CN116426472A - 一种促进造血干细胞或造血祖细胞分化为红细胞的诱导分化体系及其应用 - Google Patents

一种促进造血干细胞或造血祖细胞分化为红细胞的诱导分化体系及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种促进造血干细胞或造血祖细胞分化为红细胞的诱导分化体系及其应用，所述诱导分化体系适用于各种来源的造血干细胞或造血祖细胞向红细胞的诱导分化，具有诱导分化效率高、稳定性强、培养体系成分明确、安全性高等优点，为解决血源紧张及防止血源性疾病的传播提供了红细胞替代品，具有巨大的市场价值及广阔的应用前景。

Description

一种促进造血干细胞或造血祖细胞分化为红细胞的诱导分化 体系及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体地，本发明涉及一种促进造血干细胞或造血祖细胞分化为红细胞的诱导分化体系及其应用。
背景技术
红细胞（Red Blood Cell，RBC）是血液中数量最多的一种血细胞，其主要功能是为机体运输氧气和二氧化碳。红细胞输注是目前治疗严重贫血和急性失血的重要临床治疗方法和有效手段，其广泛应用于术后及外伤、慢性贫血及其他多种疾病的治疗。目前临床用血的主要来源是志愿者的无偿献血，但近年来随着临床用血的急剧增加，血液供应短缺已经成为世界性的重大公共卫生问题。此外，因输血导致疾病感染和传播等问题对临床用血的安全性带来了严峻的挑战，并严重威胁着人类的生命健康。因此，如何获取安全、有效、充足、可靠的血液来源成为目前临床上亟待解决的世界性难题。
此前研究表明，通过体外诱导人体分离的CD34+造血干细胞（Hemopoietic StemCell，HSC）可以分化获得成熟红细胞。但是由于造血干细胞在体内的存在比例很低且体外扩增能力有限，导致无法获取大量的成熟红细胞，也即无法从根本上满足临床用血的需求，并且存在诱导分化效率低、培养体系成分复杂等缺点。近年来随着干细胞研究及再生医学的迅速发展，以干细胞为基础衍生和开发的新型细胞治疗已经成为解决人类面临的重大临床疾病的最富有前景的应用。人多能干细胞（Human Pluripotent Stem Cells，hPSCs）是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，可以实现体外无限增殖和所有人体细胞的定向分化。
因此，在体外由人多能干细胞定向诱导分化为成熟的红细胞作为临床血液替代品有可能为解决当前临床输血短缺和安全问题提供新的方案和思路。此外，由于成熟的红细胞不具有细胞核而仅携带极少量的遗传物质。因此，人多能干细胞源的红细胞可能成为最早的干细胞治疗产品而应用于输血替代治疗，并具有广泛的应用前景和重大的社会经济效益。而如何提高红细胞诱导分化的效率和稳定性是目前本领域亟待解决的问题之一。
发明内容
针对现有技术存在的上述技术问题，本发明的目的在于提供一种促进造血干细胞或造血祖细胞分化为红细胞的诱导分化体系及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种用于诱导造血干细胞或造血祖细胞分化为红细胞的基础培养基。
进一步，所述基础培养基包含IMDM培养基、ITS-X、抗坏血酸、乙酰半胱氨酸、奎诺二甲基丙烯酸酯、BSA。
进一步，所述基础培养基中各组分的含量分别为：1% ITS-X、50 µg/mL抗坏血酸、50 µM乙酰半胱氨酸、50 µM奎诺二甲基丙烯酸酯、0.5% BSA。
在一些实施方案中，本发明通过对比实验验证首次发现，在红细胞分化培养基中添加BSA对红细胞诱导分化的效果显著优于添加FBS的效果，相对于FBS而言，BSA能够显著提高红细胞的诱导分化效率，即本发明第一方面所述包含BSA的用于诱导造血干细胞或造血祖细胞分化为红细胞的基础培养基取得了预料不到的技术效果。
在一些实施方案中，本发明通过对比实验验证首次发现，采用IMDM培养基对红细胞诱导分化的效果显著优于采用DMEM/F12培养基，相对于DMEM/F12培养基而言，IMDM培养基能够显著提高红细胞的诱导分化效率，即本发明第一方面所述包含IMDM培养基的用于诱导造血干细胞或造血祖细胞分化为红细胞的基础培养基取得了预料不到的技术效果。
在一些实施方案中，本发明通过对比实验验证首次发现，在红细胞分化培养基中添加抗氧化剂（抗坏血酸、乙酰半胱氨酸和奎诺二甲基丙烯酸酯）能够显著提高红细胞分化效率。
在一些实施方案中，本发明所述的造血干细胞或造血祖细胞包括各种来源的造血干细胞或造血祖细胞，包括但不限于：脐血来源的造血干/祖细胞（CB-HSPC）、诱导多能干细胞来源的造血干/祖细胞（hiPSC-HSPC）、骨髓来源的造血干细胞/祖细胞、外周血来源的造血干细胞/祖细胞。各种来源的造血干细胞或造血祖细胞均在本发明的保护范围内。
在一些实施方案中，本发明所述的抗氧化剂包括各种类型的抗氧化剂或还原剂，包括但不限于：抗坏血酸、乙酰半胱氨酸、奎诺二甲基丙烯酸酯、谷光甘肽维生素C、维生素E、辅酶O、褪黑素、丙酮酸钠、2-巯基乙醇、亚硒酸钠。能够降低ROS对细胞的损伤的抗氧化剂或还原剂均在本发明的保护范围内。
在一些实施方案中，所述基础培养基中各组分的含量分别为：(0.1-10)% ITS-X、(10-100) µg/mL抗坏血酸、(10-100) µM乙酰半胱氨酸、(10-100) µM奎诺二甲基丙烯酸酯、(0.1-10)% BSA。
在具体实施方案中，所述基础培养基中各组分的含量分别为：1% ITS-X、50 µg/mL抗坏血酸、50 µM乙酰半胱氨酸、50 µM奎诺二甲基丙烯酸酯、0.5% BSA。
第二方面，本发明提供了一种用于诱导造血干细胞或造血祖细胞分化为红细胞的培养体系。
进一步，所述培养体系包括红细胞特化阶段培养基、红细胞扩增阶段培养基、红细胞成熟阶段培养基、红细胞脱核阶段培养基；
所述红细胞特化阶段培养基包含本发明第一方面所述的基础培养基、SCF、IL-3、EPO、地塞米松；
所述红细胞扩增阶段培养基包含本发明第一方面所述的基础培养基、SCF、IL-3、EPO、地塞米松；
所述红细胞成熟阶段培养基包含本发明第一方面所述的基础培养基、SCF、EPO；
所述红细胞脱核阶段培养基包含本发明第一方面所述的基础培养基、EPO。
进一步，所述红细胞特化阶段培养基中各组分的含量分别为：50 ng/mL SCF、10ng/mL IL-3、10 ng/mL EPO、1 µM地塞米松；
所述红细胞扩增阶段培养基中各组分的含量分别为：50 ng/mL SCF、10 ng/mLIL-3、10 ng/mL EPO、1 µM地塞米松；
所述红细胞成熟阶段培养基中各组分的含量分别为：50 ng/mL SCF、10 ng/mLEPO；
所述红细胞脱核阶段培养基中各组分的含量分别为：10 ng/mL EPO。
在一些实施方案中，所述红细胞特化阶段培养基中各组分的含量分别为：(10-100) ng/mL SCF、(1-50) ng/mL IL-3、(1-50) ng/mL EPO、(0.1-10) µM地塞米松。
在具体实施方案中，所述红细胞特化阶段培养基中各组分的含量分别为：50 ng/mL SCF、10 ng/mL IL-3、10 ng/mL EPO、1 µM地塞米松。
在一些实施方案中，所述红细胞扩增阶段培养基中各组分的含量分别为：(10-100) ng/mL SCF、(1-50) ng/mL IL-3、(1-50) ng/mL EPO、(0.1-10) µM地塞米松。
在具体实施方案中，所述红细胞扩增阶段培养基中各组分的含量分别为：50 ng/mL SCF、10 ng/mL IL-3、10 ng/mL EPO、1 µM地塞米松。
在一些实施方案中，所述红细胞成熟阶段培养基中各组分的含量分别为：(10-100) ng/mL SCF、(1-50) ng/mL EPO。
在具体实施方案中，所述红细胞成熟阶段培养基中各组分的含量分别为：50 ng/mL SCF、10 ng/mL EPO。
在一些实施方案中，所述红细胞脱核阶段培养基中各组分的含量分别为：(1-50)ng/mL EPO。
在具体实施方案中，所述红细胞脱核阶段培养基中各组分的含量分别为：10 ng/mL EPO。
在一些实施方案中，本发明所列举的培养基中各组分含量的具体数值范围或具体数值仅用于解释本发明所取得的技术效果，而不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员可在本发明所列举的具体数值范围或具体数值的基础上进行多种调整或修改，只要能够达到预期的造血干细胞或造血祖细胞分化为红细胞的诱导分化效果，这样经调整或修改后的具体数据范围或具体数值同样包含在本发明的保护范围内。
第三方面，本发明提供了一种诱导造血干细胞或造血祖细胞分化为红细胞的方法。
进一步，所述方法包括采用本发明第二方面所述的培养体系对造血干细胞或造血祖细胞进行培养。
进一步，所述方法包括如下步骤：
(1) Day0-6，红细胞特化阶段，采用本发明第二方面中所述的红细胞特化阶段培养基培养造血干细胞或造血祖细胞；
(2) Day6-12，红细胞扩增阶段，采用本发明第二方面中所述的红细胞扩增阶段培养基培养步骤(1)得到的细胞；
(3) Day12-15，红细胞成熟阶段，采用本发明第二方面中所述的红细胞成熟阶段培养基培养步骤(2)得到的细胞；
(4) Day15-20，红细胞脱核阶段，采用本发明第二方面中所述的红细胞脱核阶段培养基培养步骤(3)得到的细胞，获得红细胞。
进一步，步骤(1)中细胞密度为1×105个/mL。
进一步，步骤(2)中细胞密度为5×105个/mL。
进一步，步骤(3)、步骤(4)中细胞密度为1×106个/mL。
进一步，每2天更换一次新鲜培养基，直至Day20。
在一些实施方案中，步骤(1)中细胞密度为(0.01-10)×105个/mL。
在具体实施方案中，步骤(1)中细胞密度为1×105个/mL。
在一些实施方案中，步骤(2)中细胞密度为(0.1-50)×105个/mL。
在具体实施方案中，步骤(2)中细胞密度为5×105个/mL。
在一些实施方案中，步骤(3)、步骤(4)中细胞密度为(0.01-10)×106个/mL。
在具体实施方案中，步骤(3)、步骤(4)中细胞密度为1×106个/mL。
在一些实施方案中，每1-4天更换一次新鲜培养基，直至Day20。
在具体实施方案中，每2天更换一次新鲜培养基，直至Day20。
此外，本发明还提供了基于本发明第三方面所述的方法诱导分化得到的红细胞在预防、治疗和/或改善红细胞相关疾病或障碍中的应用。
此外，本发明还提供了一种预防、治疗和/或改善红细胞相关疾病或障碍的方法，所述方法包括向有需要的对象施用基于本发明第三方面所述的方法诱导分化得到的红细胞。
进一步，所述红细胞相关疾病或障碍是指需要进行红细胞输注的相关疾病或障碍，包括但不限于：严重贫血、急性失血、癌症、移植、自身免疫疾病、感染性疾病、炎症、免疫缺陷相关疾病等。
在一些实施方案中，通过一种或多种选自全身、局部、静脉内、皮下、关节内、肌内、鞘内和腹膜内的途径向所述对象施用红细胞。在一些实施方案中，所述对象包括一种或多种动物，包括例如，牛、马、绵羊、灵长类动物、禽类和啮齿类动物物种。所述对象可以是其血液中包含红细胞的动物（例如，哺乳动物、鸟、鱼、爬行动物或两栖动物）。在一些实施方案中，所述对象可以是哺乳动物，例如人或非人哺乳动物。在另一些实施方案中，所述对象可以是小鼠、大鼠、仓鼠、白鼬、沙鼠、兔、猴子、黑猩猩、马、矮种马、驴、绵羊、猪、鸡、山羊、猫或狗。在优选的实施方案中，所述对象为人。
相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果：
(1) 本发明提供了一种无血清、化学成分明确的红细胞诱导分化体系，适用于各种来源的造血干细胞或造血祖细胞向红细胞的诱导分化，具有诱导分化效率高、稳定性强、培养体系成分明确、安全性高等优点，适用于规模化红细胞诱导分化培养，为解决血源紧张及防止血源性疾病的传播提供了红细胞替代品，具有巨大的市场价值及广阔的应用前景。
(2) 本发明通过对比实验验证首次发现，在红细胞分化培养基中添加BSA对红细胞诱导分化的效果显著优于添加FBS的效果，相对于FBS而言，BSA能够显著提高红细胞的诱导分化效率，即本发明提供的红细胞诱导分化体系取得了预料不到的技术效果。
(3) 本发明通过对比实验验证首次发现，采用IMDM培养基对红细胞诱导分化的效果显著优于采用DMEM/F12培养基，相对于DMEM/F12培养基而言，IMDM培养基能够显著提高红细胞的诱导分化效率，即本发明提供的红细胞诱导分化体系取得了预料不到的技术效果。
附图说明
图1为BSA对红细胞诱导分化的影响结果图，其中，A图：造血干/祖细胞向红细胞分化流程图，B图：在红细胞诱导分化第20天，细胞流式分析添加0.5% BSA或5% FBS对血细胞标志物CD45和红细胞标志物CD235a表达情况的影响结果图；
图2为抗氧化剂对红细胞诱导分化的影响结果图，其中，A图：造血干/祖细胞向红细胞分化流程图，B图：在红细胞诱导分化第20天，细胞流式分析添加50 µg/mL AscorbicAcid、50 µM Acetylcysteine、50 µM Trolox对血细胞标志物CD45和红细胞标志物CD235a表达情况的影响结果图，AA代表50 µg/mL Ascorbic Acid；NAC代表50 µMAcetylcysteine；Trolox代表50 µM Trolox；
图3为基础培养基对红细胞诱导分化的影响结果图，其中，A图：造血干/祖细胞向红细胞分化流程图，B图：在红细胞诱导分化第20天，细胞流式分析DMEM/F12或IMDM对血细胞标志物CD45和红细胞标志物CD235a表达情况的影响结果图；
图4为采用本发明开发的红细胞诱导分化体系分别测试脐血来源的造血干/祖细胞（CB-HSPC）和诱导多能干细胞来源的造血干/祖细胞（hiPSC-HSPC）的结果图，其中，A图：造血干/祖细胞向红细胞分化流程图，B图：在红细胞诱导分化第15天，细胞流式分析CB-HSPC和hiPSC-HSPC诱导获得细胞表达红系祖细胞标志物CD36和红细胞标志物CD235a的情况。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。为了促进对本发明的理解，此处对本发明中涉及到的如下术语进行解释：
在本文中使用，术语“或”，是指列举的可选择要素中的单个要素，除非上下文明确地另外指出。
在本文中使用，术语“包括”或“包含”，是指包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
在本文中使用，术语“造血干/祖细胞”，是指造血干细胞（Hematopoietic StemCell，HSC）和/或造血祖细胞（Hematopoietic Progenitor Cell，HPC），其中，术语“造血干细胞”是指能够产生三种造血谱系（红系、淋巴系和髓系）的所有血细胞类型的干细胞，这些细胞类型包括髓系谱系（单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突状细胞）和淋巴系（T细胞、B细胞、NK细胞）。术语“造血祖细胞”是指造血干细胞在一定的微环境和某些因素的调节下，增殖分化为各类血细胞的祖细胞，其也是一种相当原始的具有增殖能力的细胞，但已失去多向分化能力，只能向一个或几个血细胞系定向增殖分化，故也称定向干细胞（committed stem cell），造血祖细胞能够分化为造血系统的数种细胞类型的多能细胞，包括但不限于：粒细胞、单核细胞、红细胞、巨核细胞、B细胞和T细胞造血祖细胞定向于造血细胞谱系，一般不自我再生。术语“造血祖细胞”包括短期造血干细胞（ST-HSC）、多能祖细胞（MPP）、共同髓系祖细胞（CMP）、粒-单系祖细胞（GMP），以及巨核-红血球系祖细胞（MEP），造血干/祖细胞表达CD45。
在一些实施方案中，所述“造血干/祖细胞”可得自以下来源的任何一者或多者：胚胎组织、脐带血、骨髓、外周血、流通外周血、干细胞系，或者可体外得自其他细胞，比如胚胎干细胞、诱导多能干细胞（iPS细胞）或成体多能细胞。以上来源的细胞可在使用前采用所属领域技术人员可接受的任何方法体外扩增。在一些情况下，造血干细胞可分离自任何上述来源（例如骨髓）或体外培养。如果使用的细胞得自永生干细胞系，则可进一步有利于轻松获取和制备充分数量的细胞。
在本文中使用，术语“红细胞”，是指具有红细胞成熟的特征性标志物的去核细胞，它们特别表达糖蛋白A(CD235a)，不表达标志物CD36。红细胞是血液中数量最多的一种血细胞，同时也是脊椎动物体内通过血液将氧气从肺或鳃运送到身体各个组织的最主要的媒介。红细胞的主要功能分子是血红蛋白，占红细胞的90%。血红蛋白是一种含有血红素的蛋白质分子，它可以在肺部或鳃部与氧气分子结合，然后在身体的组织中将结合的氧气分子释放。氧气分子可以很容易地以扩散方式通过红细胞的细胞膜。血红蛋白也可以运送有机体使用氧气后产生的二氧化碳（不到氧气总量的2%，更多的二氧化碳由血浆来运输）。另一种相关的蛋白质分子肌红蛋白，可以在肌肉细胞中存储氧气。
在一些实施方案中，红细胞生成由以下阶段组成：(a) 从造血干/祖细胞分化为红系祖细胞；(b) 红系祖细胞分化为原红细胞；(c) 从原红细胞分化为早幼红细胞；(d) 从早幼红细胞分化为中幼红细胞；(e) 从中幼红细胞分化为晚幼红细胞；(f) 从晚幼红细胞分化为网织红细胞；(g) 从网织红细胞分化为红细胞。其中，术语“红系祖细胞”是指一类处于造血干细胞和红系前体细胞之间的细胞群，由红系祖细胞向红系前体细胞分化的阶段，是调节红细胞生成自体稳定机制中的一个关键过程。术语“红系前体细胞”是指在促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）的作用下，分化得到的一类处于红系祖细胞和红细胞之间的细胞群。所述“红系祖细胞”和“红系前体细胞”表达CD36。
在本文中使用，术语“诱导多能干细胞（iPSC）”，是指通过分化的体细胞的基因重编程获得并具有与胚胎干细胞部分相似的形态以及自我更新和多能性潜力的多能干细胞。这些细胞特别是对多能性标志物呈阳性，所述多能性标志物包括碱性磷酸酶染色和蛋白NANOG、SOX2、OCT4和SSEA3/4的表达。获得诱导性多能干细胞的方法是本领域技术人员众所周知的，并且特别是在Yu等人（《科学》(Science),2007,318(5858):1917-1920），Takahashi等人（《细胞》(Cell),2007,131(5):861-872）和Nakagawa等人（《自然—生物技术》(NatBiotechnol),2008,26(1):101-106）的文章中有所描述。
在一些实施方案中，在制备所述“诱导多能干细胞”时，可以从市场上购得用于制备诱导多能干细胞的各种试剂，如重编程载体、表达盒、培养基等，甚至商业化的诱导多能干细胞。hiPSC是指从人体细胞诱导获得的诱导多能干细胞。在本发明的具体实施方案中，实施例中所采用的hiPSC是按照中国专利CN113462638A中公开描述的制备方法制备得到，在此通过引用将该专利文献全文并入本文。
在本文中使用，术语“红细胞分化基础培养基（Erythrocyte-differentiationbasal medium，EDBM）”，是指本发明经实验确定的最优的用于诱导造血干细胞或造血祖细胞分化为红细胞的基础培养基，所述基础培养基中包含IMDM培养基、ITS-X、抗坏血酸、乙酰半胱氨酸、奎诺二甲基丙烯酸酯、BSA。本发明经对比实验验证首次发现，在红细胞分化培养基中添加BSA对红细胞诱导分化的效果显著优于添加FBS的效果，相对于FBS而言，BSA能够显著提高红细胞的诱导分化效率；采用IMDM培养基对红细胞诱导分化的效果显著优于采用DMEM/F12培养基，相对于DMEM/F12培养基而言，IMDM培养基能够显著提高红细胞的诱导分化效率，即本发明提供的红细胞分化基础培养基取得了预料不到的技术效果。
在一些实施方案中，所述基础培养基中各组分的含量分别为：(0.1-10)% ITS-X、(10-100) µg/mL抗坏血酸、(10-100) µM乙酰半胱氨酸、(10-100) µM奎诺二甲基丙烯酸酯、(0.1-10)% BSA。在本发明具体实施方案中，所述基础培养基中各组分的含量分别为：1%ITS-X、50 µg/mL抗坏血酸、50 µM乙酰半胱氨酸、50 µM奎诺二甲基丙烯酸酯、0.5% BSA。
在一些实施方案中，本发明所列举的数值范围或具体数值（例如，基础培养基中各组分的含量范围或具体含量、在红细胞分化的4个阶段中添加的各种诱导分化因子的含量范围或具体含量、在红细胞分化的4个阶段中的细胞密度范围或具体数值、在红细胞分化的4个阶段中的培养天数、培养基的更换次数等）仅用于解释本发明所取得的技术效果，而不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员可在本发明所列举的数值范围或具体数值的基础上进行多种调整或修改，只要能够达到预期的诱导分化效果，这样经调整或修改后的数据范围或具体数值同样包含在本发明的保护范围内。
本发明建立一种无血清的、化学成分明确的红细胞诱导分化体系，该分化体系适用于各种来源的造血干细胞或造血祖细胞向红细胞的诱导分化，其中，造血干细胞或造血祖细胞包括体内分离、培养或通过多能干细胞诱导分化获得的造血干/祖细胞。本发明所建立的红细胞分化流程主要包括4个阶段：红细胞特化阶段、红细胞扩增阶段、红细胞成熟阶段和红细胞脱核阶段。本发明的发明人对红细胞分化过程中涉及到的基础培养基、抗氧化剂和BSA等条件进行了优化，以提高红细胞诱导分化的效率及稳定性。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
本发明各实施例中所使用到的实验材料见下表1。
Figure SMS_1
Figure SMS_2
本发明各实施例中所涉及的流式细胞术（FACS）检测细胞表面标志物的实验方法如下：
1、FACS检测所需试剂和抗体
（1）清洗试剂：Buffer A (PBS+4% FBS)。
（2）直标一抗：FITC anti-human CD34 antibody，APC anti-human KDRantibody，PE anti-human PDGFRα antibody，PE anti-human CD144 antibody，APC anti-human ITGA3 antibody，PE anti-human EPCR antibody，PerCP/Cyanine5.5 anti-humanCD90 antibody。
2、待测样品的准备
（1）配制TrypLE工作液：吸取适量DPBS至新的15 mL离心管中，按照1：1的比例加入相应体积的TrypLE原液，混匀后即为工作液，37℃水浴锅预热10分钟。
（2）从培养箱取分化的细胞，吸弃原培养液，加入适量的DPBS清洗细胞，并用DPBS洗两遍（每次DPBS用量不少于原培养基用量），每次1分钟（洗的时候，要将DBPS在板/瓶内放置30-45秒再行吸出）。
（3）加TrypLE工作液（6孔培养板中每孔加入1 mL TrypLE工作液），使其均匀覆盖板底，置于培养箱孵育2-5分钟，期间可镜下观察，细胞收缩变圆且分散开即可。
（4）轻轻拍打培养瓶/板，使细胞脱离板底，然后用移液器轻轻吹打几次，最后加入等体积Buffer A终止消化，细胞计数后取1×106细胞（悬浮细胞不需要细胞消化步骤，直接收取悬浮细胞进行后续操作）。
（5）配平后离心，200 g离心5 min，离心结束后吸弃上清，轻弹离心管底部使细胞充分分散，加入适量Buffer A重悬，200 g离心5分钟，弃上清。
（6）用Buffer A清洗细胞2次，每次3 mL Buffer A，200 g离心5分钟，弃上清。
（7）孵育直标一抗：用100 µL Buffer A重悬细胞后，每管加入1 test直标一抗，4℃孵育30分钟，并每隔10分钟轻弹离心管，使细胞与抗体充分结合。
（8）用Buffer A清洗细胞3次，每次3 mL Buffer A，200 g离心5分钟，弃上清。
（9）每管加入200 µL DPBS重悬细胞，并经70 µm孔径滤网过滤细胞，以除去未消化开的细胞团块，转移至96孔培养板中，置于4℃避光保存，等待上机检测。
注明：诱导分化的第15天检测CB-HSPC和hiPSC-HSPC诱导获得细胞表达红系祖细胞标志物CD36和红细胞标志物CD235a的情况；诱导分化的第20天检测血细胞标志物CD45和红细胞标志物CD235a表达。
（10）流式上机检测，所述流式上机检测的步骤如下：
1）开启流式细胞仪Guava easyCyte HT和电脑。
2）设置流式仪；打开流式软件，设置各种参数。
3）待机器变为Ready状态后，清洗机器。
4）首先通过同型对照样品，设置FSC和SSC的电压和增益，使离散细胞群位于象限的合适位置，一般左下角为细胞碎片，右上角为较大的细胞团块。圈出目标细胞群，设置Gate，进入下一步分析。
5）根据抗体偶联的荧光素，选择合适的检测通道。通过调节相应通道电压和补偿，使得阴性细胞群和阳性细胞群可以明显地区分，然后依次检测实验样品。
6）检测完毕，清洗流式仪，关闭流式仪和电脑。
实施例1 造血干细胞（HSC）的制备
1、单层贴壁细胞形成
（1）配制TrypLE工作液：吸取5 mL DPBS至新的15 mL离心管中，再加入5 mLTrypLE原液，混匀后即为TrypLE工作液。
（2）根据传代所需的培养基量，配制含1% PS（Penicillin-Streptomycin）、10 μMY-27632（ROCKi）的E8完全培养基，每毫升培养基加1 μL Y-27632（10 mM）储存液。
（3）从培养箱取出待传代的hiPSC孔板/培养瓶，吸弃上清，用DPBS洗两遍（每次DPBS用量不少于原培养基用量），每次1 min（洗的时候，要将DBPS在孔/瓶内放置30-45 sec再行吸出）。
（4）加TrypLE工作液后（六孔板加约1 mL TrypLE工作液，T25瓶加约2 mL TrypLE工作液），置于培养箱孵育2-5 min，期间可镜下观察，细胞收缩变圆且分散开即可。
（5）轻轻拍打培养瓶/板，使细胞脱离板底，然后用移液器轻轻吹打几次，最后加入DMEM/F12终止消化。吸取适量的细胞悬液计数。
（6）配平后离心，200 g，5 min，离心结束后吸弃上清，轻震离心管底部，按照不同的细胞密度，加入含10 μM Y-27632的E8完全培养基重悬。细胞充分混匀后，将细胞悬液滴至培养板孔中，接种细胞密度为4000 cells/cm2，置于37℃，5% CO2培养箱中静置培养。
（7）培养24 h后，使用DPBS清洗两次后进行后续的诱导分化。
2、HSC诱导分化培养基配制
中胚层诱导培养基：STEMdiff™ APEL™2 Medium + 1% Penicillin-Streptomycin + 9 μM CHIR99021。
造血中胚层特化培养基：STEMdiff™ APEL™2 Medium + 1% Penicillin-Streptomycin + 20 ng/mL VEGF + 20 ng/mL bFGF。
生血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基：STEMdiff™ APEL™2 Medium + 1%Penicillin-Streptomycin + 20 ng/mL VEGF + 20 ng/mL bFGF + 20 ng/mL SCF + 10ng/mL IL-3 + 30 ng/mL TPO + 10 ng/mL Flt-L + 10 ng/mL BMP4。
3、中内胚层诱导（Day0）
（1）配置适量的中胚层诱导培养基，37℃水浴锅预热。
（2）吸弃原培养液，加入适量的DPBS清洗细胞。
（3）添加中胚层诱导培养基，然后置于37℃，5% CO2培养箱中静置培养24 h。
4、造血中胚层特化（Day1）
（1）配置适量的造血中胚层特化培养基，37℃水浴锅预热。
（2）吸弃原培养液，加入适量的DPBS清洗细胞。
（3）添加造血中胚层特化培养基，然后置于37℃，5% CO2培养箱中静置培养48 h。
5、生血内皮特化及内皮-造血细胞转化（Day3）
（1）配置适量的生血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基，37℃水浴锅预热。
（2）造血中胚层特化48 h后，吸弃原培养液；加入适量的DPBS清洗细胞，TrypLE工作液消化细胞至单细胞，终止细胞消化，200 g，5 min离心后，用生血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基重悬细胞，并加入10 μM Y-27632，按照20000 cells/cm2接种细胞；然后置于37℃，5% CO2培养箱中静置培养。
（3）培养24 h后更换新鲜的生血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基。
（4）此后，每2天更换一次新鲜的生血内皮特化及内皮-造血细胞转化培养基。培养至Day12收取悬浮细胞。
实施例2 由造血干细胞/造血祖细胞分化制备红细胞
造血干细胞/造血祖细胞向红细胞的诱导分化包括如下四个阶段：
（1）红细胞特化阶段（第0-6天）
细胞密度为：1×105个/mL；
培养基组成为：DMEM/F12、1% ITS-X（胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂）、50ng/mL SCF（干细胞因子）、10 ng/mL IL-3（白介素3）、10 ng/mL EPO（促红细胞生成素）、1 µM Dexamethasone（地塞米松）。
（2）红细胞扩增阶段（第6-12天）
细胞密度为：5×105个/mL；
培养基组成为：DMEM/F12、1% ITS-X、50 ng/mL SCF、10 ng/mL IL-3、10 ng/mLEPO、1 µM Dexamethasone。
（3）红细胞成熟阶段（第12-15天）
细胞密度为：1×106个/mL；
培养基组成为：DMEM/F12、1% ITS-X、50 ng/mL SCF、10 ng/mL EPO。
（4）红细胞脱核阶段（第15-20天）
细胞密度为：1×106个/mL；
培养基组成为：DMEM/F12、1% ITS-X、10 ng/mL EPO。
红细胞诱导分化过程中，每2天更换一次新鲜培养基，直至Day20。
实施例3 BSA对红细胞诱导分化的影响
1、实验方法
为了提高红细胞分化的稳定性及分化效率，本实施例分别测试了胎牛血清（FetalBovine Serum，FBS）和牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）对红细胞诱导分化的影响，以对比分别使用FBS和BSA的效果。
实验分为2组：FBS添加组和BSA添加组，具体实施方法即在实施例2的各阶段培养基的基础上均添加5% FBS或0.5% BSA。在红细胞诱导分化第20天，细胞流式分析添加5%FBS或0.5% BSA对血细胞标志物CD45和红细胞标志物CD235a表达情况的影响。
2、实验结果
本实施例造血干/祖细胞向红细胞分化流程见图1A，主要包括红细胞特化阶段、红细胞扩增阶段、红细胞成熟阶段和红细胞脱核阶段。细胞流式分析结果见图1B，结果显示，FBS添加组的CD45-CD235a+红细胞的比例为3.68%，BSA添加组的CD45-CD235a+红细胞比例高达56.39%，即相对于添加5% FBS而言，添加0.5% BSA能够显著提高CD45-CD235a+红细胞的分化效率。上述结果表明，相对于FBS，BSA更有利于CD45-CD235a+红细胞的诱导分化，这一结果属于本领域技术人员所预料不到的技术效果。
实施例4 抗氧化剂对红细胞诱导分化的影响
1、实验方法
为减少ROS对红细胞诱导分化的影响，本实施例筛选了抗氧化能力较强的三种抗氧化剂：抗坏血酸（Ascorbic acid，AA）、乙酰半胱氨酸（Acetylcysteine，NAC）、奎诺二甲基丙烯酸酯（Trolox），在红细胞诱导分化的各阶段培养基中均添加上述3种抗氧化剂或还原剂，以测试抗氧化剂对红细胞诱导分化的影响。
实验分为5组：对照组（实施例2各阶段培养基+0.5% BSA）、AA添加组（实施例2各阶段培养基+0.5% BSA+50 µg/mL抗坏血酸）、NAC添加组（实施例2各阶段培养基+0.5% BSA+50µM乙酰半胱氨酸）、Trolox添加组（实施例2各阶段培养基+0.5% BSA+50 µM Trolox）、AA+NAC+Trolox添加组（实施例2各阶段培养基+0.5% BSA+50 µg/mL抗坏血酸+50 µM乙酰半胱氨酸+50 µM Trolox）。在红细胞诱导分化第20天，细胞流式分析在实施例2的各阶段培养基的基础上均添加50 µg/mL Ascorbic Acid、50 µM Acetylcysteine、50 µM Trolox对血细胞标志物CD45和红细胞标志物CD235a表达情况的影响。其中，AA代表50 µg/mL AscorbicAcid；NAC代表50 µM Acetylcysteine；Trolox代表50 µM Trolox。
2、实验结果
本实施例造血干/祖细胞向红细胞分化流程见图2A，主要包括红细胞特化阶段、红细胞扩增阶段、红细胞成熟阶段和红细胞脱核阶段。细胞流式分析结果见图2B，结果显示，相对于对照组（Control）而言，添加3种抗氧化剂的实验组（AA+NC+Trolox）提高CD45-CD235a+红细胞的诱导分化效率至66.84%。
实施例5 基础培养基对红细胞诱导分化的影响
1、实验方法
为提高红细胞分化的稳定性，本实施例对红细胞诱导分化的基础培养基DMEM/F12和IMDM进行了比较。
实验分2组：DMEM/F12培养基实验组（实施例2各阶段培养基+0.5% BSA+50 µg/mL抗坏血酸+50 µM乙酰半胱氨酸+50 µM Trolox）、IMDM培养基实验组（将DMEM/F12培养基实验组各阶段的基础培养基替换为IMDM培养基）。在红细胞诱导分化第20天，细胞流式分析基础培养基DMEM/F12或IMDM对血细胞标志物CD45和红细胞标志物CD235a表达情况的影响。
2、实验结果
本实施例造血干/祖细胞向红细胞分化流程见图3A，主要包括红细胞特化阶段、红细胞扩增阶段、红细胞成熟阶段和红细胞脱核阶段。细胞流式分析结果见图3B，结果显示，IMDM培养基实验组CD45-CD235a+红细胞的诱导分化效率为81.86%，而DMEM/F12培养基实验组CD45-CD235a+红细胞的诱导分化效率为61.81%。上述实验结果表明，IMDM培养基更有利于CD45-CD235a+红细胞的诱导分化，这一结果属于本领域技术人员所预料不到的技术效果。
实施例6 不同来源的造血干/祖细胞分化为红细胞
1、实验方法
根据如前所述的实施例的结果，本发明确定了最优的红细胞诱导分化体系，确定了红细胞分化基础培养基（Erythrocyte-differentiation basal medium，EDBM），所述EDBM包含IMDM培养基、1% ITS-X、50 µg/mL抗坏血酸、50 µM乙酰半胱氨酸、50 µM奎诺二甲基丙烯酸酯、0.5% BSA。整个分化流程如下：
（1）红细胞特化阶段（Day0-6）
细胞密度为：1×105个/mL；
培养基组成为：EDBM、50 ng/mL SCF、10 ng/mL IL-3、10 ng/mL EPO、1 µMDexamethasone。
（2）红细胞扩增阶段（Day6-12）
细胞密度为：5×105个/mL；
培养基组成为：EDBM、50 ng/mL SCF、10 ng/mL IL-3、10 ng/mL EPO、1 µMDexamethasone。
（3）红细胞成熟阶段（Day12-15）
细胞密度为：1×106个/mL；
培养基组成为：EDBM、50 ng/mL SCF、10 ng/mL EPO。
（4）红细胞脱核阶段（Day15-20）
细胞密度为：1×106个/mL；
培养基组成为：EDBM、10 ng/mL EPO。
红细胞诱导分化过程中，每2天更换一次新鲜培养基，直至Day20。
采用上述红细胞诱导分化体系，分别测试脐血来源的造血干/祖细胞（CB-HSPC）和诱导多能干细胞来源的造血干/祖细胞（hiPSC-HSPC）分化为红细胞的效率。在诱导分化第15天，细胞流式分析CB-HSPC和hiPSC-HSPC诱导获得细胞表达红系祖细胞标志物CD36和红细胞标志物CD235a的情况。
2、实验结果
本实施例不同来源的造血干/祖细胞向红细胞分化流程见图4A，主要包括红细胞特化阶段、红细胞扩增阶段、红细胞成熟阶段和红细胞脱核阶段。细胞流式分析结果见图4B，结果显示，CB-HSPC经诱导分化后获得90.05% CD36+红系祖细胞、35.07% CD36+CD235a+红系前体细胞；hiPSC-HSPC经诱导分化后获得29.02% CD36+CD235a+红系前体细胞，32.96%CD235a+红细胞。上述结果表明，CB-HSPC更有利于分化为CD36+红系祖细胞或红系前体细胞，hiPSC-HSPC经诱导后迅速地生成CD36+红系前体细胞和CD235a+红细胞。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种用于诱导造血干细胞或造血祖细胞分化为红细胞的基础培养基，其特征在于，所述基础培养基包含IMDM培养基、ITS-X、抗坏血酸、乙酰半胱氨酸、奎诺二甲基丙烯酸酯、BSA。
2.根据权利要求1所述的基础培养基，其特征在于，所述基础培养基中各组分的含量分别为：1% ITS-X、50 µg/mL抗坏血酸、50 µM乙酰半胱氨酸、50 µM奎诺二甲基丙烯酸酯、0.5%BSA。
3.一种用于诱导造血干细胞或造血祖细胞分化为红细胞的培养体系，其特征在于，所述培养体系包括红细胞特化阶段培养基、红细胞扩增阶段培养基、红细胞成熟阶段培养基、红细胞脱核阶段培养基；
所述红细胞特化阶段培养基包含权利要求1或2所述的基础培养基、SCF、IL-3、EPO、地塞米松；
所述红细胞扩增阶段培养基包含权利要求1或2所述的基础培养基、SCF、IL-3、EPO、地塞米松；
所述红细胞成熟阶段培养基包含权利要求1或2所述的基础培养基、SCF、EPO；
所述红细胞脱核阶段培养基包含权利要求1或2所述的基础培养基、EPO。
4.根据权利要求3所述的培养体系，其特征在于，所述红细胞特化阶段培养基中各组分的含量分别为：50 ng/mL SCF、10 ng/mL IL-3、10 ng/mL EPO、1 µM地塞米松；
所述红细胞扩增阶段培养基中各组分的含量分别为：50 ng/mL SCF、10 ng/mL IL-3、10 ng/mL EPO、1 µM地塞米松；
所述红细胞成熟阶段培养基中各组分的含量分别为：50 ng/mL SCF、10 ng/mL EPO；
所述红细胞脱核阶段培养基中各组分的含量分别为：10 ng/mL EPO。
5.一种诱导造血干细胞或造血祖细胞分化为红细胞的方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求3或4所述的培养体系对造血干细胞或造血祖细胞进行培养。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1) Day0-6，红细胞特化阶段，采用权利要求3或4中所述的红细胞特化阶段培养基培养造血干细胞或造血祖细胞；
(2) Day6-12，红细胞扩增阶段，采用权利要求3或4中所述的红细胞扩增阶段培养基培养步骤(1)得到的细胞；
(3) Day12-15，红细胞成熟阶段，采用权利要求3或4中所述的红细胞成熟阶段培养基培养步骤(2)得到的细胞；
(4) Day15-20，红细胞脱核阶段，采用权利要求3或4中所述的红细胞脱核阶段培养基培养步骤(3)得到的细胞，获得红细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)中细胞密度为1×105个/mL。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)中细胞密度为5×105个/mL。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)、步骤(4)中细胞密度为1×106个/mL。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，每2天更换一次新鲜培养基，直至Day20。
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