CN105259227A - 一种分子印迹电化学传感器的凝血酶检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种分子印迹电化学传感器的凝血酶检测方法,本发明方法以碳纳米管为增敏材料,以凝血酶为模板分子,邻苯二胺为功能单体,通过简单的电聚合法制得对凝血酶具有特异性识别功能的分子印迹聚合膜,利用聚邻苯二胺兼具分子印迹膜和电化学探针的两者作用,构建了测定非电活性物质凝血酶的无试剂型分子印迹电化学传感器。本发明碳纳米管的增敏作用,聚邻苯二胺电化学探针的指示作用,可以灵敏、准确、特异性地检测凝血酶。本发明只需要改变模板分子,可以实现对其它非电活性物质的检测。本发明适用于电化学分子印迹传感器法测定凝血酶。
Description
技术领域
本发明涉及一种分子印迹电化学传感器的凝血酶检测方法,本发明属于化学传感和电分析化学检测技术领域。
背景技术
凝血酶是一种广泛存在于哺乳动物血液凝固系统中的丝氨酸蛋白水解酶,可以催化体内纤维蛋白元转变成纤维蛋白,在创伤愈合、炎症、血液凝固等方面发挥着极其重要的作用,在临床上常用于毛细血管出血的局部止血和外科手术后组织的愈合,凝血酶的活性及浓度是衡量凝血机制是否健康的重要指标之一,在疾病早期诊断、疗效及愈后判断以及药物研究中具有十分重大的意义。
分子印迹技术是制备对所选目标分子具有专一选择性功能的分子印迹聚合物的技术,其基本思路是,以目标分子为模板分子,选择合适的功能单体,在一定条件下引发聚合形成三维高分子聚合物,然后洗去模板分子,留下与之空间结构完全匹配的三维空穴。将对模板分子具有特异性识别作用的分子印迹聚合物,作为传感器的识别元件(敏感膜)构建的分子印迹电化学传感器,可有效克服生物传感器抗恶劣环境差、稳定性差和制备成本高等缺点,分子印迹电化学传感器的应用已成为人们关注的焦点。根据分子印迹聚合物与电化学信号换能器的结合方式的不同,制备分子印迹电化传感器主要有自组装、滴涂、溶胶-凝胶和电聚合等方法,电聚合法以简单、膜厚可控和重现性好等优点受到研究者的青睐
近年来,分子印迹电化学传感器虽然在生化分析、环境分析、食品和医药等领域的应用研究取得了较大的进展,但其仍存在灵敏度较低的缺点,这限制了分子印迹电化学传感器的应用。纳米材料如碳纳米管、金纳米粒子、石墨烯、纳米二氧化硅等纳米材料的引入可有效增大分子印迹膜的比表面积而提高识别位点的数量,大大提高分子印迹电化学传感器的灵敏度。
分子印迹电化学传感器测定具有电活性物质的目标分子,可以通过测定结合目标分子前后,目标分子本身的电化学信号的变化直接进行检测。而对非电活性物质目标分子的测定,主要通过外加电化学探针铁氰化钾和酶标记催化等间接法测定非电活性物质。测定非电活性物质存在的问题有外加电化学探针不方便而且可能污染电极,及酶标记催化方法繁琐费时。
迄今,分子印迹电化学传感器测定凝血酶的研究未见报道。本发明将碳纳米管固定在基础电极表面作为增敏材料,然后通过电聚合电化学探针的方法制备测定凝血酶的分子印迹传感器。通过高比表面积的纳米材料有效增加分子识别位点的增敏作用,电聚合形成的聚合物兼具分子印迹聚合膜和电化学探针两者的作用,建立简单、灵敏度高和稳定性好的测定非电活性物质凝血酶的无试剂型分子印迹电化学方法。
发明内容
本发明的目的是,提供一种基于碳纳米管的电聚合电化学探针制备的分子印迹电化学传感器的凝血酶检测方法;在碳纳米管修饰的电极表面,通过电聚合邻苯二胺制备分子印迹电化学传感器用于凝血酶的检测,建立一种新的无试剂型分子印迹电化学传感器检测凝血酶的方法。
实现本发明的技术方案是,一种分子印迹电化学传感器的凝血酶检测方法以碳纳米管为增敏材料,以凝血酶为模板分子,邻苯二胺为功能单体,通过电聚合法制得对凝血酶具有特异性识别功能的分子印迹聚合膜,利用聚邻苯二胺兼具分子印迹膜和电化学探针的两者作用,构建测定非电活性物质凝血酶的无试剂型分子印迹电化学传感器。本发明方法以分子印迹膜修饰电极作为工作电极,参比电极为Ag/AgCl电极,辅助电极为铂电极,组成三电极体系,实现对凝血酶的高灵敏检测。
本发明提出一种分子印迹电化学传感器的凝血酶检测方法,所述方法步骤如下:
(1)将干净的玻碳电极置于含有0.5~2.0mg/mL的羧基化的碳纳米管悬浮液中,于1.0~2.2V恒电位电沉积30~500s,制得碳纳米管修饰的玻碳电极。
(2)将碳纳米管修饰电极置于含有0.3~1.5mg/mL的邻苯二胺和0.01~0.10mg/mL的凝血酶的pH5.0~7.0磷酸缓冲液中,于0.5~1.2V恒电位沉积5~15min,然后将此修饰电极用去离子水冲洗后,制得分子印迹聚合膜-凝血酶/碳纳米管修饰的玻碳电极
(3)将分子印迹聚合膜-凝血酶/碳纳米管修饰的玻碳电极置于乙醇与乙酸的混合溶液中洗脱,混合溶液中乙醇与乙酸的体积比为1:0.2~1:5;去除聚合膜中的凝血酶,得到分子印迹聚合膜/碳纳米管修饰的玻碳电极,该修饰电极即为测定凝血酶的分子印迹传感器。
本发明基于分子印迹传感器检测凝血酶的方法如下:
本发明利用分子印迹传感器中与凝血酶分子相匹配的分子印迹空穴,对凝血酶的特异性结合后,导致电化学探针聚邻苯二胺的电流变化,实现对凝血酶的检测,将前述的分子印迹传感器为工作电极,参比电极为Ag/AgCl电极,辅助电极为铂电极,组成三电极体系,即可实现对凝血酶的检测。
本发明分子印迹传感器测定凝血酶的线性范围为10.0fg/mL~1.0μg/mL,检测限为1.7fg/mL。利用同一根玻碳电极制备五次分子印迹传感器,测定其对凝血酶的响应电流,其相对标准偏差为2.2%,利用3根玻碳电极平行制备的分子印迹传感器对凝血酶测定的相对标准偏差为2.5%,说明该电极具有良好的重现性。该传感器置于4℃的环境中考察其稳定性,两周后,仍保留响应电流值的90%以上,表明该电极具有良好的稳定性。
本发明的有益效果是,本发明通过电聚合形成的聚邻苯二胺分子印迹膜在碳纳米管修饰的玻碳电极表面制备分子印迹传感器,由于碳纳米管的信号放大作用和聚邻苯二胺的电化学探针作用,提供了一种简单和灵敏地检测非电活性物质凝血酶的无试剂型分子印迹传感器方法。
本发明适用于无试剂型分子印迹传感器测定凝血酶。
附图说明
图1为本发明检测凝血酶的分子印迹传感器的制备框图;
图2为本发明中碳纳米管修饰的玻碳电极的扫描电镜图;
图3为在pH6.0的PBS溶液中不同修饰电极的循环伏安图,(a)碳纳米管修饰的玻碳电极,(b)分子印迹聚合膜-凝血酶/碳纳米管修饰的玻碳电极,(c)分子印迹聚合膜/碳纳米管修饰的玻碳电极,(d)在100.0pg/ml凝血酶溶液中孵育后的分子印迹聚合膜/碳纳米管修饰的玻碳电极;
图4为分子印迹聚合膜/碳纳米管修饰的玻碳电极对不同浓度的凝血酶的差分脉冲伏安响应图;
图5为分子印迹传感器的电流响应对凝血酶浓度的校准曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细说明,以下实施例有助于本领域的技术人员进一步理解本发明,但决不限制本发明的保护范围。
实施例1
基于碳纳米管材料电聚合邻苯二胺制备分子印迹传感器,如图1所示。
(1)配制0.5mg/mL的羧基化的碳纳米管悬浮液,将干净的玻碳电极置于碳纳米管悬浮液中,于1.0V恒电位电沉积30s,制得碳纳米管修饰的玻碳电极。
(2)将碳纳米管修饰电极置于含有0.3mg/mL的邻苯二胺和0.01mg/mL的凝血酶的pH5.0磷酸缓冲液中,于0.7V恒电位沉积5min,然后将此修饰电极用去离子水冲洗后,制得分子印迹聚合膜-凝血酶/碳纳米管修饰的玻碳电极
(3)将分子印迹聚合膜-凝血酶/碳纳米管修饰的玻碳电极置于乙醇:乙酸[V:V=1:0.2]的混合溶液中洗脱,去除聚合膜中的凝血酶,得到分子印迹聚合膜/碳纳米管修饰的玻碳电极,该修饰电极即为测定凝血酶的分子印迹传感器。
实施例2
基于碳纳米管材料电聚合邻苯二胺制备分子印迹传感器。
(1)配制1.5mg/mL的羧基化的碳纳米管悬浮液,将干净的玻碳电极置于碳纳米管悬浮液中,于1.5V恒电位电沉积400s,制得碳纳米管修饰的玻碳电极。
(2)将碳纳米管修饰电极置于含有0.5mg/mL的邻苯二胺和0.10mg/mL的凝血酶的pH7.0磷酸缓冲液中,于0.5V恒电位沉积6min,然后将此修饰电极用去离子水冲洗后,制得分子印迹聚合膜-凝血酶/碳纳米管修饰的玻碳电极
(3)将分子印迹聚合膜-凝血酶/碳纳米管修饰的玻碳电极置于乙醇:乙酸[V:V=1:4]的混合溶液中洗脱,去除聚合膜中的凝血酶,得到分子印迹聚合膜/碳纳米管修饰的玻碳电极,该修饰电极即为测定凝血酶的分子印迹传感器。
实施例3
基于碳纳米管材料电聚合邻苯二胺制备分子印迹传感器。
(1)配制1.0mg/mL的羧基化的碳纳米管悬浮液,将干净的玻碳电极置于碳纳米管悬浮液中,于2.0V恒电位电沉积50s,制得碳纳米管修饰的玻碳电极。
(2)将碳纳米管修饰电极置于含有1.0mg/mL的邻苯二胺和0.01mg/mL的凝血酶的pH5.0磷酸缓冲液中,于2.0V恒电位沉积10min,然后将此修饰电极用去离子水冲洗后,制得分子印迹聚合膜-凝血酶/碳纳米管修饰的玻碳电极
(3)将分子印迹聚合膜-凝血酶/碳纳米管修饰的玻碳电极置于乙醇:乙酸[V:V=1:1]的混合溶液中洗脱,去除聚合膜中的凝血酶,得到分子印迹聚合膜/碳纳米管修饰的玻碳电极,该修饰电极即为测定凝血酶的分子印迹传感器。
实施例4
将实施例3得到的碳纳米管修饰的玻碳电极进行扫描电镜表征。
碳纳米管修饰的玻碳电极的扫描电镜表征见图2,从图2可以明显看出形状规则的管状结构在玻碳电极表面均匀分布,碳纳米管的管径分布在40nm-70nm之间。
实施例5
将实施例3得到的分子印迹传感器用于电化学测试:
(1)不同修饰电极的循环伏安测试。
分别将碳纳米管修饰的玻碳电极、分子印迹聚合膜-凝血酶/碳纳米管修饰的玻碳电极、分子印迹聚合膜/碳纳米管修饰的玻碳电极和在凝血酶溶液中孵育后的分子印迹聚合膜/碳纳米管修饰的玻碳电极为工作电极,参比电极为Ag/AgCl电极,辅助电极为铂电极;底液为0.2mol/LPBS(pH6.0);扫描速度为0.1V/s。循环伏安图见图3,从图3可见,修饰了碳纳米管之后,没有氧化还原峰出现,电聚合分子印迹薄膜-凝血酶之后出现一对聚邻苯二胺的氧化还原峰;用洗脱液洗后这对氧化还原峰峰电流明显增加,而且峰电位间距变小,是由于凝血酶分子被洗脱之后留下与凝血酶分子相匹配分子印迹空穴,使得聚邻苯二胺更容易和基底电极之间发生电子交换;再将洗脱后的分子印迹聚合膜/碳纳米管修饰电极在100.0pg/mL的凝血酶溶液中孵育后,凝血酶又占据一定量的分子印迹空穴,而又在一定程度上阻碍了聚邻苯二胺与基底电极间的电子传递。
(2)分子印迹传感器对凝血酶的差分脉冲伏安测试。将分子印迹传感器为工作电极,参比电极为Ag/AgCl电极,辅助电极为铂电极;底液为0.2mol/LPBS(pH6.0);扫描电位范围0.1~-1.0V,电位增量0.004V,振幅0.05V,脉冲宽度0.05s,采样宽度0.02s,脉冲周期0.2s;将分子印迹传感器置于差分脉冲测试底液中,扫描得到空白电流I 0,然后再将分子印迹传感器置于一定浓度的凝血酶溶液中孵育后,再扫描得到电流I,则传感器的响应电流为ΔI=I-I 0,测定结果见图4和图5。测定凝血酶的线性范围为10.0fg/mL~1.0μg/mL,检测限为1.7fg/mL。该传感器置于4℃的环境中,两周后,仍保留响应电流值的90%以上。
Claims (4)
1.一种分子印迹电化学传感器的凝血酶检测方法,其特征在于,所述方法以羧基化的碳纳米管为增敏材料,以凝血酶为模板分子,邻苯二胺为功能单体,通过电聚合法制得对凝血酶具有特异性识别功能的分子印迹聚合膜,利用聚邻苯二胺兼具分子印迹膜和电化学探针的两者作用,构建测定非电活性物质凝血酶的无试剂型分子印迹电化学传感器;所述方法以分子印迹膜修饰电极作为工作电极,参比电极为Ag/AgCl电极,辅助电极为铂电极,组成三电极体系,实现对凝血酶的高灵敏检测。
2.根据权利要求1所述一种分子印迹电化学传感器的凝血酶检测方法,其特征在于,所述方法步骤为:
(1)将干净的玻碳电极置于含有0.5~2.0mg/mL的羧基化的碳纳米管悬浮液中,于1.0~2.2V恒电位电沉积30~500s,制得碳纳米管修饰的玻碳电极;
(2)将碳纳米管修饰电极置于含有0.3~1.5mg/mL的邻苯二胺和0.01~0.10mg/mL的凝血酶的pH5.0~7.0磷酸缓冲液中,于0.5~1.2V恒电位沉积5~15min,然后将此修饰电极用去离子水冲洗后,制得分子印迹聚合膜-凝血酶/碳纳米管修饰的玻碳电极;
(3)将分子印迹聚合膜-凝血酶/碳纳米管修饰的玻碳电极置于乙醇与乙酸的混合溶液中洗脱,混合溶液中乙醇与乙酸的体积比为1:0.2~1:5;去除聚合膜中的凝血酶,得到分子印迹聚合膜/碳纳米管修饰的玻碳电极,该修饰电极即为测定凝血酶的分子印迹传感器。
3.根据权利要求1所述一种分子印迹电化学传感器的凝血酶检测方法,其特征在于,所述分子印迹传感器检测凝血酶的方法如下:
直接以分子印迹聚合膜聚邻苯二胺为电化学探针,利用分子印迹传感器中的空穴与凝血酶的特异性结合作用,通过检测分子印迹传感器结合凝血酶后的电流变化,实现对凝血酶的检测,将分子印迹传感器为工作电极,参比电极为Ag/AgCl电极,辅助电极为铂电极,组成三电极体系,即可实现对凝血酶的检测。
4.根据权利要求1所述一种分子印迹电化学传感器的凝血酶检测方法,其特征在于,所述分子印迹传感器测定凝血酶的线性范围为10.0fg/mL~1.0μg/mL,检测限为1.7fg/mL。
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Granted publication date: 20171017 Termination date: 20181110 |
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