KR20170001951A - 적혈구의 인 비트로 대량 생산방법 및 이의 저장 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 적혈구의 인 비트로 대량 생산 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 무기질(stroma-free), 무혈청(serum-free) 및 무혈장(plasma-free) 배지 조건 및/또는 분화시기에 따른 온도 변화 조건에 따라 적혈구 전구세포를 배양하여 인 비트로에서 적혈구를 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

적혈구의 인 비트로 대량 생산방법 및 이의 저장 방법{A Method for in vitro large―scale Production of Red Blood Cells AND Storage thereof}

본 발명은 적혈구의 인 비트로 대량 생산 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 무기질(stroma-free), 무혈청(serum-free) 및 무혈장(plasma-free) 배지 조건 및/또는 분화시기에 따른 온도 변화 조건에 따라 적혈구 전구세포를 배양하여 인 비트로에서 적혈구를 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

많은 국가에서 인구 노령화와 의료적 수요의 증가로 인하여 수혈용 적혈구의 공급이 부족하다. 그리고 수혈전파감염은 적혈구의 이용에 있어서 심각한 문제를 야기한다. 이러한 수혈전파감염은 인간면역결핍 바이러스, B형 간염 바이러스와 같은 바이러스 및 세균 오염을 포함한다. 증가한 해외 여행으로 인한 혈액감염 열대병(blood-borne tropical diseases) 및 변종 크로이츠펠트 야곱병(variant Creutzfeldt-Jacob disease)과 같은 새롭게 등장한 병원체들도 역시 문제가 된다. 이러한 요인들로 인하여 인위적으로 생산된 적혈구의 필요성이 증가한다(Greenwalt, T. J.; Zehner Sostok, C.; Dumaswala, U. J. Studies in red blood cell preservation. 1. Effect of the other formed elements. Vox Sang. 58:85-89; 1990; Olsson, M. L.; Clausen, H. Modifying the red cell surface: towards an ABO-universal blood supply. Br. J. Haematol. 140:3-12; 2008).

기증된 혈액 세포 대신 가능성 있는 대체물로서, 다양한 줄기세포로부터의 혈액 제조가 연구되어왔다(Giarratana, M. C.; Kobari, L.; Lapillonne, H.; Chalmers, D.; Kiger, L.; Cynober, T.; Marden, M. C.; Wajcman, H.; Douay, L. Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells. Nat. Biotechnol. 23:69-74; 2005; Neildez-Nguyen, T.M.; Wajcman, H.; Marden, M. C.; Bensidhoum, M.; Moncollin, V.; Giarratana, M.C.; Kobari, L.; Thierry, D.; Douay, L. Human erythroid cells produced ex vivo at large scale differentiate into red blood cells in vivo. Nat. Biotechnol. 20:467-472; 2002). 또한, 사람의 다능성 줄기세포(pluripotent stem(hiPS) cell)에서 유도된 적혈구의 체외 생성이 보고된 바 있다(Lapillonne, H.; Kobari, L.; Mazurier, C.; Tropel, P.; Giarratana, M. C.; Zanella-Cleon, I.; Kiger, L.; Wattenhofer-Donze, M.; Puccio, H.; Hebert, N.; Francina, A.; Andreu, G.; Viville, S.; Douay, L. Red blood cells generation from human induced pluripotent stem cells: perspectives for transfusion medicine. Haematologica; 2010. [Epub ahead of print]).

그러나 이러한 결과로 얻은 적아세포(erythroblasts)는 시기적절치 않은 분화 진행과 부적절한 탈핵 및 큰 취약성을 보이기 때문에, 이러한 인공적인 시스템에서는 최종 적혈구 분화에 문제가 있다(Choong, M. L.; Yang, H. H.; McNiece, I. MicroRNA expression profiling during human cord blood-derived CD34 cell erythropoiesis. Exp. Hematol. 35:551-564; 2007; Ronzoni, L.; Bonara, P.; Rusconi, D.; Frugoni, C.; Libani, I.; Cappellini, M. D. Erythroid differentiation and maturation from peripheral CD34+ cells in liquid culture: cellular and molecular characterization. Blood Cells Mol. Dis. 40:148-155; 2008). 적혈구 생성(Erythropoiesis)은 복잡하고 다단계 과정이다. 조혈줄기세포(Hematopoietic stem cells (HSCs))는 적혈구 선구세포로 분화하고, 이어서 성숙한 적혈구로 분화한다. 이 과정에서 탈핵은 마지막 단계이다. 그러나 이러한 과정의 근간이 되는 분자와 세포의 메카니즘에 대한 이해는 불충분하다.

또한, 체외 적혈구 생성에 관한 이전의 다른 연구는 혈청(10~30%)의 첨가에도 불구하고, 세포 형태, 제한적인 증식, 및 낮은 탈핵율의 결함을 보고하였다. 더욱이, 체외 생산한 적혈구의 저장에 대해 기술한 보고는 없었다. 체외 생산된 적혈구의 생존은 겨우 며칠에 불과한 정도로, 그 생존율이 매우 미약하다고 알려져 왔다(Baek, E. J.; Kim, H. S.; Kim, J. H.; Kim, N. J.; Kim, H. O. Stroma-free mass production of clinical-grade red blood cells (RBCs) by using poloxamer 188 as an RBC survival enhancer. Transfusion 49:2285-2295; 2009). 인공적으로 생산된 적혈구가 곧 나타날 것이라는 이전의 낙관론은 실현되지 못했다. 간질세포(stromal cells)와 혈청 및 혈장이 없는 조건에서 생존력 있는 탈핵 적혈구의 대량 생산에 대한 보고는 현재까지 없다(Leberbauer, C.; Boulme, F.; Unfried, G.; Huber, J.; Beug, H.; Mullner, E. W. Different steroids co-regulate long-term expansion versus terminal differentiation in primary human erythroid progenitors. Blood 105:85-94; 2005; Narayan, A. D.; Ersek, A.; Campbell, T. A.; Colon, D. M.; Pixley, J. S.; Zanjani, E. D. The effect of hypoxia and stem cell source on haemoglobin switching. Br. J. Haematol. 128:562-570; 2005). 그러므로 혈청, 간질세포와 같은 추가적인 첨가물의 보충 없이 적혈구 생산을 위한 안전하고 효율적인 배양 체계 및 저장 방법의 개발은 중요한 연구 과제로 남아있다.

본 발명자들은 임상 등급 적혈구의 대량 생산 및 보관을 위해, 전술한 선행 기술들의 문제점을 극복하고, 혈청, 혈장 및 기질 세포를 사용하지 않으면서 온도 조절이라는 간단한 방법에 의해 건강한 체외 생산 적혈구(in vitro genertated RBC, cRBC)(인공 적혈구)의 대량 수득이 가능함을 확인하고, 이를 효과적으로 보관할 수 있는 방법을 찾아 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 주요한 목적은 전술한 선행 기술들의 문제점을 극복하면서 임상 등급 적혈구의 대량 생산이 가능한, 적혈구의 인 비트로 대량 생산방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 적혈구의 대량 생산에 사용되는, 적혈구의 인 비트로 대량 생산용 배지를 제공하는 데 있다.

본 발명의 상기 방법으로 수득한 인공 적혈구를 효과적으로 보관할 수 있는, 인공 적혈구의 저장방법을 제공하는 데 있다.

상기 과제를 해결하기 위해서 본 발명은 일 태양으로,

에너지 공급원 및 항산화제를 포함하는, 무기질(stroma-free), 무혈청(serum-free) 및 무혈장(plasma-free) 배지에서 적혈구 전구세포를 배양하는 단계를 포함하는, 적혈구의 인 비트로 대량 생산방법 및;

상기 에너지 공급원 및 항산화제를 포함하고, 무기질(stroma-free), 무혈청(serum-free) 및 무혈장(plasma-free)을 특징으로 하는 적혈구 인 비트로 대량 생산용 배지를 제공한다.

이 때, 상기 항산화제는 비타민 C인 것이 바람직하다.

상기 적혈구 전구세포는 전적아세포, 호염기성 적아세포, 다염성 적아세포 및 정염성 적아세포로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

상기 배지는 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분만을 포함하는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium: CCMM)일 수 있고, 이 때 상기 탄소원이 에너지 공급원 기능을 한다. 즉, 에너지 공급원으로서 다당류(polysaccharides), 단당류(monosaccharides), 유기산(organic acid), 아미노산(amino acid), 알콜(alcohol), 다환식 함유물(polycyclic compounds), 셀룰로스(cellurose), 헤미셀룰로스(hemicellurose), 리그닌(lignin) 등의 여러가지 탄소원을 이용할 수 있다. 상기 다당류로는 덱스트린, 스타치 등을 예로 들 수 있고, 이당류로는 수크로오스, 말토오스, 트레할로오스, 만니톨 등을 예로 들 수 있고, 단당류로는 글루코스, 만노스, 프록토오스, 갈락토오스 등을 예로 들 수 있다.

상기 세포배양 최소배지로서, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), EDM(Endothelial differentiation medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium) 및 Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등을 예로 들 수 있다.

한편, 본 발명의 배지는 필요에 따라, 줄기세포인자, 인터루킨-1, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-5, 인터루킨-11, 과립구 대식세포 집락자극인자, 대식세포 집락자극인자, 과립구 집락자극인자 또는 에리쓰로포이에틴 등에서 하나 이상을 조합하여 추가로 포함할 수도 있다.

상기 배양은 당업자가 통상의 기술적 지식을 바탕으로 적절한 기간동안 배양할 수 있는데, 예를 들어, 약 25일 기간 동안 배양할 수 있다.

이 때, 배양기간의 후반에서는 25~27 ℃의 저온에서 배양하는 것이 바람직하다. 즉, 일 구체예로서, 상기 저온 배양은 배양개시 후 17일 이후에 이루어질 수 있다.

한편, 본 발명은 다른 태양으로,

다음을 포함하는 적혈구의 인 비트로 대량 생산방법을 제공한다:

적혈구 전구세포의 초기 분화기에서는, 상온 하에 에너지 공급원 및 항산화제를 포함하는 무기질(stroma-free), 무혈청(serum-free) 및 무혈장(plasma-free) 배지에서 적혈구 전구세포를 배양하는 단계; 및

적혈구 전구세포의 후기 분화기에서는, 에너지 공급원 및 항산화제를 포함하는 무기질(stroma-free), 무혈청(serum-free) 및 무혈장(plasma-free) 배지에서 25~27℃의 저온 조건으로 배양하는 단계.

이와 관련된 설명은 앞서 기술한 부분과 같다.

본 발명은 또 다른 태양으로,

상기 방법들에 의해 인공 적혈구에 혈장을 첨가하여 보관하는 것을 특징으로 하는, 인공 적혈구 저장방법을 제공한다. 바람직하게는 상기 혈장은 제대혈 유래인 것을 사용한다.

본 발명에 따라 적혈구 세포를 수득할 경우, 지지 기질 세포와의 공배양 없이, 그리고 혈청 및 혈장의 첨가도 없이, 세포의 분화와 증식 및 유지에 필요한 영양과 환경이 제공되어, 고효율로 세포핵 유출(enuleation)을 유도함으로써, 적혈구 세포를 대량 생산할 수 있다.

따라서 본 발명은 공배양에 이용되는 많은 세포주, 안전성에 문제가 많은 우혈청(fetal bovine serum, FBS)과 같은 외래성 인자, 그리고 비싸고 구하기 힘들며 안전성을 보장하기 힘든 인간 혈장 및 혈청 그리고 기질세포를 포함하지 아니하는 배지를 사용하여 배양함으로써 적혈구 전구세포를 적혈구계 세포로 순수하게 분화시키고 대량으로 증식시킬 뿐만 아니라 탈핵 과정까지 가능하게 함으로써 수혈가능한 양질의 적혈구를 생산할 수 있게 한다. 그리고 무엇보다도 본 발명의 방법의 간단성 및 저비용의 경제성 효과 부분도 매우 유리하며 이는 적혈구의 산업적 대량 생산에 있어서 매우 중요한 요소라고 할 수 있다.

또한, 지금까지 인공 적혈구를 장기간 보관한 예가 전무하였으나, 본 발명에 의해 수득한 인공 적혈구는 혈장을 첨가한 용액에 보관함으로써 한 달 정도 장기간 보관이 가능해진 바, 임상적 사용에 더욱 유용하다.

도 1은 다양한 조건으로 나누어 분주한 세포에 있어서, 배지 교환시기까지의 적혈구계 세포의 증폭배수와 누적증폭배수를 보여주는 그래프 및 비타민 C의 유무에 따른 적혈구로의 분화 결과이다.
도 2은 본 발명의 실시예에 따라 SR 및 혈청의 유무에 따른 적혈구로의 분화 를 형태변화, 마커, 탈핵율 등을 이용하여 날짜별로 확인한 결과이다.
도 3은 배양된 적혈구의 혈액학적 파라미터를 측정한 결과이다.
도 4는 배양된 적혈구의 4℃에서의 저장성 여부를 확인한 결과이다.
도 5는 적혈구 세포의 최종 성숙에서의 저온(hypothermia)의 영향을 조사하기 위한 세포 생존능(cell viability), 세포 운동성, 탈핵율, 형태 등을 관찰한 결과이다.
도 6는 적혈구 세포의 최종 성숙에서의 저온의 영향을 조사하기 위한 삼투 취약성(osmolarity fragility)을 관찰한 결과이다.
도 7은 종래 인공 적혈구 생산에 있어서 혈장을 사용한 경우의 현미경 사진이다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

'전구세포(progenitor cell)'는 자기 복제능 및 분화능(differentiation potency)을 가진 미분화 세포이지만, 최종적으로 분화하는 세포의 종류가 이미 결정되어 있는 궁극적으로 분화된 세포이다. 전구세포는 분화 경로가 예정되어 있지만, 일반적으로 성숙한 완전히 분화된 세포의 마커를 발현하지 않거나, 성숙한 완전히 분화된 세포로서는 기능하지 않는다. 따라서, 전구세포는 관련 세포 타입으로 분화되지만 정상적인 상태에서는 매우 다양한 세포 타입을 형성할 순 없다. 본 발명에서는 적혈구 전구세포를 사용한다.

'배양'이라는 용어는 생물체(주로 미생물 및 발생중인 동식물의 배)나 생물체의 일부(기관 ·조직 ·세포 등)를 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 일을 의미한다. 이 경우 외적 조건으로 온도 ·습도 ·빛 ·기체상의 조성(이산화탄소나 산소의 분압) 등이 중요하며, 그 밖에 배양되는 생물체에 가장 중요한 직접적인 영향을 주는 것은 배지(培地)이다.

'배지'는 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등의 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외에서 세포 등의 성장 및 증식을 위한 혼합물을 말한다. 특히, 본 발명의 배지는 적혈구 전구세포 배양을 통해 적혈구를 대량으로 수득하기 위한 배지이다.

'혈청'은 동물 또는 사람의 혈액으로부터 원심분리하여 얻을 수 있는 상층액이다. 상기 혈청은 세포의 성장 시 필요한 필수 영양소 이외에 성장에 필수적이나 명확히 규명되지 않은 각종 무기염, 폴리펩타이드성 성장인자, 및 폴리펩타이드성 호르몬 등의 각종 인자를 포함하는 미량원소가 포함된다.

'분화(differentiation)'는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 일반적으로 비교적 단순한 계(系)가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계(部分系)로 분리되는 현상이다. 예를 들면, 개체발생에서 처음에 동질적이었던 알 부분 사이에 머리나 몸통 등의 구별이 생기거나 세포에도 근세포라든가 신경세포 등의 구별이 생기는 것과 같이 처음에 거의 동질이었던 어떤 생물계의 부분 사이에 질적인 차이가 생기는 것, 또는 그 결과로서 질적으로 구별할 수 있는 부역 또는 부분계로 나누어져 있는 상태를 분화라고 한다.

'인 비트로 대량생산 (in vitro large-scale production)'이란 적혈구 전구세포를 분리하여 배양시켜 임상적으로 유용할 수 있을 정도로 적혈구를 높은 수준으로 수득하는 것을 말한다. 본 발명에서 '대량 생산'이란 적혈구 전구세포의 효과적인 분화로 인해 탈핵된 적혈구의 '증식(proliferation)' 또는 '확장 또는 증폭(expansion)'이 산업적으로 유용할 정도로 충분히 일어나는 것이다.

"약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 인 비트로에서 적혈구를 대량 생산할 수 있는 방법을 개발하고자 노력한 결과, 적혈구 전구세포의 배양 시에 혈청, 혈장 및 피더 세포(기질)가 없는 조건에서 배양하면서 특정한 때에 온도 조건을 달리하여 배양하면, 앞서 기술했던 기존의 문제를 해결하면서 생존능이 우수한 적혈구를 임상학적으로 유용할 정도로 인 비트로에서 대량 생산할 수 있음을 발견하였다.

본 발명은 혈청, 혈장 및 피더 세포(기질)가 없는 배지에서 탈핵 적혈구의 대량 생산과 장기 보관을 개시하는 최초의 발명이다.

본 발명은 일 관점에서, 에너지 공급원 및 항산화제를 포함하는, 무기질(stroma-free), 무혈청(serum-free) 및 무혈장(plasma-free) 배지에서 적혈구 전구세포를 배양하는 것을 포함하는, 적혈구의 인 비트로 대량 생산방법 및 이에 사용되는 적혈구의 인 비트로 대량 생산용 배지에 관한 것이다.

본 명세서에서 적혈구 전구세포(erythroid progenitor cell)는 성숙과정이 완료된 적혈구를 제외한 적혈구 형성과정에 포함되는 모든 세포를 의미한다.

상기 적혈구 전구세포는 다음과 같은 단계로 이루어진 적혈구 형성 과정(erythropoiesis)를 거쳐 성숙한 적혈구(erythrocyte)로 분화한다: (a) 단일분화성 줄기세포(unipotent stem cell, hemocytoblast)에서 전적아세포(proerythroblast)로 분화하는 단계; (b) 전적아세포에서 호염기성 적아세포(basophilic erythroblast)로 분화하는 단계; (c) 호염기성 적아세포에서 다염기성 적아세포(polychromatophilic erythroblast)로 분화하는단계; (d) 다염기성 적아세포에서 정염성 적아세포(orthochromatic erythroblast)로 분화하는 단계; (e) 정염성 적아세포에서 다염성 적혈구(polychromatic erythrocyte)로 분화하는 단계; 및 (f) 다염성 적혈구에서 적혈구(erythrocyte)로 분화하는 단계.

그러므로, 상기 적혈구 전구세포는 전적아세포, 호염기성 적아세포, 다염성 적아세포 또는 정염성 적아세포일 수 있다. 또한, 이들은 적혈구 전구세포로 분화 가능한 모든 세포원-배아줄기세포, iPS cell(유도만능줄기세포), 지방 유래 조혈모세포 등으로부터 유래된 것일 수 있다.

상기 적혈구 전구세포는 CD34+ 세포인 것을 특징으로 포함할 수 있다.

CD34+ 세포는 CD34를 발현하는 세포를 의미한다. CD34는 단백질을 인코딩하는 인간유전자의 이름이다. CD34분자는 세포 표면의 당단백질로 인체 내의 특정 세포에 존재하는 분화 분자로 하나의 군을 이루며 세포-세포 접착 인자(cell-cell adhesion factor)로서 기능한다. 또한, 골수의 세포외 기질 또는 기질 세포에 줄기세포의 접촉을 매개한다. CD34를 발현하는 세포는 정상적인 혈관의 조혈 세포, 혈관내피 전구세포(endothelial progenitor cell) 및 혈관내피 세포(endothelial cell)같은 탯줄(umbilical cord) 및 골수에서 발견되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

적혈구 전구세포는 다양한 소스, 예컨대 말초혈액, 제대혈 또는 골수로부터 얻을 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 CD34+세포는 제대혈로부터 유래된 세포이다. 적혈구 전구세포로서의 CD34+세포는 당업계에 공지된 다양한 세포 분리 방법, 예컨대 CD34+항체를 이용하는 면역자기-비드 분리방법에 따라 분리할 수 있다.

또한, 본 발명에서 사용되는 배지는, 인 비트로에서 적혈구 전구 세포로부터 적혈구를 얻기 위한 배지로서, 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분만을 포함하는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium: CCMM)일 수 있다.

즉, 세포가 살아가기 위해 필요한 필수적인 당, 아미노산, 물 등이 포함된 혼합물로서, 혈청, 영양 물질 및 각종 성장인자를 제외한 기본 배지이다.

특히, 에너지 공급원으로서 다당류(polysaccharides), 단당류(monosaccharides), 유기산(organic acid), 아미노산(amino acid), 알콜(alcohol), 다환식 함유물(polycyclic compounds), 셀룰로스(cellurose), 헤미셀룰로스(hemicellurose), 리그닌(lignin) 등의 여러가지 탄소원을 이용한다. 상기 다당류로는 덱스트린, 스타치 등을 예로 들 수 있고, 이당류로는 수크로오스, 말토오스, 트레할로오스, 만니톨 등을 예로 들 수 있고, 단당류로는 글루코스, 만노스, 프록토오스, 갈락토오스 등을 예로 들 수 있다.

본 발명의 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium: CCMM)는 인위적으로 합성하여 제조하여 사용하거나 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수 있다. 상업적으로 제조된 배지는 예를 들면,DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), EDM(Endothelial differentiation medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium) 및 Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 인 비트로에서 적혈구 전구 세포로부터 적혈구를 얻기 위한 배지의 주요한 특징은 항산화제를 포함하는 것이다.

상기 항산화제는 비제한적으로, 천연 항산화제인 토코페놀(Tocopherol), 쎄사몰(Sesamol), 진저론(Gingeron), 캡사이신(Capsaicin), 퀘르세틴(Quercetin), 갈릭산(Garlic acid); 합성항산제인 BHA, BHT, TBHQ; 효과상승제인 구연산, 아스코르빈산;항산화성 생체 기능 분자인 수용성 항산화제 비타민 C, 지용성 항산화제 비타민 E, 유비퀴논 (CoQ), 카로테노이드 등을 선택하여 사용할 수 있고, 가장 바람직하게는 비타민 C를 사용한다.

이러한 비타민 C의 첨가로 인해 세포 생존능이 월등히 높은 적혈구를 얻을 수 있다. 상기 비타민 C는 적혈구 전구세포가 체외에서 산화 스트레스로부터 안정 상태를 유지할 수 있도록 하기 때문이다.

또한, 본 발명의 다른 특징은 "무기질(stroma-free), 무혈청(serum-free) 및 무혈장(plasma-free) 배지"라는 점이다.

"무기질(stroma-free), 무혈청(serum-free) 및 무혈장(plasma-free)"이란 피더 기질세포(feeder stromal cells), 혈청(serum), 혈장(plasma) 모두의 부존재 또는 실질적으로 배양상에서 그 기능들을 발휘하지 않을 정도로 적은 양을 포함하는 것을 의미한다.

지금까지의 체외 적혈구 생성에 대한 이전 연구들은 일반적으로 혈청 또는 소태아혈청(FBS)을 포함하는 조건을 사용해왔다.

혈청(serum)은 광범위한 거대분자, 리포이드(lipoid) 물질 및 미량 원소를 위한 담체 단백질, 세포 부착 및 확산 인자(cell attachment and spreading factor), 저분자량 영양분, 및 호르몬 및 성장 인자를 포함하는, 혈액으로부터 유래된 분획을 의미한다. 작업적으로(operationally), 혈청은 적혈구, 혈소판 및 혈장의 응집 성분들의 제거 후 남는 혈액의 단백질성, 무세포(acellular) 분획으로 정의될 수 있다. 세포 배양을 위해 가장 널리 이용되는 동물 혈청은 우태혈청(fetal bovine serum), FBS이나, 성체 우혈청, 마혈청 및 이들의 단백질 분획(예를 들면, 분획 V 혈청 알부민)이 이용되기도 하였다. 그러나 그 가격이 고가이며, 혈청 내에 포함되어 있는 단백질 및 펩티드 때문에 세포배양 후 얻어지는 제품의 분리정제 공정이 매우 복잡해진다. 또한 혈청을 멸균하기 위하여 가열법을 사용하지 못하고 여과(filtration)해야 하기 때문에 마이코플라즈마(mycoplasma) 또는 바이러스 등에 의한 오염의 가능성을 증가시킨다. 또한 혈청을 함유한 배지는 거품이 잘 생긴다. 그러나 혈청 사용의 가장 큰 문제점은 배치(batch) 마다 혈청의 조성이 달라지기 때문에 혈청을 사용한 실험은 재현성을 얻기 어렵다는 점이다. 이러한 문제점을 극복하기 위해 무혈청(serum-free) 배지가 개발되어 왔다.

적혈구 세포의 무혈청 배양을 위해, 피더 기질세포(feeder stromal cells)가 미세환경(microenvironment)을 제공하는데 사용되었다(Ma, F.; Ebihara, Y.; Umeda, K.; Sakai, H.; Hanada, S.; Zhang, H.; Zaike, Y.; Tsuchida, E.; Nakahata, T.; Nakauchi, H.; Tsuji, K. Generation of functional erythrocytes from human embryonic stem cell-derived definitive hematopoiesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:13087-13092; 2008; Olivier, E. N.; Qiu, C.; Velho, M.; Hirsch, R. E.; Bouhassira, E. E. Large-scale production of embryonic red blood cells from human embryonic stem cells. Exp. Hematol. 34:1635-1642; 2006; Qiu, C.; Olivier, E. N.; Velho, M.; Bouhassira, E. E. Globin switches in yolk sac-like primitive and fetal-like definitive red blood cells produced from human embryonic stem cells. Blood 111:2400-2408; 2008).

또한, 혈장에 대해서도 이를 제외하면 세포들이 대부분 죽는 것으로 알려져 있고, 도 7에 나타낸 바와 같이 혈장을 첨가한 경우라도 종래의 방법에 의한 경우는 건강한 적혈구를 생산하지 못했다.

따라서, 혈청, 혈장과 기질 세포 모두를 제거하지 않고, 대량의 배지와 세포를 요구하는 수혈 과정을 위하여 충분한 적혈구의 양을 생산하는 것은 불가능한 것으로 알려져 있다(Timmins, N. E.; Nielsen, L. K. Blood cell manufacture: current methods and future challenges. Trends Biotechnol. 27:415-422; 2009).

그러나 본 발명은 비타민 C 등의 항산화제를 필수적으로 포함하면서 혈청, 혈장 및 피더 세포가 모두 없는 배지를 이용하는 경우가 건강한 적혈구 생성에 더욱 효과적임을 확인하여, 향상된 완전성(integrity)과 생존력을 가진 적혈구의 체외 생산을 제공한다.

따라서, 일 구체예로서 본 발명은

에너지 공급원 및 비타민 C를 포함하고, 무기질(stroma-free), 무혈청(serum-free) 및 무혈장(plasma-free)을 특징으로 하는 적혈구 인 비트로 대량 생산용 배지에 관한 것이다.

다른 구체예로서 본 발명은 에너지 공급원 및 비타민 C를 포함하는, 무기질(stroma-free), 무혈청(serum-free) 및 무혈장(plasma-free) 배지에서 적혈구 전구세포를 배양하는 단계를 포함하는, 적혈구의 인 비트로 대량 생산방법에 관한 것이다.

배지는 필요에 따라 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin) 또는 겐타마이신(gentamicin) 등의 항생제를 추가로 포함할 수 있고, 적혈구 전구세포의 증식 및 분화를 촉진시키기 위하여 줄기세포인자, 인터루킨-1, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-5, 인터루킨-11, 과립구 대식세포 집락자극인자, 대식세포 집락자극인자, 과립구 집락자극인자 또는 에리쓰로포이에틴 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수도 있다.

또한, 본 발명은 다른 관점에서 특정 기간동안 온도 조건을 달리하는 것을 주요한 특징으로 하는 적혈구의 인 비트로 대량 생산방법에 관한 것이다.

특히, 이러한 배양 온도 조건도 세포의 생존능(viability)을 현저히 향상시킬 수 있는 요소가 된다.

적혈구계 세포는 마지막 분화 단계에서 핵을 내보내고 그 과정에서 내부 구조를 크게 바꾸며 내부 소기관이 소실되는 과정을 거쳐 적혈구가 된다. 그러나 인 비트로 조건에서는, 이러한 마지막 분화 시기에 적혈구계 세포의 생존도(viability)가 크게 떨어진다. 대부분의 종래 연구에 따라 제조된 적혈구계 세포는 단지 며칠간만 생존하는 손상된 세포이고, 생존도가 현저히 떨어져 사실상 수혈에 이용할 수 없다. 따라서 종래의 적혈구생성(erythropoiesis)관련 연구에서는 제대로 된 실험을 할 수 없었다.

그러나 본 발명에서는 이러한 마지막 분화 단계, 예를 들어 배양개시 후 17일 이후부터 배양 온도 조건을 25~27 ℃의 저온(hypothermia)에서, 바람직하게는 27 ℃에서 배양함으로써, 적혈구 세포의 생존능(viability)을 향상시키고 세포 운동성(cell motility) 및 성숙 능력도 유지시킨다. 또한, 이에 따라 탈핵율도 현저히 증가한다.

이는 세포사멸에 관여하는 여러가지 효소들의 활성이 27 ℃에서 억제되기 때문이다.

그러므로, 본 발명은 일 구체예로서,

적혈구 전구세포의 초기 분화기에서는, 에너지 공급원을 포함하는 무기질(stroma-free), 무혈청(serum-free) 및 무혈장(plasma-free) 배지에서 적혈구 전구세포를 배양하는 단계; 및

적혈구 전구세포의 후기 분화기에서는, 에너지 공급원을 포함하는 무기질(stroma-free), 무혈청(serum-free) 및 무혈장(plasma-free) 배지에서 25~27℃의 저온 조건으로 배양하는 단계를 포함하는, 적혈구의 인 비트로 대량 생산방법을 제공한다.

이와 관련된 설명은 앞서 기술한 바와 같다.

본 발명의 적혈구 전구세포 배양의 총 기간은 제한은 없지만, 예를 들어 바람직하게는 약 25일 정도일 수 있고, 이 때 상기 적혈구 전구세포의 초기 분화기는 배양 개시 후 약 17일의 기간 일 수 있으며, 상기 적혈구 전구세포의 후기 분화기는 배양 개시 후 17일 내지 25일 정도의 기간일 수 있다. 당업자의 필요에 따라 적당한 범위에서의 가감이 가능함은 자명한 사항일 것이다.

본 발명은 적혈구 전구체의 배양 환경을 무혈청, 무혈장, 무기질의 조건 및/또는 분화시기에 따른 온도 변화 조건으로 제공함으로써, 적혈구 전구체의 세포 생존도를 높이며, 고효율로 탈핵된 적혈구를 얻을 수 있게 한다. 추가로 비타민 C 등의 항산화제의 첨가로 인해 더욱 많은 적혈구를 얻을 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 방법 및 이에 사용되는 배지는 생물반응장치 시스템(bioreactor systems)을 통해 인간 적혈구의 "대량 생산"에 적용시킬 수 있을 것이고, 임상학적으로 유용한 수준을 달성할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 방법에 의해 수득한 인공 적혈구의 장기간 저장방법에 관한 것이다.

지금까지 인공 적혈구를 한 달 가까이 장기간 보관에 성공한 예는 보고되지 않았다.

그러나, 본 발명에서는 상기 방법으로 수득한 인공 적혈구에 혈장을 첨가하여 4 ℃ 냉장보관함으로써 4주, 즉 약 한 달 정도의 장기 보관에 성공하였다. 이 때, 사용되는 혈장의 유래는 제한은 없지만, 예를 들어 제대혈 유래의 것을 사용할 수 있다.

한편, 본 발명의 방법에 의해 수득된 적혈구는 다양한 치료학적 적용을 가질 수 있다.

더구나, 본 발명에 의해서 유도된 증량된 수의 적혈구는 조혈 장애의 치료에 있어서의 신규한 치료학적 전략에서, 또는 혈액 은행에서 이용될 수 있다.

특정의 구체예에서, 적용하는 적혈구는 수혈에 사용될 수 있다. 수혈을 위한 다량의 세포를 생성시키는 능력은 전국적으로 혈액 은행 및 병원에서 겪고 있는 혈액의 만성적 부족을 완화시킬 수 있다.

본 발명의 특정한 관점은 인간 적혈구 세포를 상업적 양에 도달하도록 증량시키고 이러한 인공 인간 적혈구 세포를 장기간 저장하는데 관한 것이다.

본 발명에 기술된 방법에 의해서 증량된 적혈구 세포를 생산, 저장, 및 배포하는 방법에 관한 것이다. 시험관 내에서 인간 적혈구 세포를 생성 및 증량시킨 후에, 인간 적혈구 세포를 수확하고, 정제하고, 환자의 치료 전에 임의로 저장할 수 있다. 따라서, 특별한 구체예에서 본 발명은 적혈구 세포를 병원, 건강관리 센터, 및 임상의에게 공급하는 방법을 제공하며, 이에 의해서 본 발명에 기술된 방법에 의해서, 생산된 인공 적혈구 세포는 저장되고, 병원, 건강관리 센터, 또는 임상의에 의한 요구에 따라 주문하여 적혈구 세포 치료법이 필요한 환자에 투여된다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 본 발명에 따른 적혈구 세포의 생산 및 다양한 특성 확인 테스트

1. 세포 배양 및 산출(enumeration)

면역자성 마이크로비드 분리법(immunomagnetic microbead selection method) 및 EasySep CD34 분리 키트(StemCell Technologies, 밴쿠버, 캐나다)를 사용하여 건강한 기증자의 제대혈로부터 CD34+를 분리하였다.

분리한 CD34+ 세포를 무기질(stroma-free) 조건에서 21일 내지 26일 동안 1×10⁵ cells/ml의 밀도에서 배양하였다. IMDM(Iscove's modified Dulbecco's medium, Gibco, Grand Island, NY) 또는 스템라인 II 조혈모세포 증식배지(Stemline II hematopoietic stem cell expansion medium, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)를 150 μg/ml의 홀로트랜스페린(Sigma-Aldrich), 160 μM의 모노티오글리세롤(Sigma-Aldrich), 2 μg/ml의 콜레스테롤(Sigma-Aldrich), 지질 혼합물(Sigma-Aldrich), 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액(Gibco)과 함께 첨가하였다. 일부 실험에서는 30.8 μM의 L-아스코르브산(Sigma-Aldrich)을 첨가하였다. IMDM을 사용한 실험에서는 인간 알부민(Green Cross, Korea) 1%를 첨가하였다.

몇가지 싸이토카인을 첨가하여 CD34+ 세포를 분화시켰다.

제0일부터 제7일까지는, 1×10 μM의 하이드로코르티손(Sigma), 100 ng/ml의 줄기세포인자(stem cell factor, SCF; R&D systems, Minneapolis, MN, USA), 10 ng/ml의 인터루킨(IL)-3(R&D systems, Minneapolis, MN, USA) 및 6 IU/ml의 에리쓰로포이에틴(erythropoietin, EPO; Calbiochem, La Jolla, CA, USA)로 보충된 배지 내의 6-웰 또는 12-웰 플레이트(BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) 내에서 상기 세포를 배양하였다. 제7일부터 제13일까지는, 50 ng/ml의 SCF, 10 ng/ml의 IL-3 및 3 IU/ml의 EPO 존재 하에서 증식된 적아세포(erythroblast)를 배양하였다. 제13일부터 제17일까지는, 50 ng/ml의 SCF 및 2 IU/ml의 EPO를 첨가하였다.

제13일부터 상기 배양 배지를 4개의 서로 다른 조건, 즉 ± 10% FBS(TerraCell International, Ontario, Canada) 또는 ± 10% 혈청대체시약(Serum replacement reagent, SR; Gibco)으로 나누었다. 상기 배양 배지를 매 2~3일마다 교체하였고 37 ℃의 CO₂ 인큐베이터(Sanyo, Japan) 내에서 배양하였다.

모든 세포계수에서 트리판 블루 염색법을 사용하였고, 오직 살아있는 세포만이 배수증식(fold expansion) 결과에 포함되었다.

2. 세포내 활성 산소종 (reactive oxygen species, ROS )의 측정

산화에 민감한 형광 염료인 2,7-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트(DCF-DA, Molecular Probes, Eugene, OR)를 사용하여 세포내 ROS의 생성을 측정하였다. 각 단계로부터 총 1 × 105 개의 세포를 미리 세척하고 열을 가한 인산염완충식염수(PBS)에 다시 현탁시켰다. 세포에 200M DCF-DA를 첨가하고, 5% 이산화탄소 인큐베이터 안에서 15분 동안 37 ℃로 어둠 속에서 배양하였다. 흐름세포측정법(flow cytometry)을 이용하여 DCF-DA의 산화적 전환에 의한 형광 강도를 즉시 측정하였다.

3. 적혈구 세포의 영상화

세포원심분리기(Cellspin, Hanil Science Industrial, Seoul, Korea)를 이용한 사이토스핀법에 이어서 Wright-Giemsa 염색법(Sigma-Aldrich)에 의해 세포형태를 분석하였다. 염색된 세포의 사진을 디지털카메라(Eclipse TE2000-U, Nikon, Japan)로 찍었고, Nikon ACT-1 프로그램을 사용했다.

4. 적혈구 세포 검출의 유세포측정 분석

적혈구 세포의 성장 동안 표현형 변화를 측정하기 위하여 13일, 17일, 21일에 다음과 같은 항 인간 항체를 세포에 붙였다: (i) 글리코포린 A (GPA)-FITC (BD PharMingen, Franklin Lakes, NJ) (ii) CD71-FITC (eBioscience, San Diego, CA). 면역글로불린 G1(IgG1)-FITC 및 IgG1-PE(BeckmanCoulter,Miami,FL)를 동형 대조 염색을 위해 사용하였다. 면역표현형을 위하여, 세포를 인산염완충식염수(PBS)에서 세척하고, 각각의 단일클론항체와 함께 15분 동안 4 ℃에서 배양하였다. 세척 후, 세포를 인산염완충식염수(PBS)에 현탁시키고 유세포측정기를 사용하여 분석하였다.

헤모글로빈(Hb)의 세포내 발현을 FITC접합 항태아성헤모글로빈(HbF)과 PerCP접합 항성인형헤모글로빈(Hbβ, BD PharMingen)을 이용하여 분석했다. 간략히, 세포를 상온에서 10분 동안 차가운 0.05%의 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 안에서 다시 현탁시키고, 0.1%의 소혈청알부민(bovine serum albumin)을 포함하는 인산염완충식염수(PBS)에서 세척하고, 상온의 0.1% 트리톤 X-100에서 5분 동안 현탁시켰다. 세척 후, 상온에서 15분 동안 상기 세포에 항체를 첨가하고 세척하였다. 유세포측정기 BD FACSCalibur™ (BD Biosciences, San Jose, CA) 및 제공되는 소프트웨어를 이용하여 염색된 세포를 분석하였다.

5. RT- PCR

전체 RNA를 Trizol (Invitrogen)을 사용하여 분리해내고, SuperScript III 역 전사 효소(Invitrogen)를 사용하여 상기 전체 RNA를 역전사하였다. triplicates에서(LightCycler 480 II; Roche Diagnostics) SYBR Premix ExTaq (Takara-Bio, Shiga, Japan)를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 상대적 정량분석은 내생적 β-actin으로의 정상화(normalization)에 의해 달성하였다.

사용된 프라이머 세트의 서열은 다음과 같다(forward/reverse):

β-globin: 5’-GAAGGCTCATGGCAAGAAAG-3’(서열번호 1)

5’-CACTGGTGGGGTGAATTCTT-3’(서열번호 2);

γ-globin: 5’-GCTGACTTCCTTGGGAGATG-3’(서열번호 3)

5’-GAATTCTTTGCCGAAATGGA-3’(서열번호 4);

GATA1: 5’-CCAAGCTTCGTGGAACTCTC-3’(서열번호 5)

5’-CCTGCCCGTTTACTGACAAT-3’(서열번호 6).

6. 제조된 적혈구의 ABO형 및 Rh형 결정을 위한 슬라이드 검사

시험관에서 배양된 적혈구(cRBCs)(인공 적혈구)의 ABO형 군과 Rh발현을 검사하고 기증자의 원래 적혈구와 비교하였다. 한 방울의 세포를 유리 슬라이드 위에 놓고 항A, 항B, 항C, 항D 시약을 각각 한 방울 씩 떨어뜨렸다. 슬라이드를 천천히 기울이고 응집을 관찰하였다.

7. 혈액학적 파라미터의 평가

배양된 세포를 21일에 수집하고, 헤모글로빈 수준(level)과 평균적 혈구혈색소(MCH)를 포함하는 혈액세포 파라미터를 기증된 말초 적혈구와 비교하기 위하여 Sysmex XE-2100 hematology analyzer (Sysmex, Kobe, Japan) 사용하여 측정하였다.

8. 배양된 적혈구( cRBCs )의 산소 운반 능력의 측정

배양된 적혈구(cRBCs)의 산소 운반 능력을 입증하기 위하여, 산소(이산화황(SO2))의 포화도를 계산하였다. 오래된 분광법인 산소 포화도 계산을 앞서 설명한 방법(Refsum, H. E.; Sveinsson, S. L. Spectrophotometric determination of hemoglobin oxygen saturation in hemolyzed whole blood. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 8:67-70; 1956)에 기초하여 수정하였다. 요약하면, HbO2의 흡광도가 최대 및 최소인 560nm 및 576nm에서 분광광도계를 사용하여 흡광도를 측정했다. 이러한 측정값, 상수 및 H. E. Refsum 과 S. L. Sveinsson의 방정식을 사용하여 말초혈액, CB, 배양된 적혈구(cRBCs)에 대한 SO2 값을 계산했다(Refsum, H. E.; Sveinsson, S. L. Spectrophotometric determination of hemoglobin oxygen saturation in hemolyzed whole blood. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 8:67-70; 1956). 12시간 동안 1.5% 의 저산소 인큐베이터 (Sanyo)에서 배양함으로써 낮은 산소 분압을 달성했다. 태아와 성인형 헤모글로빈 간에 가장 큰 SO2 차이를 보이는 말초혈액 압력인 50 mmHg 근처의 한 임계점에서 산소 분압을 측정했다. 그러나 자동분석기가 아닌 저산소 인큐베이터를 사용하는 기술적인 제한으로 0-120의 전체 범위에서 도식화 하지는 못했다.

9. 적혈구 변형능 ( deformability ) 측정

인체 내 다양한 혈류의 압력을 견디고, 모세혈관 등에서 세포막의 변형능이 있는지 보기 위해 예민하게 측정할 수 있는 기기 Rheoscan (Rheomeditech, Seoul, Korea)를 사용하여 실험하였다(Biorheology 2009;46:251-264).

10. 세포 생존능의 측정

트리판 블루 염색법과 아넥신 V 분석을 사용한 흐름세포측정기로 세포 생존력을 측정하였다. 아넥신 V-PE와 프로피디움 아이오다이드(PI, Invitrogen, Camarillo, CA) 로 상온에서 15분 동안 세포를 염색하였다. 상기 세포를 세척 완충제로 두 번 세척하고 유세포측정기로 분석하였다.

11. 화학적 분석

18일에서 21일 동안 적혈구 세포를 배양하기 위해 사용한 배지의 pH와 칼슘이온 (Ca2+) 그리고 포타슘이온 (K+) 농도를 RapidSystems사의 혈액 가스 분석기 (Siemens, USA)를 사용하여 분석하였다.

12. 통계적 분석

프리즘 소프트웨어 (Prism, Version 5.0, GraphPad, San Diego, CA)를 사용한 통계 분석을 수행했다. 결과는 평균 ± 평균의 표준오차(sem)로서 나타냈다. 통계적 유의성을 0.05 이하의 p값에서 설정했다. 한쌍을 이루는 티-테스트(t-tests)를 사용하여 ±FBS 조건과 두 온도 효과 하에서 최종 세포 수를 비교하였다. ±SR 및 ±FBS 조건 하의 최종 세포 산물을 단방향 ANOVA로 비교하였다.

실시예 2: 본 발명에 따른 적혈구 세포 특성 확인 테스트 결과

(1) 적혈구 세포 획득에 대한 혈청 및 기질이 없는 배양 조건의 효과

이전의 결과 보고에서는, 체외의 적혈구 생성은 혈장 또는 혈청을 포함하는 조건 하에서 수행되었다.

그러나 본 연구에서는, 혈장 또는 혈청이 없는 배양법이 확립되었다. 상기 조건 하에서는 세포 사멸이 증가되리라 예상되었기 때문에, 일반적으로 FBS 대신 다양한 줄기 세포의 성장을 뒷받침하고 영양을 공급을 하기 위해 첨가하는 혈청 대체(SR) 시약의 영향을 측정했다. 혈청 및 기질이 없는 배양 조건의 영향을 평가하기 위하여, CD34+ HSC를 21일 동안 배양된 CB(각각의 순도 > 96%)로부터 분리하였다. CD34+ 세포를 EPO, IL-3, 및 SCF를 포함한 적혈구분화 배지에서 배양하였다. 배양한지 13일째에 세포를 혈청을 포함하거나 포함하지 않는 다른 조건의 배지로 분리하였다. 배양 0일 째 EPO, IL-3, 및 SCF를 첨가한 결과 13일이 지나 초기 세포 수에 비해 평균 30,000배 증폭의 세포 증식 결과를 보였다.

최종 세포 수는 본 발명의 임상 적용을 위한 가장 중요한 요소 중 하나이므로, 21일째의 세포 수를 비교해 보았다. 13일부터 21일까지 적혈구 세포의 최종 증식 배수는 무혈청 조건(+FBS, 6.4배; -FBS, 13.4배) (paired t-test, p<0.05, n=10) (도 1A)에서보다 2.1배 더 컸다. 그 다음 상기 두 그룹을 SR 조성이 있거나 없는 배지로 나누어 4 그룹으로 세분하였다. 21째 날의 관찰 결과, +SR-FBS 조건(16.3배)은 -SR-FBS 조건(11.0배) 보다 5.3배 더 높은 증식을 보였다. 하위 그룹은 큰 차이를 보이지 않았는데, 이는 무혈청 조건(일방향 ANOVA, p>0.05) (도 1B) 에서 SR이 없어도 영향이 거의 없음을 입증하는 것이다.

그러므로 본 발명자들은 혈청과 SR이 없는 조건에서 하나의 CD34+ 세포로부터 5×10⁵ 배 이상 얻을 수 있었다. 이는 이론적으로, 하나의 CB에서 전체 CD34+ 세포(2×10⁶ 세포)로 실험한다면, 1×10¹² 개의 적혈구를 얻는 것이 가능함을 확인하였다.

즉, 생존 세포만 계수한 결과에 따르면, 무혈청배지에서의 마지막 적혈구 생산물이 2.1배의 유의한 차이(p<0.05, n=10)로 더 많이 얻었고(도 1A, B), 각 조건을 SR 유무에 따라 더 세분화해 비교하면, 세포가 많이 손상받는 19일 이후에 SR의 첨가하면 세포 수득에 더 도움을 주는 것으로 나타났으며, 여전히 무혈청조건이 혈청이 있는 조건보다 더 좋은 것으로 나타났다.

(2) 비타민 C의 효과

본 발명자들은 비타민 C가 적아세포(erythroblast)가 산화 스트레스로부터 체외에서 안정 상태를 유지하는지 여부를 확인코자 하였다.

세포 자멸사는 배양 21일째에서 대조군 조건에 비해 비타민 C가 존재하는 조건에서 10.8%까지 감소했다(도 1C). 비타민 C를 첨가하지 아니한 경우에, 배양 21일에는 살아있는 세포가 거의 없을 정도로 적혈구 수득률이(recovery of final product) 좋지 않았다. 반면에, 비타민 C를 첨가한 경우, 잘 깨지지 않는 적혈구를 얻을 수 있었다. ROS의 평균 수준도 12% 감소하였다(도 1D).이는 비타민 C가 무혈청, 무기질 조건에서 세포들을 산화 스트레스로부터 더욱 안정화시킴을 의미한다.

따라서, 이후 무혈청 실험에서는 모두 비타민 C를 같은 농도로 첨가하여 실험하였다.

(3) 인간 적혈구 세포의 분화

세포 성장과 분화를 Wright-Giemsa 염색법으로 검출했다.

각 배양 단계에서, 적아세포 및 적혈구의 모양은 혈청이나 SR의 유무에 관계없이 비슷하였으며, 적합한 적혈구가 생성되었다. 배양 14일째에는 세포의 크기가 크고 핵도 크며 세포들이 푸른빛을 띠는 호염기성 적아세포(basophilic erythroblast)가 많이 관찰되었다.

이전 연구에서 혈청 및 기질이 없는 조건 하에서 적혈구 생산을 위한 가장 결정적인 제한은 낮은 핵 제거율(Freyssinier, J. M.; Lecoq-Lafon, C.; Amsellem, S.; Picard, F.; Ducrocq, R.; Mayeux, P.; Lacombe, C.; Fichelson, S. Purification, amplification and characterization of a population of human erythroid progenitors. Br. J. Haematol. 106:912-922; 1999; Malik, P.; Fisher, T. C.; Barsky, L. L.; Zeng, L.; Izadi, P.; Hiti, A. L.; Weinberg, K. I.; Coates, T. D.; Meiselman, H. J.; Kohn, D. B. An in vitro model of human red blood cell production from hematopoietic progenitor cells. Blood 91:2664-2671; 1998; Neildez-Nguyen, T. M.; Wajcman, H.; Marden, M. C.; Bensidhoum, M.; Moncollin, V.; Giarratana, M. C.; Kobari, L.; Thierry, D.; Douay, L. Human erythroid cells produced ex vivo at large scale differentiate into red blood cells in vivo. Nat. Biotechnol. 20:467-472; 2002) 이었다.

정색성 적아세포(orthochromic erythroblasts)로의 세포 분화 결과로 평균 세포 크기는 15일 이후 시간이 지나면서 감소하였다. 배양 18일에는 대부분의 세포가 탈핵 전단계의 적아세포인 정염성 적아세포(orthochromic erythroblast)가 대부분이었다. 19일부터 탈핵 적혈구 세포가 혈청을 포함하는 배지에서보다 혈청이 없는 배지에서 더 많이 나타났다. 배양 21일에는 적혈구가 생성되기 시작하였으며, 다른 개체에서 나온 세포들 간에 그 성숙시기와 탈핵 정도의 차이가 컸다(도 2A). 따라서, 일부 세포는 탈핵시키기 위해 배양 25일까지 두어도 계속 탈핵되었다. 배양 22일에는 SR과 FBS 없이 배양한 세포들을 2장의 백혈구제거 필터로 여과하여 순도 높은 적혈구를 얻었다(도 2A에서 화살표로 지시된 것은 탈핵된 적혈구이다).

21일째 탈핵율을 비교했을 때, 혈청과 함께 배양된 세포 보다 혈청 없이 배양된 세포에서 3.74배만큼 더 높은 탈핵율을 측정하였다. 혈청을 포함하는 몇몇 경우의 조건에서 대부분의 세포가 죽었기 때문에 탈핵율을 측정할 수 없었다. 비록 탈핵율이 37℃ 조건에서 상대적으로 낮기는 했지만, 본 발명에서는 명확하게 혈청이 없는 조건(p<0.005)에서 탈핵율의 증가를 확인하였다.

혈청과 기질이 없는 조건에서 최종 적혈구 생성이 올바르게 진행되는지를 조사하기 위하여, 세포 표면 마커인 트랜스페린(transferrin) 수용체(CD71)/글리코포린(glycophorin) A (GPA) (둘 다 성숙한 적혈구 세포에 대한 마커임) 그리고 성체/태아 헤모글로빈(Hbβ 및 Hbγ) 발현 프로파일을 기본으로 FACS 분석법을 사용하여 최종 적혈구 생성도 측정하였다. 혈청 및 기질이 없는 조건에서 95% 이상의 세포가 CD71/GPA 와 Hbβ/ Hbγ를 발현하였다(도 2B).

적혈구 세포의 성숙 역시 적혈구 분화 단계를 통해 적혈구-특이적 유전자 β- 및 γ-글로빈, GATA1 전사 인자 발현의 상향조절에 의해 이루어졌다(도 2C). 그리고, 적혈구 세포의 성숙는 band3의 웨스턴 블럿 분석에 의해 확인되었다. 적아세포 단계로부터 망상 적혈구(reticulocyte) 단계까지 band3의 세포 표면 발현 증가가 나타났다(도 2D). 이러한 데이터는 도 2A에서 보이는 바와 같이 형태적인 변화에 따라 측정한 성숙 단계와 상관관계가 있다.

또한, 후기 단계(20~22일)에서 무혈청 배지에서 배양된 90% 이상의 세포들이여전히 생존하고 있는 데 반해, 혈청 존재 하에서 배양된 세포는 60~80% 만이 생존하고 있었다.(도 2E)

(4) 혈액학적 파라미터 및 배양된 적혈구의 기능분석

21일째 배양 최종산물을 백혈구 제거 필터(leukocyte removal filter)로 통과시켜 적혈구 및 유핵 적혈구 세포를 제거함으로써 정제하였다(도 3A) 배양된 적혈구의 혈액형은 기증된 적혈구의 혈액형에 상응하였다(도 3B). 배양된 적혈구의 혈액학적 파라미터는 기증된 본래의 적혈구의 경우와 유사하였다(Hb 12.29±2.91 g/dL; mean cell volume, 99.72±0.58 fL; and mean cell hemoglobin, 27.31±6.47 pg, n=3).

또한, 본 발명자들은 저산소 인큐베이터와 가스 분석기(RAPID Lab 1265)를 사용하여 산소 운반 능력에 따른 헤모글로빈의 기능을 측정하였다. 계산된 산소포화도(SO₂)값은 CB RBC (63.6%) > cRBCs (59.4±2.1%) > PB RBC (54.6±5.6%) 순이었다. 본 발명자들은 결과가 정상적인 혈액 대조군과 유사했기 때문에 cRBC가 정상적인 기능을 보일 것이라는 것을 기대할 수 있었다. 글루타치온을 감소시키고 ATP 수준을 유지하는 G6PD(glucose-6-phosphate dehydrogenase) 활성은 515.25 mU/ml이고, cRBC의 알맞은 변형능은 말초혈관 적혈구(peripheral blood natural RBCs, PB RBCs)와 비교되어 나타났다(도 3 C 및 D).

(5) 적혈구 세포의 최종 성숙에서의 저온 조건(hypothermia)의 영향

17일부터 세포 생존능(cell viability)이 감소되어, 불균형적인 세포사멸 공정을 억제하기 위해 적혈구 세포의 성숙에서 저온(hypothermia)의 영향을 조사하였다.

27 ℃에서 배양된 RBCs의 생존율은 19~21일에 약 17.4%까지 증가하였고(도 5A), 더욱이 형태도 잘 보존되었을 뿐만 아니라, 세포 운동성(cell motility) 및 성숙 능력도 유지되어 탈핵율도 현저히 증가하였다(도 5B).

게다가 이러한 세포 생존능은 저온 조건에서 현저히 향상됨을 확인하였다.

이는 세포사멸에 관여하는 여러가지 효소들의 활성이 27 ℃에서 억제되기 때문으로 생각된다. 세포사멸 과정 중의 mitochondrial dehydrogenase 활성을 보면, 27 ℃에서 배양된 세포들의 효과 활성이 37℃의 경우와 비교하여 35%까지 감소되었다(데이터 도시 않음).

또한, 전자 현미경을 통해, 27 ℃의 낮은 온도에서의 보다 나은 형태 및 무손상(intactness)이 관찰되었고(도 5 C 및 D), osmolarity fragility(삼투 취약성) 분석을 통해서도 이를 확인하였다(도 6).

따라서, 배양이 37 ℃에서 마지막까지 유지되는 경우는 세포막이 약해짐을 알 수 있었다. 그러므로 적혈구 분화 후기단계에서는 27 ℃의 낮은 온도에서 배양하는 것이 세포 생존능이 우수한 적혈구 세포 수득에 유리하다.

실시예 3 : 수득한 인공 적혈구의 보관 및 저장

또한, 본 발명자들은 상기 수득한 적혈구 세포를 효과적으로 보관 및 저장할 수 있는 방법을 찾고자 하였다.

이를 위해, 냉장고에, 즉, 4 ℃에서 cRBC를 효과적으로 저장할 수 있는지 여부를 실험하였다. 자연적 적혈구(natural RBC) 및 수득한 인공 적혈구(in vitro genertated RBC, cRBC)에 대하여, 혈청 또는 혈장 첨가 여부에 따른 세포 생존 결과를 비교하였다. 상기 혈장은 제대혈 유래의 것을 사용하였다.

그 결과를 도 4에 도시하였다.

인공 적혈구나 자연적 적혈구 모두 혈청 첨가의 경우에는 2주까지도 건강하게 생존하지 못했지만, 제대혈-유래 혈장을 넣었을 때는 28일, 즉 약 한 달 정도까지 생존함을 확인하였다. 적혈구의 도넛 모양은 저장 마지막 날까지 유지됐다(도 4B). 이는 인공 적혈구를 한 달간 보관에 성공한 최초의 경우이다.

지금까지 인공 적혈구는 생존 기간이 짧아 상용성에 문제가 있었는 바, 본 발명의 방법에 의하면 인공 적혈구일지라도 한 달 동안 냉장보관하여 사용할 수 있음을 시사한다.

<110> HANYANG UNIVERSITY INDUSTRY COOPERATION FOUNDATION <120> A Method for in vitro large-scale Production of Red Blood Cells AND Storage thereof <130> JKP-0701 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for beta-globin <400> 1 gaaggctcat ggcaagaaag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for beta-globin <400> 2 cactggtggg gtgaattctt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for gamma-globin <400> 3 gctgacttcc ttgggagatg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for gamma-globin <400> 4 gaattctttg ccgaaatgga 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for GATA1 <400> 5 ccaagcttcg tggaactctc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for GATA1 <400> 6 cctgcccgtt tactgacaat 20

Claims (9)

1. 에너지 공급원 및 항산화제를 포함하는 무기질(stroma-free), 무혈청(serum-free) 및 무혈장(plasma-free) 배지에서 적혈구 전구세포를 적혈구로 분화시켜 배양하는 단계;를 포함하고,
   상기 배양 단계에서 적혈구 전구세포가 다염기성 적아세포, 정염성 적아세포, 다염성 적혈구 및 적혈구로 순차적으로 분화하는 기간 동안에는 25 ~ 27 ℃에서 저온 배양하는 적혈구의 인 비트로 대량 생산방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), EDM(Endothelial differentiation medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium) 및 Iscove's Modified Dulbecco's Medium으로 구성된 군에서 선택되는 세포배양 최소배지(Cell culture minimun medium, CCMM)인 것을 특징으로 하는 적혈구의 인 비트로 대량 생산방법.
3. 제1항에 있어서,
   상기 항산화제는 비타민 C인 것을 특징으로 하는 적혈구의 인 비트로 대량 생산방법.
4. 제1항에 있어서,
   상기 에너지 공급원은 다당류(polysaccharides), 단당류(monosaccharides), 유기산(organic acid), 아미노산(amino acid), 알콜(alcohol), 다환식 함유물(polycyclic compounds), 셀룰로스(cellurose), 헤미셀룰로스(hemicellurose) 및 리그닌(lignin)으로 구성된 군에서 선택되는 1이상의 탄소원인 것을 특징으로 하는 적혈구의 인 비트로 대량 생산방법.
5. 제1항에 있어서,
   상기 배지가 줄기세포인자, 인터루킨-1, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-5, 인터루킨-11, 과립구 대식세포 집락자극인자, 대식세포 집락자극인자, 과립구 집락자극인자 및 에리쓰로포이에틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 적혈구의 인 비트로 대량 생산방법.
6. 제1항에 있어서,
   상기 적혈구 전구세포를 적혈구로 분화시켜 배양하는 단계는 25일 기간 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 적혈구의 인 비트로 대량 생산방법.
7. 제1항에 있어서,
   상기 저온 배양은 배양개시 후 17일 이후에 이루어지는 것을 특징으로 하는 적혈구의 인 비트로 대량 생산방법.
8. 제1항의 방법에 의해 수득한 인공 적혈구에 혈장을 첨가하여 보관하는 것을 특징으로 하는 인공 적혈구 저장방법.
9. 제8항에 있어서,
   상기 혈장은 제대혈 유래인 것을 특징으로 하는 인공 적혈구 저장방법.

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