CN109722415A - 一种造血干细胞的培养组合物、培养基以及造血干细胞的培养方法 - Google Patents

一种造血干细胞的培养组合物、培养基以及造血干细胞的培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种组合物，其包括：转化生长因子‑β，即TGF‑β；Notch配体；干细胞生长因子，即SCF；Fms相关的酪氨酸激酶受体3，即Flt3L；促血小板生成素，即TPO；白介素‑6，即IL‑6；以及UM171分子，所述UM171分子的结构式如式I所示。本发明还涉及体外长期培养、扩增造血干细胞的无血清培养基及使用其的培养方法。

Description

一种造血干细胞的培养组合物、培养基以及造血干细胞的培 养方法
技术领域
本发明涉及一种体外长期培养、扩增造血干细胞的无血清培养方法。具体而言，本发明涉及一种包含调控造血干细胞和祖细胞自我更新的生长因子的组合物，以及包含该组合物的无血清培养基，以及使用该培养基培养、扩增造血干细胞的方法，以及利用所述方法制备成的造血干细胞及其用途。
背景技术
造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs)具有自我更新细胞增殖和分化到各种血液组织的能力。造血干细胞对于血液系统的发育、维持和再生发挥着至关重要的作用。通常情况下，造血干细胞在正常的血液系统中处于静息状态，但是一旦发生如移植器官过程中的血液损失和感染，造血干细胞被立即激活以发生快速造血的功能。大部分的造血干细胞处于细胞周期的G0 期，大约每个月会更新一次，造血干细胞进入细胞周期启动增殖的程序是相对随机发生的。
造血干细胞的生长主要由两种机制调控。第一是细胞周期G0期的调节，第二是命运决定(fate determination)，即分化或者自我更新。其中在调控造血干细胞生长的过程中，有多种结合于细胞膜表面的蛋白质参与了细胞功能和自我更新的过程。
其中干细胞生长因子(stem cell factor,SCF)和促血小板生成素(thrombopoietin,TPO)是对于造血干细胞来说两个最关键的生长因子。SCF 通过结合到c-kit的受体上来发挥其功能。研究表明，将小鼠中c-kit受体敲除或者用中和抗体减弱其功能将导致由于造血干细胞和成熟的细胞消失而引起的胚胎死亡(Geissler,etal.Genetics.1981；Ogawa,et al.J Exp Med.1991)。此外，SCF能够与白介素-3、白介素-6、白介素-11、白介素-12、白介素-27 和TPO协同，共同调节造血干细胞的存活和增殖。TPO则是另一个关键的生长因子。研究表明，TPO在体外培养造血干细胞过程中，与SCF连用可显著扩增造血干细胞，将TPO的受体敲除后，造血干细胞无法重建模型小鼠的造血系统(Sitnicka,et al.Blood.1996；Kimura,et al.PNAS.1998)。
此外，转化生长因子-β(transforming growth factor-β1,TGF-β)在多种细胞中表达，例如巨噬细胞、T细胞、基质细胞和内皮细胞等。研究表明，单细胞培养造血干细胞过程中发现，TGF-β能够维持造血干细胞自我更新至少一个星期。通过体内动物模型实验进一步发现，TGF-β受体1缺失的造血干细胞呈现正常的细胞周期和长期的重建造血系统的能力。而将TGF-β受体2 敲除后则显著抑制了造血干细胞重建的能力，由此表明，TGF-β受体2发挥着TGF-β信号通路在造血干细胞自我更新过程中的核心作用(Oshima,et al. DevBiol.1996；Larsson,et al.Blood.2003)。除了SCF、TPO、TGF-β等生长因子外，还有其它的细胞因子例如白介素-6(Interleukin 6,IL-6)、Fms相关的酪氨酸激酶3受体(Fms-relatedtyrosine kinase 3ligand,Flt3L)、Notch蛋白的配体等(Zhao,et al.Progress inHematology.2016)，以及化学小分子SR-1,PGE2。
迄今为止，自体的造血干细胞移植对于治疗血液疾病例如血液系统相关的癌症和重型贫血等疾病是唯一的治疗手段。但是，大部分的病人无法获得人类白细胞抗原(humanleukocyte antigen，HLA)全相合的供体。由此可见，如果能够建立体外长期培养、扩增造血干细胞的培养系统，对于解决HLA 全相合的供体严重缺乏是一种质的飞跃。
发明内容
技术问题
综上所述，本发明的目的在于通过一种新型的生长因子的组合物，以及包含其的培养基和培养方法，以解决造血干细胞长期体外扩增的科学问题。进行本发明以解决本领域中存在的上述问题，且本发明的目的是使用从脐带血分离的CD34阳性的造血干细胞，在本发明无血清培养体系下长期扩增，持续表达造血干细胞特异的细胞膜蛋白CD34，使得表达比例大于95％，并且CD45RA阴性的比例大于40％，同时，长期扩增后的造血干细胞能够高效重建小鼠模型的造血系统，由此以解决临床造血干细胞移植供体短缺的问题。
然而，通过本发明实现的技术目的不限于上述目的，但本领域的技术人员从如下说明将显而易见地理解其他未提及的目的。
技术方案
为实现上述目的，本发明提供从脐带血、骨髓和外周血等组织分离获得表达CD34阳性蛋白的造血干细胞。
本发明还提供将CD34阳性的造血干细胞和/或祖细胞在无血清培养体系下，长期扩增的培养方案。
本发明还提供用于解决造血干细胞移植供体严重短缺问题的用途。
本发明涉及一种体外长期培养、扩增造血干细胞和/或祖细胞的无血清培养基，其包含小分子活性化合物的组合物。
具体来说，本发明涉及以下内容：
1.一种组合物，其包括：
转化生长因子-β，即TGF-β；
Notch配体；
干细胞生长因子，即SCF；
Fms相关的酪氨酸激酶受体3，即Flt3L；
促血小板生成素，即TPO；
白介素-6，即IL-6；以及
UM171分子，所述UM171分子的结构式如式I所示
2.根据项1所述的组合物，其中，
所述TGF-β的浓度为50-200ng/ml，优选为50-100ng/ml；
所述Notch配体的浓度为10-100ng/ml，优选为20-50ng/ml。
3.根据项1或2所述的组合物，其中，
所述SCF的浓度为50-200ng/ml，优选为50-100ng/ml；
所述Flt3L的浓度为50-200ng/ml，优选为50-100ng/ml；
所述TPO的浓度为50-200ng/ml，优选为50-100ng/ml；
所述IL-6的浓度为10-100ng/ml，优选为20-50ng/ml；
所述UM171分子的浓度为20nmol-1μmol/ml，优选为100-350nmol/ml。
4.一种体外长期培养、扩增造血干细胞和/或祖细胞的无血清培养基，其包括：
基础培养基以及项1～3中任一项所述的组合物。
5.根据项4所述的无血清培养基，其中，所述基础培养基为无血清基础培养基。
6.一种体外长期培养、扩增造血干细胞和/或祖细胞的方法，包括：
使用包含项1～3中任一项所述的组合物的无血清培养基或使用项4或5 所述的无血清培养基进行体外培养、扩增造血干细胞和/或祖细胞。
7.根据项6的方法，其中，该方法将造血干细胞和/或祖细胞培养7天后，造血干细胞数目扩增8-15倍，细胞存活率大于95％。
8.根据项7的方法，其中，该方法将造血干细胞和/或祖细胞培养7天后，所述造血干细胞CD34阳性比例大于95％，CD45RA阴性比例大于40％，该方法将造血干细胞培养14天后，所述造血干细胞CD34阳性比例大于 70％。
9.根据项6～8中任一项的方法，其中该方法将造血干细胞和/或祖细胞培养14天后，细胞数目扩增40～55倍。
10.根据项6～9中任一项的方法，其中所述造血干细胞和/或祖细胞为人造血干细胞和/或祖细胞。
11.根据项10的方法，其中所述造血干细胞和/或祖细胞来源于脐带血、骨髓、外周血等组织。
12.项6～11中任一项所述的方法制备的造血干细胞和/或祖细胞。
13.根据项12的细胞，其为人造血干细胞和/或祖细胞。
14.根据项13的细胞，其来源于脐带血、骨髓、外周血等组织
15.根据项14的细胞，其为CD34分子表达阳性、CD45RA分子表达阴性。
16.项12～15中任一项所述的造血干细胞和/或祖细胞在制备在治疗有需要的患者的疾病的药物中的用途。
发明效果
本发明中造血干细胞和/或祖细胞可以从脐带血、骨髓和外周血中通过临床级别的磁珠分选的方式获得，起始细胞是成体干细胞，易获得且无致瘤风险。造血干细胞体外可长期扩增，扩增7天后，细胞数目扩增8-15倍，例如10倍，CD34阳性比例大于95％，CD45RA阴性的比例大于40％，细胞存活率大于95％；扩增14天后，CD34阳性比例大于70％，细胞数目扩增40-55倍，例如50倍，显著优于已报道的造血干细胞培养系统，且本培养体系是不含有血清的无血清培养系统，消除了血清带来的血清成分不明确，批次差异显著的问题，利于大规模工业化生产。
进一步，经过本发明涉及的培养基和利用本发明的培养方法培养2天和 7天后，将造血干细胞移植进入免疫缺陷小鼠模型中，在6周、8周和10周后的结果显示均能高效重建小鼠模型的造血系统，证明造血干细胞体内造血功能正常。
附图简述
图1显示实施例1从脐带血中分离获得的造血干细胞流式分析结果；上面两张图显示阴性细胞的结果，下面两张图显示HSCs的结果，其中，检测 CD34和CD45RA两种膜蛋白。
图2显示实施例1从不同的脐带血供体中分离获得造血干细胞的CD34 和CD45RA两种膜蛋白的效率统计图。
图3显示在实施例2中利用实施例1中从脐带血中分离的造血干细胞进行长期培养、扩增的造血干细胞表达CD34阳性细胞的流式分析实验结果图，其中，APC-H通道是荧光通道，由于CD34抗体上带有APC荧光，能够被 APC-H通道的荧光激发，识别出CD34阳性的细胞，因此可以用于检测CD34 阳性的细胞，FSC-H通道是指FSC与细胞直径平分正相关，表示细胞的大小，FITC-H通道是CD45RA染色情况，SSC-H通道代表侧向角散射，其代表细胞的颗粒度，值越大代表细胞的颗粒度越大，颗粒度指细胞表面的皱折度，细胞内亚细胞器、颗粒的数目等。
图4显示在实施例2中对从脐带血中分离的造血干细胞长期培养扩增的CD34蛋白阳性细胞的流式分析实验的比例统计图。
图5显示在实施例2中从脐带血中分离的造血干细胞培养7天后流式分析结果。上图和下图分别是两个供体。检测CD34和CD45RA两种膜蛋白, 和PI染色细胞活性，其中，APC-H通道是CD34染色情况，FITC-H通道是 CD45RA染色情况，PE-H是PI染色情况。PI阴性细胞群指针活细胞，SSC-H 通道代表侧向角散射，其代表细胞的颗粒度，值越大代表细胞的颗粒度越大，颗粒度指细胞表面的皱折度，细胞内亚细胞器、颗粒的数目等。
图6显示实施例2中的不同供体来源的造血干细胞的生长曲线图。起始细胞数量均为2*10^5细胞，分别在第0天，第4天，第7天和第14天对细胞数量和存活率进行检测。
图7显示实施例2中从脐带血中分离的造血干细胞长期培养扩增的流式分析实验结果图(从左至右从上到下分别是培养第0天，第4天，第7天和第14天的CD34和CD45RA蛋白表达情况，以及pi染色测试细胞活率情况)，其中APC-H通道是CD34染色情况，FITC-H通道是CD45RA染色情况，PE-H显示PI染色情况，PI表示阴性细胞群指针活细胞，SSC-H通道代表侧向角散射，其代表细胞的颗粒度，值越大代表细胞的颗粒度越大，颗粒度指细胞表面的皱折度，细胞内亚细胞器、颗粒的数目等。
图8显示实施例3中，将实施例1得到的造血干细胞体外培养2天后，移植进入经过辐照仪照射的NPG免疫缺陷小鼠模型，6周后检测人CD45 和小鼠CD45的表达情况，上部的三张图表示：未注射细胞的小鼠，下部的三张图：注射培养人造血干细胞2天后的小鼠，CD45-FITC：小鼠CD45， CD45-APC-Cy7-H：人CD45。
图9显示实施例3中，将实施例1得到的造血干细胞体外培养7天后，移植进入经过辐照仪照射的NPG免疫缺陷小鼠模型，6周后检测人CD45 和小鼠CD45的表达情况，上部的三张图表示：未注射细胞的小鼠，下部的三张图：注射培养人造血干细胞7天后的小鼠，CD45-FITC：小鼠CD45， CD45-APC-Cy7-H：人CD45。
图10显示实施例3中，将实施例1得到的造血干细胞体外培养7天后，移植进入经过辐照仪照射的NPG免疫缺陷小鼠模型，6周、8周、10周后检测人CD45的比例，其中CD45比例的计算方式为人CD45％/(人CD45％+ 小鼠CD45％)，人CD45％和小鼠CD45％分别是流式分析实验结果中各自表达的百分比。
具体实施方案
本发明涉及的组合物，其包括：转化生长因子-β，即TGF-β；Notch配体；干细胞生长因子，即SCF；Fms相关的酪氨酸激酶受体3，即Flt3L；促血小板生成素，即TPO；白介素-6，即IL-6；以及UM171分子。其中在该组合物中TGF-β的浓度为50-200ng/ml，优选为50-100ng/ml；Notch配体的浓度为10-100ng/ml，优选为20-50ng/ml。其中，在该组合物中，SCF的浓度为50-200ng/ml，优选为50-100ng/ml；Flt3L的浓度为50-200ng/ml，优选为50-100ng/ml；TPO的浓度为50-200ng/ml，优选为50-100ng/ml；IL-6 的浓度为10-100ng/ml，优选为20-50ng/ml；UM171分子的浓度为 20nmol-1μmol/ml，优选为100-350nmol/ml。
在本发明的一个具体的实施方式中，组合物由转化生长因子-β，即 TGF-β；Notch配体；干细胞生长因子，即SCF；Fms相关的酪氨酸激酶受体3，即Flt3L；促血小板生成素，即TPO；白介素-6，即IL-6；以及UM171 分子组成。
如本发明使用的，术语“白介素-6(interleukin-6,IL-6)”是一种细胞因子，属于白细胞介素的一种。它是由纤维母细胞、单核/巨噬细胞、T淋巴细胞、 B淋巴细胞、上皮细胞、角质细胞、以及多种瘤细胞所产生。IL-1、TNF-a, PDGF、病毒感染、双链RNA及c AMP等，均可诱导正常细胞产生白介素6。白介素6能够刺激参与免疫反应的细胞增殖、分化并提高其功能。
如本发明使用的，术语“促血小板生成素(thrombopoietin,TPO)”是指一种细胞因子，重组TPO在动物体内的实验表明，它不仅能比其它造血因子更有效地增加血小板水平，还具有促进其它造血细胞系活力的能力。
如本发明使用的，术语“干细胞因子(stem cell factor,SCF)”是指又称肥大细胞生长因子(MGF)，Kit配体(KL)及Steel因子(SLF)。它是由骨髓微环境中的基质细胞产生的一种酸性糖蛋白。SCF和其他细胞因子一起诱导干细胞和 /或祖细胞增生、延长其存活期及引起干细胞和/或祖细胞动员。虽然SCF的受体在祖细胞无显著不同，但SCF诱导红系祖细胞增生比粒-单祖细胞强，可能是其他特异性因素影响祖细胞对SCF的反应性。
如本发明使用的，术语“转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)“是属于一组新近发现的调节细胞生长和分化的TGF-β超家族。这一家族除TGF-β外，还有活化素(activins)、抑制素(inhibins)、缪勒氏管抑制质 (Mullerian inhibitorsubstance,MIS)和骨形成蛋白(bone morpho-genetic proteins,BMPs)。
如本发明使用的，术语“UM171”是一种化学合成的小分子，其结构式如下。UM171有效扩增人CD34+CD45RA-动员的外周血(mPB)细胞，减弱细胞分化，并促进原始人造血细胞的体外扩增。UM171在体外能够通过造血诱导的关键步骤增强造血细胞的分化。它能够在多个发育时期、阶段增强造血细胞的衍生。UM171对血红细胞的发育没有作用，但能够抑制血红细胞的成熟。UM171对更原始表型的细胞具有更强有效的作用，包括 CD34+CD45RA-细胞。
如本发明使用的，术语“Notch配体”是Notch信号通路的重要组成成分。 Notch信号通路由Notch受体、Notch配体(DSL蛋白)、CSL(CBF-1，Suppressor of hairless，Lag的合称)DNA结合蛋白、其他的效应物和Notch的调节分子等组成。Notch信号的产生是通过相邻细胞的Notch配体与受体相互作用， Notch蛋白经过三次剪切，由胞内段(NICD)释放入胞质，并进入细胞核与转录因子CSL结合,形成NICD/CSL转录激活复合体，从而激活HES、HEY、HERP等碱性-螺旋-环-螺旋转录抑制因子家族的靶基因，发挥生物学作用。
如本发明使用的，术语“Flt3L”是指FMS-like tyrosine kinase 3ligand， FMS络氨酸激酶3受体。Flt3L是一种细胞内源表达的小分子，其功能和生长因子和细胞因子类似，通过激活血液系统的祖细胞来增加T淋巴细胞和B 淋巴消等免疫细胞。作用机理是通过与CD135(在小鼠中表达在多潜能的祖细胞和淋巴祖细胞的膜蛋白)结合，来诱导激活造血干细胞和/或祖细胞，帮助清除癌细胞等。
本发明涉及的无血清培养基，其包含基础培养基，该基础培养基是无血清基础培养基，即serum-free culture basal medium(SFCBM)。本领域技术人员可以理解，任何常用的无血清基础培养基均可以使用。例如可以列举本领域中常用的无血清基础培养基，例如StemSpanTM SFEM II(购自STEM CELL TECHONOLOGIES)；例如购自Thermo Fisher的IMDM、DF12、Knockout DMEM、RPMI 1640、Alpha MEM、DMEM等。此外，任何本领域技术人员已知的无血清基础培养基均可以使用。此外，可以根据需要进一步在上述培养基中外加一些其他成分，例如可以外加ITS(即主要包括胰岛素、人转铁蛋白以及硒元素)、L-谷氨酰胺、维生素C以及牛血清白蛋白。例如可以在IMDM 培养基中外加ITS、外加2mM L-谷氨酰胺、外加10-50μg/ml维生素C以及0.5-5质量％的BSA(牛血清白蛋白)。此外，上述DF12可以外加同样浓度的ITS，L-谷氨酰胺，维生素C和牛血清白蛋白。Knockout DMEM可以外加同样浓度的ITS，L-谷氨酰胺，维生素C和牛血清白蛋白，RPMI 1640可以外加同样浓度的ITS，L-谷氨酰胺，维生素C和牛血清白蛋白，Alpha MEM 可以外加同样浓度的ITS，L-谷氨酰胺，维生素C和牛血清白蛋白，DMEM 也可以外加同样浓度的ITS，L-谷氨酰胺，维生素C和牛血清白蛋白。在此，各种基础培养基中外加的ITS的浓度可以是：胰岛素浓度是0.1mg/ml、人转铁蛋白是0.0055mg/ml、硒元素6.7*10-6mg/ml。此外，外加的ITS各成分的浓度也可以根据实际需要来调整。ITS可以从Thermofisher购买，并根据需要调节成合适的最终使用浓度。
在一个实施方案中，基础培养基为StemSpanTM SFEM II(购自STEM CELLTECHONOLOGIES)，该无血清培养基中使用的生长因子为50-200 ng/ml SCF,50-200ng/mlFlt3-L,10-100ng/ml IL-6,50-200ng/ml TPO,50-200 ng/ml TGF-β，10-100ng/ml Notch配体,20nmol/ml-1μmol/mlUM171，以上生长因子和小分子在该范围内的组合均可以长期维持造血干细胞的增殖和生长。最优浓度分别是100ng/ml SCF,100ng/ml Flt3-L,20ng/mlIL-6,100ng/ml TPO,50ng/ml TGF-β，50ng/ml Notch配体，350nmol/mlUM171。
在一个实施方案中，基础培养基可包含IMDM+ITS(其中培养基中ITS 中各物质的终浓度是：胰岛素浓度是0.1mg/ml、人转铁蛋白是0.0055mg/ml、硒元素6.7*10-6mg/ml)(即主要包括胰岛素、人转铁蛋白以及硒元素)，10-50 μg/ml维生素C，以及0.5-5质量％的BSA(牛血清白蛋白)，该无血清培养基中使用的生长因子为50-200ng/ml SCF,50-200ng/mlFlt3-L，10-100ng/ml IL-6,50-200ng/ml TPO,50-200ng/ml TGF-β，10-100ng/ml Notch配体, 20nmol/ml-1μmol/ml的UM171。以上生长因和小分子在该范围内的组合均可以长期维持造血干细胞的增殖和生长。优选上述物质的浓度分别是100 ng/ml SCF,100ng/ml Flt3-L,20ng/ml IL-6,100ng/ml TPO,50ng/ml TGF-β，50 ng/ml Notch配体,350nmol/ml的UM171。
优选上述物质的浓度组合为50ng/ml SCF,50ng/ml Flt3-L,50ng/ml IL-6,50ng/ml TPO,100ng/ml TGF-β，20ng/ml Notch配体,350nmol/ml的 UM171。基础培养基是StemSpanTM SFEM II。
本发明的发明人首先从脐带血中获得大量的CD34阳性且CD45RA阴性的造血干细胞,并检测和评估造血干细胞在细胞因子和化学分子组成的无血清培养体系下扩增培养的情况，由此完成本发明。
根据本发明的扩增造血干细胞的培养体系通过包括：
a)-b)的方法产生，但不限于此：
a)从人脐带血中通过磁珠分选的方法分离CD34阳性的造血干细胞；
b)在无血清培养基中，添加额外的生长因子和化学小分子的组合物，即采用本发明涉及的无血清造血干细胞扩增培养基，利用该培养基来培养步骤a)中分离的造血干细胞。
如本文使用，术语“造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs)指骨髓中的干细胞，它具有自我更新能力并分化成为各种细胞前体细胞，最终生成各种血细胞成分，包括红细胞、白细胞和血小板，它们也可以分化成为各种其他细胞。造血干细胞包括三级分化水平，即多能干细胞、定向干细胞及成熟的子细胞。造血干细胞的两个重要特征是，可分化成所有类型的血细胞和高度的自我更新或自我复制能力。
如本发明使用的，术语“分化”指其中细胞的结构或功能在分裂、增殖和其生长过程中特化的现象，即，生物体细胞或组织的特征和功能改变以实施给予细胞或组织的功能。一般而言，其指其中相对简单的系统分为两种或多种性质不同的部分系统的现象。
如本发明使用的，术语“Ficoll液密度梯度离心法”，其基本原理是血液中的不同成分的比重存在差异，在低速密度梯度离心时，可将不同的细胞层粉离开。红细胞和粒细胞密度大于分层液体，并且因红细胞遇到ficoll液之后会迅速凝集成串钱状而积于管底。唯有于分层液体密度相当的单个核细胞富集在血浆层和分层液之间，即白膜层，造血干细胞/祖细胞即存在于此层，通过后续磁珠分选即可获得。在本发明中，单个核细胞是利用商售的淋巴细胞分离管获得。
如本发明使用的，术语“无血清造血干细胞扩增培养基”是指帮助HSCs 的细胞大量扩增培养体系。本发明中该培养基包含两种主要成分，分别是无血清基础培养基，生长因子和化学小分子添加剂。基础培养基是无血清体系，可以是StemSpanTM SFEM II(STEMCELLS TECHNOLOGY Inc.),也可以是 IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)，外加ITS(Thermofisher)和L- 谷氨酰胺(Thermofisher)和维生素C和牛血清白蛋白，也可以是上述DF12外加ITS，L-谷氨酰胺，维生素C和牛血清白蛋白。也可以是上述Knockout DMEM外加ITS，L-谷氨酰胺，维生素C和牛血清白蛋白，也可以是上述 RPMI 1640外加ITS，L-谷氨酰胺，维生素C和牛血清白蛋白，也可以是上述Alpha MEM外加ITS，L-谷氨酰胺，维生素C和牛血清白蛋白，也可以是上述DMEM外加ITS，L-谷氨酰胺，维生素C和牛血清白蛋白。生长因子添加剂为IL-6、SCF、TPO、Flt-3L、TGF-β、Notch配体和小分子UM171 的不同浓度的组合。ITS、L-谷氨酰胺、维生素C和牛血清白蛋白等物质的添加浓度，以及各生长因子添加剂的浓度可以参照上文所述。
如本发明使用的，术语“磁珠分选”是指把细胞用超级顺磁性的MACS MicroBeads(MACS微型磁珠)特异性地标记，磁性标记完后，把这些细胞通过一个放在强而稳定磁场中的分选柱。分选柱里的基质造成一个高梯度磁场。被磁性标记的细胞滞留在柱里而未被标记的细胞则流出。当分选柱移出磁场后，滞留柱内的磁性标记细胞就可以被洗脱出来，这样就完全可以获得标记和未标记的两个细胞组份。
实施例
此后，本发明将参照实施例进一步说明。对本领域的技术人员显而易见的是这些实施例仅出于说明目的而不应理解为对本发明保护范围的限制。因此，本发明的实质性保护范围将通过所附权利要求和其等同物限定。
实施例1：源自人脐带血的CD34阳性的造血干细胞和/或祖细胞HSCs的收集
根据本发明的源自人脐带血的HSCs构建和培养。
(1)密度梯度离心
本发明是采用商售的淋巴细胞分离管(达科为)通过密度梯度离心的方法从三个人供体的脐带血(该三个供体的脐带血购买自澳赛尔斯生物技术(上海) 有限公司)中分离单核细胞。离心参数为1600rpm，30min。
(2)磁珠分选
本发明采用的磁珠分选试剂盒是购自德国美天旎公司。将步骤(1)中得到的单核细胞磷酸盐缓冲液洗涤，离心，加入CD34的磁珠标记造血干细胞和 /或祖细胞，在4℃，30min后，再经过磷酸盐缓冲液洗涤，离心，过磁珠分选分离柱子，即可获得高纯度的CD34阳性的造血干细胞和/或祖细胞(以下简称为新鲜分离的HSCs)。
对实施例1获得的高纯度的CD34阳性的造血干细胞和/或祖细胞进行流式分析，其结果如图1所示。根据图1可以看出从新鲜的脐带血中分离的 CD34阳性的造血干细胞和/或祖细胞高表达CD34且低表达CD45RA。
本实施例1得到的造血干细胞和/或祖细胞的CD34和CD45RA两种膜蛋白的效率统计图如图2所示，根据图2显示的结果，显示来自不同来源的 3个供体上提取结果基本一致，说明采用实施例1的方法新鲜分离的HSCs 的结果具有重现性。
实施例2：无血清造血干细胞扩增培养基培养扩增造血干细胞
将实施例1中来自其中一个供体的新鲜分离的HSCs利用下述培养基进行体外培养扩增14天，分别在第0天、3天、4天、7天、14天检测CD34 蛋白的表达情况，结果如图3和图4所示。
上述培养的条件为，在37℃培养箱中(Thermo fisher)，采用的基础培养基是：StemSpanTM SFEM II,添加的生长因子为100ng/ml SCF,20ng/ml IL-6, 100ng/ml TPO,100ng/ml Flt3-L,50ng/ml TGF-β，50ng/ml Notch配体, 350nmol UM171。
在上述体外培养扩增的第7天，检测CD34蛋白和CD45RA蛋白的表达情况，其中CD34蛋白阳性比例的结果如图5所示。在体外培养扩增7天， PI染色检测细胞活率，结果如图5所示。将上述新鲜分离的HSCs体外培养扩增14天，分别在第0天，第4天和第7天和第14天测定细胞数目，绘制增殖曲线，结果如图6所示。
根据上述图7的结果可以说明，无血清造血干细胞扩增培养基能够不仅能够长期维持CD34阳性的造血干干细胞的干性，保持CD34高表达， CD45RA低表达，而且细胞生长活率高(活细胞比例大于85％)，生长状态良好。图3～图7的结果说明，无血清造血干细胞扩增培养基能够长期扩增造血干细胞，14天后扩增50倍以上，同时维持造血干细胞的干性状态和生长活力。
实施例3培养得到的造血干细胞在免疫缺陷小鼠模型中的蛋白质表达
针对实施例1的方法获得新鲜分离的HSCs，并利用实施例2的方法进行体外造血干细胞体外培养，培养2天后，移植进入经过辐照仪照射的NPG 免疫缺陷小鼠模型(购自北京维通达生物技术有限公司(Beijing Vitalstar Biotechnology,Inc.)。在移植6周后检测人CD45和小鼠CD45的表达情况，其结果如图8所示。其中移植到小鼠中的方法为：在细胞移植24小时前，进行1.0Gy射线照射，清除小鼠模型的骨髓。随后将用20μL 0.9％的生理盐水重悬的1.0*106的细胞注射到小鼠的尾静脉中，随后放入洁净级别的动物房中饲养。图8的结果表明在无血清造血干细胞扩增培养基中培养2天后的 CD34阳性的造血干细胞，移植进入小鼠模型后，6周后观察，小鼠体内约有12.97％的人源的细胞，说明培养2天后的造血干细胞能够重建小鼠模型的造血系统。
将实施例1利用实施例2的方法进行体外造血干细胞体外培养，培养7 天后，按照如上所述的方法移植进入经过辐照仪照射的上述NPG免疫缺陷小鼠模型，移植6周后检测人CD45和小鼠CD45的表达情况，其结果如图 9所示。图9的结果表明在无血清造血干细胞扩增培养基中培7天后的CD34 阳性的造血干细胞，移植进入小鼠模型后，6周后观察，小鼠体内约有41.53％的人源的细胞，说明培养7天后的造血干细胞能够重建小鼠模型的造血系统。
将实施例1利用实施例2的方法进行体外造血干细胞体外培养，培养7 天后，按照如上所述的方法移植进入经过辐照仪照射的上述NPG免疫缺陷小鼠模型，移植6周、8周、10周后检测人CD45的比例，其结果如图10 所示。
图10的结果表明在无血清造血干细胞扩增培养基中培7天后的CD34 阳性的造血干细胞，移植进入小鼠模型后，6周、8周、10周后观察，重建小鼠造血系统的效率(humanCD45％)的在提高，从第6周的平均重建效率 20％提高到第10周的平均重建效率40％,进一步证明该培养基培养7天后的造血干细胞能快速、高效地重建小鼠模型的造血系统，表明培养7天后的细胞功能正常，明显好于现有的文献报道(Xu,et al.Molecular Therapy.2017；DeWitt,et al.Sci Transl Med.2016；Mettananda,et al.Nature Communications.2017)。
工业实用性
根据本发明，从脐带血中分离得到单核细胞，经过CD34磁珠分选获得造血干细胞。将造血干细胞在无血清造血干细胞培养基下培养，扩增7天后，细胞数目扩增10倍，CD34阳性比例大于95％，CD45RA阴性的比例大于 40％，细胞活率大于95％；扩增14天后，CD34阳性比例大于70％，细胞数目扩增50倍，扩增2天和7天后的造血干细胞能够有效重建小鼠模型的造血系统，且本培养基不含血清等不确定性成分，利于大规模GMP车间生产造血干细胞，以解决临床医学所面临的造血干细胞供体严重短缺的问题。

Claims (16)

1.一种组合物，其包括：
转化生长因子-β，即TGF-β；
Notch配体；
干细胞生长因子，即SCF；
Fms相关的酪氨酸激酶受体3，即Flt3L；
促血小板生成素，即TPO；
白介素-6，即IL-6；以及
UM171分子，所述UM171分子的结构式如式I所示
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，
所述TGF-β的浓度为50-200ng/ml，优选为50-100ng/ml；
所述Notch配体的浓度为10-100ng/ml，优选为20-50ng/ml。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中，
所述SCF的浓度为50-200ng/ml，优选为50-100ng/ml；
所述Flt3L的浓度为50-200ng/ml，优选为50-100ng/ml；
所述TPO的浓度为50-200ng/ml，优选为50-100ng/ml；
所述IL-6的浓度为10-100ng/ml，优选为20-50ng/ml；
所述UM171分子的浓度为20nmol-1μmol/ml，优选为100-350nmol/ml。
4.一种体外长期培养、扩增造血干细胞和/或祖细胞的无血清培养基，其包括：
基础培养基以及权利要求1～3中任一项所述的组合物。
5.根据权利要求4所述的无血清培养基，其中，所述基础培养基为无血清基础培养基。
6.一种体外长期培养、扩增造血干细胞和/或祖细胞的方法，包括：
使用包含权利要求1～3中任一项所述的组合物的无血清培养基或使用权利要求4或5所述的无血清培养基进行体外培养、扩增造血干细胞和/或祖细胞。
7.根据权利要求6的方法，其中，该方法将造血干细胞和/或祖细胞培养7天后，造血干细胞数目扩增8-15倍，细胞存活率大于95％。
8.根据权利要求7的方法，其中，该方法将造血干细胞和/或祖细胞培养7天后，所述造血干细胞CD34阳性比例大于95％，CD45RA阴性比例大于40％，该方法将造血干细胞培养14天后，所述造血干细胞CD34阳性比例大于70％。
9.根据权利要求6～8中任一项的方法，其中该方法将造血干细胞和/或祖细胞培养14天后，细胞数目扩增40～55倍。
10.根据权利要求6～9中任一项的方法，其中所述造血干细胞和/或祖细胞为人造血干细胞和/或祖细胞。
11.根据权利要求10的方法，其中所述造血干细胞和/或祖细胞来源于脐带血、骨髓、外周血等组织。
12.权利要求6～11中任一项所述的方法制备的造血干细胞和/或祖细胞。
13.根据权利要求12的细胞，其为人造血干细胞和/或祖细胞。
14.根据权利要求13的细胞，其来源于脐带血、骨髓、外周血等组织。
15.根据权利要求14的细胞，其为CD34分子表达阳性、CD45RA分子表达阴性。
16.权利要求12～15中任一项所述的造血干细胞和/或祖细胞在制备在治疗有需要的患者的疾病的药物中的用途。
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