ヒトＣＤ３４⁺細胞は、ほとんど存在しなかった（図６２、ｎ＝５マウス）。

単球／マクロファージ（骨髄系分化）を生じさせるｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣをさらに確認するために、ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣ移植マウスにおいて、マクロファージ関連マーカーの抗ヒトＣＤ１１ｂ及びＣＤ１１ｃｍＡｂｓを用いて、それぞれ１２週間及び１６週間に、さらなる動物研究を行った。フローサイトメトリーでは、ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣ移植マウスの脾臓細胞中で、１６週間におけるｍＣＤ４５^-ｈＣＤ４５⁺ｈＣＤ３^-ｈＣＤ１１ｂ⁺ｈＣＤ１１ｃ⁺マクロファージの割合が７５．２２％±１８．３３％であることが示された（図６３、ｎ＝３）。対照的に、ｍＣＤ４５^-ｈＣＤ４５⁺ｈＣＤ３⁺ｈＣＤ１１ｂ^-Ｔ細胞の割合は、１２週間で５９％±１４．０１％から１６週間で４．０５％±２．８７％に減少した（図６３）。したがって、データは、照射ＮＳＧマウスに移植後のｍｉＤ３４⁺ＨＳＣの単球／マクロファージ（骨髄）分化を示した。他の系統分化（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、巨核球、及び赤血球）を考慮すると、これらのデータは、ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣの多系統分化を示した。

実施例１１
血小板由来ミトコンドリア処置後のｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣ分化に寄与するＮｏｔｃｈシグナル伝達経路
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、ＨＳＣの生成及び分化に不可欠な調節因子として十分に確立されている。具体的には、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路は、様々な段階でのＴ細胞の発生及び成熟において重要な役割を果たす。Ｅｘ ｖｉｖｏデータ及びｉｎ ｖｉｖｏデータは両方とも、ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣの複数の分化を示した。ミトコンドリア処置の基礎となる分子機構を解剖するために、図６４～６７に示すとおり、ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣに対するＰＢ－ＩＰＣの分化誘導中のＮｏｔｃｈシグナル伝達の作用を検討した。フローサイトメトリーでは、ミトコンドリアが、ＮｏｔｃｈリガンドＪａｇｇｅｄ１（ＪＡＧ１）（２５．１３％±１６．０％）、Ｊａｇｇｅｄ２（ＪＡＧ２）（６８．０４％±１４．６％）、及びデルタ様３（ＤＬＬ３）（６９．３％±２５．９６％）を発現したが、ＤＬＬ１（２．２１％±１．７４％）及びＤＬＬ４（０．２３％±０．０９％）を発現しなかったことが明らかになった（図６４）。血小板由来ミトコンドリアによる処置後、ＰＢ－ＩＰＣ中でのＮｏｔｃｈ受容体１～４の発現レベルが著しく上方制御された（図６５）。ミトコンドリア誘導ＰＢ－ＩＰＣのｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣ分化におけるＮｏｔｃｈシグナル伝達の役割を調べるために、Ｎ－［Ｎ－（３，５－ジフルオロフェナセチル）－Ｌ－アラニル］－Ｓ－フェニルグリシン－ｔ－ブチルエステル（ＤＡＰＴ）処置を用いて、遺伝子転写を開始するため核へとＮｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）を放出するのに必要な酵素であるγ－セクレターゼをブロックした（図６６）。ミトコンドリア及びＤＡＰＴ（２６．２％±５．６８％）処置群において、ＣＤ３４⁺細胞の割合が有意に増加した（図６７）。対照的に、ＤＡＰＴ単独処置では、ＣＤ３４⁺細胞を誘導する能力（２．５９％±０．１３％）が非常に低く現れ、これは、ｍｉＣＤ３４⁺ＨＳＣ細胞分化のためにミトコンドリアが必要であることを示すものである。

このように発明を説明してきたが、新規かつ特許状によって担保されることが望ましいと主張されるものは，次のとおりである：

Claims (20)

1. 多能性細胞を生成する方法であって、前記方法が、
   成体末梢血のサンプルを提供するステップと；
   前記成体末梢血サンプルを疎水性表面に適用し、前記ＰＢ－ＩＰＣを前記疎水性表面に付着させることにより、前記成体末梢血サンプルから末梢血インスリン産生細胞（ＰＢ－ＩＰＣ）を単離するステップと；
   前記成体末梢血サンプルからミトコンドリアを単離するステップと；
   前記ＰＢ－ＩＰＣを前記ミトコンドリアで処置するステップと；を含み、
   前記ミトコンドリアが、前記ＰＢ－ＩＰＣに侵入し；
   前記ＰＢ－ＩＰＣが、多能性分化のための前記ＰＢ－ＩＰＣの再プログラミングに対応するように構成された、多能性細胞を形成する前記侵入させたミトコンドリアを有する、前記方法。
2. 前記成体末梢血サンプルから末梢血由来単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離するステップをさらに含み、
   前記成体末梢血サンプルからＰＢ－ＩＰＣを単離する前記ことは、前記ＰＢＭＣを前記疎水性表面に適用し、前記ＰＢ－ＩＰＣを前記疎水性表面に付着させることを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記成体末梢血からミトコンドリアを単離する前記ことが、前記成体末梢血から血小板を単離することと、前記血小板から前記ミトコンドリアを単離することと、を含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記成体末梢血からミトコンドリアを単離する前記ことが、前記成体末梢血からＰＢＭＣを単離することと、前記ＰＢＭＣから前記ミトコンドリアを単離することと、を含む、請求項１に記載の方法。
5. 前記成体末梢血からミトコンドリアを単離する前記ことが、前記成体末梢血から血漿を単離することと、前記血漿から前記ミトコンドリアを単離することと、を含む、請求項１に記載の方法。
6. 前記成体末梢血のサンプルが、第１供給源からの成体末梢血の第１サンプルと、第２供給源からの成体末梢血の第２サンプルとを含み；
   前記成体末梢血の第１サンプルは、前記ＰＢ－ＩＰＣを単離する前記ことのために使用され、
   前記成体末梢血の第２サンプルは、前記ミトコンドリアを単離する前記ことのために使用される、請求項１に記載の方法。
7. 前記侵入したミトコンドリアが、前記ＰＢ－ＩＰＣの核に侵入するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
8. 前記ミトコンドリアが、ＳＤＦ－１タンパク質リガンドを含み；
   前記ＰＢ－ＩＰＣ核が、ＣＸＣＲ４タンパク質受容体などの核膜を含み、
   前記ＰＢ－ＩＰＣの前記核に侵入する前記侵入したミトコンドリアは、前記ＣＸＣＲ４タンパク質受容体と相互作用する前記ＳＤＦ－１タンパク質リガンドを含む、請求項７に記載の方法。
9. 前記侵入したミトコンドリアを有する前記ＰＢ－ＩＰＣを、所望の分化細胞のためのプロモーターで処置するステップ；をさらに含み、
   前記侵入したミトコンドリアを有する前記ＰＢ－ＩＰＣが、前記所望の分化細胞に発達する、請求項１に記載の方法。
10. 前記所望の分化細胞が、マクロファージ細胞、神経細胞、ＲＰＥ細胞、顆粒球細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、赤血球、巨核球細胞、血小板細胞、骨髄細胞、間質細胞、骨芽細胞、ケラチノサイト、毛包細胞、腺細胞、内皮細胞、角膜内皮細胞、心筋細胞、筋細胞、上皮細胞、肝細胞、腎臓細胞、及び膵島β細胞からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
11. 造血幹細胞（ＨＳＣ）様細胞を生成する方法であって、前記方法が、
    成体末梢血のサンプルを提供するステップと；
    前記成体末梢血サンプルを疎水性表面に適用し、前記ＰＢ－ＩＰＣを前記疎水性表面に付着させることにより、前記成体末梢血サンプルからＰＢ－ＩＰＣを単離するステップと；
    前記成体末梢血サンプルからミトコンドリアを単離するステップと；
    前記ＰＢ－ＩＰＣを前記ミトコンドリアで処置するステップと；を含み、
    前記ミトコンドリアが、前記ＰＢ－ＩＰＣに侵入し；
    前記侵入したミトコンドリアが、前記ＰＢ－ＩＰＣにおいてＨＳＣマーカーＣＤ３４を上方制御し、
    前記ＰＢ－ＩＰＣが、造血分化のための前記ＰＢ－ＩＰＣの再プログラミングに対応するように構成された、ＨＳＣ様細胞を形成する前記侵入させたミトコンドリアを有する、前記方法。
12. 前記成体末梢血サンプルからＰＢＭＣを単離するステップをさらに含み、
    前記成体末梢血サンプルから前記ＰＢ－ＩＰＣを単離する前記ことが、前記ＰＢＭＣを前記疎水性表面に適用し、前記ＰＢ－ＩＰＣを前記疎水性表面に付着させることを含む、請求項１１に記載の方法。
13. 前記成体末梢血からミトコンドリアを単離する前記ことが、前記成体末梢血から血小板を単離することと、前記血小板から前記ミトコンドリアを単離することと、を含む、請求項１１に記載の方法。
14. 前記成体末梢血からミトコンドリアを単離する前記ことが、前記成体末梢血からＰＢＭＣを単離することと、前記ＰＢＭＣから前記ミトコンドリアを単離することと、を含む、請求項１１に記載の方法。
15. 前記成体末梢血からミトコンドリアを単離する前記ことが、前記成体末梢血から血漿を単離することと、前記血漿から前記ミトコンドリアを単離することと、を含む、請求項１１に記載の方法。
16. 前記成体末梢血のサンプルが、第１供給源からの成体末梢血の第１サンプルと、第２供給源からの成体末梢血の第２サンプルとを含み；
    前記成体末梢血の第１サンプルは、前記ＰＢ－ＩＰＣを単離する前記ことのために使用され、
    前記成体末梢血の第２サンプルは、前記ミトコンドリアを単離する前記ことのために使用される、請求項１１に記載の方法。
17. 前記侵入したミトコンドリアを有する前記ＰＢ－ＩＰＣを血球プロモーターで処置するステップをさらに含み、
    前記侵入したミトコンドリアを有する前記ＰＢ－ＩＰＣが、前記血球プロモーターに対応する分化した血球に発達する、請求項１１に記載の方法。
18. 前記分化した血球が、マクロファージ細胞、顆粒球細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、赤血球、巨核球細胞、及び血小板細胞からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
19. 多能性細胞の生成及び医療用治療のための方法であって、前記方法が、
    成体末梢血のサンプルを提供するステップと；
    前記成体末梢血サンプルからＰＢＭＣを単離するステップと；
    前記ＰＢＭＣを疎水性表面に適用し、前記ＰＢ－ＩＰＣを前記疎水性表面に付着させることにより、前記ＰＢＭＣからＰＢ－ＩＰＣを単離するステップと；
    前記成体末梢血サンプルからミトコンドリアを単離するステップと；
    前記ＰＢ－ＩＰＣを前記ミトコンドリアで処置するステップであって、
    前記ミトコンドリアが、前記ＰＢ－ＩＰＣに侵入し；
    前記ＰＢ－ＩＰＣが、多能性分化のための前記ＰＢ－ＩＰＣの再プログラミングに対応するように構成された、多能性細胞を形成する前記侵入させたミトコンドリアを有する、前記ステップと；
    前記侵入したミトコンドリアを有する前記ＰＢ－ＩＰＣを、所望の分化細胞のためのプロモーターで処置するステップであって、
    前記侵入したミトコンドリアを有する前記ＰＢ－ＩＰＣが、前記所望の分化細胞に発達する、前記ステップと；
    前記所望の分化細胞で患者を治療するステップと、を含む、前記方法。
20. 前記所望の分化細胞が、マクロファージ細胞、神経細胞、ＲＰＥ細胞、顆粒球細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、赤血球、巨核球細胞、血小板細胞、骨髄細胞、間質細胞、骨芽細胞、ケラチノサイト、毛包細胞、腺細胞、内皮細胞、角膜内皮細胞、心筋細胞、筋細胞、上皮細胞、肝細胞、腎臓細胞、及び膵島β細胞からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。

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