CN116640728A - RO8191和/或AS2863619在诱导产生表达成人型β-珠蛋白的脱核红细胞中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了RO8191和/或AS2863619在诱导产生表达成人型β‑珠蛋白的脱核红细胞中的应用，本发明首次发现RO8191和/或AS2863619能够显著促进由造血干/祖细胞生成高表达成人型β‑珠蛋白的终末红细胞，并且能够显著提高红细胞的脱核率，本发明为临床级红细胞输注提供了一种新的途径，在红细胞输注方面具有巨大的应用潜力。

Description

RO8191和/或AS2863619在诱导产生表达成人型β-珠蛋白的脱 核红细胞中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体地，本发明涉及RO8191和/或AS2863619在诱导产生表达成人型β-珠蛋白的脱核红细胞中的应用。

背景技术

红细胞输血对于紧急缺血或血液疾病患者至关重要，然而红细胞的供应仍然不稳定，主要依赖于志愿者捐赠。目前，在临床医学中存在着血液短缺以及输血风险等问题。先前的研究探索了从人造血干细胞和祖细胞（hHSPCs）、人诱导多能干细胞（hiPSCs）和人胚胎干细胞（hESCs）中体外分化红细胞的技术作为潜在的红细胞输血替代来源。然而，采用现有的红细胞分化方案分化得到的红细胞主要表达胚胎型ε-珠蛋白（ε-globin）和胎儿型γ-珠蛋白（γ-globin），而成人型β-珠蛋白（β-globin）表达很少；此外，在红细胞生成过程中，红细胞脱核效率普遍较低。因此，如何在体外诱导造血干细胞/祖细胞分化为红细胞的过程中提高成人型β-珠蛋白的表达、脱核率是本领域当前面临的亟待解决的重要问题。

体内红细胞的生成主要分为初级红细胞生成（primitive erythropoiesis）和次级红细胞生成（definitive erythropoiesis）；其分别生成初级红细胞和次级红细胞，区分两者主要依赖于不同血红蛋白（Hemoglobin，Hb）的表达。成体次级红细胞主要表达β-globin，而初级红细胞则通过ε-globin的表达来进行鉴定。虽然第一波次级红细胞生成以γ-globin的表达为标志，但该发生过程持续及其短暂，仅出生后的2-3周。其中，γ-globin，也称为胎儿型血红蛋白，是在胎儿发育过程中表达的一种血红蛋白。γ-globin的表达在出生后逐渐减少，同时β-globin的表达逐渐增加。此外，红细胞成熟脱核对于输注医学应用意义重大，红细胞的脱核是红细胞成熟终末阶段发生的关键事件。但是目前对红细胞的脱核机制研究并不明确，并且体外成熟红细胞的制备技术也仍待改进，特别是多种类型来源的造血干/祖细胞诱导生成的成红细胞中脱核效率的提高。

迄今为止，尚未见两种小分子化合物RO8191和AS2863619在促进红细胞分化、提高分化得到的红细胞成人型β-珠蛋白的表达、提高分化得到的红细胞的脱核率方面的相关研究或报道，本发明的发明人首次提出了RO8191和AS2863619在诱导产生表达成人型β-珠蛋白的脱核红细胞中的应用，并通过实验证实了所述小分子化合物能够显著促进由造血干/祖细胞生成高表达成人型β-珠蛋白的终末红细胞，并且能够显著提高红细胞的脱核率，这一发现为本领域提供了一种有希望的红细胞输血替代来源。

发明内容

为了解决使用传统诱导分化方案分化得到的红细胞β-globin表达低、红细胞脱核率低和红细胞的诱导分化效率低等问题，本发明的目的在于提供RO8191和/或AS2863619在诱导产生表达成人型β-珠蛋白的脱核红细胞中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明的第一方面提供了RO8191和/或AS2863619在促进高表达成人型β-珠蛋白和/或脱核的红细胞生成中的应用。

在本发明中，所述RO8191是一种咪唑并萘啶化合物，结构式如式(Ⅰ)所示，名称：8-(1,3,4-oxadiazol-2-yl)-2,4-bis(trifluoromethyl)imidazo[1,2-a][1,8]naphthyridine，CAS编号：691868-88-9，分子式：C₁₄H₅F₆N₅O，是一种具有口服活性的干扰素（IFN）受体激动剂，其直接与IFNα/β受体2结合，激活IFN刺激的基因（ISGs）表达等。RO8191对HCV和EMCV均显示抗病毒活性。RO8191通过具有干扰素样活性发挥cccDNA调节剂作用，并具有抗HBV活性。

式(Ⅰ)。

在本发明中，所述AS2863619是一种有效的、口服的细胞周期蛋白依赖性激酶8（CDK8）和CDK19抑制剂，结构式如式(Ⅱ)所示，名称：4-(1-(2-Methyl-1H-benzo[d]imidazol-6-yl)-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-2-yl)-1,2,5-oxadiazol-3-aminedihydrochloride，CAS编号：2241300-51-4，分子式：C₁₆H₁₄Cl₂N₈O，AS2863619可以将抗原特异性效应或记忆T细胞转换为Foxp3⁺调节性T(T_reg)细胞，以研究各种免疫疾病，其对CDK8抑制剂和CDK19抑制剂的IC₅₀分别为0.61 nM和4.28 nM。AS2863619抑制CDK8/19可增强STAT5的激活，从而激活Foxp3基因。

式(Ⅱ)。

在一些实施方案中，本发明通过实验验证首次发现RO8191和/或AS2863619能够显著促进由造血干/祖细胞生成高表达成人型β-珠蛋白的终末红细胞，并且能够显著提高红细胞的脱核率，其中，RO8191和AS2863619两者联合具有协同增效的作用。此外，RO8191和/或AS2863619能够显著促进诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞向次级红细胞分化和增殖、显著促进单个核细胞和/或造血干细胞向次级红细胞分化和增殖。

在一些实施方案中，所述RO8191和/或AS2863619的使用浓度分别为：(0.1-5) μMRO8191、(0.1-20) μM AS2863619，在具体实施方案中，所述RO8191和/或AS2863619的使用浓度分别为：1 μM RO8191、5 μM AS2863619。

本发明的第二方面提供了一种用于促进造血干/祖细胞诱导分化为高表达成人型β-珠蛋白和/或脱核的红细胞的红细胞特化培养基。

进一步，所述红细胞特化培养基包含RO8191和/或AS2863619。

进一步，所述红细胞特化培养基还包含基础分化培养基；

所述基础分化培养基包含IMDM、牛血清白蛋白、ITS-X、抗坏血酸、乙酰半胱氨酸、Trolox。

在一些实施方案中，所述红细胞特化培养基中各组分的含量分别为：(0.1-5) μMRO8191、(0.1-20) μM AS2863619、(0.1-1)%牛血清白蛋白、(0.01-1)% ITS-X、(10-100) μg/mL抗坏血酸、(10-100) μM乙酰半胱氨酸、(10-100) μM Trolox、(0.1-5)Dexamethasone、(10-100) ng/mL SCF、(1-50) ng/mL EPO、(1-50) ng/mL IL-3。

在具体实施方案中，所述红细胞特化培养基中各组分的含量分别为：1 μMRO8191、5 μM AS2863619、0.5%牛血清白蛋白、0.1% ITS-X、50 μg/mL抗坏血酸、50 μM乙酰半胱氨酸、50 μM Trolox、1 μM Dexamethasone、50 ng/mL SCF、10 ng/mL EPO、10 ng/mLIL-3。

在一些实施方案中，所述造血干/祖细胞可来源于诱导多能干细胞（hiPSCs）、胚胎干细胞（hESCs）、单个核细胞（外周血来源或脐血来源的MNCs）、造血干细胞（外周血来源或脐血来源的CD34⁺ HSCs）、间充质干细胞（MSCs），但并不局限于上述来源，能够分化为红细胞的各种来源的造血干/祖细胞均在本发明的保护范围内。

在本发明中，所述红细胞是重要的血液成分，其主要由骨髓产生。红细胞生成包括红系祖细胞、红系前体细胞和成熟红细胞阶段。红细胞生成过程中，由骨髓最早产生的红系祖细胞为增殖缓慢的红系爆式集落形成单位（burst-forming unit-erythroid，BFU-E），之后BFU-E细胞分裂，并进一步分化为由红系前体细胞组成，并且细胞分裂迅速的红系集落形成单位（colony-forming unit-erythroid，CFU-E）。红系前体细胞先后经历原始红细胞、早幼红细胞、中幼红细胞、晚幼红细胞、网织红细胞5个阶段，最后脱核形成血液循环中的成熟红细胞，即红细胞终末分化阶段。

本发明的第三方面提供了一种促进造血干/祖细胞诱导分化为高表达成人型β-珠蛋白和/或脱核的红细胞的培养体系。

进一步，所述培养体系包括本发明第二方面所述的红细胞特化培养基、红细胞扩增培养基、红细胞成熟培养基；

所述红细胞扩增培养基包含本发明第二方面中所述的基础分化培养基、SCF、EPO；

所述红细胞成熟培养基包含本发明第二方面中所述的基础分化培养基、EPO。

进一步，所述红细胞扩增培养基中各组分的含量分别为：50 ng/mL SCF和10 ng/mL EPO；

所述红细胞成熟培养基中组分的含量为：10 ng/mL EPO。

在一些实施方案中，所述红细胞扩增培养基中各组分的含量分别为：(10-100)ng/mL SCF、(1-50) ng/mL EPO。在具体实施方案中，所述红细胞扩增培养基中各组分的含量分别为：50 ng/mL SCF和10 ng/mL EPO。

在一些实施方案中，所述红细胞成熟培养基中组分的含量为：(1-50) ng/mL EPO。在具体实施方案中，所述红细胞成熟培养基中组分的含量为：10 ng/mL EPO。

本发明的第四方面提供了一种促进造血干/祖细胞诱导分化为高表达成人型β-珠蛋白和/或脱核的红细胞的方法。

进一步，所述方法包括采用本发明第三方面所述的培养体系对造血干/祖细胞进行培养。

进一步，所述方法包括如下步骤：

(1) Day 0-12，红细胞特化阶段，采用本发明第二方面所述的红细胞特化培养基培养造血干/祖细胞；

(2) Day 12-15，红细胞扩增阶段，采用本发明第三方面中所述的红细胞扩增阶段培养基培养步骤(1)得到的细胞；

(3) Day 15-35，红细胞成熟阶段，采用本发明第三方面中所述的红细胞成熟阶段培养基培养步骤(2)得到的细胞，获得高表达成人型β-珠蛋白和/或脱核的红细胞。

在一些实施方案中，在上述方法的Day 0-9或Day 0-12期间所使用的培养基中含有RO8191和/或AS2863619。

在一些实施方案中，步骤(1)中细胞密度为(0.01-10)×10⁵个/mL，在具体实施方案中，步骤(1)中细胞密度为1×10⁵个/mL。

在一些实施方案中，步骤(2)中细胞密度为(0.1-50)×10⁵个/mL，在具体实施方案中，步骤(2)中细胞密度为5×10⁵个/mL。

在一些实施方案中，步骤(3)中细胞密度为(0.01-10)×10⁶个/mL，在具体实施方案中，步骤(3)中细胞密度为1×10⁶个/mL。

在一些实施方案中，在上述方法步骤中，每隔1-5天更换一次培养基，细胞在5%CO₂和37℃的湿润环境中培养，在具体实施方案中，每隔3天更换一次培养基，细胞在5% CO₂和37℃的湿润环境中培养。

在一些实施方案中，本发明所列举的数值范围或具体数值（例如，上述各种培养基中各组分的含量范围或具体含量、在各个分化阶段中添加的各种诱导分化因子的含量范围或具体含量、在各个分化阶段中的细胞密度范围或具体数值、在各个分化阶段中的培养天数、培养基的更换次数等）仅用于解释本发明所取得的技术效果，而不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员可在本发明所列举的数值范围或具体数值的基础上进行多种调整或修改，只要能够达到预期的诱导分化效果，这样经调整或修改后的数据范围或具体数值同样包含在本发明的保护范围内。

此外，本发明还提供了基于本发明第二方面所述的红细胞特化培养基、本发明第三方面所述的培养体系、和/或本发明第四方面所述的方法诱导分化得到的红细胞在预防、治疗和/或改善红细胞相关疾病或障碍中的应用。

此外，本发明还提供了一种预防、治疗和/或改善红细胞相关疾病或障碍的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用基于本发明第二方面所述的红细胞特化培养基、本发明第三方面所述的培养体系、和/或本发明第四方面所述的方法诱导分化得到的红细胞。

进一步，所述红细胞相关疾病或障碍是指需要进行红细胞输注的相关疾病或障碍，包括但不限于：再生障碍性贫血、恶性贫血、缺铁性贫血、镰状细胞性贫血、球形细胞增多症、溶血性贫血、高歇氏病、溶血、嗜中性白血球减少症、血小板减少症、粒细胞减少症、血友病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、急性髓样白血病、前B急性淋巴细胞白血病、前T急性淋巴细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、难治性白血病、急性失血、癌症、移植、自身免疫疾病、感染性疾病、炎症、免疫缺陷等相关疾病和/或其组合。

在一些实施方案中，通过一种或多种选自全身、局部、静脉内、皮下、关节内、肌内、鞘内和腹膜内的途径向所述受试者施用所述红细胞。在一些实施方案中，所述受试者包括一种或多种动物，包括例如牛、马、绵羊、灵长类动物、禽类和啮齿类动物物种。所述受试者可以是其血液中包含红细胞的动物（例如，哺乳动物、鸟、鱼、爬行动物或两栖动物）。在一些实施方案中，所述受试者可以是哺乳动物，例如人或非人哺乳动物。在另一些实施方案中，所述受试者可以是小鼠、大鼠、仓鼠、白鼬、沙鼠、兔、猴子、黑猩猩、马、矮种马、驴、绵羊、猪、鸡、山羊、猫或狗。在优选的实施方案中，所述受试者为人。

本发明的第五方面提供了如下任一方面的应用：

(1) RO8191和/或AS2863619在促进诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞向次级红细胞分化和增殖、提高所述红细胞成人型β-珠蛋白的表达、和/或促进所述红细胞脱核中的应用；

(2) RO8191和/或AS2863619在促进单个核细胞和/或造血干细胞向次级红细胞分化和增殖、提高所述红细胞成人型β-珠蛋白的表达、和/或促进所述红细胞脱核中的应用。

进一步，所述次级红细胞（definitive erythrocyte）是无核红细胞，体积相对较小，表达成人型β-珠蛋白（β-globin）。另外，本发明中所述初级红细胞（primitiveerythrocyte）通常产生于胚胎期的卵黄囊（yolk sac），为有核红细胞，细胞体积较大，表达胚胎型ε-珠蛋白（ε-globin）。

相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果：

本发明首次发现小分子化合物RO8191和/或AS2863619能够显著促进由造血干/祖细胞生成高表达成人型β-珠蛋白的终末红细胞，并且能够显著提高红细胞的脱核率，小分子化合物具有高可控性、易于优化、易于标准化和易于制造等多种优势，本发明为临床级红细胞输注提供了一种新的途径，在红细胞输注方面具有巨大的应用潜力。

附图说明

图1为小分子AS和/或RO促进从HPSCs生成人类红细胞前体细胞的特化结果图，其中，A图：实验方案示意图，用于测试小分子对红细胞前体细胞特化的影响；B图：流式细胞术分析结果图，显示在0-12天期间使用1 μM AS和/或5 μM RO对HSPCs进行特化后，第12天培养产生的CD36⁺CD235a⁺和CD71⁺CD235a⁺红细胞前体细胞的比例；

图2为从hiPSCs中稳定生成hHSPCs的结果图，其中，A图：用于从hiPSCs生成hHSPCs的实验方案示意图；B图：iPSC、血管内皮前体细胞（HE）和HSPC的照片；C图和D图：流式细胞术分析结果图，分别显示从hiPSCs中分化出的CD34⁺KDR⁺CD144⁺ HE和CD34⁺CD45⁺ HSPC的比例；

图3为小分子AS和/或RO以剂量和浓度依赖的方式促进人类红细胞前体特化的流式细胞术分析结果图，其中，A图：在指定的AS用量与RO（5 µM）一起于HSPCs的0-12天中特化产生的CD36⁺CD235a⁺和CD71⁺CD235a⁺红细胞前体细胞的比例；B图：在指定的RO用量与AS（5µM）一起于HSPCs的0-12天中特化产生的CD36⁺CD235a⁺和CD71⁺CD235a⁺红细胞前体细胞的比例；C图：在指定的时间点上，经过1 µM RO和5 µM AS处理后的12天时CD36⁺CD235a⁺和CD71⁺CD235a⁺红细胞前体的比例；

图4为使用小分子AS和RO处理生成表达β-珠蛋白的HPSCs来源的终末端红细胞的实验结果图，其中，A图：流式细胞术分析在使用1 µM RO和5 µM AS（RO+AS）或DMSO（CTL）处理的细胞群体中，CD34⁺、CD45⁺、CD36⁺、CD71⁺、CD235a⁺和CD36⁺CD235a⁺细胞的比例在指定的培养天数上的变化；B图：qRT-PCR分析在使用1 µM RO和5 µM AS（RO+AS）或DMSO（CTL）处理的细胞群体中，在指定的培养天数上ε-珠蛋白（HBE）、γ-珠蛋白（HBG）和β-珠蛋白（HBB）基因的表达变化，所示值是相对于参考基因GAPDH的相对表达量。误差线表示三个独立实验的标准差（N=3），* P < 0.05，与DMSO处理的细胞（CTL）相比，通过Student's t检验进行分析；C图：细胞在分化前和分化20天时经Wright-Giemsa染色的照片，比例尺：50 μm；D图：细胞在分化前和分化20天时经Benzidine染色的照片，比例尺，50 μm；E图：细胞在分化前和分化20天时的细胞沉淀照片；

图5为小分子AS和RO增强STAT1、STAT3和STAT5磷酸化的结果图，其中，A图：Western blot分析在使用1 µM RO和5 µM AS（RO+AS）或DMSO（CTL）处理的培养物中，总STATs（STAT1、STAT3和STAT5）和磷酸化STATs（p-STAT1、p-STAT3和p-STAT5）的表达情况，培养天数为0-6天；B图：通过分析磷酸化STATs与总STATs的比例来评估STATs的活化情况，所显示的统计数据是从A图中描述的三个独立实验的平均值±标准差。* P < 0.05被认为是显著的；

图6为HSPCs和红细胞前体的RNA-seq分析结果图，其中，A图：在AS+RO处理组（AR）和对照组（NT）中，红细胞分化过程中所有样本的FPKM值的无监督层次聚类热图；B图：AS+RO组和对照组在第12天（D12）之间的差异基因的火山图，横坐标表示基因表达的倍数变化（log₂FoldChange），纵坐标表示显著性水平（-log₁₀padj）；C图：富集气泡图显示了最显著的20个KEGG通路，横坐标表示KEGG通路上注释的差异基因数与总差异基因数的比例，纵坐标表示KEGG通路，点的大小表示注释到KEGG通路的基因数，颜色表示富集的显著性；

图7为小分子AS和RO促进红细胞前体去核化的结果图，其中，A图：流式细胞术分析在培养基中经1 μM RO和5 μM AS（RO+AS）或DMSO（CTL）处理的细胞，在第30天中的DRAQ5^-去核化红细胞的比例，B图：去核化细胞的百分比，误差棒表示三个独立实验的标准偏差（N=3），* P < 0.05，与DMSO处理的细胞（CTL）相比，经过Student's t检验分析，C图：经1 μM RO和5 μM AS（RO+AS）或DMSO（CTL）处理的细胞产生的细胞形态学变化，在RO+AS处理的细胞培养中观察到去核化红细胞。比例尺为5 μm；

图8为小分子AS和RO促进外周血MNCs和CD34⁺ HSC来源的次级红细胞分化的结果图，基于qRT-PCR的表达分析在使用1 µM RO和5 µM AS（RO+AS）或DMSO（CTL）处理的细胞群体中，在指定的培养天数上ε-珠蛋白（HBE）、γ-珠蛋白（HBG）和β-珠蛋白（HBB）基因的表达变化，所示值是相对于参考基因GAPDH的相对表达量，误差线表示三个独立实验的标准差（N=3）；* P< 0.05，与DMSO处理的细胞（CTL）相比，通过Student's t检验进行分析。

具体实施方式

本发明建立了一种各种来源的造血干/祖细胞向红细胞分化的方法和体系，所述方法和体系中包含RO8191和/或AS2863619，该方法和体系具有以下特征：（1）促进CD36⁺红系祖细胞或红系前体细胞的增殖；（2）促进并提高hiPSCs和hESCs向次级红细胞分化，提高成人型β-珠蛋白（β-globin）的表达，提高红细胞的脱核率；（3）提高外周血来源的MNCs（mononuclear cells）或CD34⁺ HSCs（hematopoetic stem cells）向次级红细胞的诱导分化，并提高成人型β-珠蛋白表达。本发明建立的方法和体系解决了现有的常规红细胞分化方案产生的红细胞成人型β-珠蛋白的表达量低、红细胞生成过程中去核效率低等难题。

本发明揭示了RO8191和AS2863619协同处理在体外衍生自人类诱导多能干细胞（hiPSCs）的红细胞的终末成熟和去核过程中起到了关键作用，促进了表达成人型β-珠蛋白的终末红细胞的生成，在干细胞诱导分化为红细胞的过程中，加入RO8191和AS2863619不仅能够促进红细胞的增殖和分化，而且红细胞的成熟率高，为目前人工造血等技术领域奠定了基础。这是一项重要的进展，因为高效的去核是生成功能性红细胞的关键步骤。本研究的发现有助于更深入地了解从hHSPCs生成终末红细胞的分化和去核过程，这些发现不仅扩展了本领域技术人员对造血过程的认识，也为开发新的适用于临床输血应用的红细胞打下了坚实的基础，临床应用前景广阔。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

本发明各实施例中所使用到的实验材料见下表1。

表1 实验材料

实施例1 小分子RO8191（RO）和AS2863619（AS）特化红细胞前体细胞

1、实验方法

本实施例的目的是为了研究小分子RO8191（RO）、AS2863619（AS）是否能够增强HSPCs的红细胞分化，以及其对红细胞生成的影响。为了研究人类红细胞前体细胞的特化并更好地了解人类红细胞的发育，本实施例建立了一个在红细胞生成的早期阶段（第0-12天）加入上述小分子RO、AS的方案（具体实验方案示意图见图1A）。在分化的第0天至第12天期间，培养物中加入RO（5 μM）或AS（1 μM）。本实施例进一步研究了RO和AS的不同剂量对红细胞生成的影响。

（1）hiPSCs的维持

hiPSCs在涂有matrigel的培养板（Corning, 354277）上以E8培养基（Stemcell,05990）为基础，添加1%青霉素-链霉素（Gibco, 15140163）进行维持。培养基每天更换一次。当细胞密度达到约70%时，使用TrypLE express酶（Gibco, 12604021）进行细胞传代。

（2）hiPSCs向hHSPCs分化

将hiPSC以8×10³个细胞/cm²的密度接种，并在E8培养基中维持2天。为了诱导HSPC分化，将培养基更换为STEMdiff™ APEL™ 2培养基（Stemcell, 05275），添加9 μM CHIR-99021（Selleck, S1263）处理24 h。然后，更换培养基，并添加20 ng/mL VEGF和20 ng/mLbFGF处理48小时。然后，将细胞以2×10⁴个细胞/cm²的密度重新接种，并在培养基中添加50ng/mL SCF、30 ng/mL TPO、20 ng/mL VEGF、20 ng/mL bFGF、10 ng/mL BMP4、10 ng/mL IL3和10 ng/mL Flt-3L进行维持7天（见图2A）。所有细胞因子均购自于Peprotech公司，除非另有说明。

从hiPSCs生成hHSPCs的实验方案示意图见图2A，iPSC、血管内皮前体细胞（HE）和HSPC的照片见图2B，流式细胞术的分析结果见图2C和2D，结果显示了从hiPSC中分化出的CD34⁺KDR⁺CD144⁺ HE和CD34⁺CD45⁺ HSPC的比例。

（3）HSPCs向红细胞分化

基础培养基中逐渐添加补充剂以特定阶段诱导HSPCs向红细胞系分化。基础分化培养基包括IMDM（Stemcell, 05992）、0.5%牛血清白蛋白（Proliant, 68700）、0.1% ITS-X（Gibco, 51500-056）、50 μg/mL抗坏血酸（Sigma, A8960）、50 μM乙酰半胱氨酸（Selleck,S1623）和50 μM Trolox（Sigma, 648471）。具体诱导分化方法如下：

第一步（0-12天），将HSPCs（1 × 10⁵个细胞/mL）在红细胞特化培养基中培养（红细胞特化培养基 = 基础分化培养基 + 50 ng/mL SCF + 10 ng/mL IL-3 + 10 ng/mL EPO+ 1 μM Dexamethasone）。每3天更换培养基。

第二步（12-15天），将细胞（5 × 10⁵个细胞/mL）重新悬浮在红细胞扩增培养基中（红细胞扩增培养基 = 基础分化培养基 + 50 ng/mL SCF和10 ng/mL EPO）。

第三步（15-35天），将细胞（1 × 10⁶个细胞/mL）重新悬浮在红细胞成熟培养基中（红细胞成熟培养基 = 基础分化培养基 + 10 ng/mL EPO）。每3天更换培养基，细胞在5%CO₂和37°C的湿润环境中培养。

为了优化红细胞分化方案，本实施例研究了RO和AS的添加阶段和浓度，以及DMSO作为对照。除非另有说明，所有细胞因子均从Peprotech公司购买。

（4）流式细胞术分析

为了分析细胞表面标记物，将细胞与直标一抗在室温下孵育30分钟：CD34-FITC（BD biosciences, 555821）、CD45-APC（Biolegend, 304037）、CD71-FITC（Biolegend,334104）、CD36-PE（Biolegend, 336206）、CD235a-APC（eBioscience, 17-9987-42）。同型对照作为阴性对照。使用Guava EasyCyte HT系统（Luminex）获取流式细胞术数据，并使用FlowJo软件（Tree Star）进行分析。

2、实验结果

流式细胞术分析结果显示，在红细胞生成的早期阶段（第0-12天）加入RO或AS能够明显促进红细胞前体细胞的分化，这表现为第12天时CD36⁺CD235a⁺和CD71⁺CD235a⁺细胞的比例增加，且联合应用RO和AS处理能够显著增加CD36⁺CD235a⁺红细胞前体细胞的比例（见图1B）。

本实施例进一步研究了RO和AS剂量对红细胞生成的影响，结果显示，在使用1 μMRO处理的基础上，添加0.1-5 μM浓度的AS显著增加了红细胞前体细胞的分化，这表现为CD36⁺、CD71⁺和CD235a⁺细胞的比例（见图3A）。因此，本实施例选择了5 μM的AS用于后续实验。接下来，本实施例进行了额外的实验来确定RO的浓度及其对红细胞分化在第0-12天期间的影响，流式细胞术分析结果显示，0.1-1 μM浓度范围内的RO添加显著增加了红细胞前体细胞的分化，这表现为CD36⁺、CD71⁺和CD235a⁺细胞的比例（见图3B）。然而，更高浓度的RO（5-20 μM）抑制了红细胞前体细胞的分化。

为了更详细地定义红细胞分化的时间特征，本实施例在分化的第0天至第12天期间的不同时间间隔内操作了这些小分子，流式细胞术分析结果显示，在分化的早期阶段（第0-9天和第0-12天），加入RO和AS明显促进了CD36⁺CD235a⁺和CD71⁺CD235a⁺红细胞前体细胞的分化（见图3C）。上述结果确定了在分化的第0天需要RO和AS的最佳浓度（1 µM RO、5 µMAS），并推荐持续9-12天的处理时间来促进红细胞的分化。

实施例2 小分子RO8191（RO）和AS2863619（AS）促进次级红细胞表达成人型β-珠蛋白（β-globin）

1、实验方法

本实施例通过流式细胞术分析研究了经RO和AS处理的红细胞在后续分化和成熟过程中的情况。经过35天的分化，检测CTL组（对照组：采用等量的DMSO处理的细胞）和RO+AS组（实验组：采用RO+AS处理的细胞，所述RO和AS的使用浓度分别为1 μM和5 μM）的HSPC标记物CD34和CD45的表达情况，检测红细胞前体标记物CD36和CD71的表达，检测红细胞标记物CD235a的表达，流式细胞术分析的具体方法如实施例1中所述。

为了研究RO和AS是否调控人类成熟红细胞的分化和成熟，本实施例进行了多种不同的策略研究。在分化的第20天，通过Wright-Giemsa染色评估两种培养条件下的红细胞的变化（CTL组和RO+AS组）。接下来，本实施例通过qRT-PCR测量了在红细胞分化过程中成人型β-globin、胚胎型ε-globin和胎儿型γ-globin基因的表达。此外，通过qRT-PCR测量采用同样的RO和AS处理外周血MNCs和CD34⁺ HSCs分化获得的次级红细胞表达成人型β-globin的情况。

（1）定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）

使用Trizol试剂（Invitrogen, 15596018）提取总RNA。使用PrimeScript™ RT试剂盒（带gDNA eraser）（Takara, RR047A）合成第一链cDNA。使用LightCycler系统（Roche）进行定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR），使用TransStart® Top Green qPCR SuperMix（Transgen, AQ131-04）。将每个基因的相对表达水平归一化到GAPDH。所使用到的引物序列信息见下表2。

表2 引物序列信息

（2）统计学分析

实验至少进行三次，所有数据均表示为平均值±标准偏差（SD）。通过Student's paired t检验分析获得的数据具有统计学意义。显著性水平设定为P值小于0.05。

2、实验结果

结果显示，经过35天的分化，HSPC标记物CD34和CD45的表达在分化过程中逐渐降低（见图4A）。相反，红细胞前体标记物CD36和CD71的表达迅速增加，在第20天到达峰值，然后在整个分化期间持续下降。在分化开始时（第0天），大约50%的细胞表达红细胞标记物CD235a（见图4A）。然而，在分化的第3天，CD235a⁺细胞的比例显著下降（见图4A）。随后，CD235a的表达逐渐增加，并在分化第20天后保持稳定的高水平（见图4A）。第35天，培养细胞表现出强烈的CD235a表达，同时CD71和CD36的表达水平相对较低，表明具有典型的末端红细胞表型。在经过35天的红细胞分化过程中，CTL和RO+AS组中均实现了高效的红细胞分化。在CTL和RO+AS培养中，超过95%的细胞表达红细胞标记物CD235a（见图4A）。同时，RO和AS的处理显著增强了红细胞前体细胞的分化，如第6天至第30天期间观察到的CD36⁺细胞和CD36⁺CD235a⁺细胞的比例增加（见图4A）。为了研究RO和AS是否调控人类成熟红细胞的分化和成熟，本实施例进行了多种不同的策略研究。在分化的第20天，通过Wright-Giemsa染色评估，两种培养条件下的红细胞均显示出高染色质密度和细胞体积的减小（见图4C）。然而，只有在RO+AS培养中才观察到脱核红细胞（见图4C）。Benzidine染色显示了积累的血红蛋白，呈深褐色，出现在红细胞细胞内（见图4D）。在分化前HSPC的沉淀呈白色，随着分化进行细胞沉淀最终呈鲜红色，表明成功产生了血红蛋白（图4E）。区分人类初级和次级红细胞主要依赖于不同血红蛋白的表达。接下来，本实施例测量了在红细胞分化过程中上调的血红蛋白基因的表达。在第20天的红细胞的qRT-PCR评估中，观察到RO和AS处理（RO+AS）的红细胞中成人型β-血红蛋白（HBB）的表达显著增加，然而，与对照细胞（CTL）相比，RO和AS处理（RO+AS）的红细胞中胚胎型ε-globin（HBE）的表达显著减少，对照组（CTL）和RO+AS组（RO+AS）均表达胎儿型γ-globin（HBG）（见图4B）。RO和AS处理同样促进外周血MNCs和CD34⁺ HSCs分化获得次级红细胞表达成人型β-globin，降低胎儿型ε-globin的表达（见图8）。上述实验结果表明，RO和AS的协同处理促进了高表达成人型β-globin的成熟红细胞的分化。此外，这种协同处理的方式有效促进了CD36⁺CD235a⁺红细胞前体细胞的产生。

实施例3 小分子RO8191（RO）和AS2863619（AS）协同激活JAK/STAT信号通路

1、实验方法

细胞因子如EPO、SCF和IL-3已被证明通过激活JAK/STAT信号通路诱导红细胞的分化，本实施例首先采用Western blot分析评估了这些细胞因子对JAK/STAT信号通路的影响（对照组）。为了研究RO和AS这两个小分子的机制，本实施例将它们添加到培养物中处理了6天（所述RO和AS的使用浓度分别为1 μM和5 μM），以评估RO和AS对JAK/STAT信号通路的影响。

所述Western blot（蛋白质免疫印迹）的具体实施方法如下：将细胞收集并用含有磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解。取10 μg细胞裂解液，通过10% SDS-PAGE凝胶分离，并转移到硝酸纤维素膜上。膜用10%脱脂奶粉在室温下阻断2小时，随后与STAT1抗体（Cell Signaling Technology, 9172）、Phospho-STAT1抗体（Cell SignalingTechnology, 7649）、STAT3抗体（Cell Signaling Technology, 4904）、Phospho-STAT3抗体（Cell Signaling Technology, 4904）、STAT5抗体（Cell Signaling Technology,94205）、Phospho-STAT5抗体（Cell Signaling Technology, 9314）和GAPDH抗体在4°C过夜孵育。使用过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（H+L）二抗检测一抗。使用BeyoECL Plus试剂盒和化学发光凝胶成像系统可视化条带。使用Image J软件进行灰度统计，统计学分析方法同实施例2中所述。

2、实验结果

Western blot分析结果显示，细胞因子处理后的对照组（CTL组），STAT1、STAT3和STAT5的磷酸化水平略有增加，与先前的研究结果一致（见图5A-5B）。在对照组和RO+AS组中，STAT1、STAT3和STAT5均有表达。此外，对于任何其他STAT蛋白，总的STAT蛋白水平（STAT/GAPDH）没有显著变化（见图5A-5B）。然而，与对照组相比，RO和AS的处理显著增强了STAT1、STAT3和STAT5的磷酸化水平（pSTAT/STAT），表明RO和AS强力激活了JAK/STAT信号通路（见图5A-5B）。以上结果表明，RO和AS的协同处理显著增强了红细胞分化过程中STAT1、STAT3和STAT5的磷酸化水平。

实施例4 红细胞前体的基因表达谱

1、实验方法

为了探究定义红细胞分化的分子机制，本实施例对在6天至20天期间使用RO和AS处理的培养物进行了RNA测序分析，并将其与对照组进行了比较。

RNA测序和数据分析的过程如下：在处理AS和RO或DMSO的hiPSC源HSPC和红细胞中，分别在Day 0、Day 6、Day 12和Day 20收集样品。使用Trizol试剂（Invitrogen,15596018）提取总RNA，并由Novogene Co., Ltd构建文库。RNA测序使用Illumina Novaseq平台进行，采用150 bp双端测序。原始数据首先经过fastp软件处理。干净的reads使用Hisat2软件对参考基因组进行比对。使用edgeR进行数据标准化和差异表达基因分析。对原始数据进行KEGG富集和热图分析。

2、实验结果

基因表达谱的无监督分层聚类热图如图6A所示，显示了在红细胞分化的不同阶段基因表达谱的动态变化。RO和AS的添加导致了更明显的变化，尤其是在第6天和第12天。本实施例选择了AS+RO组和第12天的对照组进行后续分析，发现2338个基因显著上调，981个基因显著下调，如图6B所示。根据图6C，基于KEGG的富集通路分析显示，细胞因子-细胞因子受体相互作用和PI3K-AKT信号传导是其中富集程度较高的通路。

实施例5 小分子RO8191（RO）和AS2863619（AS）对终末红细胞去核过程的影响

1、实验方法

去核仍然是体外培养中hiPSC源性红细胞成熟的关键障碍。为了研究小分子对核排出的影响，本实施例使用DRAQ5染色来检测在经过RO和AS处理的培养物中核的存在与否（所述RO和AS的使用浓度分别为1 μM和5 μM），并将其与第30天的对照组进行比较。通过流式细胞术分析经RO和AS处理的培养物的去核效率，通过显微镜分析经AS和RO处理的培养物中衍生的红细胞在终末红细胞分化过程中核的排出情况。流式细胞术分析的具体方法如实施例1中所述，统计学分析方法同实施例2中所述。

2、实验结果

流式细胞术分析结果显示，从第0天到第12天经RO和AS处理的培养物明显提高了去核效率，表现为DRAQ5^-红细胞的比例较高（约40%）（见图7A-7B）。显微镜分析结果显示，经AS和RO处理的培养物中衍生的红细胞在终末红细胞分化过程中完成了核的排出，而对照组的细胞没有完成核的排出（见图7C）。上述实验结果表明，RO和AS的协同处理促进了体外hiPSC源性红细胞的终末成熟和去核过程。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.RO8191和/或AS2863619在促进高表达成人型β-珠蛋白和/或脱核的红细胞的生成中的应用。

2.一种用于促进造血干/祖细胞诱导分化为高表达成人型β-珠蛋白和/或脱核的红细胞的红细胞特化培养基，其特征在于，所述红细胞特化培养基包含RO8191和/或AS2863619。

3.根据权利要求2所述的红细胞特化培养基，其特征在于，所述红细胞特化培养基还包含基础分化培养基；

所述基础分化培养基包含IMDM、牛血清白蛋白、ITS-X、抗坏血酸、乙酰半胱氨酸、Trolox；

所述红细胞特化培养基中各组分的含量分别为：(0.1-5) μM RO8191、(0.1-20) μMAS2863619、(0.1-1)%牛血清白蛋白、(0.01-1)% ITS-X、(10-100) μg/mL抗坏血酸、(10-100) μM乙酰半胱氨酸、(10-100) μM Trolox、(0.1-5) Dexamethasone、(10-100) ng/mLSCF、(1-50) ng/mL EPO、(1-50) ng/mL IL-3。

4.根据权利要求3所述的红细胞特化培养基，其特征在于，所述红细胞特化培养基中各组分的含量分别为：1 μM RO8191、5 μM AS2863619、0.5%牛血清白蛋白、0.1% ITS-X、50 μg/mL抗坏血酸、50 μM乙酰半胱氨酸、50 μM Trolox、1 μM Dexamethasone、50 ng/mL SCF、10 ng/mL EPO、10 ng/mL IL-3。

5.一种促进造血干/祖细胞诱导分化为高表达成人型β-珠蛋白和/或脱核的红细胞的培养体系，其特征在于，所述培养体系包括权利要求2-4中任一项所述的红细胞特化培养基、红细胞扩增培养基、红细胞成熟培养基；

所述红细胞扩增培养基包含权利要求3中所述的基础分化培养基、SCF、EPO；

所述红细胞成熟培养基包含权利要求3中所述的基础分化培养基、EPO。

6.根据权利要求5所述的培养体系，其特征在于，所述红细胞扩增培养基中各组分的含量分别为：50 ng/mL SCF和10 ng/mL EPO；

所述红细胞成熟培养基中组分的含量为：10 ng/mL EPO。

7.一种促进造血干/祖细胞诱导分化为高表达成人型β-珠蛋白和/或脱核的红细胞的方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求5或6所述的培养体系对造血干/祖细胞进行培养。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1) Day 0-12，红细胞特化阶段，采用权利要求2-4中任一项所述的红细胞特化培养基培养造血干/祖细胞；

(2) Day 12-15，红细胞扩增阶段，采用权利要求5或6中所述的红细胞扩增阶段培养基培养步骤(1)得到的细胞；

(3) Day 15-35，红细胞成熟阶段，采用权利要求5或6中所述的红细胞成熟阶段培养基培养步骤(2)得到的细胞，获得高表达成人型β-珠蛋白和/或脱核的红细胞。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在Day 0-9或Day 0-12期间所使用的培养基中含有RO8191和/或AS2863619；

所述造血干/祖细胞的来源包括诱导多能干细胞、胚胎干细胞、单个核细胞、造血干细胞、间充质干细胞。

10.如下任一方面的应用，其特征在于，所述应用包括：

(1) RO8191和/或AS2863619在促进诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞向次级红细胞分化和增殖、提高所述红细胞成人型β-珠蛋白的表达、和/或促进所述红细胞脱核中的应用；

(2) RO8191和/或AS2863619在促进单个核细胞和/或造血干细胞向次级红细胞分化和增殖、提高所述红细胞成人型β-珠蛋白的表达、和/或促进所述红细胞脱核中的应用。