WO2013118899A1 - 単球増殖剤、単球増殖用培地、単球の製造方法、樹状細胞の製造方法、及び樹状細胞ワクチンの製造方法 - Google Patents

単球増殖剤、単球増殖用培地、単球の製造方法、樹状細胞の製造方法、及び樹状細胞ワクチンの製造方法 Download PDF

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阿部　博幸
広明 川崎
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    • C12N2506/115—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells from monocytes, from macrophages

Definitions

  • the present invention relates to a monocyte proliferating agent, a monocyte growth medium, a method for producing monocytes, a method for producing dendritic cells, and a method for producing dendritic cell vaccines.
  • Dendritic cell vaccines are prepared from dendritic cells that have been loaded with (pulsed) cancer antigens into dendritic cells from a subject to whom the vaccine is administered (eg, a cancer patient) and into the body of the subject to which the vaccine is administered. Be administered.
  • the administered dendritic cells present cancer antigens to T cells, and the antigen-presented T cells (CTL) specifically attack cancer cells, thus treating cancer without damaging normal cells in the body can do.
  • CTL antigen-presented T cells
  • dendritic cells necessary for the production of the dendritic cell vaccine cannot be separated directly from the body. Therefore, dendritic cells are obtained by separating monocytes from blood collected from a subject to which the vaccine is administered and differentiating the monocytes into dendritic cells.
  • a method of collecting monocytes used for producing a conventionally known dendritic cell vaccine a method of separating leukocytes in blood using a component blood collection device (hereinafter, this method is referred to as “apheresis”). It has been known. However, apheresis is expensive to operate the apparatus and requires advanced techniques for operating the apparatus. In apheresis, a mixture containing not only monocytes but also components other than monocytes (white blood cells, red blood cells, platelets, etc.) is collected. For this reason, it is common to perform a mononuclear cell separation step after apheresis in order to remove components other than monocytes such as red blood cells and platelets.
  • apheresis is usually performed about 8 times at intervals from the same target.
  • the proportion of monocytes present in the blood is small, if apheresis is used to obtain a sufficient amount of monocytes that can produce a dendritic cell vaccine, the blood is circulated in the apheresis device and leukocyte components
  • the burden on the patient is very heavy both physically and temporally. Therefore, if the patient's condition changes suddenly during apheresis, the apheresis may be interrupted halfway and the dendritic cell vaccine therapy itself may have to be abandoned.
  • monocyte components are collected by apheresis, it is said that usually about 5-8 doses of a tree cell vaccine can be prepared. It varies depending on blood conditions.
  • Patent Document 1 discloses culturing monocytes while inhibiting the expression of a specific substance in monocytes.
  • this method requires a recombinant production process and a long culture time.
  • An object of the present invention is to provide a means by which monocytes can be propagated efficiently and easily.
  • the present inventors have found that a specific cytokine involved in hematopoietic stem cell proliferation and the like can proliferate monocytes with high efficiency, and have completed the present invention. Specifically, the present invention provides the following.
  • a monocyte proliferating agent that is composed of one or more of Flt-3L, IL-3, or IFN- ⁇ , and is used before a differentiation process from monocytes to dendritic cells.
  • a method for producing monocytes comprising a growth step of growing raw material monocytes by culturing them in the monocyte growth medium described in (2) or (3).
  • the method for producing monocytes according to (4) or (5) including a reduction step of obtaining the raw material monocytes by reducing the content of components other than monocytes in the body fluid before the proliferation step .
  • the reduction is performed by using magnetic beads having higher affinity for at least one of monocytes in the raw material monocytes and leukocyte components other than monocytes, plasma, and red blood cells (6).
  • Figures (A) and (B) showing that monocytes grown by the monocyte proliferating agent of the present invention differentiated into mature dendritic cells, and mature dendritic cells obtained in (A) and (B) It is a figure (C) which shows that has an antigen presentation ability.
  • the monocyte proliferating agent of the present invention comprises one or more of Flt-3L, IL-3, or IFN- ⁇ , and is used before the differentiation process from monocytes to dendritic cells.
  • the usage aspect of the monocyte proliferative agent of this invention is not specifically limited, It is thought that it is common to use in the form which was added to the culture medium which can culture
  • “Differentiation treatment from monocytes to dendritic cells” means conditions suitable for differentiating monocytes into dendritic cells, ie, a predetermined amount of specific cytokines (GM-CSF, IL-4, and IL- 6) and the like. It is known that the number of monocytes increases to some extent even in the course of differentiation treatment, but the monocyte proliferating agent of the present invention is not used for this differentiation treatment but is used in the previous stage.
  • the amount of monocytes to differentiate into dendritic cells is the amount of dendritic cells in the total number of cells when cultured in a medium containing that amount of cytokines at 37 ° C. and 5% CO 2 for 6 days.
  • the specific amount depends on the components of the medium and the culture conditions.
  • monocytes are proliferated to an amount sufficient to produce a dendritic cell vaccine (for example, 10 6 to 10 7 cells / mL or more) before being subjected to the above differentiation treatment. This is convenient because the monocyte culture process does not need to be repeated many times for the dendritic cell vaccine.
  • a dendritic cell vaccine for example, 10 6 to 10 7 cells / mL or more
  • Flt-3L Flt3-Ligand
  • IL-3 interleukin-3
  • IFN- ⁇ interferon- ⁇
  • Flt-3L The amount of Flt-3L suitable for growing monocytes is not particularly limited, but is 100 to 10000 IU / mL, preferably 1000 to 5000 IU / mL, most preferably 1000 to 3000 IU / mL per medium in which monocytes can be cultured. It may be mL.
  • the amount of IL-3 suitable for growing monocytes is not particularly limited, but is 100 to 10000 IU / mL, preferably 100 to 5000 IU / mL, most preferably 500 to 3000 IU / mL per medium in which monocytes can be cultured. It may be mL.
  • the amount of IFN- ⁇ suitable for growing monocytes is not particularly limited, but is 1 to 1000 ng / mL, preferably 1 to 500 ng / mL, most preferably 1 to 50 ng / mL per medium in which monocytes can be cultured. It may be mL.
  • any one of Flt-3L, IL-3 and IFN- ⁇ may be used alone, or two or more may be combined.
  • Flt-3L, IL-3, and IFN- ⁇ have similar functions, even if they are used in combination, they are not expected to inhibit each other's functions.
  • the compounding quantity of each cytokine may be in the above-mentioned range, and may be less than it.
  • monocytes Whether or not the cells grown by the monocyte proliferating agent of the present invention are monocytes is confirmed by analyzing cell surface markers of the obtained cells by flow cytometry. Examples of monocyte cell surface markers include CD14. Cells with such markers are recognized as monocytes.
  • the monocyte growth medium of the present invention contains one or more of Flt-3L, IL-3 or IFN- ⁇ , and is used before the differentiation process from monocytes to dendritic cells.
  • the monocyte growth medium may further contain a nutrient component, a pH adjuster and the like for enabling monocytes to be cultured.
  • the medium containing such components is not particularly limited, and examples include serum-free synthetic medium for lymphocytes, AIM-V, RPMI-1640 and the like.
  • the “medium” in the present specification includes not only liquefied prepared forms but also component mixtures (usually powders) before preparation.
  • the monocyte growth medium of the present invention may further contain a cytokine involved in monocyte differentiation (GM-CSF (Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor)).
  • GM-CSF Gramulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor
  • Monocytes tend to differentiate into macrophages in the presence of GM-CSF and tend to differentiate into dendritic cells in the presence of GM-CSF and IL-4.
  • the monocyte growth medium of the present invention containing GM-CSF can significantly promote the growth of monocytes.
  • GM-CSF itself also has a monocyte-proliferating effect
  • monocytes can be differentiated without differentiation. Can be significantly promoted.
  • the monocyte growth medium of the present invention further contains IL-4 in an amount less than the amount that differentiates monocytes into dendritic cells (eg, 500 to 2,000 IU / mL). May be included.
  • the GM-CSF contained in the monocyte growth medium of the present invention may be in the range of 500 to 2,000 IU / mL.
  • the monocyte growth medium of the present invention may contain a reagent usually used in cell culture.
  • a reagent usually used in cell culture.
  • examples of such a reagent include antibiotics (gentamicin, kanamycin, etc.), albumin, serum (fetal bovine serum, etc.) and the like.
  • the monocyte growth medium of the present invention contains autologous plasma derived from a living body (for example, mammals such as humans, pigs, cows, horses, goats, sheep, rabbits, kangaroos, monkeys). Monocytes and autologous plasma may be obtained from the same living body).
  • the monocyte growth medium of the present invention may contain picibanil chloride, prostaglandin E2 (PGE2), etc. for the purpose of promoting differentiation induction into dendritic cells.
  • PGE2 prostaglandin E2
  • the method for producing monocytes of the present invention includes a growth step for growing raw material monocytes by culturing them in the monocyte growth medium of the present invention.
  • the conditions used in the growth step in the present invention are not particularly limited. From the viewpoint of growing monocytes before many monocytes start to differentiate, the conditions are 30 to 40 ° C. and 2 to 8% CO 2 . It may be cultured. The culture time can be appropriately adjusted depending on the amount of monocytes required, and may be 3 to 20 days, 3 to 18 days, 3 to 14 days, or 3 to 10 days. During culture, the medium may be appropriately replaced by a conventionally known method.
  • monocytes in the raw material monocytes can be grown to a clinically usable level (eg, 10 6 to 10 7 cells / mL or more) in a short culture time of 14 days, for example.
  • the level that can be used clinically refers to the level at which the obtained dendritic cell vaccine can be used as it is as a non-frozen vaccine when prepared dendritic cells obtained by differentiating expanded monocytes are prepared as a dendritic cell vaccine. .
  • monocytes are grown under conditions where the monocytes are cultured in the monocyte growth medium of the present invention under a condition that the load on the monocytes is small. Therefore, according to the method for producing monocytes of the present invention, it can be expected to obtain monocytes at a high viable cell rate (for example, more than 90%).
  • the raw material monocytes in the present invention are samples containing monocytes.
  • the raw material monocytes may consist of monocytes alone, and according to the method for producing monocytes of the present invention, monocytes can be selectively and efficiently proliferated, so that monocytes and leukocyte components other than monocytes (for example, a mixture containing lymphocytes, NK cells, and NKT cells) may be used. This mixture may further contain plasma and red blood cells.
  • the mixture may be a mononuclear cell fraction mainly containing monocytes and lymphocytes obtained from a sample of body fluid such as blood by density gradient centrifugation or the like.
  • Reduction process Before the proliferation step, it is preferable to perform a reduction step of obtaining the raw material monocytes by reducing the content of components other than monocytes in the body fluid. Reduction can be performed by, for example, a method using magnetic beads, a density gradient centrifugation method, a method in which only monocytes are adhered to a petri dish among components in a body fluid, and monocytes are separated, or a combination of these methods. it can.
  • This magnetic bead is a magnetic bead having a higher affinity for at least one (preferably all) of monocytes and non-monocyte leukocyte components, plasma, and red blood cells in the raw monocytes than the other.
  • Such a magnetic bead may have a structure in which an antibody or the like against a substance to be separated is bound to a magnetic carrier.
  • the mononuclear cell fraction obtained by subjecting the bodily fluid to density gradient centrifugation to be treated with magnetic beads from the viewpoint of further increasing the yield of monocytes.
  • monocytes can be separated mainly from body fluids (this is called positive selection of monocytes).
  • the raw material monocytes are obtained by removing the magnetic beads from the separated monocytes by a conventionally known method. This mode is advantageous in that the number of types of magnetic beads to be prepared is small, but a step of removing the magnetic beads from the monocytes is necessary, and damage to the monocytes may be a little concerned.
  • the sample for which negative selection of monocytes is performed may be a mononuclear cell fraction obtained by density gradient centrifugation of a body fluid. In this case, magnetic beads having a relatively high affinity for lymphocytes are used.
  • a magnetic cell separator When using magnetic beads, a magnetic cell separator can be used.
  • a magnetic cell separation device separates monocytes from a body fluid based on a predetermined program by setting a reagent such as a magnetic bead in the device together with a body fluid sample such as blood.
  • a reagent such as a magnetic bead in the device together with a body fluid sample such as blood.
  • Use of such an apparatus is preferable in that monocytes can be separated from body fluids quickly and with high yield.
  • the proliferation efficiency of monocytes by the monocyte proliferating agent of the present invention can be significantly increased.
  • Examples of the magnetic cell separation apparatus suitable for the present invention include “RoboSep (trademark)” (Veritas Co., Ltd.) and the like.
  • Samples for obtaining raw material monocytes include body fluids such as blood and bone marrow fluid.
  • Blood is collected from a living body (for example, a human cancer patient), and examples thereof include peripheral blood and umbilical cord blood. Among these, peripheral blood is preferable from the viewpoint of reducing the burden on the subject.
  • the method of collecting body fluid is not particularly limited, and a method of collecting from a site such as an arm, wrist, or foot using a syringe, a winged needle, or the like can be used.
  • the amount of bodily fluid to be used is small, so compared with the conventionally used methods such as apheresis, the burden on the living body (cost, time, etc.) when collecting bodily fluids ) Is extremely small.
  • the amount of body fluid used is 100 mL or less, 90 mL or less, 80 mL or less, 70 mL or less, 60 mL or less, 50 mL or less, 40 mL or less, 35 mL or less, 30 mL or less, 25 mL or less. , 20 mL or less, 15 mL or less, 10 mL or less, 5 mL or less, 1 mL or less, or 0.5 mL or less.
  • the minimum of the amount of body fluids is not specifically limited, For example, it may be 0.1 mL or more.
  • the monocytes obtained by the monocyte production method of the present invention may be differentiated into dendritic cells through a differentiation step as they are, or may be cryopreserved by a conventionally known method.
  • the cryopreserved monocytes can be subjected to a monocyte differentiation process after thawing.
  • monocytes are preferably not cryopreserved from the viewpoint of preventing loss of monocytes that can be differentiated.
  • the monocytes since it is not necessary to culture monocytes many times in order to obtain monocytes that can be subjected to a differentiation process, the monocytes can be subjected to a monocyte differentiation process without being cryopreserved.
  • the method for producing dendritic cells of the present invention comprises a monocyte producing step for producing monocytes by the monocyte producing method of the present invention, and differentiating the monocytes obtained in the monocyte producing step into dendritic cells. Differentiation step.
  • Dendritic cells Methods for differentiating monocytes into dendritic cells are known per se. That is, for example, when monocytes are cultured in a differentiation medium containing IL-4 or the like, the monocytes differentiate into immature dendritic cells. When immature dendritic cells obtained in a medium containing TNF- ⁇ and the like are cultured, the immature dendritic cells differentiate into mature dendritic cells.
  • the dendritic cells in the present invention include both immature dendritic cells or mature dendritic cells.
  • the differentiation step of the present invention it is preferable to use a medium containing one or more of Flt-3L, IL-3, or IFN- ⁇ .
  • a medium containing one or more of Flt-3L, IL-3, or IFN- ⁇ it is preferable to use.
  • monocytes can be differentiated into dendritic cells while proliferating, and a larger number of dendritic cells can be obtained.
  • the medium containing the above components may not be used.
  • Pulse process Present immature dendritic cells or mature dendritic cells present a desired antigen by incorporating (pulsing) a substance (such as a peptide) extracted from cancer cells, a cancer-specific antigen, an artificial antigen, or the like. Dendritic cells that can be obtained can be obtained.
  • the pulse process may be performed in the process of manufacturing dendritic cells, or may be performed in the process of vaccine preparation after the manufacture of dendritic cells as described later.
  • the pulse method is not particularly limited as long as it allows a dendritic cell to incorporate a desired antigen, and includes culturing a dendritic cell together with the desired antigen.
  • immature dendritic cells have higher antigen uptake than immature dendritic cells, so it is preferable to pulse against immature dendritic cells.
  • the obtained cells are dendritic cells.
  • the cell surface marker of dendritic cells include CD83. Cells with such markers are recognized as dendritic cells.
  • dendritic cells obtained by the method for producing dendritic cells of the present invention have antigen-presenting ability is confirmed by analyzing the cell surface marker of dendritic cells by flow cytometry.
  • cell surface markers of dendritic cells having antigen-presenting ability include MHC class I molecules (HLA-A, B, C) and MHC class II molecules (HLA-DR). It is recognized that dendritic cells having such markers have antigen presenting ability.
  • the method for producing a dendritic cell vaccine of the present invention comprises a dendritic cell production process for producing a dendritic cell by the method for producing a dendritic cell of the present invention, and a dendritic cell obtained by the above dendritic cell production process. And preparing a dendritic cell vaccine.
  • a method for preparing dendritic cells into a dendritic cell vaccine is not particularly limited, and examples thereof include mixing dendritic cells with drugs (physiological saline, Ringer's solution, etc.) prescribed in ordinary vaccine preparations. Moreover, when using the dendritic cell which has not passed through the pulse process, a pulse process is performed with respect to the dendritic cell.
  • the method for producing a dendritic cell vaccine of the present invention may not include a cryopreservation step of cryopreserving at least one of monocytes and dendritic cells.
  • a cryopreservation step of cryopreserving at least one of monocytes and dendritic cells it is necessary to stock monocytes and dendritic cells because a sufficient amount of monocytes and dendritic cells can be obtained in a short period of time so that the dendritic cell vaccine can be produced. And can be prepared in a timely manner. Therefore, monocytes and dendritic cells produced as necessary can be used for the production of dendritic cell vaccines without being cryopreserved. This can avoid cell damage that may occur due to freezing and a decrease in the antigen-presenting ability of dendritic cells.
  • the obtained dendritic cell vaccine can be administered to a living body by a conventionally known method such as intradermal injection.
  • the raw material monocytes are preferably obtained from body fluids collected from a subject to which a dendritic cell vaccine is administered.
  • a dendritic cell vaccine with few harmful side effects can be obtained.
  • a body fluid collected from a person who is not the subject of administration may be used as long as an immune reaction that can be caused by administration of the dendritic cell vaccine is acceptable.
  • Example 1 Separation of monocytes> 25 mL of peripheral blood was collected from the arms of three cancer patients.
  • the peripheral blood was subjected to density gradient centrifugation using Ficoll solution (GE Healthcare Japan, Inc.) to obtain mononuclear cell fraction cells.
  • the cells of the obtained mononuclear cell fraction are set in a magnetic cell separator (trade name; RoboSep, Veritas Co., Ltd.), and CD14 + monocytes and CD16 + monocytes according to a program set for monocyte separation. Isolated sphere.
  • the number of monocytes in each sample was measured according to the following conditions.
  • Cell surface markers were analyzed by flow cytometry for 3 ⁇ 10 5 cells in each sample.
  • monocyte marker CD14 was used as a marker. The result is shown in FIG.
  • FIG. 1 comparing the monocytes before (A) and after (B), the number of monocytes per cell in the sample (before separation; 534, After separation; 2938) was markedly increased, indicating that a sample enriched with monocytes was obtained.
  • Example 2 Monocyte proliferation>
  • the monocytes derived from cancer patients (CD14 + monocytes and CD16 + monocytes) separated according to the above method are used as the monocyte proliferating agent of the present invention (Flt-3L was used in this example) according to the following conditions. Cultured in a monocyte growth medium containing.
  • composition of monocyte growth medium Serum-free synthetic medium for lymphocytes (X-VIVO 15, Takara Bio Inc.) Flt-3L (Cellgenix) 2000 IU / mL GM-CSF (Miltenyi Biotec) 1000 IU / mL Gentamicin 50 ng / mL 5% autologous plasma (plasma obtained from each cancer patient)
  • the separated monocytes were added to the above monocyte growth medium so as to be 2 ⁇ 10 5 cells / mL per medium, and cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 3 days. On the fourth day of culture, the cells were cultured in the monocyte differentiation medium (1) in Example 3 for 8 days. On the 12th day of culturing, the cells were cultured in the monocyte differentiation medium (1) in Example 3 for 3 days. That is, the total culture period is 14 days.
  • Monocytes at each time point after the start of culture, 3 days after culture, 6 days after culture, 11 days after culture, and 14 days after culture were collected, stained with trypan blue, and the number of cells was counted by microscopic observation.
  • the result is shown in FIG.
  • monocytes have grown to about 2 ⁇ 10 6 cells / mL at the third day of culture. At this point, it can be subjected to a differentiation process. Furthermore, it can be expected to obtain dendritic cells of 10 7 cells / mL or more by culturing in the presence of the monocyte proliferating agent of the present invention also in the differentiation step.
  • composition of monocyte differentiation medium (1) A medium for differentiating monocytes into immature dendritic cells was prepared by adding 1000 IU IL-4 (Miltenyi Biotec) to the monocyte growth medium. Hereinafter, this medium is referred to as “monocyte differentiation medium (1)”.
  • composition of monocyte differentiation medium (2) A medium for differentiating immature dendritic cells into mature dendritic cells was prepared by further adding the following components to the monocyte differentiation medium (1).
  • this medium is referred to as “monocyte differentiation medium (2)”.
  • IL-1 ⁇ 10 ng / mL IL-6 (Miltenyi Biotec) 1000 IU / mL PGE2 (Cayman Chemical) 1 ⁇ g / mL TNF- ⁇ (Miltenyi Biotec) 20 ng / mL 0.1KE Pishibanil chloride (Chugai Pharmaceutical)
  • Proliferated monocytes ie, monocytes obtained by culturing for 3 days under the conditions of Example 2 were cultured in the monocyte differentiation medium (1) for 8 days under the same conditions as monocyte proliferation. And differentiated into immature dendritic cells. At the end of 8 days of culture, antigen peptide was added and pulsed.
  • the obtained immature dendritic cells were cultured in a monocyte differentiation medium (2) under the same conditions as monocyte proliferation for 3 days to differentiate into mature dendritic cells.
  • the obtained mature dendritic cells were analyzed for cell surface markers by flow cytometry.
  • markers CD83, which is a marker for mature dendritic cells
  • CD14 which is a marker for monocytes
  • the result is shown in FIG.
  • the number of mature dendritic cells obtained was analyzed by flow cytometry using CD83, which is a marker of mature dendritic cells, as a marker.
  • FIGS. 3 (A) and 3 (B) there are no cells expressing CD14 (ie, monocytes) among the differentiated cells, and cells expressing CD83 (ie, mature trees). Monocytes have differentiated into mature dendritic cells.
  • the antigen-presenting ability of the obtained mature dendritic cells was measured by flow cytometry using MHC class I molecules (HLA-A, B, C) and MHC class II molecules (HLA-DR) as markers. Analyzed. The result is shown in FIG. As shown in FIG. 3C, the obtained mature dendritic cells express MHC class I molecules and MHC class II molecules, and are found to have antigen presenting ability.
  • cytokines Examination of the effects of various cytokines on monocyte proliferation> The effects of the monocyte proliferating agent (Flt-3L, IL-3 or IFN- ⁇ ) and various cytokines (SCF, IFN- ⁇ or IFN- ⁇ ) of the present invention on monocyte proliferation were examined according to the following conditions. .
  • Monocytes separated according to the method described in Example 1 were added in a 96-well petri dish at 1 ⁇ 10 3 cells / well in a medium and cultured for 6 days under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the composition of the culture medium is as follows.
  • the monocyte proliferating agent (Flt-3L, IL-3 or IFN- ⁇ ) of the present invention the proliferation of monocytes is promoted. Further, in addition to the monocyte proliferating agent of the present invention, monocyte proliferation is remarkably promoted by further combining GM-CSF.
  • Example 5 Examination of the viable cell rate of monocytes> The viability of dendritic cells obtained by differentiating monocytes grown with the monocyte proliferating agent of the present invention was examined according to the following conditions.
  • the obtained mature dendritic cells were stained with trypan blue, and the total number of cells (the total number of obtained mature dendritic cells) and the viable cell ratio were measured. The results are shown in Table 2.

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Abstract

　単球を高効率かつ簡便に増殖させることができる手段を提供すること。　本発明は、Ｆｌｔ－３Ｌ、ＩＬ－３又はＩＦＮ－γのうちの１つ以上からなり、単球から樹状細胞への分化処理前に使用される単球増殖剤を提供する。また、本発明は、Ｆｌｔ－３Ｌ、ＩＬ－３又はＩＦＮ－γのうちの１つ以上を含み、単球から樹状細胞への分化処理前に使用される単球増殖用培地を提供する。本発明の単球増殖用培地は、ＧＭ－ＣＳＦを含んでいてもよい。

Description

単球増殖剤、単球増殖用培地、単球の製造方法、樹状細胞の製造方法、及び樹状細胞ワクチンの製造方法
　本発明は、単球増殖剤、単球増殖用培地、単球の製造方法、樹状細胞の製造方法、及び樹状細胞ワクチンの製造方法に関する。
　近年、癌の治療において、樹状細胞ワクチンの使用が着目されている。樹状細胞ワクチンは、ワクチンを投与される対象（例えば、癌患者）由来の樹状細胞に癌抗原を取り込ませた（パルスした）樹状細胞から調製され、ワクチンを投与される対象の体内に投与される。投与された樹状細胞はＴ細胞に癌抗原を提示し、抗原を提示されたＴ細胞（ＣＴＬ）は、癌細胞を特異的に攻撃するため、体内の正常細胞を損傷させずに癌を治療することができる。
　ところで、樹状細胞ワクチンの製造のために必要な樹状細胞は、体内から直接分離することができない。そのため、樹状細胞は、ワクチンを投与される対象から採取した血液から単球を分離し、この単球を樹状細胞に分化させることで得る。
　従来知られる樹状細胞ワクチンを製造するために使用される単球を採取する方法としては、成分採血装置を使用して血液中の白血球を分離する方法（以下、この方法を「アフェレーシス」という）が知られている。しかし、アフェレーシスは、装置の運用に費用がかかる上に、装置の操作のために高度な技術が要求される。また、アフェレーシスでは、単球だけではなく、単球以外の成分（白血球や赤血球や血小板等）も含んだ混合物を採取する。そのため、アフェレーシスの後に赤血球や血小板等の単球以外の成分を除くために単核球の分離工程を行うことが一般的である。
　樹状細胞ワクチンを臨床応用するには、１回の投与におおよそ１×１０７個の細胞数を使用することが望ましい。このような細胞数を確保するために、通常、同一の対象から間隔をあけて８回程度のアフェレーシスが行われる。また、血液中に存在する単球の割合は少ないため、樹状細胞ワクチンを製造できるほどに十分な量の単球を得るためにアフェレーシスを用いると、血液をアフェレーシス装置内で循環させて白血球成分を十分に採取する必要があるが、これは体力的また時間的に患者への負担が非常に大きい。そのため、アフェレーシス中、患者の容態が急変すると、アフェレーシスを途中で中断し、樹状細胞ワクチン療法そのものを断念せざるを得ない場合がある。また、アフェレーシスで単球の成分を採取した場合には、通常５～８回分程度の樹上細胞ワクチンを作製することができるとされるものの、得られる樹上細胞ワクチンの実際の量は患者の血液状態等によって変動する。
　また、末梢血を腕等から採取する等の従来の採血方法では、患者の負担は軽いものの、得られた単球をそのまま従来法で樹状細胞に分化させても十分な量の細胞数が得られないという欠点がある。そのため、末梢血の採血から得られた単球から十分な細胞数の樹状細胞ワクチンを作製するには、その過程において単球を増殖させることが課題であり、それを克服する技術が望まれていた。また、このような技術においては、樹状細胞ワクチンの作製期間は、樹上細胞ワクチンの投与間隔を考慮した場合、２週間程度で作製できることがより望ましい。
　そこで、上記の課題を解決するために、血液から分離された単球を体外で増殖させることが考えられる。このような方法として、特許文献１には、単球中の特定の物質の発現を阻害した状態で単球を培養することが開示されている。しかし、この方法は、組換え体の作製工程や、長期の培養時間を要する。
特表２０１０－５１５４４２号公報
　本発明は、単球を高効率かつ簡便に増殖させることができる手段を提供することを目的とする。
　本発明者らは、造血幹細胞の増殖等に関与する特定のサイトカインが、単球を高効率に増殖できることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明は、具体的には、以下のようなものを提供する。
　（１）　Ｆｌｔ－３Ｌ、ＩＬ－３又はＩＦＮ－γのうちの１つ以上からなり、単球から樹状細胞への分化処理前に使用される単球増殖剤。
　（２）　Ｆｌｔ－３Ｌ、ＩＬ－３又はＩＦＮ－γのうちの１つ以上を含み、単球から樹状細胞への分化処理前に使用される単球増殖用培地。
　（３）　ＧＭ－ＣＳＦを含む（２）に記載の単球増殖用培地。
　（４）　原料単球を、（２）又は（３）に記載の単球増殖用培地中で培養することによって増殖させる増殖工程を含む単球の製造方法。
　（５）　上記原料単球として、単球及び単球以外の白血球成分を含む混合物を用いる（４）に記載の単球の製造方法。
　（６）　上記増殖工程の前に、体液中の単球以外の成分の含有率を低減させて上記原料単球を得る低減工程を含む（４）又は（５）に記載の単球の製造方法。
　（７）　上記低減は、上記原料単球中の単球及び単球以外の白血球成分、血漿、赤血球の少なくとも１つに対して他方より高い親和性を有する磁気ビーズを使用して行う（６）に記載の単球の製造方法。
　（８）　１００ｍＬ以下の末梢血から上記原料単球を得る（６）又は（７）に記載の単球の製造方法。
　（９）　上記単球を凍結保存する凍結保存工程を含まない（６）から（８）のいずれかに記載の単球の製造方法。
　（１０）　（４）から（９）のいずれかに記載の単球の製造方法によって単球を製造する単球製造工程と、
　上記単球製造工程で得られた単球を樹状細胞へと分化させる分化工程と、
を含む樹状細胞の製造方法。
　（１１）　上記分化工程において、上記単球は、Ｆｌｔ－３Ｌ、ＩＬ－３又はＩＦＮ－γのうちの１つ以上を含む培地中で培養される（１０）に記載の樹状細胞の製造方法。
　（１２）　上記樹状細胞をパルスするパルス工程を含む（１０）又は（１１）に記載の樹状細胞の製造方法。
　（１３）　（１０）から（１２）のいずれかに記載の樹状細胞の製造方法によって樹状細胞を製造する樹状細胞製造工程と、
　上記樹状細胞製造工程で得られた樹状細胞を樹状細胞ワクチンに調製する調製工程と、
を含む樹状細胞ワクチンの製造方法。
　（１４）　上記単球及び上記樹状細胞のうち少なくとも一方を凍結保存する凍結保存工程を含まない（１３）に記載の樹状細胞ワクチンの製造方法。
　（１５）　上記原料単球は、上記樹状細胞ワクチンを投与される対象から採取した体液から得たものである（１３）又は（１４）に記載の樹状細胞ワクチンの製造方法。
　本発明によれば、単球を高効率かつ簡便に増殖させることができる手段が提供される。
末梢血から単球を分離する前（Ａ）、及び、分離した後（Ｂ）における、それぞれの細胞試料（３×１０５ｃｅｌｌｓ）中に含まれる単球数を示す図である。 本発明の一実施形態にかかる単球増殖剤の存在下で３日間培養し、その後、単球を１１日間培養して樹状細胞に分化させたときの細胞数の経時的変化を示す図である。 本発明の単球増殖剤によって増殖させた単球が成熟樹状細胞に分化したことを示す図（Ａ）及び（Ｂ）、ならびに、（Ａ）及び（Ｂ）において得られた成熟樹状細胞が抗原提示能を有することを示す図（Ｃ）である。
　以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明を限定することを意図するものではない。
＜単球増殖剤＞
　本発明の単球増殖剤は、Ｆｌｔ－３Ｌ、ＩＬ－３又はＩＦＮ－γのうちの１つ以上からなり、単球から樹状細胞への分化処理前に使用される。なお、本発明の単球増殖剤の使用態様は特に限定されないが、単球を培養可能な培地に添加され、又は培地の成分としてプレミックスされた形態で用いられるのが一般的と考えられる。
　「単球から樹状細胞への分化処理」とは、単球を樹状細胞に分化させるのに好適な条件、すなわち、所定量の特定のサイトカイン（ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、及びＩＬ－６等）の存在下で単球を培養することを指す。分化処理の過程でも単球数はある程度増加することが知られているが、本発明の単球増殖剤は、この分化処理に用いられるものではなく、その前段階で用いられる。
　上記各サイトカインについて、単球を樹状細胞に分化させる量は、その量のサイトカインを含む培地で、３７℃、５％　ＣＯ２の条件で６日間培養したときに、全細胞数における樹状細胞の数が２０％以上である量を指し、具体的な量は培地の成分や培養条件により異なる。
　本発明の単球増殖剤によれば、上記の分化処理に供する前に、樹状細胞ワクチンを製造するのに十分な量（例えば、１０６～１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上）まで単球を増殖でき、樹状細胞ワクチンのために単球の培養工程を何度も繰り返す必要がないため簡便である。
　Ｆｌｔ－３Ｌ（Ｆｌｔ３－Ｌｉｇａｎｄ）、ＩＬ－３（インターロイキン－３）、ＩＦＮ－γ（インターフェロン－γ）は、造血幹細胞の増殖等に関与するサイトカインとして知られているであるが、本願発明者らの検討の結果、驚くべきことに、効果的に単球を増殖できることが見出された。
　（Ｆｌｔ－３Ｌ）
　単球を増殖させるために好適なＦｌｔ－３Ｌの量は特に限定されないが、単球を培養可能な培地あたり、１００～１００００ＩＵ／ｍＬ、好ましくは１０００～５０００ＩＵ／ｍＬ、最も好ましくは１０００～３０００ＩＵ／ｍＬであってもよい。
　（ＩＬ－３）
　単球を増殖させるために好適なＩＬ－３の量は特に限定されないが、単球を培養可能な培地あたり、１００～１００００ＩＵ／ｍＬ、好ましくは１００～５０００ＩＵ／ｍＬ、最も好ましくは５００～３０００ＩＵ／ｍＬであってもよい。
　（ＩＦＮ－γ）
　単球を増殖させるために好適なＩＦＮ－γの量は特に限定されないが、単球を培養可能な培地あたり、１～１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１～５００ｎｇ／ｍＬ、最も好ましくは１～５０ｎｇ／ｍＬであってもよい。
　本発明の単球増殖剤は、Ｆｌｔ－３Ｌ、ＩＬ－３又はＩＦＮ－γのいずれかを単独で使用してもよく、２つ以上を組み合わせてもよい。前述の通り、Ｆｌｔ－３Ｌ、ＩＬ－３及びＩＦＮ－γは、類似する機能を有することから、組み合わせて用いても互いの機能を阻害することは想定されない。これらのうち２つ以上を組み合わせる場合、それぞれのサイトカインの配合量は上述の範囲内であってもよく、それより少なくてもよい。
　本発明の単球増殖剤によって増殖した細胞が単球であるかどうかは、フローサイトメトリーによって、得られた細胞の細胞表面マーカーを解析することで確認する。単球の細胞表面のマーカーとしてはＣＤ１４等が挙げられる。このようなマーカーを有する細胞は単球であると認められる。
＜単球増殖用培地＞
　本発明の単球増殖用培地は、Ｆｌｔ－３Ｌ、ＩＬ－３又はＩＦＮ－γのうちの１つ以上を含み、単球から樹状細胞への分化処理前に使用される。具体的に、単球増殖用培地は、さらに、単球を培養可能とするための栄養成分、ｐＨ調整剤等を含み得る。かかる成分を含む培地としては、特に限定されないが、リンパ球用無血清合成培地、ＡＩＭ－Ｖ、ＲＰＭＩ－１６４０等が挙げられる。なお、本明細書における「培地」とは、液体化された調製済みの形態のみならず、調製前の成分混合物（通常、粉体）も包含する。
　本発明の単球増殖用培地は、さらに、単球の分化に関与するサイトカイン（ＧＭ－ＣＳＦ（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ　Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　Ｃｏｌｏｎｙ－Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ；顆粒球単球コロニー刺激因子））を含んでいてもよい。
　単球は、ＧＭ－ＣＳＦの存在下でマクロファージに分化し、ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４の存在下で樹状細胞に分化しやすい傾向がある。しかし、本発明者による検討の結果、ＧＭ－ＣＳＦを含む本発明の単球増殖用培地によれば、単球の増殖を顕著に促進できることが見出された。ＧＭ－ＣＳＦ自体にも、単球の増殖効果があることは従来知られていたものの、ＧＭ－ＣＳＦを含む本発明の単球増殖用培地によれば、単球を分化させることなく、単球の増殖を顕著に促進できる。また、本発明の単球増殖用培地には、ＧＭ－ＣＳＦに加えて、さらに、単球を樹状細胞へと分化させる量（例えば、５００～２，０００ＩＵ／ｍＬ）未満のＩＬ－４を含んでいてもよい。本発明の単球増殖用培地に含まれるＧＭ－ＣＳＦは、５００～２，０００ＩＵ／ｍＬの範囲が挙げられる。
　本発明の単球増殖用培地には、細胞培養において通常使用される試薬が含まれていてもよい。このような試薬として、抗生物質（ゲンタマイシン、カナマイシン等）、アルブミン、血清（ウシ胎仔血清等）等が挙げられる。また、本発明の単球増殖用培地には、生体（例えば、ヒト、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、カンガルー、サル等の哺乳類動物）由来の自己血漿（つまり、増殖させようとする単球と自己血漿は同じ生体から得られたものであることを意味する）が含まれていてもよい。また、本発明の単球増殖用培地には、樹状細胞への分化誘導を促進するという目的で、塩化ピシバニール、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）等が含まれていてもよい。
＜単球の製造方法＞
　本発明の単球の製造方法は、原料単球を、本発明の単球増殖用培地中で培養することによって増殖させる増殖工程を含む。
　（増殖工程）
　本発明における増殖工程で使用される条件としては、特に限定されないが、多くの単球が分化し始める前に単球を増殖させる観点で、３０～４０℃、２～８％　ＣＯ２の条件で培養してもよい。培養時間は、所要される単球の量によって適宜調整でき、３～２０日、３～１８日、３～１４日、３～１０日であってもよい。培養中、従来公知の方法で適宜培地交換を行ってもよい。
　本発明の単球の製造方法によれば、例えば１４日間という短い培養時間で、原料単球中の単球を臨床使用可能なレベル（例えば、１０６～１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上）まで増殖できる。臨床使用可能なレベルとは、増殖させた単球を分化させた樹状細胞を樹状細胞ワクチンに調製した場合、得られた樹状細胞ワクチンがそのまま非凍結処理ワクチンとして使用可能なレベルを指す。
　本発明の単球の製造方法においては、本発明の単球増殖用培地中で単球を培養するという、単球への負荷が少ない条件下で単球を増殖させる。そのため、本発明の単球の製造方法によれば、高い生細胞率（例えば、９０％超）にて単球を得ることが期待できる。
　（原料単球）
　本発明における原料単球とは、単球を含む試料である。原料単球は、単球のみからなってもよく、また、本発明の単球の製造方法によれば単球を選択的に効率よく増殖できるため、単球と、単球以外の白血球成分（例えば、リンパ球、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞）とを含む混合物であってもよい。この混合物はさらに血漿、赤血球を含んでいてもよい。混合物としては、血液等の体液の試料から密度勾配遠心分離等で得られる、主に単球及びリンパ球を含む単核球画分であってもよい。
　（低減工程）
　上記増殖工程の前に、体液中の単球以外の成分の含有率を低減させて上記原料単球を得る低減工程を行うことが好ましい。低減は、例えば、磁気ビーズを使用した方法、密度勾配遠心法、体液中の成分のうち単球のみをシャーレへ接着させて単球を分離する方法や、これらの方法の組み合わせ等で行うことができる。
　簡便かつ高収率で単球を回収でき、単球へのダメージが小さい点で、磁気ビーズを使用することが好ましい。この磁気ビーズは、原料単球中の単球及び単球以外の白血球成分、血漿、赤血球の少なくとも１つ（好ましくはすべて）に対して他方より高い親和性を有する磁気ビーズである。かかる磁気ビーズは、磁性を帯びた担体に、分離しようとする物質に対する抗体等が結合した構造を有してよい。また、体液を密度勾配遠心して得られた単核球画分について、磁気ビーズによる処理を行うことは、単球の収率がさらに高まる点で好ましい。
　単球に対して相対的に高い親和性を有する磁気ビーズを使用すると、体液から主に単球を分離できる（これは、単球の陽性選択と呼ばれる）。分離された単球から従来公知の方法で磁気ビーズを外すことで、原料単球が得られる。この態様は、準備する磁気ビーズの種類が少ない点で有利であるが、磁気ビーズを単球から外す工程が必要であり、単球への損傷が若干懸念され得る。
　単球以外の白血球成分、血漿、赤血球の少なくとも１つに対して相対的に高い親和性を有する磁気ビーズを使用すると、体液から単球以外の成分を除去することができる（これは、単球の陰性選択と呼ばれる）。その結果、単球を主に含む原料単球が得られる。この態様は、準備する磁気ビーズの種類が多い点で不利となり得るが、磁気ビーズを単球から外す工程が不要であり、良質の単球が確実に得られる点で好ましい。単球の陰性選択が行われる試料は、体液を密度勾配遠心して得られた単核球画分であってもよい。この場合、リンパ球に対して相対的に高い親和性を有する磁気ビーズを使用する。
　磁気ビーズを使用する場合、磁気細胞分離装置を使用できる。磁気細胞分離装置は、血液等の体液の試料とともに磁気ビーズ等の試薬を装置内にセットすることで、所定のプログラムに基づいて体液から単球を分離する。このような装置の使用は、体液から単球を迅速かつ高収率で分離できる点で好ましい。単球を高収率で分離すると、本発明の単球増殖剤による単球の増殖効率を著しく高めることができる。
　本発明において好適な磁気細胞分離装置としては、例えば、「ＲｏｂｏＳｅｐ（商標）」（株式会社ベリタス）等が挙げられる。
　（体液）
　原料単球を得るための試料として、血液や骨髄液といった体液が挙げられる。血液は、生体（例えば、ヒト癌患者）から採取され、末梢血、臍帯血等が挙げられる。このうち、被採取者の負担軽減の観点で、末梢血が好ましい。体液の採取方法としては特に限定されず、腕、手首、足等の部位から、シリンジ、翼状針等を使用して採取する方法等を使用できる。本発明の単球の製造方法においては、使用する体液の量が少なくて済むため、従来使用されてきたアフェレーシス等の方法と比較して、体液を採取する際の生体に対する負担（費用、時間等）が著しく少ない。
　従来は、樹状細胞ワクチンの製造のために、例えば３００～４００ｍＬという大量の血液を生体から採取していた。しかし、本発明の単球の製造方法によれば、使用する体液の量は、１００ｍＬ以下、９０ｍＬ以下、８０ｍＬ以下、７０ｍＬ以下、６０ｍＬ以下、５０ｍＬ以下、４０ｍＬ以下、３５ｍＬ以下、３０ｍＬ以下、２５ｍＬ以下、２０ｍＬ以下、１５ｍＬ以下、１０ｍＬ以下、５ｍＬ以下、１ｍＬ以下、０．５ｍＬ以下という少量であってもよい。体液量の下限は特に限定されないが、例えば０．１ｍＬ以上であってよい。
　本発明の単球の製造方法によって得られた単球は、そのまま分化工程を経て樹状細胞に分化させてもよく、従来公知の方法で凍結保存してもよい。凍結保存された単球は、解凍した後に、単球の分化工程に供することができる。ただし、分化させることができる単球の損失を防ぐ観点で単球を凍結保存しないことが好ましい。本発明では、分化工程に供することのできる単球を得るために何度も単球の培養を行う必要がないため、単球を凍結保存することなく単球の分化工程に供することができる。
＜樹状細胞の製造方法＞
　本発明の樹状細胞の製造方法は、本発明の単球の製造方法によって単球を製造する単球製造工程と、上記単球製造工程で得られた単球を樹状細胞へと分化させる分化工程と、を含む。
　（分化工程）
　単球を樹状細胞へ分化させる方法自体は、従来公知である。つまり、例えばＩＬ－４等を含む分化用培地中で単球を培養すると、単球は未成熟樹状細胞に分化する。ＴＮＦ－α等を含む培地中で得られた未成熟樹状細胞を培養すると、未成熟樹状細胞は成熟樹状細胞に分化する。本発明における樹状細胞とは、未成熟樹状細胞又は成熟樹状細胞の双方を包含する。
　本発明の分化工程においても、Ｆｌｔ－３Ｌ、ＩＬ－３又はＩＦＮ－γのうちの１つ以上を含む培地を用いることが好ましい。これにより、単球を増殖させながら樹状細胞へと分化させることができ、より多数の樹状細胞を得ることができる。ただし、増殖工程で得られた単球の数が十分であるとか、所要される樹状細胞の数があまり多くないといった場合には、上記成分を含む培地を用いなくてもよい。
　（パルス工程）
　得られた未成熟樹状細胞又は成熟樹状細胞に、癌細胞から抽出した物質（ペプチド等）や癌特異的抗原、人工抗原等を取り込ませる（パルスする）ことで、所望の抗原を提示することのできる樹状細胞を得ることができる。なお、パルス工程は、樹状細胞を製造する過程で行ってもよく、後述のように樹状細胞の製造後のワクチン調製の過程で行ってもよい。
　パルスの方法としては、樹状細胞に所望の抗原を取り込ませることができる方法であれば特に限定されないが、樹状細胞を所望の抗原とともに培養すること等が挙げられる。一般に、抗原の取り込みやすさは、成熟樹状細胞よりも未成熟樹状細胞の方が高いため、パルスは未成熟樹状細胞に対して行うことが好ましい。
　得られた細胞が樹状細胞であるかどうかは、フローサイトメトリーによって樹状細胞の細胞表面マーカーを解析することで確認する。樹状細胞の細胞表面のマーカーとしてはＣＤ８３等が挙げられる。このようなマーカーを有する細胞は樹状細胞であると認められる。
　本発明の樹状細胞の製造方法によって得られた樹状細胞が抗原提示能を有するかどうかは、フローサイトメトリーによって樹状細胞の細胞表面マーカーを解析することで確認する。抗原提示能を有する樹状細胞の細胞表面のマーカーとしてはＭＨＣクラスＩ分子（ＨＬＡ－Ａ，Ｂ，Ｃ）、及び、ＭＨＣクラスＩＩ分子（ＨＬＡ－ＤＲ）等が挙げられる。このようなマーカーを有する樹状細胞は抗原提示能を有すると認められる。
＜樹状細胞ワクチンの製造方法＞
　本発明の樹状細胞ワクチンの製造方法は、本発明の樹状細胞の製造方法によって樹状細胞を製造する樹状細胞製造工程と、上記樹状細胞製造工程で得られた樹状細胞を樹状細胞ワクチンに調製する調製工程と、を含む。
　（調製工程）
　樹状細胞を樹状細胞ワクチンに調製する方法は特に限定されないが、樹状細胞を、通常のワクチン製剤に処方される薬剤（生理食塩水、リンゲル液等）と混合することが挙げられる。また、パルス工程を経ていない樹状細胞を用いる場合、樹状細胞に対してパルス工程を行う。
　本発明の樹状細胞ワクチンの製造方法は、単球及び樹状細胞のうち少なくとも一方を凍結保存する凍結保存工程を含まなくてもよい。本発明の樹状細胞ワクチンの製造方法においては、樹状細胞ワクチンを製造できるほどに十分な量の単球や樹状細胞を短期間で得られるため、単球や樹状細胞をストックする必要なく適時調製できる。そのため、必要に応じて製造した単球や樹状細胞を、凍結保存せずに樹状細胞ワクチンの製造に供することができる。これにより、凍結によって生じる可能性がある細胞の損傷や、樹状細胞の抗原提示能の低下を回避できる。
　得られた樹状細胞ワクチンは、皮内注射等の従来知られた方法によって生体に投与できる。
　原料単球は、樹状細胞ワクチンを投与される対象から採取した体液から得たものであることが好ましい。樹状細胞ワクチンを投与される対象に由来する原料単球を使用することで、有害な副作用の少ない樹状細胞ワクチンを得ることができる。ただし、樹状細胞ワクチンの投与によって生じ得る免疫反応が許容されるものである限り、投与される対象ではない者から採取した体液を用いてもよい。
　以下、本発明を実施例に基づき説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
＜実施例１；単球の分離＞
　３名の癌患者の腕から末梢血を２５ｍＬ採取した。この末梢血を、それぞれ、フィコール溶液（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いて、密度勾配遠心を行い、単核球画分の細胞を得た。得られた単核球画分の細胞を、磁気細胞分離装置（商品名；ＲｏｂｏＳｅｐ、株式会社ベリタス）にセットし、単球分離用に設定されたプログラムに従って、ＣＤ１４＋単球、及びＣＤ１６＋単球を分離した。
　単球を分離する前の末梢血、及び、末梢血から単球を分離した後の試料について、各試料中の単球数を下記の条件に従って計測した。
　各試料中の３×１０５ｃｅｌｌｓの細胞について、細胞表面のマーカーをフローサイトメトリーによって解析した。なお、マーカーとして単球のマーカーであるＣＤ１４を用いた。その結果を図１に示す。図１に示される通り、単球を分離する前（Ａ）と分離した後（Ｂ）とを比較すると、分離工程によって、試料中の細胞数当たりの単球の個数（分離前；５３４個、分離後；２９３８個）が顕著に増加しており、単球が濃縮された試料が得られたことが分かる。
＜実施例２；単球の増殖＞
　上記の方法に従って分離した癌患者由来の単球（ＣＤ１４＋単球、及びＣＤ１６＋単球）を、下記の条件に従って、本発明の単球増殖剤（本例ではＦｌｔ－３Ｌを使用した）を含む単球増殖用培地中で培養した。
（単球増殖用培地の組成）
　リンパ球用無血清合成培地（Ｘ－ＶＩＶＯ　１５、タカラバイオ株式会社）　
　Ｆｌｔ－３Ｌ（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ社）　２０００ＩＵ／ｍＬ
　ＧＭ－ＣＳＦ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社）　１０００ＩＵ／ｍＬ
　ゲンタマイシン　５０ｎｇ／ｍＬ
　５％　自己血漿（各癌患者から得られた血漿）
　上記の単球増殖用培地に、分離された単球を、培地当たり２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように加え、３７℃、５％　ＣＯ２の条件で３日間培養した。培養４日目に実施例３における単球分化用培地（１）で８日間培養した。培養１２日目に実施例３における単球分化用培地（１）で３日間培養した。つまり、培養期間の合計は１４日間である。
　培養開始時点、培養３日後、培養６日後、培養１１日後及び培養１４日後の各時点の単球を回収し、トリパンブルー染色し、顕微鏡観察によって、細胞数を計測した。その結果を図２に示す。図２に示される通り、培養３日目の時点で単球が２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ程度まで増殖している。この時点で、分化工程に供することが可能である。さらに、分化工程においても本発明の単球増殖剤の存在下で培養することで、１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上の樹状細胞を得ることが期待できる。
＜実施例３；単球の分化＞
　上記で得られた単球を、下記の条件に従って培養した。
（単球分化用培地（１）の組成）
　単球増殖用培地に、１０００ＩＵ　ＩＬ－４（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社）を加えることで、単球を未成熟樹状細胞へ分化させるための培地を調製した。以下、この培地を「単球分化用培地（１）」と呼ぶ。
（単球分化用培地（２）の組成）
　単球分化用培地（１）に、さらに下記の成分を加えることで未成熟樹状細胞を成熟樹状細胞へ分化させるための培地を調製した。以下、この培地を「単球分化用培地（２）」と呼ぶ。
　ＩＬ－１β（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社）　１０ｎｇ／ｍＬ
　ＩＬ－６（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社）　１０００ＩＵ／ｍＬ
　ＰＧＥ２（Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）　１μｇ／ｍＬ
　ＴＮＦ－α（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社）　２０ｎｇ／ｍＬ　　
　０．１ＫＥ　塩化ピシバニール（中外製薬）
　ゲンタマイシン　５０ｎｇ／ｍＬ
　５％　自己血漿（各癌患者から得られた血漿）
　増殖した単球（すなわち、実施例２の条件で３日目培養して得られた単球）を、単球分化用培地（１）中で、単球の増殖と同条件にて８日間培養して未成熟樹状細胞に分化させた。８日間の培養の終了時点で、抗原ペプチドを加えてパルスを行った。
　得られた未成熟樹状細胞を、単球分化用培地（２）中で、単球の増殖と同条件にて３日間培養して成熟樹状細胞に分化させた。
　得られた成熟樹状細胞について、細胞表面のマーカーを、フローサイトメトリーによって解析した。なお、マーカーとして成熟樹状細胞のマーカーであるＣＤ８３、及び、単球のマーカーであるＣＤ１４を用いた。その結果を図３（Ａ）に示す。また、得られた成熟樹状細胞の数を、マーカーとして成熟樹状細胞のマーカーであるＣＤ８３を用いて、フローサイトメトリーによって解析した。その結果を図３（Ｂ）に示す。図３（Ａ）及び（Ｂ）に示される通り、分化後の細胞中には、ＣＤ１４を発現している細胞（すなわち単球）は存在せず、ＣＤ８３を発現している細胞（すなわち成熟樹状細胞）が存在することから、単球が成熟樹状細胞に分化したことが分かる。
　また、得られた成熟樹状細胞の抗原提示能を、マーカーとしてＭＨＣクラスＩ分子（ＨＬＡ－Ａ，Ｂ，Ｃ）、及び、ＭＨＣクラスＩＩ分子（ＨＬＡ－ＤＲ）を用いて、フローサイトメトリーによって解析した。その結果を図３（Ｃ）に示す。図３（Ｃ）に示される通り、得られた成熟樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子及びＭＨＣクラスＩＩ分子を発現しており、抗原提示能を有することが分かる。
＜実施例４；各種サイトカインによる単球の増殖への影響についての検討＞
　本発明の単球増殖剤（Ｆｌｔ－３Ｌ、ＩＬ－３又はＩＦＮ－γ）及び各種サイトカイン（ＳＣＦ、ＩＦＮ－α又はＩＦＮ－β）が、単球の増殖へ及ぼす影響を下記の条件に従って検討した。
　実施例１記載の方法に従って分離した単球を、培地中で、１×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように９６穴シャーレ内に加え、３７℃、５％　ＣＯ２の条件で６日間培養した。なお、当該培地の組成は下記の通りである。
（培地組成）
　リンパ球用無血清合成培地（Ｘ－ＶＩＶＯ　１５、タカラバイオ株式会社）　
　表１のマトリックスに従って組み合わせたサイトカイン（各サイトカインの使用量は下記の通りである）
　　　２０００ＩＵ／ｍＬ　Ｆｌｔ－３Ｌ
　　　１０００ＩＵ／ｍＬ　ＩＬ－３
　　　１０ｎｇ／ｍＬ　ＩＦＮ－γ
　　　１０ｎｇ／ｍＬ　ＳＣＦ
　　　１０ｎｇ／ｍＬ　ＩＦＮ－α
　　　１０ｎｇ／ｍＬ　ＩＦＮ－β
　　　１０００ＩＵ／ｍＬ　ＧＭ－ＣＳＦ
　　　１０００ＩＵ／ｍＬ　ＩＬ－４
　なお、表１中、「増殖因子」とは、本発明の単球増殖剤（Ｆｌｔ－３Ｌ、ＩＬ－３又はＩＦＮ－γ）及び各種サイトカイン（ＳＣＦ、ＩＦＮ－α及びＩＦＮ－β）を合わせた呼称である。
　培養終了後の細胞数を顕微鏡下で目視観測し、各種サイトカインによる単球の増殖への影響を、「増殖因子無添加」かつ「ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４無添加」の条件の結果と比較して判定した。その結果を表１に示す。なお、判定基準は以下の通りである。
　±：変化なし
　＋：単球の増殖をやや促進した
　＋＋：単球の増殖を促進した
　＋＋＋：単球の増殖を顕著に促進した
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示される通り、本発明の単球増殖剤（Ｆｌｔ－３Ｌ、ＩＬ－３又はＩＦＮ－γ）によれば、単球の増殖が促進される。また、本発明の単球増殖剤に加えて、さらにＧＭ－ＣＳＦを組み合わせることで単球の増殖は顕著に促進される。
＜実施例５；単球の生細胞率についての検討＞
　本発明の単球増殖剤によって増殖させた単球を分化させて得られた樹状細胞の生細胞率について下記の条件に従って検討した。
　２０名の癌患者の腕から末梢血を約２５ｍＬ採取した。得られた末梢血から、実施例１と同様に単球を分離した。次いで、実施例２と同様に単球を増殖させ、得られた単球を実施例３と同様に成熟樹状細胞に分化させた。
　得られた成熟樹状細胞について、トリパンブルー染色を行い総細胞数（得られた成熟樹状細胞の総数）と生細胞率を計測した。その結果を表２に示す。なお、生細胞率は下式に基づいて算出した。
　生細胞率（％）＝生細胞の総数（未染色細胞の数）／総細胞数（染色細胞の数と未染色細胞の数との合計）×１００
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示される通り、本発明によれば、１．０×１０７以上もの細胞数と約９７％以上の生細胞を安定的に得ることが期待できる。

Claims (15)

  1. 　Ｆｌｔ－３Ｌ、ＩＬ－３又はＩＦＮ－γのうちの１つ以上からなり、単球から樹状細胞への分化処理前に使用される単球増殖剤。
  2. 　Ｆｌｔ－３Ｌ、ＩＬ－３又はＩＦＮ－γのうちの１つ以上を含み、単球から樹状細胞への分化処理前に使用される単球増殖用培地。
  3. 　ＧＭ－ＣＳＦを含む請求項２に記載の単球増殖用培地。
  4. 　原料単球を、請求項２又は３に記載の単球増殖用培地中で培養することによって増殖させる増殖工程を含む単球の製造方法。
  5. 　前記原料単球として、単球及び単球以外の白血球成分を含む混合物を用いる請求項４に記載の単球の製造方法。
  6. 　前記増殖工程の前に、体液中の単球以外の成分の含有率を低減させて前記原料単球を得る低減工程を含む請求項４又は５に記載の単球の製造方法。
  7. 　前記低減は、前記原料単球中の単球及び単球以外の白血球成分、血漿、赤血球の少なくとも１つに対して他方より高い親和性を有する磁気ビーズを使用して行う請求項６に記載の単球の製造方法。
  8. 　１００ｍＬ以下の末梢血から前記原料単球を得る請求項６又は７に記載の単球の製造方法。
  9. 　前記単球を凍結保存する凍結保存工程を含まない請求項６から８のいずれか１項に記載の単球の製造方法。
  10. 　請求項４から９のいずれか１項に記載の単球の製造方法によって単球を製造する単球製造工程と、
    　前記単球製造工程で得られた単球を樹状細胞へと分化させる分化工程と、
    を含む樹状細胞の製造方法。
  11. 　前記分化工程において、前記単球は、Ｆｌｔ－３Ｌ、ＩＬ－３又はＩＦＮ－γのうちの１つ以上を含む培地中で培養される請求項１０に記載の樹状細胞の製造方法。
  12. 　前記樹状細胞をパルスするパルス工程を含む請求項１０又は１１に記載の樹状細胞の製造方法。
  13. 　請求項１０から１２のいずれか１項に記載の樹状細胞の製造方法によって樹状細胞を製造する樹状細胞製造工程と、
    　前記樹状細胞製造工程で得られた樹状細胞を樹状細胞ワクチンに調製する調製工程と、
    を含む樹状細胞ワクチンの製造方法。
  14. 　前記単球及び前記樹状細胞のうち少なくとも一方を凍結保存する凍結保存工程を含まない請求項１３に記載の樹状細胞ワクチンの製造方法。
  15. 　前記原料単球は、前記樹状細胞ワクチンを投与される対象から採取した体液から得たものである請求項１３又は１４に記載の樹状細胞ワクチンの製造方法。
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