CN107151655A

CN107151655A - 一种细胞扩增的方法

Info

Publication number: CN107151655A
Application number: CN201710227450.8A
Authority: CN
Inventors: 张斌; 李猛; 陈虎; 赵龙
Original assignee: Pla Third O Seven Hospital
Current assignee: Pla Third O Seven Hospital
Priority date: 2017-04-10
Filing date: 2017-04-10
Publication date: 2017-09-12

Abstract

一种细胞扩增的方法,能够高效率地扩增造血干细胞。主要采用UM171及间充质干细胞联合培养基。本法培养细胞扩增量高、细胞活性好。

Description

一种细胞扩增的方法

技术领域

本发明涉及细胞扩增领域，特别是造血干细胞系包扩增领域.

背景技术

自1989^[1]年第一例脐带血移植开展以来，脐带血作为造血干细胞(hematopoieticstem cells,HSCs)的重要来源一直备受关注，脐带血移植的优势在于其不需要严格的人类白细胞主要抗原(human leukocyte antigen,HLA)配型，对供者无伤害且不存在伦理问题，感染风险小，可冷冻保存使用便捷^[2,3]等。制约其在临床中大量应用的最主要障碍在于脐带血中HSCs的数量有限，移植后会导致造血恢复延迟，感染风险增加等问题^[4]。而双份脐带血移植则会增加移植的风险，导致植入延迟等问题出现，且会增加患者经济负担^[5]。近年来国内外一直尝试对脐带血来源造血干祖细胞(hematopoieticstemprogenitorcells,HSPCs)进行体外扩增，以解决其细胞数量不足的问题。目前HSPCs扩增技术主要有细胞因子扩增技术，化学分子扩增技术，联合培养扩增技术以及三维培养系统的应用^[6]。涉及脐血源HSPCs扩增实验已经进入临床实验阶段，并证实了扩增后HSPCs的安全性及有效性^[7]，但最佳的扩增条件至今尚没有明确的共识。

造血微环境在HSCs的成长分化过程中扮演重要角色，体外培养过程中能否更有效的模拟造血微环境，是决定HSPCs体外扩增效果的重要先决条件。间充质干细胞(mesenchyma stem cell,MSC)作为造血微环境的重要组成部分，可以分泌造血生长因子和细胞因子，为HSPCs的增殖提供信号，研究表明其与HSPCs共培养可以显著提高扩增效率^[8]。UM 171是造血干细胞龛中筛选出的选择性的人HSCs再生激动剂，可以选择性的增加长期HSPCs的再生^[9]。鉴于以上结果，为更有效的模拟造血微环境，本发明采用与脐血同源的MSC与UM171联合应用于脐血HSPCs的体外扩增培养，取得了较好的效果，目前该方法国内外均无相关报道。

发明内容

附图说明

图1是倒置显微镜下观察MSCs及CD34⁺细胞培养形态，a为MSC贴壁培养细胞照片(X200)；b为UM171组培养细胞照片(X40)

图2是流式细胞仪对MSCs表面抗原检测结果

图3是光学显微镜下观察MSCs分化诱导成像(X200)，a图为MSCs成骨诱导后细胞照片；b图为MSCs成脂诱导后细胞照片；c图为成软骨诱导后细胞照片。

图4是各组培养过程不同时间点细胞总数变化情况

图5是各组细胞培养后流式检测情况

图6是细胞凋亡流式检测图a图为对照组凋亡流式检测图；b图为联合组凋亡流式检测图

图7是倒置显微镜下观察各谱系集落形成(X200)，其中a图为CFU-E；b图为BFU-E；c图为CFU-GM；d图为CFU-GEMM

具体实施方式

一、材料

1.标本采集：实验用脐带及脐血均源自307医院产科，报经医院伦理委员会批准(伦理编号KY-2016-8-36)并征得产妇及家属同意。健康足月顺产产妇娩出胎盘后，无菌剪刀采集脐带30cm，并收集于相应脐血储存于脐血采集袋中。

2.实验用试剂：UM171(美国Selleck公司)；无血清扩增培养基(StemSpan^TMSFEMⅡ，美国StemCell公司)、甲基纤维素培养基(MethoCult^TM，美国StemCell公司)；干细胞因子(SCF，美国R&D Systems)、促血小板生成素(TPO，美国R&D Systems)、fms样酪氨酸激3(FLT3，美国R&D Systems)；Ficoll淋巴细胞分离液(美国GE医疗集团)；胎牛血清(FBS，美国Gibco公司)、磷酸盐缓冲液(PBS，美国Gibco公司)、双抗(美国Gibco公司)、DMEM/F12培养基(美国Gibco公司)、成骨诱导培养基(美国Gibco公司)、成脂诱导培养基(美国Gibco公司)、成软骨诱导培养基(美国Gibco公司)；Ⅱ型胶原酶(美国Sigma公司)、胰蛋白酶(美国Sigma公司)；牛血清白蛋白(BSA,德国MACS公司)；乙二胺四乙酸缓冲液(EDTA,德国MACS公司)；CD34 MicroBead Kit UltraPure(德国MACS公司)。

二、方法

(一)实验分组

依据是否与MSC共培及是否添加UM171将实验分为以下四组：对照组、UM171培养组、MSC共培养组、UM171及MSC共培养组。每次培养设3个副孔,重复6次。

(二)细胞制备

1.MSC制备：采集到的脐带在无菌条件下应用含1％双抗的生理盐水反复冲洗，手术剪剪至1mm³小块，转移至含有0.2％Ⅱ型胶原酶的DMEM/F12培养基中，置于37℃震荡消化1h，得到的消化液分别过100目及50目滤网，滤液900×g离心15min洗涤2遍，弃上清后重悬于培养基中(包含20％FBS、2mmol/L L-谷氨酰胺、1％双抗及DMEM/F12培养基)。

2.脐血CD34⁺细胞制备：脐血与PBS按1:2稀释，50ml离心管中加入20ml Ficoll密度梯度淋巴分离液，倾斜离心管，缓慢加入30ml稀释后各血样至分离液上层。4℃下400×g离心30min，吸取中层灰白色单个核细胞层至50ml离心管中，加入5倍体积PBS混匀后400×g离心10min清洗2次，加入含0.5％BSA EDTA缓冲液300μl重悬并计数。采用德国美天尼公司CD34磁珠分选技术，将上述单个核细胞悬液分别加入100μl FcR Blocking reagent和CD34MicroBeadsUltraPure混匀后置于4℃冰箱孵育30min。孵育完成后加入10ml MACS缓冲液1700rpm离心10min，去上清加入MACS缓冲液500μl重悬。500μl MACS缓冲液预湿分选柱，将上述悬液过柱子后，500μlMACS缓冲液清洗3次，将分选柱移出磁场，加入2mlMACS缓冲液，迅速用配套活塞推出液体至15ml离心管中，计数备用。

(三)细胞扩增培养

1.对照组：对照组采用StemSpanⅡ无血清培养基，添加100ng/ml SCF，100ng/mlFLT3，50ng/ml TPO六孔板中细胞接种密度为1╳10⁵/孔，置于37℃5％CO₂培养箱培养10天。

2.UM171扩增组：采用StemSpanⅡ无血清培养基，添加100ng/ml UM171,以及100ng/ml SCF，100ng/mlFLT3，50ng/ml TPO，取适量培养基于六孔板中，分选的CD34⁺细胞接种密度为1×10⁵/孔，置于37℃5％CO₂培养箱中，间隔3～4天换液，培养10天后行指标检测。

3.脐带MSC共培养组：上述细胞制备得到的脐带MSC贴壁培养48h后去除未贴壁细胞继续培养，间隔3～4天换液1次。待细胞90％融合后，0.25％胰蛋白酶消化并传代，3次传代后以5×10⁴/孔浓度铺于6孔板中，加入MSC培养基，待细胞贴壁90％融合后采用GWXJ80型⁶⁰Co照射，总剂量为10Gy，去除培养基，加入StemSpanⅡ无血清培养基，并添加100ng/mlSCF，100ng/mlFLT3，50ng/ml TPO，按1×10⁵/孔密度接种上述细胞制备得到的CD34⁺细胞，置于37℃5％CO₂培养箱培养10天，间隔3～4天换液。

4.UM171及MSC共培养组：参照脐带MSC共培养组培养方法，培养基中额外添加100ng/ml UM171。

(五)流式检测

采用BD FACSCalibur流式检测仪，取培养前及培养后细胞悬液20μl均分为2管，1管加入FITC标记的抗体CD34，PE标记的抗体CD133，APC标记的抗体CD38；2管加入1管对应同型对照抗体FITC标记的抗体Mouse IgG2a，PE标记的抗体Mouse IgG1，APC标记的抗体MouseIgG2a。各管涡旋震荡后室温下避光孵育15min，加入适量PBS，500×g室温水平离心5min，弃上清液，加入PBS 100μl上机测定。

(六)MSC诱导分化实验

脐带MSCs贴壁培养至第三代，融合70％，去除培养基，分别添加成骨诱导培养基，成脂诱导培养基及成软骨诱导培养基，间隔3～4天换液，培养21天固定后分别行碱性磷酸酶染色、油红O染色和阿尔新蓝染色。

(七)集落培养实验

采用MethoCuhTmGF(H4434)培养体系，六孔板中加入培养基1ml/孔，CD34⁺细胞接种密度为1000/孔，置于37℃5％CO₂培养箱培养14天，计数各系集落数目。

(八)细胞凋亡实验

采用BDAnnexin V PE Apoptosis kit细胞凋亡检测试剂盒，分别取各组培养后细胞，经PBS洗涤离心后采用缓冲液调整细胞浓度至1*10⁶/ml，取100μl细胞液至5ml离心管中，加入5μl PE膜联蛋白以及5μl 7-ADD，室温避光反应15min，加入400μl缓冲液后行流式测量。

三、统计学分析方法

采用SPSS18.0软件进行统计处理，扩增后细胞数量及流式测量细胞百分比均以表示，组间细胞扩增后数量、细胞流式表型比例以及各系集落培养结果比较采用方差分析，两组之间上述数据比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

四、结果

(一)、MSC表型测定

间充质干细胞置于37℃5％CO₂培养箱体外培养，培养第3天可见成克隆增长的梭形贴壁细胞，传代后1周细胞融合可达90％(见图1)，取第3代细胞胰酶消化后流式测定CD105,HLA-DR,CD73,CD90,CD14,CD34,CD19,CD45及SSEA-4等细胞表型(见图2)。结果可见未分化MSC高表达CD105,CD73,CD90,表达率均高于99％，不表达CD14,CD34,CD19,CD45,HLA-DR，表达效率均低于1％，MSC标志物SSEA-4表达率在0.98±0.51％。MSCs经诱导分化可形成成骨细胞(图3a)，脂肪细胞(图3b)，和软骨细胞(图3c)，证明其具多谱系分化潜能。

图1中a为MSC贴壁培养1周后，细胞成梭形形态，成纤维细胞状，细胞间成网状、辐射状排列(X200)；b为UM171组培养10天后，CD34⁺细胞呈圆形状态，聚集成团悬浮于培养基中(X40)

图3中a图为MSCs成骨诱导后细胞体积变大，呈重叠生长，细胞基质钙盐逐渐沉积形成多层钙结节，碱磷酶染色阳性；b图为MSCs成脂诱导后，成纤维样细胞逐渐变成圆形细胞，并可观察到高折光性的空泡脂滴，脂滴油红O染色呈阳性；c图为成软骨诱导后细胞慢慢变小，间隙逐渐增大，细胞呈不规则形状，形成软骨基质，阿尔新蓝染色呈阳性。

(二)、磁珠分选效果

CD34⁺细胞的纯度和活力分别采用流式细胞仪和台盼蓝染色分析，经检验分离得到细胞的纯度和存活率分别为(96.46±2.92)％和(92.63±3.56)％。

(三)、扩增效果比较

对照组CD34⁺细胞10天培养后细胞总数扩增3.7倍，CD34⁺细胞扩增3.5倍；UM171组经10天培养后细胞总数扩增14倍，CD34⁺细胞扩增13.5倍(见图1b)；MSCs共培养组细胞总数扩增11倍，CD34⁺细胞扩增10倍；联合培养组细胞总数在第10天扩增达22倍，CD34⁺细胞扩增21倍，扩增后3组细胞总数及CD34⁺及CD133⁺差异均存在统计学意义。各组细胞培养情况见图4，各组培养后细胞总数、CD34⁺及CD133⁺细胞数见表1。

表1 培养后各组细胞总数及CD34⁺细胞数情况

(四)、流式检测结果

各组培养10天后收获细胞进行流式检测，结果显示UM171联合MSCs组得到CD34⁺CD38^-细胞比例为(91.49±2.67)％，较MSCs及UM171组均存在显著差异，含UM171培养体系CD133细胞比例较单独MSCs培养组存在差异。各组细胞培养后流式检测情况见表2。

表2 培养后各组细胞流式表型情况

2.5细胞凋亡实验

见图6，对照组细胞早期凋亡比例约为1.5％晚期凋亡比例为1％，死亡细胞约3％；余三组细胞早期凋亡比例约为1％，晚期凋亡比例约为1％，组别间无明显差异。

2.6集落培养效果

分别对未扩增脐血及三组扩增后CD34⁺行集落培养，培养第3天可见集落形成，扩增后细胞经甲基纤维素培养14天后集落形成良好(见图7)，各组集落计数见表3。数据分析显示，MSCs扩增组集落形成能力较其他各组存在差异，在红系及粒系形成能力方面差异较为明显，扩增体系中包含UM171的两组与脐血对照组无明显差异。

表3 扩增前后各组细胞集落培养情况

脐血来源HSPCs体外扩增体系较多，从最初的添加细胞因子向多种手段联合应用发展，以期获得更好的扩增效果，但长期体外培养对HSPCs干性损伤较大，研究表明体外培养时间控制在2周以内可以更好地保留扩增后细胞干细胞特性。造血微环境是能够支持造血干细胞定居、自我更新以及繁殖分化的特殊生理环境，造血组织中的非造血细胞对造血增值分化发挥着特殊作用，目前的扩增体系也大都基于模拟造血微环境对HSPCs行体外扩增。体外培养过程中造血微环境对干性保持起着重要作用，MSCs作为造血微环境的重要组份，其作为饲养层与CD34⁺细胞共培养，可通过分泌细胞因子、生长因子和黏附分子细胞支持HSPCs的生长和增殖，提高其生存率和自我更新能力^[9]。既往研究表明MSCs经传代培养后，细胞因子分泌能力有所下降。实验中采用与脐血同源的第3代MSCs,其流式表型及诱导分化能力较为稳定。

添加细胞因子作为HSPC体外培养的基础方法，其在调节HSPC增殖、分化、生存中发挥重要作用^[11]，应用于HSPCs扩增的细胞因子及其组合方式很多，但一般均包含以下3个细胞因子：SCF、TPO以及FLT3，该组合可有效提高细胞存活率、细胞端粒长度、黏附因子表达及干细胞扩增^[12,13]。

在造血干细胞龛中通过高通量筛选出小分子化学物质在HSPCs扩增应用越来越广泛，其特点就是在提高扩增效率的同时可以较好的保持细胞干性。UM729是存在于造血干细胞龛中的小分子化合物，它能够增加人的CD34⁺CD^45RA-外周血细胞比例。UM171是UM729的类似合成物，研究表明其扩增能力是UM729的10-20倍，经UM171扩增后CD34+细胞在猕猴体内植入效率可以提高约3倍。UM171对有丝分裂和表型上原始种群的分裂速度没有影响。此外，UM171与StemRegenin(SR1)协作可以增加短期性祖细胞的扩张。而UM171自身可以显著扩大长期正常的造血干细胞^[8]。本实验中同样发现添加UM171的培养体系在HSPCs扩增中可有效提高CD34⁺CD38^-及CD133细胞比例。

试验结果表明细胞因子联合MSCs或UM171均可对HSPCs进行有效扩增，二者联合应用在提高扩增效率同时可以更有效对CD34⁺CD38^-进行扩增，扩增效率可达20倍，凋亡实验显示MSCs联合UM171在增加扩增效率同时并未增加细胞凋亡比例，集落培养实验表明该方法扩增后细胞较MSCs扩增组的红系及粒系形成能力存在优势。

造血干细胞移植前，患者通常接受清髓的放射治疗，移植的造血干细胞寄宿在照射的基质并增殖分化，最终重建造血系统。照射的基质可能刺激造血干细胞，Celebi等人^[14]的研究认为照射的MSCs能够更好的模拟造血干细胞龛从而支持HSPCs扩增。Walenda也验证了照射后MSCs扩增的HSPCs中CD34⁺CD38^-比例较未照射提高^[15]。实验中我们同样选择照射处理的MSCs对HSPCs进行扩增，取得较好效果。

HSPCs扩增数量与其干性保持的矛盾是目前需探讨的一个重要问题，未分化的HSCs是体外扩增的追求目标，目前技术层面下扩增的更多是祖细胞而非干细胞，多数临床实验研究结果表明，扩增后的HSPCs长期造血功能并未得到明显改善，但高剂量的HSPCs输注后可以显著缩短UCBT患者全血细胞减少期，减少机会感染及移植相关疾病发病率和死亡率，因此HSPCs体外扩增仍具有较好的科研前景。

综上所述，本发明建立了全新的基于模拟造血微环境的HSPC体外培养体系，该体系可实现HSPCs数量扩增一个数量级，培养后CD34⁺CD38^-细胞比率较高，体外实验初步验证了其具有长期造血重建功能，后续将在动物模型上进一步评估其移植后造血重建能力。

参考文献：

1 Gluckman E,Broxmeyer HA,Auerbach AD,et al.Hematopoieticreconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical-cordblood from an HLA-identical sibling[J].N Engl J Med,1989,321(17):1174-1178.

2 Broxmeyer HE.Enhancing the efficacy of engraftment of cord bloodfor hematopoietic cell transplantation[J].Transfus Apher Sci,2016,54(3):364-372.

3 金婷,王利,王红祥.非血缘脐血移植治疗成人急性白血病的研究进展[J].中华器官移植杂志,2015,36(2):120-123.

4 Ballen KK,Gluckman E,Broxmeyer HE.Umbilical cord bloodtransplantation:the first 25 years and beyond[J].Blood,2013,122(4):491-498.

5 Oran B,Shpall E.Umbilical cord blood transplantation:a maturingtechnology[J].Hematology Am Soc Hematol Educ Program.2012,2012:215-222.

6 李猛,盛宏霞,张斌,等.脐血来源造血干细胞体外培养扩增技术研究进展[J].中华细胞与干细胞杂志(电子版),2016,6(2):127-133.

7 Bari S,Seah KK,Poon Z,et al.Expansion and homing of umbilical cordblood hematopoietic stem and progenitor cells for clinical transplantation[J].BiolBlood Marrow Transplant,2015,21(6):1008-1019.

8 De Lima M,Mcniece I,Robinson SN,et al.Cord-blood engraftment withex vivo mesenchymal-cell coculture[J].N Engl J Med,2012,367(24):2305-2315.

9 Fares I,Chagraoui J,Gareau Y,et al.Pyrimidoindole derivatives areagonists of human hematopoietic stem cell self-renewal[J].Science,2014,345(623):1509-1512.

10 Gammaitoni L,Weisel KC,Gunetti M,et al.Elevated telomeraseactivity and minimal telomere loss in cord blood long-term cultures withextensive stem cell replication[J].Blood,2004,103(12):4440-4448.

11 Chu PP,Bari S,Fan XB,et al.Intercellular cytosolic transfercorrelates with mesenchymal stromal cell rescue of umbilical cord bloodcellviability during ex vivo expansion[J].Cytotherapy,2012,14(9):1064-1079.

12 Chou S,Chu P,Hwang W,et al.Expansion of human cord bloodhematopoietic stem cells for transplantation[J].Cell Stem Cell,2010,7(4):427-428.

13 Gullo F,Van Der Garde M,Russo G,et al.Computational modeling ofthe expansion of human cord blood CD133+hematopoieticstem/progenitorcellswith different cytokine combinations[J].Bioinformatics,2015,31(15):2514-2522.

14 Celebi B,Mantovani D,Pineault N.Irradiated mesenchymal stem cellsimprove the ex vivo expansion of hematopoietic progenitors by partlymimicking the bone marrow endosteal environment[J].J Immunol Methods,2011,370(1/2):93-103.

15 Walenda T,Bork S,Horn P,et al.Co-culturewithmesenchymal stromalcells increases proliferation and maintenance ofhaematopoietic progenitorcells[J].J Cell Mol,2010,14(1-2):337–350.

Claims

1.一种造血干细胞体外培养方法，其特征在于采用UM171及间充质干细胞联合培养，包括如下步骤：

1)培养间充质干细胞并传代；

2)加入UM171及间充质干细胞联合培养基。

2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于还包括步骤3)用⁶⁰Co照射，总剂量为5-15Gy。

3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于还包括步骤4)除去步骤2)的培养基并用无血清培养基培养。

4.如权利要求1-3之一所述的培养方法，其特征在于UM171的浓度为100ng/ml。

5.如权利要求1-3之一所述的培养方法，其特征在于细胞培养时间为2周以内。

6.如权利要求1-3之一所述的培养方法，其特征在于步骤1)中间充质干细胞培养方法为：贴壁培养48h后去除未贴壁细胞继续培养，间隔3～4天换液1次。待细胞90％融合后，0.25％胰蛋白酶消化并传代，3次传代以1×10⁵/孔浓度加入培养器皿中。

7.如权利要求3所述的培养方法，其特征在于步骤4)中无血清培养基中添加100ng/mlSCF，100ng/mlFLT3，50ng/ml TPO，按5×10⁴/孔密度接种分选的CD34⁺细胞，置于37℃5％CO₂培养箱培养10天，间隔3～4天换液。