KR101416954B1 - 조혈세포 분화 유도 방법 - Google Patents

조혈세포 분화 유도 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101416954B1
KR101416954B1 KR1020120100821A KR20120100821A KR101416954B1 KR 101416954 B1 KR101416954 B1 KR 101416954B1 KR 1020120100821 A KR1020120100821 A KR 1020120100821A KR 20120100821 A KR20120100821 A KR 20120100821A KR 101416954 B1 KR101416954 B1 KR 101416954B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
hematopoietic progenitor
cell
gelsolin
group
Prior art date
Application number
KR1020120100821A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20140035002A (ko
Inventor
백은정
이은미
Original Assignee
한양대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한양대학교 산학협력단 filed Critical 한양대학교 산학협력단
Priority to KR1020120100821A priority Critical patent/KR101416954B1/ko
Priority to US14/427,700 priority patent/US9828584B2/en
Priority to EP13836414.6A priority patent/EP2896689B1/en
Priority to PCT/KR2013/008226 priority patent/WO2014042432A1/ko
Publication of KR20140035002A publication Critical patent/KR20140035002A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101416954B1 publication Critical patent/KR101416954B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0641—Erythrocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/15—Cells of the myeloid line, e.g. granulocytes, basophils, eosinophils, neutrophils, leucocytes, monocytes, macrophages or mast cells; Myeloid precursor cells; Antigen-presenting cells, e.g. dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/18—Erythrocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0642—Granulocytes, e.g. basopils, eosinophils, neutrophils, mast cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/99—Serum-free medium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/125—Stem cell factor [SCF], c-kit ligand [KL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/14—Erythropoietin [EPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2303—Interleukin-3 (IL-3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/48—Regulators of apoptosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C12N2506/025—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells from extra-embryonic cells, e.g. trophoblast, placenta
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/11—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 조혈세포 분화 유도 방법을 이용한 인 비트로 적혈구/과립구 생산 및 골수이형성 증후군 치료에 관한 것으로, 겔솔린(gelsolin)을 유효성분으로 포함하는 조혈전구세포로부터 적혈구/과립구로의 분화를 유도하기 위한 배지 조성물 및 겔솔린(gelsolin)을 유효성분으로 포함하는 골수이형성 증후군 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 조혈전구세포의 적혈구/과립구로의 분화 효율을 향상시키면서도 세포이형성증 발생률이 낮고, 탈핵률 및 세포생존률이 향상되는 효과가 있는 바, 체외 적혈구/과립구 생산 및 골수이형성 증후군 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

조혈세포 분화 유도 방법{Method for inducing the differentiation of the hematopoietic cell}
본 발명은 조혈세포 분화 및 성숙 유도 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 적혈구 분화 및 성숙 유도 방법을 이용한 인 비트로 적혈구 생산 및 골수이형성 증후군 치료에 관한 것이다.
인구의 급속한 노령화와 과학 기술의 발달에 따른 의료적 수요의 증가로 인하여 수혈용 적혈구의 사용이 증가하여 수혈용 적혈구 공급이 크게 부족하다. 또한 광우병, 신종플루, 말라리아 등의 질병의 창궐로 인해 헌혈 가능한 사람도 크게 줄었다. 이로 인해 국내는 물론 전 세계적으로 수혈에 필요한 혈액의 부족으로 환자 수술 및 치료에 차질을 빚고 있는 실정이다. 그러나, 향후 이런 혈액 부족은 더욱 심각해져서, 2030년에는 국내 혈액필요량의 55.5%가 부족할 것이라고 예측되고 있다(한국보건사회연구원 자료, 2005년). 게다가 수혈로 인하여 발생될 수 있는 수혈전파감염은 수혈자에게 심각한 문제를 야기하며 이를 사전에 발견하기 위한 검사 및 시스템에 막대한 비용이 쓰이고 있지만 감염을 완벽히 검출해 낼 수 없다(Timmins, N.E.; Nielsen, N.K. Manufactured RBC ?? Rivers of blood, or an oasis in the desert? Biotechnology Advances 29: 661??6; 2011). 이러한 요인들로 인하여 인위적으로 생산된 안전한 적혈구의 개발 필요성이 증가하였다(Olsson, M. L.; Clausen, H. Modifying the red cell surface: towards an ABO-universal blood supply. Br. J. Haematol. 140:3-12; 2008).
도 1은 적혈구가 생성되는 과정을 나타낸 도면이다. 도 1을 참조하면, 적아세포(erythroblasts)는 호염기성 적아세포(basophilic erythroblast)와 다염성 적아세포(polychromatic erythroblast)를 거쳐 정염성 적아세포(orthochromatic erythroblast)에서 망상적혈구(reticulocyte)의 단계로 세포 성숙이 이루어지고, 마지막 망상적혈구가 되기 위해 세포핵이 유출되는 탈핵(enucleation) 과정이 필요하며, 이를 위해 세포막과 세포골격구조(cytoskeleton)의 재구성(remodeling)이 일어난다. 이 과정에 스펙트린(spectrin), 마이크로튜블(microtubules), 비멘틴(vimentin), 엑틴(actin) 필라멘트 (F-actin)와 같은 세포골격(Cytoskeletal) 단백질이 관여한다. 또한 엑틴(actin) 필라멘트는 다양한 단백질(4.1, 4.9 spectrin, adducins, tropomysin, tropomodulin 등)들과 결합하여 막 골격 접합(membrane skeleton junction)을 이루어, 성숙 적혈구의 표면을 형성하게 된다. 그러나, 현재까지 줄기세포 유래 인공혈액 생산 관련한 연구는 대부분 줄기세포 및 전구세포의 증폭에 관하여 대부분의 노력이 집중되고 있을 뿐, 실질적으로 가장 중요하고 해결하기 어려운 단계인 후반부 성숙세포의 더딘 성숙과정, 낮은 탈핵(enucleation)율과 낮은 세포 생존도 및 이를 유발하는 요인 중 하나인 세포이형성증(myelodysplasia)에 대해서는 그 원인과 대안이 알려져 있지 않고 그에 대한 연구가 미비한 실정이다. 상기 세포이형성증은 적혈구생성과정 및 조혈과정에서 유래되는 질병을 이해하기 위해서도 매우 중요한 연구과제이다. 이런 후반부 세포 성숙 및 탈핵 등의 과정은 생체내 적혈구 생성 과정(in vivo erythropoiesis)에서는 정상적으로 일어나고 적혈구로 완성되는데 꼭 필요한 과정으로, 수혈 가능한 인공 적혈구의 체외 생산을 위해서는 정상적인 상황에서 위의 문제들이 효율적으로 조절되는 인 비보 유사(in vivo mimic) 환경의 재현이 필요하다.
한편, 골수이형성 증후군은 진행되는 범혈구 감소, 세포분화/성숙의 이상으로 비효율적 조혈을 특징으로 하는 클론성 악성 혈액질환이다. 이 질환은 수년에 이르는 만성 경과를 보이기도 하고 급성백혈병으로 진행되기도 한다. 상기와 같은 골수이형성 증후군에서는 다양한 분자 이상이 나타나는데 세포 주기와 세포 자살의 변화, DNA 메틸화, 암유전자의 변화 및 골수 미세환경 변화 등의 다양한 형태로 나타난다. 골수이형성 증후군은 일반 백혈병보다 발병율이 높지만, 현재 발병률이 과소평가되고 있다. 서양에서 이 질환 발생 연령의 중앙값은 70세로 보고되고 있고 연령이 증가함에 따라 발생 빈도도 증가한다. 2006년 한 연구보고에 의하면 미국에서 일년에 약 12,000명의 신환이 발생하는 것으로 조사되었다. 건강보험공단 통계에 의하면, 2005년 국내환자는 1,845명이고, 매년 약 600명의 환자가 새로 발생한다.
상기 골수이형성 증후군의 치료에는 전통적으로 최적의 보존적 치료 및 고위험군에서 항암화학요법 및 동종조혈모세포이식술이 시행되어 왔으나, 평균 생존기간은 22개월에 불과하며, 폐암위 환자의 위험군별 생존기간을 비교해 봤을 때 중간생존기간이 비슷한 정도로 매우 심각하여, 예후가 0.4~5.7년에 불과하다. 최근 5년 사이 새로운 개념의 표적치료제에 의해 질환의 생태 변화 및 생존률의 향상을 가져와 이때까지의 치료 원칙인 최적의 보존적치료(best supportive care)를 대체하는 새로운 치료법으로 대두되었고, 다양한 약제와의 조합 치료(combination therapy)를 위한 노력이 계속되고 있다. 이러한 노력의 일환으로서, 골수이형성 증후군의 치료에 효과가 있는 약제의 개발이 계속되고 있지만, 가장 좋은 치료제라 하더라도 치료에 반응하는 환자비율은 40%를 넘지 못한다. 이에, 향후 근본적으로 골수이형성 증후군의 원인에 대응해 치료제를 개발해야 하며, 고령의 환자에게 대부분 시행 가능하지 못한 조혈모세포 이식이 아닌, 단백질 자극에 의한 치료제가 개발되어야 한다.
본 발명의 목적은 세포이형성증 발생률이 낮고 탈핵률과 세포생존률이 높으면서도, 조혈세포로의 분화를 촉진키시는, 조혈세포로의 분화 또는 성숙 유도용 배지 조성물과 이를 이용한 인 비트로에서 적혈구를 생성하는 방법 및 골수이형성 증후군 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 겔솔린(gelsolin)을 유효성분으로 포함하는, 조혈전구세포로부터 적혈구 또는 과립구로의 분화를 유도하기 위한 배지 조성물을 제공한다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 다른 측면은 조혈전구세포를 수득하는 단계; 상기 수득된 조혈전구세포를 겔솔린(gelsolin)과 접촉시키는 단계; 및 상기 겔솔린과 접촉된 조혈전구세포를 18시간 내지 72시간 동안 배양하는 단계를 포함하는, 인 비트로(in vitro)에서의 적혈구 또는 과립구 생산 방법법을 제공한다.
아울러, 상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 또 다른 측면은 겔솔린(gelsolin)을 유효성분으로 포함하는 골수이형성 증후군 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 조혈전구세포의 적혈구 또는 과립구로의 분화 효율을 향상시키면서도 세포이형성증 발생률이 낮고, 탈핵률 및 세포생존률이 향상되는 효과가 있는 바, 체외 적혈구/과립구 생산 및 골수이형성 증후군 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 적혈구가 생성되는 과정을 나타낸 도면이다.
도 2는 겔솔린이 처리/무처리된 호염기성 적아세포의 세포 형태를 관찰한 사진이다.
도 3은 겔솔린이 처리/무처리된 호염기성 적아세포의 분화율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 겔솔린이 처리/무처리된 호염기성 적아세포의 (a)세포이형성률, (b)탈핵률 및 (c)세포생존률을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 겔솔린이 처리/무처리된 다염성 적아세포의 세포 형태를 관찰한 사진이다.
도 6은 겔솔린이 처리/무처리된 다염성 적아세포의 분화율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 겔솔린이 처리/무처리된 다염성 적아세포의 (a)세포이형성률, (b)탈핵률 및 (c)세포생존률을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 인 비트로에서 골수이형성 증후군에 대한 겔솔린이 치료효과를 확인한 결과이다:
(a)는 적혈구로만 분화시킨 제1 대조군 및 제1 실험군에서 겔솔린의 세포성숙율을 관찰한 현미경 사진이고, (b)는 적혈구와 과립구로 동시 분화시킨 제2 대조군 및 제2 실험군에서 겔솔린의 세포성숙율을 관찰한 현미경 사진으로서, 빨간색 별표는 미성숙 적혈구, 검정색 화살표는 과립구, Dys 검정색 화살표는 이형성증을 보이는 세포, Dead 검정색 화살표는 죽은 세포, 검정색 테두리 화살촉은 정염성 적아구, 검정색 화살촉은 탈핵 중인 적혈구를 각각 나타낸다;
(c)는 제1 대조군, 제1 실험군, 제2 대조군 및 제2 실험군에서의 탈핵률을 측정한 결과를 나타내는 그래프이며;
(d)는 제1 대조군, 제1 실험군, 제2 대조군 및 제2 실험군에서의 이형성률을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
먼저, 본 발명의 명세서에서 이용된 용어를 설명한다.
세포, 세포주, 세포 배양물 또는 세포 집단을 언급할 때 본 발명에서 일컫는 '분리된' 또는 '분리'는 시험관 내에서 배양될 수 있는 세포, 세포주, 세포 배양물 또는 세포 집단과 같은 세포의 천연 기원으로부터 실질적으로 분리되는 것을 의미하며, 추가로 둘 이상의 세포 집단으로부터 하나 이상의 세포의 물리적 선별을 의미하며, 여기서 세포는 세포 형태 및/또는 다양한 마커의 발현을 기초로 선택되어 질 수 있다.
본 발명에서 일컫는 '분화'는 그것이 유래된 세포 유형보다 더욱 더 분화된 세포 유형을 생성시키는 것을 의미하며, 이 용어는 부분적으로 및 종국적으로 분화 및 성숙된 세포 유형을 모두 포괄하는 의미이다.
본 발명에서 일컫는 '배지'는 동물 세포의 배양시 사용되는 공지된 배지를 의미하며, 공지의 동물 세포 배양용 배지 또는 이들의 변형된 배지를 모두 포괄하는 의미이다.
또한, 본 발명에서 일컫는 '조혈전구세포'는 조혈모세포(hemocytoblast)를 포함하고, 조혈모세포(hemocytoblast)에서 시작되는 적혈구(erythrocyte) 또는 과립구(granulocyte)의 분화 과정에서 나타나는 모든 종류의 세포들을 총칭하는 의미이다.
또한, 본 발명에서 일컫는 '적혈구 전구세포'는 상기 조혈전구세포 중에서 적혈구로 분화되는 단계에서 나타나는 모든 종류의 세포를 총칭하는 의미이고, 본 발명에서 일컫는 '과립구 전구세포'는 상기 조혈전구세포 중에서 과립구로 분화되는 단계에서 나타나는 모든 종류의 세포를 총칭하는 의미이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
1. 조혈전구세포로부터 적혈구 또는 과립구로의 분화를 유도하기 위한 배지 조성물
본 발명의 일 측면은 겔솔린(gelsolin)을 유효성분으로 포함하는, 조혈전구세포로부터 적혈구 또는 과립구로의 분화를 유도하기 위한 배지 조성물을 제공한다.
본 발명의 배지 조성물은 조혈전구세포로부터 적혈구, 과립구 및 이와 유사한 종류의 세포로 분화 및 성숙을 유도하는 용도로 이용되고, 겔솔린(gelsolin)을 유효성분으로 포함한다.
상기 배지는 적혈구 또는 과립구 분화 유도를 위해 조혈전구세포의 배양에 이용되는 배지로서, 당업자들에게 널리 알려진 동물세포 배양용 배지라면 제한 없이 사용될 수 있다. 상기 배지는 인위적으로 합성하여 제조할 수 있으며, 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수도 있다. 상업적으로 제조되는 배지로서 예를 들면, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, stemlineⅡ, α―MEM(α―Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium), MEF 및 mTeSR-1 등을 사용할 수 있고, stemlineⅡ를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 겔솔린(gelsolin)은 상기 조혈전구세포를 자극하여 적혈구 또는 과립구로의 분화를 유도하고, 특히 적혈구나 과립구로 분화되는 과정에서 필수적으로 수반되는 탈핵(enucleation) 과정을 유도 및 촉진한다.
본 발명의 배지 조성물 내 상기 겔솔린의 함량은 5 nM 내지 1 μM인 것이 바람직하고, 150 nM 내지 500 nM인 것이 더욱 바람직하며, 200 nM 내지 400 nM인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 아니한다. 상기 겔솔린의 함량이 5 nM 미만인 경우에는 적혈구 또는 과립구로의 분화 유도가 효과적으로 일어나지 않는 문제가 있을 수 있고, 반면에 상기 겔솔린의 함량이 1 uM을 초과하는 경우에는 세포 독성이 나타나 세포 생존에 문제가 있을 수 있다.
상기 겔솔린에 의해 적혈구로 분화되는 상기 조혈전구세포는 제대혈 또는 골수 유래의 세포인 것이 바람직하고, 조혈모세포(hemocytoblast), 전적아세포(proerythroblast), 적아세포(erythroblast), 호염기성 적아세포(basophilic erythroblast), 다염성 적아세포(polychromatic erythroblast) 및 정염성 적아세포(orthochromatic erythroblast)로 구성되는 적혈구 전구세포군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 상기 조혈전구세포 중에서도 적혈구로 분화되는 적혈구 전구세포는 CD34 양성 세포인 조혈모세포에서 분화되어 전적아세포(proerythroblast), 적아세포(erythroblast), 호염기성 적아세포와 다염성 적아세포 및 정염성 적아세포를 순차적으로 거쳐 망상적혈구(reticulocyte)의 단계로 세포 성숙이 이루어지므로, 본 발명의 배지 조성물은 상기 각 분화 단계에서의 조혈전구세포로부터 적혈구 세포로의 분화를 유도할 수 있다.
상기 겔솔린에 의해 과립구로 분화되는 조혈전구세포 역시 제대혈 또는 골수 유래의 세포인 것이 바람직하고, 골수아세포(myeloblast), 전골수세포(promyelocyte), 골수세포(myelocyte), 후골수세포(metamyelocyte), 간상핵구(band neutrophil), 단핵모세포(monoblast) 및 원단세포(promonocyte)로 구성되는 과립구 전구세포군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 상기 조혈전구세포 중에서도 과립구로 분화되는 과립구 전구세포는 CD34 양성 세포인 조혈모세포에서 분화되어 골수아세포, 전골수세포, 골수세포 및 후골수세포를 순차적으로 거치는 단계로 세포 성숙이 이루어지므로, 본 발명의 배지 조성물은 상기 각 분화 단계에서의 조혈전구세포로부터 과립구 세포로의 분화를 유도할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 호염기성 적아세포를 200 nM 또는 400 nM의 겔솔린이 포함된 배지에서 배양함으로써 정염성 적아세포로의 분화가 촉진되고(도 2 및 도 3 참조), 이형성된 세포가 현저히 줄고 탈핵률 및 세포생존률이 현저히 증가하였다(도 4 참조). 또한, 정염성 적아세포를 400 nM의 겔솔린이 포함된 배지에서 배양함으로써 낮은 세포이형성률, 높은 분화율, 탈핵률 및 세포 생존률로 성숙한 적혈구가 생성됨을 확인하였다(도 5 내지 도 7 참조).
2. 인 비트로(in vitro)에서의 적혈구/과립구 생산 방법
본 발명의 다른 측면은 인 비트로(in vitro)에서 조혈전구세포로부터 적혈구 또는 과립구를 생산하는 방법을 제공한다.
상기 적혈구 또는 과립구 생산 방법은 1) 조혈전구세포를 수득하는 단계; 2) 상기 단계 1)에서 수득된 조혈전구세포를 겔솔린(gelsolin)과 접촉시키는 단계; 및 3) 상기 단계 2)에서 겔솔린과 접촉된 조혈전구세포를 배양하는 단계를 포함한다.
상기 조혈전구세포 및 겔솔린에 관해서는 상기 " 1. 조혈전구세포로부터 적혈구 또는 과립구로의 분화를 유도하기 위한 배지 조성물 " 항목에서 설명한 바와 동일하다. 따라서 이에 관해서는 상기 " 1. 조혈전구세포로부터 적혈구 또는 과립구로의 분화를 유도하기 위한 배지 조성물 " 항목의 설명을 원용하여 상세한 설명은 생략하도록 하고, 이하에서는 상기 적혈구 또는 과립구 생산 방법에 특이적인 구성에 대해서만 설명한다.
상기 단계 1)의 조혈전구세포를 수득하는 단계는 조혈모세포, 전적아세포, 적아세포, 호염기성 적아세포, 다염성 적아세포 또는 정염성 적아세포 등의 적혈구 전구세포, 또는 골수아세포(myeloblast), 전골수세포(promyelocyte), 골수세포(myelocyte), 후골수세포(metamyelocyte), 간상핵구(band neutrophil), 단핵모세포(monoblast) 또는 원단세포(promonocyte) 등의 과립구 전구세포를 수득하는 단계로서, 상기 조혈전구세포는 제대혈에서 유래한 것이 바람직하다. 또한, 상기 단계 1)의 조혈전구세포를 수득하는 단계는 수득하고자 하는 적혈구 전구세포 또는 과립구 전구세포의 종류에 따라 당업계에 알려진 다양한 방법으로 수행될 수 있다.
일 예로서, 상기 단계 1)에서 수득하고자 하는 조혈전구세포가 조혈모세포인 경우, 상기 조혈전구세포는 상업적으로 입수 가능한 다양한 공지의 키트(예, EasySep CD34 분리 키트)를 이용하여 면역자성 마이크로비드 분리법(Immunomagnetic Microbead Selection Method)으로 CD34 양성 세포를 분리함으로써 수득될 수 있다.
다른 예로서, 상기 단계 1)에서 수득하고자 하는 조혈전구세포가 전적아세포 또는 적아세포인 경우, 상계 단계 1)의 조혈전구세포는 CD34 양성 세포를 하이드로코르티손, SCF, IL-3 및 EPO가 포함된 배지에서 배양하는 단계에 의해 수득될 수 있다. 또한, 상기 단계 1)의 수득하고자 하는 조혈전구세포가 골수아세포 또는 전골수세포인 경우, 상계 단계 1)의 조혈전구세포는 CD34 양성 세포를 하이드로코르티손, SCF, IL-3, EPO 및 TPO가 포함된 배지에서 배양하는 단계에 의해 수득될 수 있다. 배양되는 CD34 양성 세포의 상태 및 분화시키고자 하는 혈구의 종류에 따라 유효성분들(하이드로코르티손, SCF, IL-3, EPO 또는 TPO)의 구체적인 농도 및 배양 기간 등은 당업자가 적절히 조절할 수 있다. 일 예로서, 적혈구 전구세포인 전적아세포 또는 적아세포는 제대혈 유래의 CD34 양성 세포를 8 μM 내지 12 μM의 하이드로코르티손, 90 ng/㎖ 내지 110 ng/㎖의 SCF, 8 ng/㎖ 내지 12 ng/㎖의 IL-3 및 5 IU/㎖ 내지 7 IU/㎖의 EPO가 포함된 배지에서 6 내지 8일 동안 배양하는 단계에 의해 수득될 수 있다.
또 다른 예로서, 상기 단계 1)에서 수득하고자 하는 조혈전구세포가 호염기성 적아세포, 다염성 적아세포 또는 정염성 적아세포인 경우, 상계 단계 1)의 조혈전구세포는 1')적아세포(erythroblast)를 SCF, IL-3 및 EPO가 포함된 배지에서 1차 배양하는 단계; 및 2') 상기 1차 배양된 세포를 SCF 및 EPO가 포함된 배지에서 2차 배양하는 단계에 의해 수득될 수 있다. 배양되는 CD34 양성 세포의 상태에 따라 유효성분들(하이드로코르티손, SCF, IL-3 및 EPO)의 구체적인 농도 및 배양 기간 등은 당업자가 적절히 조절할 수 있으나, 바람직하게는 1') 제대혈 유래의 적아세포(erythroblast)를 40 ng/㎖ 내지 60 ng/㎖의 SCF, 8 ng/㎖ 내지 12 ng/㎖의 IL-3 및 2 IU/㎖ 내지 4 IU/㎖의 EPO가 포함된 배지에서 5일 내지 7일 동안 1차 배양하는 단계; 및 2') 상기 1차 배양된 세포를 40 ng/㎖ 내지 60 ng/㎖의 SCF 및 1 IU/㎖ 내지 3 IU/㎖의 EPO가 포함된 배지에서 1일 내지 3일 동안 2차 배양하는 단계에 의해 수득될 수 있다.
상계 단계 2)의 접촉은 상기 단계 1)에서 수득된 조혈전구세포를 겔솔린으로 자극하여 적혈구 또는 과립구로의 분화 및 성숙을 유도하는 단계로서, 상기 겔솔린은 독립적으로 상기 조혈전구세포에 처리될 수도 있고, 상기 조혈전구세포 배양용 배지 내에 포함되어 상기 조혈전구세포에 처리될 수도 있다. 상기 겔솔린이 상기 배양용 배지 내에 포함되어 상기 조혈전구세포에 처리되는 경우, 상기 단계 2)의 접촉과 상기 단계 3)의 배양은 동시에 수행될 수 있다.
상기 겔솔린이 상기 배양용 배지 내에 포함되어 상기 조혈전구세포에 처리되는 경우, 상기 배지는 겔솔린을 5 nM 내지 1 μM의 농도로 포함하는 것이 바람직하고, 150 nM 내지 500 nM의 농도로 포함하는 것이 더욱 바람직하며, 200 nM 내지 400 nM의 농도로 포함하는 것이 가장 바람직하다. 상기 겔솔린의 함량이 5 nM 미만인 경우에는 적혈구 또는 과립구로의 분화 유도가 효과적으로 일어나지 않는 문제가 있을 수 있고, 반면에 상기 겔솔린의 함량이 1 uM을 초과하는 경우에는 세포 독성이 나타나 세포 생존에 문제가 있을 수 있다.
상기 단계 3)의 배양은 상기 단계 2)에서 유도된 분화 및 성숙을 진행시키는 단계로서, 단계 1)에서 수득된 조혈전구세포의 종류에 따라 18시간 내지 72시간 동안 진행되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 상기 단계 1)에서 수득된 조혈전구세포가 적혈구 전구체포인 호염기성 적아세포인 경우에는 상기 단계 2)의 배양은 48시간 이상 진행되는 것이 바람직하고, 상기 단계 1)에서 수득된 조혈전구세포가 적혈구 전구체포인 다염성 적아세포인 경우에는 상기 단계 2)의 배양은 24시간 이상 진행되는 것이 바람직하다. 물론, 상기 단계 1)에서 수득된 적혈구 전구세포가 조혈모세포이거나 전적아세포 또는 적아세포인 경우에는 상기 단계 2)의 배양 시간은 더욱 길어진다.
상기 적혈구/과립구 생산 방법은 상기 적혈구 또는 과립구의 분화 과정에서 각 단계에의 조혈전구세포의 분화능을 향상시킴으로써 인 비트로(in vitro)에서 효율적인 적혈구 또는 과립구의 생산이 가능하도록 한다. 특히, 종래 인 비트로 환경에서 잘 해결되지 않던 탈핵 과정을 촉진할 수 있는 효과가 있는 바, 인 비트로에서의 적혈구 또는 과립구 생산 효율을 현저히 높일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 정염성 적아세포를 400 nM의 겔솔린이 포함된 배지에서 24시간 배양함으로써 낮은 이형성률, 높은 분화율, 높은 탈핵률 및 높은 세포생존률로 성숙한 적혈구를 생산하였다(도 5 내지 도 7 참조).
3. 골수이형성 증후군 치료용 조성물
본 발명의 또 다른 측면은 겔솔린(gelsolin)을 유효성분으로 포함하는 골수이형성 증후군 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 골수이형성 증후군(Myelodysplastic Syndrome, MDS)은 조혈모세포의 다양한 이상에 의해 유발되는 질환으로서, 백혈구, 적혈구 및 혈소판 등 모든 종류의 혈구세포의 모양에 이상이 발생하며, 결국 골수 내에 세포가 쌓이고, 말초혈액에는 혈구세포가 부족한 상황이 반복되는 질환을 의미하는 것으로서, 이형성된 세포의 형태학(morphology)적 소견에 따라 크게 ①과립구 계열(granulocytic series), ②적혈구 계열(erythroid series) 및 ③거핵구 계열(Megakaryocytic series)로 나뉘어진다. 상기 골수이형성 증후군은 골수혈구형성 장애, 말초 혈액 혈구감소증 및 가변적인 급성 백혈병으로 진행할 위험성이 있으며, 결과적으로 비효율적인 혈액 세포 생산을 가져올 수 있다. 따라서, 골수이형성 증후군의 치료라는 측면에서 조혈세포의 이형성 억제 인자는 조혈세포의 분화 및 성숙을 자극하여 성숙한 혈구세포를 후속적으로 증식시키는데 이용될 수 있다.
상기 겔솔린(gelsolin)은 상기와 같은 조혈세포의 이형성 억제 인자의 하나로서, 조혈전구세포의 성숙에 따른 낮은 생존도와 세포 성숙을 효율적으로 조절하고 탈핵률을 증가시킴으로써 성숙한 적혈구 또는 과립구의 생성을 유도하므로 골수이형성 증후군, 특히 적혈구 계열(erythroid series) 골수이형성 증후군 또는 과립구 계열(myeloid series) 골수이형성 증후군과 같은 질병의 치료제의 유효성분으로서 사용할 수 있다. 본 발명이 구체적인 실시예에서는 골수이형성 증후군 환자에서 채취한 골수세포에 400 nM의 겔솔린을 처리하여 적혈구 전구세포 및 과립구 세포에서 이형성률과 탈핵률을 감소시키고, 분화율을 향상시킴으로써(도 8 참조), 본 발명의 겔솔린이 골수이형성 증후군의 치료제로서 이용될 수 있음을 확인하였다.
상기 겔솔린에 추가하여 이와 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 투여를 위해서는 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화 할 수 있다. 더 나아가 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 골수이형성 증후군 치료용 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명에 따른 겔솔린의 일일 투여량은 0.01 ~ 5000 ㎎/㎏이며, 바람직하게는 0.01 ~ 10 ㎎/㎏이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
조혈전구세포의 준비
<1-1> 제대혈 유래의 CD34 양성 세포의 분리
한양대학교 서울병원 산부인과에 내원한 건강한 산모에게 상세히 설명하고 분만 전에 제대혈 기증 동의서를 받은 후, 출산 직후 제대에서 약 50 ㎖ 내지 150 ㎖의 제대혈을 채취하였다. 상기와 같이 채취한 제대혈로부터 EasySep CD34 분리 키트(StemCell Technologies, 캐나다)를 이용하여 면역자성 마이크로비드 분리법(Immunomagnetic Microbead Selection Method, Partington et al., J. Immunol. Methods. 1999 Mar 4;223(2):195-205)에 따라 CD34 양성 세포를 분리하였다.
<1-2> 적아세포(erythroblast)로의 분화 및 증식
상기 실시예 <1-1>에서 분리된 CD34 양성 세포(5×104 cells/㎖)를 10 μM의 하이드로코르티손(hydrocortisone)(Sigma, 미국), 100 ng/㎖l의 SCF(Stem Cell Factor)(R&D Systems, 미국), 10 ng/㎖l의 IL-3(R&D Systems, 미국) 및 6 IU/㎖의 EPO(erythropoietin)(Calbiochem, 미국)이 포함된 무혈장(plasma-free) 및 무혈청(serum-free) StemlineⅡ(Sigma, 미국)에서 18일 동안 현탁배양(suspension culture)하여 적아세포(erythroblast)로 분화 및 증식시켰다. 상기 현탁배양은 37 ℃의 CO2 인큐베이터(Sanyo, 일본)에서 진행되었다.
<1-3> 호염기성 적아세포(basophilic erythroblast)로의 분화
상기 실시예 <1-2>에서 수득된 적아세포를 50 ng/㎖l의 SCF(Stem Cell Factor)(R&D Systems, 미국) 및 2 IU/㎖의 EPO(erythropoietin)(Calbiochem, 미국)이 포함된 무혈장(plasma-free) 및 무혈청(serum-free) StemlineⅡ(Sigma, 미국)에서 2일 동안 현탁배양(suspension culture)하여 적혈구 전구세포의 일종인 호염기성 적아세포(basophilic erythroblast)로 분화 및 증식시켰다. 상기 현탁배양은 37 ℃의 CO2 인큐베이터(Sanyo, 일본)에서 진행되었다.
<1-4> 다염성 적아세포(polychromatic erythroblast)로의 분화
상기 실시예 <1-2>에서 수득된 적아세포를 50 ng/㎖l의 SCF(Stem Cell Factor)(R&D Systems, 미국) 및 2 IU/㎖의 EPO(erythropoietin)(Calbiochem, 미국)이 포함된 무혈장(plasma-free) 및 무혈청(serum-free) StemlineⅡ(Sigma, 미국)에서 4일 동안 현탁배양(suspension culture)하여 적혈구 전구세포의 일종인 다염성 적아세포(polychromatic erythroblast)로 분화 및 증식시켰다. 상기 현탁배양은 37 ℃의 CO2 인큐베이터(Sanyo, 일본)에서 2일 마다 배지를 교체하면서 진행되었다.
겔솔린(gelsolin)의 분화 유도 효과 확인
<2-1> 겔솔린의 조혈전구세포 성숙 유도 효과 확인
<2-1-1> 적혈구 전구세포의 성숙 유도
상기 실시예 <1-3>에서 수득한 호염기성 적아세포를 24웰 페트리 디쉬에 1×106 cells/㎖의 농도로 분주한 다음, 2시간 경과 후에 겔솔린(Adipo Bioscience, 미국)을 0 nM, 200 nM 및 400 nM의 농도로 각각 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 세포원심분리기(Cellspin)(한일과학산업(주), 한국)를 이용한 사이토스핀법으로 상기와 같이 배양된 세포의 슬라이드 도말표본을 제작하였다.
<2-1-2> 유도/성숙 효과 확인
상기 실시예 <2-1-1>에서 제작된 표본을 Tripan blue(Sigma-Aldrich, 미국)로 염색하여 세포생존률(viability)을 측정하였다. 또한, 상기 표본을 Wright-Giemsa(Sigma-Aldrich, 미국)로 염색한 후, 상기 염색된 세포의 영상을 디지털카메라((Eclipse TE2000-U)(Nikon, 일본)로 촬영하여 세포형태를 관찰하였고, 400개의 세포를 계수하여 세포성숙율(cell maturation status), 이형성률(dysplasia) 및 탈핵률(nucleation)을 측정하였다.
먼저, 세포의 형태를 관찰한 결과, 겔솔린을 처리하지 않은 호염기성 적아세포에서는 다핵화된 세포, 단편화된 핵을 가진 세포 등의 세포이형성증을 나타내는 세포(적색 별표)가 관찰되었으나, 400 nM의 겔솔린이 처리된 호염기성 적아세포는 상기와 같은 세포이형성증이 관찰되지 않았다(도 2). 또한 세포성숙율을 측정한 결과, 겔솔린을 처리 하지 않은 군에서는 호염기성 적아세포 및 다염성 적아세포의 비율이 43.4 %로 측정되었으나, 200 nM 및 400 nM의 겔솔린을 처리한 군에서는 호염기성 적아세포는 거의 관찰되지 않았고, 다염성 적아세포가 각각 19.4 % 및 26.5 %로 측정되었다(도 3). 특히, 겔솔린을 처리하지 않은 군에 비하여, 겔솔린을 처리한 군에서의 정염성 적아세포(orthochromatic erythroblast)의 15 % 이상 증가하였다(도 3). 상기와 같은 결과로부터, 호염기성 적아세포가 정염성 적아세포로 분화되는 과정에서 겔솔린이 그 분화를 촉진시킴을 알 수 있다.
이형성률을 측정한 결과, 겔솔린을 처리하지 않은 군에 비하여, 200 nM 및 400 nM의 겔솔린을 처리한 군에서 이형성률이 각각 19 % 및 15 % 감소하였다(도 4의 (a)). 탈핵률의 경우, 겔솔린을 처리하지 않은 군에 비하여, 200 nM의 겔솔린을 처리한 군에서는 탈핵률이 증가하지 않았지만, 400 nM의 겔솔린을 처리한 군에서는 탈핵률이 44.5 % 증가하였다(도 4의 (b)). 마지막으로 세포생존률을 측정한 결과, 겔솔린을 처리하지 않은 군에 비하여, 200 nM 및 400 nM의 겔솔린을 처리한 군에서 세포생존률이 각각 5 % 및 8 % 증가하였다(도 4의 (c)).
상기와 같은 결과로부터, 호염기성 적아세포에 겔솔린을 처리함으로써 호염기성 적아세포의 분화 및 성숙을 유도할 수 있음을 알 수 있다.
<2-2> 겔솔린의 적혈구 생성 유도 효과 확인
<2-2-1> 적혈구의 생성 유도
상기 실시예 <1-4>에서 수득한 다염성 적아세포를 24웰 페트리 디쉬에 1×106 cells/㎖의 농도로 분주한 다음, 2시간 경과 후에 겔솔린(Adipo Bioscience, 미국)을 0 nM 및 400 nM의 농도로 각각 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 세포원심분리기(Cellspin)(한일과학산업(주), 한국)를 이용한 사이토스핀법으로 상기와 같이 배양된 세포의 슬라이드 도말표본을 제조하였다.
<2-2-2> 유도 효과 확인
상기 실시예 <2-2-1>에서 제작된 표본을 Tripan blue(Sigma-Aldrich, 미국)로 염색하여 세포생존률(viability)을 측정하였다. 또한, 상기 표본을 Wright-Giemsa(Sigma-Aldrich, 미국)로 염색한 후, 상기 염색된 세포의 영상을 디지털카메라((Eclipse TE2000-U)(Nikon, 일본)로 촬영하여 세포형태를 관찰하였고, 400개의 세포를 계수하여 세포성숙율(cell maturation status), 이형성률(dysplasia) 및 탈핵률(nucleation)을 측정하였다.
먼저, 세포의 형태를 관찰한 결과, 겔솔린을 처리하지 않은 다염성 적아세포에서는 다염성 적아세포가 상당부분 남아 있고, 분화된 정염성 적아세포의 비율이 적을 뿐만 아니라, 세포의 크기가 매우 크고 불규칙하며 핵분열 이상을 보이는 세포이형성증을 나타내는 세포가 관찰되었다. 반면, 400 nM의 겔솔린이 처리된 다염성 적아세포는 정염성 적아세포(orthochromatic erythroblast)가 많이 관찰되며 세포나 핵이 균일하여 정상적으로 성숙되고 있었고, 세포이형성증은 관찰되지 않았다(도 5). 이를 객관적으로 정량화하기 위해, 상기 염색하여 촬영한 세포에서 각 실험 조건마다 핵 크기에 대해서는 150개 내지 200개의 세포 이미지를, 세포 크기에 대해서는 약 400개의 세포 이미지를 캡쳐하여, image J 프로그램으로 세포와 핵의 면적 및 변이 정도를 산출하였고, Prism software(Prism, Version 5.0; GraphPad)로 통계분석하였다. 적혈구는 세포 성숙이 진행됨에 따라 세포 면적이 약 20% 감소하는데, 세포 전체 면적은 대조군과 겔솔린을 처리 한 군에서 각각 mean+/-SD 가 119.2+/-53.93와 114.8+/-44.09 (임의 단위(arbitary units))로, 겔솔린을 처리 군에서 유의하게 작은 크기와(t-test, p-value < 0.0001) 낮은 표준편차(Std. Deviation, SD)값을 보여 크기의 분포도 더 일정함을 확인하였다. 세포 핵 면적은 대조군과 겔솔린을 처리 한 군에서 각각 mean+/-SD 가 115.35+/-80.45와 92.4+/-42.57 (임의 단위)로서 겔솔린 처리 군에서 유의하게 작은 핵 크기와(t-test, p-value < 0.0001) 낮은 표준편차(Std. Deviation, SD)값을 보여 핵의 크기 분포도 더 일정함을 확인하였다.
또한, 세포성숙율을 측정한 결과, 겔솔린을 처리 하지 않은 군에서는 다염성 적아세포의 비율이 59.7 %로 측정되었으나, 400 nM의 겔솔린을 처리한 군에서는 다염성 적아세포가 43.8 %로 측정되었다(도 6). 특히, 겔솔린을 처리하지 않은 군에 비하여, 400 nM의 겔솔린을 처리한 군에서의 성숙한 적혈구가 15 % 이상 증가하였다(도 6). 상기와 같은 결과로부터, 다염성 적아세포가 적혈구로 분화되는 과정에서 겔솔린이 그 분화를 촉진시킴을 알 수 있다.
이형성률을 측정한 결과, 겔솔린을 처리하지 않은 군에 비하여, 400 nM의 겔솔린을 처리한 군에서 이형성률이 20 % 감소하였다(도 7의 (a)). 탈핵률의 경우, 겔솔린을 처리하지 않은 군에 비하여, 400 nM의 겔솔린을 처리한 군에서 탈핵률이 3배 정도 증가하였다(도 7의 (b)). 마지막으로 세포생존률을 측정한 결과, 겔솔린을 처리하지 않은 군에 비하여, 400 nM의 겔솔린을 처리한 군에서 세포생존률이 각각 5 % 증가하였다(도 7의 (c)).
상기와 같은 결과로부터, 다염성 적아세포에 겔솔린을 처리함으로써 적혈구로의 분화 및 성숙을 유도할 수 있음을 알 수 있다.
골수이형성 증후군(Myelodysplastic Syndrome, MDS)의 치료 효과 확인
겔솔린이 정상 조혈모세포의 인 비트로(in vitro) 분화 시 발생하는 이형성증을 감소시키는 효과가 있음을 확인 한 상기 <실시예 2>에 더불어, 상기 겔솔린이 실제 병리학적으로 발생하는 골수이형성 증후군을 치료하는데 효과가 있는지 확인하였다.
<3-1> 인 비트로(in vitro)에서의 MDS 치료 효과 확인
한양대학교 서울병원 혈액종양내과에서 골수이형성 증후군(Refractory cytopenia with multilineage dysplasia, RCMD)으로 진단받은 환자에게 상세히 설명하고 골수세포 기증 동의서를 받은 후, 치료 전에 골수에서 약 3 ㎖의 골수세포를 채취하였다.
상기와 같이 채취된 골수세포를 하기 표 1과 같은 조성의 배양배지에서 24시간 동안 현탁배양(suspension culture)하여 분화 및 증식시켰다. 상기 현탁배양은 37 ℃의 CO2 인큐베이터(Sanyo, 일본)에서 진행되었다.
Figure 112012073541816-pat00001
상기와 같이 현탁배양된 세포를 Wright-Giemsa(Sigma-Aldrich, 미국)로 염색한 후, 상기 염색된 세포의 영상을 디지털카메라((Eclipse TE2000-U)(Nikon, 일본)로 촬영하여 세포형태를 관찰하였고, 1500개의 세포를 계수하여 세포성숙율(cell maturation status), 탈핵률(nucleation) 및 이형성률(dysplasia)을 측정하였다.
먼저, TPO를 처리하지 않아 순수하게 적혈구로의 분화만을 유도한 제1 대조군 및 제1 실험군에서 세포성숙률을 비교한 결과, 겔솔린을 처리하지 않은 제1 대조군에서는 성숙한 정염성 적아세포의 비율이 62.5 %인 반면, 겔솔린을 처리한 제1 실험군에서는 성숙한 정염성 적아세포의 비율이 94 %로 나타났다(도 8의 (a)). 상기와 같은 결과로부터, 겔솔린의 처리에 의해 적혈구 계열의 세포가 높은 순도로 배양됨을 확인하였다.
다음으로, EPO와 함께 TPO를 처리하여 적혈구와 과립구로의 동시 분화를 유도한 제2 대조군 및 제2 실험군에서 세포성숙률을 비교한 결과, 제2 대조군 및 제2 실험군에서 각각 49.2% 및 50.8 %의 세포가 과립구 계열로 분화되었고, 48시간 이후에는 겔솔린을 처리하지 않은 제2 대조군에서는 과립구계세포는 대부분 사멸되어 관찰되지 않았고, 정염성 적아세포만이 일부가 이형성증을 나타내며 관찰되었다. 반면, 겔솔린이 첨가된 제2 실험군에서는 48시간이 경과한 후에도 과립구 계열의 세포가 지속적으로 관찰(47.6 %)되었고, 미성숙한 세포 없이 정상적으로 분화된 성숙한 적혈구들이 관찰(93.1 %)되었다(도 8의 (b)).
또한, 탈핵률을 분석한 결과, 겔솔린을 처리하지 않은 제1 대조군 및 제2 대조군에서는 각각 7.8 % 및 18.9 %의 탈핵률을 나타내었으나, 겔솔린을 처리한 제1 실험군 및 제2 실험군에서는 각각 12 % 및 42 %의 탈핵률을 나타내었다(도 8의 (c)). 겔솔린의 처리에 의하여, 탈핵률이 약 2배 정도 향상되었다.
마지막으로, 이형성률을 분석한 결과, 겔솔린을 처리하지 않은 제1 대조군 및 제2 대조군에서는 각각 9.4 % 및 13.5 %의 이형성률을 나타내었으나, 겔솔린을 처리한 제1 실험군 및 제2 실험군에서는 각각 6 % 및 4 %의 이형성률을 나타내었다(도 8의 (d)).
상기와 같은 결과로부터, 겔솔린은 골수이형성 증후군 환자에서 유래한 골수세포의 분화 및 탈핵을 촉진함으로써, 비정상의 골수세포의 이형성증을 감소 또는 완화시킴을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 겔솔린은 골수이형성 증후군의 치료제로서 이용될 수 있다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.

Claims (15)

  1. 겔솔린(gelsolin)을 유효성분으로 포함하는, 조혈전구세포로부터 적혈구 또는 과립구로의 분화를 유도하기 위한 배지 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조혈전구세포는 조혈모세포(hemocytoblast), 전적아세포(proerythroblast), 적아세포(erythroblast), 호염기성 적아세포(basophilic erythroblast), 다염성 적아세포(polychromatic erythroblast) 및 정염성 적아세포(orthochromatic erythroblast)로 구성되는 적혈구 전구세포 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조혈전구세포는 골수아세포(myeloblast), 전골수세포(promyelocyte), 골수세포(myelocyte), 후골수세포(metamyelocyte), 간상핵구(band neutrophil), 단핵모세포(monoblast) 및 원단세포(promonocyte)로 구성되는 과립구 전구세포 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 조혈전구세포는 제대혈 또는 골수 유래인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 겔솔린은 5 nM 내지 1 μM의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 겔솔린은 상기 조혈전구세포의 탈핵(enucleation)을 촉진하는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
  7. 조혈전구세포를 수득하는 단계;
    상기 수득된 조혈전구세포를 겔솔린(gelsolin)과 접촉시키는 단계; 및
    상기 겔솔린과 접촉된 조혈전구세포를 18시간 내지 72시간 동안 배양하는 단계를 포함하는, 인 비트로(in vitro)에서의 적혈구 또는 과립구 생산 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 조혈전구세포는 조혈모세포(hemocytoblast), 전적아세포(proerythroblast), 적아세포(erythroblast), 호염기성 적아세포(basophilic erythroblast), 다염성 적아세포(polychromatic erythroblast) 및 정염성 적아세포(orthochromatic erythroblast)로 구성되는 적혈구 전구세포 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 인 비트로(in vitro)에서의 적혈구 또는 과립구 생산 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 조혈전구세포는 상기 조혈전구세포는 골수아세포(myeloblast), 전골수세포(promyelocyte), 골수세포(myelocyte), 후골수세포(metamyelocyte), 간상핵구(band neutrophil), 단핵모세포(monoblast) 및 원단세포(promonocyte)로 구성되는 과립구 전구세포 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 인 비트로(in vitro)에서의 적혈구 또는 과립구 생산 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 조혈전구세포는 제대혈 또는 골수 유래인 것을 특징으로 하는 인 비트로(in vitro)에서의 적혈구 또는 과립구 생산 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 호염기성 적아세포, 다염성 적아세포 또는 정염성 적아세포를 수득하는 단계는
    적아세포(erythroblast)를 SCF, IL-3 및 EPO가 포함된 배지에서 5일 내지 7일 동안 1차 배양하는 단계; 및
    상기 1차 배양된 세포를 SCF 및 EPO가 포함된 배지에서 1일 내지 5일 동안 2차 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 인 비트로(in vitro)에서의 적혈구 또는 과립구 생산 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 전적아세포 또는 적아세포는 제대혈 유래의 조혈모세포(hemocytoblast)를 하이드로코르티손, SCF, IL-3 및 EPO가 포함된 배지에서 6 내지 8일 동안 배양하는 단계에 의해 수득되는 것을 특징으로 하는 인 비트로(in vitro)에서의 적혈구 또는 과립구 생산 방법.
  13. 제7항에 있어서, 상기 겔솔린은 5 nM 내지 1 μM의 농도로 배지에 포함되는 것을 특징으로 하는 인 비트로(in vitro)에서의 적혈구 또는 과립구 생산 방법.
  14. 겔솔린(gelsolin)을 유효성분으로 포함하는 골수이형성 증후군 치료용 약학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 골수이형성 증후군은 적혈구 계열(erythroid series) 또는 과립구 계열(myeloid series)의 골수이형성 증후군인 것을 특징으로 하는 골수이형성 증후군 치료용 약학적 조성물.
KR1020120100821A 2012-09-12 2012-09-12 조혈세포 분화 유도 방법 KR101416954B1 (ko)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120100821A KR101416954B1 (ko) 2012-09-12 2012-09-12 조혈세포 분화 유도 방법
US14/427,700 US9828584B2 (en) 2012-09-12 2013-09-11 Method for inducing hemoblast differentiation
EP13836414.6A EP2896689B1 (en) 2012-09-12 2013-09-11 Method for inducing hemoblast differentiation
PCT/KR2013/008226 WO2014042432A1 (ko) 2012-09-12 2013-09-11 조혈세포 분화 유도 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120100821A KR101416954B1 (ko) 2012-09-12 2012-09-12 조혈세포 분화 유도 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140035002A KR20140035002A (ko) 2014-03-21
KR101416954B1 true KR101416954B1 (ko) 2014-07-16

Family

ID=50278464

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020120100821A KR101416954B1 (ko) 2012-09-12 2012-09-12 조혈세포 분화 유도 방법

Country Status (4)

Country Link
US (1) US9828584B2 (ko)
EP (1) EP2896689B1 (ko)
KR (1) KR101416954B1 (ko)
WO (1) WO2014042432A1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100081678A (ko) * 2009-01-07 2010-07-15 연세대학교 산학협력단 임상―등급 적혈구의 인 비트로 대량 생산 방법
KR20120003760A (ko) * 2010-07-05 2012-01-11 고려대학교 산학협력단 인간 배아줄기세포로부터 분화된 간세포를 배양한 조건배지를 함유하는 간질환 치료용 조성물

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5691160A (en) * 1992-08-14 1997-11-25 Biogen, Inc. Effects of actin filaments of fibrin clot structure and lysis
CA2488013A1 (en) 2002-05-30 2003-12-11 Celgene Corporation Methods of using jnk or mkk inhibitors to modulate cell differentiation and to treat myeloproliferative disorders and myelodysplastic syndromes
US9408891B2 (en) * 2003-11-12 2016-08-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of using gelsolin to treat or prevent bacterial sepsis
AT500483B1 (de) * 2004-07-13 2006-01-15 Mattner Frank Dr Set zur vorbeugung oder behandlung der alzheimer'schen erkrankung
ES2641879T3 (es) * 2006-03-15 2017-11-14 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Uso de gelsolina para diagnosticar y tratar enfermedades inflamatorias
EP2002258B1 (en) * 2006-03-15 2017-09-27 The Brigham and Women's Hospital, Inc. Use of gelsolin to treat multiple sclerosis and to diagnose neurologic diseases

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100081678A (ko) * 2009-01-07 2010-07-15 연세대학교 산학협력단 임상―등급 적혈구의 인 비트로 대량 생산 방법
KR20120003760A (ko) * 2010-07-05 2012-01-11 고려대학교 산학협력단 인간 배아줄기세포로부터 분화된 간세포를 배양한 조건배지를 함유하는 간질환 치료용 조성물

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
논문1;ASIAN PACIFIC J CANCER PREV *
논문2;CANCER RESEARCH 60 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20140035002A (ko) 2014-03-21
US20160060600A1 (en) 2016-03-03
EP2896689A1 (en) 2015-07-22
WO2014042432A1 (ko) 2014-03-20
EP2896689B1 (en) 2019-04-10
US9828584B2 (en) 2017-11-28
EP2896689A4 (en) 2015-11-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7758857B2 (en) Stimulation of hematopoiesis by ex vivo activated immune cells
Mao et al. Glycyrrhizic acid promotes M1 macrophage polarization in murine bone marrow‐derived macrophages associated with the activation of JNK and NF‐κB
CN109722415A (zh) 一种造血干细胞的培养组合物、培养基以及造血干细胞的培养方法
Sun et al. Improvement of icaritin on hematopoietic function in cyclophosphamide-induced myelosuppression mice
CN107475192B (zh) 一种以记忆干t细胞为主要成分的淋巴细胞群及其体外高效扩增方法
WO2022188788A1 (zh) 肝病调控制剂及其应用
Tavassoli Handbook of the hemopoietic microenvironment
KR101400900B1 (ko) 탄시논을 유효성분으로 함유하는 자연살해세포 분화 또는 활성 증진용 조성물
WO2020077343A1 (en) Hematopoietic stem and progenitor cell expansion system
Zhang et al. Enhancing and stabilization of cord blood regulatory T-cell suppressive function by human mesenchymal stem cell (MSC)-derived exosomes
CN107119015B (zh) 外泌体、其制备方法及其在制备治疗肺癌的药物中的应用
KR101416954B1 (ko) 조혈세포 분화 유도 방법
CN107502592A (zh) 一种免疫细胞无血清培养基及其制备方法
US11642373B2 (en) Cancer-killing cells
Erie et al. MHC class II upregulation and colocalization with Fas in experimental models of immune-mediated bone marrow failure
CN111758963A (zh) 甘草次酸防治干细胞衰老的应用
CN108148801A (zh) 多不饱和脂肪酸体外扩增髓系来源的抑制性细胞的方法
US20150353897A1 (en) Method of generating multilineage potential cells
CN105176928A (zh) 一种用于肿瘤细胞免疫治疗的高细胞毒活性cik细胞
Wang et al. An in vitro study of differentiation of hematopoietic cells to endothelial cells
KR102032384B1 (ko) 제대혈 단핵세포에서의 자연살해세포의 제조 방법
EP4366745A1 (en) Mesenchymal stem cells for use in the treatment of chronic kidney disease
Miller et al. An extract from North American ginseng stimulates spontaneous immunity in infant mice: sustained, augmented immunity in adulthood long after withdrawal of the extract
Nesi A study on tumor microenvironment: from metabolism to immunotherapy.
JP2023542640A (ja) 幹細胞機能を向上させるための組成物及び方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
PA0109 Patent application

Patent event code: PA01091R01D

Comment text: Patent Application

Patent event date: 20120912

PA0201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20131128

Patent event code: PE09021S01D

PG1501 Laying open of application
E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

Patent event code: PE07011S01D

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event date: 20140626

GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20140702

Patent event code: PR07011E01D

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20140703

End annual number: 3

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180702

Year of fee payment: 5

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20180702

Start annual number: 5

End annual number: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190624

Year of fee payment: 6

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20190624

Start annual number: 6

End annual number: 6

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20200701

Start annual number: 7

End annual number: 7

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20210702

Start annual number: 8

End annual number: 8

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20220701

Start annual number: 9

End annual number: 9

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20230628

Start annual number: 10

End annual number: 10

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20240701

Start annual number: 11

End annual number: 11