CN108148801A - 多不饱和脂肪酸体外扩增髓系来源的抑制性细胞的方法 - Google Patents

多不饱和脂肪酸体外扩增髓系来源的抑制性细胞的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108148801A
CN108148801A CN201611108030.XA CN201611108030A CN108148801A CN 108148801 A CN108148801 A CN 108148801A CN 201611108030 A CN201611108030 A CN 201611108030A CN 108148801 A CN108148801 A CN 108148801A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polyunsaturated fatty
fatty acid
bone marrow
cell
system source
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201611108030.XA
Other languages
English (en)
Inventor
鄢德洪
万晓春
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Original Assignee
Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS filed Critical Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority to CN201611108030.XA priority Critical patent/CN108148801A/zh
Publication of CN108148801A publication Critical patent/CN108148801A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602Vertebrate cells
    • C12N5/0652Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0669Bone marrow stromal cells; Whole bone marrow
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30Organic components
    • C12N2500/36Lipids
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30Organic components
    • C12N2500/44Thiols, e.g. mercaptoethanol
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/22Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种多不饱和脂肪酸体外扩增髓系来源的抑制性细胞的方法,该方法包括:取动物股骨和胫骨,用培养液冲洗骨髓,获得骨髓细胞悬液;向上述骨髓细胞悬液中加入红细胞裂解液进行裂解处理;裂解处理后的细胞悬液进行离心,得到骨髓细胞;将骨髓细胞于加入多不饱和脂肪酸与粒细胞‑巨噬细胞集落刺激因子的培养液中培养,获得髓系来源的抑制性细胞。本发明的方法简单,可快速获得有抑制功能的、非肿瘤来源的、安全的髓系来源的抑制性细胞,可用于炎症、自身免疫性等疾病的细胞治疗。

Description

多不饱和脂肪酸体外扩增髓系来源的抑制性细胞的方法
技术领域
本发明是关于一种多不饱和脂肪酸体外扩增髓系来源的抑制性细胞的方法,具体地说,是关于一种通过多不饱和脂肪酸(例如亚麻酸或亚油酸)与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子联合处理获得鼠髓系来源的抑制性细胞的方法。
背景技术
多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid,PUFA)是含有超过两个不饱和C-C双键的脂肪酸,根据脂肪酸链ω末端最后一个不饱和C-C双键的位置将PUFAs分为n-3多不饱和脂肪酸和n-6多不饱和脂肪酸。N-3多不饱和脂肪酸的母体脂肪酸-亚麻酸(ɑ-linolenic acid,ALA)和n-6多不饱和脂肪酸的母体脂肪酸-亚油酸(linoleic acid,LA)被称为人体的必需脂肪酸。亚麻酸主要来源于如大豆、亚麻籽和琉璃苣等植物的种子和叶子,而亚油酸则主要来源于如黄豆、葵花籽油和红花油等植物油。它们在饮食过程中被消化并在后续代谢反应中被转化成为多种生物活性介质,如类二十烷酸(eicosanoid)。
除了维持细胞膜的正常结构外,多不饱和脂肪酸还具有重要的免疫调节功能。临床研究表明,服用多不饱和脂肪酸可显著缓解一些自身免疫性疾病或炎症性疾病的临床症状,起到临床辅助治疗作用。关于多不饱和脂肪酸介导的免疫抑制作用的机制,目前尚有待进一步阐明。研究表明,过量摄入n-3多不饱和脂肪酸能够抑制正常人NK细胞活性;饮食吸收n-3多不饱和脂肪酸会减少小鼠腹膜巨噬细胞和人外周血单核细胞的细胞因子TNF-ɑ、IL-1β和IL-6的产生以及显著降低表面分子MHCII表达;多不饱和脂肪酸通过改变在T细胞和抗原呈递细胞形成的突触上细胞膜的微观组织(脂筏)来调控T细胞信号;多不饱和脂肪酸也能够改变初始T细胞从Th1向Th2细胞方向分化,从而抑制T细胞增殖和IL-2的产生;多不饱和脂肪酸处理小鼠骨髓来源的树突状细胞能够抑制内毒素LPS诱导的树突状细胞的激活和成熟,显著降低了树突状细胞表面分子MHCII、CD40、CD80和甘露糖受体的表达。这些研究结果表明多不饱和脂肪酸对免疫系统具有抑制作用。
髓系来源的抑制性细胞(Myeloid-Derived Suppressor Cell,MDSC)是在某些病理情况下,因髓系细胞分化障碍所产生的未成熟髓系细胞及髓系祖细胞的集合,具有强大而广谱的免疫抑制功能,是免疫系统重要的负性调控元件之一。目前的研究表明MDSC与肿瘤、慢性感染、创伤和炎症等多种疾病的发生发展密切相关。在小鼠,髓系来源的抑制性细胞被定义为共表达Gr-1和CD11b的细胞。根据Gr-1的抗原表位Ly6G和Ly6C两种分子表达的不同,小鼠髓系来源的抑制性细胞可分为CD11b+Ly6G+Ly6ClowMDSCs和CD11b+Ly6G-Ly6ChighMDSCs两种亚型。前者在形态学上与多形核粒细胞相似,称为粒细胞样髓系来源的抑制性细胞(Granulocytic MDSC,G-MDSC),后者则具有单核细胞的形态,称为单核细胞样髓系来源的抑制性细胞(Monocytic MDSC,M-MDSC)。M-MDSC主要通过高表达精氨酸酶活性以抗原非特异性的方式抑制T细胞功能,而G-MDSC则利用活性氧ROS作为免疫介质以抗原特异性地方式抑制T细胞反应。对病理情况下髓系来源的抑制性细胞异常扩增及活化的机制研究表明:炎症细胞所产生的炎症因子如COX-2、PGE2、VEGF、S100A8/A9或肿瘤细胞来源的细胞因子如SCF、M-CSF、GM-CSF、G-CSF、IL-6、IL-1β、IFNγ、IL-4、IL-13等在促进髓系来源的抑制性细胞的聚集和活化方面起重要作用。转录因子信号转导子和转录激活子(Signal Transducerand Activator of Transcription,STAT)家族是病理情况下调控髓系来源的抑制性细胞扩增与活化的主要信号转导通路之一。STAT3可以通过刺激髓系细胞的生成而抑制其分化来调节髓系来源的抑制性细胞的产生,并且通过诱导MYC、BCL-XL以及细胞周期蛋白Dl等的表达促进髓系来源的抑制性细胞的增殖,并由此引发髓系来源的抑制性细胞上调产生活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)而获得免疫抑制功能;STAT6和STAT1以及Toll样受体(Toll-like recepter,TLR)介导的核因子-κB(Nuclear Factor-κB,NF-κB)的激活可引起髓系来源的抑制性细胞内精氨酸酶-1(Arginase 1,ARG1)和诱导性一氧化氮合成酶(inducible Nitric Oxide Synthase,iNOS)的上调,进而增强了抑制性细胞因子的产生,如转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β),促进髓系来源的抑制性细胞聚集和活化。另外,C/EBPβ也可通过上调表达髓系来源的抑制性细胞细胞内c-myc基因,促进髓系来源的抑制性细胞的增殖和存活,进而诱导髓系来源的抑制性细胞精氨酸酶-1和诱导性一氧化氮合成酶的上调表达促进髓系来源的抑制性细胞聚集和活化。
尽管目前在髓系来源的抑制性细胞相关领域的研究取得了重大的突破,但是由于髓系来源的抑制性细胞细胞数量少、可用于细胞治疗的、安全的、非肿瘤来源的髓系来源的抑制性细胞的体外扩增方法目前尚未有详尽描述。
因而,开发一种简单快速地多不饱和脂肪酸体外扩增髓系来源的抑制性细胞的技术,用于炎症、自身免疫性等疾病的细胞治疗,将具有重大的现实意义和客观临床需求。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种简单快速地多不饱和脂肪酸体外扩增髓系来源的抑制性细胞的方法。
本发明提供了一种多不饱和脂肪酸体外扩增髓系来源的抑制性细胞的方法,该方法包括步骤:
(1)取动物股骨和胫骨,用培养液冲洗骨髓,获得骨髓细胞悬液;
(2)向上述骨髓细胞悬液中加入红细胞裂解液进行裂解处理;
(3)裂解处理后的细胞悬液进行离心,得到骨髓细胞;
(4)将骨髓细胞于加入多不饱和脂肪酸与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的培养液中培养,获得髓系来源的抑制性细胞。
根据本发明的具体实施方案,本发明的方法中,所述动物为小鼠。
根据本发明的具体实施方案,本发明的方法中,步骤(1)中所述培养液为RPMI1640培养液。
根据本发明的具体实施方案,本发明的方法中,步骤(2)中所述红细胞裂解液的组成如下:
每升红细胞裂解液中,氯化铵8~8.6克,碳酸氢钾1~1.2克,乙二胺四乙酸钠30~50毫克,加水至总体积1升,并调酸碱度至7.2~7.4。
根据本发明的具体实施方案,本发明的方法中,步骤(2)中,所述红细胞裂解液的用量为:每1×107个骨髓细胞加入红细胞裂解液0.3~1毫升。
根据本发明的具体实施方案,本发明的方法中,步骤(2)中裂解处理条件为10~15分钟。通常是将加入裂解液的样品置于冰上静置进行裂解处理,裂解处理结束后加入PBS终止反应,之后进行离心。
根据本发明的具体实施方案,本发明的方法中,步骤(3)中离心条件为2500~4000转/分钟离心5~10分钟。
根据本发明的具体实施方案,本发明的方法中,步骤(4)中所述多不饱和脂肪酸为亚麻酸或亚油酸。
根据本发明的具体实施方案,本发明的方法中,步骤(4)的培养体系中所述多不饱和脂肪酸的浓度为50~200微摩尔/升;粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的浓度为10~30纳克/毫升。
根据本发明的具体实施方案,本发明的方法中,步骤(4)的培养体系中还加入有β-巯基乙醇,β-巯基乙醇在培养体系中的浓度为30~80微摩尔/升。
根据本发明的具体实施方案,本发明的方法中,步骤(4)中的培养条件为:培养液为含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基,培养于37℃、5%CO2培养箱中,隔一天换培养液一次,培养至第5~7天(优选第6天),收集细胞。
在本发明的一具体实施方案中,是取小鼠股骨和胫骨,用眼科剪刀剪开两端,用注有培养基的注射器冲洗骨髓,获得骨髓细胞悬液,加入红细胞裂解液在冰上处理,之后加入PBS终止裂解,通过离心得到骨髓细胞。细胞计数后通过多不饱和脂肪酸(亚麻酸或亚油酸)与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子联合处理6天获得鼠髓系来源的抑制性细胞。
综上所述,本发明的多不饱和脂肪酸体外扩增髓系来源的抑制性细胞的方法,通过从骨髓中释放获得骨髓细胞而最大限度维持骨髓细胞活性;通过红细胞裂解液温和处理,将骨髓细胞与骨髓红细胞分离开,从而达到有效富集骨髓细胞的效果;通过多不饱和脂肪酸(亚麻酸或亚油酸)与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子联合处理快速获得有抑制功能的、非肿瘤来源的、安全的髓系来源的抑制性细胞,可用于炎症、自身免疫性等疾病的细胞治疗。
附图说明
图1显示多不饱和脂肪酸体外扩增髓系来源的抑制性细胞实验结果。
图2显示多不饱和脂肪酸体外诱导的髓系来源的抑制性细胞对T细胞增殖的抑制作用实验结果。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明,现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。
实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件,或按照制造商所建议的条件。
实施例1
一、多不饱和脂肪酸体外扩增小鼠髓系来源的抑制性细胞试验方案
以下实验均需无菌操作(在生物安全柜(Thermo Fisher scientific公司)中进行试验)。
1.取小鼠股骨和胫骨,放入加有RPMI 1640培养基(10%胎牛血清,货号10099141,Gibco公司;1%青霉素链霉素,货号15140122,Gibco公司;1%4-羟乙基哌嗪乙磺酸,货号15630080,Gibco公司;1%L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽,货号A1286001,Gibco公司;1%非必需氨基酸,货号10370021,Gibco公司;1‰β-巯基乙醇,货号21985-023,Invitrogen公司;RPMI 1640,货号11875093,Gibco公司)的无菌培养皿(Corning公司),置于冰上(制冰机,SANYO公司)。
2.用手术剪刀剪去小鼠股骨和胫骨的两端,用5毫升无菌注射器(双鸽集团有限公司)吸入RPMI 1640培养基5毫升,将注射器插入骨髓腔,缓缓地将骨髓腔中的细胞冲至50毫升无菌离心管(Corning公司)中,可以重复冲洗一次。
3.加入1~2毫升(一只小鼠股骨和胫骨获得的骨髓细胞量的用量,根据小鼠只数酌情增减)红细胞裂解液(配方:氯化铵8.29克,碳酸氢钾1克,乙二胺四乙酸钠37.2毫克,加水至总体积1升,调酸碱度至7.21),将细胞于裂解液中混匀,冰上静置10分钟后加入PBS(货号14190144,Gibco公司)5~10毫升(按照5倍体积的红细胞裂解液用量酌情增减),终止反应,并且混匀,于3500转/分钟离心(离心机,Eppendorf公司)5分钟,弃上清。
4.用细胞计数板(上海求精公司)于生物显微镜(Leica Microsystems公司)下计数新鲜分离的小鼠骨髓细胞悬液,用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基将小鼠骨髓细胞调整至1×106/毫升,置冰上备用。
5.依次加入50微摩尔/升β-巯基乙醇和20纳克/毫升粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(货号AF-315-03,PeproTech公司)。充分混匀后,将细胞混合液铺板于24孔板(Corning公司)中,培养于37℃、5%二氧化碳培养箱(Thermo Fisher Scientific公司)中,隔一天换培养液一次(即第0天、第2天、第4天时换新鲜培养液),培养至第6天收集细胞备用。培养至第6天收集细胞备用。100微摩尔/升的亚麻酸(货号L2376,Sigma公司)或亚油酸(货号L1376,Sigma公司)于第0天添加,换培养液时补加。
二、流式细胞术检测多不饱和脂肪酸体外扩增小鼠髓系来源的抑制性细胞表型及比例
1、对于小鼠Gr-1+CD11b+MDSCs检测:
1)将1×106个小鼠骨髓细胞(上述方案一步骤5中收集到的细胞)装入5毫升流式管(BD Biosciences公司)中。
2)加入4毫升的1×PBS混匀,4℃,3500转/分钟离心5分钟,弃上清。
3)按照抗体说明书,各加入0.5微升的CD11b-PE(货号561689,BD Bioscience s公司)和Gr-1-PE-Cy5(货号561084,BD Biosciences公司),4℃避光孵育30分钟(或者室温避光孵育15分钟)。
4)然后加入4毫升的1×PBS混匀,3500转/分钟离心5分钟,弃上清。
5)每管加入500微升的1×PBS将细胞重悬,用流式细胞仪(BD Biosciences公司)检测。
2、对于小鼠MHC II+CD11c+DCs检测:
1)将1×106个小鼠骨髓细胞(上述方案一步骤5中收集到的细胞)装入5毫升流式管中。
2)加入4毫升1×PBS混匀,4000转/分钟离心5分钟,弃上清。
3)按照抗体说明书,各加入0.5微升的MHC II-PE(货号130-102-896 MiltenyiBiotec公司)和CD11c-PE-Cy5(货号561044,BD Biosciences公司),4℃避光孵育30分钟(或者室温避光孵育15分钟)。
4)余下步骤同小鼠Gr-1+CD11b+MDSCs检测方法。
3、对于小鼠MDSCs两个亚型G-MDSCs和M-MDSCs检测:
1)将1×106个小鼠骨髓(上述方案一步骤5中收集到的细胞)装入5毫升流式管中。
2)加入4毫升1×PBS混匀,3500转/分钟离心5分钟,弃上清。
3)按照抗体说明书,各加入0.5微升的CD11b-FITC、Ly6C-PE(货号561084,BDBiosciences公司)和Ly6G-PE-Cy7(货号552985,BD Biosciences公司),4℃避光孵育30分钟(或者室温避光孵育15分钟)。
4)余下步骤同小鼠Gr-1+CD11b+MDSCs检测方法。
图1显示本实施例的多不饱和脂肪酸体外扩增髓系来源的抑制性细胞实验结果。
本发明中在小鼠骨髓细胞体外诱导MDSC的培养体系中加入粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(20纳克/毫升),于培养第0天加入100微摩尔/升的n-3多不饱和脂肪酸(亚麻酸ALA)或100微摩尔/升的n-6多不饱和脂肪酸(亚油酸LA)作为实验组,以溶剂酒精作为对照组。培养6天后利用流式细胞术分析了未成熟DC(CD11c+,CD11c+MHCII+)和MDSCs(Gr-1+CD11b+)及其亚群Ly6G+Ly6C-/low(G-MDSC)和Ly6G-Ly6Chigh(M-MDSC)所占的百分比。结果显示:n-3多不饱和脂肪酸(ALA)或n-6多不饱和脂肪酸(LA)均能显著抑制未成熟CD11c+DCs和CD11c+MHCII+DCs的分化,分别使CD11c+DCs在小鼠骨髓细胞中所占的百分比从对照组(48.5%±1.3%)下降到亚麻酸组(23.5%±2.5%)或亚油酸组(23.3%±3.1%),而使CD11c+MHCII+DCs在小鼠骨髓细胞中所占的百分比从对照组(36.3%±3.3%)下降到亚麻酸组(15.6%±2.6%)或亚油酸组(14.7%±1.8%);伴随DC的分化障碍,本发明发现亚麻酸或亚油酸处理可显著提高MDSCs在小鼠骨髓细胞所占的百分比,分别从对照组(10.9%±2.8%)上升到亚麻酸组(29.6%±1.6%)或亚油酸组(30.2%±1.9%)。这说明多不饱和脂肪酸可通过抑制髓系细胞分化而促进髓系来源的抑制性细胞聚集。
本发明进一步研究了多不饱和脂肪酸对髓系来源的抑制性细胞亚型产生的影响。流式分析结果表明:相对于对照组,亚麻酸或亚油酸均能显著促进G-MDSC的聚集,分别使G-MDSC在小鼠骨髓细胞中所占的百分比从对照组(20.5%±3.5%)上升到亚麻酸组(39.6%±2.3%)或亚油酸组(45.9%±3.7%),而M-MDSC在小鼠骨髓细胞中所占的百分比并无明显改变,分别为对照组(3.6%±0.5%)、亚麻酸组(3.7%±0.3%)和亚油酸组(3.6%±0.6%)。这结果表明多不饱和脂肪酸在体外特异性地引起G-MDSC扩增。
实施例2
本实施例中,通过髓系来源的抑制性细胞与T淋巴细胞共培养试验验证多不饱和脂肪酸体外扩增小鼠髓系来源的抑制性细胞功能。众所周知,髓系来源的抑制性细胞是一群异质性的未成熟髓系细胞,其发挥免疫抑制功能的主要途径是抑制T细胞免疫反应。本实施例首先研究多不饱和脂肪酸诱导产生的髓系来源的抑制性细胞对T细胞的作用。通过流式细胞术分选了多不饱和脂肪酸体外诱导产生的髓系来源的抑制性细胞,将其与经抗CD3/CD28磁珠预刺激之后的同种异体小鼠脾脏来源的CD3+T细胞按照不同比例进行共培养,3天后通过流式细胞术检测T细胞增殖情况(CFSE染色)。具体实验操作如下:
1、用含0.1%牛血清白蛋白(货号A500023-0025,上海生物工程有限公司)的无菌PBS配制250微摩尔/升的CFSE(羧基荧光素双乙酸盐,琥珀酰亚胺酯,货号C34570,Invitrogen公司)储存液。
2、将无菌分选C57BL/6脾脏CD3+T(货号552774,BD Biosciences公司)细胞重悬于37℃预热的含0.1%牛血清白蛋白的无菌PBS中,细胞浓度达l×106/毫升。
3、加入4微升浓度为250微摩尔/升的CFSE储存液于细胞悬液中,使CFSE终浓度达1微摩尔/升。
4、37℃孵育10分钟,加入5倍体积的冷的培养基冰上放置5分钟终止染色,2500转/分钟离心5分钟。
5、用RPMI1640培养基洗涤2次,调整细胞浓度达2×105/孔,铺板于96孔板。
6、实验组加抗CD3/CD28磁珠(货号11456D,Invitrogen公司)刺激,本底对照组不加抗CD3/CD28磁珠,每组设3个复孔。以8:1、4:1、2:1的比例加入经100微摩尔/升亚麻酸或亚油酸处理的小鼠来源的MDSCs(细胞数分别为2.5×104/孔、5×104/孔、1×105/孔),培养3天后,收集细胞,经CD4-PE(货号561829,BD Biosciences公司)和CD8a-PE-Cy5(货号561094,BD Biosciences公司)双染色后,流式细胞术(BD Biosciences公司)检测并用FlowJo7.6(BD Biosciences公司)软件分析。
图2显示本实施例的多不饱和脂肪酸体外诱导的髓系来源的抑制性细胞对T细胞增殖的抑制作用实验结果。结果显示:多不饱和脂肪酸诱导产生的髓系来源的抑制性细胞对CD4+T细胞和CD8+T细胞增殖的抑制作用均有细胞浓度依赖性,当T:MDSC比例达到1:1时,PUFA-MDSC可显著抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞增殖(CD4+T:无MDSC(70.4%±3.5%)对PUFA-MDSC(18.3%±1.8%),CD8+T:无MDSC(79.0%±4.5%)对PUFA-MDSC(22.8%±2.5%));而当T:MDSC比例达到4:1时,PUFA-MDSC只有极弱的抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞增殖能力(CD4+T:无MDSC(70.4%±3.5%)对PUFA-MDSC(58.7%±3.6%),CD8+T:无MDSC(79.0%±4.5%)对PUFA-MDSC(69.9%±4.3%)。这结果表明多不饱和脂肪酸诱导产生的髓系来源的抑制性细胞具有抑制T细胞免疫反应的功能。

Claims (10)

1.一种多不饱和脂肪酸体外扩增髓系来源的抑制性细胞的方法,该方法包括步骤:
(1)取动物股骨和胫骨,用培养液冲洗骨髓,获得骨髓细胞悬液;
(2)向上述骨髓细胞悬液中加入红细胞裂解液进行裂解处理;
(3)裂解处理后的细胞悬液进行离心,得到骨髓细胞;
(4)将骨髓细胞于加入多不饱和脂肪酸与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的培养液中培养,获得髓系来源的抑制性细胞。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述动物为小鼠。
3.根据权利要求1所述的方法,其中,步骤(1)中所述培养液为RPMI 1640培养液。
4.根据权利要求1所述的方法,其中,步骤(2)中所述红细胞裂解液的组成如下:
每升红细胞裂解液中,氯化铵8~8.6克,碳酸氢钾1~1.2克,乙二胺四乙酸钠30~50毫克,加水至总体积1升,并调酸碱度至7.2~7.4;
优选地,红细胞裂解液的用量为:每1×107个骨髓细胞加入红细胞裂解液0.3~1毫升。
5.根据权利要求1所述的方法,其中,步骤(2)中裂解处理条件为10~15分钟。
6.根据权利要求1所述的方法,其中,步骤(3)中离心条件为2500~4000转/分钟离心5~10分钟。
7.根据权利要求1所述的方法,其中,步骤(4)中所述多不饱和脂肪酸为亚麻酸或亚油酸。
8.根据权利要求1或7所述的方法,其中,步骤(4)的培养体系中所述多不饱和脂肪酸的浓度为50~200微摩尔/升;粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的浓度为10~30纳克/毫升。
9.根据权利要求1或7所述的方法,其中,步骤(4)的培养体系中还加入有β-巯基乙醇,β-巯基乙醇在培养体系中的浓度为30~80微摩尔/升。
10.根据权利要求1或7所述的方法,其中,步骤(4)中的培养条件为:培养液为含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基,培养于37℃、5%CO2培养箱中,隔一天换培养液一次,培养至第5~7天,收集细胞。
CN201611108030.XA 2016-12-06 2016-12-06 多不饱和脂肪酸体外扩增髓系来源的抑制性细胞的方法 Pending CN108148801A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611108030.XA CN108148801A (zh) 2016-12-06 2016-12-06 多不饱和脂肪酸体外扩增髓系来源的抑制性细胞的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611108030.XA CN108148801A (zh) 2016-12-06 2016-12-06 多不饱和脂肪酸体外扩增髓系来源的抑制性细胞的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108148801A true CN108148801A (zh) 2018-06-12

Family

ID=62470999

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611108030.XA Pending CN108148801A (zh) 2016-12-06 2016-12-06 多不饱和脂肪酸体外扩增髓系来源的抑制性细胞的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108148801A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111808800A (zh) * 2020-07-20 2020-10-23 中南大学湘雅二医院 一种体外诱导免疫抑制性髓系抑制细胞及其制备和应用
CN112646777A (zh) * 2020-12-31 2021-04-13 广州医科大学 一种扩增髓系来源的抑制性细胞的方法
CN115896015A (zh) * 2023-02-08 2023-04-04 上海诚益生物科技有限公司 一种髓系来源抑制性细胞的体外培养方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101370395A (zh) * 2005-12-23 2009-02-18 N.V.努特里西阿公司 用于改善膜组成的包含多不饱和脂肪酸的组合物
JP2012080874A (ja) * 2010-09-15 2012-04-26 National Institute Of Advanced Industrial Science & Technology 擬微小重力環境下での三次元組織構築方法
CN103458887A (zh) * 2011-03-31 2013-12-18 雀巢产品技术援助有限公司 用于增加精氨酸水平的营养组合物及其使用方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101370395A (zh) * 2005-12-23 2009-02-18 N.V.努特里西阿公司 用于改善膜组成的包含多不饱和脂肪酸的组合物
JP2012080874A (ja) * 2010-09-15 2012-04-26 National Institute Of Advanced Industrial Science & Technology 擬微小重力環境下での三次元組織構築方法
CN103458887A (zh) * 2011-03-31 2013-12-18 雀巢产品技术援助有限公司 用于增加精氨酸水平的营养组合物及其使用方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DEHONG YAN等: "Polyunsaturated fatty acids promote the expansion of myeloid-derived suppressor cells by activating the JAK/STAT3 pathway", 《EUROPEAN JOURNAL OF IMMUNOLOGY》 *
SHENG XIA等: "Chronic intake of high fish oil diet induces myeloid‑derived suppressor cells to promote tumor growth", 《CANCER IMMUNOL IMMUNOTHER》 *
廖原等: "荷瘤小鼠髓系来源抑制性细胞对哮喘小鼠气道炎症的影响", 《中国呼吸与危重监护杂志》 *
赵文秀等: "不同流式抗体分选小鼠原位肝癌模型中髓系来源抑制性细胞的比较", 《中国实验动物学报》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111808800A (zh) * 2020-07-20 2020-10-23 中南大学湘雅二医院 一种体外诱导免疫抑制性髓系抑制细胞及其制备和应用
CN112646777A (zh) * 2020-12-31 2021-04-13 广州医科大学 一种扩增髓系来源的抑制性细胞的方法
CN115896015A (zh) * 2023-02-08 2023-04-04 上海诚益生物科技有限公司 一种髓系来源抑制性细胞的体外培养方法
CN115896015B (zh) * 2023-02-08 2023-09-29 上海诚益生物科技有限公司 一种髓系来源抑制性细胞的体外培养方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101643165B1 (ko) 말초혈액단핵구 유래 자연 살해세포의 유도 및 증식 방법
CN107326008B (zh) 一种从外周血中高效高纯度扩增自然杀伤细胞的方法
Tvede et al. Effect of physical exercise on blood mononuclear cell subpopulations and in vitro proliferative responses
Wang et al. IL-27 induces the differentiation of Tr1-like cells from human naive CD4+ T cells via the phosphorylation of STAT1 and STAT3
Hou et al. High-dose dexamethasone corrects impaired myeloid-derived suppressor cell function via Ets1 in immune thrombocytopenia
CN102676454B (zh) 一种脐带血来源的cik细胞的制备方法
Chang et al. A novel phycobiliprotein alleviates allergic airway inflammation by modulating immune responses
Li et al. Effects of simulated microgravity on primary human NK cells
WO2013118899A1 (ja) 単球増殖剤、単球増殖用培地、単球の製造方法、樹状細胞の製造方法、及び樹状細胞ワクチンの製造方法
CN108893443A (zh) 一种细胞因子诱导脐带血自然杀伤细胞的高效扩增方法
Frikeche et al. Impact of valproic acid on dendritic cells function
CN103756963A (zh) 一种体外扩增nk细胞的方法
CN108148801A (zh) 多不饱和脂肪酸体外扩增髓系来源的抑制性细胞的方法
US11154571B2 (en) Exosomes sourced from granulocytic myeloid-derived suppressor cells and application thereof
CN103555666A (zh) 一种提高Vγ9Vδ2T细胞扩增效率及活性的培养方法
CN105087488A (zh) 一种肿瘤抗原诱导的dc-cik细胞的制备方法及应用
Zhang et al. Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide promotes T-helper 17 cell differentiation from human CD4+ naïve T cells via toll-like receptor-2 in vitro
Guo et al. Immunomodulatory effect of bone marrow mesenchymal stem cells on T lymphocytes in patients with decompensated liver cirrhosis
Ohtsuka et al. Changes in leukocyte population after ozonated autohemoadministration in cows with inflammatory diseases
Martínez et al. Systemic candidiasis and TLR2 agonist exposure impact the antifungal response of hematopoietic stem and progenitor cells
Zheng et al. Recovery profiles of T-cell subsets following low-dose total body irradiation and improvement with cinnamon
CN104152411A (zh) 一种自体树突状细胞激活肿瘤浸润性t淋巴细胞的制备方法及其应用
Du et al. Oridonin prolongs the survival of mouse cardiac allografts by attenuating the NF-κB/NLRP3 pathway
CN115521914A (zh) 一种人原代自然杀伤细胞体外扩增体系及方法
Bharadwaj et al. Effects of Cyclophilin A on Myeloblastic Cell Line KG-1 Derived Dendritic Like Cells (DLC) Through p38 MAP Kinase Activation1, 2

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180612

RJ01 Rejection of invention patent application after publication