CN108398470A - 血液活化凝血时间测定生物传感器及其制作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种血液活化凝血时间测定生物传感器及其制作方法。该生物传感器包括依次层叠连接的底层、中间层和上层，中间层设有检测池，底层及上层朝向且对应检测池的表面区域与检测池的池壁配合围成样品检测腔，样品检测腔的上部腔壁以及位于工作电极与参比电极之间的下部腔壁上均设有干燥的凝血促进剂涂层。在凝血反应单元的顶部和底部以及侧壁的凝血促进剂涂层将最大限度的减小聚合物表面的固有变化，并且为精确和一致的活化凝血时间测定提供了均匀的接触表面，在活化凝血时间测定时，待测血液与干燥的凝血促进剂能够充分接触，保持有最大的接触表面，保证血液与凝血促进剂能够充分的混合，进而保证了活化凝血时间测定结果的准确性和可靠性。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测领域，尤其是涉及一种血液活化凝血时间测定生物传感器及其制作方法。
背景技术
ACT(activated clotting time，活化凝血时间)测定通常用在搭桥术、经皮腔内冠状动脉成形术、血液透析、体外生命支持(extracorporeal life support，ECLS)等手术的术前、术中或术后，这类手术通常都需要一定剂量的肝素以预防血栓形成。特别是在心肺转流术患者中，ACT是决定肝素用量的关键。肝素是通过代谢不饱和方式由肾脏排泄，因此，必须在手术中每隔15到20分钟检测血液的凝固情况。无肝素使用时，正常ACT约120秒，而添加有肝素的ACT大于480秒。当ACT低于400秒到480秒，必须另给一次肝素。
高岭土、硅藻土和玻璃珠(二氧化硅)等都是用来启动凝血最常见的表面活性剂。最初，ACT测定是在上述表面活性剂处理的试管中完成的。在添加新鲜全血样本后，试管在37℃孵育，轻轻搅动，每隔几秒钟观察一次，直至观察到血块形成。血液添加和血块形成之间的时间是ACT。自从最初的ACT测定方法形成至今，已开发出众多应用原有分析原理的机械、光学和电化学凝块检测方法。
基于目前可行的凝血试验(如活化部分凝血酶原时间、或APTT)中，ACT测定法是在血管成形术中分析血液的抗凝血(经皮冠状动脉介入治疗)情况的最快速、广泛的方法。除了采样和出结果所需的时间短之外，测试所需的血液样本量较小，并且可以防止样品降解，测试人员也无需经过专业训练。
然而，传统的ACT测定方法得到的时间往往难以准确反映全部血液样品发生凝血的时间，误差较大。另外，还很容易产生无法区别于非凝结样品的软凝块。该问题在ACT测定的早期方法中普遍存在。在ACT测定方法的其他迭代中，还有通过测量样品运动速度的机械和光学方法来检测凝块。然而，研究发现，即使在低剂量肝素(达2.5单位/毫升血液)的情况下，也无法精确检测血块的存在。
发明内容
基于此，有必要提供一种能够提高测定结果准确度的血液活化凝血时间测定生物传感器。
一种血液活化凝血时间测定生物传感器，包括依次层叠连接的底层、中间层和上层；所述上层设有加样通道和透气通道，所述加样通道及所述透气通道均沿厚度方向贯穿所述上层；所述中间层设有至少一个样品沉积孔、至少一个扩散通道及至少一个检测池，所述检测池通过所述扩散通道与所述样品沉积孔连通，所述检测池沿厚度方向贯穿所述中间层；所述底层的上表面设有工作电极和参比电极；所述加样通道位于所述样品沉积孔的上方且与所述样品沉积孔连通；所述透气通道位于所述检测池的上方且与所述检测池连通；所述底层及所述上层朝向且对应所述检测池的表面区域与所述检测池的池壁配合围成至少一个样品检测腔；所述工作电极与所述参比电极的一端均位于所述样品检测腔内，另一端均延伸至所述中间层及所述上层之外形成用于与检测仪器连接的连接端；所述样品检测腔的上部腔壁以及位于所述工作电极与所述参比电极之间的下部腔壁上均设有干燥的凝血促进剂涂层。
在其中一个实施例中，每个所述扩散通道包括一个主扩散通道及多个子扩散通道，所述主扩散通道的一端与一个所述样品沉积孔连通，另一端与所述多个子扩散通道分别连通，每个所述子扩散通道均对应连通一个所述检测池，每个所述检测池的下方均对应设有一对所述工作电极与所述参比电极。
在其中一个实施例中，所述检测池的宽度大于所述子扩散通道的宽度。
在其中一个实施例中，与同一个所述主扩散通道对应的多个所述子扩散通道中相邻的两个所述子扩散通道的长度不等，以使相邻的两个所述检测池的末端距离所述中间层的侧边的距离不等以形成错位设置。
在其中一个实施例中，与同一个所述主扩散通道对应的多个所述检测池下方的参比电极串接在一起后引出至所述连接端，且各所述检测池的下方独立设有一个所述工作电极并独立引出至所述连接端。
在其中一个实施例中，各所述样品检测腔内的所述参比电极与所述工作电极之间的距离相同。
在其中一个实施例中，所述参比电极及多个所述工作电极在连接端均呈矩形且末端齐平设置，在连接端位于最外侧的两个工作电极的矩形端部还分别向两外侧延伸形成矩形的凸出部。
在其中一个实施例中，每个所述扩散通道包括一个主扩散通道及五个子扩散通道。
在其中一个实施例中，每个所述样品沉积孔以及与其对应的所述主扩散通道、多个所述子扩散通道、多个所述样品检测腔、多个所述工作电极以及所述参比电极构成一个检测单元，所述血液活化凝血时间测定生物传感器具有多个所述检测单元。
在其中一个实施例中，多个所述检测单元在所述血液活化凝血时间测定生物传感器上并列设置，多个所述检测单元的连接端齐平。
在其中一个实施例中，所述加样通道与所述样品沉积孔为内径一样的圆孔，且所述加样通道与所述样品沉积孔的中轴线共线。
在其中一个实施例中，所述凝血促进剂涂层是由含有凝血促进剂的缓冲液经干燥而形成，所述含有凝血促进剂的缓冲液包含质量浓度为0.1％～5％的凝血促进剂以及pH为6.5～8.0、HEPES浓度为2mM～50mM的HEPES缓冲液。
在其中一个实施例中，所述凝血促进剂为高岭土。
在其中一个实施例中，每个所述检测池对应一个所述透气通道，所述透气通道设在所述检测池的正上方且呈长条形，所述透气通道的长度方向与所述检测池的宽度方向平行，且所述透气通道的长度不小于所述检测池的宽度。
在其中一个实施例中，所述透气通道靠近对应的所述检测池的末端。
在其中一个实施例中，所述检测池下方的参比电极靠近所述检测池与所述扩散通道连接的一端，所述检测池下方的工作电极靠近所述检测池的末端。
在其中一个实施例中，每个所述样品检测腔内的所述参比电极及所述工作电极均从所述样品检测腔的宽度方向横贯所述样品检测腔。
在其中一个实施例中，所述参比电极与所述工作电极均为印刷电极。
在其中一个实施例中，所述参比电极为AgCl电极，所述工作电极为Ag电极。
在其中一个实施例中，至少所述样品检测腔的整个下表面经由体积百分比为20％～70％的乙醇水溶液表面处理。
在其中一个实施例中，所述样品沉积孔和/或所述扩散通道也沿厚度方向贯穿所述中间层。
在其中一个实施例中，所述底层、所述中间层以及所述上层之间粘接。
一种血液活化凝血时间测定生物传感器的制作方法，包括如下步骤：
制作上层及中间层，其中，所述上层设有沿厚度方向贯穿的加样通道和透气通道，所述中间层设有至少一个样品沉积孔、至少一个扩散通道及至少一个检测池，所述样品沉积孔通过所述扩散通道与所述检测池连通，所述检测池沿厚度方向贯穿所述中间层；
将所述上层贴合在所述中间层的一侧，使所述加样通道位于所述样品沉积孔的上方且与所述样品沉积孔连通，并使所述透气通道位于所述检测池的上方且与所述检测池连通，得到半成品；
在所述上层朝向且对应所述检测池的表面区域均匀分散含有凝血促进剂的缓冲液，干燥后，在所述上层朝向且对应所述检测池的表面区域上形成干燥的凝血促进剂涂层；
制作底层，并在所述底层的预设位置制作工作电极和参比电极，并在所述工作电极和所述参比电极之间均匀分散含有凝血促进剂的缓冲液，干燥后，在所述工作电极和所述参比电极之间形成干燥的凝血促进剂涂层；
将所述半成品的所述中间层的另一侧贴合在所述底层上，使所述底层及所述上层朝向且对应所述检测池的表面区域与所述检测池的池壁配合围成至少一个样品检测腔，并使所述工作电极与所述参比电极的一端位于所述样品检测腔内，另一端延伸至所述中间层及所述上层之外形成用于与检测仪器连接的连接端。
在其中一个实施例中，所述含有凝血促进剂的缓冲液包含质量浓度为0.1％～5％的凝血促进剂以及pH为6.5～8.0、HEPES浓度为2mM～50mM的HEPES缓冲液。
在其中一个实施例中，所述凝血促进剂的缓冲液的加入量需保证在干燥后在所述半成品的相应区域或所述底层的所述工作电极与所述参比电极之间的相应区域能够形成均匀的薄层。
在其中一个实施例中，所述凝血促进剂是高岭土。
在其中一个实施例中，所述血液活化凝血时间测定生物传感器的制作方法还包括在所述底层分散含有凝血促进剂的缓冲液之前，在所述底层的预设表面区域喷洒体积浓度为20％～70％的乙醇水溶液以进行表面处理，并进行干燥的步骤，该预设表面区域至少对应所述样品检测腔的整个下表面。
经过研究发现，在传统的ACT测定过程中，待测的全血样本难以与沉积在测试单元底部表面的凝血促进试剂完全均匀混合，导致与通道的底部重悬的凝血促进试剂直接接触的血液会有血液凝结，但通道上部的血液却不能直接接触凝血促进试剂。因此，这种混合凝血促进剂的方式不足以激活血块的形成，尤其是在病人血液中存在较多的肝素的情况下，该试验可能会导致人工延长凝血时间。而本发明的上述血液活化凝血时间测定生物传感器通过上层、中层及底层相配合围成用于血液活化凝血时间检测的样品检测腔，并在样品检测腔的上部和下部腔壁设置干燥的凝血促进剂涂层，在进行测定时，血液样本从加样通道经样品沉积孔、扩散通道流入样品检测腔中，与样品检测腔中的凝血促进剂混合，并诱导血液凝固。当血液流入样品检测腔时，通过样品检测腔中的工作电极与参比电极可以检测血液的阻抗，当血液充满样品检测腔，因为红细胞堆积产生叠连效应而产生尖峰阻抗，从这一点看，阻抗逐渐降低，当血液凝结形成血块时，会有一个突然的变化，使阻抗曲线趋于平缓，信号混凝，该曲线的拐点即可表示活化凝血时间。
由于样品检测腔的上部和下部腔壁都设有凝血促进剂涂层，从而在凝血反应单元的顶部和底部的凝血促进剂涂层将最大限度的减小聚合物表面的固有变化，并且为精确和一致的活化凝血时间测定提供了均匀的接触表面，在活化凝血时间测定时，待测血液与干燥的凝血促进剂能够充分接触，保持有最大的接触表面，保证血液与凝血促进剂能够充分的混合，有助于完整和一致地激活因子XII，以精确测定不同个体之间的活化凝血时间，进而保证了活化凝血时间测定结果的准确性和可靠性。该血液活化凝血时间测定生物传感器能够准确地测定从正常血液到大剂量肝素处理的血液的凝血时间。
附图说明
图1为一实施方式的血液活化凝血时间测定生物传感器的结构示意图(透视图)；
图2为图1所示血液活化凝血时间测定生物传感器的局部放大示意图；
图3为图1所示血液活化凝血时间测定生物传感器的上层的局部结构示意图；
图4为图1所示血液活化凝血时间测定生物传感器的中间层的局部结构示意图；
图5为图1所示血液活化凝血时间测定生物传感器的底层的局部结构示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
需要说明的是，当元件被称为“固定于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
请结合图1至图5，一实施方式的血液活化凝血时间测定生物传感器10包括上层100、中间层200及底层300。
上层100设有加样通道110和透气通道120。加样通道110及透气通道120均沿厚度方向贯穿上层100。中间层200设有至少一个样品沉积孔210、至少一个扩散通道220及至少一个检测池230。样品沉积孔210通过扩散通道220与检测池230连通。检测池230沿厚度方向贯穿中间层200。底层300的上表面设有工作电极310和参比电极320。
具体的，在本实施方式中，底层300、中间层200和上层100依次层叠连接。其中，加样通道110位于样品沉积孔210的上方且与样品沉积孔210直接连通。透气通道120位于检测池230的上方且与检测池230直接连通。底层300及上层100朝向且对应检测池230的表面区域与检测池230的池壁配合围成至少一个样品检测腔。工作电极310与参比电极320的一端位于样品检测腔内，另一端延伸至中间层200及上层100之外形成用于与检测仪器连接的连接端330。样品检测腔的上部腔壁(即上层100朝向且对应检测池230的表面区域)以及位于工作电极310与参比电极320之间的下部腔壁(即底层300朝向且对应检测池230的表面区域)上设有干燥的凝血促进剂涂层。
在本实施方式中，在底层300的上表面区域，凝血促进剂涂层仅设置在工作电极310与参比电极320之间，一方面可以避免因电极本体的表面覆盖凝血促进剂涂层而影响电化学信号的采集和检测，另一方面可以准确确定凝血的起始时间。由于工作电极310与参比电极320之外无凝血促进剂，因而当血液样品进入工作电极310与参比电极320之间时即可认为是凝血开始时间，此时也可以检测到电化学信号变化，否则若其他区域也有凝血促进剂涂层，则血液样品流到这些位置时就会发生凝血，但此时工作电极310与参比电极320无法到检测到电化学信号变化，也即，凝血发生在电化学信号变化之前，因而难以界定该凝血开始时间，导致界定的凝血时间不准。
更具体的，本实施方式的上层100和中间层200均呈矩形。加样通道110和透气通道120分别靠近所述上层100的两侧边。样品沉积孔210与检测池230分别靠近中间层200的两侧边。在一个实施例中，上层100与中间层20的形状及尺寸(长度和宽度)相同。
本实施方式的血液活化凝血时间测定生物传感器10在进行测定时，血液样本从加样通道110经样品沉积孔210、扩散通道220流入样品检测腔中，与样品检测腔的上、下腔壁上的凝血促进剂涂层混合，诱导血液凝固。当血液流入样品检测腔时，通过样品检测腔中的工作电极310与参比电极320可以检测血液的阻抗，随着血液不断填充在样品检测腔中，阻抗值一直在变化，当血液凝结形成血块时，会有一个突然的变化，也即阻抗曲线会有一个拐点，该拐点即可表示活化凝血时间。
由于本实施方式的样品检测腔的上部腔壁和下部腔壁都设有凝血促进剂涂层，从而可以最大限度的减小聚合物表面的固有变化，为精确和一致的活化凝血时间测定提供了均匀的接触表面，在活化凝血时间测定时，待测血液与干燥的凝血促进剂能够充分接触，保持有最大的接触表面，保证血液与凝血促进剂能够充分的混合，进而保证了活化凝血时间测定结果的准确性和可靠性。本实施方式的血液活化凝血时间测定生物传感器10能够准确地测定从正常血液到大剂量肝素处理的血液的凝血时间。
在一个实施例中，凝血促进剂涂层是由含有凝血促进剂的缓冲液经干燥而形成的。其中，含有凝血促进剂的缓冲液包含质量浓度为0.1％～5％的凝血促进剂以及pH为6.5～8.0、HEPES浓度为2mM～50mM的HEPES缓冲液。凝血促进剂优选为高岭土。该凝血促进剂的缓冲液可以使得干燥后得到的凝血促进剂涂层具有较好的稳定性，如经过检测，该凝血促进剂涂层在室温(温度变化区间4℃～45℃)下至少可以保证在12个月内具有完全凝血促进活性，并且反应灵敏度高，一旦接触血液样品，即可促进血液凝固，因而可以及时检测到电化学信号的变化。
在一个实施例中，每个扩散通道220包括一个主扩散通道222及多个子扩散通道224。主扩散通道222的一端与一个样品沉积孔210连通，另一端与多个子扩散通道224分别连通。每个子扩散通道224均对应连通一个检测池230。每个检测池230的下方均对应设有一对工作电极310与参比电极320。通过设置多个平行的检测池230形成多个平行的样品检测腔，可以同时进行多组平行检测，进一步有利于保证测定结果的准确性。
在上述实施例中，检测池230可以是由子扩散通道224在末端加宽并延伸形成，也即检测池230的宽度大于子扩散通道224的宽度，以形成用于储存血液的储存腔。
在一个可选的实施例中，与同一个主扩散通道222对应的多个子扩散通道224中相邻的两个子扩散通道224的长度不等，以使相邻的两个检测池230的末端距离中间层200的侧边的距离不等，从而每个主扩散通道222对应的多个检测池230错位设置，以有效形成结构避让，便于设置工作电极310与参比电极320。
在一个可选的实施例中，与同一个主扩散通道222对应的多个检测池230下方的参比电极320串接在一起后引出至连接端330，且各检测池230的下方分别独立设有一个工作电极310并独立引出至连接端330。进一步，参比电极320及工作电极310在各样品检测腔内的相对位置一致，如各样品检测腔内的参比电极320与工作电极310之间的距离相等。通过将每个主扩散通道222的各个检测池230下方的参比电极320串在一起，并进一步使各参比电极320及工作电极310在检测样品检测腔的同样位置进行电阻测定，可以有效保证各个样品检测腔的检测结果的一致性。
在一个可选的实施例中，参比电极320及多个工作电极310在连接端330均呈矩形且末端齐平设置，并且在连接端330位于最外侧的两个工作电极310的矩形端部还分别向两外侧延伸形成矩形的凸出部332，以便于插拔。
具体的，在图示所示的实施例中，每个扩散通道220包括一个主扩散通道222及五个子扩散通道224，也即该主扩散通道222对应有五个检测池230。在连接端330共有六个矩形端部，其中五个对应五个检测池230的工作电极310，一个对应参比电极320。
每个样品沉积孔210以及与其对应的主扩散通道222、多个子扩散通道224、多个样品检测腔、多个工作电极310以及参比电极320构成一个检测单元11。在一个可选的实施例中，血液活化凝血时间测定生物传感器10上设有多个检测单元11。多个检测单元11可以在血液活化凝血时间测定生物传感器10上并列设置，并且多个检测单元11的连接端330齐平。通过设置多个检测单元11，可以一次性检测多个血液样本，获取多组数据，进一步保证测定结果的准确性和可靠性。
在一个可选的实施例中，加样通道110与样品沉积孔210为内径一样的圆孔，且加样通道110与样品沉积孔210的中轴线共线，也即加样通道110位于样品沉积孔210的正上方。
在一个可选的实施例中，每个检测池230对应一个透气通道120，透气通道120设在检测池230的正上方且呈长条形，透气通道120的长度方向与检测池230的宽度方向平行，且透气通道120的长度不小于检测池230的宽度。进一步，透气通道120靠近对应的检测池230的末端。通过将透气通道120的长度设置为不小于检测池230的宽度，优选设置为与检测池230的宽度一致，并进一步将透气通道120设置为靠近对应的检测池230的末端，可以在血液流入样品检测腔时，释放压力，以保证血液顺利且充分的流入样品检测腔。
在一个可选的实施例中，检测池230下方的参比电极320靠近检测池230与扩散通道220连接的一端，检测池230下方的工作电极310靠近检测池230的末端。进一步，每个样品检测腔内的参比电极320及工作电极310均从样品检测腔的宽度方向横贯样品检测腔，以精确测定各样品检测腔内的阻抗情况。
在一个可选的实施例中，参比电极320为AgCl电极，工作电极310为Ag电极。进一步，参比电极320与工作电极310均为印刷电极，通过丝印等工艺直接将电极墨水印刷在底层300的预设位置形成，制作工艺简单。
在一个可选的实施例中，至少样品检测腔内整个下部表面区域经由乙醇水溶液表面处理，以使血液样本能够均匀的流入样品检测腔，并进入工作电极310与参比电极320之间。优选的，所述乙醇水溶液中乙醇的体积浓度为20％～70％。
在一个可选的实施例中，样品沉积孔210和/或扩散通道220也沿厚度方向贯穿中间层200。优选的，中间层200中的样品沉积孔210、扩散通道220及检测池230均沿厚度方向贯穿中间层200，在制作的时候，可以直接蚀刻或钻孔形成所需要的图案。
在一个可选的实施例中，底层300、中间层200以及上层100之间粘接。具体的，中间层200的两侧表面均设有粘胶层，底层300与上层100直接与中间层200粘接，如可以先将上层100粘接在中间层200的一侧表面，中间层200的另一侧表面的粘胶层上通过离型纸等保护层保护，再对于含有上层100与中间层200的半成品进行相应的处理，最后可撕去保护层，将底层300粘接在中间层200的另一侧表面。
本实施方式还提供了一种血液活化凝血时间测定生物传感器的制作方法，其包括如下步骤：
步骤一：制作上层及中间层，其中，上层设有沿厚度方向贯穿的加样通道和透气通道，中间层设有至少一个样品沉积孔、至少一个扩散通道及至少一个检测池，样品沉积孔通过扩散通道与检测池连通，检测池沿厚度方向贯穿中间层。
上层与中间层上的各孔可以通过刻蚀或模具冲压或在模具中成型等方式形成。
步骤二：将上层贴合在中间层的一侧，使加样通道位于样品沉积孔的上方且与样品沉积孔连通，并使透气通道位于检测池的上方且与检测池连通，得到半成品。
步骤三：在上层朝向且对应检测池的表面区域均匀分散含有凝血促进剂的缓冲液，干燥后，在半成品的上层朝向且对应检测池的表面区域上形成干燥的凝血促进剂涂层。
步骤四：制作底层，并在底层的预设位置制作工作电极和参比电极，并在工作电极和参比电极之间均匀分散含有凝血促进剂的缓冲液，干燥后，在工作电极和所述参比电极之间形成干燥的凝血促进剂涂层。
在一个可选的实施例中，工作电极和参比电极通过印刷的方式直接在底层上形成，成型工艺简单，易于实现。
在一个可选的实施例中，含有凝血促进剂的缓冲液包含质量浓度为0.1％～5％的凝血促进剂以及pH为6.5～8.0、HEPES浓度为2mM～50mM的HEPES缓冲液。该凝血促进剂的缓冲液可以使得干燥后得到的凝血促进剂涂层具有较好的稳定性，如经过检测，该凝血促进剂涂层在室温(温度变化区间4℃～45℃)下至少可以保证在12个月内具有完全凝血促进活性，并且反应灵敏度高，一旦接触血液样品，即可促进血液凝固，因而可以及时检测到电化学信号的变化。
在一个可选的实施例中，凝血促进剂的缓冲液的加入量需保证在干燥后在半成品的相应区域或在底层的工作电极与参比电极之间的相应区域能够形成均匀的薄层，如在一个具体的实施例中，在半成品的检测池中均匀分散凝血促进剂的缓冲液时，是在上层朝向且对应检测池的表面区域分散0.5～3.1μL的含有凝血促进剂的缓冲液；在工作电极和参比电极之间均匀分散含有凝血促进剂的缓冲液时，是在工作电极与参比电极之间分散0.2～2.8μL的含有凝血促进剂的缓冲液。
在一个可选的实施例中，凝血促进剂是高岭土。
步骤五：将半成品的中间层的另一侧贴合在底层上，使底层及上层朝向且对应检测池的表面区域与检测池的池壁配合围成至少一个样品检测腔，并使工作电极与参比电极的一端位于样品检测腔内，另一端延伸至中间层及上层之外形成用于与检测仪器连接的连接端。
在一个可选的实施例中，该血液活化凝血时间测定生物传感器的制作方法还包括在所述底层分散含有凝血促进剂的缓冲液之前，在底层的预设表面区域喷洒体积浓度为20％～70％的乙醇水溶液以进行表面处理，并进行干燥的步骤，该预设表面区域至少对应样品检测腔的整个下表面(包括工作电极310与参比电极320之上的区域、之间的区域以及两侧的区域)。通过对底层的预设表面区域进行乙醇水溶液的表面处理，可以保证血液样品均匀地流入样品检测腔，并能够稳定地、连续地从样品检测腔的一端流至另一端，以避免血液样品流动时出现不均匀或锯齿状的流动情况，保证凝血过程的稳定性，进一步提高活化凝血时间测定的精度。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (27)
1.一种血液活化凝血时间测定生物传感器，其特征在于，包括依次层叠连接的底层、中间层和上层；所述上层设有加样通道和透气通道，所述加样通道及所述透气通道均沿厚度方向贯穿所述上层；所述中间层设有至少一个样品沉积孔、至少一个扩散通道及至少一个检测池，所述检测池通过所述扩散通道与所述样品沉积孔连通，所述检测池沿厚度方向贯穿所述中间层；所述底层的上表面设有工作电极和参比电极；所述加样通道位于所述样品沉积孔的上方且与所述样品沉积孔连通；所述透气通道位于所述检测池的上方且与所述检测池连通；所述底层及所述上层朝向且对应所述检测池的表面区域与所述检测池的池壁配合围成至少一个样品检测腔；所述工作电极与所述参比电极的一端均位于所述样品检测腔内，另一端均延伸至所述中间层及所述上层之外形成用于与检测仪器连接的连接端；所述样品检测腔的上部腔壁以及位于所述工作电极与所述参比电极之间的下部腔壁上均设有干燥的凝血促进剂涂层。
2.如权利要求1所述的血液活化凝血时间测定生物传感器，其特征在于，每个所述扩散通道包括一个主扩散通道及多个子扩散通道，所述主扩散通道的一端与一个所述样品沉积孔连通，另一端与所述多个子扩散通道分别连通，每个所述子扩散通道均对应连通一个所述检测池，每个所述检测池的下方均对应设有一对所述工作电极与所述参比电极。
3.如权利要求2所述的血液活化凝血时间测定生物传感器，其特征在于，所述检测池的宽度大于所述子扩散通道的宽度。
4.如权利要求2所述的血液活化凝血时间测定生物传感器，其特征在于，与同一个所述主扩散通道对应的多个所述子扩散通道中相邻的两个所述子扩散通道的长度不等，以使相邻的两个所述检测池的末端距离所述中间层的侧边的距离不等以形成错位设置。
5.如权利要求2所述的血液活化凝血时间测定生物传感器，其特征在于，与同一个所述主扩散通道对应的多个所述检测池下方的参比电极串接在一起后引出至所述连接端，且各所述检测池的下方独立设有一个所述工作电极并独立引出至所述连接端。
6.如权利要求5所述的血液活化凝血时间测定生物传感器，其特征在于，各所述样品检测腔内的所述参比电极与所述工作电极之间的距离相同。
7.如权利要求5所述的血液活化凝血时间测定生物传感器，其特征在于，所述参比电极及多个所述工作电极在连接端均呈矩形且末端齐平设置，在连接端位于最外侧的两个工作电极的矩形端部还分别向两外侧延伸形成矩形的凸出部。
8.如权利要求2～7中任一项所述的血液活化凝血时间测定生物传感器，其特征在于，每个所述扩散通道包括一个主扩散通道及五个子扩散通道。
9.如权利要求2～7中任一项所述的血液活化凝血时间测定生物传感器，其特征在于，每个所述样品沉积孔以及与其对应的所述主扩散通道、多个所述子扩散通道、多个所述样品检测腔、多个所述工作电极以及所述参比电极构成一个检测单元，所述血液活化凝血时间测定生物传感器具有多个所述检测单元。
10.如权利要求9所述的血液活化凝血时间测定生物传感器，其特征在于，多个所述检测单元在所述血液活化凝血时间测定生物传感器上并列设置，多个所述检测单元的连接端齐平。
11.如权利要求1～7中任一项所述的血液活化凝血时间测定生物传感器，其特征在于，所述加样通道与所述样品沉积孔为内径一样的圆孔，且所述加样通道与所述样品沉积孔的中轴线共线。
12.如权利要求1～7中任一项所述的血液活化凝血时间测定生物传感器，其特征在于，所述凝血促进剂涂层是由含有凝血促进剂的缓冲液经干燥而形成，所述含有凝血促进剂的缓冲液包含质量浓度为0.1％～5％的凝血促进剂以及pH为6.5～8.0、HEPES浓度为2mM～50mM的HEPES缓冲液。
13.如权利要求12所述的血液活化凝血时间测定生物传感器，其特征在于，所述凝血促进剂为高岭土。
14.如权利要求1～7中任一项所述的血液活化凝血时间测定生物传感器，其特征在于，每个所述检测池对应一个所述透气通道，所述透气通道设在所述检测池的正上方且呈长条形，所述透气通道的长度方向与所述检测池的宽度方向平行，且所述透气通道的长度不小于所述检测池的宽度。
15.如权利要求1～7中任一项所述的血液活化凝血时间测定生物传感器，其特征在于，所述透气通道靠近对应的所述检测池的末端。
16.如权利要求1～7中任一项所述的血液活化凝血时间测定生物传感器，其特征在于，所述检测池下方的参比电极靠近所述检测池与所述扩散通道连接的一端，所述检测池下方的工作电极靠近所述检测池的末端。
17.如权利要求1～7中任一项所述的血液活化凝血时间测定生物传感器，其特征在于，每个所述样品检测腔内的所述参比电极及所述工作电极均从所述样品检测腔的宽度方向横贯所述样品检测腔。
18.如权利要求1～7中任一项所述的血液活化凝血时间测定生物传感器，其特征在于，所述参比电极与所述工作电极均为印刷电极。
19.如权利要求1～7中任一项所述的血液活化凝血时间测定生物传感器，其特征在于，所述参比电极为AgCl电极，所述工作电极为Ag电极。
20.如权利要求1～7中任一项所述的血液活化凝血时间测定生物传感器，其特征在于，至少所述样品检测腔的整个下表面经由体积百分比为20％～70％的乙醇水溶液表面处理。
21.如权利要求1～7中任一项所述的血液活化凝血时间测定生物传感器，其特征在于，所述样品沉积孔和/或所述扩散通道也沿厚度方向贯穿所述中间层。
22.如权利要求1～7中任一项所述的血液活化凝血时间测定生物传感器，其特征在于，所述底层、所述中间层以及所述上层之间粘接。
23.一种血液活化凝血时间测定生物传感器的制作方法，其特征在于，包括如下步骤：
制作上层及中间层，其中，所述上层设有沿厚度方向贯穿的加样通道和透气通道，所述中间层设有至少一个样品沉积孔、至少一个扩散通道及至少一个检测池，所述样品沉积孔通过所述扩散通道与所述检测池连通，所述检测池沿厚度方向贯穿所述中间层；
将所述上层贴合在所述中间层的一侧，使所述加样通道位于所述样品沉积孔的上方且与所述样品沉积孔连通，并使所述透气通道位于所述检测池的上方且与所述检测池连通，得到半成品；
在所述上层朝向且对应所述检测池的表面区域均匀分散含有凝血促进剂的缓冲液，干燥后，在所述上层朝向且对应所述检测池的表面区域上形成干燥的凝血促进剂涂层；
制作底层，并在所述底层的预设位置制作工作电极和参比电极，并在所述工作电极和所述参比电极之间均匀分散含有凝血促进剂的缓冲液，干燥后，在所述工作电极和所述参比电极之间形成干燥的凝血促进剂涂层；
将所述半成品的所述中间层的另一侧贴合在所述底层上，使所述底层及所述上层朝向且对应所述检测池的表面区域与所述检测池的池壁配合围成至少一个样品检测腔，并使所述工作电极与所述参比电极的一端位于所述样品检测腔内，另一端延伸至所述中间层及所述上层之外形成用于与检测仪器连接的连接端。
24.如权利要求23所述的血液活化凝血时间测定生物传感器的制作方法，其特征在于，所述含有凝血促进剂的缓冲液包含质量浓度为0.1％～5％的凝血促进剂以及pH为6.5～8.0、HEPES浓度为2mM～50mM的HEPES缓冲液。
25.如权利要求24所述的血液活化凝血时间测定生物传感器的制作方法，其特征在于，所述凝血促进剂的缓冲液的加入量需保证在干燥后在所述半成品的相应区域或所述底层的所述工作电极与所述参比电极之间的相应区域能够形成均匀的薄层。
26.如权利要求23～25中任一项所述的血液活化凝血时间测定生物传感器的制作方法，其特征在于，所述凝血促进剂是高岭土。
27.如权利要求23～25中任一项所述的血液活化凝血时间测定生物传感器的制作方法，其特征在于，还包括在所述底层分散含有凝血促进剂的缓冲液之前，在所述底层的预设表面区域喷洒体积浓度为20％～70％的乙醇水溶液以进行表面处理，并进行干燥的步骤，该预设表面区域至少对应所述样品检测腔的整个下表面。
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