KR20100081678A - 임상―등급 적혈구의 인 비트로 대량 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 폴록사머(poloxamer)를 포함하는 배지에서 적혈구 전구세포(erythroid progenitor cell)를 배양하는 단계를 포함하는 적혈구(red blood cell)의 인 비트로 생산 방법; 폴록사머를 포함하는 적혈구의 인 비트로 생산용 배지; 및 제대혈 혈장을 포함하는 적혈구의 인 비트로 생산용 배지에 관한 것이다. 본 발명은 폴록사머를 이용하여 적혈구 전구세포의 생존율을 크게 향상시켜 결국 적혈구 생산성을 향상시켜 적혈구 전구세포로부터 적혈구의 인 비트로 생산성을 크게 향상시킨다. 본 발명에 따르면 임상-등급의 적혈구를 인 비트로 배양 방법으로 얻을 수 있으며, 적혈구의 배양에 통상적으로 이용되는 동물혈청 또는 인간 혈청의 대체제로서 제대혈 혈장을 제공한다.

RBCs, 적혈구 형성 과정, F68, 인 비트로 대량 생산, 제대혈 혈장, 액상배양

Description

임상―등급 적혈구의 인 비트로 대량 생산 방법{Process of In Vitro Mass Production of Clinical―Grade Red Blood Cells}

본 발명은 임상 등급 적혈구의 인 비트로 대량 생산 방법에 관한 것이다.

기증된 적혈구(RBCs)의 부족 문제가 심화됨에 따라 조혈모세포로부터 RBC의 인 비트로 생산(generation)이 매우 중요하게 되었다. 하지만 후기 단계의 적아 세포의 높은 증가 배수(fold expansion)에도 불구하고 최종 성숙 기간 동안 적혈구의 낮은 생존율로 인해 CD34⁺ 세포로부터 배양된 성숙한 RBC들의 전체적인 회수율(recovery)은 그다지 높지 않다(Choong et al, 2007, Giarratana et al, 2005, Lu et al, 2008a, Miharada et al, 2006, Neildez-Nguyen et al, 2002, Ronzoni et al, 2008). 일반적으로, 후기 단계의 적혈구는 증식하지 않아 성숙한 세포의 수는 점차적으로 감소하기 때문에 세포의 증가 배수는 17일 부터 빠르게 감소한다. 최근의 여러 보고들은 조혈줄기세포(Fujimi A, 2008, Giarratana et al, 2005, Ma et al, 2008) 및 인간 배아줄기세포(Lu et al, 2008a, Ma et al, 2008)로부터 인 비트로 RBC 생산을 기술하였다. 이들 연구는 기질세포와 함께 공동배양(co-culture) 방법(Fujimi A, 2008, Giarratana et al, 2005, Lu et al, 2008a)을 이용하여 RBC를 획득하였는데, 이러한 방법들은 본질적으로 임상에 적용하기에는 제한들을 가지고 있으며 그 이유는 2×10¹² 이상의 RBC에 해당하는 기증 RBCs의 1 단위와 동일한 수준의 임상 등급의 RBC들을 수득하기 위해 매우 많은 기질 세포(stromal cells)가 필요하기 때문이다. 또한, 이전의 연구들에서 이용된 기질 세포는 배지 내 또는 배양 중에 우태아혈청으로부터 이종(xenogeneic) 병원체에 의한 오염의 위험성을 가지고 있다. 현재의 기술력은 인 비보 말초 RBC들과 비교할 정도의 건강한 RBC를 생산하는 기질이 없는(stromal-free) 배양 시스템을 제공할 수 없으므로, 배양 조건들을 개선하고 신규한 첨가물들을 동정할 필요가 있다. 플루로닉(pluronic) F68(분자량 8,400)은 하이드로다이나믹 스트레스에 대해 세포를 보호(cytoprotective)하는 것으로 알려진 비-이온성 블록 고분자 화학 계면활성제이다. 정맥 주사로 투여되는 약물(Han et al, 2006, Lu et al, 2008b) 또는 세포 배양액(Harting et al, 2008)의 제조에 있어서도 플루로닉 고분자들은 첨가제로서 널리 이용되어 왔다. 하지만, 플루로닉 고분자들의 폭넓은 인 비보 이용 및 안전한 정맥 주사 적용(Hokett et al, 2000)에도 불구하고 RBC들의 인 비트로 대량 생산 상에 이들의 효과를 기술한 보고들은 없다. 더욱이 기질이 없는 배양에 관한 기존의 여러 연구들은 상업적인 인간 혈청을 이용하였다(Fujimi A, 2008, Miharada et al, 2006). 응집 과정 때문에 배양 과정에서 정상 혈장이 이용되지 않는데 반해, 본 발명자들은 초-고속 원심분리 과정없이 혈청 대신에 제대혈(cord blood, CB) 혈장을 성공적으로 도입하였다. 본 발명에서 본 발명자들은 F68의 효과를 비교함으로써 자가-제대혈(auto-cord blood) 또는 혼합-제대혈 혈장을 이용하여 임상 등급 RBC용 기질이 없는 대량 생산 프로토콜을 완성하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 인 비트로에서 적혈구를 대량 생산할 수 있는 방법(특히, 기질의 부존재 하에서의 생산 방법)을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 적혈구 전구세포, 바람직하게는 CD34⁺ 세포의 배양 시에 폴록사머(poloxamer) 또는 제대혈 혈장을 처리하면 RBC(red blood cell) 막의 안정성을 증가시키고 삼투 취약성을 감소시켜 적혈구의 말기 성숙 단계에서 용혈을 억제시켜 인 비트로에서 적혈구를 대량 생산할 수 있음을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 적혈구(red blood cell)의 인 비트로 생산 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 적혈구(red blood cell)의 인 비트로 생산용 배지를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 폴록사머(poloxamer)를 포함하는 배지에서 적혈구 전구세포(erythroid progenitor cell)를 배양하는 단계를 포함하는 적혈구(red blood cell)의 인 비트로 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 폴록사머(poloxamer)를 포함하는 적혈구(red blood cell)의 인 비트로 생산용 배지를 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 제대혈 혈장을 포함하는 적혈구(red blood cell)의 인 비트로 생산용 배지를 제공한다.

본 발명자들은 인 비트로에서 적혈구를 대량 생산할 수 있는 방법(특히, 기질의 부존재 하에서의 생산 방법)을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 적혈구 전구세포, 바람직하게는 CD34⁺ 세포의 배양 시에 폴록사머(poloxamer) 또는 제대혈 혈장을 처리하면 RBC(red blood cell) 막의 안정성을 증가시키고 삼투 취약성을 감소시켜 적혈구의 말기 성숙 단계에서 용혈을 억제시켜 인 비트로에서 적혈구를 대량 생산할 수 있음을 발견하였다.

본 발명에 따르면 적혈구를 배양 시에 폴록사머를 처리하여 RBC의 막 안정성 증가 및 삼투 취약성 감소를 통하여 RBC를 인 비트로에서 대량 생산한다.

본 발명은 적혈구 전구세포(erythroid progenitor cell)의 배양에 폴록사머를 처리하여 기질이 없는(stroma-free) 시스템에서 적혈구를 대량 생산할 수 있는 최초의 발명이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 폴록사머(poloxamer)는 다음의 화학식 1로 표시되는 비-이온성 고분자 물질이다:

화학식 1

(PE)_x-(PPO)_y-(PE)_z

상기 화학식에서, PE는 에틸렌옥사이드, PPO는 프로필렌옥사이드, x, y 및 z는 각각 독립적으로 1-10,000의 정수이다.

상기 폴록사머는 폴리프로필렌 옥사이드의 소수성 센터 및 폴리에틸렌 옥사이드의 양 끝의 친수성 폴리 택(tag)으로 구성된 삼중블럭(tri-block) 구조로, 플루로닉스(pluronics) 상표명(BASF Corporation)으로 구입이 가능하다. 폴록사머는 양친매성 구조를 가지기 때문에, 소수성 오일 물질의 물 용해도를 증가시키거나 서로 다른 성질을 지니는 두 물질의 혼화성(miscibility)를 증가시키는 데 폴록사머를 이용한다. 폴록사머는 공업, 화장품 또는 의학 분야에 응용되며, 특히 약제 운반 시스템(drug delivery system)의 모델 시스템으로 유용하게 이용된다. 또한, 폴록사머의 첨가는 세포 완충 효능(cell cushioning effects)으로 인해 세포를 낮은 스트레스 조건에 놓이게 하기 때문에 세포 배양 배지에 매우 유용하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용된 폴록사머는 폴리프로필렌 옥사이드의 분자량이 1,000-3,000 g/mol이고 폴리에틸렌옥사이드의 함량이 50-90%이다. 보다 바람직하게는, 본 발명에서 이용된 폴록사머는 폴리프로필렌 옥사이드의 분자량이 1,200-2,500 g/mol이고, 가장 바람직하게는 1,500-2,000 g/mol이다. 본 발명에서 이용된 폴록사머는 폴리에틸렌옥사이드의 함량이 보다 바람직하게는 60-90%, 가장 바람직하게는 70-85%이다.

본 발명에서 이용되는 배지에서 폴록사머의 양은 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 배지를 기준으로 하여 0.005-1 %(w/v), 보다 바람직하게는 0.01-0.5 %(w/v), 보다 더 바람직하게는 0.02-0.1 %(w/v), 가장 바람직하게는 0.04-0.08 %(w/v)이다.

본 발명에 따르면 폴록사머를 포함하는 배지에서 적혈구 전구세포를 배양한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 적혈구 전구세포는 CD34⁺ 세포이다.

본 발명에서 이용된 CD34⁺ 세포는 CD34를 발현하는 세포를 의미한다. CD34는 단백질을 인코딩하는 인간유전자의 이름이다. CD34분자는 세포 표면의 당단백질로 인체 내의 특정 세포에 존재하는 분화 분자로 하나의 군을 이루며 세포-세포 접착 인자(cell-cell adhesion factor)로서 기능한다. 또한, 골수의 세포외 기질 또는 기질 세포에 줄기세포의 접촉을 매개한다. CD34를 발현하는 세포는 정상적인 혈관의 조혈 세포, 혈관내피 전구세포(endothelial progenitor cell) 및 혈관내피 세포(endothelial cell)같은 탯줄(umbilical cord) 및 골수에서 발견되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 CD34⁺ 세포는 제대혈로부터 유래된 세포이다.

적혈구 전구세포는 다음과 같은 단계로 이루어진 적혈구 형성 과정(erythropoiesis)를 거쳐 성숙한 적혈구(erythrocyte)로 분화한다: (a) 단일분화성 줄기세포(unipotent stem cell, hemocytoblast)에서 전적아세 포(proerythroblast)로 분화하는 단계; (b) 전적아세포에서 호염기성 적아세포(basophilic erythroblast)로 분화하는 단계; (c) 호염기성 적아세포에서 다염기성 적아세포(polychromatophilic erythroblast)로 분화하는 단계; (d) 다염기성 적아세포에서 정염성 적아세포(orthochromatic erythroblast)로 분화하는 단계; (e) 정염성 적아세포에서 다염성 적혈구(polychromatic erythrocyte)로 분화하는 단계; 및 (f) 다염성 적혈구에서 적혈구(erythrocyte)로 분화하는 단계.

본 명세서에서 사용되는 용어 “적혈구 전구세포(erythroid progenitor cell)”는 성숙이 끝난 적혈구를 제외한 적혈구 형성 과정에 포함된 모든 세포를 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 적혈구 전구세포는 전적아세포(proerythroblast), 호염기성 적아세포(basophilic erythroblast), 다염기성 적아세포(polychromatophilic erythroblast), 정염성 적아세포(orthochromatic erythroblast) 또는 다염성 적혈구(polychromatic erythrocyte, reticulocyte)이고, 보다 바람직하게는 다염기성 적아세포, 정염성 적아세포 또는 다염성 적혈구이다. 하기의 실시예에서 규명된 바와 같이, 폴록사머에 의한 적혈구 생산성 향상은 상술한 적혈구 형성 과정에서 말기 단계에서 뚜렷하게 나타난다. 적혈구 형성 과정의 말기 단계에서의 적아세포의 낮은 생존율은 적혈구의 인 비트로 생산에서 큰 장애물이었다. 본 발명에서 이용되는 폴록사머는 이러한 종래 기술의 문제를 극복할 수 있도록 한다. 즉, 본 발명은 다염기성 적아세포로 분화 이후의 세포들의 생존율을 크게 향상시킬 수 있다.

폴록사머는 상기 적혈구 형성 과정에 따른 적혈구 전구세포의 배양에서 처음부터 사용될 수도 있고, 중간 단계(예컨대, 다염성 적혈구가 형성된 시점, 배양 13일째)에서 추가적으로 배지에 첨가될 수도 있다.

적혈구 전구세포는 다양한 소스, 예컨대 말초혈액, 제대혈 또는 골수로부터 얻을 수 있다. 적혈구 전구세포로서의 CD34⁺ 세포는 당업계에 공지된 다양한 세포 분리 방법, 예컨대 CD34⁺ 항체를 이용하는 면역자기-비드 분리 방법에 따라 분리할 수 있다.

본 발명의 배지는 적혈구 전구세포의 생존율을 향상시키기 위한 성분인 폴록사머 이외에 동물세포의 배양에 통상적으로 이용되는 성분을 포함할 수 있다. 본 발명의 배지를 이루는 기본배지는 당업계의 통상적인 배지, 예컨대 Eagle’s MEM [Eagle’s minimum essensial medium, Eagle, H. Science 130:142(1959)], α-MEM[Stanner, C.P. et al., NAT. New Biol. 230:52(1971)], Iscove's MEM[Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)], 199 medium [Morgan et al., Proc. Soc. Exp. BioMed., 73:1(1950)], CMRL 1066, RPMI 1640 [Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)], F12[Ham, Pro. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)], F10 [Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)], DMEM [Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., virology 8:396(1959)], DMEM 및 F12의 혼합물[Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102:225(1980)], Way-mouth's MB752/1[Waymouth, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)], 이스코브 변형 둘베 코 배지(Iscove’s modified Dulbecco’s medium), 이스코브 변형 피셔 배지 또는 이스코브 변형 이글 배지, McCoy's 5A [McCoy, T. A., et al, Pro. soc. Exp. Bio. Med. 100:115(1959)], MCDB의 시리즈 [Ham, R.G et al., In Vitro 14:11(1978)], AIM-V 배지, 및 이의 변형배지를 포함한다. 배지의 상세한 설명은 R. Ian Freshney, Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique, Alan R. Liss, Inc., New York에서 알 수 있으며, 상기 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 본 발명의 배지는 이스코브 변형 둘베코 배지를 이용한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 배양은 기질세포의 존재 또는 부존재 하에서 실시한다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 배양은 기질세포의 부존재 하에서 실시한다. 본 발명의 가장 큰 특징 중 하나는 기질세포를 이용하지 않고도 적혈구를 인 비트로 대량 생산이 가능하다는 것이다.

종래 기술에 따르면, 적혈구 인 비트로 생산에서 기질세포를 사용하여 공동배양 하며, 이러한 공동 배양 시스템은 임상 등급의 적혈구를 생산하기 위하여 매우 많은 기질세포를 요구한다. 따라서, 공동 배양 시스템은 많은 제한과 단점을 가지고 있다. 본 발명은 기질세포-부재 배양이 가능하여 이러한 종래 기술의 문제를 완벽하게 극복할 수 있게 한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 배지는 적혈구 전구세포의 증식 및 분화를 촉진시키기 위해 SCF(stem cell factor), IL-1, IL-3, IL-4, IL-5, IL-11, GM-CSF(granulocyte macrophage-colony stimulating factor), M-CSF(Macrophage Colony-Stimulating Factor), G-CSF(granulocyte-colony stimulating factor) 및 EPO(erythropoietin)로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 하나의 성분을 추가적으로 포함한다.

보다 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 배지는 전적아세포에서 호염기성 적아세포로 분화시키는 단계에서 하이드로코티손, SCF, IL-3 및 EPO를 포함하며; 호염기성 적아세포에서 다염기성 적아세포로 분화시키는 단계에서 SCF, IL-3 및 EPO를 포함하고; 다염기성 적아세포에서 정염성 적아세포로 분화시키는 단계에서 SCF 및 EPO를 포함하며; 정염성 적아세포에서 다염성 적혈구(즉, 망상적혈구)로 분화시키는 단계(즉, 탈핵 단계)에서는 사이토카인을 포함하지 않는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 배지는 동물의 혈청 대체제로서 제대혈 혈장을 포함한다.

제대혈 혈장은 제대혈로부터 간단하게 피브린 덩어리(fibrin clot)를 제거하여 얻을 수 있다. 제대혈 혈장은 혼합 혈장(즉, 다양한 개체로부터 얻은 혈장의 혼합물) 또는 자가 혈장 모두 이용할 수 있다.

종래기술에 따르면, 적혈구세포의 생산 및 배양을 위하여 동물 혈청(예컨대, FBS) 또는 인간 혈청이 이용된다. 그러나 동물 혈청은 이종간의 안전성 문제가 있으며, 인간 혈청은 고비용의 문제점이 있다.

본 발명에 따르면 제대혈 혈장이 적혈구세포의 생산에서 성공적으로 동물의 혈청을 대체할 수 있다.

제대혈 혈장은 상기 적혈구 형성 과정에 따른 적혈구 전구세포의 배양에서 처음부터 사용될 수도 있고, 중간 단계(예컨대, 정염성 적혈구가 형성된 시점, 배양 17일째)에서 추가적으로 배지에 첨가될 수도 있다.

적혈구 전구세포를 배양하여 적혈구를 얻는 과정은 동물 세포의 통상적인 배양 조건에서 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 배양은 5% CO₂의 항습 대기 환경 37℃에서 실시할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 폴록사머(poloxamer)를 포함하는 적혈구(red blood cell)의 인 비트로 생산용 배지이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 배지는 제대혈 혈장을 추가적으로 포함한다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명의 배지는 제대혈 혈장을 포함하는 적혈구(red blood cell)의 인 비트로 생산용 배지이다.

본 발명의 배지는 상기 본 발명의 적혈구 인 비트로 생산용 방법에서 사용되는 배지와 동일하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 폴록사머를 이용하여 적혈구 전구세포의 생존율을 크게 향상시켜 결국 적혈구 생산성을 향상시킨다.

(b) 본 발명에 따르면 적혈구 전구세포로부터 적혈구의 인 비트로 생산성을 크게 향상시킨다.

(c) 본 발명에 따르면 임상-등급의 적혈구를 인 비트로 배양 방법으로 얻을 수 있다.

(d) 본 발명은 적혈구의 배양에 통상적으로 이용되는 동물혈청 또는 인간 혈청의 대체제로서 제대혈 혈장을 제공한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 실험방법

CB CD34 ⁺ 세포의 분리

본 발명자들은 공식적인 서면 인증서를 받은 후 정상적 임신 기간을 거친 CB 시료들(n = 8)을 45 ml 시트레이트 포스페이트 덱스트로오스 A(CPDA-1)를 포함하는 백(Green Cross Corp., Yong-in, Korea)에 수득하였다. CB를 기증한 산모들 및 그들의 아기들은 모두 어떠한 비정상적 실험 결과를 나타내지 않고 건강한 상태였다. 대한민국 서울에 있는 세브란스 병원의 윤리 위원회가 본 연구를 승인하였다. 운반 후 6시간 안에 CD34⁺ 세포 분리를 시작하였다. 이전에 기술된 방법(Baek et al, 2008)에 따라 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque) 밀도 구배 원심분리(밀도 1.077, Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)를 이용하여 단핵 세포(mononuclear cell, MNC) 분획을 분리하였다. 제조사의 지시사항에 따라 면역자기 마이크로비드 선택법(immunomagnetic microbead selection, MACS CD34 분리 키트, Miltenyi Biotech, Auburn, CA)을 이용하여 CD34⁺ 세포를 분리하였다. 선택된 CD34⁺ 세포를 사이토카인-보충된 이스코브 변형 둘베코 배지(Iscove’s modified Dulbecco’s medium, IMDM; Sigma Chemical Co., St Louis, MO)에 5×10⁴/cm²의 농도로 분주하였다.

CB CD34 ⁺ 세포의 배양

CB CD34⁺ 세포를 풍부하게 하기 위해, 세포를 1% 인간 알부민(Green Cross, Yong-in, Korea), 150 mg/ml 철-포화 인간 트랜스페린(Sigma), 90 ng/ml 페릭 니트 레이트(Sigma), 50 mg/ml 인슐린(Sigma), 4 mmol/l L-글루타민(Sigma), 160 x μmol/l 모노티오글라이세롤(Sigma), 308 mmol/ml 비타민 C (Sigma) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액(Gibco, Grand Island, NY)이 보충된 IMDM으로 구성된 혈청이 없는(serum-free) 배양 배지에서 13일 동안 배양하였다. 기본적인 배양 방법은 4개의 기(phase)로 나뉘어졌다. Ⅰ기(0-7일)에, CB CD34⁺ 세포를 1 mM/l 하이드로코티손(Sigma), 100 ng/ml 줄기세포 인자(stem cell factor, SCF; Peprotech, Rehovot, Israel), 10 ng/ml 인터루킨-3(Peprotech) 및 6 IU/ml 에리스로포이에틴(EPO; Peprotech)이 보충된 배지에서 배양하였다. 세포를 4일 째에 2배 희석하였다. Ⅱ기(7-13일)에, 적혈구계 세포(erythroid cells)를 50 ng/ml SCF, 10 ng/ml 인터루킨-3 및 3 IU/ml EPO의 존재 하에서 배양하였다. Ⅲ기(13-17일)에, 50 ng/ml SCF 및 2 IU/ml EPO를 첨가하였다. 마지막으로, Ⅳ기의 탈핵(enucleation) 단계(탈핵 상태에 따라 17-21일 또는 17-24일)에 적혈구를 사이토카인이 없는 새로운 배지로 옮겼다. 17일부터 마지막 날까지 CB로부터 유래된 자가-혈장(auto-plasma)을 5%로 첨가하였다. 각 기의 끝에 배양된 세포를 수득하고 혈구계산기를 이용하여 적혈구를 카운트하였다. 모든 배양을 5% CO₂의 항습 대기 환경에서 37℃로 유지하였다.

플루로닉 F68(BASF Corporation)의 최적 농도를 결정하기 위한 예비적인 연구에서, 처리된 F68의 농도는 0.025%에서 0.05%(w/v)까지 다양하였으며 본 발명자들은 0.05%의 농도를 선택하였는데, 이는 적혈구의 형태가 더 좋으면서 높은 증 가(expansion)를 유발했기 때문이다. 또한, 증가에 있어서 F68의 효과가 증식이 활발하게 유지되는 13일 까지 최소임을 확인하였기 때문에 0.05% F68가 첨가된 배양을 13일부터 21일 또는 24일(성숙이 지연되는 경우에 완전한 탈핵을 허용하기 위해)까지 F68이 없이 배양된 대조군과 비교하였다. 0.05% F68의 부재 또는 존재 하에서 13일 이후의 세포 형태, 생존율(viability) 및 증가 배수를 비교하였다. 배지 교체 및 세포 카운팅을 위한 4번의 세포 수득 단계를 제외하고는 거품 형성 및 관련 세포 손상을 제한하기 위해 배양 기간 동안 세포에 하이드로다이나믹 스트레스를 유발하는 유체 이동의 유입을 최소화하였다.

CB-유래된 혈장의 제조

피콜-하이파크 밀도 구배 원심분리에 의한 CB의 원심분리 과정 동안 MNC를 분리하기 전에 MNC 층의 위층을 구성하는 CB-유래된 혈장을 수득하였다. 간단하게 피브린 덩어리(clot)를 제거하여 혈소판-부족 혈장을 제조하였다; 1.0 M CaC1₂를 첨가하여 CaC1₂의 최종 농도가 20 pmoles/ml로 조절된 혈장. 37℃에서 하룻밤 동안 항온배양한 후 피브린 덩어리를 제거하기 위해 혈장-유래된 혈청을 13,200 rpm에서 30분 동안 원심분리하였다. 분취된 혈청을 -20℃에 보관하고 이를 동일한 기증자로부터 유래한 적혈구에 13일 째부터 첨가물로 처리하였다.

적혈구 마커들의 유동세포분석(flow cytometric analyses)

적혈구의 성숙 과정 동안 표현형 변화를 조사하기 위해, 본 발명자들은 세포를 8일, 13일, 17일 및 21일 째에 다음의 항-인간 항체들로 표지하였다: CD45-피코에리스린(PE; Immunotech, Marseille, France); CD34-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 및 글라이코포린 A(GPA)-PE(BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ); CD71-FITC(eBioscience, San Diego, CA); 이뮤노글로불린 G1 IgG1-FITC 및 IgG1-PE(Beckman Coulter, Miami, FL)을 이소티픽(isotypic) 대조군 염색을 위해 사용하였다.

면역표면형질 분류(immunophenotyping)를 위해, 세포를 인산완충용액(PBS)으로 세척하고 10 ㎕의 각 단일클론 항체들과 4℃에서 15분 동안 반응시켰다. 세척한 후 세포를 400 ml의 PBS에 재현탁하고 우태아 헤모글로빈(fetal haemoglobin, HbF)의 세포내 발현을 제조사의 지시사항에 따라 FITC-결합된 항-HbF(BD Pharmingen)를 이용하여 분석하였다. 4×10⁴ 개의 세포를 상온에서 10분 동안 1 ml의 냉장 글루타르알데하이드(0.05%)에 재현탁한 후 PBS/0.1% 보바인 시럼 알부민(bovine serum albumin)으로 세척하고 상온에서 5분 동안 0.5 ml Triton X-100(0.1%)에 현탁하였다. 세척 후, 2.0 ㎍의 항체를 세포에 첨가하며 세척 전에 100 ㎕ 부피에서 15분 동안 반응시키며 300 ㎕ 포름알데하이드(1%)에 재현탁하였다. 염색된 세포를 혈구계수기(Cytomics FC 500, Beckman Coulter) 및 FCS 3.0 소프트웨어(Beckman Coulter)를 이용하여 분석하였다.

세포 생존율 측정

유동세포 분석법을 이용하여 7-아미노악티노마이신 D(7-ADD) 염색 및 카스페이즈-3 어세이, 및 트립토판 블루 염색을 통해 살아있는 세포를 카운팅하여 세포 생존율을 측정하였다. 상술한 대로 7-ADD(BD PharMingen) 염색을 실시하였다. 카스페이즈-3 염색(CaspGlow 플루오레신 활성 카스페이즈-3 염색 키트, Biovision, Mountain view, CA)을 위해, 1 ㎕의 FITC-DEVD-FMK을 5×10⁴ 개의 세포에 첨가하여 5% CO₂ 하에서 30분 동안 37℃로 반응시켰다. 제조사의 지시사항에 따라 세포를 아넥신 V-FITC 및 프로피디움 아이오다이드(Invtrogen, Camarillo, CA)로 상온에서 15분 동안 염색하였다. 세포를 세척 완충액으로 두 번 세척한 후 유동세포 분석법에 의해 분석하였다.

적혈구에 대한 표준 혈액학적 변이들(variables) 및 염색

헌혈된 정상 말초혈액내의 RBC들과의 비교를 위해, 배양된 세포를 21일 째에 수득하고 RBC 카운트, Hb 수치, 평균 세포 부피(mean cell volume, MCV) 및 평균 세포 Hb(MCH) 등을 포함하는 혈액 세포 변이들을 자동혈구계산기(Advia 2120, Bayer Diagnostics, Tarrytown, NY)을 이용하여 측정하였다. ABO 군 항원들 및 RhD 발현을 젤 기법(DiaMed, Cressier Sur Morat, Switzerland)에 의해 측정하였다.

적혈구의 형태를 분석하기 위해, 1-1.5×10⁵ 개의 세포를 슬라이드 위에서 원심분리(Cytospin3; Thermo Shandon, Pittsburgh, PA)하고 이전에 기술된 대로 라이트-기엠사(Wright-Giemsa, Sigma-Aldrich)로 염색하였다(Baek et al, 2008).

주사전자현미경 및 투과전자현미경 소견

F68의 존재 또는 부재 하에서 배양된 적혈구의 전자 사진을 전계방출주사현미경(field emission-scanning electron microscope; Hitachi S-800, Tokyo, Japan)을 이용하여 21일 째에 촬영하였다. 주사현미경 이미지 분석 시스템(ESCAN-4000, Bummi Universe, Tokyo, Japan)을 이용하여 이미지를 기록하였다. 또한, 배양된 세포를 투과전자현미경(TEM; JEM1011, JEOL, Tokyo, Japan)을 이용하여 관찰하고 촬영하였다.

삼투 취약성 조사(osmotic fragility evaluation)

F68의 존재 또는 부재 하에서 배양된 적혈구를 두 번 세척한 후 5 mM 소듐 포스페이트 용액(pH 7.4)으로 완충된 다양한 농도(50150 mM)의 NaCl 용액과 함께 0.25% 헤마토크리트(haematocrit)로 희석하였다. 세포 현탁액을 상온에서 20분 동안 반응시킨 후, 원심분리하여 비-용해된 세포의 백분율을 조사하였다.

통계 분석

그래프패드 프리즘 컴퓨터 소프트웨어(GraphPad Prism computer software; Version 5.0, SanDiego, CA)를 이용하여 데이터 분석을 실시하였다. 결과를 평균 값 ± 평균값의 표준 오차(SEM)로 나타낸다. F68의 존재 또는 부재 하에서 테스트하는 삼투 취약성에 의한 세포의 증가 배수 및 생존 세포를 윌콕슨 보증 랭크 테스트(Wilcoxon's signed rank test)로 비교하고 유의적 수준을 P < 0.05로 표시하였다.

실험결과

CB CD34 ⁺ 세포의 분리

CD34⁺ 분리로부터 수득된 CB 시료들의 평균 부피는 80.0 ± 7.7 ml (n=8)를 나타냈다. 분리된 CD34⁺ 세포의 평균 숫자는 CB 시료 당 1.0×10⁶ 개였으며 최대 2.2×10⁶ 개에 달했다. 분리된 CD34⁺ 세포의 순도(purity)는 90% 이상 이었다.

적혈구의 증가

F68의 존재 하에서 하나의 CD34⁺ 세포로부터 적혈구의 최대 증가는 21일 째에 1.1×10⁵-배였는데, 이는 이론적으로 2.3×10¹¹ 개의 RBC에 해당한다. 평균 증가는 F68이 없는 대조군보다 F68의 존재 하에서 1.5배 더 높게 나타났다(각각 29,362.4 대 19,792.5-배)(n=8)(표 1).

하나의 CD34⁺ 세포로부터 성숙한 적혈구로의 증가 배수

날짜	대조군(N=8)	F68(N=8)
7	59.0 ± 9.5
13	1909.6 ± 861.6
17	11,792.4 ± 6,028.0	11,886.3 ± 6,012.4
21	19,792.5 ± 9,585.5	29,362.4 ± 12,325.9*

데이터를 평균값 ± SEM으로 표시한다.

^*적혈구의 증가 배수는 F68을 첨가하면 21일 째에 대조군보다 1.5배 더 높게 증가하였다(P < 0.05).

본 발명자들은 17일 및 21일 째에 적혈구 증가 상에 F68의 효과를 조사하였는데, 호염기성(basophilic) 적아 세포 및 다염성(polychromatophilic) 적아 세포의 증식이 일어나고 있을 때 F68의 존재에 상관없이 17일 째에는 이들 배양액 간에 거의 차이가 없음을 발견하였다. 하지만, 17일 및 21일 째 사이의 적혈구 증가는 F68을 처리한 배양에서 더욱 크게 증가하였는데 F68을 처리하지 않은 대조군에 비해 평균적으로 1.5배 및 최대 3.6배까지 증가하였다. 따라서 성숙이 주요한 과정이고 증식은 최소로 일어나는 말기의(terminal) 성숙기에서만 F68의 효과를 관찰할 수 있었다(표 1).

생존율

F68의 부재 하에서 세포 생존율이 17일 이후에 감소(적혈구 파편의 빠른 증가로 확인)할 지라도, 트립토판 블루 염색, 카스페이즈-3 어세이 및 7-AAD 어세이를 이용하여 F68의 존재 또는 부재 하에서 배양된 세포의 전체적인 생존율을 측정하였을 경우 이들의 생존율은 17일 또는 21일 째에 유의하게 다르지 않았다(도 1). 다량의 세포 절편들을 위상차현미경(phase-contrast microscopy)을 통해 관찰할 수 있지만, 이들은 세포 카운팅 또는 염색 과정에서 세척을 통해 제거되며, 포워드 및 사이드 스캐터(forward and side scatters)에 게이트 세팅에 의해 절편된 입자들이 제거되기 때문에 유동세포 분석에서 분석되지 않았다. 결과적으로, 생존율 마커들은 대조군 및 F68 군들 간에 뚜렷하게 다르지 않았지만 생존 세포를 나타내는 증가 배수는 생존율과 일치한다(도 1). 본 발명자들은 아넥신 V-FITC 및 프로피디움 아이오다이드 염색을 통해, F68을 첨가하여 배양된 세포가 17일 및 21일 모두에서 명백하게 더 높은 생존율을 나타냄을 확인하였다(도 1).

삼투질농도 테스트(osmolarity testing)

저삼투압 조건을 형성하기 위해 삼투질농도를 더 낮출수록 더 많은 RBC들이 용혈되고 생존 세포의 수가 감소하였다. 삼투 취약성이 대조군에 비해 F68의 존재 하에서 배양된 세포에서 현저하게 낮았다(P < 0.05)(도 2).

주사전자현미경 및 투과전자현미경

세포 형태의 붕괴(loss)를 관찰하기 위해, 본 발명자들은 주사전자현미경을 이용하여 세포를 시각화하였다. F68의 존재 하에서 배양된 세포는 죽어가는 세포가 거의 보이지 않는 깨끗한 상태를 나타냈다; 하지만, F68의 부재 하에서 배양된 대부분의 세포는 흘러나온(leaked) DNA 가닥들이 노출된 부서진 핵을 가지고 있었는데 이러한 DNA들은 주변 RBC들을 트랩하여 파괴하였다(도 3). 더욱이 생성 중인 RBC의 막은 F68-처리된 배양에서 정상적인 도넛형을 회복한 반면에 F68의 부재 하에서는 거의 모든 적아 세포의 막이 구조적 형태를 상실하였다. 따라서 적혈구의 갑작스런 감소를 핵들이 빠져나오기 시작하는 17-21일에 세포형태의 붕괴에 의한 것으로 설명할 수 있다.

F68의 존재 하에서 배양된 적혈구의 TEM 이미지의 경우 핵을 내보내기 위해 세포질의 움직임이 격렬한데, 이를 통해 세포질이 막기 성숙 단계에서 쉽게 용혈되는 이유를 설명할 수 있었다(도 4A-4E). 새로이 형성되는(도 4F) 및 재-구성되는 도넛형(dounut-shape) 망상 적혈구를 관찰하였다. 더 나아가, 허물 벗은(shedding off) 세포질 및 에이팝토틱(apoptotic) 액포들을 관찰하였다(도 4H-4I).

배양된 적혈구의 형태

배양 8일 째에 거의 모든 세포는 호염기성 적아 세포들을 나타냈다(도 5A). 17일 째에, 유핵세포는 다염성(polychromatophilic) 또는 정염성(orthochromic) 적아세포들로 구성되었다(도 5B). 주어진 시간에 정염성 적아세포 및 탈핵된 RBC의 백분율에 의해 측정된 성숙 과정의 속도는 기증자에 따라 다양하였다(도 5C). 성숙이 지연되고 탈핵이 불완전한 경우, 최대 탈핵율(enulceation rate)을 달성하기 위해 배양 기간을 약 3일간 연장하였다. 21일 또는 24일 째에 탈핵된 RBC들의 백분율은 40% 내지 100%로 다양하였는데, 이는 거대세포 또는 피더 세포주 같은 세포들이 기질의 존재 없이 자가 탈핵-유도능(self-enucleation-inducing ability)을 갖는다는 것을 나타낸다(도 5D). 탈핵율은 F68 군 및 대조군 간에 큰 차이는 없었다. 에이팝토틱 세포 파편(debris) 및 액포 또는 블레브(bleb)없는 세포질의일관성을 조사하였을 때, 상기 세포 상태를 혈색소 다양성(polychromasia)을 보이는 태아의 RBC들의 상태와 비교하여 RNA 잔해(remnants)의 존재를 확인하였다(도 5D). 배양 마지막 날에, 적혈구계 세포의 비율이 거의 100%였고 다른 계통의 세포는 검출되지 않았다. 마지막 세포 생산물을 수득하여 이들로부터 F68의 존재 하에서 에이팝토틱 분획을 거의 유발하지 않는 여과를 이용하여 순수한 RBC들을 획득할 수 있었으며 적혈구는 뚜렷한 용혈 현상 없이 배양 후 25일까지 생존할 수 있었다. 최종 RBC 생산물의 시료를 도 5E에 나타낸다.

표준 혈액학적 변이들

21일 째 적혈구는 망상 적혈구의 수치와 유사한 14.9 ± 3.8 g/dl Hb, 115.2 ± 0.7 fl MCV 및 42.9 pg MCH 값을 나타냈다. 망상 적혈구의 백분율은 60.9 ± 4.5%이었다. 배양된 RBC들은 A 또는 B 항원들(4+) 및 RhD 항원들(4+)을 강하게 발현하였는데, 이들은 CB 기증자와 동일한 혈액형이었다.

적혈구의 면역표현형(immunophenotypes)

본 발명의 배양 프로토콜이 표현형적으로 성숙한 RBC들을 생성하는지 여부를 테스트하기 위하여, 본 발명자들은 유동세포분석기를 이용하여 RBC 마커들의 발현을 분석하였다. 배양된 RBC들은 적혈구 마커인 글라이코포린 A(> 95%) 및 CD71(75.8%)를 발현하였다. CD45의 발현은 7일까지 강력하게 발현한 후 천천히 감소하다가 17일에 이르러 발현되지 않았다. 적혈구에서 GPA 및 CD71의 발현은 F68의 처리에 의해 영향받지 않았다(도 6A). 이러한 데이터는 라이트-기엠사(Wright-Giemsa) 염색에 의해 관찰된 형태학적 변화로 측정된 성숙 단계와 일치하였다. HbF의 평균값은 8일 째에 97.1 ± 0.7%로부터 24일 째에 6.6 ± 1.7%까지 감소하였다(도 6B).

추가논의

본 발명에서, F68 및 CB 혈장을 이용하여 인 비트로 임상-등급(clinical-grade) RBC 생산 시스템을 확증하였다. F68은 RBC의 인 비트로 생산을 명확하게 증가시켜 건강한 RBC의 대량 생산을 위한 중요한 첨가물로 기능하였다. F68은 초기(incipient) 망상 적혈구의 생존을 증가시키는데 매우 효과적이며 세포막의 형태를 유지시킴으로써 말기 적혈구 생성 과정동안 적혈구를 탈핵하는데 매우 효과적이었다. 반대로, F68의 부재 하에서 망상 적혈구의 파괴는 파편(debris)의 증가된 생산과 함께 지속되었다. 본 발명자들은 F68의 부재 하에서 배양된 경우 탈핵 과정 동안 심각한 세포 파괴가 RBC 막의 통합성 상실 및 파괴된 핵으로부터 나온 끈적끈적한 DNA에 의해 일어난다는 것을 주사전자현미경 분석을 통해 확인하였다. 또한, CB 혈장은 인 비트로 RBC 발생을 위한 우태아혈청 또는 인간 혈청의 적합한 대체물이었다.

최근까지, 인 비트로 RBC 발생에 대한 보고들은 증가 배수에 집중되어 연구한 반면에, 발생된 RBC의 건강성 및 배양 프로토콜의 효율성에 대해서 별로 주의를 기울이지 않았다. 인 비트로 RBC 발생을 위한 배양 조건들은 기증된 성숙한 RBC의 저장 시에 이용되는 조건들과는 매우 다르다. 본 발명자들이 일반적으로 이용되는 항응고제 또는 저장 반응물(예컨대, CPDA-1, AS-1 또는 ACD-A)를 첨가할 경우, 적혈구는 건강한 상태를 유지할 수 없었다(결과를 보이지 않음). 따라서 양 및 질적인 측면에서 인 비트로 RBC 생산의 최적화는 임상 적용에 중요하다. 본 발명에서 본 발명자들은 배양의 최종기(final phase)에 세포 손실을 감소시키는 것에 초점을 맞춰 임상 등급의 RBC 생산을 증대시켰다. 이전의 보고에서, 인 비트로 발생된 RBC가 배양 후기에 약화되고 감소되는 특징 때문에 많은 기능성 테스트들을 배양 종결 전에 실시하였다(Giarratana et al, 2005, Lu et al, 2008a). 본 발명자들의 접근방식은 여러 날 동안 용혈 없이 안정적이고 순수한 RBC 제조 과정을 제공함으로써 임상 적용을 위한 RBC 질을 강화시킬 수 있다.

비록 상기 탈핵 과정의 기전을 이해할 수 없을 지라도, 배양된 세포의 낮은 생존율에 대한 하나의 가능한 이유가 자극 및 영양분을 갖는 적아 세포를 제공하며 세포-세포 접촉에 의한 핵-돌출 과정을 촉진시키는 거대세포 같은 피더 기질층(feeder stromal layer)의 부재일 수 있다. 하지만 본 발명자들은 기질이 없는 배양에서조차도 100% 탈핵을 획득할 수 있음을 관찰하였다. 본 발명은 탈핵이 시작되는 시점 및 건강한 세포가 탈핵 과정을 거치고 건강하지 않은 세포가 용혈되는 시점에서의 세포 안정성 및 세포 생존율이 건강한 RBC의 인 비트로 생산에 중요한 요소임을 제안한다. 이러한 사실은 기질 세포가 적혈구에 대해 항-에이팝토틱 효과(Koury et al, 2002)를 가지지만 본질적으로 탈핵 과정에 필수적이지 않다(Rhodes et al, 2008)는 이전의 결과들과 일치한다. 본 발명자들은 영양분 및/또는 사이토카인의 다른 조합들을 시험하였는데, 이러한 조합들 중 어떠한 것도 막을 안정화시킬 수 없으며 돌출된 핵의 쪼개진 조각들(splinters) 및 용혈된 적혈구계 세포로부터의 철 누출에 의해 야기되는 세포 독성 환경을 극복할 수 없음을 확인하였다.

또한 폴록사머 188 및 루트롤 F68로 알려진 F68은 하나의 소수성 폴리 센터 및 두 개의 친수성 폴리 택(tag)으로 구성된 삼중블럭(tri-block) 구조를 포함하는 비-이온성 계면활성제이다(Hu et al, 2008). F68은 혈액 세포와의 헤모리올라지컬(haemorrheological), 혈전성 및 소수성 상호작용에 의하여 혈관계 질환 및 뇌졸중 같은 많은 질병들의 관리에 효과적이며, 4,000명 이상의 환자에 대하여 임상실험이 진행되었다(Harting et al, 2008, Moghimi and Hunter, 2000). 또한, F68은 인공적인 혈액 생산물 및 항생제의 제조에 이용된다(Hokett et al, 2000).

세포 배양에서 첨가물로서의 F68의 긍정적인 효과는 RBC에 제한되지 않는다. 예를 들어 F68은 인간의 잇몸 섬유아세포의 성장률을 증대시켰다(Hokett et al, 2000). 하지만 이러한 F68의 효과를 유발하는 기전은 알려지지 않은 상태다. MNC의 경우, Hokett 등은 F68이 세포 막(cell membrane)을 좀 더 안정화시켜 세포로의 성장 인자들의 접촉 및 이동을 촉진시킬 것으로 제안하였다(Hokett et al, 2000). 또한, F68은 세포 막으로 흡수되거나(Zhangetal,1992) 또는 세포 막 또는 세포내 소낭에 함입될 수 있으며, 세포질의 기계적인 특성을 변화시켜 막 경화(stiffening)를 유도할 수 있다(Gigout et al, 2008). 더 나아가, F68은 세포능(cell capacity)을 변화시켜 곤충 세포에 의한 바이러스 및 재조합 단백질의 생산을 증가시키는 것으로 알려져 있다(Palomares et al, 2000).

본 발명에서 F68의 부재의 경우, 탈핵 과정 동안 세포막의 통합성이 유지되지 않았고 세포의 표면이 너덜너덜해졌다. 또한, 탈핵하는 세포 주위로 DNA가 실처럼 감기며 DNA 독성으로 인해 바람직하지 않은 배양 조건들을 생성하였다(Brunk et al, 1997, Nagata, 2000). 이러한 상황에서 F68은 핵막 및 RBC 막의 파괴(breakage)를 억제하여 DNA 누출을 방지하며 좋은 배양 조건들을 보장하는 것으로 보인다. 본 발명자들은 하이드로다이나믹 스트레스에 의한 세포 손상을 야기할 수 있는 거품의 형성을 최소화하였기 때문에, 본 발명에서 F68의 역할은 직접적인 절단 보호 효과가 아니라 세포막을 안정화하는 효과에 있다. 이러한 사실과 일치하는, 본 발명자들은 세척에 의한 F68의 제거 후에도 저삼투에 대한 저항성을 부여한다는 것을 발견하였다. 이것은 F68이 막과의 구조적 상호작용 또는 세포 취약성(fragility) 또는 용혈에 결정적으로 영향을 미칠 수 있는 지질-단백질 상호작용을 변화시킴으로써 항용혈(antihaemolytic) 활성을 가진다는 이전 보고(Janoff et al, 1981)와도 일치한다. 다양한 유동학적(rheological) 압력 하에서 연장 지수(elongation index)를 측정하는 기형 테스트에서, 배양된 RBC는 기증된 RBC에 비해 정상적인 기능을 나타냈다(결과를 보이지 않음).

F68을 처리하거나 또는 처리하지 않고 배양된 세포의 생존율을 트립토판 블루 염색, 7-AAD 염색 및 카스페이즈-3 어세이로 비교한 경우, 처리군 간의 생존율에서의 차이는 놀랍게도 거의 없었다. 이것은 RBC가 상기 죽음-관련된 마커들 또는 표현형을 발현하기 시작하면 매우 빠르게 용혈된다는 것을 의미한다. 더욱이 RBC 형성에서 적혈구 형성 말기에 높은 카스페이즈-3 파지티브 활성(positivity)은 정상적인 것으로 보이는데(Lacronique et al, 1997), 이는 미토콘드리아 같은 미세-소기관들이 자식작용에 의해 파괴되어 카스페이즈-3 활성화를 초래하기 때문이다(Sandoval et al, 2008). 하지만, 아넥신 V로 검출하는 막의 플립-플랍(flip-flop) 변화는 초기 세포 사멸 변화를 지시하며 F68의 부재 하에서 배양된 세포에서 크게 증가된 시그널을 나타냈다. 따라서 7-AAD 또는 카스페이즈-3 염색에 의한 세포 죽음의 결정은 후기 단계의 적혈구에서 세포사멸을 검출할 유효한 방법이 아니고 트립토판 블루 또는 아넥시 V 염색에 의한 살아있는 세포의 카운팅이 성숙한 적혈구의 생존 및 건강성을 평가할 가장 좋은 방법이다.

적혈구를 위한 배지에서 가장 중요한 첨가물들 중의 하나로서, 이종의 우태아혈청을 이용하여 왔다. 감염의 위험을 극복하기 위해, 적혈구 생산을 위한 여러 보고들에서 상업적인 인간 혈청을 이용하였다. 하지만, RBC를 생산하기 위해서 인간 혈청을 이용하는 것은 현실적이지 못한 데, 이는 인간 혈장 생산물의 부족이 매우 심각하기 때문이다. 비록 혈장이 배양 배지에 존재하는 칼슘에 의해 응집을 초래하지만 본 발명자들은 간단한 피브린-제거 과정 후 CB 혈장을 13일 째 배양액에 첨가하였다. 배양 플라스크의 바닥에 젤 형성을 관찰하는 동안, CB 혈장이 세포 증가 및 성숙에 영향을 미치치 않았다. CB가 항-A 또는 항-B 항체를 가지고 있지 않기 때문에, A, B, O 또는 AB 혈액형을 가지는 여러 기증자들의 것이 풀링된 복합된 혈장은 자기혈장과 비교하여 어떠한 차이도 보이지 않았다(결과를 보이지 않음).

RBC 소스로서 CB의 유용성은 다소 논란거리이다. 인간 배아줄기세포로부터 RBC 발생을 기술한 최근의 보고에 따르면, 배아줄기세포로부터 최종적인 RBC로의 증가 정도가 최대 45%의 탈핵율을 가질 정도로 높지 않았다(Bonig et al, 2008). 또한, Kell 혹은 Rh 시스템 항원들 같은 여러 강한 면역원성의(immunopotent) RBC 항원들의 존재 및 베타 글로빈의 부재로 인해 보편적인 기증자로부터 RBC를 만드는 것이 실제적으로 불가능하다(Bonig et al, 2008). 따라서 CB는 배양된 RBC의 개발에 있어서 매우 중요한 소스를 의미한다. 본 발명에서 세포수의 증가 수준은 다른 연구에서 얻어진 수준과 유사 및 비교할 만하거나 또는 보다 더 높았다. 더 나아가, F68의 증명된 임상적 안정성을 고려하면, 본 발명의 시스템은 이종 오염의 잠재적 위험이 없는 매우 간단하고 편리한 기질이 없는(stroma-free) 시스템이다.

본 발명의 내용을 요약하면, 본 발명자들은 F68 및 CB-유래된 혈장을 도입함으로써 인 비트로 RBC 생성용 기질이 없는 배양 시스템을 확립하였다. F68은 적혈구 형성 말기에 세포막을 안정화시킴으로써 용혈 작용을 최소화시켰다. 본 발명의 발견은 적혈구 형성 과정에 대한 연구에 있어서 효과적인 수단을 제공할 뿐만 아니라 미래에 수혈용 RBC의 대량 생산 시스템을 위한 중요한 고려사항을 제공한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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도 1은 적혈구의 생존에 대한 F68의 효과를 나타내는 결과이다. (A) CD34⁺ 세포에서 증가 배수(fold expasion)를 비교한 그래프로, 13일 째 F68의 첨가가 17일 내지 21일 사이의 말기 적혈구 생성의 과정 동안 세포 파괴를 감소시킨다는 것을 보여주었다. 트립토판 블루 염색(B), 7-AAD(C) 및 카스페이즈-3 분석(D)에 의해 측정된 생존율은 대조군 및 F-68 군 간에 뚜렷한 차이를 나타내지 않았다. 반대로, 아넥신 V-FITC 및 프로피디움 아이오다이드(PI) 염색을 이용하여 아넥신 V-파지티브 부분(E)을 측정하였을 때, F68 없이 배양된 세포에서 에이팝토틱 세포가 더 많다는 것을 확인하였다. 데이터는 평균값 ± SEM(A-D)로 나타내었다.

도 2는 F68의 존재 또는 부재 하에서 삼투 이동에 의한 적혈구의 취약성(fragility)을 비교한 결과이다. 배양된 RBC를 세척한 후, 다른 농도의 NaCl 용액에서 20분 동안 반응시키고 용해되지 않은 세포의 수를 카운트하였다.

도 3은 F68의 존재 또는 부재 하에서 탈핵한 적혈구를 비교한 결과이다. 주사전자현미경을 이용하여 21일 째에 이미지를 얻었다(× 10,000). 탈핵된 건강한 적아 세포(A, B) 및 RBC들(C, D)을 F68의 존재 하에서 관찰하고 F68의 부재 하에서 탈핵된 비정상 적아 세포의 파괴와 비교하였다.

도 4는 탈핵 과정 동안 세포질의 변화를 관찰한 결과이다. 정색성(orthochromic) 적아 세포(A-E) 및 세포질의 활발한 움직임을 관찰하였다. 수직(C) 및 가로(D) 절편에서 핵을 둘러싼 세포질이 나타나기 때문에 기질이 없 는(stroma-free) 배양액에서 탈핵 과정을 관찰하였다. 새로이 형성되는(F) 및 재-구성되는 도넛형 망상 적혈구들이 아직까지 미토콘드리아 같은 미세-소기관들을 포함하는 것을 확인하였다. 허물 벗은(shedding-off) 세포질 및 많은 액포를 가지는 에이팝토틱 세포를 검출하였다(H, I). 투과전자현미경을 이용하여 21일 째에 이미지를 얻었다(×5,000).

도 5는 기질이 없는 배양액에서 조혈모세포의 성숙한 RBC들로의 분화를 관찰한 결과이다. 이미지들은 배양 8일 째 적아 세포(A), 배양 17일 째 정색성(orthochromatophilic) 적아세포(B), 배양 21일 째 핵을 돌출한 적아 세포(C) 및 배양 24일 째에 완전히 탈핵된 RBC들(D)을 나타낸다. 라이트-기엠사(Wright-Giemsa) 염색, × 400. 튜브 안의 배양된 RBC들(E).

도 6은 인 비트로 적혈구의 분화 과정에서 표면 마커들의 변화를 알아본 그래프이다. 헤모글로빈 F가 감소되었다(B). 글라이코포린 A(GPA)는 13일까지 95%까지 발현하였으며, 성숙한 RBC들에서는 발현되지 않는 CD71은 7일 째까지 높게 발현하였으나 그 이후에 감소하였다.

Claims (13)

1. 폴록사머(poloxamer)를 포함하는 배지에서 적혈구 전구세포(erythroid progenitor cell)를 배양하는 단계를 포함하는 적혈구(red blood cell)의 인 비트로 생산 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 적혈구 전구세포는 CD34⁺ 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 적혈구 전구세포는 전적아세포(proerythroblast), 호염기성 적아세포(basophilic erythroblast), 다염기성 적아세포(polychromatophilic erythroblast), 정염성 적아세포(orthochromatic erythroblast) 또는 다염성 적혈구(polychromatic erythrocyte)인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 적혈구 전구세포는 다염기성 적아세포, 정염성 적아 세포 또는 다염성 적혈구인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 배양은 기질세포의 존재 또는 부존재 하에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 4 항에 있어서, 상기 배양은 기질세포의 부존재 하에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1 항에 있어서, 상기 배지는 제대혈 혈장을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1 항에 있어서, 상기 배지는 SCF(stem cell factor), IL-1, IL-3, IL-4, IL-5, IL-11, GM-CSF(granulocyte macrophage-colony stimulating factor), M-CSF(Macrophage Colony-Stimulating Factor), G-CSF(granulocyte-colony stimulating factor) 및 EPO(erythropoietin)로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 하나의 성분을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 1 항에 있어서, 상기 폴록사머는 폴리프로필렌 옥사이드의 분자량이 1,000-3,000 g/mol이고 폴리에틸렌옥사이드의 함량이 50-90%인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 1 항에 있어서, 상기 적혈구 전구세포는 제대혈로부터 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
11. 폴록사머(poloxamer)를 포함하는 적혈구(red blood cell)의 인 비트로 생산용 배지.
12. 제 11 항에 있어서, 상기 배지는 제대혈 혈장을 추가적으로 포함하는 것을 특징을 하는 배지.
13. 제대혈 혈장을 포함하는 적혈구(red blood cell)의 인 비트로 생산용 배지.

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