CN115747155A - 白三烯在促进红系细胞成熟化中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了白三烯在促进红系细胞成熟化中的用途。根据本发明的具体实施例，在诱导红系细胞成熟的过程中加入适量白三烯，能够有效促进所述红系细胞的成熟化。
Description
技术领域
本发明涉及细胞工程领域，具体地，本发明涉及白三烯在促进红系细胞成熟化中的用途。
背景技术
红细胞(RBCs)是血液的主要成分之一，其主要生理功能是进行体内外的气体交换，为细胞和组织提供氧气，具有重要的临床应用价值，红细胞输注是临床广泛应用的治疗措施。目前血液的供应仍依靠志愿者的捐赠，这使得RBCs在世界范围内依然处于短缺状态。同时因血液储存而出现的问题、输血传染性疾病及输血相关并发症依然威胁着病人的生命健康。因此可供临床应用的体外血液制备成为目前的关注热点。
干细胞是最原始的，未分化的细胞，且具有不断自我更新，保持持续增殖等特点，在一定条件下可以分化成各种组织细胞，为组织提供新的细胞。到目前为止，包括脐带血、外周血和骨髓来源的造血干 /祖细胞(Hematopoietic Stem/Progenitor Cells，HSPCs)，以及包括胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells， ESCs)和诱导多能干细胞(InducedPluripotent Stem Cells iPSCs)在内的多能干细胞(Pluripotent Stem Cells，PSCs)都被证明具有分化为血液细胞的能力。其中，由于PSCs可以在体外长期培养扩增，并维持其多向分化的能力，已成为极具应用前景的种子细胞。
多能干细胞制备红细胞通常经历中胚层、生血内皮、造血干/祖细胞、红系-巨核共祖细胞、红系祖细胞、成熟红细胞几个阶段，其诱导通常为分阶段的诱导方案。早在2008年就分别有两项报道证实，诱导hESCs可以制备出红细胞。其中Ma等人的研究显示，在基质细胞的辅助下，约98％的hESCs体外诱导的红细胞能表达成人型血红蛋白(AdultHemoglobin,HbA)。然而更多的研究则提示，hESCs或 iPSCs诱导获得的RBCs与卵黄囊或胎肝阶段造血产生的RBCs类似，细胞的扩增水平偏低、细胞脱核比例低、体积偏大，且细胞中表达的主要为胎儿型血红蛋白HbF。这些问题的存在将限制人多能干细胞诱导制备的红细胞的临床应用。因此，寻找和确定可有效提高红系分化及红细胞成熟的调控因素并加以利用，将提高多能干细胞来源的红细胞的产量和成熟水平，推进人工红细胞的临床应用。
发明内容
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：RBCs在世界范围内一直处于短缺状态，探索可有效提高红细胞脱核成熟的方法，将提高体外制备红细胞的产量。发明人经过大量实验研究后发现，在多能干细胞或造血干/祖细胞分化培养过程中的合适阶段加入白三烯可以有效促进其诱导获得的红系细胞的成熟化，显著提高红系细胞的成熟效率。
为此，在本发明的第一方面，本发明提出了白三烯在促进红系细胞成熟化中的用途。根据本发明的实施例，所述白三烯可以有效促进红系细胞的成熟化，提高了红系细胞成熟的效率，获得的红细胞能够有效治疗或预防红系细胞异常减少相关疾病。
根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述白三烯包括下列中的至少之一：LTB4、LTC4、LTD4和LTE4。
根据本发明的实施例，所述红系细胞包括有核红细胞。
根据本发明的实施例，所述红系细胞由干细胞分化获得的有核红细胞。
根据本发明的实施例，所述红系细胞包含BFU-E、CFU-E、前红细胞、早幼红细胞、中幼红细胞、晚幼红细胞、网织红细胞中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述干细胞包括多能干细胞和造血干/祖细胞中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述干细胞包括人源多能干细胞和人源造血干/祖细胞中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述人源多能干细胞包括人源胚胎干细胞和/或人源诱导多能干细胞。
根据本发明的实施例，所述人源多能干细胞为人源胚胎干细胞系-H1。
根据本发明的实施例，所述人源造血干/祖细胞为人源脐带血造血干/祖细胞。
在本发明的第二方面，本发明提出了白三烯在制备试剂中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂用于促进红系细胞成熟化。如前所述，白三烯可以有效促进红系细胞的成熟化，提高了红系细胞成熟的效率，因此，包含白三烯的所述制剂同样具备促进红系细胞的成熟化，提高红系细胞成熟的效率的效果。
根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述白三烯包括下列中的至少之一：LTB4、LTC4、LTD4和LTE4；
根据本发明的实施例，所述红系细胞包括有核红细胞。
根据本发明的实施例，所述红系细胞由干细胞分化获得的有核红细胞。
根据本发明的实施例，所述红系细胞包含BFU-E、CFU-E、前红细胞、早幼红细胞、中幼红细胞、晚幼红细胞、网织红细胞中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述干细胞包括多能干细胞和造血干/祖细胞中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述干细胞包括人源多能干细胞和人源造血干/祖细胞中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述人源多能干细胞包括人源胚胎干细胞和/或人源诱导多能干细胞。
根据本发明的实施例，所述人源多能干细胞为人源胚胎干细胞系-H1。
根据本发明的实施例，所述人源造血干/祖细胞为人源脐带血造血干/祖细胞。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种培养基体系。根据本发明的实施例，所述培养基体系包括红系细胞成熟培养基和/或诱导分化培养基，其中，所述红系细胞成熟培养基和/或诱导分化培养基中包含白三烯。如前所述，白三烯可以有效促进红系细胞的成熟化，提高了红系细胞成熟的效率，因此，包含白三烯的所述培养基能够有效促进红系细胞的成熟。
根据本发明的实施例，上述培养基体系还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述白三烯包括下列中的至少之一：LTB4、LTC4、LTD4和LTE4。
根据本发明的实施例，所述白三烯为LTB4。
根据本发明的实施例，所述白三烯在所述红系细胞成熟培养基和/或诱导分化培养基中的终浓度为 1-320nM。根据本发明的一些具体实施例，当所述红系细胞成熟培养基和/或诱导分化培养基中白三烯的终浓度为1-320nM时，红细胞成熟的效率得到显著提高。
根据本发明的实施例，所述红系细胞成熟培养基进一步包括EPO和肝素。
根据本发明的实施例，在所述红系细胞成熟培养基中，所述EPO的终浓度为3～8u/mL。
根据本发明的实施例，在所述红系细胞成熟培养基中，所述肝素的终浓度为1～6u/mL。
根据本发明的实施例，所述红系细胞成熟培养基还包括Basic medium。
根据本发明的实施例，所述诱导分化培养基进一步包括SCF、TPO、Flt3L、IL-3、VEGF、SB431542、 EPO、转铁蛋白。
根据本发明的实施例，在所述诱导分化培养基中，所述SCF的终浓度为40～60ng/mL。
根据本发明的实施例，在所述诱导分化培养基中，所述TPO的终浓度为10～30ng/mL。
根据本发明的实施例，在所述诱导分化培养基中，所述Flt3L的终浓度为10～30ng/mL。
根据本发明的实施例，在所述诱导分化培养基中，所述IL-3的终浓度为10～30ng/mL。
根据本发明的实施例，在所述诱导分化培养基中，所述VEGF的终浓度为10～30ng/mL。
根据本发明的实施例，在所述诱导分化培养基中，所述SB431542的终浓度为5～15μM。
根据本发明的实施例，在所述诱导分化培养基中，所述EPO的终浓度为3～6u/mL。
根据本发明的实施例，在所述诱导分化培养基中，所述转铁蛋白的终浓度为80～110μg/mL。
根据本发明的实施例，所述诱导分化培养基进一步包括BEL基础培养基。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种诱导红系细胞成熟化的方法。根据本发明的实施例，包括： 1)将所述红系细胞在第三方面所述的培养基体系中的诱导分化培养基中进行培养，获取分化细胞；2) 将所述分化细胞在第三方面所述的培养基体系中的红系细胞成熟培养基中进行培养，以便获取所述成熟化的红系细胞。如前所述，白三烯可以有效促进干细胞来源红系细胞的成熟化，提高了干细胞来源红系细胞成熟的效率，因此，根据本发明实施例的方法可以有效促进干细胞来源红系细胞的成熟化，提高干细胞来源红系细胞成熟的效率。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述红系细胞由干细胞分化获得的有核红细胞。
根据本发明的实施例，所述红系细胞包含BFU-E、CFU-E、前红细胞、早幼红细胞、中幼红细胞、晚幼红细胞、网织红细胞中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述干细胞包括多能干细胞和造血干/祖细胞中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述干细胞包括人源多能干细胞和人源造血干/祖细胞中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述人源多能干细胞包括人源胚胎干细胞和/或人源诱导多能干细胞。
根据本发明的实施例，所述人源多能干细胞为人源胚胎干细胞系-H1。
根据本发明的实施例，所述人源造血干/祖细胞为人源脐带血造血干/祖细胞。
在本发明的第五方面，本发明提出了白三烯在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防红系细胞异常减少相关疾病。如前所述，白三烯可以有效促进红系细胞的成熟化，提高了红系细胞成熟的效率，因此，包含所述白三烯的药物可以有效促进红系细胞的成熟化，提高红系细胞成熟的效率，有效治疗或预防红系细胞异常减少相关疾病。
根据本发明的实施例，上述制药用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述红系细胞异常减少相关疾病为白血病、淋巴瘤、骨髓异常增生综合征、多发性骨髓瘤、地中海贫血、联合免疫缺陷病、结缔组织病、再生障碍性贫血、血红蛋白尿、下肢缺血和红系细胞减少症中的至少之一。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明实施例的多能干细胞向红系细胞诱导的分化过程，包括第一阶段(Stage 1)至第四阶段(Stage 4)，由第1天(Day1)诱导分化培养第18天(Day18)；
图2是根据本发明实施例的多能干细胞培养诱导至Day18时的红细胞脱核水平的流式细胞分析结果图；
图3是根据本发明实施例的多能干细胞培养诱导至Day18时的红细胞脱核水平的细胞染色分析结果图；
图4是根据本发明实施例的多能干细胞添加LTB4培养诱导至Day18时的红细胞表达成人beta珠蛋白实时定量PCR分析的结果图，其中，D18表示未添加LTB4组第18天的结果，D18+LTB4表示添加 LTB4组第18天的结果；
图5是根据本发明实施例的人脐带血造血干/祖细胞向红系细胞诱导的分化过程，包括第一阶段 (Stage 1)至第三阶段(Stage3)，由第1天(Day1)诱导分化培养第21天(Day18+3)；
图6是根据本发明实施例的人脐带血造血干/祖细胞诱导21天所得红细胞的表面标志以及红细胞脱核水平的流式细胞分析结果图；
图7是根据本发明实施例的人脐带血造血干/祖细胞诱导21天所得红细胞的染色分析结果图。
图8是根据本发明实施例的人脐带血造血干/祖细胞诱导21天所得红细胞表达成人alpha(α)、beta (β)珠蛋白实时定量PCR分析的结果图，其中，Relative expression表示相对表达量。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本申请中，所述“白三烯”，是花生四烯酸经5-脂氧合酶途径代谢产生的一组物质，白三烯是由白细胞产生并具有共轭三烯结构，其包括白三烯A4(LTA4)、白三烯B4(LTB4)、白三烯C4(LTC4)、白三烯D4(LTD4)和白三烯E4(LTE4)，其中，LTA4的分子式为C20H30O3，摩尔质量为318.45；LTB4 的分子式为C20H32O4，摩尔质量为336.46；LTC4的分子式为C30H47N3O9S，摩尔质量为625.775；LTD4 的分子式为C25H40N2O6S，摩尔质量为496.66。
本申请中，所述“多能干细胞向红系细胞分化的第一阶段”是指多能干细胞分化为中胚层细胞的阶段；所述“多能干细胞向红系细胞分化的第二阶段”是指中胚层细胞分化为生血内皮细胞的阶段；所述“多能干细胞向红系细胞分化的第三阶段”是指生血内皮细胞分化为成红细胞的阶段；所述“多能干细胞向红系细胞分化的第四阶段”是指成红细胞分化为红细胞的阶段。
下面将对实施例作具体介绍。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1LTB4对hESC-H1来源的红系细胞成熟化的影响
本实施例中，发明人通过在不同阶段添加小分子或细胞因子以模拟人体内红细胞发育的过程，促使 hESC-H1经生血内皮、造血干/祖细胞、红系祖细胞、成红细胞向红细胞分化，诱导体系如图1所示，并在诱导体系的第4阶段添加LTB4，对LTB4影响hESC-H1来源的红系细胞成熟化的效果进行检测，通过流式细胞术和细胞染色观测分析红细胞脱核的情况，通过实时定量PCR分析红细胞中成人型珠蛋白beta珠蛋白的表达情况，通过实验组(诱导第4阶段添加LTB4，H1-LTB4+)和对照组(未添加LTB4， H1-CON)红细胞的成熟水平的比较分析LTB4的功能。
具体的实验过程如下：
1.1hESC-H1诱导培养
1)将hESC-H1(购自美国WiCell公司)复苏在6孔板中使用mTeSR Plus培养基进行培养传代2-3 代后，当细胞生长至适合的密度时可进行后续的体外诱导；
2)待hESC-H1在6孔板内常规培养的未分化野生型H1生长至70％-80％汇合时，吸弃旧培养基，用1mL PBS洗涤细胞一次；
4)于步骤2)获得含有细胞的6孔板的各孔内分别加入500μL Accutase，于37℃培养箱内消化3min；
5)消化结束后轻敲6孔培养板边缘，促使细胞从板底脱落；
6)将步骤5)获得的细胞加入3mL的mTeSR Plus培养基终止消化；
7)将步骤6)获得的带有细胞的混合液转移至15mL离心管内，并于室温，1000rpm，离心5min，获得细胞；
8)同时配制含有10μM Y27632的mTeSR Plus培养基；
9)加入1mL含有10μM Y27632的mTeSR Plus重悬步骤7)获得的细胞，并计数；
10)以2x105/mL的密度接种步骤9)获得的细胞于低吸附6孔板内，每孔添加3mL含有10μM Y27632 的mTesR Plus，记做Day-1，并放置于37℃、5％ CO2的恒温培养箱中进行培养24h；
11)步骤10)培养结束后，于室温，1000rpm条件下离心5min，获得细胞；
12)将步骤11)获得细胞更换第一阶段诱导培养基时记做Day0；
13)更换第一阶段诱导培养基培养上述细胞两天后，于室温，1200rpm条件下离心5min，获得细胞记做Day2；
14)将步骤13)获得的细胞更换第二阶段诱导培养基每天换液，培养四天后，于室温，1400rpm条件下，离心5min，获得细胞，记做Day6；
15)将步骤14)获得的细胞更换第三阶段培养基后隔天换液，换液的第二天补液2mL，培养九天后，用100μm的筛网过滤，弃去剩余的EB球，于室温，1600rpm，离心5min，获得细胞，记做Day15；
16)以2x105/mL的密度将步骤15)获得的细胞接种于普通6孔板，每孔添加3mL第四阶段培养基，视情况补液，培养三天后，记做Day18。
其中，实验组各个培养阶段使用的培养基如下：
第一阶段(Stage1)诱导培养基：Advanced D/F12基础培养基、AA2P(50μg/mL)、bFGF(25ng/mL)、 BMP4(25ng/mL)、Activin A(25ng/mL)、Glutamax(1X)、P/S(1X)。
第二阶段(Stage2)诱导培养基：Advanced D/F12基础培养基、AA2P(50μg/mL)、bFGF(25ng/mL)、 VEGF(50ng/mL)、SB431542(5μM)、Glutamax(1X)、P/S(1X)。
第三阶段(Stage3)诱导培养基：BEL基础培养基(200mL)、SCF(50ng/mL)、TPO(20ng/mL)、 Flt3L(20ng/mL)、IL-3(20ng/mL)、VEGF(20ng/mL)、SB431542(10μM)、EPO(Pepro Tech)(5u/mL)、转铁蛋白(100μg/mL)；其中，所述BEL基础培养基包括：IMDM(91mL)、F12(91mL)、10％Deionized BSA(5mL)、Lindeic acid(20μL)、Linolenic acid(20μL)、AA2P(2mL)、Synthe chol(400μL)、α-MTG(7.8μL)、GlutaMax(2mL)、P/S(1mL)、Protein-freehybHdonta mix(PFHM)(10mL)、 Insulin-transferrin selenium(ITS)(2mL)。
第四阶段(Stage4)成熟培养基：Basic medium培养基(200mL)、EPO(pepro Tech)(5u/mL)、肝素(3u/mL)；其中，所述Basic medium培养基包括：IMDM(91mL)、F12(91mL)、AB血清(5mL)、 Linoleic acid(20μL)、linolenic acid(20μL)、AA2P(2mL)、Synthechol(400μL)、α-MTG(7.8μL)、 GlutaMAX(2mL)、P/S(1mL)、PFHM(10mL)、ITS(2mL)以及LTB4(300nM)。
其中，本实施例中的对照组未在第四阶段诱导培养基中添加LTB4，此外，第一、二、三阶段诱导培养基的组分以及第四阶段诱导培养基中的其它组分及浓度均与实验组相同。
1.2流式细胞术检测
选取步骤1.1诱导过程中第18天(Day18)收取的细胞(实验组，H1-LTB4+)以及诱导过程中未添加LTB4(对照组，H1-CON)的细胞分别进行流式细胞术检测，具体实验操作如下：
1)将第18天(Day18)收取的细胞团块吹匀后，吸取1mL含有细胞的培养基，于室温，1000rpm 条件下离心5min，弃掉上清；
2)将步骤2)获得的细胞团加入500μL Accutase消化液，捶打混匀，于37℃培养箱内消化3min；
3)上述消化操作结束后再次吹打细胞，以促使细胞团块消化为单细胞；
4)取1mL培养基加入到单细胞中终止消化，并转移细胞至含有8mL PBS的15mL离心管内，于室温，1000rpm条件下离心5min；
5)将步骤4)获得的产物离心后弃掉上清，用100μl PBS重悬细胞于1.5ml EP管内；
6)标记相应的流式抗体，于4℃冰箱孵育30min，孵育结束后加入1mL PBS洗涤细胞2次，并用 300μl PBS重悬细胞；
8)将步骤7)重悬后的细胞过一遍筛网后置入流式管内，上机进行检测。
1.3瑞氏-吉姆萨染色
1)将细胞涂片机(
Cytocentrifuge Rotor)专用离心杯、载玻片和吸水纸安装在一起后放置入细胞涂片机内；
2)取5x105个实验1.1获得的细胞重悬于500μL PBS内；
3)吸取重悬后的50μL细胞悬液加入离心杯内；
4)于室温，800rpm，离心3min；
5)取出玻片，镜下观察细胞密度是否适合；
6)用免疫组化笔在细胞周围画个封闭的圈；
7)加入A染液(瑞氏染料、姬姆萨染料)，计时1min；
8)加入B染液(磷酸盐)，混匀，计时9min；
9)用清水洗去染液，注意不要直接冲洗细胞；
10)将玻片晾干，镜下观察并拍照，以分析红细胞脱核情况。
1.4提取RNA
1)每1.5mL的EP管细胞加入1mL Trizol反复吹打，细胞脱落，室温静置5-10min；
2)每ml Trizol中加入0.2mL CHCL4，剧震15s，室温静置10min；
3)将步骤2)产物于4℃12000rmp离心15min，吸取上清液；
4)向上述上清液中加入0.5mL异丙醇(预冷)，手动巅倒，于4℃静置10min后，于4℃12000rpm 离心10min弃去上清，并用1mL的75％乙醇对沉淀进行一次清洗；
5)吸弃上清后，将沉淀置于超净台吹干至半透明，并用DEPC水100μl溶解RNA；
6)将步骤5)获得的产物于-80℃保存备用。
1.5逆转录反应
将实验1.4获得的部分RNA进行逆转里反应，具体的实验操作及反应条件如下：
1)逆转录的反应体系如表1所示，其中，RNA浓度：A(ng/μL)；RNA体积：B(μL)＝(800ng/A)。
表1
2)RNA+DEPC水预变性，具体为：取出置于冰上，加入MIX弹匀，离心，放入PCR仪逆转录，于65℃进行5min；
3)将PCR仪设置程序为37℃ 15min，50℃ 5min，98℃ 5min，4℃ hold；
4)将步骤3)获得的产物于-20℃保存备用。
1.6实时定量PCR
将实验1.5获得的产物进行PCR扩增反应，具体操作及反应条件如下：
1)qRT-PCR的反应体系如表2所示。
表2
| 试剂 | 体积μL |
| THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix | 10 |
| DEPC水 | 8 |
| 上游引物 | 0.5 |
| 下游引物 | 0.5 |
| cDNA | 1 |
| 总计 | 20 |
2)将PCR仪设置程序为95℃3min，94℃20s，58℃20s，72℃30s，重复40个循环。
3)实时定量PCR检测中所需的引物序列如表3所示。
表3
| α-globin F | CAACTTCAAGCTAAGCCACTGC(SEQ ID NO:1) |
| α-globin R | CGGTGCTCACAGAAGCCAG(SEQ ID NO:2) |
| β-globin F | AGGAGAAGTCTGCCGTTACTG(SEQ ID NO:3) |
| β-globin R | CCGAGCACTTTCTTGCCATGA(SEQ ID NO:4) |
1.7实验结果分析
具体的实验结果如图2-4所示，其中，实验组在诱导人胚胎干细胞H1红系分化的第四阶段加入 LTB4，并设置不加LTB4的对照组，诱导的第18天以流式细胞术和细胞染色分析红细胞脱核情况，以及通过PCR检测所获得的红细胞表达beta珠蛋白的情况。其中，由图2可以看出培养至第18天，实验组中代表脱核的细胞核染料Syto16阴性的红细胞比例显著高于对照组，脱核率是对照组的160倍。图3 的实验结果显示，诱导培养人胚胎干细胞H1至第18天，所述实验组中出现明显的无核红细胞，而对照组中几乎检测不到无核红细胞。图4的实验结果显示，人胚胎干细胞H1分阶段诱导红系分化，培养至第18天，实验组成人型珠蛋白——beta(β)珠蛋白的表达较对照组有显著提高。综上所述，通过在现有的多能干细胞红系诱导培养体系的第4阶段中添加300nM LTB4，可明显促进多能干细胞来源的红细胞的成熟化。
实施例2LTB4对人脐带血造血干/祖细胞来源的红系细胞成熟化的影响
本实施例中，发明人通过在不同阶段添加小分子或细胞因子以模拟人体内红细胞发育的过程，促使人脐带血造血干/祖细胞经红系祖细胞、成红细胞向红细胞分化，诱导体系如图5所示，并在诱导体系的第3阶段添加LTB4或LTB4受体抑制剂LY255283，对LTB4影响人脐带血造血干/祖细胞来源的红系细胞成熟化的效果进行检测，通过流式细胞术和细胞染色观测分析红细胞脱核的情况，通过实时定量PCR分析红细胞中成人型珠蛋白beta珠蛋白的表达情况，通过实验组(诱导第3阶段添加LTB4，LTB4+) 和对照组(未添加LTB4，CON)以及抑制剂组(添加LTB4受体抑制剂LY255283，LY255283)红细胞的成熟水平的比较分析LTB4的功能。具体的实验过程如下：
2.1CB-MNCs向红细胞诱导分化
1)将购买的脐带血单个核细胞(购自北京脐带血库)以2x106/孔接种于低吸附6孔板内，以Stage1 扩增培养基培养，记做D0；
2)根据具体情况半量换液或者于室温，2000rpm，离心5min离心换液；
3)将上述细胞培养7天，于2000rpm，离心5min离心更换Stage2诱导培养基，以2x106/孔接种于低吸附6孔板内，记做D7；
4)根据具体情况半量换液或者于室温，2000rpm，离心5min离心换液；
5)将步骤3)所述的细胞培养继续7天，于2000rpm，离心5min离心更换无地塞米松的Stage2诱导培养基，以2x106/孔接种于低吸附6孔板内，记做D14。
6)根据具体情况半量换液或者于室温，2000rpm，离心5min离心换液；
7)培养第18天，将细胞于2000rpm，离心5min离心更换Stage3脱核培养基，以5x106/孔接种于普通6孔板内继续培养3天，记作D21。
其中，各个培养阶段使用的试剂如下：
Stage1扩增培养基：在StemSpan基础培养基中加入100ng/mL SCF、10ng/mL TPO、20ng/mL IL-3、 10ng/mL IL-6、100ng/mL Flt3-L、1μM SR1、1X P/S。
Stage2诱导培养基：在Stem Span II基础培养基中加入100ng/mL SCF、40ng/mLIGF-1、 5U/mLEPO、2mM Glutamax、40μg/mL类脂、100μg/mL转铁蛋白、1×P/S、1μM地塞米松。
Stage3脱核培养基：95％IMDM基础培养基、3U/mL肝素、1×ITS、5U/mLEPO、5％ AB血清。
2.2人脐带血造血干/祖细胞来源的红细胞的检测
本实验对于2.1部分获得的人脐带血造血干/祖细胞来源的红细胞的脱核情况和血红蛋白表达情况采用流式细胞术、细胞染色和实时定量PCR分析，具体的操作方法参考实施例1。
2.3实验结果分析
具体的实验结果如图6-8所示，实验组在诱导脐带血造血干/祖细胞红系分化的第三阶段加入LTB4，并设置不加LTB4的对照组和加入LTB4受体抑制剂LY255283的抑制剂组，诱导的第21天以流式细胞术和细胞染色分析红细胞脱核情况，并通过PCR检测。其中，由图6可以看出培养至第21天，实验组中代表脱核的细胞核染料Syto16阴性的红细胞比例高于对照组，抑制剂组则出现脱核细胞比例的显著下降。图7的实验结果显示，诱导培养脐带血造血干/祖细胞至第21天，所述实验组中无核红细胞的比例高于对照组，而对照组中无核红细胞的比例又高于抑制剂组。图8的实验结果显示，人脐带血造血干 /祖细胞分阶段诱导红系分化，培养至第21天，实验组成人型珠蛋白——beta珠蛋白的表达较对照组有显著提高，而抑制剂组beta珠蛋白的表达无显著差别。综上所述，通过在现有的人脐带血造血干/祖细胞红系诱导培养体系的第3阶段中添加300nM LTB4，可明显促进多能干细胞来源的红细胞的成熟化，且成熟化的效果显著优于LTB4受体抑制剂LY255283。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (12)
1.白三烯在促进红系细胞成熟化中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述白三烯包括下列中的至少之一：LTB4、LTC4、LTD4和LTE4。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述红系细胞包括有核红细胞；
任选地，所述红系细胞由干细胞分化获得的有核红细胞；
任选地，所述红系细胞包含BFU-E、CFU-E、前红细胞、早幼红细胞、中幼红细胞、晚幼红细胞、网织红细胞中的至少之一；
任选地，所述干细胞包括多能干细胞和造血干/祖细胞中的至少之一；
任选地，所述干细胞包括人源多能干细胞和人源造血干/祖细胞中的至少之一；
任选地，所述人源多能干细胞包括人源胚胎干细胞和/或人源诱导多能干细胞；
任选地，所述人源多能干细胞为人源胚胎干细胞系-H1；
任选地，所述人源造血干/祖细胞为人源脐带血造血干/祖细胞。
4.白三烯在制备试剂中的用途，所述试剂用于促进红系细胞成熟化。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述白三烯包括下列中的至少之一：LTB4、LTC4、LTD4和LTE4；
任选地，所述红系细胞包括有核红细胞；
任选地，所述红系细胞由干细胞分化获得的有核红细胞；
任选地，所述红系细胞包含BFU-E、CFU-E、前红细胞、早幼红细胞、中幼红细胞、晚幼红细胞、网织红细胞中的至少之一；
任选地，所述干细胞包括多能干细胞和造血干/祖细胞中的至少之一；
任选地，所述干细胞包括人源多能干细胞和人源造血干/祖细胞中的至少之一；
任选地，所述人源多能干细胞包括人源胚胎干细胞和/或人源诱导多能干细胞；
任选地，所述人源多能干细胞为人源胚胎干细胞系-H1；
任选地，所述人源造血干/祖细胞为人源脐带血造血干/祖细胞。
6.一种培养基体系，其特征在于，包括红系细胞成熟培养基和/或诱导分化培养基，其中，所述红系细胞成熟培养基和/或诱导分化培养基中包含白三烯。
7.根据权利要求6所述的培养基体系，其特征在于，所述白三烯包括下列中的至少之一：LTB4、LTC4、LTD4和LTE4；
任选地，所述白三烯为LTB4；
任选地，所述白三烯在所述红系细胞成熟培养基和/或诱导分化培养基中的终浓度为1-320nM。
8.根据权利要求7所述的培养基体系，其特征在于，所述红系细胞成熟培养基进一步包括EPO和肝素；
任选地，在所述红系细胞成熟培养基中，所述EPO的终浓度为3～8u/mL；
任选地，在所述红系细胞成熟培养基中，所述肝素的终浓度为1～6u/mL；
任选地，所述红系细胞成熟培养基还包括Basic medium。
9.根据权利要求6～8任一项所述的培养基体系，其特征在于，所述诱导分化培养基进一步包括SCF、TPO、Flt3L、IL-3、VEGF、SB431542、EPO、转铁蛋白；
任选地，在所述诱导分化培养基中，所述SCF的终浓度为40～60ng/mL；
任选地，在所述诱导分化培养基中，所述TPO的终浓度为10～30ng/mL；
任选地，在所述诱导分化培养基中，所述Flt3L的终浓度为10～30ng/mL；
任选地，在所述诱导分化培养基中，所述IL-3的终浓度为10～30ng/mL；
任选地，在所述诱导分化培养基中，所述VEGF的终浓度为10～30ng/mL；
任选地，在所述诱导分化培养基中，所述SB431542的终浓度为5～15μM；
任选地，在所述诱导分化培养基中，所述EPO的终浓度为3～8u/mL；
任选地，在所述诱导分化培养基中，所述转铁蛋白的终浓度为80～120μg/mL；
任选地，所述诱导分化培养基进一步包括BEL基础培养基。
10.一种诱导红系细胞成熟化的方法，其特征在于，包括：
1)将所述红系细胞在权利要求6～9中任一项所述的培养基体系中的诱导分化培养基中进行培养，获取分化细胞；
2)将所述分化细胞在权利要求6～9中任一项所述的培养基体系中的红系细胞成熟培养基中进行培养，以便获取所述成熟化的红系细胞。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述红系细胞包括有核红细胞；
任选地，所述红系细胞由干细胞分化获得的有核红细胞；
任选地，所述红系细胞包含BFU-E、CFU-E、前红细胞、早幼红细胞、中幼红细胞、晚幼红细胞、网织红细胞中的至少之一；
任选地，所述干细胞包括多能干细胞和造血干/祖细胞中的至少之一；
任选地，所述干细胞包括人源多能干细胞和人源造血干/祖细胞中的至少之一；
任选地，所述人源多能干细胞包括人源胚胎干细胞和/或人源诱导多能干细胞；
任选地，所述人源多能干细胞为人源胚胎干细胞系-H1；
任选地，人源造血干/祖细胞为人源脐带血造血干/祖细胞。
12.白三烯在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防红系细胞异常减少相关疾病；
任选地，所述红系细胞异常减少相关疾病为白血病、淋巴瘤、骨髓异常增生综合征、多发性骨髓瘤、地中海贫血、联合免疫缺陷病、结缔组织病、再生障碍性贫血、血红蛋白尿、下肢缺血和红系细胞减少症中的至少之一。
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