CN112041428A - 用于在悬浮培养物中分化人多能干细胞系的方法 - Google Patents

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Abstract

本文描述了将多能干细胞分化为造血前体细胞、造血祖细胞、成红细胞和去核成红细胞的方法，其中所述方法在悬浮搅动下进行，并且在中胚层诱导阶段期间加入GSK‑3‑抑制剂或Wnt通路激活剂。在优选的实施方案中，多能干细胞在搅动的微载体培养物中扩增，且GSK‑3抑制剂是CHIR99021。本文还公开了用于本文公开的方法的细胞培养基，以及用于进行所述方法的试剂盒。

Description

用于在悬浮培养物中分化人多能干细胞系的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年1月18日提交的SG临时申请No.10201800488W 的优先权的权益，其全部内容通过引用并入本文用于所有目的。
技术领域
本发明一般涉及分子生物学领域。特别地，本发明涉及细胞分化的方法。
背景技术
已经提出人诱导多能干细胞(hiPSC)的红系分化作为产生无限供应的红血球(RBC)的手段。因此，需要开发可扩展的悬浮培养物分化方法。先前显示使用基于骨形态发生蛋白-4(BMP4)的分化方案在搅动微载体(MC) 悬浮培养物中扩增的人多能干细胞(hPSC)的红系分化，其中中胚层诱导和成红细胞扩增在静态条件下进行。然而，反复尝试实施此过程以区分多个hPSC 系显示红系分化中的可变性。
通用的O-阴性(neg)红血球(RBC)可来源于从具有O-阴性血型的供体产生的人诱导多能干细胞(hiPSC)的分化。人诱导多能干细胞产生的红血球有可能成为细胞的无限来源，以补充医疗保健行业的紧急输液需要。假定每单位血液需要一万亿红血球，则需要开发可允许产生增加数量的红血球的有效分化和生物过程。虽然已经描述了将人诱导多能干细胞分化为红系细胞的许多方法，但这些方法尚未证明能够扩大规模。
发明内容
在一个方面，本发明涉及将多能干细胞分化为造血前体细胞的方法，其中所述方法在悬浮搅动下进行，并且其中在中胚层诱导阶段期间加入GSK-3 抑制剂或Wnt通路激活剂。
在另一方面，本发明涉及用于将多能干细胞分化为造血前体细胞从而使用微载体胚状体(EB)从多能干细胞产生造血前体细胞的细胞培养基，所述细胞培养基包含骨形态发生蛋白、GSK-3激酶抑制剂，其中所述抑制剂选自由以下组成的组：CHIR99021、(2’Z,3’E)-6-溴靛玉红-3’-肟(Bio；CAS 667463-62-9)、Kenpaullone(CAS 142273-20-9)、GSK-3β抑制剂XII(TWS119； CAS 601514-19-6)、Bio-丙酮肟(CAS 667463-85-6)、CHIR-98014、SB216763 (CAS 280744-09-4)、GSK-3β抑制剂VIII(CAS 487021-52-3)及其组合，或Wnt通路激活剂、激活素A和血管内皮生长因子。
在另一方面，本发明涉及用于将多能干细胞分化为造血前体细胞从而使用微载体胚状体(EB)或多能干细胞从多能干细胞产生造血前体细胞的细胞培养基，所述细胞培养基包含骨形态发生蛋白、激活素A和血管内皮生长因子。
在另一方面，本发明涉及用于将多能干细胞分化为造血前体细胞从而使用微载体胚状体(EB)或多能干细胞从多能干细胞产生造血前体细胞的细胞培养基，所述细胞培养基包含骨形态发生蛋白、激活素A、bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)或其变体、激素、细胞因子和血管内皮生长因子。
在另一方面，本发明涉及用于将多能干细胞分化为造血前体细胞的方法，其中所述方法在悬浮搅动下进行，所述方法包括：a.(任选地)提供多能干细胞；b.将步骤a.的细胞暴露于如本文定义的细胞培养基中持续24小时(第0 天至第1天)，从而产生T-Brachyury(T-Bra；原条/早期中胚层标志物)阳性细胞；c.将步骤b.的细胞暴露于如本文所公开的细胞培养基中持续24小时(第 1天至第2天)；d.将步骤c.的附着于微载体的细胞暴露于如本文公开的细胞培养基中持续48小时(第2天至第4天)，由此步骤b.至d.诱导中胚层诱导； e.去除细胞培养基，并分离步骤d.的所得KDR+PDGFRα-造血前体细胞。
在另一方面，本发明涉及用于将多能干细胞分化为造血前体细胞的方法，其中所述方法在悬浮搅动下进行，所述方法任选地包括提供多能干细胞；根据本文公开的方法，在从步骤a.分离的多能干细胞中诱导中胚层诱导，从而产生KDR+PDGFRα-造血前体细胞；在从步骤b分离的细胞中诱导造血诱导，从而产生CD34/CD43/CD45造血祖细胞；在步骤c分离的细胞中诱导成红细胞扩增，从而产生CD235a+CD71+成红细胞；在步骤d分离出的细胞中诱导成红细胞成熟，从而产生CD235a+DRAQ5-ve去核的成红细胞；去除细胞培养基，并分离步骤e得到的CD235a+DRAQ5-ve去核的成红细胞。
在另一方面，本发明涉及包含微载体和本文公开的细胞培养基的试剂盒。
附图说明
当结合非限制性实例和附图考虑时，参考详细描述将更好地理解本发明，在附图中：
图1显示在搅动的微载体(MC)培养物中扩增人多能干细胞(hPSC)的结果，与未搅动的静态培养物相比，该结果导致减少的基于BPM4的造血分化。(A)显示静态或搅动培养7天后hES-3MC聚集体的图像。示出在多能扩增阶段最初在静态(静态hPSC扩增)或搅动(搅动hPSC扩增)条件下扩增的hES-3-MC聚集体中(B)多能标志物(hPSC扩增后7天)、(C)T-bra(分化后48小时)和KDR(分化后4天)表达的流式细胞术评价结果。(D) 示出实时RT-PCR数据，示出早期造血特异性标志物(CD31、GATA2、GATA1、 SCL、RUNX1)从分化持续4天的hES-3-MC聚集体(从静态或搅动的hPSC 扩增衍生)的表达(相对于未分化的hES-3)的平均倍数变化。(E)示出在基于甲基纤维素的培养基中扩增后第2天和第14天造血前体细胞(从静态/搅动的hPSC扩增衍生)的图像。标尺＝1000微米。(F)是总结下述总计数的表格：每孔造血前体细胞(在最初接种1×105细胞后于Blast生长培养基(BGM) 中扩增后第14天)；6孔板每孔的成红细胞(分化后第28天)，来自hES-3-MC 聚集体(从静态或搅动的hPSC扩增衍生)；以及CD235a+细胞和胎儿血红蛋白(HbF)表达细胞的相应流式细胞术表达(％)(分化后第28天)；以及28 天后成红细胞沉淀的图像。所有数据均为平均值±SEM，n＝3，p-值比较从静态或搅动的hPSC扩增衍生的细胞。
图2显示多因子实验设计(DoE)分析的结果，其将CHIR-99021鉴定为改善造血中胚层诱导和从最初在搅动条件下扩增的hPSC-MC培养物中产生造血前体细胞的重要因子。(A)是示出不同实验设计(DoE)条件的表，具有不同浓度的以下各项：激活素A(ng/ml)、CHIR-99021(μM)维持24小时、从24至48小时的CHIR-99021(μM)和在实验开始时加入的BMP4(ng/ml)，以及在分化后第4天通过流式细胞术测定相应的KDR+细胞百分比，以及在最初接种1×105个细胞后在Blast生长培养基(BGM)中扩增14天后每孔总造血前体细胞。(B)是柱形图，其中CHIR-99021(仅维持24小时)被鉴定为在分化的第4天获得更高％KDR+细胞(P＝2.3E-07)和(C)更高的造血前体细胞扩增(P＝1.01E-05)的显著因子。Act＝激活素；CHI＝CHIR-99021，持续24小时，CH2＝CHIR-99021，持续24至48小时；BMP＝BMP4。显著的P- 值显示在图表中。(D)显示在Blast生长培养基(BGM)中培养14天后，分化第4天的高(>15)％和低(<5)％KDR表达与相应的每孔造血前体细胞总数之间的相关性。
图3显示使用选择的DoE条件在搅动条件下在微载体(MC)上初始扩增的O-阴性hiPSC系的红系细胞分化结果。(A)显示描绘针对所选择的条件从第0天至第34天的总细胞扩增的线图：第0-4天(hPSC-MC聚集体的中胚层诱导)，第4-17天(Blast生长培养基(BGM)中的造血前体细胞扩增，第17-34 天(悬浮培养中的红细胞扩增)(与条件#7相比,*p<0.05)。所有数据均为平均值±SEM，n＝3。(B)是总结衍生自使用条件#7和#18的成红细胞实验的第34天(6孔板的)每孔活细胞总计数以及成红细胞表面标志物(CD235a和 CD71)和HbF的流式细胞术表达(％)的表。在实验的第34天，来自条件 #7和#18的相应的红血球沉淀。报告了用于条件#7和#18之间比较的相应p 值。所有数据均为平均值±SEM，n＝3。
图4显示CHIR剂量对在搅动微载体(MC)培养物中扩增的9个人多能干细胞(hPSC)系的造血分化的影响。(A)显示9个不同的人多能干细胞系在搅动微载体培养中扩增持续7天的结果。表显示：细胞-微载体聚集体图像，细胞倍数扩增，多能性(Oct-4，Tra1-60和SSEA4表达)，核型和平均聚集体尺寸。NA＝不可用。显示CHIR剂量(μM)对9个不同人多能干细胞-微载体系的(B)分化后48小时T-bra+细胞百分比(通过流式细胞术测定)和(C) 分化后96小时KDR+PDGFRα-细胞百分比(通过流式细胞术测定)的影响。 CHIR剂量(μM)对9个不同hPSC-MC系分化后衍生的造血前体细胞群体中(D)分化后14天造血前体细胞的平均扩增倍数和(E)CD 43+细胞的百分比的影响。(F)在分化不同的hPSC系后，确定了总存活细胞的累积倍数扩增(与X13相比，在第42天，每行(D11、D12和BR2除外)的累积倍数扩增*p<0.05)。所有数据均为平均值±SEM，n＝3。(G)在实验的第35天，来自不同人多能干细胞系的相应红血球沉淀。
图5显示O-neg hPSC衍生的成红细胞的功能表征和终末成熟的结果。(A) 显示成人外周血红血球(成人RBC)、hES-3衍生的成红细胞(hES-3RBC) 和O-neg hiPSC衍生的成红细胞(D5红血球)的血红蛋白亚型的实时RT-PCR 评价结果。数据表示为相对于成人红血球的平均表达倍数变化±SEM，n＝3。 (B)显示成人外周血红血球(PB)、脐带血红血球(CB)的细胞裂解物中血红蛋白亚型和β-肌动蛋白的免疫印迹检测结果，以及hES-3衍生的成红细胞和O-neg人诱导多能干细胞(hiPSC)衍生的成红细胞(D5)的一式三份检测。白线区分合并在一起的凝胶图像的区域。(C)显示描绘成人红血球(◆)、hES-3 分化的成红细胞(□)和D5成红细胞(1-▲，2-，3-○)的一式三份样品的氧平衡曲线[氧合血红蛋白百分比与氧压力(mm Hg)]的线图。给出了与成人红血球相比的相应的p50值(平均值±SD，n＝2)和p值。(D)显示在终末成熟条件下于扩增培养基(Expansion)中培养或与人胎儿间充质干细胞 (MSC)共培养持续19天的O-neg hiPSC衍生的成红细胞CD235a和DRAQ5 表达的流式细胞术评价结果(去核重复1-3)。用同型抗体染色的成红细胞用作对照。(E)显示用抗人CD 235-FITC抗体和DRAQ5染色的终末成熟O-neg 成红细胞的图像。显示代表性的明场图像、CD235a和DRAQ5的荧光图像以及CD235a和DRAQ5的合并荧光图像。在合并图像中，可将去核细胞鉴定为缺乏核染色的CD235a阳性细胞(放大图显示如下)。标尺＝20微米。(F)显示成熟前(第0天)和成熟期间(第4-19天)的O-neg成红细胞的Giemsa 染色。黑色箭头表示去核的红系细胞。标尺＝20微米。
图6显示实验设计(DoE)多因子分析的结果，其鉴定CHIR-99021为最初在连续搅动条件下扩增的O-阴性hiPSC-MC聚集体分化后增加的KDR表达的显著因子。(A)显示列出了针对
Figure BDA0002689216970000051
软件生成的多因子条件实验的激活素A浓度(ng/ml)、维持24小时的CHIR-99021(μM)、在48小时的 CHIR-99021(μM)、在实验开始时加入的BMP4(ng/ml)以及分化后第4 天通过流式细胞术测定的相应KDR水平(％)的列表。(B)针对所测试的各个条件(分化后第4天)的KDR水平(％)的图表。条件27、28和29是所测试的相同条件的一式三份。(C)显示将CHIR-99021(仅维持24小时)鉴定为在分化的第4天达到更高KDR水平的显著因子(P＝0.0005)，如使用 MODDE软件所鉴定。Act＝激活素A；CHI＝CHIR-99021，持续24h， CH2＝CHIR-99021，持续24-48h；BMP＝BMP4。计算的P值在图表下方显示。 (D)显示由MODDE软件生成的模型统计的计算总结，显示概率得分R2＝0.56， Q2＝0.24，模型有效性>0.3和再现性得分>0.9。
图7显示不同hPSC系的微载体聚集体培养物的图像。在连续搅动下在 iPSC-球体TM上扩增的9个不同hPSC系的第7天的图像。标尺＝1000微米。
图8显示不同hPSC系的G-带核型分析结果。本实验中使用的不同hPSC 系(D5、D9、D11、D12、X13、hES-3、BR2和BR7)的G-带核型的代表性图像。在每个系的20个G-带中期计数中没有检测到大体核型异常。
图9显示描绘造血特异性标志物表达的实时RT-PCR分析结果的柱形图。使用优化的条件以及5、10和15μM(图例)的CHIR-99021剂量来分化来自9个不同系(D5、D9、D11、D12、X13、BR2、BR7、IMR90和hES-3) 的连续搅动hPSC-MC聚集体培养物。第4天采用RT-PCR评价CD31、SCL、 GATA2、RUNX1和LMO2的表达水平。报道了相对于未分化细胞(在分化前第7天的hPSC-MC聚集体)的表达倍数变化。数据为平均值±SEM，n＝3。
图10显示KDR和T-bra水平与造血前体细胞倍数扩增之间的相关性分析的箱线图结果。通过流式细胞术评价使用优化条件分化的9种不同人多能干细胞系(hPSCs)和3种不同CHIR-99021剂量(5、10和15μM)的第7天人多能干细胞-微载体(hPSC-MC)聚集体培养物的T-bra(分化后第2天)和 KDR(分化后第4天)表达。分化细胞在甲基纤维素培养基中扩增为造血前体细胞持续14天，并测定倍数扩增。对于每个测试的细胞系，将T-bra表达细胞分组为<15％T-bra+或>15％T-bra+，并且将KDR表达细胞分组为<10％ KDR+或>10％KDR+，并且绘制造血前体细胞的相应倍数扩增。注意，hES-3 和IMR90分离为T-bra<10％/T-bra>10％和KDR<5％/KDR>5％，而X13分离为T-bra<35％/T-bra>35％和KDR<35％/KDR>35％。
图11显示免疫印迹，说明在分化的成红细胞中检测不同血红蛋白亚型的结果。用对α(alpha)、β(beta)、γ(gamma)、ε(epsilon)人血红蛋白亚型和管家对照人β-肌动蛋白有特异性的抗体对从D9、BR7和IMR90(分化后第35天)分化的成红细胞的细胞裂解物进行免疫印迹。将来自外周血(PB) 和脐带血(CB)衍生的成红细胞的细胞裂解物作为对照。白线区分合并在一起的凝胶图像的区域。
图12显示描绘了当用BMP4方案分化时，连续搅动微载体聚集体具有降低的分化的数据。(A)显示柱形图，其描绘了在微载体上培养、最初在静态条件下扩增7天或在多能扩增阶段的搅动条件下(3或7天搅动的人多能干细胞(hPSC)扩增)的hES-3聚集体的多能性标记物(Oct-4、Tra1-60、SSEA-4) 的流式细胞术分析结果。(B)显示柱形图，其描绘了从最初在微载体上培养、在静态条件、3天搅动或7天搅动下的hES-3细胞分化的T-bra(分化后48小时)和KDR(分化后4天)的流式细胞术的分析结果(与静态hPSC扩增条件相比，*p<0.05，#p<0.001)。(C)显示描绘了实时RT-PCR数据的柱形图，所述数据显示早期造血特异性标志物(CD31、GATA2、GATA1、SCL、RUNX1) 从分化4天的hES微载体聚集体(最初衍生自静态培养物，3天搅动培养物或7天搅动培养物)的表达(相对于未分化的hES-3)的平均倍数变化,作为造血特异性的表征(与静态hPSC扩增条件相比，*p<0.05；#p<0.001)。数据表示为相对于未分化hES-3表达的平均倍数变化，n＝3。(D)显示hES-3微载体聚集体的图像。呈现hES-3微载体聚集体的第0天图像，随后是静态培养7 天或搅动培养3和7天。在基于甲基纤维素的培养基中扩增后第2天和第14 天的造血前体细胞图像。(E)显示由从衍生自静态和3或7天搅动培养物的 hES-3-微载体(MC)聚集体分化的造血前体细胞(在BGM培养基中初始接种1×105个细胞后第14天)和成红细胞(在成红细胞扩增培养基中接种后第 14天)的总计数的柱形图(与静态hPSC扩增条件相比，#P<0.001)。(F)显示在实验结束时(第28天)的成红细胞沉淀的图像。
图13显示实验设计(DoE)分析的结果，其鉴定CHIR 99021为在连续搅动下扩增的hES-3微载体聚集体培养物的分化中增加KDR表达的显著因子。 (A)表格显示在实验开始时针对由MODDE软件产生的多因子条件，激活素 A(ng/ml)、维持24小时的CHIR99021(pM)、48小时的CHIR99021(pM)、在第3天加入的SB-431542(pM)和实验一开始加入BMP4(ng/ml)的浓度，以及分化后第4天通过流式细胞术测定的相应KDR水平(％)。(B)显示所测试的相应条件(分化后第4天)的KDR(％)水平的散点图。(C)显示 MODDE软件的数据，其中CHIR(仅维持24小时)被鉴定为在分化的第4 天达到较高KDR水平的显著因子。Act＝激活素；CHI＝CHIR持续24小时， CH2＝CHIR持续24-48小时；SB＝SB-431542；BMP＝BMP4；CHI*CH2＝CHI 和CH2之间的相互作用。(D)显示由MODDE软件生成的模型统计的计算总结，显示R2的概率得分(显示模型拟合；>0.5表示显著拟合的模型)，Q2(表示未来预测精度的估计，Q2>0.1表示显著模型，且>0.5表示良好模型)，模型有效性(是不同模型问题的测试，<0.25表示统计上显著的模型问题)和可重复性(是与总可变性相比的重复的变化，>0.5表示保证)。
图14提供进一步的数据，显示多因子分析的实验设计将CHIR99021鉴定为在连续搅动下扩增的O-阴性人诱导多能干细胞(hiPSC)微载体聚集体培养物的分化中增加的KDR表达的重要因子。(A)显示在实验开始时针对由 MODDE软件产生的多因子条件，激活素A(ng/ml)、维持24小时的CHIR99021 (pM)、48小时的CHIR99021(pM)、在第3天加入的SB-431542(pM)和实验一开始加入BMP4(ng/ml)的浓度，以及分化后第4天通过流式细胞术测定的相应KDR水平(％)的表格。(B)显示所测试的相应条件(分化后第 4天)的KDR(％)水平的散点图。(C)显示MODDE软件将CHIR(仅维持24小时)鉴定为在分化的第4天实现更高KDR水平的显著因子。Act＝激活素A；CHI＝CHIR持续24小时，CH2＝CHIR持续24-48小时；SB＝SB-431542； BMP＝BMP4；CHI*CH2＝CHI和CH2之间的相互作用。(D)显示由MODDE 软件产生的模型统计的计算总结的结果，显示R2的概率得分(显示模型拟合；>0.5表示显著拟合的模型)，Q2(表示未来预测精度的估计，Q2>0.1表示显著模型，且>0.5表示良好模型)，模型有效性(是不同模型问题的测试， <0.25表示统计上显著的模型问题)和可重复性(是与总可变性相比的重复的变化，>0.5表示保证)。
图15显示表明BMP4、激活素A和Wnt信号传导的调节显著改善了在连续搅动下扩增的O-阴性hiPSC微载体聚集体培养物的中胚层诱导、成血管细胞扩增和成红细胞分化的结果。(A)是显示测试的选定条件(由MODDE软件产生)和在指定时间点通过流式细胞术测定的它们相应的T-bra水平(％) 的表格。(B)显示描绘针对所测试的选定条件在分化后4天测定的KDR(％) 的流式细胞术水平的柱形图。(C)是显示分化后4天选择的造血特异条件(CD31、SCL、RUNX 1)的实时RT-PCR表征结果(与条件7相比，*p<0.05) 的柱形图。数据表示为相对于未分化细胞表达的平均倍数变化，n＝3。(D)呈现对于测试的选定条件在甲基纤维素培养基中扩增后4天、10天和17天的成血管细胞扩增图像。报道了成血管细胞的相应倍数扩增(第17天，与最初接种相比)和微载体聚集体的CD31、SCL和RUNX1标志物的倍数上调(第4 天，与第0天相比)。(E)显示描绘对于选定条件从第0天至第34天的总细胞扩增的线图。第0-4天(微载体聚集物的中胚层诱导)，第4-17天(在甲基纤维素中的成血管细胞扩增)，第17-34天(在悬浮培养物中的成红细胞扩增)。
图16显示来自优化分化条件的O-阴性成红细胞的评价结果。(A)显示柱形图，其中确定了使用不同条件(在中胚层诱导阶段中)分化的O-阴性供体iPSC(供体#5)的总存活细胞数的累积倍数扩增。来自实验第34天条件7 和18的相应红血球沉淀。(B)显示总结使用条件7和18衍生的成红细胞的实验的第34天的成红细胞表面标志物(CD235a和CD71)、胎儿血红蛋白(HbF) 和总存活细胞产量的流式细胞术表达(％)的表格。报告用于条件7和18之间比较的相应p值。(C)是总结通过RT-PCR测定成人红血球、hES-3衍生的成红细胞和O-阴性hiPSC衍生的成红细胞的血红蛋白亚型的表达图(胚胎；ε链，胎儿；γ链，成人；β链)。(D)显示在终末成熟条件(E成核1-3) 下、在扩增培养基(Expansion)中培养的O-阴性诱导多能干细胞(iPSC)衍生的成红细胞或在培养后2周和3周表达CD235a和DRAQ5的流式细胞仪的数据。用同型抗体染色的成红细胞用作同型对照。去核百分比的图示(CD235+ 和DRAQ5-成红细胞的平均百分比，数据为平均值±SEM，n＝3)。(E)显示在终末成熟条件下培养3周的成红细胞用抗人CD235a-FITC抗体和DRAQ5 染色图像。显示代表性的明场图像，CD235a(FITC通道)、DRAQ5(CY5通道)的荧光图像以及CD235a和DRAQ5的合并荧光图像。白色箭头表示去核的(DRAQ5-)CD235a+RBCs。黄色星号表示经历去核的晚期成红细胞。原始放大率X40。
图17显示描绘最初在连续搅动下扩增的不同hPSC微载体聚集体培养物(一条人胚胎干细胞系，一条商业hiPSC系，七条O-阴性hiPSC系)的分化的数据。(A)总结在连续搅动7天扩增的九种不同hPSC微载体聚集体系的表格。通过流式细胞术检测Oct-4、Tra1-60和SSEA4的多能性。选择的系通过G-显带进行核型分析，发现没有异常克隆。报道了连续搅动培养7天后微载体聚集体的平均倍数扩增和聚集体直径(微米)。通过RT-PCR测定未分化hPSC微载体聚集体的IGF-2mRNA水平(相对于hES-3)。(B)显示CHIR99021 剂量(pM)对不同hPSC微载体聚集体培养物分化后14天的成血管细胞的平均扩增倍数的影响(对于每一系，与5pM CHIR99021剂量相比，*p<0.05， **p<0.01；每一系的15pM CHIR99021剂量与每一系的15pM CHIR99021剂量X13比较时，#p<0.05)。(C)显示柱形图，表示CHIR99021剂量(pM) 对不同hPSC微载体聚集体培养物分化后14天衍生的成血管细胞群中CD43+ 细胞的百分比的影响(与每一系的5pM CHIR99021剂量相比，*p<0.05， **p<0.01；每一系的指定CHIR99021剂量与每一系的15pM CHIR 99021剂量 X13比较时，#p<0.001)。
图18显示衍生自连续搅动培养物的微载体人多能干细胞(hPSC)聚集体的悬浮培养物分化的结果。(A)是人多能干细胞微载体聚集体培养物的悬浮培养物分化示意图。在6孔超低附着板中连续搅动5-7天的人诱导多能干细胞 (hiPSC)微载体聚集体培养物在静态条件下分化为胚状体(EB)持续3天，与微载体分离并进一步分化为单细胞悬浮培养物(静态条件)持续17-21天。 (B)是显示在指定人多能干细胞系分化后测定总活细胞数的累积倍数扩增的柱形图。在实验的第29天，来自不同人多能干细胞系的相应红血球沉淀。(C) 为总结针对不同hPSC系的成红细胞在实验第29天成红细胞表面标志物 (CD235a)、胎儿血红蛋白(HbF)的流式细胞术表达(％)和存活细胞数的累积倍数扩增。
图19显示人胚胎干(ES)细胞/诱导多能干细胞(iPSC)向外胚层、内胚层和中胚层谱系分化的潜能示意图。图像取自Zacharoula Konsoula MATER METHODS 2013；3:166。
图20显示与红血球类型和从指刺血衍生的红血球有关的信息。(A)示意图显示从指刺血衍生人诱导多能干细胞(iPSCs)。将来自10μl指刺血的成红细胞在体外扩增12天，并且用表达OCT4、KLF4、SOX4、c-MYC(OKSM) 的仙台病毒(Sendai virus)转导。hiPSC可在转导3周内衍生。图像取自Tan HK Stem Cells Trans Med 2014,3:586-598。(B)示意性显示ABO血型，红血球表面上的抗原表达和血浆中的抗体。O型血液在其表面缺乏A和B抗原，因此可用作通用供体。
图21显示使用常规胚状体(EB)方法和微载体-EB方法进行红血球(RBC) 分化的示意图。图像取自Sivalingam et al.,Tissue Eng Part C Methods.2016Aug； 22(8):765-80。分化过程包括多能干细胞扩增，胚状体(EB细胞/中胚层)诱导，成血管细胞形成和成红细胞扩增以及终末成熟。在常规方法中，hiPSC作为单层培养物在Geltrex包被的平皿上培养，而在微载体途径中，hiPSC作为搅动悬浮培养物在重组人LN-521包被的Solohill微载体上用mTeSR培养基培养7天。常规方法诱导中胚层包括通过单细胞接种到AggreWell 800平板上来形成胚状体，然后机械收获胚状体并转移到悬浮培养物中，而微载体方法简单地包括将微载体簇从生长培养基转换到中胚层诱导培养基中。成血管细胞扩增阶段涉及在含有细胞因子的甲基纤维素基培养基中生长12-17天。通过酶处理分离来自常规方法的胚状体以衍生用于成血管细胞接种的单细胞，而由微载体方法形成的胚状体可以通过温和的移液简单地分离。红系扩增和终末成熟阶段是这两种方法所共有的，并且包括在造血扩增培养基中对红系祖细胞进行悬浮培养长达14天，然后通过在人间充质干细胞(MSC)饲养层上共培养对终末成熟进行再诱导14-21天。图像显示从各个分化阶段衍生的血红蛋白化红血球的红血球沉淀特征。通过常规方法分化的细胞在成红细胞扩增和终末成熟阶段未扩增。
图22显示描绘了本文公开的悬浮搅动分化方案在摇瓶中衍生少量红血球以及在受控的搅拌釜式生物反应器中扩大分化的每个阶段(多能细胞扩增、中胚层诱导和造血诱导以及成红细胞扩增)以获得足够数量的红血球用于获得可输注单位的红血球的潜力的实例的示意图。
图23显示使用基于BMP4或CHIR的方案从静态和搅动条件分化 hES-3MC聚集体。(A)显示在静态或搅动条件下扩增7天然后通过流式细胞术评价其多能性并分化的hES3微载体聚集体的显微照片图像，并使用(B) 显示经受基于BMP4或基于CHIR的分化方案并在BGM中扩增14天以衍生造血前体的细胞的图像。(C)显示描绘造血前体细胞(在最初接种3×105细胞后在BGM培养基中扩增后第14天)和成红细胞(在成血红细胞扩增培养基中接种后第12天)的总数的柱形图。对于比较BMP4-搅动组与所有其他组， *p<0.05。(D)显示在第32天分化的红血球(RBC)沉淀和每个接种的人多能干细胞的红系细胞产量的图像。对于比较BMP4-搅动组与所有其他组， P<0.05。数据均为平均值±SEM，n＝3。
图24显示描绘供体5O-neg人诱导多能干细胞-微载体(hiPSC-MC) 搅动培养：对于选定条件(从DoE多因子研究鉴定)从第0天至第56天的累积倍数扩增的结果图像和柱形图。所有数据均为平均值±SEM，n＝3。在分化的第1天或第2天使用的相应条件的细胞因子和小分子的浓度如下表所示。显示条件7和18的实验第34天的红血球沉淀。
图25显示9个不同人多能干细胞(hPSC)系在blast生长培养基中平均扩增造血前体细胞持续2周的结果。(A)显示9个不同的人多能干细胞 (hPSC)系的柱形图，这些人类多能干细胞系最初在微载体(MC)上、在搅动条件下培养(D5、D9、D11、D12、X13、BR2、BR7、IMR90、hES-3)，并且用不同浓度的CHIR99021(5、10和15μM)进行分化。(B)显示了示出9个不同系在分化的第42天的CD235a+ve红系细胞和胎儿血红蛋白(HbF) 表达细胞的百分比(％)以及相应的累积倍数扩增的表。用“^”表示的细胞系在成红细胞扩增阶段未扩增。
图26显示两个示意图。(A)是取自Olivier等(Stem Cell Trans Med；2016； 5:1–12)的示意图，说明本领域公开的用于衍生红系细胞的分化方案。该示意图表示通过添加小分子增强了hPSC的无饲养层和无血清的红系分化。使用的缩写：BMP，骨形态发生蛋白；EB，胚状体；EPO，促红细胞生成素；FGF，成纤维细胞生长因子；Flt3L，Flt3-配体；hPSC，人多能干细胞；HSPC，造血干细胞和祖细胞；IBIT，IMDM+牛血清白蛋白、胰岛素、转铁蛋白；IBMX，异丁基甲基黄嘌呤；IGF，胰岛素样生长因子；IL，白介素；RBC，红血球； SCF，干细胞因子；TPO，血小板生成素；VEGF，血管内皮生长因子165。(B) 是用于本文公开的方法与现有技术的方法之间的直接比较的示意图。现有技术中公开的方法与目前要求保护的方法之间的差异是，例如，本文公开的方法使用人诱导多能干细胞(hiPSC)的微载体培养物和微载体-hiPSC作为胚状体(EB)用于中胚层诱导。此外，本文公开的方法的所有步骤在连续搅动下在悬浮培养中进行。此外，针对本文公开的中胚层诱导的第0天和第1天的条件，成红细胞扩增培养基、成熟培养基条件与Olivier等人描述的不同。
图27O-neg hPSC在6孔超低附着(ULA)板中的连续搅动悬浮培养分化。 (A)是悬浮培养连续搅动分化过程从hiPSC到成红细胞阶段的示意图。框区分Olivier等人的方案。将人诱导多能干细胞(hiPSC)在层粘连蛋白-521包被的Solohill微载体上培养7天，然后用于在6孔超低附着板中分化。第3天 hPSC-MC聚集体衍生的单细胞从第9天至第21天扩增并分化为成红细胞。(B) 显示表明在分化2种不同的O-neg hiPSC系(D12和D5)后测定总活细胞数的累积倍数扩增的数据，并且显示相应的血红蛋白化细胞沉淀。(C)是总结来自分化的第35天的分化细胞的流式细胞术表征的表格。显示在第35天红细胞特异性标志物CD235a、CD71、CD36和胎儿/成人血红蛋白表达的百分比以及骨髓单核细胞标志物(CD14、CD15)和造血干细胞的标志物(CD133， CXCR4)以及累积倍数扩增。
图28显示O-neg人诱导多能干细胞(hiPSC)在摇瓶中连续搅动悬浮培养分化的结果。(A)是显示在连续搅动下在6孔超低附着板中扩增和分化的hPSC-MC聚集体的图像的示意图。将衍生自第3天人类多能干细胞-微载体(hPSC-MC)聚集体的单细胞在摇瓶中扩增并分化为成红细胞。(B)显示在8个不同的人诱导多能干细胞系(D12、D9、BR7和X13是O-neg人诱导多能干细胞)分化后总存活细胞数的累积倍数扩增的结果。(C)显示沉淀的图像。8个不同的人诱导多能干细胞全都能分化为血红蛋白化成红细胞。(D) 显示表示细胞密度和存活力的线图，其在从第18天至第26天的成红细胞扩增期间监测。对于人诱导多能干细胞系D9，在1×107细胞/ml(1e7细胞/ml) 的细胞密度，从第23天至第26天注意到生存力和总细胞数的降低。在第23 天和第24天(如箭头所示)，人诱导多能干细胞系X13的完全培养基变化允许细胞密度大于1.2×107细胞/ml(1.2e7细胞/ml)。(E)显示总结在培养的第 23天(和X13培养的第26天)的剩余葡萄糖水平和累积的乳酸和氨水平的表。
图29显示单一O-neg hiPSC系(X13)在旋瓶中的连续搅动悬浮培养分化的结果。(A)是显示hiPSC系在旋瓶中在连续搅动下的扩增和分化的示意图。(B)显示多能标志物Oct-4、Nanog、Tra1-60和SSEA4在旋瓶中扩增7 天后的流式细胞术表征以及中胚层分化第1天和第3天中胚层标志物T-Bra 和KDR的表达的结果。(C)显示描绘在造血诱导阶段期间第7至16天的CD34 和CD43标志物的流式细胞分析表征的柱形图。(D)是显示在多能扩增、中胚层诱导、造血诱导和红系扩增期间总存活细胞数的累积倍数扩增的线图。(E) 是分化第27天15ml falcon管中的血红蛋白化红血球沉淀的图像。(F)是总结在分化第27天的最大细胞浓度、总细胞来源、使用的培养基、乳酸和氨产生以及葡萄糖消耗的表。(G)是显示来自分化第27天的分化细胞的Giemsa 染色图像。箭头表示自发去核的红血球。
图30显示表示在本文公开的方法的一个实施方案的示意性时间线。进行实验设计(DoE)研究以鉴定搅动的人多能干细胞-微载体(hPSC-MC)培养物的最佳中胚层诱导的条件。为了中胚层的诱导，用BMP4、VEGF和bFGF 分化静态培养物，而在中胚层阶段用BMP4、VEGFA、bFGF±激活素A、 CHIR99021分化搅动的培养物。造血前体细胞扩增、成红细胞扩增和成熟都是在静态条件下进行的，培养基详见附图中的各个部分。
图31显示成红细胞和OP9细胞在旋瓶中微载体上的悬浮搅动共培养的示意图。
图32显示脐带血(CB)成红细胞去核的评价结果。左上：OP9微载体(MC) 聚集体的低放大率明场图像。中上：脐带血成红细胞在没有任何共培养的情况下成熟3周的Giemsa染色。右上：脐带血成红细胞(无OP9共培养)与膜联蛋白V和DRAQ5的流式细胞术评价显示显著的凋亡细胞(膜联蛋白V+)。左下：在静态条件下将OP9微载体聚集体与脐带血成红细胞共培养。中下：与OP9微载体聚集体共培养3周后脐带血成红细胞的Giemsa染色。右下：脐带血成红细胞(有OP9-微载体共培养)与膜联蛋白V和DRAQ5的流式细胞术评价显示显著的非凋亡去核细胞(膜联蛋白V-DRAQ5-)。
图33显示描绘在不同条件下脐带血(CB)成红细胞去核的优化的柱形图。脐带血成红细胞在以下条件下进行终末成熟3周：无OP9共培养，2D(单层) OP9共培养，2D Warton’sJelly衍生的人MSC(WJ1)共培养，0.4μm跨孔板中OP9单层共培养，在静态下3D-OP9(OP9-MC聚集体)共培养，在搅动条件(75rpm)下3D OP9共培养和在摇床(50rpm)下3D OP9共培养。(A) 显示描绘膜联蛋白V阴性DRAQ5-(非凋亡去核的)红血球的百分比的柱形图：(B)显示每周通过流式细胞术评价的膜联蛋白V阳性(凋亡)细胞的百分比的柱形图。*p<0.05，***p<0.001。
图34显示由人诱导多能干细胞(hiPSC)成红细胞去核的评价得到的数据。左上：hiPSC成红细胞(无OP9共培养)与膜联蛋白V和DRAQ5 的流式细胞术评价显示显著的凋亡细胞(膜联蛋白V+)。右上：人诱导多能干细胞(hiPSC)成红细胞在没有任何共培养的情况下成熟3周的Giemsa染色。左下：hiPSC成红细胞(有OP9-微载体共培养)与膜联蛋白V和DRAQ5 的流式细胞术评价显示显著的非凋亡去核细胞(膜联蛋白V-DRAQ5-)的百分比。框区分去核的和非凋亡的细胞群。右下：与OP9-MC聚集体共培养成熟3周的hiPSC成红细胞的Giemsa染色显示显著更多的去核细胞。
图35显示在不同条件下对人诱导多能干细胞(hiPSC)成红细胞去核的优化得到的数据。在以下条件下，HiPSC成红细胞进行终末成熟3周：无OP9 共培养，2D(单层)OP9共培养，在静态条件下3D OP9(OP9-微载体(MC) 聚集体)共培养和在搅动条件下(75rpm)3D OP9共培养。(A)显示膜联蛋白V阴性DRAQ5-(非凋亡去核的)红血球的百分比。(B)显示每周通过流式细胞术评价的膜联蛋白V阳性(凋亡)细胞的百分比。*p值与无OP9共培养相比，#p值与2D OP9共培养相比。(C)显示hiPSC成红细胞在没有任何共培养(无OP9)、与单层OP9共培养(2D OP9)、在静态条件下与3D OP9-MC 共培养(OP9-MC静态)和在搅动条件下3D OP9-MC共培养(OP9-MC搅动) 的情况下成熟3周的Giemsa染色图像。膜联蛋白V和DRAQ5的代表性流式细胞术图显示如下。
图36显示用非织造织物(NWF)过滤而富集去核红血球的结果。(上) 膜联蛋白V和DRAQ5对于人诱导多能干细胞(hiPSC)成红细胞在通过NWF 过滤器富集之前和之后的流式细胞术图。框区分非凋亡去核红血球。(下)如下显示富集前后细胞的相应Giemsa染色。
图37显示描绘对中胚层诱导有效的各种Wnt通路激活剂的筛选结果的柱形图。(A)是显示两种不同浓度的七种Wnt通路激活剂(BIO、SB-216763、 CHIR98014、抑制剂VIII、Kenpaullone、DRF053二盐酸盐和Wnt3a)的柱形图，它们选自文献综述并以CHIR99021作为对照筛选所公开的造血分化方案。在各种Wnt通路调节剂处理后24小时，将微载体上的X13诱导的多能干细胞(iPSCs)的存活力制表。在用各种化合物处理的X13的细胞活力之间没有显著差异(p>0.05)，除了在CHIR98014的10μM(p＝0.02)观察到显著降低的活力。(B)是显示中胚层诱导的百分比的柱形图。为了研究Wnt通路调节剂对于中胚层诱导的效力，使用流式细胞术分析24小时时T-bra(T-brachyury) 表达细胞的百分比和72小时时KDR+PDGFRα-(激酶插入结构域受体；血小板衍生生长因子受体)细胞群。24小时后，发现与对照(p<0.05)相比，所有条件下的T-bra表达均显著更低。在72小时，当与其他Wnt通路调节剂相比时，对照的KDR+PDGFRα-群体保持显著最高(最高p值为1.6×10-5)。与其他Wnt通路调节剂相比，两种抑制剂(5μM的SB-216763和1μM的 CHIR98014)能够诱导更高的T-bra表达。
图38显示源自静态或搅动培养并用基于BMP4或基于CHIR的方案分化的hES-3微载体聚集体的图像和毛细管Western Blot分析结果。第7天使用 BMP4方案(50ng/ml BMP4)或优化的基于CHIR的方案(30ng/ml BMP4， 40ng/ml激活素A和15μM CHIR)对来自静态或搅动条件的hES-3-MC聚集体进行分化。使用自动Capillary Western Blot系统(Peggy Sue)分析在分化开始前(0小时)和分化开始后24小时的细胞裂解物中涉及Wnt/β-连接素(catenin)信号传导(T-BRA、TCF-1和LEF-1)和BMP4信号传导(SMAD7、 SMAD1和磷酸SMAD1/5)的蛋白质。包括GAPDH作为蛋白加样对照的所有样品平行运行。(A)是显示以带强度表示的数字化化学发光信号的图像。指示了检测蛋白质的相应分子量。垂直蓝线区分合并在一起的数字化凝胶的区域。(B)Wnt/β-连接素信号传导和(C)BMP4信号传导中涉及的蛋白质的化学发光强度(表示为GAPDH表达的百分比)的图示。所有数据均为平均值±SEM，n＝2，*p<0.05。
图39显示与未搅动的静态培养物相比人多能干细胞(hPSC)在搅动的微载体(MC)培养物中的扩增导致减少的基于BPM4的造血分化的结果。(A) 显示整个分化过程示意图，从人多能干细胞(hPSC)在微载体上扩增开始(MC；在静态/搅动下)至造血前体细胞和成红细胞的分化和扩增，然后是终末成熟。所有后续步骤均在静态条件下进行。(B)显示静态7天或搅动培养3天和7 天后hES-3微载体聚集体的图像。柱形图显示了总结(C)多能性标记物(hPSC 扩增后3天或7天)，(D)T-Bra(分化后48小时)和KDR(分化后4天)在多能扩增阶段期间最初在静态(静态hPSC扩增)或搅动(搅动的hPSC扩增 3天或7天)条件下扩增的hES-3-MC聚集体中的表达的流式细胞术评价结果。 *p<0.05；#P<0.001，与静态人多能干细胞(hPSC)扩增条件相比。(E)显示描绘实时RT-PCR数据的柱形图，其显示来自分化4天的hES-3微载体聚集体的早期造血特异性标志物(CD31、GATA2、GATA1、SCL、RUNX1)的表达(相对于未分化hES-3)的平均倍数变化。*p<0.05；#P<0.001，与静态人多能干细胞(hPSC)扩增条件相比。(F)显示在基于甲基纤维素的培养基中扩增后第2天和第14天的造血前体细胞图像。标尺＝1000微米。(G)显示柱形图，其表示从衍生自静态和3或7天搅动培养物的hES-3微载体聚集体分化的造血前体细胞(在BGM培养基中最初接种1×105细胞后第14天)和成红细胞(在成红细胞扩增培养基中接种后第14天)的总计数(与静态hPSC 扩增条件相比，#P<0.001)。(H)是总结了hES3-MC聚集体在分化后28天， CD235a+CD71+、总CD235a+和胎儿血红蛋白(HbF)表达细胞的流式细胞术表达(％)和存活细胞的总产量的表。显示用于在静态和搅动培养物之间进行比较的相应P-值以及在实验结束时(第28天)的成红细胞沉淀图像。所有数据均为平均值±SEM，n＝3。
图40显示hPSC衍生的成红细胞的功能特征和终末成熟的结果。(A)显示总结了MSC共培养18天后的P50值(hemox分析)、血红蛋白亚型相对于总血红蛋白的百分比(基于免疫印迹的光密度测量)和去核细胞的百分比 (CD235a+DRAQ5-)的表格。NA＝不可用；NIL＝未表达。(B)显示成人 RBC(●)、hES-3分化的成红细胞(■)和hiPSC分化的成红细胞D5(▲)、D9(▼)、X13(◆)和IMR90(○)的氧平衡曲线[氧合血红蛋白百分比与氧压力(mm Hg)。给出相应的p50值(平均值±SD，n＝2)。(C)显示从X13、 D5、D9、BR7、IMR90和hES-3(分化后第35天)分化而来的外周血(PB)、脐带血(CB)和成红细胞的细胞裂解物的Western Blot，其用对α、β、γ、ε人血红蛋白亚型有特异性的抗体和管家对照人β-肌动蛋白进行免疫印迹。白线区分合并在一起的凝胶图像的区域。使用Imagej软件进行免疫印迹带的光密度测量。基于光密度测量，显示用肌动蛋白加样对照归一化后的血红蛋白百分比(相对于表达的总血红蛋白)(平均值±SEM)。(D)显示培养于扩增培养基(第0天)或在终末成熟条件下与人间充质干细胞(MSC)共培养 18天(第18天)的hiPSC来源的成红细胞的CD235a和DRAQ5表达的流式细胞术评价结果。用同型抗体染色的成红细胞用作对照(第0天的插图FACS 图显示)。(E)显示人诱导多能干细胞(hiPSC)分化的成红细胞在间充质干细胞(MSC)共培养物上成熟18天后的Giemsa染色图像。箭头表示去核的红细胞。(F)显示终末成熟的人诱导多能干细胞(hiPSC)分化的成红细胞用抗-人CD235a-FITC抗体和DRAQ5染色的图像。显示CD235a和DRAQ5的合并荧光图像。在合并图像中，可将去核红血球鉴定为缺乏核染色的CD235a 阳性细胞。标尺＝20微米。
具体实施方式
O-阴性恒河猴因子D阴性(O-neg)血液是普遍的供体血型，被认为是用于紧急输血应用的有限且有价值的红血球(RBC)来源。由于人口老龄化和新出现的病毒和病原体的风险，未来预期的供应短缺已驱使倡议开发替代的和现成的通用供体血液来源。使用O-neghiPSC作为产生通用供体红血球的起始材料的潜力已经是长期持续的想法，并且最近已经被证实。hiPSC的无限增殖潜力以及它们分化成造血谱系4的潜力已经使这些细胞成为用于产生通用红血球的无限细胞来源。据推测，低至10个具有罕见血型的hiPSC克隆即可足以覆盖99％需要反复输血的人群所需的血型。随着高质量GMP级hiPSC的产生和建库技术的不断进步，大规模地衍生出临床级的通用RBC已成为未来的主要趋势。
已经提出了几种用于从hiPSC产生红血球的方法，并且这些方法可以广泛地分类为单层或胚状体(EB)介导的分化。大多数分化研究依赖于使用在平面2维(D)表面上扩增的hiPSC，其虽然对于小规模研究是可行的，但当需要扩大规模时变得受到限制。用无异源条件和限定条件开发的胚状体介导的分化方法可能更适合于未来的临床开发。然而，在悬浮培养中大规模生产胚状体的常规方法(例如通过强制聚集(forced aggregation))尚未成功证明。因此，仍需要进一步改进以使胚状体(EB超分化过程)适于扩大规模。
将hiPSC培养为3维(3D)聚集体或在限定的细胞外基质(ECM)包被的微载体(MC)上培养是扩大悬浮培养中hPSC扩增的可能手段。除hPSC 扩增外，胚状体阶段的扩大需要产生大小和质量一致的胚状体的手段。在本公开中，显示出当与常规基于BMP4的分化方案一起使用时，在多能扩增阶段期间持续搅动hPSC-MC聚集体最初显示对原条/中胚层标志物T-bra和KDR 的表达以及随后的造血分化具有负面影响。为了克服这种限制，使用多因子设计途径来鉴定可以提高来自搅动的hPSC-MC培养物的KDR阳性细胞产生的因子。结果表明，使用CHIR-99021联合BMP4和激活素A对Wnt/β-连接素信号传导的瞬时激活显著提高了从搅动的hPSC-MC培养物的中胚层诱导、造血分化和成红细胞分化。在一个实例中，本文显示在50天内从几种O-阴性人诱导多能干细胞系的红系分化和从造血前体细胞到成红细胞的高达60,000 倍的扩增。O-阴性成红细胞主要表达胎儿血红蛋白，并与原代人骨髓间充质干细胞共培养后可去核。所建立的MC-悬浮培养方法具有扩大人多能干细胞分化的扩增和中胚层阶段的潜力，可进一步发展用于红血球的大规模分化。
本文开发了基于微载体(MC)的悬浮培养平台，该平台可应用于人多能干细胞扩增和胚状体分化阶段的综合扩大规模，并证明人多能干细胞-微载体 (hPSC-MC)聚集体培养物在以基于BMP4的方案分化时可分化为造血前体细胞和成红细胞。
在此，发明人显示，在使用基于BMP4的方案分化时，与衍生自静态条件的培养物相比，人多能干细胞-微载体(hPSC-MC)聚集体在多能细胞扩增阶段期间的连续搅动阻止了原条/中胚层标志物T-bra和造血中胚层标志物 KDR的表达，以及随后的造血前体细胞和成红细胞分化。不受理论的约束，认为在扩增阶段由搅动引起的剪切应力可能是减少中胚层诱导的原因。使用多因子实验设计(DoE)途径，筛选了多种因子组合，针对其改进其在多能扩增阶段连续搅动产生的hPSC-MC-聚集体培养物对造血中胚层的诱导能力。例如，CHIR-99021(CHIR)——其为糖原合酶激酶3-β(GSK-3β)的选择性抑制剂和经典Wnt/β-连接素信号传导的有效激活剂，与BMP4和激活素A- -其为转化生长因子β(TGF-β)超家族信号传导途径的激活剂的组合，被鉴定为显著促进hPSC-MC聚集体培养物的KDR+细胞的发育以及随后的造血前体细胞和成红细胞分化。
暴露于GSK3-抑制剂(诸如举例而言CHIR)的剂量和时间对于促进早期中胚层诱导和随后的造血分化是关键的。使用例如针对CHIR的优化的组分剂量，证明了若干O-neg人诱导多能干细胞系的有效红系分化。所述微载体平台使得能够鉴定：在微载体上良好扩增的O-neg人诱导多能干细胞(hiPSC) 系，其为在悬浮培养生物反应器中的未来扩大规模所必需的标准；以及具有良好造血分化潜能的那些。这些是上游工艺开发向大规模工艺生产通用红血球发展的第一步。
本发明人先前已经报道了hES-3(hES系)-微载体聚集体的成功红系分化，所述hES-3使用基于BMP4的分化方案在搅动条件下最初扩增。然而，对分化同一系的重复尝试显示，当两种条件均使用基于BMP4的分化方案时，与在搅动条件相比，在静态条件下扩增微载体-聚集体时，显示出显著更好的红系分化(从2×105个造血前体细胞开始分别为0.25-7.3×107和0.004-4.2× 107个红系细胞)。试图分化最初在搅动条件下扩增的多个O-neghiPSC系也导致高度可变和差的红系分化(数据未显示)。不受理论的约束，这些观察似乎表明，由搅动诱导的剪切应力引起的抑制信号的累积可能对分化具有负面影响。认为在上述条件下和超过这些抑制信号的特定阈值时，搅动的HES-3MC 聚集体未分化。
衍生自搅动培养物的HPSC-MC聚集体的基于BMP4的分化显示造血分化降低
为了检验搅动条件可能是可变分化的主要因子的假设，使用基于BMP4 的分化方案，在静态(静态人多能干细胞(hPSC)扩增)或搅动(搅动人多能干细胞扩增)条件下最初扩增7天的hES-3在静态条件下分化。尽管细胞在静态培养物中作为大簇在微载体上生长并且在搅动培养物中作为均匀聚集体(直径大约400μm)生长(图1A)，但两种培养物均显示多能性标志物的类似表达(图1B)。然而，在分化开始后，原条/中胚层标志物T-bra[在静态与搅动的hPSC扩增培养物中，第2天T-bra：32.6±1.2％和0.50±0.02％ (p<0.0001)]和造血中胚层标志物KDR[在静态与搅动的hPSC扩增培养物中，第4天KDR：27.9±3.3％和1.1±0.12％(p＝0.001)]的表达有显著差异(图 1C)。在搅动hPSC扩增组中，指示造血分化的关键造血标志物的上调被显著阻止。RT-PCR分析表明，在静态hPSC扩增组而不是搅动hPSC扩增组分化后4天，CD31(一种早期血-内皮标志物)、GATA2、GATA1、SCL/Tal-1和 RUNX1的表达显著增加(图1D)。在随后的分化阶段，连续搅动的hPSC-MC 聚集体的作用最明显(图1D和E)，其中在搅动的hPSC扩增组中，分化2 周后没有观察到造血前体细胞扩增(每孔的总造血前体细胞：1.39×105±2.18 ×104)，而在静态hPSC-MC扩增组中，注意到显著的扩增(每孔总造血前体细胞：5.77×106±6.30×105，p＝0.0009)。同样地，与静态hPSC扩增组相比，在来自搅动的培养物中随后产生的成红细胞也严重受损(每孔的总成红细胞：分别为4.11±2.4×104与26.2±4.7×106，p＝0.005；总CD235a群体：0.51±0.1％与51.8±2.0％，p<0.0001)(图1E)。这些发现最初似乎证明在多能扩增阶段期间hES-3-MC聚集体的连续搅动负面地影响在KDR+细胞早期产生以及晚期红系阶段的随后分化过程。
常规中胚层分化方案依赖于在静态条件下衍生的人多能干细胞(hPSC) 聚集体/胚状体(EB)的使用。因此，用于诱导在静态条件下衍生的人多能干细胞的中胚层分化的培养基对于在搅动条件下衍生的人多能干细胞而言可能是次优的。鉴于当扩大搅拌釜式生物反应器中的分化过程时，搅动条件是重要的，因此寻求开发允许在搅动条件下衍生的hPSC-MC聚集体的有效中胚层分化和随后的红系分化的培养基制剂。这是进行实验多因子研究设计的基础，以改进初始中胚层诱导培养基，用于搅动条件下衍生的hPSC-MC聚集体的分化。对多因子条件的评价鉴定了，在分化的前24小时内包含最佳浓度的 CHIR99021对于在搅动条件下最初衍生的hPSC-MC聚集体的有效造血命运的中胚层诱导是关键的。
先前已经显示在早期分化阶段KDR表达增加与后期造血分化增加相关。因此，进行实验设计(DoE)多因子分析以鉴定可改善KDR+细胞从在搅动条件下扩增的hES-3-MC聚集体产生的初始中胚层分化条件。
使用
Figure BDA0002689216970000211
软件对不同剂量(和/或暴露持续时间)的在诱导中胚层和造血细胞分化中具有已知作用的细胞因子和小分子针对最初搅动下衍生的 hES-3MC聚集体培养物的分化进行了评价。设计DoE以研究BMP4(10-50 ng/ml)、激活素A(0至80ng/ml)、CHIR(在中胚层诱导开始后0至48小时，0-15μM)的作用。这些变量产生29个培养条件(图2A)，测试它们对KDR+ 细胞百分比(分化开始后4天)和造血前体细胞产生的后续阶段(在Blast生长培养基(BGM)中培养2周)的影响。BMP4水平(10至50ng/ml)和激活素A水平(0-80ng/ml)不显著改变KDR+细胞或造血前体细胞的产生。然而，CHIR暴露0至24小时导致KDR+细胞百分比的显著增加(P＝2.37E-07；图2B)以及造血前体细胞的产生(P＝1.01E-05)(图2C)。
与早期观察一致，单独的BMP4处理(条件1)导致非常低的KDR+细胞 (0.44％)，与用激活素A联合BMP4处理(条件2：1.07％)相同，而CHIR、激活素A和BMP4的组合(条件4)导致增加的KDR+细胞(18.5％)。重要的是注意，表达较高初始KDR+细胞群百分比的培养物分别导致较高数量的造血前体细胞[(总造血前体细胞/孔：分别为，高，3.85×105±3.72×104与1.82×105±3.79×104(>15％)和低(<5％)KDR+细胞种群；p＝0.001](图 2D)。
使用在搅动的微载体培养物中扩增的O-neg hiPSC系(D5)也证实了这些发现(图6)。对O-neg人诱导多能干细胞的DoE分析显示，激活素A(P＝0.02) 和CHIR暴露24小时(P＝0.0005)是分化后4天KDR+细胞增加的显著因子 (图6C)。总之，根据实验分析的设计，确定10至50ng/ml的BMP4剂量， 25至50ng/ml的激活素A剂量和6至12μM剂量的CHIR暴露24小时对于 KDR+细胞的产生是有效的。
CHIR对来自在搅动微载体培养中扩增的多能细胞的造血中胚层诱导、造血前体细胞和成红细胞生成的影响的验证
为了验证CHIR对在搅动的微载体培养物中扩增的多能细胞的造血分化效率的影响，使用BMP4/激活素A方案(非CHIR介导的)或CHIR介导的方案评价D5 O-neg hiPSC系(于搅动条件下、初始在微载体上扩增)的分化 (表1；根据图6中的实验条件的设计建立)。BMP4/激活素A方案导致非常少的原条/中胚层诱导，如在诱导后48小时T-bra+细胞百分比非常低 (6.66-8.36％)和在诱导后96小时低的造血中胚层诱导(KDR+细胞的 5.3-13.84％)所反映(表1)。这些条件还导致对造血转录因子SCL和RUNX1 的诱导非常低，并且在Blast生长培养基(BGM)中培养2周后几乎没有或没有造血前体细胞扩增，且随后不能作为成红细胞扩增(表1)。
表1-在搅动微载体培养物中扩增的多能细胞从中胚层诱导到成红细胞扩增的CHIR和非CHIR介导的分化的比较。使用由所选择的DoE条件鉴定的 CHIR和非CHIR介导的分化方案，对在搅动条件下最初扩增的O-neg hiPSC-MC聚集体(D5 hiPSC)进行分化。对于每种测试的条件，在指定的时间点通过流式细胞术测定表达T-bra和KDR的细胞的百分比。在分化后4天，通过实时RT-PCR测定早期造血特异性标志物(CD31、SCL和RUNX1)相对于未分化细胞的平均表达倍数变化。报道了在Blast生长培养基(BGM)中 14天后造血前体细胞的相应扩增倍数和第34天时成红细胞的累积扩增倍数。与条件#7相比的P-值示于括号中。
Figure BDA0002689216970000241
Figure BDA0002689216970000251
另一方面，用基于CHIR的方案调节Wnt/β-连接素信号传导导致高度原条/中胚层诱导(第2天46.9-89.6％T-bra+细胞)和高度造血中胚层诱导(第4 天18.63-29.43％KDR+细胞)。与添加CHIR的中胚层和造血前体细胞诱导的改善相一致，通过RT-PCR分析发现，分化后4天，CD31、SCL/Tal-1(造血调节因子)和RUNX1(造血调节因子)的诱导倍数更高，并且分化后17天的造血前体细胞扩增有所改善(表1)。暴露于高浓度CHIR持续48小时的条件#16具有较低的SCL诱导(p＝0.048，对比于条件#7)和RUNX1(p＝0.01，对比于与条件#7)和较差的造血前体细胞扩增(p<0.001，对比于条件#7)，且随后不能分化为成红细胞(表1)。随后，仅条件#7和#18导致显著的红系分化和扩增(第34天倍数扩增：分别为284.4±9.2和95.79±1.2；表1和图3)。在这些条件中，条件#7导致的成红细胞数目显著高于条件#18[9.77×107，相比于4.31×107细胞，分化后34天，p＝0.0003)(图3A)。此外，与衍生自条件#18的群体相比，从条件#7分化的成红细胞群体也具有较高百分比的红系细胞和胎儿血红蛋白(HbF)表达(图3B)。在分化的第34天，从条件 #7和#18成功分化的成红细胞可见地血红蛋白化(图3B)。考虑到条件#7实现较高的成红细胞倍数扩增和红系细胞的纯度，所有后续实验均根据条件#7 (50ng/ml激活素A，12μM CHIR，持续24小时，10ng/ml BMP4)。每当细胞密度超过2×106个细胞/ml，通过在新鲜培养基中以2.5×105个细胞/ml的密度重新接种，使用条件#7分化的成红细胞可以在连续培养的第56天实现 62343±15070的累积倍数扩增(与在第0天最初接种2×105个造血前体细胞相比)。
CHIR剂量的优化导致在搅动的微载体培养中扩增的不同人多能干细胞系的红细分化得到改善
在成功地将单个O-阴性(O-neg)人诱导多能干细胞-微载体(hiPSC-MC) 系(最初在连续搅动下扩增)分化为红系谱系，并瞬时暴露于12μM的CHIR 后，测试了七(7)个不同的O-neg hiPSC系(BR2、BR7、D5、D9、D11、D12、X13)、一(1)个市售hiPSC系(IMR90)和hESC系(hES-3)。所有 hPSC系成功地在微载体上在连续搅动下扩增7天(图7)，实现5.3至12.5倍的倍数扩增，平均聚集体直径范围为255至510μm(图4A)。多能标志物 Oct-4的表达范围为72.9至94.6％，Tra1-60的范围为84.8至93.5％，SSEA4 的范围为97.2至99.7％(图4A)。对本文所用的人多能系中的8种进行G显带核型分析，并发现它们全部是核型正常的(图8)。
使用3种不同的CHIR剂量(5、10和15μM，持续24小时)使从不同 hPSC系产生的人多能干细胞-微载体(HPSC-MC)聚集体分化，并通过流式细胞术评价T-bra(第2天)和KDR+PDGFRβ-(第4天)的表达，通过RT-PCR (第4天)、造血前体细胞扩增(第14天)和成红细胞扩增(第42天)评价关键造血转录因子的诱导。
对于所有测试的系，相比于5μM CHIR，15μM CHIR产生显著更高 (p<0.05)的T-Bra+细胞(D5：55.6±8.26％；D9:39±5.37％；D11:33.4± 4.10％；D12:10.6±2.78％；X13:60.9±8.55％；BR2:20.1±2.4％；BR7: 20.8±3.8％；IMR90:17.22±7.4％；hES-3:18±3.82％)(图4B)。
指示血管祖细胞(hematovascular)的KDR+PDGFRβ-细胞的表达反映了 T-bra+细胞的趋势。相比于5μM CHIR，15μM CHIR产生显著更高(p<0.05) 的KDR+PDGFRβ-细胞(D5:35.77±1.53％；D9:18.07±0.6％；D11:11.74 ±1.16％；D12:31.13±5.17％；X13:40.8±1.34％；BR2:24.07±1.34％； BR7:18.6±1.57％；IMR90:14.2±1.69％:hES-3:14.6±0.81％)(图4C)。在分化后第4天，通过RT-PCR评估分化细胞的造血诱导的CD31和关键造血转录因子SCL、GATA2、RUNX1和LMO2的表达示出，在大多数测试的系中，随着CHIR剂量的增加，上调倍数更高(图9)。在测试的不同hiPSC系中，X13在CD31、SCL、GATA2、RUNX1和LMO2的表达方面具有最高上调(图9)。
除了D9和IMR90(其甚至在5μM CHIR剂量下也具有造血前体细胞扩增)之外，相比于5μM CHIR，当用15μM CHIR剂量诱导时，所有其他人多能干细胞系在分化后第14天具有显著增加的造血前体细胞倍数扩增 (p<0.05)(D5：7.99±0.82；D11:3.2±0.33；D12:5.26±1.32；X13:9.93± 0.28；BR2:8.07±2.06；BR7:5.81±0.92；hES-3:6.97±1.35)(图4D)。在分化后14天扩增的分化细胞表达CD43，指示造血前体细胞(图4E)。对于测试的9个系中的7个(D5、D11、D12、X13、BR2、BR7和hES-3)，在第4 天，较高的初始KDR+细胞群(KDR>10％)导致2周后造血前体细胞扩增显著增加(图10)，而测试的9个系中的5个(D5、D11、X13、BR2、hES-3) 在分化的第2天的较高T-bra+细胞和造血前体细胞扩增增加之间具有正相关 (图10)。因此，在一个实例中，存在的CHIR的浓度为15μM。
将从第0天至第14天在blast生长培养基中扩增的造血前体细胞接种在成红细胞扩增培养基中以诱导成红细胞分化。细胞在分化后持续扩增直至第42 天，并计算累积倍数扩增。9个系中的六个(D5、D9、X13、BR7、IMR90、 hES-3)成功分化为成红细胞，而3个系(D11、D12、BR2)不能分化为红系细胞(图4F)。X13具有为12605±2126的最大累积倍数扩增，这显著高于其他测试的系[累积倍数扩增：D5；3712±1651(p＝0.03),D9；121.2±36.89 (p＝0.0042),IMR90；918.1±342.4(p＝0.0056),hES-3；324±83.97(p＝0.0045) 和BR7；31.48±7.7(p＝0.0041)](图4F；表2)。对于表现最好的细胞系， X13，每个接种的hPSC可以衍生7607±1016CD235a+红系细胞(表2)。具有可见地血红蛋白化的红色沉淀物的分化的成红细胞(图4G)具有CD235a 表达和高水平的HbF(表2)。
表2-九个人多能干细胞(hPSC)系的造血分化，从搅动微载体培养中的扩增到成红细胞扩增-该表总结了分化的不同阶段；用最佳剂量CHIR-99021 分化的多个hPSC-MC聚集系的hPSC扩增、中胚层诱导、造血前体细胞和成红细胞扩增。报道了在搅动培养7天后hPSC-MC聚集体的倍数扩增，在甲基纤维素培养基中培养14天后的造血前体细胞和在扩增培养基中培养24天后的成红细胞扩增。总结了中胚层诱导阶段第2天的％T-bra+细胞和第4天的％KDR+细胞、造血前体细胞扩增阶段的％CD43+细胞、成红细胞扩增阶段的％CD235a+细胞和胎儿血红蛋白表达的流式细胞术评价。将在第42天接种的每个hPSC的总红系细胞计算为在第4天接种的每个hPSC衍生的胚状体的数目*成红细胞倍数扩增*CD235a+成红细胞的百分比。
Figure BDA0002689216970000291
从O-阴性hiPSC分化出的成红细胞的终末成熟及功能表征
通过与原代人MSC共培养使O-neg成红细胞(D5)进行终末成熟，并对分化的成红细胞进行功能表征。RT-PCR评估血红蛋白亚型的表达显示，与成人成红细胞相比，O-neg成红细胞(D5红血球)具有α(33.13 ±5.16倍增加，p＝0.0034)、γ(1.31±0.33倍增加)、ε(279±43.89倍增加，p＝0.0032)血红蛋白的表达，但具有非常少的β(0.009±0.001倍增加，p<0.0001)血红蛋白的表达。hES-3衍生的成红细胞与成人成红细胞进行的类似比较显示较高的α、γ和ε血红蛋白，但较低的β血红蛋白 (图5A)。免疫印迹分析证实了在hES-3和D5分化的成红细胞中(图5B) 以及在其他hPSC系中(图11)中α、γ和ε血红蛋白的表达，几乎没有或没有β血红蛋白的表达。有趣的是，从BR7分化的成红细胞也显示β血红蛋白亚型的表达(图11)。从供体5人诱导多能干细胞(hiPSC)分化的三(3)个O-neg成红细胞系的氧平衡曲线分析显示相当的氧结合亲和力 (D5成红细胞-1：p50-14.7±0.8；D5成红细胞-2：p50-13.2±0.04；D5成红细胞-3：p50-13.8±0.6)，这与成人红血球(p50-19.6±0.2)显著不同 (p<0.01)，但与以前已显示与脐带血红血球类似的衍生自人ES系的成红细胞(hES-3：p50-13.4±0.1)相似(图5C)。通过在成熟培养基中与原代人MSC共培养19天的时间段使O-neg成红细胞终末成熟。流式细胞术分析显示，39.0±1.0％的成红细胞为CD235a+和DRAQ5(细胞可渗透核染料)阴性，指示去核的红系细胞(图5D)。这进一步通过对终末成熟的成红细胞进行免疫荧光染色(其显示缺乏核染色的CD235a+红细胞)(图5E) 和通过细胞的Giemsa染色(其显示更大比例的去核红细胞(图5F)，具有更长的成熟持续时间)来证实。
讨论
已经提出了基于胚状体(EB)的分化方法的若干变化，来将hPSC分化为红系细胞，但是到目前为止，没有一种显示出用于扩大规模的可行性。先前已经在用于心脏祖细胞分化的旋转培养平台和生物反应器中成功地将人多能干细胞-微载体(hPSC-MC)聚集体培养物扩大规模。因此，人多能干细胞-微载体(hPSC-MC)聚集体也具有开发大规模-红系分化过程的潜在用途。
人多能干细胞-微载体(hPSC-MC)聚集体悬浮培养物的体积扩大规模的必要条件之一是需要将连续搅动作为维持有效的氧质传递(oxygen and mass transfer)以及使细胞保持悬浮的手段。然而，本发明人已经观察到，在多能扩增阶段期间在连续搅动下扩增的hPSC-MC聚集体具有降低的中胚层和造血分化的潜力，即使它们的多能性水平相对不受影响。中胚层诱导的早期阶段涉及原纹标志物T-bra的表达，其是参与早期原肠胚形成的 T-box转录因子。随后，响应于VEGF信号传导的KDR+造血中胚层细胞出现并分化成造血祖细胞。hPSC-MC聚集体的搅动显示出导致严重降低的 T-bra和KDR的表达，以及降低的关键转录因子(如SCL33、38，GATA239 和RUNX134)的诱导，所述转录因子参与早期造血诱导。结果，当这些细胞用基于BMP4的方案分化时，红系分化严重减少(如果没有完全消除的话)。在不受理论束缚的情况下，认为由搅动诱导的剪切应力引起的分化抑制信号的建立可能导致观察到用衍生自搅动培养物的人多能干细胞- 微载体(hPSC-MC)聚集体差的分化。
先前已经报道了搅动在多能扩增阶段期间和在心脏分化期间的负面影响。认为剪切应力可诱导SMAD-7的表达，已知SMAD-7对中胚层分化初期由BMP4诱导的TGF-β信号传导通路的组分SMAD具有抑制作用。因此，搅动的培养物中BMP4信号传导的抑制可能是差的中胚层诱导和分化不良的可能原因。然而，假定先前已显示从连续搅动的hES-3微载体聚集体的分化，认为可能存在耐受由搅动剪切应力诱导的抑制信号的阈值效应，超过所述阈值，搅动的微载体聚集体无法分化。hES-3系的连续传代和/或批次间异质性的影响也可解释耐受搅动诱导的剪切应力和可变分化结果的差异。
鉴于在搅动hPSC扩增培养物中T-bra和KDR的发展受到负面影响，假设可以提高T-bra和KDR表达的初始中胚层分化条件可以提高造血分化的结果。事实上，以前的研究已经将较高百分比的KDR+细胞与增加的造血前体细胞产生相关联。进行的“设计实验”筛选确定，在分化的前24 小时期间CHIR的瞬时暴露是在分化的第4天增加KDR+细胞(来自在搅动条件下最初扩增的hPSC-MC聚集体)的显著因素。CHIR-99021激活经典的Wnt/β-连接素信号传导通路，并已显示诱导用于心肌细胞和造血分化的人多能干细胞(hPSC)的原条/中胚层发育。在由搅动的培养物衍生的人多能干细胞-微载体(hPSC-MC)聚集体中，Wnt信号传导通路的直接靶基因之一T-bra在瞬时暴露于CHIR后被显著上调，但在用基于BMP4 的方案分化时明显未被诱导。已经报道T-bra直接与BMP4信号传导的下游效应子SMAD1相互作用，用于适当的中胚层分化。此外，在经BMP4 处理的细胞中，已显示T-bra表达对于激活造血所必需的基因(如KDR和 LMO2)是必需的。因此，Wnt/β-连接素信号传导的激活可通过直接激活 T-bra表达并允许随后经历造血特化和最终红系分化的KDR+中胚层细胞的发育来绕过BMP4介导的信号传导所维持的抑制作用。如本文中所示，将较高百分比的KDR+细胞的初始产生与显著改善的经由多个hPSC系的分化而造血前体细胞产生相关联是可能的。
在本文所示的数据中，显示O-neg hiPSC有效分化为成熟红血球。不同O-neghiPSC系之间的分化效率差异可能归因于不同供体样品之间的固有遗传或表观遗传差异。用最佳地发挥作用的系，在培养的56天内显示高达60,000倍的细胞数目扩增。这转化为从2×107个造血前体细胞开始衍生出1×1012个红血球(RBC；相当于1单位红血球)。
已经考虑了在本文公开的方法可以转化为用于产生红血球(RBC)的常规方法之前需要的若干改进。首先，为了在生物反应器中扩大规模，必须对该过程进行改进，使得造血前体细胞分化和扩增的初期可以在液体悬浮培养中进行，而不是在半固体blast生长培养基中进行。其次，需要在搅动条件下展示多能扩增阶段、中胚层诱导阶段和造血扩增阶段的整个过程，以模拟搅拌釜式生物反应器(stirred tank bioreactor)中的条件。第三，必须开发用于培养强化的方法，使得可以常规地实现在1×108个细胞/ml范围内的高细胞密度。这将确保可以在10L生物反应器中产生一个单位的血液，具有更实用和成本有效的培养基利用。第四，胎儿血红蛋白(HbF)表达的问题必须被解决，因为胎儿血红蛋白表达红血球(RBC)的氧结合亲和力表现出类似脐带血红血球，而不是成人红血球。已经提出KLF-1和BCL11A的表达作为诱导血红蛋白从胎儿转换为成人的手段。在从已经测试的人诱导多能干细胞(hiPSC)系之一(BR7)分化的成红细胞中观察到β血红蛋白的蛋白表达，这使得有必要进一步研究表观遗传记忆的维持是否可以在β血红蛋白启动子的激活中起作用。最后，需要改进人诱导多能干细胞(hiPSC)分化的成红细胞的去核低效率。如目前所提出的，显示成红细胞在本文的情况下与原代人类间充质干细胞(MSC)共培养，给出正确信号，具有去核的潜能。进一步地，该方法的扩大规模需要开发用限定的培养基配方的去核方案。
总之，通过上游过程优化，本文提供了优化方案，其可以允许在连续搅动下最初扩增的O-neg hiPSC-MC聚集体的有效红系分化。这用作允许进一步开发可转化至悬浮培养生物反应器以用于扩大规模产生通用红血球(RBC)的过程的方法。
用于从O阴性人诱导多能干细胞产生红系细胞的可扩大规模的搅动悬浮培养分化平台的开发
先前已显示，通过使用用于初始中胚层诱导的由BMP4、激活素A和 CHIR组成的优化方案，在限定的细胞外基质(ECM)包被的微载体上在搅动悬浮培养下扩增的九种人多能干细胞(hPSC)中的六种可以有效地分化为红系细胞。除hiPSC在悬浮搅动条件下扩增外，所有其他剩下的阶段全都在静态条件下进行。此外，造血前体细胞从造血命运的中胚层细胞的初始扩增在基于半固体甲基纤维素的培养基中进行，这对于该过程的体积扩大规模是有挑战性的。
为了解决缺乏基于甲基纤维素的扩增方案的可扩大规模性的限制，如本文所公开的，开发一种分化方法，其可以以搅动悬浮培养形式从hiPSC 扩增阶段一直进行到红系扩增阶段，以便允许整个过程的体积扩大规模，并且使这些培养适合于扩大规模至受控生物反应器。将微载体扩增hiPSC 的最佳中胚层诱导条件和造血诱导条件的改进方法组合起来，以允许搅动悬浮培养物分化和成红细胞扩增。
因此，在一个实例中，公开了将多能干细胞分化为造血前体细胞的方法，其中所述方法在悬浮搅动下进行，并且其中在中胚层诱导阶段期间加入GSK-3抑制剂或Wnt通路激活剂。在另一个实例中，将多能干细胞分化为造血前体细胞的方法包括以下阶段：任选地多能干细胞扩增阶段；中胚层诱导阶段；造血诱导阶段；成红细胞诱导阶段；以及成红细胞成熟阶段。在又一个实例中，将多能干细胞分化为造血前体细胞的方法包括以下阶段：中胚层诱导阶段；造血诱导阶段；成红细胞诱导阶段；以及成红细胞成熟阶段。
如本文所用，术语“多能干细胞”是指具有分化成以下三个胚层中的任一个的潜能的干细胞：内胚层(内胃粘膜(interior stomach lining)、胃肠道、肺)，中胚层(肌肉、骨、血液、泌尿生殖系统)或外胚层(表皮组织和神经系统)。话虽如此，细胞多能性是连续体，范围从可以形成胚胎本身的每个细胞的完全多能细胞，例如胚胎干细胞和诱导多能干细胞，到可以形成所有三个胚层的细胞但可能不显示完全多能细胞的所有特征的不完全或部分多能细胞。多能干细胞可以是天然具有多能性的细胞，或者可以是已经以化学方式通过方法使其成为多能(即诱导多能性)的细胞。在一个实例中，多能干细胞是诱导多能干细胞。在另一个实例中，多能干细胞是人多能干细胞。在又另一个实例中，不使用涉及破坏胚胎的方法分离多能干细胞。
在一个实例中，多能干细胞附着于微载体。
本领域技术人员能够基于本领域已知的方法容易地确定细胞所处的阶段，所述方法例如，但不限于，阶段特异性细胞表面表达的标志物的使用、特定细胞类型的存在或不存在、发育因子的分泌等。例如，造血前体细胞是KDR+PDGFRα-造血前体细胞。
因此，在另一个实例中，中胚层诱导阶段导致在来自多能干细胞扩增阶段的多能干细胞中诱导中胚层形成，产生KDR+PDGFRα-造血前体细胞。在另一个实例中，造血诱导阶段导致来自中胚层诱导阶段的造血前体细胞的扩增，产生CD34/CD43/CD45造血祖细胞。这种扩增可以是例如10至 100倍的扩增。在又另一个实例中，成红细胞扩增阶段导致来自造血诱导阶段的造血祖细胞的扩增，产生CD235a+CD71+成红细胞。这种扩增可以是例如50至1000倍的扩增。在一个实例中，成红细胞成熟阶段导致来自成红细胞扩增阶段的成熟的CD235a+成红细胞的终末成熟和去核，产生去核的CD235a+成红细胞。在另一个实例中，通过选自但不限于DRAQ5 (DRAQ5-ve)、Hoechst 33342、SYTO16及其组合的染色来鉴定去核的CD235a+成红细胞。在一些实例中，染色是DRAQ5(DRAQ5-ve)。
如本文所用的，多能细胞通常从2×105个细胞/ml扩增至2×106至3 ×106个细胞/ml。通常，多能细胞密度保持在4×106个细胞/ml以下，且微载体-聚集体直径的尺寸为250至700μm。在扩增期间较高的细胞浓度可导致乳酸/氨抑制水平的建立，这可能使细胞失去多能性。直径大于700 μm的聚集体尺寸可能由于减少的扩散而导致对簇的内部区域中的细胞的营养限制。在中胚层分化开始期间(当加入GSK3-抑制剂时；例如CHIR)，细胞以2×105个细胞/ml至1×106个细胞/ml接种。
在一个实例中，例如在多能干细胞扩增阶段期间，将多能干细胞扩增至1.5×105至4×106个细胞/ml的浓度。在另一个实例中，多能干细胞被扩增至1.5×105至4×106个细胞/ml、2×105至1×106个细胞/ml、5×105至1.5×106个细胞/ml、1.75×106至3×106个细胞/ml、2×106至3×106个细胞/ml或约2×105个细胞/ml、约5×105个细胞/ml、约8×105个细胞 /ml、约1×106个细胞/ml、约1.5×106个细胞/ml、约2.0×106个细胞/ml、约2.1×106个细胞/ml、约2.2×106个细胞/ml、约2.3×106个细胞/ml、约 2.4×106个细胞/ml、约2.5×106个细胞/ml、约2.6×106个细胞/ml、约2.75 ×106个细胞/ml、约2.8×106个细胞/ml、约2.9×106个细胞/ml或约3×106个细胞/ml的浓度。
在另一个实例中，多能干细胞扩增阶段的培养进行5至8天，或5、6、 7、8天。
在又另一个实施例中，中胚层诱导阶段的培养进行3至4天。
在另一个实例中，造血诱导阶段的培养进行7至12天、7至9天、8 至10天、9至11天或10至12天，或7、8、9、10、11或12天。
在又另一个实例中，成红细胞诱导阶段的培养进行10至18天、10至13天、12至16天、13至17天、14至18天或11、12、13、14、15、16、 17或18天。
在另一个实例中，成红细胞成熟阶段的培养进行7至21天、7至14 天、13至21天或8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、21 或21天。
因此，基于本文所公开的时间线，如本文所公开的方法可花费46至 50天、48至54天、50至55天、51至57天或52至58天，以衍生去核的人诱导多能干细胞(hiPSC)衍生的成红细胞(从微载体上的hiPSC的扩增开始至最终去核)。在另一个实例中，本文公开的方法可以花费多达45、 46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57或58天。在又另一实例中，本文所公开的方法可花费多达最少48天至最多56天以衍生去核的人诱导多能干细胞(hiPSC)衍生的成红细胞(从微载体上的hiPSC的扩增开始至红血球的最终去核)。
通过在搅动条件下在6孔超低附着(ULA)板中在层粘连蛋白-521包被的Solohill微载体上最初扩增的O-neg hiPSC，通过将人多能干细胞扩增培养基转换至内部优化的中胚层诱导培养基，在同一6孔超低附着板中在搅动条件下被诱导至中胚层阶段。在造血命运的中胚层诱导3天后，使用如前所述的条件将衍生自微载体聚集体培养物的单细胞以低密度接种在搅动悬浮培养物中持续另外10天。在第14天，将造血细胞在先前描述的成红细胞扩增培养基中在搅动悬浮条件下再培养14天，以允许成红细胞扩增。显示O-neg人诱导多能干细胞扩增至中胚层诱导、造血诱导和成红细胞扩增的整个过程可以在搅动条件下在悬浮培养中进行(图27)。
为了证明该过程的扩大规模，在连续搅动条件下，将中胚层诱导阶段后衍生的单细胞接种在超低附着摇瓶中的10ml体积中(图28)。使用多种人诱导多能干细胞系，显示出通过频繁更换培养基实现高密度红系细胞培养的可行性。在此，显示出培养物中乳酸和氨的累积应该保持在2g/L 和4mM以下，以维持高细胞活力并允许成红细胞的连续扩增。对于最佳分化系X13，实现了从单细胞的初始接种到分化的成红细胞的超过1000 倍的扩增。进行完全培养基更换以确保防止乳酸和氨的抑制水平，允许获得大于报道的在体外红血球培养中最高细胞密度1×107细胞/ml(1e7细胞 /ml)的细胞密度。
在一个实例中，所述方法包括在中胚层诱导阶段期间使用细胞培养基，所述细胞培养基包含骨形态发生蛋白、GSK3-抑制剂或Wnt通路激活剂、激活素A和血管内皮生长因子。在另一个实例中，如本文公开的培养基用于搅动悬浮培养。
本文还公开了一种用于将多能干细胞分化为造血前体细胞从而使用微载体胚状体(EB)或多能干细胞从多能干细胞产生造血前体细胞的细胞培养基，所述细胞培养基包含骨形态发生蛋白、激活素A和血管内皮生长因子。
在又另一个实例中，描述了用于将多能干细胞分化为造血前体细胞从而使用微载体胚状体(EB)从多能干细胞产生造血前体细胞的细胞培养基，所述细胞培养基包含骨形态发生蛋白、GSK-3激酶抑制剂，其中所述抑制剂选自由以下组成的组：CHIR99021、(2’Z,3’E)-6-溴靛玉红-3’-肟(Bio； CAS 667463-62-9)、Kenpaullone(CAS 142273-20-9)、GSK-3β抑制剂XII (TWS119；CAS 601514-19-6)、Bio-丙酮肟(CAS 667463-85-6)、 CHIR-98014、SB216763(CAS 280744-09-4)、GSK-3β抑制剂VIII(CAS 487021-52-3)及其组合，或Wnt通路激活剂、激活素A和血管内皮生长因子。
本文还公开了一种用于将多能干细胞分化为造血前体细胞从而使用微载体胚状体(EB)或多能干细胞从多能干细胞产生造血前体细胞的细胞培养基，所述细胞培养基包含骨形态发生蛋白、激活素A、bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)或其变体、激素、细胞因子和血管内皮生长因子。
如本文所用的，术语“GSK-3-抑制剂”是指能够抑制糖原合酶激酶3 (GSK-3；全部或部分)的化合物或一组化合物。糖原合酶激酶3是介导磷酸分子添加到丝氨酸和苏氨酸氨基酸残基上的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。蛋白质通过GSK-3的磷酸化通常抑制其下游靶标的活性。已显示GSK-3 整体上与细胞增殖和细胞凋亡的通路有关。例如，已显示GSK-3使β-连接素磷酸化，导致β-连接素被靶向降解。因此，GSK-3是经典的β-连接素/Wnt通路的一部分，其向细胞发送分裂和增殖的信号。GSK-3还通过使调节细胞凋亡的转录因子磷酸化而参与许多细胞凋亡信号传导通路。 GSK-3可通过激活促凋亡因子(诸如例如p53)和通过磷酸化使存活促进因子失活二者来促进凋亡。
在一个实例中，GSK3-抑制剂是但不限于丙戊酸钠盐、星形孢菌素、 KT 5720(CAS108068-98-0)、GSK-3抑制剂IX(CAS 667463-62-9)、Ro 31-8220(CAS 138489-18-6)、SB-216763(CAS 280744-09-4)、CID 755673 (CAS 521937-07-5)、Kenpaulone(CAS 142273-20-9)、氯化锂、GSK-3 β抑制剂XII(TWS119；CAS 601514-19-6)、GSK-3抑制剂XVI(CAS252917-06-9)、10Z-Hymenialdisine(CAS 82005-12-7)、靛玉红(CAS 479-41-4)，CHIR-98014(CAS 252935-94-7)、GSK-3β抑制剂VI(CAS 62673-69-2)、曼扎明A(ManzamineA，CAS 104196-68-1)、靛玉红3'-单肟(CAS 160807-49-8)、GSK-3抑制剂X(CAS 740841-15-0)、GSK-3抑制剂XV、SB-415286(CAS 264218-23-7)、1-氮杂坎帕罗酮(CAS 676596-65-9)、TWS 119二三氟乙酸酯(CAS 601514-19-6)、5-碘-靛玉红 3'-单肟、GSK-3β抑制剂I(CAS327036-89-5)、9-Cyanopaullone、靛玉红 -5-磺酸钠盐、GSK-3β抑制剂VII(CAS 99-73-0)、Cdk1/5抑制剂(CAS 40254-90-8)、Hymenidin(CAS 107019-95-4)、双吲哚基马来酰亚胺X盐酸盐(CAS 131848-97-0)、3F8(CAS 159109-11-2)、isogranulatimide(CAS 244148-46-7)、CR8、(R)-异构体(CAS 294646-77-8)L-779,450(CAS 303727-31-3)、靛玉红-3'-单肟-5-磺酸(CAS 331467-05-1)、GSK-3抑制剂 II(CAS 478482-75-6)、GSK-3β抑制剂VIII(CAS487021-52-3)、Aloisine A(CAS 496864-16-5)、GSK-3β抑制剂XI(CAS 626604-39-5)、GSK-3 抑制剂IX(CAS 710323-61-8)、阿特波龙(Alsterpaullone)、2-氰乙基(CAS 852529-97-0)、TCS 2002(CAS 1005201-24-0)、TCS 21311(CAS 1260181-14-3)、A1070722(CAS1384424-80-9)、Ro-31-8220(CAS 138489-18-6)、Enzastaurin(CAS 138489-18-6)、MeBIO(CAS 667463-95-8)、 Cdk2/9抑制剂(CAS 507487-89-0)、Cdk1/2抑制剂III(CAS 443798-55-8)、 PHA 767491盐酸盐(CAS 845714-00-3)、AR-AO 14418-d3、吲哚-3-乙酰胺(CAS879-37-8)、Hymenialdisine类似物1(CAS 693222-51-4)、CHIR-99021(也称为6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2- 嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶腈和CT99021；CAS 252917-06-9)、 CHIR-98014(CAS 556813-39-9)、(2’Z,3’E)-6-溴靛玉红(Brominodirubin)-3’- 肟(Bio；CAS 667463-62-9)、Bio-丙酮肟(CAS 667463-85-6)、SB216763 (CAS 280744-09-4)及其组合。
在另一个实例中，GSK3-抑制剂为但不限于CHIR-99021、(2’Z,3’E)-6- 溴靛玉红-3-肟(Bio；CAS 667463-62-9)、Kenpaullone(CAS 142273-20-9)、 GSK-3β抑制剂XII(TWS119；CAS 601514-19-6)、Bio-丙酮肟(CAS 667463-85-6)、CHIR-98014、SB 216763(CAS280744-09-4)、GSK-3β抑制剂VIII(CAS 487021-52--3)及其组合。在又另一个实例中，GSK3-抑制剂是CHIR-99021或其衍生物。
在又另一个实例中，所述GSK3-抑制剂为但不限于CHIR-99021、 (2’Z,3’E)-6-溴靛玉红-3-肟(Bio；CAS 667463-62-9)、SB216763(CAS 280744-09-4)、CHIR-98014(556813-39-9)、GSK-3β抑制剂VIII(CAS 487021-52-3)、Kenpaullone(CAS 142273-20-9)、DRF053(也称为2-[[9-(1- 甲基乙基)-6-[[3-(2-吡啶基)苯基]氨基]-9H-嘌呤-2-基]氨基]-1-丁醇盐酸盐水合物)、Wnt3a及其组合。在另一个实例中，GSK3-抑制剂为但不限于 CHIR-99021、SB216763、CHIR-98014、DRF053、Wnt3a及其组合。在一个实例中，GSK3-抑制剂为但不限于CHIR-99021、SB216763、CHIR-98014 及其组合。
在一个实例中，GSK3抑制剂以0.001μM至15μM、1μM至5μM、 4μM至10μM、8μM至14μM、10μM至14μM、0.5μM至2μM、1.45 μM至3.75μM、3.4μM至5μM、5.3μM至7.5μM、7.4μM至8.8μM、8.6μM至9.9μM、9.8μM至10.8μM、10.7μM至11.5μM、11.4μM至 12.8μM、12.6μM至13.5μM、13.4μM至14.5μM、14.1μM至15μM、约11μM、约12μM、约13μM、约14μM或约14.5μM的浓度存在。
CHIR是已经显示改善从在搅动条件下扩增的人多能干细胞-微载体 (hPSC-MC)培养物的造血中胚层诱导和前体产生的因子。作为该组化合物的实例，CHIR-99021的结构如下所示。
Figure BDA0002689216970000401
如本文所用的，术语“衍生物”或“变体”是指通过化学反应衍生自类似化合物的化合物。衍生物也可称为原始化合物的结构和/或功能类似物。
例如，CHIR-99021的衍生物是但不限于CHIR-98014：
Figure BDA0002689216970000402
GSK3-抑制剂的一个实例是但不限于CHIR。
术语“Wnt通路激活剂”是指激活Wnt信号传导通路的化合物。Wnt 基因家族由编码分泌的信号传导蛋白的结构相关基因组成。这些蛋白涉及例如但不限于肿瘤形成、脂肪形成和若干其他发育过程，包括在胚胎发生期间调节细胞命运和模式化(patterning)。这种蛋白的一个实例是Wnt3a。
Wnt信号传导首先由于其在癌发生中的作用而被鉴定，而不是由于其在胚胎发育中的作用(稍后阐明)被鉴定。其控制的胚胎过程包括体轴模式化、细胞命运特化、细胞增殖和细胞迁移。这些过程对于包括骨、心脏和肌肉在内的重要组织的适当形成是必要的。当Wnt通路蛋白基因突变导致果蝇胚胎异常时，发现其在胚胎发育中的作用。Wnt信号传导还控制成人骨髓、皮肤和肠道中的组织再生。后来发现负责这些异常的基因也影响小鼠中乳腺癌的发展。
在一个示例中，Wnt途径激活剂以0.5μM至20μM、1μM至15μ M、0.5μM至5μM、4μM至11μM、8μM至15μM、10μM至16μM、 17μM至20μM、约1μM、约1.5μM、约2μM、约2.5μM、约3μM、约3.5μM、约4μM、约4.5μM、约5μM、约5.5μM、约6μM、约6.5μM、约7μM、约7.5μM、约7μM、约7.5μM、约8μM、约8.5μM、约9μM、约9.5μM、约10μM、约10.5μM约11μM、约11.5μM、约12μM、约 12.5μM、约13μM、约13.5μM、约14μM、约14.5μM、约15μM、约 15.5μM、约16μM、约16.5μM、约17μM、约17.5μM、约18μM、约 18.5μM、约19μM、约19.5μM或约20μM的浓度存在。Wnt通路激活剂的一个实例是但不限于IQ-1和Wnt3a。
在又另一个实例中，Wnt通路激活剂，例如Wnt3a，以1ng/ml至150 ng/ml、10ng/ml至100ng/ml、1ng/ml至50ng、45ng/ml至75ng/ml、60 ng/ml至110ng/ml、115ng/ml至150ng/ml、约10ng/ml、约15ng/ml、约 20ng/ml、约25ng/ml、约30ng/ml、约35ng/ml、约40ng/ml、约45ng/ml、约50ng/ml、约55ng/ml、约60ng/ml、约65ng/ml、约70ng/ml、约75ng/ml、约80ng/ml、约85ng/ml、约90ng/ml、约95ng/ml、约100ng/ml、约105 ng/ml、约110ng/ml、约115ng/ml、约120ng/ml、约125ng/ml、约130ng/ml、约140ng/ml、约145ng/ml或约150ng/ml的浓度存在。
如本文所用的，术语“骨形态发生蛋白”(BMP)是指还已知具有类似于细胞因子和代谢原(metabologens)的功能的一组生长因子。这些蛋白最初是通过它们诱导骨和软骨形成的能力而被发现的。目前，认为骨形态发生蛋白构成一组形态发生信号，协调整个身体的组织构架。骨形态发生蛋白信号在生理学中的重要功能通过失调的BMP信号传导在病理过程中的多种作用所凸显。癌症疾病通常涉及BMP信号传导系统的误调。
骨形态发生蛋白与细胞表面上的特异性受体(也称为骨形态发生蛋白受体(BMPR))相互作用。通过骨形态发生蛋白受体的信号转导导致SMAD 蛋白家族成员的动员。涉及BMP、BMPR和SMAD的信号传导途径在心脏、中枢神经系统和软骨的发育以及出生后骨发育中是重要的。骨形态发生蛋白在胚胎发育期间对胚胎模式化和早期骨骼形成也具有重要作用。因此，BMP信号传导的破坏可以影响发育中的胚胎的身体计划(body plan)。例如，BMP4及其抑制剂头蛋白和腱蛋白(chordin)帮助调节胚胎的极性(即，所谓的从后至前模式化(back to front patterning))。具体而言，BMP-4及其抑制剂在神经胚形成和神经板发育中起主要作用。BMP-4向外胚层细胞发出发育成皮肤细胞的信号，但通过在下面的中胚层的抑制剂的分泌阻断了 BMP-4的作用，使外胚层继续其神经细胞发育的正常过程。BMP4通常存在于早期胚胎发育的腹侧边缘区中以及眼睛、心血和耳泡中。
在一个实例中，骨形态发生蛋白以5ng/ml至50ng/ml、10ng/ml至 20g/ml、18ng/ml至27ng/ml、26ng/ml至36g/ml、35ng/ml至45g/ml、约9ng/ml、约10ng/ml、约11ng/ml、约19ng/ml、约20ng/ml、约21ng/ml、约28ng/ml、约29ng/ml、约30ng/ml、约48ng/ml、约50ng/ml或约51ng/ml 的浓度存在。骨形态发生蛋白的一个实例是但不限于BMP4。因此，在另一个实例中，BMP4以5ng/ml至50ng/ml、10ng/ml至20g/ml、18ng/ml 至27ng/ml、26ng/ml至36ng/ml、35ng/ml至45g/ml、约9ng/ml、约10 ng/ml、约11ng/ml、约19ng/ml、约20ng/ml、约21ng/ml、约28ng/ml、约29ng/ml、约30ng/ml、约48ng/ml、约50ng/ml或约51ng/ml的浓度存在。
如本文所用，术语“血管内皮生长因子(VEGF)”是指由刺激血管形成的细胞产生的信号蛋白。换句话说，VEGF是生长因子的亚家族，胱氨酸结生长因子的血小板衍生生长因子家族。这些生长因子是参与血管发生 (vasculogenesis，其为胚胎循环系统的从新形成)和血管生成(angiogenesis，其为来自预先存在的脉管系统的血管的生长)的重要信号传导蛋白。
在一个实例中，所述血管内皮生长因子以35ng/ml至55ng/ml、37 ng/ml至47ng/ml、44ng/ml至51ng/ml、50.5ng/ml至52ng/ml、51.9ng/ml 至53ng/ml、53.5ng/ml至54ng/ml、约40ng/ml、约45ng/ml、约48ng/ml、约49ng/ml、约50ng/ml或约51ng/ml的浓度存在。
血管内皮生长因子的一个实例是但不限于VEGF165。在这样的实例中， VEGF165以20ng/ml至35ng/ml、32ng/ml至38ng/ml、35ng/ml至55ng/ml、 37ng/ml至47ng/ml、44ng/ml至51ng/ml、48ng/ml至51ng/ml、50.5ng/ml 至52ng/ml、51.9ng/ml至53ng/ml、53.5ng/ml至54ng/ml、约29ng/ml、约30ng/ml、约35ng/ml、约38ng/ml、约40ng/ml、约45ng/ml、约48ng/ml、约49ng/ml、约50ng/ml或约51ng/ml的浓度存在。
如本文所用，术语“激活素A”是指二聚体蛋白复合物，其增强FSH 生物合成和分泌，并参与月经周期的调节。已发现激活素发挥多种其他功能，包括在细胞增殖、分化、凋亡、代谢、体内平衡、免疫应答、创伤修复和内分泌功能中的作用。已经鉴定的激活素类型是激活素A、激活素B 和激活素AB，其中激活素A包含两个β-A(βA)亚基。与超家族的其他成员一样，激活素与两类细胞表面跨膜受体(I型和II型)相互作用，这两类受体在其胞质结构域中具有固有的丝氨酸/苏氨酸激酶活性，这两类受体为激活素1型受体(例如ACVR1、ACVR1B、ACVR1C)和激活素2 型受体(例如ACVR2A和ACVR2B)。激活素与II型受体结合并引发级联反应，该级联反应导致I型激活素受体的募集、磷酸化和活化。然后，这与胞质SMAD蛋白中的两个SMAD2和SMAD3相互作用，然后使它们磷酸化。然后，Smad3转位至细胞核并通过多聚化与SMAD4相互作用，导致它们的调节为负责多种基因表达的转录因子复合物。
在一个实例中，激活素A以0.001ng/ml至50ng/ml、0.5ng/ml至10 ng/ml、8ng/ml至18ng/ml、17ng/ml至27ng/ml、26ng/ml至36ng/ml、 35ng/ml至46ng/ml、44ng/ml至49ng/ml、约38ng/ml、约39ng/ml、约 40ng/ml、约41ng/ml、约42ng/ml或约43ng/ml的浓度存在。在另一个实例中，激活素A以0.1ng/ml至10ng/ml、0.5ng/ml至8ng/ml、2.5ng/ml 至6ng/ml、3ng/ml至7ng/ml、4ng/ml至8ng/ml、3ng/ml至9ng/ml、约 3ng/ml、约4ng/ml、约4.25ng/ml、约4.5ng/ml、约4.75ng/ml、约5ng/ml、约5.25ng/ml或约5.5ng/ml的浓度存在。
如本文所用，术语“激素”是指由多细胞生物中的腺体产生的一类信号传导分子的任何成员，由循环系统转运至靶向远端器官以调节生理学和行为。激素包括具有不同化学结构的化合物，其可主要分为三类：类花生酸、类固醇和氨基酸/蛋白质衍生物(其包括但不限于胺、肽和蛋白质)。
在一个实例中，激素以0.05ng/ml至2ng/ml、0.1ng/ml至1.5ng/ml、 0.25ng/ml至1ng/ml、0.2ng/ml至0.8ng/ml、0.4ng/ml至0.6g/ml、0.3ng/ml 至1ng/ml、约0.38ng/ml、约0.39ng/ml、约0.40ng/ml、约0.41ng/ml、约0.42ng/ml、约0.43ng/ml、约0.44ng/ml、约0.45ng/ml、约0.46ng/ml、约0.47ng/ml、约0.48ng/ml、约0.49ng/ml、约0.50ng/ml或约0.51ng/ml 的浓度存在。
在另一个实例中，激素是β-雌二醇。因此，在该实例中，β-雌二醇以0.05ng/ml至2ng/ml、0.1ng/ml至1.5ng/ml、0.25ng/ml至1ng/ml、0.2 ng/ml至0.8ng/ml、0.4ng/ml至0.6g/ml、0.3ng/ml至1ng/ml、约0.38ng/ml、约0.39ng/ml、约0.40ng/ml、约0.41ng/ml、约0.42ng/ml、约0.43ng/ml、约0.44ng/ml、约0.45ng/ml、约0.46ng/ml、约0.47ng/ml、约0.48ng/ml、约0.49ng/ml、约0.50ng/ml或约0.51ng/ml的浓度存在。
如本文所用，术语“碱性成纤维细胞生长因子”是指由FGF2基因编码的生长因子和信号传导蛋白。已知碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，也称为FGF2)具有广泛的促有丝分裂和细胞存活活性，并且参与多种生物学过程，包括胚胎发育、细胞生长、形态发生、组织修复、肿瘤生长和侵袭。碱性成纤维细胞生长因子也称为人胚胎干细胞培养基的组分；它是认为细胞保持未分化状态所必需的生长因子之一。已经证明它诱导gremlin 表达，已知gremlin又抑制骨形态发生蛋白诱导的分化。已显示碱性成纤维细胞生长因子与例如BMP4结合可促进干细胞向中胚层谱系分化。
在一个实例中，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或其变体以2ng/ml 至15ng/ml、5ng/ml至14g/ml、8ng/ml至11ng/ml、6ng/ml至10g/ml、约5ng/ml、约6ng/ml、约7ng/ml、约8ng/ml、约9ng/ml、约9.5ng/ml、约10ng/ml、约10.25ng/ml、约10.5ng/ml、约11ng/ml、约12ng/ml或约 13ng/ml的浓度存在。在另一个实例中，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 或其变体是bFGF的热稳定的嵌合变体或稳定的嵌合成纤维细胞生长因子 (FGF)。
如本文所用，术语“细胞因子”是指在细胞信号传导中重要的广泛和宽泛种类的小蛋白(～5-20kDa)。它们由细胞释放并影响其他细胞的行为，有时影响释放细胞本身。细胞因子包括趋化因子、干扰素、白介素、淋巴因子、肿瘤坏死因子，但通常不包括激素或生长因子。细胞因子由多种细胞产生，包括免疫细胞，如巨噬细胞、B-淋巴细胞、T-淋巴细胞和肥大细胞；以及内皮细胞；成纤维细胞和各种基质细胞。给定的细胞因子可以由多于一种类型的细胞产生。细胞因子调节体液和基于细胞的免疫应答之间的平衡，并且还调节特定细胞群的成熟、生长和应答。一些细胞因子以复杂的方式增强或抑制其他细胞因子的作用，并且与也是重要细胞信号传导分子的激素的不同之处在于，激素以非常低的浓度循环并且激素倾向于由特定种类的细胞产生。
在一个实例中，细胞因子以5ng/ml至50ng/ml、10ng/ml至20g/ml、 18ng/ml至27ng/ml、26ng/ml至36g/ml、35ng/ml至45g/ml、约9ng/ml、约10ng/ml、约11ng/ml、约19ng/ml、约20ng/ml、约21ng/ml、约28ng/ml、约29ng/ml、约30ng/ml、约48ng/ml、约50ng/ml或约51ng/ml的浓度存在。
在另一个实例中，所述细胞因子是干细胞因子(SCF)。在该实例中，干细胞因子(SCF)以5ng/ml至50ng/ml、10ng/ml至20g/ml、18ng/ml 至27ng/ml、26ng/ml至36g/ml、35ng/ml至45g/ml、约9ng/ml、约10ng/ml、约11ng/ml、约19ng/ml、约20ng/ml、约21ng/ml、约28ng/ml、约29ng/ml、约30ng/ml、约48ng/ml、约50ng/ml或约51ng/ml的浓度存在。
在另一个实例中，细胞培养基包含BMP4、激活素A、CHIR99021和 VEGF165。在另一个实例中，BMP4以26至36ng/ml的浓度存在，激活素 A以35至46ng/ml的浓度存在，CHIR-99021以8μM至14μM的浓度存在，并且VEGF165以48ng/ml至51ng/ml的浓度存在。在又一个实例中，BMP4以约30ng/ml的浓度存在，激活素A以约40ng/ml的浓度存在， CHIR99021以约12μM的浓度存在，并且VEGF165以约50ng/ml的浓度存在。
在一个实例中，如本文所公开的方法需要使用如本文所公开的细胞培养基，所述细胞培养基包含BMP4、激活素A、CHIR99021和VEGF165。在一个实例中，BMP4以26至36ng/ml的浓度存在，激活素A以35至46 ng/ml的浓度存在，CHIR-99021以8μM至14μM的浓度存在，并且VEGF165以48ng/ml至51ng/ml的浓度存在。
在另一个实例中，细胞培养基包含BMP4、激活素A和VEGF165。在该实例中，BMP4以26ng/ml-36ng/ml的浓度存在，激活素A以35-46ng/ml 的浓度存在，VEGF165以48ng/ml-51ng/ml的浓度存在。在另一个实例中， BMP4以约30ng/ml的浓度存在，激活素A以约40ng/ml的浓度存在，并且VEGF165以约50ng/ml的浓度存在。
在另一个实例中，细胞培养基包含BMP4、激活素A、bFGF、β-雌二醇、干细胞因子(SCF)和VEGF165。在一个实例中，BMP4以18ng/ml 至27ng/ml的浓度存在，激活素A以3ng/ml至7ng/ml的浓度存在，bFGF 以5ng/ml至14g/ml的浓度存在，β-雌二醇以0.2ng/ml至0.8ng/ml的浓度存在，SCF以26ng/ml至36g/ml的浓度存在，并且VEGF165以32ng/ml 至38ng/ml的浓度存在。在另一个这样的实例中，BMP4以约20ng/ml的浓度存在，激活素A以约5ng/ml的浓度存在，bFGF以约10ng/ml的浓度存在，β-雌二醇以约0.4ng/ml的浓度存在，干细胞因子(SCF)以约20ng/ml 的浓度存在，并且VEGF165以约30ng/ml的浓度存在。
因此，本文还公开了用于将多能干细胞分化为造血前体细胞的方法，其中所述方法在悬浮搅动下进行，所述方法包含：a.任选地提供多能干细胞；b.将步骤a.的细胞暴露于如本文描述的细胞培养基中持续24小时(第 0天至第1天)，从而产生T-Brachyury(T-Bra；原条/早期中胚层标志物) 阳性细胞；c.将步骤b.的细胞暴露于如本文描述的细胞培养基中持续24小时(第1天至第2天)；d.将步骤c.的附着于微载体的细胞暴露于如本文描述的细胞培养基中持续48小时(第2天至第4天)，由此步骤b.至d.诱导中胚层诱导；e.去除细胞培养基，并分离步骤d.的所得KDR+PDGFRα- 造血前体细胞。
在另一个实例中，用于将多能干细胞分化成造血前体细胞的方法，其中所述方法在悬浮搅动下进行，所述方法包含：a.将多能干细胞暴露于如本文定义的细胞培养基持续24小时(第0天至第1天)，从而产生T- Brachyury(T-Bra；原条/早期中胚层标志物)阳性细胞；b.将步骤a.的细胞暴露于本文公开的细胞培养基中持续24小时(第1天至第2天)；c.将步骤b.的附着于微载体的细胞暴露于如本文公开的细胞培养基中持续48小时(第2天至第4天)，由此步骤a.至b.诱导中胚层诱导；d.去除细胞培养基，并分离步骤c所得的KDR+PDGFRα-造血前体细胞。
在另一个实例中，公开了用于将多能干细胞分化为造血前体细胞的方法，其中所述方法在悬浮搅动下进行，所述方法包含：a.任选地提供多能干细胞；根据本文公开的方法，在从步骤a.分离的多能干细胞中诱导中胚层诱导，从而产生KDR+PDGFRα-造血前体细胞；在从步骤b分离的细胞中诱导造血诱导，从而产生CD34/CD43/CD45造血祖细胞；如本文所公开的，在步骤c分离出的细胞中诱导成红细胞扩增，从而产生CD235a+CD71+ 成红细胞；如本文所公开的，在步骤d分离出的细胞中诱导成红细胞成熟，从而产生CD235a+DRAQ5-ve去核的成红细胞；去除细胞培养基，并分离步骤e得到的CD235a+DRAQ5-ve去核的成红细胞。
在另一个实例中，公开了用于将多能干细胞分化为造血前体细胞的方法，其中所述方法在悬浮搅动下进行，所述方法包含：a.在从经历悬浮搅动的细胞培养物中分离的多能干细胞中诱导中胚层诱导，从而产生 KDR+PDGFRα-造血前体细胞；b.在从步骤a分离的细胞中诱导造血诱导，从而产生CD34/CD43/CD45造血祖细胞；c.在从步骤b分离的细胞中诱导成红细胞扩增，从而产生CD235a+CD71+成红细胞；d.在从步骤c分离出的细胞中诱导成红细胞成熟，从而产生CD235a+DRAQ5-ve去核的成红细胞；e.去除细胞培养基，并分离步骤d得到的CD235a+DRAQ5-ve去核的成红细胞。
为了具有类似于搅拌釜式生物反应器的平台，在125ml旋瓶中进行人诱导多能干细胞的全部扩增和分化(图29)。将人诱导多能干细胞-微载体 (HiPSC-MC)培养物在旋瓶中在mTeSR1培养基中连续搅动7天进行扩增。将hiPSC-MC聚集体在相同的摇瓶中通过培养基更换分化为造血命运的中胚层，持续再3天。然后将衍生自人诱导多能干细胞-微载体(HiPSC-MC)聚集体的单细胞接种回相同的旋转器中，并在周期性培养基更换的搅动条件下进行造血诱导持续10天。通过改变为成红细胞扩增培养基并在周期性培养基更换的情况下再培养14天，实现在连续搅动下的成红细胞扩增。到第30天，可以实现细胞数的1000倍扩增(数据未显示)。在单独的实验中，显示通过完全培养基改变，同时监测和保持乳酸和氨水平低于其抑制水平，有可能在旋瓶中实现高细胞密度。结果表明，在50ml的培养体积中，可以获得非常高的细胞密度1.7×107个细胞/ml (1.7e7细胞/ml)和总细胞数8.5×108个细胞(8.5e8个细胞)。至第30天，分化细胞为>73％的CD235a红系细胞，且示出主要为胎儿血红蛋白 (HbF；>85％)表达，以及一些水平的可检测的血红蛋白A(HbA；16％)。在相同的旋瓶中在搅动条件下成熟后，可观察到5％至10％的去核红血球。与成人红血球相比，分化红血球的氧结合谱发生了左移，表现出更高的氧亲和力，与高水平胎儿血红蛋白(HbF)的表达一致。
在一个实例中，所述方法在细胞培养容器中进行，所述细胞培养容器选自由多孔超低附着细胞培养容器(例如，6孔板)、滚瓶、生物反应器(如搅拌釜式生物反应器、摆动生物反应器)、摇瓶和旋瓶组成的组。
本文还公开了一种包含微载体和一种或多种本文公开的细胞培养基的试剂盒。本文公开的组分可以以任何储存稳定的制剂或状态提供。例如，细胞培养基作为浓缩溶液与用于稀释的适当基础培养基一起提供。在另一个实例中，浓缩溶液是20×、50×或100×浓缩溶液。在又一个实例中，细胞培养基以冷冻(即用型)溶液提供。细胞培养基的任何组分也可以与基础培养基分开提供。细胞培养基的组分也可以作为冻干物质提供。
在可扩大规模的搅动悬浮培养平台中改进脐带血和hiPSC衍生的成红细胞的去核效率
本部分描述了从人诱导多能干细胞(hiPSC)分化的成红细胞和脐带血衍生的(CB)成红细胞得到高百分比的非凋亡去核红血球的方法。当使用文献中描述的常规途径进行时，即在含有10-15％人血清/血浆的培养基中培养成红细胞(加之EPO、胰岛素、全转铁蛋白)，脐带血来源的成红细胞的去核效率(<40％去核红血球)和hiPSC成红细胞的去核效率(<10％去核红血球)通常非常低。已经测试了一种方法，其中，在连续搅动下将脐带血衍生的/hiPSC成红细胞与在微载体上培养的OP9鼠基质细胞系 (ATCC：CR-2749)共培养。显示在这种悬浮搅动共培养系统中，对于hiPSC 成红细胞，非细胞凋亡(膜联蛋白V阴性)去核的成红细胞(DRAQ5阴性)的百分比从6.3±0.3％(常规方法)增加到59.3±1.5％，对于脐带血衍生的成红细胞，非细胞凋亡(膜联蛋白V阴性)去核的成红细胞(DRAQ5 阴性)的百分比从44.6±0.8％(常规方法)增加到84.5±0.5％。当细胞如常规途径中那样终末成熟时，检测到非常高百分比的凋亡细胞。发现OP9 的共培养显著降低凋亡细胞的比例。不受理论的约束，实验数据显示OP9 的这种抗凋亡作用可能是由于旁分泌作用，而不是由于细胞-细胞接触。此外，在与OP9共培养的过程中包括搅动显著提高了去核效率。
已显示脐带血衍生的/hiPSC成红细胞在OP9和/或其他基质细胞系(如 MS-5)的单层培养物上的共培养可以显著改善去核。然而，因为与单层培养相关的表面积限制，所以该途径在扩大衍生大量去核红血球的过程方面具有限制。另一方面，如本文所公开，在微载体上培养OP9的方法允许开发用于衍生去核红血球的潜在可扩大规模的搅动悬浮培养平台。迄今为止，还没有其他关于OP9或其他间充质干细胞(MSC)与成红细胞的悬浮共培养以开发用于增加去核效率的可扩大规模的平台的描述。
在微载体培养物中通过Wnt/β-连接素信号传导调节多种人多能干细胞系的红系分化
O-阴性恒河猴因子D阴性(O-neg)人类诱导性多能干细胞(hiPSC) 的分化可产生可用于输注应用的通用供体红血球(RBC)。在描述的用于红血球产生的方法中，使用无异源的和限定的条件开发的胚状体(EB)介导的分化途径似乎对于未来的临床开发是最可行的。然而，在悬浮培养中大规模生产胚状体的常规方法(例如通过强制聚集)尚未成功证明。将hiPSC培养为3维(3D)聚集体或在限定的细胞外基质(ECM)包被的微载体(MC)上培养是在悬浮培养中将人多能干细胞(hPSC)和胚状体扩增扩大规模的可能手段。先前已经表明，当使用基于BMP4的方案分化时， hPSC-MC聚集体可以分化为造血前体细胞和成红细胞。然而，对分化最初在连续搅动条件下扩增的多个hPSC细胞系的反复尝试证实了红系分化的可变性。不受理论的约束，已经假设搅动剪切应力可以诱导SMAD7的表达，已知SMAD7对SMAD1、5和8的磷酸化具有抑制作用，所有这些是中胚层分化初期由BMP4激活的TGF-β信号传导途径的组分。因此，在搅动的培养物中BMP4信号传导的抑制可能是中胚层诱导差和分化结果可变性的可能原因。本文显示在搅动下最初扩增的人多能干细胞-微载体(hPSC-MC)聚集体的红系分化的优化方案，其作为大规模产生通用红血球的基础或过程。
]这里公开的方法不同于现有技术中所示的方法，如图26所示。图26B 是直接比较本文公开的方法和现有技术的方法(Olivier等；2016)的示意图。现有技术中公开的方法与当前要求保护的方法之间的差异是，但不限于，例如，本文公开的方法使用人诱导多能干细胞(hiPSC)的微载体培养和微载体-hiPSC作为胚状体(EB)用于中胚层诱导。在另一个实例中，本文公开的方法的所有步骤在连续搅动下在悬浮培养物中进行。在本发明要求保护的方法与现有技术的区别的另一个实例中，本文公开的用于中胚层诱导的第0天和第1天的条件、成红细胞扩增培养基、成熟培养基条件与现有技术描述的条件不同。
图39A总结了为评价搅动对中胚层诱导和随后红系分化的影响而进行的实验研究。通过比较在维持多能性(图39C)的人胚胎干细胞(hESC) 系hES-3的人多能干细胞(hPSC)扩增阶段(图39B)期间衍生自静态、 3天或7天搅动的条件的人多能干细胞-微载体(hPSC-MC)聚集体，显示，与使用基于BMP4的方案分化衍生自静态条件的培养物相比，使用基于 BMP4的方案连续搅动7天阻止了原条/中胚层标志物T-Bra9和造血中胚层标志物KDR10(图39D)的表达以及随后的造血前体细胞(图39E-G)和成红细胞分化(图39G-H)。与上述假说一致，与静态培养物相比，搅动培养物显示出抑制性SMAD7的增加水平。BMP4信号传导在搅动培养物中受到不利影响，其中SMAD1/5的磷酸化仅在静态培养物中明显(图38A 和图38C)。
为了改善来自搅动培养的差分化结果，使用多因子实验设计(DoE) 途径来筛选可改善衍生自连续搅动的hES-3(图2B、图2C和表3)与O-neg hiPSC系D5(图6)的hPSC-MC-聚集体培养物的造血中胚层诱导的因子的组合。
表3-多因子DoE分析鉴定CHIR-99021为改善造血中胚层诱导和造血分化的显著因子；hES-3-MC搅动培养：下表示出不同的DoE条件，具有不同浓度的以下各项：激活素A(ng/ml)、CHIR-99021(μM)维持24 小时、从24至48小时的CHIR-99021(μM)和在实验开始时加入的BMP4 (ng/ml)，以及在分化后第4天通过流式细胞术确定的相应的KDR+细胞百分比，以及在最初接种1×105个细胞后在BGM中扩增14天后每孔总造血前体细胞。
Figure BDA0002689216970000511
Figure BDA0002689216970000521
DoE研究鉴定，当与BMP4和激活素A联合使用时，CHIR-99021(CHIR，其为糖原合酶激酶3-β(GSK-3β)的选择性抑制剂和经典Wnt/β-连接素信号传导的激活剂)是改善KDR+细胞发育(图2B和图6C)和随后产生造血前体细胞(图2C、2D)的最显著因子。还可以将较高的初始KDR+细胞群百分比与较高的所产生的造血前体细胞总数相关联(P＝0.001)(图2D)。CHIR-99021已显示诱导人多能干细胞(hPSC)的原条/中胚层发育，用于心肌细胞和造血分化。Wnt/β-连环蛋白信号传导途径的组分(诸如TCF-1 和LEF-1)，以及Wnt信号传导的直接靶标(诸如T-BRA)，早在用CHIR 诱导24小时时被检测到(图38A和38B)。本文公开的基于CHIR的方案在衍生自静态(11.5±2.6)或搅动(8.0±2.1)条件的hES-3微载体聚集体分化后，导致每个人多能干细胞接种后产生的成红细胞产量相似(P>0.05)，而对于基于BMP4的分化，仅在静态(7.7±1.9)条件下而非搅动(1.2± 0.7)条件下观察到有效扩增(P<0.05)(图23)。为了验证CHIR对在搅动的微载体培养物中扩增的人多能干细胞的改善的红系分化的作用，使用D5 (人诱导多能干细胞系)评价来自DoE研究的29种条件(图6A)。然后选择六种条件进行详细研究；条件1、2和4基于BMP4/激活素A方案，而条件7、16和18是CHIR介导的方案(表1)。BMP4/激活素A方案导致诱导后48小时非常少的原条/中胚层诱导(T-Bra+细胞：6.66-8.36％)，和诱导后96小时低造血中胚层诱导(5.33-13.8％的KDR+细胞)(见表1)。这些条件还导致对造血转录因子SCL和RUNX1的诱导非常低，并且在基于甲基纤维素的blast生长培养基(BGM)中培养2周后几乎没有或没有造血前体细胞扩增，并且随后无法扩增成红细胞(表1)。另一方面，CHIR 诱导方案导致了高原条/中胚层诱导(第2天，44.9-89.6％T-Bra+细胞)，高造血中胚层诱导(第4天，18.6-29.4％的KDR+细胞)，CD31、SCL/Tal-1 和RUNX1(已知为造血作用的主要调节剂)的更高倍诱导以及分化后14 天造血前体细胞的改善扩增(表1)。在测试的基于CHIR的条件中，条件 #7(12mM CHIR持续24小时)和#18(6mMCHIR持续48小时)导致成红细胞分化和扩增(第34天倍数扩增，分别为：284.4±9.2与95.8±1.2) (表1)，条件#7显示比条件#18显著更多数量的成红细胞(分化后34天， 1.42×108个细胞，相比于4.31×107个细胞，P＝0.0003)(图3A)。使用条件#7分化的成红细胞在培养的第56天达到62343±15070的累积倍数扩增。
对从搅拌条件衍生的人多能干细胞微载体(hPSC-MC)聚集体的红系分化的条件进行优化，测试了7种核型正常的O-neg hiPSC细胞系(BR2、 BR7、D5、D9、D11、D12、X13)、1个商业hiPSC系(IMR90)和hESC 系(hES-3)。在维持多能性的搅动条件下将人多能干细胞系在微载体上扩增7天，达到5.3至12.5倍扩增，平均聚集体直径范围为255至510mm (图4A)。使用3个不同的CHIR剂量(5、10和15mM，持续24小时) 来分化从不同hPSC系产生的hPSC-MC聚集体。对于所有测试的系，与5 mM CHIR相比，15mM CHIR导致显著更高(P<0.05)的T-Bra+细胞(图 4B)。指示血管祖细胞的KDR+PDGFRα-细胞的表达反映了T-Bra+细胞的趋势，与5mMCHIR相比，15mM CHIR显示显著更高(P<0.05)的 KDR+PDGFRα-细胞(图4C)。分化后第4天，通过RT-PCR评估分化细胞的造血诱导的CD31和造血转录因子SCL、GATA2、RUNX1和LMO2 的表达示出，在大多数测试系中，随着CHIR剂量的增加，表现出更高倍数的上调(图9)。除了D9和IMR90之外，与5mM CHIR相比，当用15 mM CHIR剂量诱导时，所有其他hPSC系在分化后第14天造血前体细胞的倍数扩增显著增加(P<0.05)(图4D)。在红系分化之后，X13实现了 12605±2126的累积倍数扩增，显著高于所有测试的其他细胞系(图4F)。 9个系中的六个(D5、D9、X13、BR7、IMR90、hES-3)成功地分化为成红细胞(图4G)，并表达CD235a和高水平的HbF(表2)。对于表现最好的系，X13，每个接种的人多能干细胞可以衍生7607±1016CD235a+红系细胞(表2)。血红蛋白亚型的免疫印迹评价显示，与成人成红细胞相比，大多数人多能干细胞分化的成红细胞有α-血红蛋白，γ-血红蛋白和ε-血红蛋白的表达，其中β-血红蛋白的表达非常少(图40A和40C)。
还注意到，从BR7和X13分化的成红细胞也显示β-血红蛋白亚型的一些表达(图40)。人多能干细胞分化的成红细胞的氧平衡曲线显示与成人RBC(P50值，19.6±0.2)相比更高的氧结合亲和力(P50值范围为从 10.1至13.4)(图40A和40B)。与原代人骨髓间充质干细胞(MSC)共培养18天后，28-40.6％的成红细胞为CD235a+和DRAQ5(细胞可渗透核染料)阴性，指示为去核红系细胞(图40A和40D)。这进一步通过细胞的 Giemsa染色(图40E)和终末成熟的成红细胞的免疫荧光染色来证实，该染色显示CD235a+红细胞缺乏核染色(图40F)。
本文说明性描述的本发明可以在不存在本文未具体公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制的情况下适当地实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应被广义而非限制性地理解。另外，本文使用的术语和表达已经用作描述而非限制的术语，并且使用这些术语和表达并非意图排除所示出和描述的特征的任何等同物或其部分，但是应认识到，在所要求保护的本发明的范围内各种修改是可能的。因此，应当理解，尽管已经通过优选实施例和可选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以对在此公开的本发明实施例进行修改和变化，并且这些修改和变化被认为是在本发明的范围内。
如在本申请中所使用的，单数形式“一个(a/an)”、“一种(a/an)”和“所述”包括复数引用，除非上下文另外明确指出。例如，术语“遗传标志物”包括多种遗传标志物，包括其混合物和组合。
如本文所用，在制剂组分浓度的上下文中，术语“约”典型地是指所述值的±5％，更典型地是指所述值的±4％，更典型地是指所述值的±3％，更典型地是指所述值的±2％，甚至更典型地是指所述值的±1％，并且甚至更典型地为所述值的±0.5％。
贯穿本公开，某些实施方案可以范围形式公开。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对所公开的范围的僵化限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体公开了该范围内的所有可能的子范围以及单个数值。例如，诸如1至6的范围的描述应被认为已具体公开了诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等的子范围，，以及该范围内的单个数值，例如1、2、3、4、5、6。这与范围的宽度无关。
本文还可以广泛地和一般性地描述某些实施方案。属于一般公开内容的较窄种类和亚类分组中的每一个也形成本公开内容的一部分。这包括具有从该类中去除任何主题名称的附带条件或否定限制的实施方案的一般性描述，而不管所删除的材料是否在本文中具体叙述。
本文已经广泛地和一般性地描述了本发明。属于一般公开内容的较窄种类和亚类分组中的每一个也形成本发明的一部分。这包括具有从该类中去除任何主题名称的附带条件或否定限制的本发明的一般性描述，而不管所删除的材料是否在本文中具体叙述。
其他实施方案在所附权利要求书和非限制性实例内。此外，当本发明的特征或方面以马库什组的形式描述时，本领域技术人员将认识到，由此在本发明中也以马库什组的任何单个成员或成员的子组进行了描述。
实验部分
单层多能细胞培养
使用四(4)个重编程因子的仙台病毒转导，将O-neg人诱导多能干细胞(hiPSC)系(D5、D9、D11、D12、X13、BR2、BR7)从得自经同意的人供体(经新加坡国立大学伦理委员会批准)的指刺血的CD71+成红细胞重编程。
总之，在无菌实验室环境中收集总共10ml的指尖毛细血管血。将样品在2ml的1×红血球(RBC)裂解缓冲液(eBioscience)中裂解10分钟，然后以250g离心5分钟。离心后立即抽吸裂解缓冲液。用500ml细胞扩增培养基重悬经纯化的细胞，并接种到24孔组织培养板的一个孔中。含有StemSpan无血清扩增培养基(StemCell Technologies)的指刺(FP)血细胞扩增培养基补充有1×青霉素/链霉素(pen/strep)(Gibco)、1×L-谷氨酰胺(Gibco)，1×非必需氨基酸(Gibco)、50mg/ml L-抗坏血酸 (Sigma-Aldrich)、50ng/ml干细胞因子(Peprotech)、10ng/ml白介素-3 (Peprotech)、40ng/ml胰岛素样生长因子-1(Peprotech)、2U/ml促红细胞生成素(R&D Systems)和1mM地塞米松(Sigma-Aldrich)，含有或不含10ng/ml白介素-6(Peprotech)。每天更换培养基，小心地吸出一半培养基并用新鲜培养基替换。十二至16天后，当细胞群达到20,000-30,000个细胞时，用仙台病毒转导它们。
将总共20,000–30,000个细胞用OCT4、SOX2，KLF4和c-MYC仙台病毒(CytoTune-iPS重编程试剂盒；Life Technologies)进行转导，其中每个因子的感染复数为10(每个因子约5ml)。24小时后，通过用新鲜的细胞扩增培养基替换，来终止转导。在第3天，将细胞转移至在六孔组织培养板中经辐照的CF1-小鼠胚胎成纤维细胞(MEF；以每孔200,000的密度接种)的四至五个孔中，并且1:1比率的扩增培养基和用人胚胎干细胞 (hESC)培养基(Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基[DMEM]/F12，补充有 20％敲除血清替代物、具有非必需氨基酸溶液的100mM最低限度必需培养基，100mMβ-巯基乙醇、1×青霉素/链霉素、1×L-谷氨酰胺和10ng/ml 碱性成纤维细胞因子)。
两天后，将培养基更换为hESC培养基，每天更换培养基。从第14天开始，用1:1比率的MEF调节的hESC培养基和mTeSR1继续重编程。用于六孔培养的培养基的体积为每孔2ml。一旦形态上类似人胚胎干细胞 (hESC)的人诱导多能干细胞(hiPSC)集落出现，机械挑取集落并重新铺板到MEF上用于扩增。
获得人胚胎干细胞系hES-3和诱导多能干细胞(iPSC)系IMR90-iPSC。所有人多能干细胞(hPSC)系使用TeSRTM1培养基(STEMCELLTM Technologies，美国)培养。对本文详述的所选择的细胞系进行G-显带核型分析。
微载体多能细胞培养
简单地说，将得自用Accutase(ThermoFisher Scientific,美国)酶处理后的单层培养物的一百万个单细胞人多能干细胞接种到6孔超低附着 (ULA)板(Corning，美国)的各孔中，所述板含有5ml mTeSR1培养基、 10μM ROCK抑制剂Y27632(STEMCELLTechnologies)和胞外基质包被的聚苯乙烯微载体、iPS-Spheres(Brilliant Research，新加坡)，且按照制造商说明书进行培养。在用于实验之前，将人多能干细胞-微载体 (HPSC-MC)聚集体在连续搅动下在搅动平台中以110rpm或在静态条件下培养7天，每天更换培养基。
使用BMP4方案对hPSC-MC聚集体的造血中胚层诱导
先前已经描述了使用基于BMP4的方案对hPSC-MC聚集体的中胚层诱导。在静态条件下，在含有50ng/mlBMP4和50ng/ml VEGF165的 StemlineII造血干细胞扩增培养基(Sigma-Aldrich，美国)中培养一百万个 HPSC-MC聚集体。48小时后，除去一半培养基，用含有50ng/ml BMP4、 50ng/ml VEGF165和20ng/ml bFGF(所有细胞因子来自STEMCELLTechnologies)的Stemline II培养基替换。在用于造血前体细胞分化之前，将HPSC-MC聚集体再培养48小时。
用实验设计法多因子评价造血中胚层诱导和造血前体细胞产生
使用MODDE软件(Sartorius Stedim Biotech，德国)进行使用解析度 IV分数因子设计的实验设计(DoE)，以评价初始BMP4、激活素A和 CHIR-99021的剂量和暴露持续时间对以下响应因子的影响：中胚层诱导后 4天KDR+细胞的诱导或分化后2周产生的总造血前体细胞。
使用CHIR介导的优化方案的造血中胚层诱导
对实验设计(DoE)结果的分析和对由
Figure BDA0002689216970000571
软件产生的选定条件的评价允许开发用于人多能干细胞-微载体(hPSC-MC)聚集体的造血中胚层诱导的优化方案，所述人多能干细胞-微载体(hPSC-MC)聚集体最初在连续搅动下扩增。约2-4百万hPSC-MC聚集体在3ml的
Figure BDA0002689216970000572
培养基中分化，如下：第1天：30ng/ml BMP4、50ng/ml VEGF165、12μ MCHIR-99021(Selleck Chemicals，美国)，50ng/ml激活素A，第2天： 30ng/ml BMP4、50ng/mlVEGF165、50ng/ml激活素A，第3天：30ng/ml BMP4、50ng/ml VEGF165和20ng/ml bFGF。分化后四天，通过TrypLETM Express(ThermoFisher Scientific)处理衍生并通过40μm细胞过滤器(Greiner Bio-one，Germany)过滤的单细胞用于造血前体细胞和成红细胞扩增和成红细胞终末成熟，如本文详述。用流式细胞仪、实时荧光定量PCR、免疫印迹和显微成像等方法监测造血细胞和成红细胞分化。使用Hemox 分析仪(TCS Scientific公司，美国)测定分化的成红细胞的氧结合亲和力。
使用BMP4方案对hPSC-MC聚集体的造血中胚层诱导
在含有50ng/ml BMP4和50ng/ml VEGF165的StemlineII造血干细胞扩增培养基(Sigma-Aldrich，美国)中培养一百万个HPSC-MC聚集体。 48小时后，除去一半培养基，用含有50ng/ml BMP4、50ng/ml VEGF165和20ng/ml bFGF(所有细胞因子来自STEMCELLTechnologies)的Stemline II培养基替换。在用于造血前体细胞扩增之前，将HPSC-MC聚集体再培养48小时。
甲基纤维素培养基中造血前体细胞的扩增
通过用TrypLE处理将HPSC-MC聚集体解离成单细胞。在37℃表达 (ThermoFisherScientific)5分钟，通过40μm细胞滤器(Greiner Bio-one)，以1300rpm离心3分钟以沉淀细胞，并且用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗一次，然后重悬于Stemline II培养基中。将100μlStemline II培养基中的二十万个细胞转移到6孔超低附着板中，并在本文详述的静态条件下用 Blast生长培养基(BGM)培养2周。
成红细胞分化与增殖
将造血前体细胞与等体积的含有50ng/ml SCF(STEMCELL. Technologies)和3U/ml EPO(Peprotech，美国)的Stemline II培养基混合，持续另外7天。随后，细胞用PBS稀释10倍并通过3000rpm离心10分钟而沉淀。将成红细胞以2.5×105细胞/ml的浓度接种在于静态条件下在6 孔超低附着板中的3ml Stemline II培养基，该培养基含有1×血清替代物 3(Sigma-Aldrich)、0.3％v/v Ex-CYTE生长增强培养基补充剂(Merck，美国)、100ng/mlSCF、3U/ml EPO、1μM氢化可的松(Sigma-Aldrich 公司)、200μg/ml全转铁蛋白(MPBiomedicals)和1X青霉素-链霉素 (ThermoFisher Scientific)。每4天将细胞重悬于新鲜培养基中，每当细胞浓度超过2×106个细胞/ml，以2.5×105个细胞/ml重新接种。通过在实验过程中细胞传代之间获得的倍数扩增相乘来计算累积倍数扩增。
用实验设计法(MODDE软件)多因素评价造血中胚层诱导和造血前体细胞产生
使用MODDE软件(Sartorius Stedim Biotech，德国)进行使用解析度 IV分数因子设计(resolution IV Fractional Factorial Design)的实验设计 (DoE)，以评价初始BMP4、激活素A和CHIR-99021的剂量和暴露持续时间对以下响应因子的影响：中胚层诱导后4天KDR+细胞的诱导或分化后2周产生的总造血前体细胞。MODDE软件用所测试的因子的不同组合产生不同的实验条件，并允许鉴定单一因子或2-因子相互作用对响应因子是否具有统计学上有意义的作用(正或负)。R2得分>0.5的计算模型表示显著拟合的模型，Q2得分>0.1表示显著模型，而Q2>0.5表示用于估计未来预测精度的良好模型，模型有效性得分<0.25表示统计学上显著的模型问题且可重复性(与整体变异性相比，重复的变异)应大于0.5。
使用多因子条件，将人多能干细胞-微载体(HPSC-MC)聚集体(衍生自7天连续搅动条件，相当于5×105个细胞)接种在具有Stemline II培养基的24孔超低附着板中并分化，如图2A和图6A以及表3中详述。测试以下因子/剂量和持续时间：BMP4，持续4天(10-50ng/ml)；激活素A，前48小时(0-80ng/ml)；CHIR-99021，前24小时(0至15μM)；和 CHIR-99021，从24小时到48小时(0-15μM)。分化4天后VEGF165的浓度维持在50ng/ml，而在第2天加入20ng/ml的bFGF并维持至分化第 4天为止。对实验设计(DoE)结果的分析和对由MODDE软件产生的选定条件的评价允许开发用于hPSC-MC聚集体的造血中胚层诱导的优化方案，所述hPSC-MC聚集体最初在连续搅动下扩增。将3ml的Stemline II 培养基中的约2至4百万hPSC-MC聚集体分化如下：第1天：30ng/ml BMP4，50ng/ml VEGF165，10-15μM CHIR-99021(SelleckChemicals，美国)，50ng/ml激活素A；第2天：30ng/ml BMP4，50ng/ml VEGF165，50 ng/ml激活素A；第3天：30ng/ml BMP4，50ng/ml VEGF165和20ng/ml bFGF。
在分化4天后，通过用TrypLE处理从微载体聚集体衍生单细胞。表达并通过40μm滤器将细胞与微载体分离。将分化的细胞在4％多聚甲醛中在室温固定30分钟，离心并且用PBS冲洗一次，之后于4℃、在含有 1％BSA(Sigma-Aldrich)的PBS中储存，用于KDR的流式细胞术分析。对于造血前体细胞产生，将来自每种实验条件的1×105个单细胞接种至12 孔超低附着板的每个孔中的如以上详述的Blast生长培养基(BGM)中。使造血培养物扩增2周，然后使用Nucleocounter NC-3000(Chemometec) 计数扩增细胞的总数。然后固定细胞用于CD31和CD43的流式细胞术分析。以2周后衍生的细胞总数与最初接种1×105个细胞相比来计算倍数扩增。
成红细胞终末成熟
通过将成红细胞与原代人间充质干细胞(MSC)共培养3周来诱导终末成熟和去核。将最初在补充有10％FCS(Life Technologies)的α-最低限度基本培养基(α-MEM；ThermoFisher Scientific)中培养的间充质干细胞以每孔1×105个细胞的密度接种到6孔板上。以1×106细胞/ml的浓度重悬于去核培养基中的成红细胞与预接种的间充质干细胞共培养，该去核培养基包含Iscove’s的改良的Dulbecco’s培养基(IMDM；ThermoFisherScientific)和8％的人血清(Sigma-Aldrich)，1×脂质混合物(Peprotech)， 6U/ml EPO，50ng/ml SCF，1000μg/ml全转铁蛋白和1×青霉素-链霉素。将细胞转移至新鲜接种的间充质干细胞(MSC；1×105个细胞/孔)每周一次，持续2至3周，更换新鲜培养基。
RNA提取和定量实时PCR
将细胞样品在Trizol试剂(ThermoFisher Scientific)中裂解并储存在 -80℃，直至RNA提取为止。使用Direct-zolRNA提取试剂盒(Zymo Research)根据制造商的说明进行DNA酶处理的RNA提取。通过使用NanoDrop UV-Vis分光光度计(ThermoFisherScientific)的OD260 nm测量对RNA样品进行定量。
使用iScript用500ng总RNA合成第一链cDNA。Advanced cDNA合成试剂盒(BioRad，美国)使用如表4中详述的基因特异性引物，将在无RNA酶的水中以1:10稀释的cDNA样品用于定量实时PCR。
表4-用于实时PCRT的基因特异性引物
Figure BDA0002689216970000611
Figure BDA0002689216970000621
使用上表4中所列的基因特异性引物iTAQ分析早期造血标志物的相对量。通用SYBR绿色超混合物(BioRad)和Applied Biosystems 7500FAST 实时PCR系统(ThermoFisher Scientific)。将GAPDH用作将样品量标准化的管家基因。使用δ-δc(t)方法测定基因表达的相对变化。
免疫印迹
使用2x Laemmli缓冲液(Bio-Rad)裂解后，从冷冻细胞沉淀中提取用于分析的蛋白样品，并使用BCA蛋白测定试剂盒(ThermoFisher Scientific)定量。将50μg细胞裂解物加样至SDS-PAGE凝胶并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad)。将膜用5％脱脂乳在室温封闭2小时，然后与一抗[1:800稀释的β-球蛋白(Santa Cruz，SC-21757)、1:400 稀释的γ-球蛋白(Santa Cruz，SC-21756)、1:2000稀释的α-球蛋白(Santa Cruz，SC-31110)、1:400稀释的ε-球蛋白(Abcam，ab156041)和1:2000 稀释的肌动蛋白(Santa Cruz，SC-1615)]于室温孵育持续1.5小时。然后用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗小鼠IgG(JacksonImmunoResearch)、 HRP缀合的抗兔IgG(Jackson ImmunoResearch)或HRP缀合的抗山羊IgG(Jackson ImmunoResearch)以1:10000的稀释度孵育印迹。使用 SuperSignal West DuraExtended Duration Substrate(Thermo Scientific)检测免疫复合物，并将其捕获到CLXposure膜上(Thermo Scientific)。使用 ImageJ软件(https://imagej.nih.gov/ij/)测量条带强度，将其归一化至加样对照(肌动蛋白)，并报告为总血红蛋白条带的百分比。
毛细管Western blot
使用全自动系统Peggy Sue(Proteinsimple，R&D，美国)，进行毛细管蛋白印迹。根据制造商的方案(www.proteinsimple.com)基于大小分离(12-230kDa)来对蛋白质进行分离、检测和定量。在含有1×苯甲基磺酰氟(PMSF)、1×磷酸酶和1×蛋白酶抑制剂(BioSpes)的1×细胞裂解缓冲液(Cell Signaling Technology)中制备细胞裂解物。通过毛细管电泳分离1mg/ml的总蛋白样品(在95℃用DTT和SDS变性)，用封闭缓冲液封闭，用第一兔单克隆抗体[1:100稀释的Brachyury(D2Z3J)、TCF1/TCF7 (C63D9)、TCF3/TCFF7L1(D15G11)、Lef1(C12A5)、SMAD1(D59D7)， 1:50稀释的pSMAD1/5Ser 463/465(41D10)、1:5000稀释的GAPDH(D16H11)](全部来自Cell Signaling Technology)[1:50稀释的SMAD7 (Sigma-Aldrich)]进行探针探测，然后是辣根过氧化物酶缀合的二抗，并用Luminol/过氧化物酶底物检测。化学发光信号的鉴定和定量用Compass 软件(Proteinsmple)进行，其用于将化学发光信号转化为蛋白印迹图像。
流式细胞术
用于流式细胞术的样品在4％多聚甲醛(eBioscience)中固定30分钟，并于4℃在含有1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS中储存。对于多能性测量，在室温(25℃)将样品与以下稀释的一抗一起孵育20分钟：1:100Oct4 (R&D Systems，美国)；1:50Tra1-60(Millipore)，1:100SSEA4(BioLegend，美国)。用FACS缓冲液(PBS+1％BSA)洗涤后，使用1:500稀释的兔抗小鼠IgG-FITC缀合物(DAKO)检测一抗。在用FACS缓冲液洗涤并通过 40μm筛过滤后，将样品在NovoCyte流式细胞仪(ACEA Biosciences公司，美国)上运行并使用FlowJo软件进行分析。
对于中胚层和造血表面标志物的流式细胞分析，在室温将细胞与1:50 稀释的直接缀合的抗体孵育15分钟。使用以下人抗体：T-brachyury-FITC (R&D Systems)、KDR-PE(Miltenyi Biotec)、CD31-PE、CD43-FITC、 CD 45-PE、CD71-APC、CD235a-FITC(均来自BDBiosciences，美国)。用以下抗体作为同种型对照：小鼠IgG1-FITC和PE(Miltenyi Biotec，德国)、小鼠IgG2bk-FITC和小鼠IgG2ak-APC(BD Biosciences)。为了分析血红蛋白，用含有1％BSA和0.1％TritonX-100的PBS来透化细胞，并与 1:50稀释的胎儿血红蛋白-FITC(ThermoFisher Scientific)或成人血红蛋白 -PE抗体(Santa Cruz Biotechnology，美国)孵育。
通过流式细胞术分析用1:100稀释的CD235a-FITC和1:5000稀释的细胞可渗透核染料DRAQ-5(eBioscience)染色的活细胞来检测去核细胞。
免疫组织化学和显微镜成像
使用Cytospin 4细胞离心机(Thermofisher Scientific)将100 0l PBS 中的细胞样品以500rpm离心3分钟旋涂至载玻片上。将细胞在100％甲醇 (Sigma-Aldrich)中固定5分钟，用蒸馏水漂洗并在室温储存。载玻片用 Giemsa染色剂(Sigma-Aldrich)染色20分钟，用PBS(pH 7.2)漂洗并使其风干，然后用VECTASHIELD HardSet抗褪色封固剂(VECTORLaboratories)封固并盖玻片。使用Axiovert 200M倒置显微镜(Zeiss)对载玻片成像。
使用Nikon Eclipse Ti-E荧光显微镜(Nikon)对终末成熟的成红细胞进行免疫荧光成像。
使用EVOSR细胞成像系统(Thermofisher Scientific)拍摄所有其他细胞图像。通过分析每个细胞系至少40个人多能干细胞-微载体聚集体，使用ImageJ软件进行人多能干细胞(hPSC)-微载体聚集体平均直径的计算。
氧平衡曲线
用B型Hemox分析仪(TCS Scientific公司)产生hPSC分化的成红细胞的氧结合和解离平衡曲线。在HEMOX溶液(TCS Scientific公司)中大约1×107个成红细胞在氧气饱和条件下使用压缩空气运行，然后使用氮气在脱氧条件下运行。使用Hemox AnalyticalSoftware计算p50值(产生 50％氧合血红蛋白饱和度的氧压)。将成人外周血(来自供体)作为对照。所有样品均一式两份测量。
核型分析
本实验中使用的人多能干细胞系用于G-显带核型分析(KKH妇幼医院，病理和检验医学，新加坡)，其中通常评价20个细胞中期的总染色体异常和非整倍性。
统计分析
使用GraphPad Prism 6(Graphpad软件公司)进行统计分析。将Student’非配对t检验用于在具有相等方差的两组之间进行比较，并且当假设方差不相等时使用Mann-Whitney检验。P值小于0.05(p<0.05)被认为是显著的。
OP9鼠基质细胞系的微载体培养方案
将OP9培养物(ATCC：CR-2749)在具有补充有20％FCS(Gibco) 和1×青霉素/链霉素的Alpha-MEM培养基(ThermoFisher)的常规组织培养瓶中的单层培养物上培养。通过在37℃用TrypLETM进行酶处理5分钟而获得单细胞。将二十万个细胞接种到6孔超低附着板(Corning)的各孔中，所述超低附着板含有5ml Alpha-MEM 20％FCS培养基和20mg
Figure BDA0002689216970000651
Plastic Plus微载体(Pall公司)。在37℃在摇摆平台中以75rpm 搅动板，以允许细胞附着到微载体。在用于与成红细胞共培养之前，将 OP9-MC培养物在连续搅动下培养2天。
hiPSC/CB成红细胞与OP9-MC共培养的终末成熟方案
在本申请说明书的第67页第15-25行中描述了人诱导多能干细胞 (hiPSC)成红细胞的衍生和培养。
人诱导多能干细胞成红细胞在旋转培养瓶中连续搅动培养。根据如前所述的方案进行脐带血(CB)成红细胞的分化，除了其在连续搅动下在旋转培养瓶中进行。
总之，细胞在改良的无血清培养基中培养，该培养基补充有1％去离子BSA、120mg/ml铁饱和人转铁蛋白、900ng/ml硫酸亚铁、90ng/ml硝酸铁和10mg/ml胰岛素(Sigma)。扩增程序包含三步。第一步(第0-8天)，在10-6M氢化可的松(Sigma)、100ng/ml干细胞因子(SCF)、5ng/ml IL-3 (R&D Systems)和3IU/ml促红细胞生成素(Eprex)存在下，培养104个细胞/mlCD34+细胞。在第4天，将一体积的细胞培养物在四体积的含有氢化可的松、SCF、IL-3和促红细胞生成素的新鲜培养基中稀释。第二步 (3天)，将细胞以5×104、1×105、2×105或3×105/ml(分别用于脐带血、白细胞分离术(LK)、骨髓和外周血细胞)重悬浮，并在补充有促红细胞生成素的新鲜培养基中在粘附基质层上共培养。在第三步中(持续至第10天)，在不含细胞因子的新鲜培养基中在粘附基质层上培养细胞。
将培养物保持在在37℃、含5％CO2的空气中。粘附细胞层由MS-5 基质细胞系或间充质基质细胞(MSC)组成，其是由成人正常全骨髓在补充有10％胎牛血清的RPMI(Invitrogen)中制成。通过至少两次连续的传代扩增和纯化所粘附的MSC。
将成红细胞转移到6孔超低附着板中并以2×106细胞/ml(5ml体积) 的浓度接种到成熟培养基中，并与从6孔板的1孔获得的OP9-MC聚集体共培养(最初以2×105细胞/孔接种并培养2天)。将板在37℃在摇摆平台中以75rpm搅动。终末成熟进行3周，每培养3天进行完全培养基更换。每周收集单细胞(从通过40μM筛过滤衍生)用于流式细胞术分析和Giemsa染色以评价去核。
终末成熟培养基配方：IMDM，补充有10％人血浆(iDNA)、1×青霉素/链霉素、10μg/ml人重组胰岛素(Gibco)、500μg/ml全转铁蛋白、4U/ml 人重组EPO(Peprotech)、5％v/v肝素、1μM米非司酮。
用于富集去核红血球(RBC)的方案
通过使活/死细胞和有核细胞通过非织造织物(NWF)过滤器(Antoshin，新加坡)，来从活/死细胞和有核细胞的混合物中分离去核红血球(RBC)。简单地说，用10ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)漂洗非织造织物(NWF)过滤器。使用30ml注射器缓慢地使10ml磷酸盐缓冲盐水中浓度为107个细胞/ml的细胞轻柔地通过非织造织物过滤器，收集滤液。非织造织织物过滤器随后用10ml磷酸盐缓冲盐水冲洗并收集在与滤液相同的管中。过滤的细胞在室温以1500rpm离心(spin)5分钟。将收集的红血球再悬浮在含有腺嘌呤的柠檬酸盐-磷酸盐-右旋糖溶液(Sigma-Aldrich)中并保存在4℃用于进一步分析。
用于评价去核红血球(RBC)的方案
流式细胞术
将从通过40μm过滤器的过滤细胞悬浮液衍生的未固定单细胞悬浮在磷酸盐缓冲盐水中并用于流式细胞术。简单地说，大约每孔100,000个细胞(96孔v-底板)以1500rpm离心3分钟。于黑暗中、在25℃，将细胞沉淀重悬于100μl具有1:100稀释度的膜联蛋白V-FITC缀合的抗体 (E-bioscience)(用于评价细胞凋亡)或具有1:100稀释度的CD235a-FITC 缀合的抗体(E-Bioscience)的1×膜联蛋白V结合缓冲液(Thermofisher Scientific)中，持续20分钟。细胞以1500rpm离心3分钟，之后用200μl 的1×膜联蛋白V结合缓冲液洗涤。最后将细胞重悬于200μl含有1:5000 稀释的DRAQ5(E-bioscience)的1×结合缓冲液中。在Novocyte流式细胞仪上评价细胞并在488nm和647nm处检测。
Giemsa染色
使用cytospin离心机以350g离心5分钟将约50,000-100,000个细胞旋涂到显微镜载玻片上。使用100％甲醇将细胞固定5分钟并风干。在25℃将固定细胞用以pH 7.2的磷酸盐缓冲盐水缓冲液(Sigma)以1:10稀释的 Giemsa染剂(Sigma)染色15分钟。将染色的细胞用pH 7.2的磷酸盐缓冲盐水缓冲液冲洗，然后使用明场显微镜(Zeiss Axiovert)观察/成像。
可扩大规模的搅动悬浮培养分化平台的开发方案，用于从O阴性人诱导多能干细胞中产生红系细胞
人诱导多能干细胞-微载体(hiPSC-MC)聚集体的造血中胚层诱导
将人诱导多能干细胞微载体(hiPSC-MC)聚集体(1×106细胞/ml或 1e6细胞/ml)转移至在75rpm连续搅动下的6孔超低附着板(5ml)或在 36rpm连续搅动下的125ml旋瓶(50ml)中的中胚层诱导培养基(所有细胞因子均来自Stemcell Technologies)和StemlineII造血干细胞扩增培养基(SL2)中。每天按如下指示更换培养基：第0天：SL2+30ng/ml BMP4+50 ng/ml VEGF-165+40ng/ml激活素A+12-15μM CHIR-99021；第1天： SL2+30ng/ml BMP4+50ng/ml VEGF-165+40ng/ml激活素A；第2天： SL2+20ng/ml BMP4+30ng/ml VEGF165+5ng/ml激活素A+10ng/ml bFGF+20ng/ml SCF+0.4ng/mlβ-雌二醇。在第1天和第3天分别收集样品用于T-brachyury(T-Bra)和KDR/PDGFRα细胞的流式细胞术分析。
从人诱导多能干细胞-微载体(hiPSC-MC)聚集体衍生的细胞的造血诱导
在分化的第3天，于37℃用TrypLETM Express(Thermofisher Scientific) 处理5分钟后，从hiPSC-MC聚集体衍生单细胞，之后通过40μm细胞过滤器(Greiner Bio-one，德国)过滤。将细胞以1.25×105至2.5×105细胞 /ml的浓度接种在在6孔超低附着板(5ml)、50ml摇瓶(10ml)或125ml 旋瓶(50ml/孔)中的造血诱导培养基中。按指示进行完全培养基更换(除非另有说明)：第3天：SL2+20ng/ml BMP4+30ng/ml VEGF-165+10 ng/ml bFGF+30ng/ml SCF+10ng/ml IGF2+10ng/ml TPO+5U/ml肝素 +50μM IBMX+0.4ng/mlβ-雌二醇；第5天：最高1:6，用SL2+120ng/ml BMP4+180ng/ml VEGF-165+60ng/ml bFGF+180ng/ml SCF+60ng/ml IGF2+60ng/ml TPO+30U肝素+300μM IBMX+2.4ng/mlβ--雌二醇；第7天：SL2+20ng/ml BMP4+30ng/ml VEGF+10ng/ml bFGF+30ng/ml SCF+10ng/ml IGF2+10ng/ml TPO+5U/ml肝素+50μM IBMX+0.4 ng/mlβ-雌二醇+1μM干再生素1(SR1)(StemcellTech)。第9天：最高1:2，用SL2+20ng/ml BMP4+30ng/ml VEGF165+10ng/ml bFGF+30 ng/ml SCF+10ng/ml IGF2+10ng/ml TPO+5U/ml肝素+50μM IBMX+ 0.4ng/mlβ-雌二醇。
从hiPSC-MC聚集体衍生的细胞的红系诱导
将细胞以1.25×105至2.5×105细胞/ml接种到在6孔超低附着板(5ml)、 50ml摇瓶(10ml)或125ml旋瓶(50-100ml)中的红系诱导培养基中。按指示进行完全培养基更换(除非另有说明)：第11天：SL2+6.7ng/ml BMP4+30ng/ml SCF+50μM IBMX+1μM氢化可的松(Sigma-Aldrich) +16.7ng/ml Flt3L+6.7ng/ml IL3+4U/ml EPO(Peprotech)；第13天：最高 1:6，用SL2+40.2ng/ml BMP4+180ng/ml SCF+300μM IBMX+6μM氢化可的松(Sigma-Aldrich)+100.2ng/ml Flt3L+40.2ng/ml IL3+24U/ml EPO+3μM Pluripotin；第15天开始：SL2+1×血清替代物3(Sigma-Aldrich) +0.3％v/v ExCyte试剂(Millipore)+1μM氢化可的松+100ng/ml SCF+4 U/ml EPO+10ng/ml IL3+0.2mg/ml全铁蛋白(MPBiomedicals)+1×青霉素和链霉素。从第15天开始，每3天进行一次完全培养基更换。在高细胞密度培养中，当细胞密度超过5×106个时(5e6个细胞/ml)，每天进行完全培养基更换。为了获得高累积倍数扩增，无论何时细胞密度超过5×106个细胞/ml(5e6个细胞/ml)，以1×106个细胞/ml(1e6个细胞/ml)接种回细胞。通过在进行的实验过程中细胞传代之间获得的倍数扩增相乘来计算累积倍数扩增。
序列表
<110> 加速技术有限公司
<120> 用于在悬浮培养物中分化人多能干细胞系的方法
<130> 9869SG5339
<160> 22
<170> PatentIn第3.5版
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 1
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<223> CD31反向引物
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<400> 9
ggatgccttc cctatgttca 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCL/Tal-1反向引物
<400> 10
ggtgtgggga ccatcagtaa 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RunX1正向引物
<400> 11
ccgagaacct cgaagacatc 20
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RunX1反向引物
<400> 12
gctgaccctc atggctgt 18
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 血红蛋白亚型α正向引物
<400> 13
cggtcaactt caagctccta ag 22
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 血红蛋白亚型α反向引物
<400> 14
ccgcccactc agactttatt 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 血红蛋白亚型γ正向引物
<400> 15
tggatcctga gaacttcaag 20
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 血红蛋白亚型γ反向引物
<400> 16
gcagaataaa gcctatcctt gaaag 25
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 血红蛋白亚型ε正向引物
<400> 17
aagatgaatg tggaagaggc tgg 23
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 血红蛋白亚型ε反向引物
<400> 18
ttagcaaagg cgggcttgag 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 血红蛋白亚型β正向引物
<400> 19
acatttgctt ctgacacaac 20
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 血红蛋白亚型β反向引物
<400> 20
acagatcccc aaaggact 18
<210> 21
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH正向引物
<400> 21
ctcctcctgt tcgac 15
<210> 22
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH反向引物
<400> 22
accaaatccg ttgact 16

Claims (41)

1.一种将多能干细胞分化为造血前体细胞的方法，其中所述方法在悬浮搅动下进行，并且其中在中胚层诱导阶段期间加入GSK-3-抑制剂或Wnt通路激活剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述将多能干细胞分化为造血前体细胞的方法包括以下阶段：
a.中胚层诱导阶段；
b.造血诱导阶段；
c.成红细胞诱导阶段；以及
d.成红细胞成熟阶段。
3.如权利要求2所述的方法，其中在所述多能干细胞扩增阶段期间，将多能干细胞扩增至1.5×105至4×106细胞/ml的浓度。
4.如权利要求2或3所述的方法，其中所述中胚层诱导阶段导致在来自所述多能干细胞扩增阶段的多能干细胞中诱导中胚层形成，产生KDR+PDGFRα-造血前体细胞。
5.如权利要求2至4中任一项所述的方法，其中所述造血诱导阶段导致来自中胚层诱导阶段的造血前体细胞扩增，产生CD34/CD43/CD45造血祖细胞。
6.如权利要求2至5中任一项所述的方法，其中所述成红细胞扩增阶段导致来自所述造血诱导阶段的造血祖细胞扩增，产生CD235a+CD71+成红细胞。
7.如权利要求2至6中任一项所述的方法，其中所述成红细胞成熟阶段导致来自所述成红细胞扩增阶段的成熟的CD235a+成红细胞的终末成熟和去核，产生去核的CD235a+成红细胞。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述方法包括在所述中胚层诱导阶段期间使用细胞培养基，所述细胞培养基包含：
■骨形态发生蛋白，
■GSK3-抑制剂或Wnt通路激活剂，
■激活素A，和
■血管内皮生长因子。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述GSK3-抑制剂选自由以下各项组成的组：丙戊酸钠盐、星形孢菌素、KT 5720(CAS 108068-98-0)、GSK-3抑制剂IX(CAS 667463-62-9)、Ro 31-8220(CAS 138489-18-6)、SB-216763(CAS 280744-09-4)、CID 755673(CAS521937-07-5)、Kenpaulone(CAS 142273-20-9)、氯化锂、GSK-3β抑制剂XII(TWS119；CAS601514-19-6)、GSK-3抑制剂XVI(CAS252917-06-9)、10Z-Hymenialdisine(CAS 82005-12-7)、靛玉红(CAS 479-41-4)，CHIR-98014(CAS 252935-94-7)、GSK-3β抑制剂VI(CAS 62673-69-2)、曼扎明A(CAS 104196-68-1)、靛玉红3'-单肟(CAS 160807-49-8)、GSK-3抑制剂X(CAS 740841-15-0)、GSK-3抑制剂XV、SB-415286(CAS 264218-23-7)、1-氮杂坎帕罗酮(CAS676596-65-9)、TWS 119二三氟乙酸酯(CAS 601514-19-6)、5-碘-靛玉红3’-一肟、GSK-3β抑制剂I(CAS 327036-89-5)、9-Cyanopaullone、靛玉红-5-磺酸钠盐、GSK-3β抑制剂VII(CAS99-73-0)、Cdk1/5抑制剂(CAS 40254-90-8)、Hymenidin(CAS 107019-95-4)、双吲哚基马来酰亚胺X盐酸盐(CAS 131848-97-0)、3F8(CAS 159109-11-2)、isogranulatimide(CAS244148-46-7)、CR8、(R)-异构体(CAS 294646-77-8)L-779,450(CAS 303727-31-3)、靛玉红-3'-单肟-5-磺酸(CAS 331467-05-1)、GSK-3抑制剂II(CAS 478482-75-6)、GSK-3β抑制剂VIII(CAS 487021-52-3)、Aloisine A(CAS 496864-16-5)、GSKβ抑制剂XI(CAS 626604-39-5)、GSK-3抑制剂IX(CAS 710323-61-8)、阿特波龙、2-氰乙基(CAS 852529-97-0)、TCS2002(CAS 1005201-24-0)、TCS 21311(CAS 1260181-14-3)、A 1070722(CAS 1384424-80-9)、Ro-31-8220(CAS 138489-18-6)、Enzastaurin(CAS 138489-18-6)、MeBIO(CAS 667463-95-8)、Cdk2/9抑制剂(CAS 507487-89-0)、Cdk1/2抑制剂III(CAS 443798-55-8)、PHA767491盐酸盐(CAS 845714-00-3)、AR-AO 14418-d3、吲哚-3-乙酰胺(CAS 879-37-8)、Hymenialdisine类似物1(CAS 693222-51-4)、CHIR-99021(也称为6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶腈和CT99021；CAS252917-06-9)、CHIR-98014(CAS 556813-39-9)、(2’Z,3’E)-6-溴靛玉红-3’-肟(Bio；CAS667463-62-9)、Bio-丙酮肟(CAS 667463-85-6)、SB216763(CAS 280744-09-4)及其组合。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述GSK3-抑制剂是CHIR-99021或其衍生物。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述Wnt通路激活剂选自由IQ-1和Wnt3a组成的组。
12.如权利要求8至11中任一项所述的方法，其中所述骨形态发生蛋白是BMP4。
13.如权利要求8至12中任一项所述的方法，其中所述血管内皮生长因子是VEGF165。
14.如权利要求8-13中任一项所述的方法，其中所述细胞培养基包含BMP4、激活素A、CHIR99021和VEGF165。
15.如权利要求8至14中任一项所述的方法，其中BMP4以26至36ng/ml的浓度存在，其中激活素A以35至46ng/ml的浓度存在，其中CHIR-99021以8μM至14μM的浓度存在，并且其中VEGF165以48ng/ml至51ng/ml的浓度存在。
16.一种细胞培养基，其用于将多能干细胞分化为造血前体细胞，从而使用微载体胚状体(EB)从多能干细胞生成造血前体细胞，所述细胞培养基包含：
-骨形态发生蛋白，
-GSK-3激酶抑制剂，其中所述抑制剂选自由以下组成的组：CHIR99021、(2’Z,3’E)-6-溴靛玉红-3’-肟(Bio；CAS 667463-62-9)、Kenpaullone(CAS 142273-20-9)、GSK-3β抑制剂XII(TWS119；CAS 601514-19-6)、Bio-丙酮肟(CAS 667463-85-6)、CHIR-98014、SB216763(CAS 280744-09-4)、GSK-3β抑制剂VIII(CAS 487021-52-3)及其组合，或Wnt通路激活剂，
-激活素A和
-血管内皮生长因子。
17.如权利要求16所述的细胞培养基，其中所述造血前体细胞是KDR+PDGFRα-造血前体细胞。
18.如权利要求16至17中任一项所述的细胞培养基，其用于搅动悬浮培养。
19.如权利要求16至18中任一项所述的细胞培养基，其中所述骨形态发生蛋白是BMP4。
20.如权利要求16至19中任一项所述的细胞培养基，其中所述Wnt通路激活剂选自由IQ-1和Wnt3a组成的组。
21.如权利要求16至20中任一项所述的细胞培养基，其中所述血管内皮生长因子是VEGF165。
22.如权利要求16至21中任一项所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含BMP4、激活素A、CHIR99021和VEGF165。
23.如权利要求16至22中任一项所述的细胞培养基，其中BMP4以26ng/ml至36ng/ml的浓度存在，其中激活素A以35至46ng/ml的浓度存在，其中CHIR99021以8μM至14μM的浓度存在，并且其中VEGF165以48ng/ml至51ng/ml的浓度存在。
24.一种细胞培养基，其用于将多能干细胞分化为造血前体细胞，从而使用微载体胚状体(EB)或多能干细胞从多能干细胞生成造血前体细胞，所述细胞培养基包含：
-骨形态发生蛋白，
-激活素A，和
-血管内皮生长因子。
25.如权利要求24所述的细胞培养基，其中所述骨形态发生蛋白是BMP4。
26.如权利要求24至25中任一项所述的细胞培养基，其中所述血管内皮生长因子是VEGF165。
27.如权利要求24至26中任一项所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含BMP4、激活素A和VEGF165。
28.如权利要求24至27中任一项所述的细胞培养基，其中BMP4以26至36ng/ml的浓度存在，其中激活素A以35至46ng/ml的浓度存在，且其中VEGF165以48ng/ml至51ng/ml的浓度存在。
29.一种细胞培养基，其用于将多能干细胞分化为造血前体细胞，从而使用微载体胚状体(EB)或多能干细胞从多能干细胞生成造血前体细胞，所述细胞培养基包含：
-骨形态发生蛋白，
-激活素A，
-bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)或其变体，
-激素，
-细胞因子，和
-血管内皮生长因子。
30.如权利要求29所述的细胞培养基，其中所述骨形态发生蛋白是BMP4。
31.如权利要求29至30中任一项所述的细胞培养基，其中，所述激素是β-雌二醇。
32.如权利要求29所述的细胞培养基，其中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或其变体是bFGF的热稳定嵌合变体或稳定嵌合成纤维细胞生长因子(FGF)。
33.如权利要求29至32中任一项所述的细胞培养基，其中所述细胞因子是干细胞因子(SCF)。
34.如权利要求29至33中任一项所述的细胞培养基，其中所述血管内皮生长因子是VEGF165。
35.如权利要求29至34中任一项所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基包含BMP4、激活素A、bFGF、β-雌二醇、SCF和VEGF165。
36.如权利要求29至35中任一项所述的细胞培养基，其中BMP4以18ng/ml至27ng/ml的浓度存在，其中激活素A以3ng/ml至7ng/ml的浓度存在，其中bFGF以5ng/ml至14g/ml的浓度存在，其中所述β-雌二醇以0.2ng/ml至0.8ng/ml的浓度存在，其中所述SCF以26ng/ml至36g/ml的浓度存在，并且其中VEGF165以32ng/ml至38ng/ml的浓度存在。
37.一种用于将多能干细胞分化为造血前体细胞的方法，其中所述方法在悬浮搅动下进行，所述方法包括
a.将多能干细胞暴露于如权利要求15至31中任一项所定义的细胞培养基持续24小时(第0天至第1天)，从而产生T-Brachyury(T-Bra；原条/早期中胚层标志物)阳性细胞；
b.将步骤a.的细胞暴露于根据权利要求48至57中任一项所述的细胞培养基持续24小时(第1天至第2天)；
c.将步骤c.的微载体附着的细胞暴露于根据权利要求58至76中任一项所述的细胞培养基持续48小时(第2天至第4天)，由此步骤a.至步骤b.诱导中胚层诱导；
d.去除细胞培养基，并分离步骤c所得的KDR+PDGFRα-造血前体细胞。
38.一种用于将多能干细胞分化为造血前体细胞的方法，其中所述方法在悬浮搅动下进行，所述方法包括
(a)在从进行悬浮搅动的细胞培养物分离的多能干细胞中诱导中胚层诱导，从而产生KDR+PDGFRα-造血前体细胞；
(b)在从步骤a分离的细胞中诱导造血诱导，从而产生CD34/CD43/CD45造血祖细胞；
(c)在从步骤b分离的细胞中诱导成红细胞扩增，从而产生CD235a+CD71+成红细胞；
(d)在从步骤c分离出的细胞中诱导成红细胞成熟，从而产生CD235a+DRAQ5-ve去核的成红细胞；
(e)去除细胞培养基，并分离步骤d得到的CD235a+DRAQ5-ve去核的成红细胞。
39.根据权利要求37至38中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞附着于微载体。
40.根据权利要求1至15中任一项所述的方法、根据权利要求16至36中任一项所述的细胞培养基、或根据权利要求37至39中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是诱导多能干细胞。
41.一种试剂盒，其包含微载体和根据权利要求16至36中任一项所述的细胞培养基。
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