JP2021510527A - 懸濁培養におけるヒト多能性幹細胞系の分化のための方法 - Google Patents

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Abstract

多能性幹細胞を造血前駆細胞に分化させるための方法であって、懸濁撹拌下で実施し、ＧＳＫ−３阻害因子またはＷｎｔ経路活性化因子を中胚葉誘導のステージで添加する方法が記載されている。さらに、本明細書に記載の方法に使用するための細胞培養培地、および当該方法を実施するためのキットを開示する。

Description

関連出願に対する相互参照
本願は、２０１８年１月１８日に出願したシンガポール国仮出願第１０２０１８００４８８Ｗの優先権を主張するものであり、その内容は本記載をもって完全に組み込まれるものとする。
本発明は、概して分子生物学の分野に関連する。具体的には、本発明は細胞分化の方法に関する。
ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣｓ）の赤血球分化は、赤血球（ＲＢＣｓ）の無限の供給源を作製する手段として提案されている。これを実現するためには、スケーラブルな、懸濁培養分化方法が開発されなければならない。骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ４）ベースの分化プロトコルを用いた振盪マイクロキャリア（ＭＣ）懸濁培養で増殖させたヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣｓ）の赤血球分化が既に報告されており、ここでは中胚葉誘導および赤芽球増殖を静置条件下で実施した。しかしながら、この方法を複数のｈＰＳＣ系の分化に使用する試みは、赤血球分化のばらつきを示した。
万能なＯ陰性（ｎｅｇ）赤血球（ＲＢＣｓ）は、Ｏ陰性の血液型のドナーから作製したヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣｓ）の分化によって誘導することができる。ヒト人工多能性幹細胞から作製した赤血球は、医療産業における緊急輸血に対する需要を補う、無制限の細胞供給原となり得るものである。１単位の血液が１兆個の赤血球を必要とすることを踏まえると、より多くの赤血球の作製を可能とする効率的な分化およびバイオプロセスの開発に対する需要がある。ヒト人工多能性幹細胞を赤血球へと分化させるいろいろな手段が報告されているが、これらの中に、アップスケーリング可能であると示されたものは未だない。
一態様において、本発明は、多能性幹細胞を造血前駆細胞に分化させる方法に関し、当該方法は、懸濁撹拌下で実施され、ＧＳＫ−３阻害因子またはＷｎｔ経路活性化因子が中胚葉誘導ステージで添加される。
別の態様において、本発明は、多能性幹細胞の造血前駆細胞への分化のための細胞培養培地であって、マイクロキャリア胚様体（ＥＢ）を用いて多能性幹細胞から造血前駆細胞を作製するものに関し、当該細胞培養培地は、骨形態形成タンパク質と、ＣＨＩＲ９９０２１、（２’Ｚ、３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−オキシム（Ｂｉｏ、ＣＡＳ ６６７４６３−６２−９）、カンパウロン（Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）（ＣＡＳ １４２２７３−２０−９）、ＧＳＫ−３ベータ阻害因子ＸＩＩ（ＴＷＳ１１９、ＣＡＳ ６０１５１４−１９−６）、ビオ−アセトオキシム（ＣＡＳ ６６７４６３−８５−６）、ＣＨＩＲ−９８０１４、ＳＢ２１６７６３（ＣＡＳ ２８０７４４−０９−４）、ＧＳＫ−３ベータ阻害因子ＶＩＩＩ（ＣＡＳ ４８７０２１−５２-３）およびそれらの組み合わせからなる群より選ばれるＧＳＫ−３キナーゼ阻害因子、またはＷｎｔ経路活性化因子と、アクチビンＡと、血管内皮増殖因子とを含む。
さらに別の態様において、本発明は、多能性幹細胞の造血前駆細胞への分化のための細胞培養培地であって、マイクロキャリア胚様体（ＥＢ）または多能性幹細胞を用いて多能性幹細胞から造血前駆細胞を作製するためのものに関し、当該細胞培養培地は、骨形態形成タンパク質と、アクチビンＡと、血管内皮増殖因子とを含む。
さらなる態様において、本発明は、多能性幹細胞の造血前駆細胞への分化のための細胞培養培地であって、マイクロキャリア胚様体（ＥＢ）または多能性幹細胞を用いて多能性幹細胞から造血前駆細胞を作製するためのものに関し、当該細胞培養培地は、骨形態形成タンパク質、アクチビンＡ、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）またはその変異体、ホルモン、サイトカインおよび血管内皮増殖因子を含む。
さらに別の態様において、本発明は、多能性幹細胞を造血前駆細胞に分化させる方法に関し、当該方法は懸濁撹拌下で実施され、下記工程を含む。
ａ．（任意で）多能性幹細胞を提供する工程、
ｂ．工程ａの細胞を、本願で定義する細胞培養培地に２４時間（０日目〜１日目）暴露し、Ｔ−ブラキウリ（Ｔ−Ｂｒａ、原条／早期中胚葉マーカー）陽性細胞を得る工程と、
ｃ．工程ｂの細胞を、本願で定義する細胞培養培地に２４時間（１日目〜２日目）暴露する工程と、
ｄ．工程ｃのマイクロキャリア付着細胞を本願で定義する細胞培養培地に４８時間（２日目〜４日目）暴露する工程であって、工程ｂ〜ｄで中胚葉誘導を実施し、
ｅ．細胞培養培地を除去し、工程ｄで得られたＫＤＲ＋ＰＤＧＦＲα−造血前駆細胞を単離する工程。
別の態様において、本発明は、多能性幹細胞を造血前駆細胞に分化させる方法に関し、当該方法は懸濁撹拌下で実施され、任意で多能性幹細胞を提供する工程と、本願で開示する方法に基づき工程ａで単離した多能性幹細胞から中胚葉誘導を実施し、ＫＤＲ＋ＰＤＧＦＲα−造血前駆細胞を得る工程と、工程ｂで単離した細胞に対して造血細胞誘導を実施し、ＣＤ３４／ＣＤ４３／ＣＤ４５造血前駆細胞を得る工程と、工程ｃで単離した細胞に対して赤芽球増殖を誘導し、ＣＤ２３５ａ＋ＣＤ７１＋赤芽球細胞を得る工程と、工程ｄで単離した細胞に対して赤芽球成熟を誘導し、ＣＤ２３５ａ＋ＤＲＡＱ５陰性除核赤芽球細胞を得る工程と、細胞培養培地を除去し、工程ｅで得られたＣＤ２３５ａ＋ＤＲＡＱ５陰性除核赤芽球細胞を単離する工程とを含む。
さらなる態様において、本発明は、マイクロキャリア、および本願で開示する細胞培養培地を含むキットに関する。
本発明は、本発明を限定することのない例示および添付の図面と共に詳細な説明を考慮することによって、よりよく理解することができる。
図１は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の振盪マイクロキャリア（ＭＣ）培養による増殖は、非振盪静置培養と比べて、ＢＰＭ４ベースの造血分化の減少をもたらすことを示す。（Ａ）は、７日間の静置培養または振盪培養後のｈＥＳ−３ ＭＣ凝集体の画像である。多能性増殖ステージにおいて静置（静置ｈＰＳＣ増殖）または振盪（振盪ｈＰＳＣ増殖）条件下で初めに増殖させたｈＥＳ−３−ＭＣ凝集体による（Ｂ）多能性マーカー（ｈＰＳＣ増殖後７日）、（Ｃ）Ｔ−ｂｒａ（分化後４８時間）およびＫＤＲ（分化後４日）の発現のフローサイトメトリー評価の結果を示す。 （Ｄ）は、４日間分化させた（静置または振盪ｈＰＳＣ増殖由来の）ｈＥＳ−３−ＭＣ凝集体における、早期造血細胞初期発生（early hematopoietic specification）マーカー（ＣＤ３１、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ１、ＳＣＬ、ＲＵＮＸ１）の発現の、（未分化ｈＥＳ−３に対する）平均倍率変化を表す、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲデータを示す。（Ｅ）は、メチルセルロースをベースとする培地中での増殖開始から２日目および１４日目の、（静置／振盪ｈＰＳＣ増殖由来の）造血前駆体の画像である。スケールバー＝１０００ミクロン。 （Ｆ）は、（１×１０５細胞の初期播播種に続くブラスト成長培地（ＢＧＭ）における増殖開始から１４日目の）ウェル当たりの総造血前駆体数、６穴プレートのウェル当たりの、（静置または振盪ｈＰＳＣ増殖に由来の）ｈＥＳ−３−ＭＣ凝集体由来の赤芽球数（分化後２８日目）、ならびにＣＤ２３５ａ＋細胞および胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）発現細胞（分化後２８日目）の対応するフローサイトメトリーにおける発現（％）をまとめた表、および２８日目以降の赤芽球細胞ペレットの画像である。データは平均±ＳＥＭ、ｎ＝３、ｐ値は静置または振盪ｈＰＳＣ増殖由来の細胞を比較する。 図２は、初めに振盪条件下で増殖させたｈＰＳＣ−ＭＣ培養物からの、改良造血中胚葉誘導および造血前駆体の作製における重要因子としてＣＨＩＲ−９９０２１を同定した、多因子実験計画（ＤｏＥ）解析の結果を示す。（Ａ）は、異なる濃度のアクチビンＡ（ｎｇ／ｍｌ）、２４時間維持したＣＨＩＲ−９９０２１（μＭ）、２４〜４８時間のＣＨＩＲ−９９０２１（μＭ）、および実験開始時に添加したＢＭＰ４（ｎｇ／ｍｌ）、ならびにフローサイトメトリーで決定した分化４日目のＫＤＲ＋細胞に対応するパーセンテージ、ならびに１×１０５細胞の初期播種に続く、ブラスト成長培地（ＢＧＭ）中での１４日間の増殖後のウェル当たりの総造血前駆細胞を含む、種々の実験計画（ＤｏＥ）条件を示す表である。 （Ｂ）は、分化の４日目でより高い％ＫＤＲ＋細胞を達成するための重要因子（Ｐ＝２．３Ｅ−０７）として、ＣＨＩＲ−９９０２１（２４時間のみ維持）が同定された棒グラフである。Ａｃｔ＝アクチビン、ＣＨＩ＝２４時間のＣＨＩＲ−９９０２１、ＣＨ２＝２４〜４８時間のＣＨＩＲ−９９０２１、ＢＭＰ＝ＢＭＰ４。有意なＰ値を表に示した。 （Ｃ）は、より大きな造血前駆体増殖ための重要因子（Ｐ＝１．０１Ｅ−０５）として、ＣＨＩＲ−９９０２１（２４時間のみ維持）が同定された棒グラフである。Ａｃｔ＝アクチビン、ＣＨＩ＝２４時間のＣＨＩＲ−９９０２１、ＣＨ２＝２４〜４８時間のＣＨＩＲ−９９０２１、ＢＭＰ＝ＢＭＰ４。（Ｄ）は、分化の４日目の高（＞１５％）ＫＤＲ発現と低（＜５％）ＫＤＲ発現との相関、および対応する、ブラスト成長培地（ＢＧＭ）で１４日間培養後に誘導したウェル当たりの造血前駆体の総数を示す。 図３は、選択したＤｏＥ条件を用いて、振盪条件下のマイクロキャリア（ＭＣ）で初めに増殖させたＯ陰性ｈｉＰＳＣ系の赤血球分化の結果を示す。（Ａ）は、選択した条件下における０〜３４日目の総細胞増殖を表した線グラフである：０〜４日目（ｈＰＳＣ−ＭＣ凝集体の中胚葉誘導）、４〜１７日目（ブラスト成長培地（ＢＧＭ）における造血前駆体増殖）、１７〜３４日目（懸濁培養における赤芽球増殖）（＊は、条件＃７と比べたｐ＜０．０５）。すべてのデータが平均±ＳＥＭ、ｎ＝３である。 （Ｂ）は、条件＃７および＃１８を用いて誘導した赤芽球の実験開始３４日目の、（６穴プレートの）ウェル当たりの総生細胞数ならびに赤芽球表面マーカー（ＣＤ２３５ａとＣＤ７１）およびＨｂＦのフローサイトメトリー発現（％）をまとめた表である。条件＃７および＃１８の実験開始３４日目の対応赤血球ペレット。条件＃７および＃１８を比較するために、対応するｐ値を報告した。全データは平均±ＳＥＭ、ｎ＝３である。 図４は、ＣＨＩＲの用量が、振盪マイクロキャリア（ＭＣ）培養で増殖させた９種のヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）系の造血分化に対して与える影響を示す。（Ａ）は、９種のヒト多能性幹細胞系を振盪マイクロキャリア培養で７日間増殖させた結果を示す。表は、細胞−マイクロキャリア凝集体の画像、細胞増殖倍率、多能性（Ｏｃｔ−４、Ｔｒａ１−６０およびＳＳＥＡ４の発現）、核型および平均凝集体サイズを示す。ＮＡ＝不明。 ９種のヒト多能性幹細胞−マイクロキャリア系における、（Ｂ）分化後４８時間のＴ−ｂｒａ＋細胞のパーセンテージ（フローサイトメトリーで決定）および（Ｃ）分化後９６時間のＫＤＲ＋ＰＤＧＦＲα−細胞のパーセンテージ（フローサイトメトリーで決定）に対する、ＣＨＩＲ用量の影響を示す。 （Ｄ）分化後１４日目の造血前駆体の平均増殖倍率、および（Ｅ）９種のｈＰＳＣ−ＭＣ系の分化に続く、誘導造血前駆体集団におけるＣＤ４３＋細胞のパーセンテージに対する、ＣＨＩＲ用量（μＭ）の影響。 （Ｆ）異なるｈＰＳＣ系の分化に続き、総生細胞数の積算増殖倍率を決定した（＊はｐ＜０．０５、４２日目の、（Ｄ１１、Ｄ１２およびＢＲ２を除く）各細胞系の積算増殖倍率をＸ１３と比較した）。すべてのデータは平均±ＳＥＭ、ｎ＝３である。（Ｇ）実験開始から３５日目の、異なるヒト多能性幹細胞系の対応赤血球ペレット。 図５は、Ｏ陰性ｈｉＰＳＣ由来赤芽球の機能的特徴付けおよび最終成熟の結果を示す。（Ａ）は、成人末梢血赤血球（成人ＲＢＣｓ）、ｈＥＳ−３由来赤芽球（ｈＥＳ−３ ＲＢＣｓ）およびＯ陰性ｈｉＰＳＣ由来赤芽球（Ｄ５赤血球）の、ヘモグロビンサブタイプのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ評価の結果を示す。データは、成人赤血球±ＳＥＭに対する発現平均倍率変化としてあらわした、ｎ＝３。（Ｂ）は、成人末梢血赤血球（ＰＢ）、臍帯血赤血球（ＣＢ）、ならびにｈＥＳ−３由来赤芽球およびＯ陰性ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）由来赤芽球（Ｄ５）の、３回の試験のそれぞれの細胞溶解物に対する、ヘモグロビンサブタイプおよびベータ・アクチンの免疫ブロット検出の結果を示す。白い線は、ゲル画像上で融合してしまった領域を画定するものである。 （Ｃ）は、成人赤血球（◆）、ｈＥＳ−３分化赤芽球（□）、およびＤ５赤芽球の３つのサンプル（１−▲、２−×、３−○）の酸素平衡曲線［パーセント・オキシヘモグロビン対酸素圧（ｍｍＨｇ）］を表す折れ線グラフである。成人赤血球と比較した、対応するｐ５０値（平均±ＳＤ、ｎ＝２）およびｐ値を示した。（Ｄ）は、Ｏ陰性ｈｉＰＳＣ由来赤芽球を最終成熟条件下で１９日間、増殖培地で培養（増殖）したとき、またはヒト胎児間葉系幹細胞（ＭＳＣ）と共培養したときの、ＣＤ２３５ａおよびＤＲＡＱ５発現のフローサイトメトリー評価結果（除核複製物１〜３）を示す。アイソタイプ抗体で染色した赤芽球が対象となった。 （Ｅ）は、抗ヒトＣＤ２３５ａ−ＦＩＴＣ抗体およびＤＲＡＱ５で染色した高成熟Ｏ陰性赤芽球の画像を示す。代表的な明視野像、ＣＤ２３５ａとＤＲＡＱ５のそれぞれの蛍光像、ならびにＣＤ２３５ａとＤＲＡＱ５の蛍光像を重ね合わせたものを示す。除核細胞は、重ね合わせ像において、核染色のないＣＤ２３５ａ陽性細胞として同定することができる（下記図において高倍率で示した）。スケールバー＝２０ミクロン。 （Ｆ）は、成熟前（０日）または成熟途中（４〜１９日）のＯ陰性赤芽球のギムザ染色を示す。黒い矢印は除核赤血球を示す。スケールバー＝２０ミクロン。 図６は、連続振盪条件下で初めに増殖させたＯ陰性ｈｉＰＳＣ−ＭＣ凝集体の分化に続いて増加したＫＤＲ発現に対する重要因子としてＣＨＩＲ−９９０２１を同定する、実験計画（ＤｏＥ）多因子解析の結果を示す。（Ａ）は、多因子条件の実験のためにＭＯＤＤＥ（登録商標）ソフトウエアによって作製された、アクチビンＡ（ｎｇ／ｍｌ）、２４時間維持したＣＨＩＲ−９９０２１（μＭ）、４８時間維持したＣＨＩＲ−９９０２１（μＭ）、および実験開始時に添加したＢＭＰ４（ｎｇ／ｍｌ）のそれぞれの濃度、ならびに分化後４日目にフローサイトメトリーで決定した対応するＫＤＲレベルを列挙した表を示す。 （Ｂ）は、それぞれの試験条件（分化後４日）におけるＫＤＲレベル（％）のプロットである。条件２７、２８および２９は、同一試験条件で３回行った結果である。 （Ｃ）は、ＭＯＤＤＥソフトウエアを用いた、分化の４日目により高いＫＤＲレベルを達成するための重要因子としての、（２４時間のみ維持した）ＣＨＩＲ−９９０２１の同定を示す。Ａｃｔ＝アクチビンＡ、ＣＨＩ＝２４時間のＣＨＩＲ−９９０２１、ＣＨ２＝２４〜４８時間のＣＨＩＲ−９９０２１、ＢＭＰ＝ＢＭＰ４。計算したＰ値をチャートの下に示した。（Ｄ）は、確率スコアがＲ２＝０．５６、Ｑ２＝０．２４、モデル有効性＞０．３および再現性スコア＞０．９である、ＭＯＤＤＥソフトウエアによって作製されたモデル統計の計算概要を示す。 図７は、異なるｈＰＳＣ系のマイクロキャリア凝集体培養の画像を示す。連続振盪下、ｉＰＳＣ−ｓｐｈｅｒｅｓＴＭ上で増殖させた９種のｈＰＳＣ系の７日目の画像。スケールバー＝１０００ミクロン。 図８は、異なるｈＰＳＣ系のＧ分線法による核型解析の結果を示す。本実験に用いた異なるｈＰＳＣ系（Ｄ５、Ｄ９、Ｄ１１、Ｄ１２、Ｘ１３、ｈＥＳ−３、ＢＲ２およびＢＲ７）のＧ分線法核型の代表的な画像である。各細胞系において、２０個のＧ分線分裂中期像からは全体的核異常は検出されなかった。 図８の続き。 図９は、造血細胞初期発生マーカーの発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析結果を示す棒グラフである。９種の細胞系（Ｄ５、Ｄ９、Ｄ１１、Ｄ１２、Ｘ１３、ＢＲ２、ＢＲ７、ＩＭＲ９０およびｈＥＳ−３）の連続振盪ｈＰＳＣ−ＭＣ凝集体培養物を、最適条件およびＣＨＩＲ−９９０２１用量を５、１０および１５μＭ（凡例）として分化させた。４日目のサンプルについて、ＣＤ３１、ＳＣＬ、ＧＡＴＡ２、ＲＵＮＸ１およびＬＭＯ２の発現レベルをＲＴ−ＰＣＲで評価した。未分化細胞（分化前の、７日目のｈＰＳＣ−ＭＣ凝集体）に対する発現の倍率変化を報告した。データは平均±ＳＥＭ、ｎ＝３。 図９の続き。 図１０は、ＫＤＲレベルおよびＴ−ｂｒａレベルと、造血前駆体の増殖倍率との間の相関解析の結果を示す箱ひげ図である。最適条件および３種のＣＨＩＲ−９９０２１用量（５、１０および１５μＭ）で分化させた９種のヒト多能性幹細胞系（ｈＰＳＣｓ）の、７日目のヒト多能性幹細胞−マイクロキャリア（ｈＰＳＣ−ＭＣ）凝集体培養物による、Ｔ−ｂｒａ（分化後２日）およびＫＤＲ（分化後４日）の発現について、フローサイトメトリーで評価した。分化した細胞を造血前駆体としてメチルセルロース培地中で１４日間増殖させ、増殖倍率を決定した。試験した各細胞系について、Ｔ−ｂｒａ発現細胞を＜１５％のＴ−ｂｒａ＋または＞１５％のＴ−ｂｒａ＋に分類し、ＫＤＲ発現細胞を＜１０％のＫＤＲ＋または＞１０％のＫＤＲ＋に分類し、造血前駆体の対応する増殖倍率をプロットした。ｈＥＳ−３およびＩＭＲ９０は、Ｔ−ｂｒａ＜１０％／Ｔ−ｂｒａ＞１０％およびＫＤＲ＜５％／ＫＤＲ＞５％に分離され、一方、Ｘ１３は、Ｔ−ｂｒａ＜３５％／Ｔ−ｂｒａ＞３５％およびＫＤＲ＜３５％／ＫＤＲ＞３５％に分離されたことに着目されたい。 図１１は、分化赤芽球における異なるヘモグロビンサブタイプの検出結果を図示した免疫ブロットを示す。（分化後３５日の）Ｄ９、ＢＲ７およびＩＭＲ９０から分化した赤芽球細胞溶解物に対してヒトヘモグロビンのアルファ、ベータ、ガンマ、エプシロンサブタイプおよびハウスキーピング制御ヒトβ−アクチンに特異的な抗体で免疫ブロットを行った。末梢血（ＰＢ）および臍帯血（ＣＢ）由来赤芽球の細胞溶解物を対照として実験を行った。白い線は、ゲル画像上で融合してしまった領域を画定するものである。 図１２は、ＢＭＰ４プロトコルで分化させると、連続振盪マイクロキャリア凝集体の分化が減少することを表すデータを示す。（Ａ）は、多能性増殖ステージにおいて、初めに静置条件下で７日または振盪条件（３または７日目の振盪ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）増殖）で増殖させ、マイクロキャリア上で培養したｈＥＳ−３凝集体に対する、多能性マーカー（Ｏｃｔ−４、Ｔｒａ１−６０、ＳＳＥＡ−４）のフローサイトメトリー解析結果を表す棒グラフを示す。 （Ｂ）は、初めにマイクロキャリアの静置条件下で培養、３日間の振盪培養または７日間の振盪培養に付した分化ｈＥＳ−３細胞に対する、Ｔ−ｂｒａ（分化後４８時間）およびＫＤＲ（分化後４日）のフローサイトメトリー解析結果を表す棒グラフを示す（＊はｐ＜０．０５、＃は静置ｈＰＳＣ増殖条件と比べたときにｐ＜０．００１）。（Ｃ）は、早期造血細胞初期発生マーカー（ＣＤ３１、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ１、ＳＣＬ、ＲＵＮＸ１）の発現における、（未分化ｈＥＳ−３に対する）平均倍率変化のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲデータを表す棒グラフであり、当該倍率変化は、造血細胞初期発生を特徴付けるために、ｈＥＳマイクロキャリア凝集体（初めに静置培養で誘導し、３日間の振盪培養または７日間の振盪培養に付したもの）を４日間分化させたものに対して測定したものである（＊はｐ＜０．０５、＃は静置ｈＰＳＣ増殖条件と比較したときにｐ＜０．００１）。データは未分化ｈＥＳ−３に対する発現の平均倍率変化で表した、ｎ＝３。（Ｄ）は、ｈＥＳ−３マイクロキャリア凝集体の画像である。７日間の静置培養後、あるいは３日間および７日間の振盪培養後の、０日目のｈＥＳ−３マイクロキャリア凝集体の画像を示す。メチルセルロースをベースとする培地での増殖後２日目および１４日目の造血前駆体の画像を示す。 （Ｅ）は、静置培養および３日間または７日間の振盪培養によって誘導したｈＥＳ−３−マイクロキャリア（ＭＣ）凝集体から分化させた、（１×１０５細胞の初期播種につづく、ＢＧＭ培地での増殖から１４日目の）造血前駆体および（赤芽球増殖培地への植え付け後１４日目の）赤芽球の、合計カウント数の棒グラフを示す（静置ｈＰＳＣ増殖条件と比較した＃Ｐ＜０．００１）。（Ｆ）は、実験終了時（２８日目）の赤芽球細胞ペレットの画像である。 図１３は、連続振盪下で増殖させたｈＥＳ−３マイクロキャリア凝集体培養物の分化におけるＫＤＲ発現の増加に対する重要因子としてＣＨＩＲ９９０２１を同定する、実験計画（ＤｏＥ）解析の結果である。（Ａ）は、ＭＯＤＤＥソフトウエアによって作製された多因子条件の実験開始時に添加した、アクチビンＡ（ｎｇ／ｍｌ）、２４時間維持したＣＨＩＲ９９０２１（ｐＭ）、４８時間のＣＨＩＲ９９０２１（ｐＭ）、３日目に添加したＳＢ−４３１５４２（ｐＭ）およびＢＭＰ４（ｎｇ／ｍｌ）の濃度、および分化後４日目のフローサイトメトリーで決定した対応するＫＤＲレベル（％）を示す表である。 （Ｂ）は、（分化後４日目に）試験した条件に対応するＫＤＲ（％）レベルを示す散布図である。（Ｃ）は、ＣＨＩＲ（２４時間のみ維持）が、分化の４日目により高いＫＤＲレベルを達成するための重要因子として同定された、ＭＯＤＤＥソフトウエアのデータを示す。Ａｃｔ＝アクチビン、ＣＨＩ＝２４時間のＣＨＩＲ、ＣＨ２＝２４〜４８時間のＣＨＩＲ、ＳＢ＝ＳＢ−４３１５４２、ＢＭＰ＝ＢＭＰ４、ＣＨＩ＊ＣＨ２＝ＣＨＩとＣＨ２との間の相互作用。（Ｄ）は、Ｒ２（モデルとの一致を表し、＞０．５は有意な一致を示唆する）、Ｑ２（未来予測の精度の概算を表し、Ｑ２＞０．１は有意なモデルであり、＞０．５はよいモデルである）、モデル有効性（多様なモデル問題の試験であり、＜０．２５は統計的に有意なモデル問題を表す）および再現性（全体の分散に対する複製の分散であり、＞０．５は保証される）の確率スコアを示す、ＭＯＤＤＥソフトウエアによって生成されたモデル統計の計算概要を示す。 図１４は、実験計画多因子解析が、連続振盪下において増殖させたＯ陰性ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）マイクロキャリア凝集体培養物の分化におけるＫＤＲ発現の増加においてＣＨＩＲ９９０２１が重要因子であると同定されたことを示す、さらなるデータを提供する。（Ａ）は、ＭＯＤＤＥソフトウエアによって作製された多因子条件に基づき、実験開始時に添加したアクチビンＡ（ｎｇ／ｍｌ）、２４時間維持したＣＨＩＲ９９０２１（ｐＭ）、４８時間のＣＨＩＲ９９０２１（ｐＭ）、３日目に添加したＳＢ−４３１５４２（ｐＭ）およびＢＭＰ４（ｎｇ／ｍｌ）の濃度、および分化後４日目にフローサイトメトリーで決定した対応するＫＤＲレベル（％）の表を示す。 （Ｂ）は、（分化後４日目に）試験した条件に対応するＫＤＲ（％）レベルを示す散布図である。（Ｃ）は、ＭＯＤＤＥソフトウエアが、分化の４日目により高いＫＤＲレベルを達成するための重要因子としてＣＨＩＲ（２４時間のみ維持）を同定したことを示す。Ａｃｔ＝アクチビン、ＣＨＩ＝２４時間のＣＨＩＲ、ＣＨ２＝２４〜４８時間のＣＨＩＲ、ＳＢ＝ＳＢ−４３１５４２、ＢＭＰ＝ＢＭＰ４、ＣＨＩ＊ＣＨ２＝ＣＨＩとＣＨ２との間の相互作用。（Ｄ）は、Ｒ２（モデルとの一致を表し、＞０．５は有意な一致を示唆する）、Ｑ２（未来予測の精度の概算を表し、Ｑ２＞０．１は有意なモデルであり、＞０．５はよいモデルである）、モデル有効性（多様なモデル問題の試験であり、＜０．２５は統計的に有意なモデル問題を表す）および再現性（全体の分散に対する複製の分散であり、＞０．５保証されている）の確率スコアを示す、ＭＯＤＤＥソフトウエアによって作製されたモデル統計の計算概要を示す。 図１５は、ＢＭＰ４、アクチビンＡおよびＷｎｔシグナル伝達の調節が、連続振盪下で増殖させたＯ陰性ｈｉＰＳＣマイクロキャリア凝集体培養物の中胚葉誘導、血管芽細胞増殖および赤芽球への分化を有意に向上させることを表す結果を示す。（Ａ）は、試験した選択条件（ＭＯＤＤＥソフトウエアが作製）および表示した時点にフローサイトメトリーで決定した、対応するＴ−ｂｒａレベル（％）を示す表である。 （Ｂ）は、試験した選択条件について分化後４日目に決定したＫＤＲ（％）のフローサイトメトリーレベルを表す棒グラフである。（Ｃ）は、分化後４日目の造血細胞初期発生マーカー（ＣＤ３１、ＳＣＬ、ＲＵＮＸ１）に対する、選択した条件のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる特徴づけの結果を示す棒グラフである（＊は条件７と比較したときにｐ＜０．０５）。データは、未分化細胞に対する発現の平均倍率変化として表した、ｎ＝３。 （Ｄ）は、試験する選択条件下、メチルセルロース培地で増殖した４日後、１０日後、及び１７日後の血管芽細胞の画像である。血管芽細胞の対応する増殖倍率（初期植え付け時と１７日目との比較）、およびマイクロキャリア凝集体のＣＤ３１、ＳＣＬおよびＲＵＮＸ１マーカーの倍率増加制御（ｆｏｌｄ−ｕｐ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）（４日目と０日目の比較）を報告する。 （Ｅ）は、選択した条件における０日〜３４日の総細胞増殖を表す折れ線グラフを示す。０〜４日（マイクロキャリア凝集体の中胚葉誘導）、４〜１７日（メチルセルロース中の血管芽細胞増殖）、１７〜３４日（懸濁培養による赤芽球増殖）。 図１６は、最適分化条件から誘導したＯ陰性赤芽球の評価結果を示す。（Ａ）は、（中胚葉誘導ステージにおいて）異なる条件を用いて分化させたＯ陰性ドナーｉＰＳＣ（ドナー＃５）について決定した、総生細胞数の積算増殖倍率の棒グラフを示す。実験３４日目の条件７および１８の対応赤血球ペレット。（Ｂ）は、赤芽球表面マーカー（ＣＤ２３５ａおよびＣＤ７１）、のフローサイトメトリー発現（％）、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）、および条件７および１８を用いて誘導した赤芽球の実験３４日目の総生細胞収率をまとめた表を示す。条件７および１８の比較のための対応するｐ値も報告した。 （Ｃ）は、ＲＴ−ＰＣＲで決定した、成人赤血球のヘモグロビンサブタイプ（胚性、エプシロン鎖、胎児、ガンマ鎖および成人、ベータ鎖）、ｈＥＳ−３由来赤芽球およびＯ陰性ｈｉＰＳＣ由来赤芽球の発現プロファイルをまとめた表を示す。（Ｄ）は、増殖培地で培養後（増殖）、あるいは最終成熟条件下での培養から２および３週間後（除核１〜３）のＯ陰性人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来赤芽球のＣＤ２３５ａおよびＤＲＡＱ５発現のフローサイトメトリー評価データを示す。アイソタイプ抗体で染色した赤芽球は、アイソタイプ対照となる。除核のパーセンテージの図形表現（ＣＤ２３５＋およびＤＲＡＱ５−の赤芽球の平均パーセンテージ、データは平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）。 （Ｅ）は、最終成熟条件下で３週間培養した赤芽球を抗ヒトＣＤ２３５ａ−ＦＩＴＣ抗体およびＤＲＡＱ５で染色した画像を示す。代表的な明視野像、ＣＤ２３５ａ（ＦＩＴＣチャンネル）の蛍光像、ＤＲＡＱ５（ＣＹ５チャンネル）の蛍光像およびＣＤ２３５ａおよびＤＲＡＱ５の蛍光像を重ね合わせたものを示す。白い矢印は除核（ＤＲＡＱ５−）ＣＤ２３５ａ＋ＲＢＣを示す。黄色の星印は除核途中の後期赤芽球を示す。元の倍率は×４０。 図１７は、初めに連続振盪下で増殖させた異なるｈＰＳＣマイクロキャリア凝集体培養物（１つはヒト胚性幹細胞系、１つは市販のｈｉＰＳＣ系、７つはＯ陰性ｈｉＰＳＣ系）の分化を表すデータを示す。（Ａ）は、連続振盪下で７日間増殖させた９種のｈＰＳＣマイクロキャリア凝集体系をまとめた表である。Ｏｃｔ−４、Ｔｒａ１−６０およびＳＳＥＡ４の多能性レベル（％）をフローサイトメトリーで決定した。選択した細胞系の核型決定をＧ分染法で行い、異常クローンを有していないことが分かった。７日間の連続振盪培養に続いて、マイクロキャリア凝集体の平均増殖倍率および凝集体径（ミクロン）を報告した。未分化ｈＰＳＣマイクロキャリア凝集体の（ｈＥＳ−３に対する）ＩＧＦ−２ ｍＲＮＡレベルをＲＴ−ＰＣＲで決定した。 （Ｂ）は、分化後１４日目の種々のｈＰＳＣマイクロキャリア凝集体培養物における血管芽細胞の平均増殖倍率に対するＣＨＩＲ９９０２１用量（ｐＭ）の効果を示す（＊はｐ＜０．０５、＊＊は５ｐＭのＣＨＩＲ９９０２１用量と比較したときにｐ＜０．０１、＃は各細胞系の１５ｐＭのＣＨＩＲ９９０２１用量とＸ１３の１５ｐＭのＣＨＩＲ９９０２１用量とを比較したときにｐ＜０．０５）。（Ｃ）は、異なるｈＰＳＣマイクロキャリア凝集体培養物の分化後１４日目に誘導した血管芽細胞集団におけるＣＤ４３＋細胞のパーセンテージに対するＣＨＩＲ９９０２１用量（ｐＭ）の効果を表す棒グラフである（＊はｐ＜０．０５、＊＊は各細胞系について５ｐＭのＣＨＩＲ９９０２１用量と比較したときにｐ＜０．０１、＃は各細胞系について示したＣＨＩＲ９９０２１用量とＸ１３の１５ｐＭのＣＨＩＲ９９０２１用量とを比較したときにｐ＜０．００１）。 図１８は、連続振盪培養由来のマイクロキャリアヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）凝集体の懸濁培養分化の結果を示す。（Ａ）は、ヒト多能性幹細胞マイクロキャリア凝集体培養物の懸濁培養分化の模式図である。超低接着表面６穴プレートで５〜７日間連続振盪させたヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）マイクロキャリア凝集体培養物を静置条件下で胚様体（ＥＢ）として３日間分化させ、マイクロキャリアからはがし、１７〜２１日間の単一細胞懸濁培養（静置条件）としてさらに分化させた。（Ｂ）は、表示したヒト多能性幹細胞系の分化に続いて求めた、総生細胞数の積算増殖倍率を示す棒グラフである。実験２９日目の、種々のヒト多能性幹細胞系の対応する赤血球ペレット。 （Ｃ）は、赤芽球表面マーカー（ＣＤ２３５ａ）のフローサイトメトリー発現（％）、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）、および種々のｈＰＳＣ系由来赤芽球の実験２９日目の生細胞数における積算増殖倍率をまとめた表である。 図１９は、ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞／人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の外胚葉系統、内胚葉系統および中胚葉系統への分化能を示す模式図である。画像は、Zacharoula Konsoula MATER METHODS 2013, 3:166より入手。 図２０は、赤血球型およびフィンガープリック血液からの赤血球の誘導に関する情報を示す。（Ａ）フィンガープリック血液からのヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）の誘導を示す模式図である。１０μｌのフィンガープリック血液中の赤芽球をｉｎ ｖｉｔｒｏで１２日間増殖させ、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ４、ｃ−ＭＹＣ（ＯＫＳＭ）を発現するセンダイウイルスで形質転換させた。ｈｉＰＳＣは形質転換から３週間以内に誘導することができる。画像は、Tan HK stem cells Trans Med 2014, 3:586-598より入手。（Ｂ）は、ＡＢＯ血液型、赤血球の細胞表面における抗原発現、および血漿中の抗体を表す模式図である。Ｏ型の血液はＡおよびＢ抗原をその表面に有していため、万能ドナーとして働く。 図２１は、従来の胚様体（ＥＢ）法およびマイクロキャリア−ＥＢ法を用いた赤血球（ＲＢＣ）分化を示す模式図である。画像はSivalingam et al., Tissue Eng Part C Methods. 2016 Aug, 22(8):765-80より入手。分化プロセスは多能性幹細胞増殖、胚様体（ＥＢ）／中胚葉誘導、血管芽細胞形成と赤芽球増殖、および最終成熟を含む。従来のアプローチでは、ｈｉＰＳＣｓはＧｅｌｔｒｅｘ被覆ディッシュ上の単層培養物として培養されるが、マイクロキャリアアプローチでは、ｈｉＰＳＣｓは、組み換えヒトＬＮ−５２１被覆Ｓｏｌｏｈｉｌｌマイクロキャリア上の振盪懸濁培養物としてｍＴｅＳＲ培地で７日間培養される。従来法による中胚葉誘導は、ＡｇｇｒｅＷｅｌｌ ８００プレートへの単一細胞の植え付けによる胚様体形成と、それに続く機械的回収および胚様体の懸濁培養への移植を含むが、マイクロキャリア法は、単純にマイクロキャリアクラスターを成長培地から中胚葉誘導培地へと切り替えるだけである。血管芽細胞増殖ステージは、サイトカインを含むメチルセルロースベースの培地における、１２〜１７日間の成長を含む。血管芽細胞の植え付けのための単一細胞を誘導するために、従来法の胚様体は酵素処理によって解離されるが、マイクロキャリア法の胚様体は、単に緩やかなピペッティングで解離される。赤血球増殖および最終成熟ステージは両方の方法に共通し、赤血球前駆体の造血増殖培地における最長１４日間の懸濁培養と、それに続く、ヒト間葉幹細胞（ＭＳＣ）フィーダー層上のさらに１４〜２１日間の共培養による最終成熟の誘導とを含む。画像は、分化のそれぞれのステージで誘導したヘモグロビン化赤血球に特徴的な赤血球ペレットを示す。従来法で分化された細胞は、赤芽球増殖および最終成熟ステージにおいて増殖に失敗した。 図２２は、少量の赤血球を誘導するためにスピナーフラスコで行う、本願に記載の懸濁撹拌分化プロトコルの一例と、輸血可能な単位の赤血球を得るために十分な数の赤血球を誘導するための、制御された混合タンクバイオリアクターによる各分化ステージ（多能性細胞増殖と、中胚葉誘導と、造血細胞誘導と、赤芽球増殖）の規模拡大の可能性とを表す模式図である。 図２３は、ＢＭＰ４またはＣＨＩＲをベースとするプロトコルを用いた静置および振盪条件におけるｈＥＳ−３ ＭＣ凝集体の分化を示す。（Ａ）は、静置または振盪条件下で７日間増殖させたｈＥＳ３−マイクロキャリア凝集体であって、その後、フローサイトメトリーにより多能性を評価したものの顕微鏡像であり、（Ｂ）は、ＢＭＰ４ベースまたはＣＨＩＲベースの分化プロトコルに付され、造血前駆体を誘導するためにＢＧＭで１４日間増殖させた細胞の画像を示す。 （Ｃ）は、（３×１０５細胞の初期播種に続くＢＧＭ培地での増殖後１４日目の）造血前駆体および（赤芽球増殖培地への植え付け後１２日目の）赤芽球の、総細胞数を表す棒グラフを示す。＊はＢＭＰ４−振盪群対その他のすべての群の比較のためのｐ＜０．０５である。（Ｄ）は、分化３２日目の赤血球（ＲＢＣ）ペレット、および植え付けたヒト多能性幹細胞あたりの生成赤血球の画像を示す。Ｐ＜０．０５は、ＢＭＰ４−振盪群対その他のすべての群の比較のためである。データは平均±ＳＥＭ、ｎ＝３である。 図２４は、ドナー５のＯ陰性ヒト人工多能性幹細胞−マイクロキャリア（ｈｉＰＳＣ−ＭＣ）振盪培養の結果を表す画像および棒グラフである。（ＤｏＥ多因子研究によって同定した）選択条件における０日から５６日の積算増殖倍率。全データは平均±ＳＥＭ、ｎ＝３である。各条件において、分化の１日目または２日目に使用したサイトカインおよび小分子の濃度は下記表に示した。条件７および１８の実験３４日目の赤血球ペレットを示した。 図２５は、９種のヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）系の、ブラスト成長培地において２週間の造血前駆体の平均増殖の結果を示す。（Ａ）は、初めに振盪条件下のマイクロキャリア（ＭＣ）で培養し、異なる濃度のＣＨＩＲ９９０２１（５、１０および１５μＭ）で分化させた９種のヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）系（Ｄ５、Ｄ９、Ｄ１１、Ｄ１２、Ｘ１３、ＢＲ２、ＢＲ７、ＩＭＲ９０、ｈＥＳ−３）の棒グラフを示す。 （Ｂ）は、９種の細胞系の、ＣＤ２３５ａ陽性赤血球および胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）発現細胞のパーセンテージ（％）のみならず、分化４２日目の対応する積算増殖倍率を示す表である。赤芽球増殖ステージで増殖しなかった細胞系は「＾」で記した。 図２６は、２つの模式図を示す。（Ａ）は、Olivier et al.（Stem Cell Trans Med, 2016, 5: 1-12）より入手した、赤血球を誘導するための当業界で公知の分化プロトコルを例証する模式図である。この模式図は、小分子の添加によって増強された、ｈＰＳＣｓのフィーダー無しおよび無血清の赤血球分化を表す。使用した略語：ＢＭＰは骨形態形成タンパク質、ＥＢｓは胚様体、ＥＰＯはエリスロポエチン、ＦＧＦは繊維芽細胞成長因子、Ｆｌｔ３ＬはＦｌｔ３リガンド、ｈＰＳＣはヒト多能性幹細胞、ＨＳＰＣｓは造血幹および前駆細胞、ＩＢＩＴはＩＭＤＭ＋ウシ血清アルブミン、インスリン、トランスフェリン、ＩＢＭＸはイソブチルメチルキサンチン、ＩＧＦはインスリン様成長因子、ＩＬはインターロイキン、ＲＢＣｓは赤血球、ＳＣＦは幹細胞因子、ＴＰＯはトロンボポエチン、ＶＥＧＦは血管内皮増殖因子１６５。 （Ｂ）は、本願で開示する方法と、従来技術の方法とを直接比較した模式図である。従来技術の方法と本願の方法との違いは、例えば、本願に記載の方法は、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣｓ）のマイクロキャリア培養物およびマイクロキャリア−ｈｉＰＳＣｓを中胚葉誘導のための胚様体（ＥＢｓ）として使用することにある。さらに、本願の方法の全工程を連続振盪下の懸濁培養で実施する。さらに、本願に開示する中胚葉誘導の０日および１日目の条件、赤芽球増殖培地、成熟培養条件は、Olivier et al.に開示されているものと異なる。 図２７は、６穴の超低接着表面（ＵＬＡ）プレートのＯ陰性ｈｉＰＳＣｓの連続震盪懸濁培養分化。（Ａ）は、ｈｉＰＳＣから赤芽球ステージへの懸濁培養による連続振盪分化プロセスの模式図である。枠はOlivier et al.のプロトコルを画定する。ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）は、６穴の超低接着表面プレートでの分化に使用する前に、Ｌａｍｉｎｉｎ−５２１被覆Ｓｏｌｏｈｉｌｌマイクロキャリア上で７日間培養した。３日目のｈＰＳＣ−ＭＣ凝集体から誘導した単一細胞を増殖させ、９〜２１日目に赤芽球へと分化させた。 （Ｂ）は、２種のＯ陰性ｈｉＰＳＣ系（Ｄ１２およびＤ５）の分化に続いて決定した総生細胞数の積算増殖倍率を示すデータ、および対応するヘモグロビン化細胞ペレットを表す。（Ｃ）は、分化の３５日目の、分化細胞のフローサイトメトリーによる特徴付けをまとめた表である。赤血球特異的マーカーであるＣＤ２３５ａ、ＣＤ７１、ＣＤ３６および胎児／成人ヘモグロビン発現マーカー、さらには骨髄単球性細胞マーカー（ＣＤ１４、ＣＤ１５）および造血幹細胞マーカー（ＣＤ１３３、ＣＸＣＲ４）のパーセンテージを、３５日目の積算増殖倍率と共に示した。 図２８は、振盪フラスコ中のＯ陰性ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣｓ）の連続震盪懸濁培養分化の結果を示す。（Ａ）は、連続振盪下の６穴超低接着表面プレートで増殖および分化させたｈＰＳＣ−ＭＣ凝集体の画像を示す模式図である。３日目のヒト多能性幹細胞−マイクロキャリア（ｈＰＳＣ−ＭＣ）凝集体に由来の単一細胞を振盪フラスコ中で増殖させ、赤芽球に分化させた。（Ｂ）は、８種のヒト人工多能性幹細胞系（Ｄ１２、Ｄ９、ＢＲ７およびＸ１３はＯ陰性ヒト人工多能性幹細胞）の分化に続いて決定した、総生細胞数の積算増殖倍率の結果を示す。（Ｃ）は、ペレットの画像である。８種すべてのヒト人工多能性幹細胞系が、ヘモグロビン化赤芽球に分化し得る。 （Ｄ）は、赤芽球増殖の１８から２６日目の期間にモニタリングした細胞密度および生存率を表す折れ線グラフを示す。ヒト人工多能性幹細胞系Ｄ９の場合、細胞密度が１×１０７細胞／ｍｌ（１ｅ７細胞／ｍｌ）のとき、生存率および総細胞数の低下が認められた。ヒト人工多能性幹細胞系Ｘ１３の２３日目および２４日目（矢印で示した）の完全培地交換は、１．２×１０７細胞／ｍｌ（１．２ｅ７細胞／ｍｌ）を超える細胞密度を可能にした。（Ｅ）は、培養の２３日目（およびＸ１３の培養の２６日目）の残留グルコースレベル、ならびに蓄積乳酸およびアンモニアレベルをまとめた表を示す。 図２９は、スピナーフラスコ中の単一Ｏ陰性ｈｉＰＳＣ系（Ｘ１３）の連続震盪懸濁培養分化の結果を示す。（Ａ）は、ｈｉＰＳＣ系のスピナーフラスコによる連続振盪下の増殖および分化の模式図である。 （Ｂ）は、スピナーフラスコでの７日間の増殖後の、多能性マーカーであるＯｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｔｒａ１−６０およびＳＳＥＡ４の発現、ならびに中胚葉分化の１日目および３日目の中胚葉マーカーＴ−ＢｒａおよびＫＤＲの発現の、フローサイトメトリーによる特徴付けの結果を示す。（Ｃ）は、造血細胞誘導ステージの７から１６日目のＣＤ３４およびＣＤ４３マーカーのフローサイトメトリーによる特徴付けの結果を表す棒グラフを示す。（Ｄ）は、多能性増殖、中胚葉誘導、造血細胞誘導および赤血球増殖における、総生細胞数の積算増殖倍率を表す折れ線グラフを示す。 （Ｅ）は、分化２７日目の１５ｍｌのファルコンチューブ内のヘモグロビン化赤血球ペレットの画像である。（Ｆ）は、分化２７日目の、最大細胞濃度、誘導した総細胞数、培地使用、乳酸およびアンモニア産生、ならびにグルコース消費をまとめた表である。（Ｇ）は、分化の２７日目の分化細胞のギムザ染色を示す画像である。矢印は、自発的に除核された赤血球である。 図３０は、本願に開示する方法の一態様を表す模式的なタイムラインを示す。振盪ヒト多能性幹細胞−マイクロキャリア（ｈＰＳＣ−ＭＣ）培養物の最適中胚葉誘導のための条件を同定するために、実験計画（ＤｏＥ）研究を実施した。中胚葉誘導のために、静置培養物をＢＭＰ４、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦを用いて分化させ、中胚葉ステージ中は、振盪培養物を、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦＡ、ｂＦＧＦ±アクチビンＡ、ＣＨＩＲ９９０２１を用いて分化させた。造血前駆体増殖、赤芽球増殖および成熟のすべてを、図中の各セクションに詳細に記載した培地を用い、静置条件下で実施した。 図３１は、スピナーフラスコ内のマイクロキャリア上での、赤芽球およびＯＰ９細胞の懸濁撹拌共培養の模式図を示す。 図３２は、臍帯血（ＣＢ）赤芽球の除核の評価結果を示す。上部左：ＯＰ９−マイクロキャリア（ＭＣ）凝集体の低倍率、明視野画像。上部中央：共培養なしで３週間成熟させた臍帯血赤芽球のギムザ染色。上部右：臍帯血赤芽球（ＯＰ９共培養なし）のアネキシンＶおよびＤＲＡＱ５によるフローサイトメトリー評価は、有意なアポトーシス細胞（アネキシンＶ＋）を示した。下部左：ＯＰ９−マイクロキャリア凝集体と臍帯血赤芽球の静置条件下での共培養。下部中央：ＯＰ９−マイクロキャリア凝集体と３週間共培養した後の臍帯血赤芽球のギムザ染色。下部右：臍帯血赤芽球（ＯＰ９−マイクロキャリアとの共培養あり）のアネキシンＶおよびＤＲＡＱ５によるフローサイトメトリー評価は、有意な非アポトーシス除核細胞（アネキシンＶ−ＤＲＡＱ５−）を示した。 図３３は、異なる条件下における、臍帯血（ＣＢ）赤芽球の除核の最適化を表す棒グラフを示す。臍帯血赤芽球の最終成熟を以下の条件下で３週間実施した：ＯＰ９共培養なし、２Ｄ（単層）ＯＰ９共培養、２ＤのＷａｒｔｏｎ’ｓ Ｊｅｌｌｙ由来ヒトＭＳＣｓ（ＷＪ１）共培養、０．４μＭのｔｒａｎｓｗｅｌｌプレート内でのＯＰ９単層共培養、静置条件下の３ＤのＯＰ９（ＯＰ９−ＭＣ凝集体）共培養、振盪条件（７５ｒｐｍ）の３ＤのＯＰ９共培養、およびロッキング（ｒｏｃｋｉｎｇ）プラットホーム（５０ｒｐｍ）における３ＤのＯＰ９共培養。（Ａ）は、アネキシンＶ陰性ＤＲＡＱ５−（非アポトーシス性除核）赤血球のパーセンテージを表す棒グラフである。（Ｂ）は、毎週、フローサイトメトリーで評価した、アネキシンＶ陽性（アポトーシス性）細胞のパーセンテージの棒グラフである。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。 図３４は、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）赤芽球の除核の評価によってもたらされたデータを示す。上部左：ｈｉＰＳＣ赤芽球（ＯＰ９共培養なし）のアネキシンＶおよびＤＲＡＱ５によるフローサイトメトリー評価は、有意なアポトーシス性細胞を示す（アネキシンＶ＋）。上部右：共培養なしで３週間の成熟後のヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）赤芽球のギムザ染色。下部左：ｈｉＰＳＣ赤芽球（ＯＰ９−マイクロキャリアとの共培養あり）のアネキシンＶおよびＤＲＡＱ５によるフローサイトメトリー評価は、有意な非アポトーシス除核細胞（アネキシンＶ−ＤＲＡＱ５−）を示す。枠は除核および非アポトーシス性の細胞集団を分離する。下部右：ＯＰ９−ＭＣ凝集体との共培養により３週間成熟させたｈｉＰＳＣ赤芽球のギムザ染色は、より有意に多い除核細胞を示す。 図３５は、種々の条件下におけるヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）赤芽球の除核の最適化によって得られたデータを示す。ＨｉＰＳＣ赤芽球の最終成熟を以下の条件下で３週間実施した：ＯＰ９共培養なし、２Ｄ（単層）ＯＰ９共培養、静置条件下の３ＤのＯＰ９（ＯＰ９−マイクロキャリア（ＭＣ）凝集体）共培養、および振盪条件下（７５ｒｐｍ）の３ＤのＯＰ９共培養。（Ａ）は、アネキシンＶ陰性ＤＲＡＱ５−（非アポトーシス性除核）赤血球のパーセンテージを示す。 （Ｂ）は、毎週、フローサイトメトリーで評価した、アネキシンＶ陽性（アポトーシス性）細胞のパーセンテージを示す。＊はＯＰ９共培養なしと比較したｐ値、＃は２ＤのＯＰ９共培養と比較したｐ値。（Ｃ）は、共培養なし（ＯＰ９なし）、単層ＯＰ９共培養（２Ｄ ＯＰ９）、静置条件下の３ＤのＯＰ９−ＭＣ共培養（ＯＰ９−ＭＣ静置）および振盪条件下の３ＤのＯＰ９−ＭＣ共培養（ＯＰ９−ＭＣ振盪）によって、３週間成熟させた後のｈｉＰＳＣ赤芽球のギムザ染色画像を示す。アネキシンＶおよびＤＲＡＱ５に対する代表的なフローサイトメトリープロットを下記に示す。 図３６は、不織布（ＮＷＦ）ろ過による除核赤血球富化の結果を示す。（上部）ＮＷＦフィルタの通過による富化の前後のヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）赤芽球に対する、アネキシンＶおよびＤＲＡＱ５のフローサイトメトリープロット。枠は非アポトーシス性除核赤血球を画定する。（下部）富化前後の対応する細胞のギムザ染色を下記に示した。 図３７は、中胚葉誘導に効果的な種々のＷｎ経路活性化因子のスクリーニングの結果を表す棒グラフを示す。（Ａ）は、７つのＷｎｔ経路活性化因子（ＢＩＯ、ＳＢ−２１６７６３、ＣＨＩＲ９８０１４、阻害因子ＶＩＩＩ、カンパウロン、ＤＲＦ０５３ジヒドロクロリドおよびＷｎｔ３ａ）の２種の濃度を示す棒グラフであり、これらは文献から選択し、ＣＨＩＲ９９０２１を対照として、開示した造血分化プロトコルでスクリーニングした。種々のＷｎｔ経路モジュレーターによる処理から２４時間後に、マイクロキャリア上のＸ１３人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）の生存率を適宜表にした。有意に低い生存率が見られた１０μＭのＣＨＩＲ９８０１４（ｐ＝０．０２）以外は、種々の化合物で処理したＸ１３の細胞生存率に有意差は見られなかった（ｐ＞０．０５）。（Ｂ）は、中胚葉（ｍｅｓｏｇｅｒｍ）誘導のパーセンテージ示す棒グラフである。中胚葉誘導におけるＷｎｔ経路モジュレーターの強度を調べるために、２４時間のときのＴ−ｂｒａ（Ｔ−ブラキウリ）発現細胞集団および７２時間のときのＫＤＲ＋ＰＤＧＦＲα−（キナーゼ挿入ドメイン受容体、血小板由来成長因子受容体）細胞集団のパーセンテージを、フローサイトメトリーを用いて解析した。すべての条件におけるＴ−ｂｒａ発現は、２４時間後の対照と比べて有意に低いことが判明した。７２時間では、対照のＫＤＲ＋ＰＤＧＦＲα−集団が、他のＷｎｔ経路モジュレーターと比べて、最も高い値を維持していた（最も高いｐ値が１．６×１０−５）。２種の阻害因子（５μＭのＳＢ−２１６７６３および１μＭのＣＨＩＲ９８０１４）は、他のＷｎｔ経路モジュレーターと比べて、より高いＴ−ｂｒａ発現を誘導することができた。 図３８は、静置または振盪培養から誘導し、ＢＭＰ４ベースまたはＣＨＩＲベースのプロトコルで分化させたｈＥＳ−３マイクロキャリア凝集体のキャピラリーウエスタンブロット解析の画像および結果を示す。静置または振盪条件の７日目のｈＥＳ−３−ＭＣ凝集体は、ＢＭＰ４プロトコル（５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４）または最適化ＣＨＩＲベースのプロトコル（３０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、４０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡおよび１５μＭのＣＨＩＲ）を用いた分化に付された。分化前（０時間）および分化開始から２４時間の細胞溶解物について、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達に関与するタンパク質（Ｔ−ＢＲＡ、ＴＣＦ−１およびＬＥＦ−１）ならびにＢＭＰ４シグナル伝達に関与するタンパク質（ＳＭＡＤ７、ＳＭＡＤ１およびホスホＳＭＡＤ１／５）を自動化キャピラリーウエスタンブロットシステム（Ｐｅｇｇｙ Ｓｕｅ）を用いて解析した。タンパク質ロード対照であるＧＡＰＤＨを含むすべてのサンプルを並行に流した。（Ａ）は、バンド強度として表されるデジタル化化学発光シグナルを示す画像である。検出タンパク質に対応する分子量を示した。縦の青い線はデジタル化したゲル中の融合してしまった領域を画定するものである。 （Ｂ）Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達に関与するタンパク質の、（ＧＡＰＤＨ発現に対するパーセンテージとして表される）化学発光強度の図形表現である。データは平均±ＳＥＭ、ｎ＝２、＊ｐ＜０．０５である。 （Ｃ）ＢＭＰ４シグナル伝達に関与するタンパク質の、（ＧＡＰＤＨ発現に対するパーセンテージとして表される）化学発光強度の図形表現である。データは平均±ＳＥＭ、ｎ＝２、＊ｐ＜０．０５である。 図３８（Ｃ）の続き。 図３９は、振盪マイクロキャリア（ＭＣ）培養によるヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の増殖が、非振盪静置培養と比べて、ＢＭＰ４ベース造血分化の減少をもたらすという結果を示す。（Ａ）は、マイクロキャリア（ＭＣｓ、静置／振盪下）でのヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）増殖から、造血前駆体および赤芽球の分化および増殖を経て、最終成熟へと続く全分化プロセスの模式図である。すべての後続の工程を静置条件下で実施した。 （Ｂ）は、７日間の静置または３および７日間の振盪培養に続く、ｈＥＳ−３マイクロキャリア凝集体の画像を示す。棒グラフは、多能性増殖ステージにおいて初めに静置（静置ｈＰＳＣ増殖）または振盪（３または７日間の振盪ｈＰＳＣ増殖）条件で増殖させたｈＥＳ−３−ＭＣ凝集体の（Ｃ）多能性マーカー（ｈＰＳＣ増殖後３または７日）、（Ｄ）Ｔ−Ｂｒａ（分化後４８時間）およびＫＤＲ（分化後４日）の発現の、フローサイトメトリー評価の結果をまとめたものである。＊はＰ＜０．０５、＃は静置ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）増殖条件との比較したときのＰ＜０．００１。 （Ｅ）は、４日間分化させたｈＥＳ−３−マイクロキャリア凝集体の早期造血細胞初期発生マーカー（ＣＤ３１、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ１、ＳＣＬ、ＲＵＮＸ１）の発現における、（未分化ｈＥＳ−３に対する）平均倍率変化を表すリアルタイムＲＴ−ＰＣＲデータの棒グラフである。＊はＰ＜０．０５、＃は静置ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）増殖条件と比較したときのＰ＜０．００１。（Ｆ）は、メチルセルロースをベースとする培地における増殖後２日および１４日の造血前駆体の画像を示す。スケールバー＝１０００ミクロン。（Ｇ）は、静置培養および３または７日間の振盪培養由来のｈＥＳ−３−マイクロキャリア凝集体から分化させた造血前駆体（１×１０５細胞の初期播種に続き、ＢＧＭ培地での増殖後１４日）および赤芽球（赤芽球増殖培地への植え付け後１４日）の総数を表す棒グラフを示す（＃は静置ｈＰＳＣ増殖条件と比較したときのＰ＜０．００１）。 （Ｈ）は、ＣＤ２３５ａ＋ＣＤ７１＋発現細胞、総ＣＤ２３５ａ＋発現細胞および胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）発現細胞のフローサイトメトリー発現（％）、ならびにｈＥＳ３−ＭＣ凝集体の分化後２８日の生細胞収率をまとめた表である。静置培養と振盪培養との比較のための対応するＰ値、および実験終了時（２８日目）の赤芽球細胞ペレットの画像も示した。全データが平均±ＳＥＭ、ｎ＝３である。 図４０は、ｈＰＳＣ由来赤芽球の機能的特徴付けおよび最終成熟の結果を示す。（Ａ）は、Ｐ５０値（ｈｅｍｏｘ解析）、総ヘモグロビンに対するヘモグロビンサブタイプのパーセンテージ（免疫ブロットのデンシトメータによる測定に基づく）、および１８日間のＭＳＣ共培養後の除核細胞（ＣＤ２３５ａ＋ＤＲＡＱ５−）のパーセンテージをまとめた表である。ＮＡ＝該当なし、ＮＩＬ＝発現なし。 （Ｂ）は、成人ＲＢＣｓ（●）、ｈＥＳ−３分化赤芽球（■）およびｈｉＰＳＣ分化赤芽球であるＤ５（▲）、Ｄ９（▼）、Ｘ１３（◆）およびＩＭＲ９０（○）の、酸素平衡曲線［オキシヘモグロビンのパーセンテージ対酸素圧（ｍｍＨｇ）］を示す。対応するｐ５０値（平均±ＳＤ、ｎ＝２）を示した。（Ｃ）は、末梢血（ＰＢ）、臍帯血（ＣＢ）、ならびにＸ１３、Ｄ５、Ｄ９、ＢＲ７、ＩＭＲ９０およびｈＥＳ−３から分化した赤芽球（分化後３５日）の細胞溶解物のウエスタンブロットを示し、サブタイプがアルファ、ベータ、ガンマ、エプシロンであるヒトヘモグロビン、および対照となるハウスキーピング遺伝子であるヒトβ−アクチンのそれぞれに特異的な抗体で免疫ブロッティングを行った。白い線は、融合してしまったゲル画像上の領域を画定する。免疫ブロットバンドのデンシトメータによる測定はＩｍａｇｅＪソフトウエアで実施した。デンシトメータによる測定に基づき、アクチンのロード対照による正規化後の、（総ヘモグロビン発現に対する）ヘモグロビンのパーセンテージを示した（平均±ＳＥＭ）。 （Ｄ）は、増殖培地で培養した（０日目）またはヒト間葉幹細胞（ＭＳＣｓ）と最終成熟条件で１８日間共培養した（１８日目）ｈｉＰＳＣ由来赤芽球の、ＣＤ２３５ａおよびＤＲＡＱ５のフローサイトメトリー発現評価の結果を示す。アイソタイプ抗体で染色した赤芽球が対照として働いた（０日目のＦＡＣＳプロットの内部に示した）。 （Ｅ）は、間葉幹細胞（ＭＳＣ）共培養による１８日間の成熟の後に、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）から分化した赤芽球のギムザ染色画像を示す。矢印は除核赤血球を示す。（Ｆ）は、抗ヒトＣＤ２３５ａ−ＦＩＴＣ抗体およびＤＲＡＱ５で染色した最終成熟ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）分化赤芽球の画像を示す。ＣＤ２３５ａおよびＤＲＡＱ５の蛍光像を重ね合わせたものを示す。除核赤血球は、核染色のないＣＤ２３５ａ陽性細胞として、重ね合わせ像から同定することができる。スケールバー＝２０ミクロン。
発明の詳細な説明
万能ドナー血液型であるＯ陰性Ｒｈ因子Ｄ陰性（Ｏ陰性）血液は、緊急時の輸血用において、限りある貴重な赤血球（ＲＢＣｓ）源と考えられている。人口の高齢化および発生し得るウイルスや病原のリスクによって起こり得る未来の供給不足に対する懸念は、入手容易な万能ドナー血液の代替物の開発に対するイニシアチブを加速させた。Ｏ陰性ｈｉＰＳＣｓを万能ドナー赤血球作製のための出発材料として使用する可能性は、長らく考えられて来たアイデアであり、近年、実行に移された。ｈｉＰＳＣｓの無制限の増殖能と、その造血細胞系へと分化する可能性との組み合わせは、これら細胞を、万能赤血球作製のための無限の細胞資源として魅力的なものにした。１０個という少なさの、珍しい血液表現型のｈｉＰＳＣクローンが、繰り返し輸血を必要とする人口の９９％をカバーするのに十分であろうと仮定されている。高品質ＧＭＰグレードのｈｉＰＳＣｓの作製および貯蔵における近年の発展によって、臨床グレードの万能ＲＢＣｓの大量誘導が次に起こる主な前進の一歩と考えられる。
ｈｉＰＳＣから赤血球を作製する方法としていくつかのアプローチが提案されており、これは大まかに単層または胚様体（ＥＢ）仲介分化に分類することができる。分化研究の大部分が平面の２次元（２Ｄ）表面上で増殖させたｈｉＰＳＣｓに依存するものであり、これは小規模研究には適しているが、規模を拡大する必要が生じた場合には足かせとなる。異種物不含の限定条件と共に開発された胚様体仲介分化アプローチは、将来の臨床展開にはより適している可能性がある。しかし、強制的な凝集などによる、胚様体の作製のための従来のアプローチは、大規模懸濁培養における成功が未だ示されていない。よって、胚様体（ＥＢ）分化方法をスケールアップに適するようにするためのさらなる改良が必要である。
３次元（３Ｄ）凝集体として、または限定細胞外マトリクス（ＥＣＭ）被覆マイクロキャリア（ＭＣｓ）としてのｈｉＰＳＣの培養は、懸濁培養によるｈＰＳＣ増殖の規模を拡大させるための有効な手段と考えらえる。ｈＰＳＣ増殖後の胚様体ステージのスケールアップは、均一な大きさ及び質の胚様体の作製を必要とし得る。本願の開示においては、多能性増殖ステージにおけるｈＰＳＣ−ＭＣ凝集体の連続振盪は、従来のＢＭＰ４ベースの分化プロトコルと共に使用すると、原条中胚葉マーカーであるＴ−ｂｒａおよびＫＤＲの発現および続く造血分化に対して負の影響を及ぼすと初めは示された。このような制限を克服することを目的として、振盪ｈＰＳＣ−ＭＣ培養からのＫＤＲ陽性細胞の作製を改善し得る因子の同定のために多因子設計アプローチを使用した。ＣＨＩＲ−９９０２１をＢＭＰ４およびアクチビンＡと組み合わせたＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の一過性の活性化が、振盪ｈＰＳＣ−ＭＣ培養からの中胚葉誘導、ならびに造血細胞および赤芽球の分化を有意に改善することが示された。ここで開示する一例では、数種のＯ陰性ヒト人工多能性幹細胞系から赤血球を分化させ、その５０日以内の造血前駆体から赤芽球への増殖倍率は最大６０，０００になる。Ｏ陰性赤芽球は主として胎児ヘモグロビンを発現し、一次ヒト間葉間質細胞との共培養に続いて除核することができる。開発したＭＣ−懸濁培養アプローチは、ヒト多能性幹細胞の増殖および分化の中胚葉ステージのスケールアップの可能性を有し、赤血球分化の大規模化のためにさらに開発することも可能である。
マイクロキャリア（ＭＣ）ベースの懸濁培養プラットホームを本願で開発し、これはヒト多能性幹細胞増殖と胚葉体ステージの分化とを統合した大規模化に使用可能である。さらに、ＢＭＰ４ベースのプロトコルによるヒト多能性幹細胞マイクロキャリア（ｈＰＳＣ−ＭＣ）凝集体培養物は、造血前駆体および赤芽球に分化させることができることが示された。
ここで、本発明者らは、ＢＭＰ４ベースのプロトコルによって分化させた場合、ヒト多能性幹細胞−マイクロキャリア（ｈＰＳＣ−ＭＣ）凝集体の多能性細胞増殖ステージにおける連続振盪は、静置条件由来の培養物と比べて、原条／中胚葉マーカー、Ｔ−ｂｒａおよび造血中胚葉マーカー、ＫＤＲの発現のみならず、続く造血前駆体および赤芽球分化を妨害することを示した。理論に縛られることはないが、増殖ステージにおける振盪が与えるせん断応力が、中胚葉誘導の減少を担う可能性がある。多因子実験計画（ＤｏＥ）アプローチを使用し、因子の組み合わせについて、連続振盪由来のｈＰＳＣ−ＭＣ−凝集体培養物の多能性増殖ステージにおける造血中胚葉誘導を向上させる能力についてスクリーニングを行った。例えば、ＣＨＩＲ−９９０２１（ＣＨＩＲ）、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３−ベータ（ＧＳＫ−３β）の選択的阻害因子、および典型的なＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の強力な活性化因子と、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーシグナル伝達経路の活性化因子であるＢＭＰ４およびアクチビンＡとの組み合わせは、ｈＰＳＣ−ＭＣ凝集体培養物におけるＫＤＲ＋細胞の発生および続く造血前駆体および赤芽球分化を有意に向上させるものであると同定した。
ＣＨＩＲ等のＧＳＫ３阻害因子の用量および暴露のタイミングは、早期中胚葉誘導および続く造血分化の促進において重要である。最適化した成分用量の使用は、例えばＣＨＩＲについて、数種のＯ陰性ヒト人工多能性幹細胞系の効率的な赤血球分化を示した。マイクロキャリアプラットホームは、懸濁培養バイオリアクターによるスケールアップに必須な基準である、マイクロキャリアでの高い増殖能と、優れた造血分化能とを有するＯ陰性ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）系の同定を可能にした。これらは、万能赤血球を作製するための大規模プロセスの開発に向けた上流プロセスの開発のための第１の工程である。
本発明者らは、ＢＭＰ４ベースの分化プロトコルを用いて振盪条件下で初めに増殖させたｈＥＳ−３（ｈＥＳ細胞系の1つ）−マイクロキャリア凝集体の赤血球分化の成功について以前に報告した。しかし、同じ細胞系を分化させる試みを繰り返したところ、マイクロキャリア凝集体を静置条件で増殖させると、振盪条件と比べて、赤血球分化は有意に高いことが示された（２×１０５造血前駆体から開始して、それぞれ、０．２５〜７．３×１０７対０．００４〜４．２×１０赤血球細胞）。これはＢＭＰ４ベースの分化プロトコルをどちらの条件にも使用した場合である。初めに振盪条件で増殖させた多種のＯ陰性ｈｉＰＳＣ系を分化させる試みも、非常にばらつく、低い赤血球分化という結果になった（データは示さない）。論理に縛られるものではないが、これらの知見は、振盪によって誘導されるせん断応力による阻害性シグナルの構築が、負の影響を分化に与える可能性を示すようである。上記条件下で、これら阻害性シグナルの一定閾値を超えた場合には、振盪ＨＥＳ−３ ＭＣ凝集体は分化しないと考えられた。
振盪培養由来ＨＰＳＣ−ＭＣ凝集体のＢＭＰ４ベースの分化は、造血分化の減少を示す
振盪条件が分化のばらつきの主たる原因であるという仮説を試験するために、ｈＥＳ−３を初めに静置条件（静置ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）増殖）または振盪条件（振盪ヒト多能性幹細胞増殖）のいずれかで７日間増殖させ、ＢＭＰ４ベースの分化プロトコルを用いて静置条件下で分化させた。マイクロキャリア上で成長した細胞は、静置培養では大きなクラスターとなり、そして振盪培養では凝集体（直径約４００μｍ）になった（図１Ａ）という事実にもかかわらず、どちらの培養も多能性マーカーの同様の発現を示した（図１Ｂ）。しかし、分化の開始に続き、以下の発現には有意な差が見られた：原条／中胚葉マーカーであるＴ−ｂｒａ［２日目のＴ−ｂｒａ：静置対振盪ｈＰＳＣ増殖培養で３２．６±１．２％および０．５０±０．０２％（ｐ＜０．０００１）］および造血中胚葉マーカーであるＫＤＲ［４日目のＫＤＲ：静置対振盪ｈＰＳＣ増殖培養で２７．９±３．３％および１．１±０．１２％（ｐ＝０．００１）］（図１Ｃ）。造血分化を示す鍵となる造血マーカーの上方制御は、振盪ｈＰＳＣ増殖群においては有意に妨げられた。ＲＴ−ＰＣＲ解析は、静置ｈＰＳＣ増殖群の４日間の分化後にＣＤ３１（早期血内皮マーカー）、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ１、ＳＣＬ／Ｔａｌ−１およびＲＵＮＸ１の有意な発現増加を示したが、振盪ｈＰＳＣ増殖群（図１Ｄ）にはなかった。ｈＰＳＣ−ＭＣ凝集体の連続振盪の効果は、続く分化ステージにおいて最も明らかであり（図１ＤおよびＥ）、２週間の分化後の振盪ｈＰＳＣ増殖群には、造血前駆体の増殖は見られない（ウェル当たりの総造血前駆体：１．３９×１０５±２．１８×１０４）が、一方、静置ｈＰＳＣ増殖群では、有意な増殖が認められた（ウェル当たりの総造血前駆体数：５．７７×１０６±６．３０×１０５、ｐ＝０．０００９）。同様に、振盪由来の培養においては、静置ｈＰＳＣ増殖群と比べて、続く赤芽球の作製が非常に減じていた（ウェル当たりの総赤芽球数：４．１１±２．４×１０４対２６．２±４．７×１０６、ｐ＝０．００５、総ＣＤ２３５ａ集団：０．５１±０．１％対５１．８±２．０％、ｐ＜０．０００１）（図１Ｅ）。これらの知見は、初めは、多能性増殖ステージにおけるｈＥＳ−３−ＭＣ凝集体の連続振盪は、ＫＤＲ＋細胞の早期生成における分化プロセスのみならず後の赤血球ステージにも負の影響を与えるように見えた。
従来の中胚葉分化プロトコルは、静置条件下で誘導したヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）凝集体／胚様体（ＥＢｓ）の使用に依存する。よって、静置条件下で誘導されたヒト多能性幹細胞の中胚葉分化の誘導に使用する培地は、振盪条件下で誘導したヒト多能性幹細胞には最適以下である。混合タンクバイオリアクターによる分化プロセスのスケールアップには振盪条件が重要であることを考慮すると、振盪条件由来のｈＰＳＣ−ＭＣ凝集体の効率的な中胚葉分化および続く赤血球分化を可能にする培地組成の開発が考えられた。これが振盪条件下で誘導されたｈＰＳＣ−ＭＣ凝集体の分化のための初期中胚葉誘導培地を改善するための実験計画多因子研究を実施する理由である。多因子条件の評価は、分化の初めの２４時間にＣＨＩＲ９９０２１を最適濃度で含有することが、初めに振盪条件で誘導したｈＰＳＣ−ＭＣ凝集体の、造血細胞を運命づける効率的な中胚葉誘導には重要であることを同定した。
早期分化ステージにおけるＫＤＲ発現の増加は、後期ステージにおける造血分化の増加と相関することが以前に示された。よって、実験計画（ＤｏＥ）多因子解析は、ｈＥＳ−３−ＭＣ凝集体からのＫＤＲ＋細胞の作製を向上させ得る初期中胚葉分化条件の同定のために実施した。
中胚葉および造血分化の誘導における役割が知られているサイトカインおよび小分子について、初めに振盪下で誘導したｈＥＳ−３ ＭＣ凝集体培養物の分化に対する異なる用量（および／または暴露期間）を、ＭＯＤＤＥ（登録商標）ソフトウエアを使用して評価した。ＤｏＥは、ＢＭＰ４（１０〜５０ｎｇ／ｍｌ）、アクチビンＡ（０〜８０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲ（中胚葉誘導開始から０〜４８時間に０〜１５μＭ）の効果を検証するように設計した。これらの変数は２９の培養条件をもたらし（図２Ａ）、ＫＤＲ＋細胞（分化開始後４日）および続く造血前駆体作製ステージ（ブラスト成長培地（ＢＧＭ）で２週間の培養）に対するその効果を試験した。ＢＭＰ４レベル（１０〜５０ｎｇ／ｍｌ）およびアクチビンＡレベル（０〜８０ｎｇ／ｍｌ）は、ＫＤＲ＋細胞または造血前駆体の作製に対して有意な変化を生じなかった。しかし、ＣＨＩＲに０〜２４時間の暴露は、ＫＤＲ＋細胞のパーセンテージ（Ｐ＝２．３７Ｅ−０７、図２Ｂ）と、造血前駆細胞の作製（Ｐ＝１．０１Ｅ−０５）の有意な増加をもたらした（図２Ｃ）。
以前の知見と同様に、ＢＭＰ４のみの処置（条件１）は、アクチビンＡとＢＭＰ４との組み合わせによる処置（条件２：１．０７％）と同様に、非常に低いＫＤＲ＋細胞（０．４４％）をもたらした。一方、ＣＨＩＲ、アクチビンＡおよびＢＭＰ４の組み合わせ（条件４）は、ＫＤＲ＋細胞の増加（１８．５％）をもたらした。ＫＤＲ＋細胞集団の初期パーセンテージがより高い培養物は、高い造血前駆体数［（総造血前駆体／ウェル：高（＞１５％）および低（＜５％）ＫＤＲ＋細胞集団のそれぞれが３．８５×１０５±３．７２×１０４対１．８２×１０５±３．７９×１０４、ｐ＝０．００１］（図２Ｄ）をもたらしたことに注目することが重要である。
これら知見は、振盪マイクロキャリア培養で増殖させたＯ陰性ｈｉＰＳＣ系（Ｄ５）においても確認された（図６）。Ｏ陰性ヒト人工多能性幹細胞のＤｏＥ解析は、アクチビンＡ（Ｐ＝０．０２）および２４時間のＣＨＩＲ暴露（Ｐ＝０．０００５）が、４日間の分化後のＫＤＲ＋細胞の増加において重要因子であることを示した（図６Ｃ）。まとめると、実験計画解析から、１０〜５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４用量、２５〜５０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ用量、および６〜１２μＭの用量で２４時間のＣＨＩＲ暴露が、ＫＤＲ＋細胞の作製に効果的であることが確立された。
振盪マイクロキャリア培養で増殖した多能性細胞からの造血中胚葉誘導、造血前駆体および赤芽球の作製に対するＣＨＩＲの効果の立証
振盪マイクロキャリア培養で増殖させた多能性細胞の造血分化の効率に対するＣＨＩＲの効果を立証するために、Ｏ陰性ｈｉＰＳＣ系（初めに振盪条件下のマイクロキャリア上で増殖）の分化を、ＢＭＰ４／アクチビンＡプロトコル（非ＣＨＩＲ仲介）またはＣＨＩＲ仲介プロトコル（表１、図６の実験計画条件から確立）のいずれかを使用して評価した。ＢＭＰ４／アクチビンＡプロトコルは、非常に少量の原条／中胚葉誘導という結果になり、これは誘導後４８時間のＴ−ｂｒａ＋細胞の低いパーセンテージ（６．６６〜８．３６％）および誘導後９６時間の低い造血中胚葉誘導（ＫＤＲ＋細胞の５．３〜１３．８４％）（表１）に反映されている。これら条件は、造血転写因子ＳＣＬおよびＲＵＮＸ１の非常に低い誘導という結果ももたらし、ブラスト成長培地（ＢＧＭ）による２週間の培養後の造血前駆体増殖が無しまたは少量となり、続く赤芽球の増殖は失敗した（表１）。
表１−振盪マイクロキャリア培養で増殖させた多能性細胞の中胚葉誘導から赤芽球増殖に対する、ＣＨＩＲ分化と非ＣＨＩＲ仲介分化との比較。初めに振盪条件下で増殖させたＯ陰性ｈｉＰＳＣ−ＭＣ凝集体（Ｄ５ ｈｉＰＳＣ）を、選択したＤｏＥ条件によって同定されたＣＨＩＲ分化プロトコルおよび非ＣＨＩＲ仲介分化プロトコルで分化させた。試験した各条件について、Ｔ−ｂｒａおよびＫＤＲを発現する細胞のパーセンテージを、指定した時点にフローサイトメトリーで決定した。未分化細胞に対する、早期造血特異的マーカー（ＣＤ３１、ＳＣＬおよびＲＵＮＸ１）の発現の平均倍率変化を、４日間の分化後にリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで決定した。ブラスト成長培地（ＢＧＭ）で１４日後の造血前駆体に対応する増殖倍率、および３４日目の赤芽球の積算増殖倍率を報告する。条件＃７と比較したＰ値をカッコ内に示す。
Figure 2021510527
一方、ＣＨＩＲベースのプロトコルによるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の調節は、高い原条／中胚葉誘導（２日目に４６．９〜８９．６％のＴ−ｂｒａ＋細胞）および高い造血中胚葉誘導（４日目に１８．６３〜２９．４３％のＫＤＲ＋細胞）をもたらした。ＣＨＩＲを加えることによる中胚葉および造血前駆体の誘導の向上と同様に、分化から４日後にはＣＤ３１、ＳＣＬ／Ｔａｌ−１（造血発生の調節因子）およびＲＵＮＸ１（造血発生の調節因子）のより高倍率の誘導がＲＴ−ＰＣＲ解析によって認められ、分化１７日後に造血前駆体増殖の向上が認められた（表１）。より高濃度のＣＨＩＲ暴露を４８時間行う条件＃１６は、より低い誘導をＳＣＬ（ｐ＝０．０４８対条件＃７）およびＲＵＮＸ１（ｐ＝０．０１対条件＃７）について示し、造血前駆体増殖は不十分であり（ｐ＜０．００１対条件＃７）、その後、赤芽球への分化に失敗した（表１）。続いて、条件＃７および＃１８のみが有意な赤血球分化および増殖をもたらした（３４日目の増殖倍率：それぞれ２８４．４±９．２対９５．７９±１．２、表１および図３）。これらの中では、条件＃７が条件＃１８よりも有意に高い赤芽球数をもたらした［４．３１×１０７細胞に対して９．７７×１０７細胞、分化から３４日後、ｐ＝０．０００３）（図３Ａ）。さらに、条件＃７で分化した赤芽球集団は、条件＃１８で誘導した集団と比べてより高いパーセンテージの赤血球細胞および胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）発現を示した（図３Ｂ）。条件＃７および＃１８において赤芽球は分化に成功し、分化から３４日目には目視できるほどヘモグロビン化されていた（図３Ｂ）。条件＃７で得られたより高い赤芽球増殖倍率および赤血球細胞の純度をもって、続くすべての実験を条件＃７（５０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、１２μＭのＣＨＩＲで２４時間、１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４）に従って実施した。条件＃７を用いた赤芽球分化は、細胞密度が２×１０６細胞／ｍｌを超えたら、２．５×１０５細胞／ｍｌの密度で新鮮培養培地に再植え付けする連続培養の５６日目には、６２３４３±１５０７０の積算増殖倍率（０日目の２×１０５の造血前駆体の初期播種との比較）を達成し得る。
ＣＨＩＲ用量の最適化は、振盪マイクロキャリア培養で増殖させた種々のヒト多能性幹細胞系の赤血球分化の向上をもたらす
１２μＭのＣＨＩＲへの一過性暴露による、単一Ｏ陰性（Ｏ陰性）ヒト人工多能性幹細胞−マイクロキャリア（ｈｉＰＳＣ−ＭＣ）細胞系（初めに連続振盪下で増殖）の赤血球細胞系への分化の成功に続き、７種（７）の異なるＯ陰性ｈｉＰＳＣ細胞系（ＢＲ２、ＢＲ７、Ｄ５、Ｄ９、Ｄ１１、Ｄ１２、Ｘ１３）と、１種（１）の市販のｈｉＰＳＣ細胞系（ＩＭＲ９０）と、ｈＥＳＣ系（ｈＥＳ−３）の分化を試験した。これらすべてのｈＰＳＣ細胞系は、マイクロキャリア連続振盪下で７日間の増殖に成功し（図７）、５．３〜１２．５倍の増殖倍率を達成し、平均凝集体径は２５５〜５１０μｍの範囲であった（図４Ａ）。多能性マーカーの発現は、Ｏｃｔ−４が７２．９〜９４．６％の範囲、Ｔｒａ１−６０が８４．８〜９３．５％の範囲、ＳＳＥＡ４が９７．２〜９９．７％の範囲であった（図４Ａ）。Ｇ分染法核型解析を、ここで使用したヒト多能性細胞系の内の８種に対して実施し、全ての核型が正常であることが判明した（図８）。
異なるｈＰＳＣ細胞系から作製したヒト多能性幹細胞−マイクロキャリア（ＨＰＳＣ−ＭＣ）凝集体を３種のＣＨＩＲ用量（５、１０および１５μＭで２４時間）で分化させ、Ｔ−ｂｒａ（２日目）およびＫＤＲ＋ＰＤＧＦＲβ−（４日目）発現をフローサイトメトリーで評価し、鍵となる造血転写因子の誘導をＲＴ−ＰＣＲ（４日目）で評価し、造血前駆体の増殖（１４日目）および赤芽球の増殖（４２日目）も評価した。
試験したすべての細胞系において、１５μＭのＣＨＩＲは、５μＭのＣＨＩＲと比べて、有意に高い（ｐ＜０．０５）Ｔ−Ｂｒａ＋細胞をもたらした（Ｄ５：５５．６±８．２６％、Ｄ９：３９±５．３７％、Ｄ１１：３３．４±４．１０％、Ｄ１２：１０．６±２．７８％、Ｘ１３：６０．９±８．５５％、ＢＲ２：２０．１±２．４％、ＢＲ７：２０．８±３．８％、ＩＭＲ９０：１７．２２±７．４％、ｈＥＳ−３：１８±３．８２％）（図４Ｂ）。
血脈管前駆体を示すＫＤＲ＋ＰＤＧＦＲβ−細胞の発現は、Ｔ−ｂｒａ＋細胞の傾向を写すものであった。１５μＭのＣＨＩＲは、５μＭのＣＨＩＲと比べて、有意に高い（ｐ＜０．０５）ＫＤＲ＋ＰＤＧＦＲβ−細胞をもたらした（Ｄ５：３５．７７±１．５３％、Ｄ９：１８．０７±０．６％、Ｄ１１：１１．７４±１．１６％、Ｄ１２：３１．１３±５．１７％、Ｘ１３：４０．８±１．３４％、ＢＲ２：２４．０７±１．３４％、ＢＲ７：１８．６±１．５７％、ＩＭＲ９０：１４．２±１．６９％、ｈＥＳ−３：１４．６±０．８１％）（図４Ｃ）。分化後４日目に、ＣＤ３１および鍵となる造血転写因子であるＳＣＬ、ＧＡＴＡ２、ＲＵＮＸ１およびＬＭＯ２の発現をＲＴ−ＰＣＲで測定して、分化した細胞の造血細胞誘導を評価したところ、試験したほとんどの細胞系において、ＣＨＩＲの用量増加に伴い、より高い上方制御倍率が見られた（図９）。試験した種々のｈｉＰＳＣ細胞系の中では、ＣＤ３１、ＳＣＬ、ＧＡＴＡ２、ＲＵＮＸ１およびＬＭＯ２の発現について、もっとも高い上方制御がＸ１３に見られた（図９）。
ＣＨＩＲ用量が５μＭでも造血前駆体増殖を示したＤ９およびＩＭＲ９０を除くその他の全てのヒト多能性幹細胞系において、５μＭのＣＨＩＲと比べて、１５μＭのＣＨＩＲ用量で誘導したときに、分化から１４日後の造血前駆体が有意に増加した増殖倍率（ｐ＜０．０５）を示した（Ｄ５：７．９９±０．８２、Ｄ１１：３．２±０．３３、Ｄ１２：５．２６±１．３２、Ｘ１３：９．９３±０．２８、ＢＲ２：８．０７±２．０６、ＢＲ７：５．８１±０．９２、ｈＥＳ−３：６．９７±１．３５）（図４Ｄ）。分化後に１４日間増殖させた分化細胞は、造血前駆体の指標となるＣＤ４３を発現した（図４Ｅ）。試験した９種の細胞系の内の７種（Ｄ５、Ｄ１１、Ｄ１２、Ｘ１３、ＢＲ２、ＢＲ７およびｈＥＳ−３）においては、４日目のより高い初期ＫＤＲ＋細胞集団（ＫＤＲ＞１０％）が、２週間後の増殖で造血前駆体の有意な増加をもたらした（図１０）。一方、試験した９種の細胞系の内の５種（Ｄ５、Ｄ１１、Ｘ１３、ＢＲ２、ｈＥＳ−３）は、分化２日目の高いＴ−ｂｒａ＋細胞と、増加した造血前駆体増殖との間に陽性の相関を示した（図１０）。よって、一例では、存在するＣＨＩＲの濃度は１５μＭである。
０日から１４日までブラスト成長培地で増殖させた造血前駆体を赤芽球増殖培地に植え付けて、赤芽球分化を誘導した。細胞を分化後４２日目まで連続的に増殖させ、積算増殖倍率を計算した。９種の細胞系の内の６種（Ｄ５、Ｄ９、Ｘ１３、ＢＲ７、ＩＭＲ９０、ｈＥＳ−３）は赤芽球への分化に成功したが、３種の細胞系（Ｄ１１、Ｄ１２、ＢＲ２）は赤血球細胞への分化に失敗した（図４Ｆ）。Ｘ１３は最大積算増殖倍率が１２６０５±２１２６であり、これは他の試験した細胞系と比べて有意に高かった［積算増殖倍率： Ｄ５は３７１２±１６５１（ｐ＝０．０３）、Ｄ９は１２１．２±３６．８９（ｐ＝０．００４２）、ＩＭＲ９０は９１８．１±３４２．４（ｐ＝０．００５６）、ｈＥＳ−３は３２４±８３．９７（ｐ＝０．００４５）およびＢＲ７は３１．４８±７．７（ｐ＝０．００４１）］（図４Ｆ、表２）。最も性能の良い細胞系であるＸ１３は、植え付けたｈＰＳＣあたり、７６０７±１０１６のＣＤ２３５ａ＋赤血球細胞を誘導し得る（表２）。目視可能なヘモグロビン化ペレットを有する分化赤芽球（図４Ｇ）は、ＣＤ２３５ａの発現および高レベルのＨｂＦを示した（表２）。
表２−振盪マイクロキャリア培養による増殖から赤芽球増殖までの、９種のヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）細胞系の造血分化。この表は、最適用量のＣＨＩＲ−９９０２１で分化させた多種のｈＰＳＣ−ＭＣ凝集体細胞系の異なる分化ステージ、ｈＰＳＣ増殖、中胚葉誘導、造血前駆体および赤芽球増殖をまとめたものである。7日間の振盪培養に続くｈＰＳＣ−ＭＣ凝集体、メチルセルロース培地における１４日間の振盪培養に続く造血前駆体、および増殖培地における２４日間の赤芽球増殖における、増殖倍率について報告する。中胚葉誘導の２日目の％Ｔ−ｂｒａ＋細胞および４日目の％ＫＤＲ＋細胞、造血前駆体増殖のときの％ＣＤ４３＋細胞、赤芽球増殖ステージの％ＣＤ２３５ａ＋細胞および胎児ヘモグロビン発現のフローサイトメトリーによる評価をまとめた。４２日目の、植え付けｈＰＳＣ当たりの総赤血球細胞数を、植え付けたｈＰＳＣ当たりの４日目に誘導された胚様体の数＊赤芽球増殖倍率＊パーセントＣＤ２３５ａ＋赤芽球として計算した。
Figure 2021510527
Ｏ陰性ｈｉＰＳＣから分化した赤芽球の最終成熟および機能的特徴付け
Ｏ陰性赤芽球（Ｄ５）を初期ヒトＭＳＣｓと共培養することで最終成熟させ、分化赤芽球の機能的特徴づけを実施した。ヘモグロビンサブタイプの発現のＲＴ−ＰＣＲ評価は、Ｏ陰性赤芽球（Ｄ５赤血球）が、成人赤芽球と比べて、アルファ（３３．１３±５．１６倍の増加、ｐ＝０．００３４）、ガンマ（１．３１±０．３３倍の増加）、エプシロン（２７９±４３．８９倍の増加、ｐ＝０．００３２）ヘモグロビンを発現するが、ベータ（０．００９±０．００１倍の増加、ｐ＜０．０００１）ヘモグロビン発現が非常に少ないことを示した。同様に、ｈＥＳ−３由来赤芽球と成人赤芽球との比較は、アルファ、ガンマおよびエプシロンヘモグロビンは高いが、ベータヘモグロビンは低いことを示した（図５Ａ）。免疫ブロット解析は、アルファ、ガンマおよびエプシロンヘモグロビンの発現と、ベータヘモグロビン発現が非常に少量または無しであることを、ｈＥＳ−３およびＤ５分化赤芽球（図５Ｂ）のみならず、他のｈＰＳＣ系（図１１）おいても確認した。興味深いことに、ＢＲ７から分化した赤芽球もベータヘモグロビンサブタイプの発現を示した（図１１）。ドナー５のヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）から分化した３種（３）のＯ陰性赤芽球細胞系の酸素平衡曲線の解析は、同様の酸素結合親和性を示し（Ｄ５赤芽球−１：ｐ５０− １４．７±０．８、Ｄ５赤芽球−２：ｐ５０− １３．２±０．０４、Ｄ５赤芽球−３：ｐ５０− １３．８±０．６）、これらは成人赤血球（ｐ５０− １９．６±０．２）とは有意に異なっている（ｐ＜０．０１）が、臍帯血赤血球と類似すると以前に示されたヒトＥＳ細胞系由来の赤芽球（ｈＥＳ−３：ｐ５０− １３．４±０．１）とは類似していた（図５Ｃ）。Ｏ陰性赤芽球は、成熟培地中で初期ヒトＭＳＣｓと１９日間にわたり共培養することで最終成熟させた。フローサイトメトリー解析によると、赤芽球の３９．０±１．０％はＣＤ２３５ａ＋且つＤＲＡＱ５（細胞浸透性核染色剤）陰性であり、除核赤血球細胞であることを示した（図５Ｄ）。この結果は、核染色のないＣＤ２３５ａ＋赤血球を示す、最終成熟赤芽球の免疫蛍光染色（図５Ｅ）およびより長期の成熟によるより多くの除核赤血球を示す細胞のギムザ染色（図５Ｆ）によってさらに確証された。
考察
ｈＰＳＣｓを赤血球細胞へと分化させるために、数種の胚様体（ＥＢ）ベースの分化アプローチが試みられているが、今のところ、スケールアップの可能を示すものはない。ヒト多能性幹細胞−マイクロキャリア（ｈＰＳＣ−ＭＣ）凝集体培養物は、心臓前駆細胞分化について、以前にスピナー培養プラットホームおよびバイオリアクターによるスケールアップに成功している。従って、ヒト多能性幹細胞−マイクロキャリア（ｈＰＳＣ−ＭＣ）凝集体の大規模赤血球分化プロセスの開発にも使用できる可能性がある。
ヒト多能性幹細胞−マイクロキャリア（ｈＰＳＣ−ＭＣ）凝集体懸濁培養の容量拡大のための要件の１つは、十分な酸素の維持と物質移動のみならず、細胞を懸濁状態に保つための手段としての連続振盪の必要性が挙げられる。しかし、本発明者らは、多能性増殖ステージ中に連続振盪下で増殖したｈＰＳＣ−ＭＣ凝集体は、その多能性レベルは比較的影響されないにも関わらず、中胚葉および造血分化の可能性が低下することを観察した。中胚葉誘導の最も初期のステージは、原条マーカーであるＴ−ｂｒａ、即ち、早期原腸胚形成に関与する保存性の高いＴ−ボックス転写因子の発現を伴う。次に、ＶＥＧＦシグナル伝達に応答するＫＤＲ＋造血中胚葉細胞が出現し、造血前駆細胞に分化する。ｈＰＳＣ−ＭＣ凝集体の振盪は、Ｔ−ｂｒａおよびＫＤＲの発現の著しい減少のみならず、早期造血細胞誘導に関与することが知られる、鍵となる転写因子であるＳＣＬ３３、３８、ＧＡＴＡ２３９およびＲＵＮＸ１３４の誘導減少ももたらすことが認められた。そのため、ＢＭＰ４ベースのプロトコルでこれら細胞を分化させると、赤血球分化は、完全になくならなくとも著しく減少した。論理に縛られるものではないが、振盪によって誘導されたせん断応力による分化阻害性シグナルの形成が、振盪培養由来のヒト多能性幹細胞−マイクロキャリア（ｈＰＳＣ−ＭＣ）凝集体における不十分な分化に関与し得ると考えられる。
多能性増殖ステージおよび心臓分化に対する振盪の負の影響は既に報告されている。せん断応力は、中胚葉分化の初期のステージでＢＭＰ４によって誘導されるＴＧＦ−βシグナル伝達経路の成分であるＳＭＡＤに対する阻害効果が知られる、ＳＭＡＤ−７の発現を誘導し得ると考えられる。従って、振盪培養におけるＢＭＰ４シグナル伝達の阻害は、不十分な中胚葉誘導および分化の適当な原因となりうる。しかし、連続振盪ｈＥＳ−３−マイクロキャリア凝集体の分化において以前に示されいることから、振盪せん断応力によって誘導される阻害性シグナルを許容するための閾値効果が存在するかもしれず、そこを超えると振盪マイクロキャリア凝集体が分化に失敗するのではないかと考えられた。連続継代の影響および／またはｈＥＳ−３細胞系のバッチ間の不均一性も、振盪誘導せん断応力の許容量の違いおよび分化結果のばらつきの一因を担う可能性がある。
振盪ｈＰＳＣ増殖培養においてＴ−ｂｒａおよびＫＤＲの発生が負の影響を受けた場合、Ｔ−ｂｒａおよびＫＤＲの発現を向上させる初期中胚葉分化の条件が、造血分化を向上させると仮定した。実際、以前の研究は、ＫＤＲ＋細胞のより高いパーセンテージと造血前駆体産生の増加とを相関付けていた。実施した実験計画スクリーンは、分化開始から２４時間のＣＨＩＲに対する一過性暴露が、（初めに振盪条件下で増殖させたｈＰＳＣ−ＭＣ凝集体からの）４日目のＫＤＲ＋細胞分化の増加に対して重要因子であることを確立した。ＣＨＩＲ−９９０２１は、典型的なＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を活性化し、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣｓ）の心筋細胞および造血細胞への分化のための原条／中胚葉発生を誘導することが示された。Ｗｎｔシグナル伝達経路の直接の標的遺伝子の１つであるＴ−ｂｒａは、振盪培養由来のヒト多能性幹細胞−マイクロキャリア（ｈＰＳＣ−ＭＣ）凝集体のＣＨＩＲに対する一過性暴露に続いて有意に上方制御されたが、ＢＭＰ４ベースのプロトコルで分化されたときには、明らかに誘導されなかった。Ｔ−ｂｒａは、正しい中胚葉分化においては、ＢＭＰ４シグナル伝達の下流のエフェクターであるＳＭＡＤ１と直接相互作用することが報告されている。さらにＢＭＰ４処理細胞においてＴ−ｂｒａ発現は、造血発生に必要な遺伝子であるＫＤＲおよびＬＭＯ２等の活性化に必須であることが示されている。よって、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の活性化は、Ｔ−ｂｒａ発現を直接活性化し、続く造血初期発生を経たＫＤＲ＋中胚葉細胞の発生と、やがては赤血球分化とを可能にすることで、ＢＭＰ４−仲介シグナル伝達によって持続される阻害性効果をバイパスしているのかも知れない。ここに示したように、より高いパーセンテージのＫＤＲ＋細胞の初期の作製と、多種のｈＰＳＣ細胞系の分化によって有意に向上した造血前駆体の作製とを相関させることができた。
ここに示すデータは、Ｏ陰性ｈｉＰＳＣの成熟赤血球への効率的な分化を示す。種々のＯ陰性ｈｉＰＳＣ系の間で見られる分化効率の違いは、異なるドナーサンプル間の固有の遺伝的またはエピゲノム的な差異によるものと考えられる。最も性能の良い細胞系では、培養５６日間で細胞数の増殖倍率は最大６０，０００となった。これは２×１０７の造血前駆体から開始して、１×１０１２の赤血球（ＲＢＣｓ、１単位の赤血球と等しい）が得られると言い換えることができる。
本願で開示する方法を赤血球（ＲＢＣｓ）の作製のための慣例法に変換するには、いくつかの改善点を検討する必要がある。第１に、バイオリアクターへとスケールアップするには、造血前駆体分化および増殖の初期ステージを、半固体ブラスト成長培地ではなく、液体懸濁培養で実施できるようにプロセスを改良しなければならない。第２に、撹拌タンクバイオリアクターでの条件のシミュレーションを実施するために、多能性増殖ステージ、中胚葉誘導ステージおよび造血増殖ステージの全プロセスを振盪条件下で実施する必要がある。第３に、１×１０８細胞／ｍｌの範囲内の高細胞密度が常に達成できるように、培養強化方法を開発しなければならない。これにより、より実用的かつ費用対効果の高い培地の使用によって、１単位の血液を１０Ｌのバイオリアクターで作製することができる。第４に、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）発現の問題を解決しなければならない。これは、胎児ヘモグロビンを発現する赤血球（ＲＢＣｓ）の酸素結合親和性は、成人赤血球ではなく、臍帯血赤血球を連想させるものであるためである。ＫＬＦ−１およびＢＣＬ１１Ａの発現は、胎児から成人へのヘモグロビンのスウィッチングを誘導する手段として提案されている。試験したヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）系の１種（ＢＲ７）から分化した赤芽球には、ベータヘモグロビンタンパク質発現が観察され、これは、エピゲノムの記憶の維持がベータヘモグロビンプロモーターの活性化において役割を担うか否かのさらなる検討の根拠となる。最後に、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）分化赤芽球の低い除核効率を改善する必要がある。現在示されているように、赤芽球は正しいシグナル、この場合は、初期ヒト間葉幹細胞（ＭＳＣｓ）との共培養、が与えられれば除核することが示されている。先に進めば、プロセスのスケールアップには、限定培地処方を用いた除核プロトコルの開発が必要である。
結論として、上流プロセスの最適化を通じて、初めに連続振盪下で増殖させたＯ陰性ｈｉＰＳＣ−ＭＣ凝集体の効率的な赤血球分化を可能にする最適プロトコルをここで提供する。これは、万能赤血球（ＲＢＣｓ）の大規模作製のための懸濁培養バイオリアクターへ変換可能なプロセスのさらなる開発を可能にする方法となる。
Ｏ陰性ヒト人工多能性幹細胞からの赤血球細胞の作製のためのスケーラブルな震盪懸濁培養分化プラットホームの開発
震盪懸濁培養下の限定細胞外マトリクス（ＥＣＭ）被覆マイクロキャリアで増殖させた９種のヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣｓ）の内の６種が、ＢＭＰ４、アクチビンＡおよびＣＨＩＲからなる、初期中胚葉誘導のための最適プロトコルによって、赤血球細胞を効率的に分化できることが過去に報告されている。しかし、懸濁撹拌条件下のｈｉＰＳＣの増殖以外の残りのステージは、すべて静置条件下で実施された。さらに、造血細胞に運命づけられた中胚葉細胞からの造血前駆体の初期増殖は、全て半固体のメチルセルロースベースの培地で行われ、プロセスの容量のスケールアップが困難である。メチルセルロースベースの増殖プロトコルのスケーラビリティの無さによる限界を解消するために、本願に開示する分化プロセスを開発した。このプロセスでは、ｈｉＰＳＣ増殖ステージから赤血球増殖ステージまでを震盪懸濁培養形式で実施することが可能であり、プロセス全体の容量のスケールアップが可能となり、これら培養を制御下のバイオリアクターへと適応させることができる。マイクロキャリア増殖ｈｉＰＳＣｓのために最適化された中胚葉誘導条件と、造血細胞誘導条件のために改変されたプロセスとを組み合わせて、赤芽球の震盪懸濁培養分化および増殖を可能にした。
よって、一例では、多能性幹細胞を造血前駆細胞へと分化させる方法であって、前記方法が懸濁撹拌下で実施され、中胚葉誘導ステージにおいて、ＧＳＫ−３阻害因子またはＷｎｔ経路活性化因子を添加する方法を開示する。別の例においては、多能性幹細胞を造血前駆細胞へと分化させる方法は、下記のステージを含む：任意の多能性幹細胞増殖ステージ、中胚葉誘導ステージ、造血細胞誘導ステージ、赤芽球誘導ステージ、および赤芽球成熟ステージ。さらに別の例では、多能性幹細胞を造血前駆細胞へと分化させる方法は、下記のステージを含む：中胚葉誘導ステージ、造血細胞誘導ステージ、赤芽球誘導ステージ、および赤芽球成熟ステージ。
本願において、「多能性幹細胞」という用語は、内胚葉（胃の内膜、消化管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）、または外胚葉（表皮系組織および神経系）の３種の胚葉のいずれにも分化する能力を有する幹細胞を意味する。細胞の多能性が連続的であると言ったとき、その範囲は、胚性幹細胞および人工多能性幹細胞のように、胚の細胞を１つ残らず正しく形成することのできる完全な多能性細胞から、３種の胚葉すべての細胞を形成することができるが、完全な多能性細胞の全ての特徴を示すことはできない、不完全なまたは部分的な多能性細胞にまで及ぶ。多能性幹細胞は、多能性を天然に有する細胞でも、化学的にまたは方法によって多能性にされた（人工多能性）細胞でもよい。一例では、多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞である。別の例では、多能性幹細胞はヒト多能性幹細胞である。さらに別の例では、多能性幹細胞は、胚の破壊を含む方法によって単離されたものではない。
一例では、多能性幹細胞はマイクロキャリアに付着している。
当業者は、公知の方法に基づき、細胞がどのステージにあるかを容易に決定することができる。このような方法は、ステージ特異的細胞表面発現マーカー、特定の細胞型の存在または不在、発生因子等の分泌などの使用であるが、これらに限定されるものではない。例えば、造血前駆細胞はＫＤＲ＋ＰＤＧＦＲα−造血前駆細胞である。
従って、別の例では、中胚葉誘導ステージが、多能性幹細胞増殖ステージの多能性幹細胞からの中胚葉形成を誘導し、その結果、ＫＤＲ＋ＰＤＧＦＲα−造血前駆細胞が得られる。別の例では、造血細胞誘導ステージが、中胚葉誘導ステージの造血前駆細胞の増殖をもたらし、その結果、ＣＤ３４／ＣＤ４３／ＣＤ４５造血前駆細胞が得られる。このような増殖は、例えば、１０〜１００倍の増殖である。さらに別の例では、赤芽球増殖ステージが、造血細胞誘導ステージの造血前駆細胞の増殖をもたらし、その結果、ＣＤ２３５ａ＋ＣＤ７１＋赤芽球細胞が得られる。このような増殖は、例えば、５０〜１０００倍の増殖である。一例では、赤芽球成熟ステージが最終成熟および赤芽球増殖ステージの成熟ＣＤ２３５ａ＋赤芽球細胞の除核をもたらし、その結果、除核ＣＤ２３５ａ＋赤芽球細胞が得られる。さらなる例では、除核ＣＤ２３５ａ＋赤芽球細胞を、ＤＲＡＱ５（ＤＲＡＱ５陰性）、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２、ＳＹＴＯ１６およびそれらの組み合わせから選ばれる染色によって同定するが、これらに限定されるものではない。いくつかの例では、染色はＤＲＡＱ５（ＤＲＡＱ５陰性）である。
本願で使用するように、多能性細胞は典型的には２×１０５細胞／ｍｌから、２×１０６〜３×１０６細胞／ｍｌに増殖させる。典型的には、多能性細胞密度を４×１０６細胞／ｍｌ未満とし、マイクロキャリア凝集体のサイズを直径２５０〜７００μＭの間とする。増殖時のより高い細胞濃度は、細胞が多能性を失うような阻害性レベルの乳酸／アンモニアの蓄積を生じる可能性がある。直径７００μＭを超える凝集体サイズは、拡散の減少によってクラスター内部の細胞の栄養が限られる可能性がある。中胚葉分化の開始時（ＧＳＫ３阻害因子、例えばＣＨＩＲの添加時）には、細胞を２×１０５細胞／ｍｌ〜１×１０６細胞／ｍｌで植え付ける。
一例では、例えば多能性幹細胞増殖ステージにおいて、多能性幹細胞は、１．５×１０５から４×１０６細胞／ｍｌの間の濃度まで増殖される。別の例では、多能性幹細胞は１．５×１０５から４×１０６細胞／ｍｌの間、２×１０５から１×１０６細胞／ｍｌの間、５×１０５から１．５×１０６細胞／ｍｌの間、１．７５×１０６から３×１０６細胞／ｍｌの間、２×１０６から３×１０６細胞／ｍｌの間、または約２×１０５細胞／ｍｌ、約５×１０５細胞／ｍｌ、約８×１０５細胞／ｍｌ、約１×１０６細胞／ｍｌ、約１．５×１０６細胞／ｍｌ、約２．０×１０６細胞／ｍｌ、約２．１×１０６細胞／ｍｌ、約２．２×１０６細胞／ｍｌ、約２．３×１０６細胞／ｍｌ、約２．４×１０６細胞／ｍｌ、約２．５×１０６細胞／ｍｌ、約２．６×１０６細胞／ｍｌ、約２．７５×１０６細胞／ｍｌ、約２．８×１０６細胞／ｍｌ、約２．９×１０６細胞／ｍｌ、または約３×１０６細胞／ｍｌの濃度まで増殖される。
別の例では、多能性幹細胞増殖ステージにおける培養は、５〜８日間、または５、６、７、８日間実施する。
さらに別の例では、中胚葉誘導ステージにおける培養は、３〜４日間実施する。
さらに別の例では、造血細胞誘導ステージにおける培養は、７〜１２日間、７〜９日間、８〜１０日間、９〜１１日間または１０〜１２日間、あるいは７、８、９、１０、１１、または１２日間実施する。
さらに別の例では、赤芽球誘導ステージにおける培養は、１０〜１８日間、１０〜１３日間、１２〜１６日間、１３〜１７日間、１４〜１８日間、あるいは１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８日間実施する。
別の例では、赤芽球成熟ステージにおける培養は、７〜２１日間、７〜１４日間、１３〜２１日間、あるいは８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、または２１日間実施する。
よって、本願に開示するタイムラインに基づき、本願に開示する方法は、除核ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）由来赤芽球を誘導するために、マイクロキャリア上でのｈｉＰＳＣの増殖から最終除核までに、４６〜５０日間、４８〜５４日間、５０〜５５日間、５１〜５７日間、または５２〜５８日間要する。別の例では、本願に開示の方法は、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７または５８日間を要する。さらに別の例では、本願に開示の方法は、除核ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）由来赤芽球を誘導するために、マイクロキャリア上でのｈｉＰＳＣの増殖から最終除核までに、最短４８日間から最長５６日間を要する。
６穴の超低接着表面（ＵＬＡ）プレートにおいて、振盪懸濁条件下のラミニン−５２１被覆Ｓｏｌｏｈｉｌｌマイクロキャリアで初めに増殖させたＯ陰性ｈｉＰＳＣｓを、振盪条件下、同じ６穴の超低接着表面プレートで、ヒト多能性幹細胞増殖培地から、独自の最適化中胚葉誘導培地へと切り替えることで、中胚葉ステージへと誘導した。３日間の造血細胞を運命づける中胚葉誘導の後、マイクロキャリア凝集体培養物由来の単一細胞を震盪懸濁培養に低密度で植え付け、既に報告されている条件を用いて、さらに１０日間培養した。１４日目には、既に報告されている赤芽球増殖培地を用い、振盪懸濁条件で、赤芽球増殖するように、造血細胞をさらに１４日間培養した。Ｏ陰性ヒト人工多能性幹細胞増殖からの中胚葉誘導、造血細胞誘導および赤芽球増殖へのプロセス全体を振盪条件下の懸濁培養で実施可能であることが示された（図２７）。
プロセスのスケールアップを示すために、中胚葉誘導ステージに続いて誘導した単一細胞を、連続振盪条件下の超低接着表面振盪フラスコに１０ｍｌ容量で植え付けた（図２８）。複数種のヒト人工多能性幹細胞系を使用し、頻繁な培地交換による高密度赤血球培養細胞を達成する可能性について示した。ここでは、高い細胞生存率を維持し、赤芽球の連続増殖を可能せしめるためには、培養物中の乳酸およびアンモニアの蓄積は２ｇ／Ｌおよび４ｍＭに抑制すべきであると示された。最も優れた分化細胞系であるＸ１３では、１０００超となる、単一細胞の初期播種から分化赤芽球への増殖倍率が達成された。阻害レベルの乳酸およびアンモニアを確実に防止するための完全な培地交換は、１×１０７細胞／ｍｌ（１ｅ７細胞／ｍｌ）を超える細胞密度の達成を可能にし、これはｉｎ ｖｉｔｒｏの培養赤血球について報告された中の最高値である。
一例では、当該方法は、中胚葉誘導ステージにおける細胞培養培地の使用を含み、細胞培養培地は、骨形態形成タンパク質と、ＧＳＫ３阻害因子またはＷｎｔ経路活性化因子と、アクチビンＡと、血管内皮増殖因子とを含む。別の例では、本願で開示する培養培地は、震盪懸濁培養用である。
多能性幹細胞の造血前駆細胞への分化のための細胞培養培地もさらに開示し、これによって、マイクロキャリア胚様体（ＥＢ）または多能性幹細胞を用いて多能性幹細胞から造血前駆細胞を作製する。当該細胞培養培地は、骨形態形成タンパク質と、アクチビンＡと、血管内皮増殖因子とを含む。
さらに別の例では、多能性幹細胞の造血前駆細胞への分化のための細胞培養培地が記載され、これによって、マイクロキャリア胚様体（ＥＢ）を用いて多能性幹細胞から造血前駆細胞を作製する。当該細胞培養培地は骨形態形成タンパク質と、ＧＳＫ−３キナーゼ阻害因子（阻害因子は、ＣＨＩＲ９９０２１、（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−オキシム（Ｂｉｏ、ＣＡＳ ６６７４６３−６２−９）、カンパウロン（ＣＡＳ １４２２７３−２０−９）、ＧＳＫ−３ベータ阻害因子ＸＩＩ（ＴＷＳ１１９、ＣＡＳ ６０１５１４−１９−６）、Ｂｉｏ−アセトオキシム（ＣＡＳ ６６７４６３−８５−６）、ＣＨＩＲ−９８０１４、ＳＢ２１６７６３（ＣＡＳ ２８０７４４−０９−４）、ＧＳＫ−３ベータ阻害因子ＶＩＩＩ（ＣＡＳ ４８７０２１−５２−３）およびそれらの組み合わせからなる群より選ばれる）またはＷｎｔ経路活性化因子と、アクチビンＡと、血管内皮増殖因子とを含む。
多能性幹細胞の造血前駆細胞への分化のための細胞培養培地も開示し、それによって、マイクロキャリア胚様体（ＥＢ）または多能性幹細胞を用いて、多能性幹細胞から造血前駆細胞を作製する。当該細胞培養培地は、骨形態形成タンパク質、アクチビンＡと、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）またはその変異体と、ホルモンと、サイトカインと、血管内皮増殖因子とを含む。
本願において「ＧＳＫ−３阻害因子」という用語は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ−３、全体または部分）を阻害し得る化合物または化合物群を意味する。グリコーゲンシンターゼキナーゼ３は、アミノ酸残基セリンまたはスレオニンへのリン酸分子の付加を仲介するセリン／スレオニンタンパク質キナーゼである。ＧＳＫ−３によるタンパク質のリン酸化は通常、その下流の標的の活性を阻害する。ＧＳＫ−３は、細胞増殖およびアポトーシスの経路に一体的に紐づけられていることが示されている。例えば、ＧＳＫ−３は、ベータ−カテニンをリン酸化し、その結果、ベータ−カテニンが分解の標的となることが示されている。よってＧＳＫ−３は、古典的なベータ−カテニン／Ｗｎｔ経路の一部であり、細胞の分裂および増殖のためのシグナルを与える。ＧＳＫ−３は、アポトーシスを制御する伝達因子をリン酸化することで、複数のアポトーシスシグナル経路にも参加する。ＧＳＫ−３は、例えばｐ５３のようなアポトーシス促進因子の活性化と、リン酸化による生存促進因子の不活化の両方によって、アポトーシスを促進することもできる。
一例では、ＧＳＫ−３阻害因子は、バルプロ酸ナトリウムスタウロスポリン、ＫＴ ５７２０（ＣＡＳ １０８０６８−９８−０）、ＧＳＫ−３阻害因子ＩＸ（ＣＡＳ ６６７４６３−６２−９）、Ｒｏ ３１−８２２０（ＣＡＳ １３８４８９−１８−６）、ＳＢ−２１６７６３（ＣＡＳ ２８０７４４−０９−４）、ＣＩＤ ７５５６７３（ＣＡＳ ５２１９３７−０７−５）、カンパウロン（ＣＡＳ １４２２７３−２０−９）、塩化リチウム、ＧＳＫ−３ベータ阻害因子ＸＩＩ（ＴＷＳ１１９、ＣＡＳ ６０１５１４−１９−６）、ＧＳＫ−３阻害因子ＸＶＩ（ＣＡＳ２５２９１７−０６−９）、１０Ｚ−ヒメニアルディシン（ＣＡＳ ８２００５−１２−７）、インディルビン（ＣＡＳ ４７９−４１−４）、ＣＨＩＲ−９８０１４（ＣＡＳ ２５２９３５−９４−７）、ＧＳＫ−３ベータ阻害因子ＶＩ（ＣＡＳ ６２６７３−６９−２）、マンザミンＡ（ＣＡＳ １０４１９６−６８−１）、インディルビン−３’モノキシム（ＣＡＳ １６０８０７−４９−８）、ＧＳＫ−３阻害因子Ｘ（ＣＡＳ ７４０８４１−１５−０）、ＧＳＫ−３阻害因子ＸＶ、ＳＢ−４１５２８６（ＣＡＳ ２６４２１８−２３−７）、１−アザ−カンパウロン（ＣＡＳ ６７６５９６−６５−９）、ＴＷＳ１１９ ジトリフルオロ酢酸（ＣＡＳ ６０１５１４−１９−６）、５−イオド−インディルビン−３’−モノキシム、ＧＳＫ−３ベータ阻害因子Ｉ（ＣＡＳ ３２７０３６−８９−５）、９−シアノプロン、インディルビン−５−スルホン酸ナトリウム、ＧＳＫ−３ベータ阻害因子ＶＩＩ（ＣＡＳ ９９−７３−０）、Ｃｄｋ１／５阻害因子（ＣＡＳ ４０２５４−９０−８）、ヒメニジン（ＣＡＳ １０７０１９−９５−４）、塩酸ビスマレイミドＸ（ＣＡＳ １３１８４８−９７−０）、３Ｆ８（ＣＡＳ １５９１０９−１１−２）、イソグラニュラチミド（ＣＡＳ ２４４１４８−４６−７）、ＣＲ８、（Ｒ）−異性体（ＣＡＳ ２９４６４６−７７−８）Ｌ−７７９，４５０（ＣＡＳ ３０３７２７−３１−３）、インディルビン−３’モノキシム−５−スルホン酸（ＣＡＳ ３３１４６７−０５−１）、ＧＳＫ−３阻害因子ＩＩ（ＣＡＳ ４７８４８２−７５−６）、ＧＳＫ−３ベータ阻害因子ＶＩＩＩ（ＣＡＳ ４８７０２１−５２−３）、アロイシンＡ（ＣＡＳ ４９６８６４−１６−５）、ＧＳＫ−３ベータ阻害因子ＸＩ（ＣＡＳ ６２６６０４−３９−５）、ＧＳＫ−３阻害因子ＩＸ（ＣＡＳ ７１０３２３−６１−８）、アルステルパウロン、２−シアノエチル（ＣＡＳ ８５２５２９−９７−０）、ＴＣＳ ２００２（ＣＡＳ １００５２０１−２４−０）、ＴＣＳ ２１３１１（ＣＡＳ １２６０１８１−１４−３）、Ａ １０７０７２２（ＣＡＳ １３８４４２４−８０−９）、Ｒｏ−３１−８２２０（ＣＡＳ １３８４８９−１８−６）、エンザスタウリン（ＣＡＳ １３８４８９−１８−６）、ＭｅＢＩＯ（ＣＡＳ ６６７４６３−９５−８）、Ｃｄｋ２／９阻害因子（ＣＡＳ ５０７４８７−８９−０）、Ｃｄｋ１／２阻害因子ＩＩＩ（ＣＡＳ ４４３７９８−５５−８）、ＰＨＡ ７６７４９１塩酸（ＣＡＳ ８４５７１４−００−３）、ＡＲ−ＡＯ １４４１８−ｄ３、インドール−３−アセタミド（ＣＡＳ ８７９−３７−８）、ヒメニアルディシンアナログ１（ＣＡＳ ６９３２２２−５１−４）、ＣＨＩＲ−９９０２１（６−［［２−［［４−（２，４−Ｄジクロロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾル−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］−３−ピリジンカルボニトリルおよびＣＴ９９０２１、ＣＡＳ ２５２９１７−０６−９とも知られる）、ＣＨＩＲ−９８０１４（ＣＡＳ ５５６８１３−３９−９）、（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−オキシム（Ｂｉｏ、ＣＡＳ ６６７４６３−６２−９）、Ｂｉｏ−アセトオキシム（ＣＡＳ ６６７４６３−８５−６）、ＳＢ２１６７６３（ＣＡＳ ２８０７４４−０９−４）およびそれらの組み合わせであるが、これに限定されるものではない。
別の例ではＧＳＫ３阻害因子は、ＣＨＩＲ−９９０２１、（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−オキシム（Ｂｉｏ、ＣＡＳ ６６７４６３−６２−９）、カンパウロン（ＣＡＳ １４２２７３−２０−９）、ＧＳＫ−３ベータ阻害因子ＸＩＩ（ＴＷＳ１１９、ＣＡＳ ６０１５１４−１９−６）、Ｂｉｏ−アセトオキシム（ＣＡＳ ６６７４６３−８５−６）、ＣＨＩＲ−９８０１４、ＳＢ２１６７６３（ＣＡＳ ２８０７４４−０９−４）、ＧＳＫ−３ベータ阻害因子ＶＩＩＩ（ＣＡＳ ４８７０２１−５２−３）、およびそれらの組み合わせであるが、これに限定されるものではない。さらに別の例では、ＧＳＫ３阻害因子はＣＨＩＲ−９９０２１またはその誘導体である。
さらに別の例では、ＧＳＫ３阻害因子は、ＣＨＩＲ−９９０２１、（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−オキシム（Ｂｉｏ、ＣＡＳ ６６７４６３−６２−９）、ＳＢ２１６７６３（ＣＡＳ ２８０７４４−０９−４）、ＣＨＩＲ−９８０１４（５５６８１３−３９−９）、ＧＳＫ−３ベータ阻害因子ＶＩＩＩ（ＣＡＳ ４８７０２１−５２−３）、カンパウロン（ＣＡＳ １４２２７３−２０−９）、ＤＲＦ０５３（２−［［９−（１−メチルエチル）−６−［［３−（２−ピリジニル）フェニル］アミノ］−９Ｈ−プリン−２−イル］アミノ］−１−ブタノール塩酸水和物とも呼ばれる）、Ｗｎｔ３ａおよびそれらの組み合わせであるが、これに限定されるものではない。さらなる例において、ＧＳＫ３阻害因子は、ＣＨＩＲ−９９０２１、ＳＢ２１６７６３、ＣＨＩＲ−９８０１４、ＤＲＦ０５３、Ｗｎｔ３ａ、およびそれらの組み合わせであるが、これに限定されるものではない。一例では、ＧＳＫ３阻害因子は、ＣＨＩＲ−９９０２１、ＳＢ２１６７６３、ＣＨＩＲ−９８０１４，およびそれらの組み合わせであるが、これに限定されるものではない。
一例では、ＧＳＫ３阻害因子は、０．００１μＭから１５μＭの間、１μＭから５μＭの間、４μＭから１０μＭの間、８μＭから１４μＭの間、１０μＭから１４μＭの間、０．５μＭから２μＭの間、１．４５μＭから３．７５μＭの間、３．４μＭから５μＭの間、５．３μＭから７．５μＭの間、７．４μＭから８．８μＭの間、８．６μＭから９．９μＭの間、９．８μＭから１０．８μＭの間、１０．７μＭから１１．５μＭの間、１１．４μＭから１２．８μＭの間、１２．６μＭから１３．５μＭの間、１３．４μＭから１４．５μＭの間、１４．１μＭから１５μＭの間、約１１μＭ、約１２μＭ、約１３μＭ、約１４μＭ、または約１４．５μＭの濃度で存在する。
ＣＨＩＲは、振盪条件で増殖させるヒト多能性幹細胞−マイクロキャリア（ｈＰＳＣ−ＭＣ）培養物における造血中胚葉誘導および前駆体の作製を向上させることが示された因子である。当該化合物群の一例であるＣＨＩＲ−９９０２１の構造を次に示す。
Figure 2021510527
本願において「誘導体」および「変種」という用語は、類似化合物から化学反応によって誘導した化合物を意味する。誘導体は、元の化合物の構造的および／または機能的な類似体として知られていることもある。
例えば、ＣＨＩＲ−９９０２１の誘導体はＣＨＩＲ−９８０１４であるが、これに限定されるものではない。
Figure 2021510527
ＧＳＫ３阻害因子の一例がＣＨＩＲであるが、これに限定されるものではない。
「Ｗｎｔ経路活性化因子」という用語は、Ｗｎｔシグナル伝達経路を活性化する化合物を意味する。Ｗｎｔ遺伝子ファミリーは、分泌シグナル伝達タンパク質をコードする、構造的に関連する遺伝子からなる。これらタンパク質は、例えば、腫瘍発生、脂肪生成、細胞運命の決定と胚発生におけるパターンニングを含むその他の発生過程について関連が知られているが、これらに限定されるものではない。このようなタンパク質の一例がＷｎｔ３ａである。
Ｗｎｔシグナル伝達は、（後に明らかとなる）胚発生ではなく、初めは発癌における役割によって同定された。これが制御する胚性プロセスには、体軸のパターンニング、細胞運命の決定、細胞増殖および細胞遊走が含まれる。これらのプロセスは、骨、心臓および筋肉を含む重要な組織の正しい形成に必要である。Ｗｎｔ経路タンパク質の遺伝子変異が異常なショウジョウバエ胚を産生することの発見によって、その胚発生における役割が見出された。Ｗｎｔシグナル伝達は、成人の骨髄、皮膚および腸における組織再生も制御する。後に、これらの異常を担う遺伝子はマウスにおける乳癌の発生にも影響することが見出された
一例では、Ｗｎｔ経路活性化因子は、０．５μＭから２０μＭの間、１μＭから１５μＭの間、０．５μＭから５μＭの間、４μＭから１１μＭの間、８μＭから１５μＭの間、１０μＭから１６μＭの間、１７μＭから２０μＭの間、約１μＭ、約１．５μＭ、約２μＭ、約２．５μＭ、約３μＭ、約３．５μＭ、約４μＭ、約４．５μＭ、約５μＭ、約５．５μＭ、約６μＭ、約６．５μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約８μＭ、約８．５μＭ、約９μＭ、約９．５μＭ、約１０μＭ、約１０．５μＭ、約１１μＭ、約１１．５μＭ、約１２μＭ、約１２．５μＭ、約１３μＭ、約１３．５μＭ、約１４μＭ、約１４．５μＭ、約１５μＭ、約１５．５μＭ、約１６μＭ、約１６．５μＭ、約１７μＭ、約１７．５μＭ、約１８μＭ、約１８．５μＭ、約１９μＭ、約１９．５μＭ、または約２０μＭの濃度で存在する。Ｗｎｔ経路活性化因子の一例はＩＱ−１およびＷｎｔ３ａであるが、これらに限定されるものではない。
さらに別の例においては、Ｗｎｔ経路活性化因子、例えばＷｎｔ３ａは、１ｎｇ／ｍｌから１５０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌの間、１ｎｇ／ｍｌから５０ｎｇ／ｍｌの間、４５ｎｇ／ｍｌから７５ｎｇ／ｍｌの間、６０ｎｇ／ｍｌから１１０ｎｇ／ｍｌの間、１１５ｎｇ／ｍｌから１５０ｎｇ／ｍｌの間、約１０ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ、約２５ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ、約３５ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ、約４５ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、約５５ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ、約６５ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ、約７５ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ、約８５ｎｇ／ｍｌ、約９０ｎｇ／ｍｌ、約９５ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ、約１０５ｎｇ／ｍｌ、約１１０ｎｇ／ｍｌ、約１１５ｎｇ／ｍｌ、約１２０ｎｇ／ｍｌ、約１２５ｎｇ／ｍｌ、約１３０ｎｇ／ｍｌ、約１４０ｎｇ／ｍｌ、約１４５ｎｇ／ｍｌ、または約１５０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。
本願で使用する「骨形態形成タンパク質」（ＢＭＰ）という用語は、サイトカインおよびメタボロゲンと同様の機能を有することも知られる、一群の成長因子を意味する。これらタンパク質は、もともとその骨および軟骨の形成を誘導する能力によって発見された。今日では、骨形態形成タンパク質は、体全体の組織構造を司る一群の形態形成シグナルを構成すると考えられる。生理学における骨形態形成タンパク質シグナルの重要な機能は、病理学的プロセスにおける調節不全ＢＭＰシグナル伝達の役割が多岐にわたることによって強調される。癌性疾患はＢＭＰシグナル伝達系の制御不全を含むことが多い。
骨形態形成タンパク質は、骨形態形成タンパク質受容体（ＢＭＰＲｓ）としても知られる、細胞表面の特定の受容体と相互作用する。骨形態形成タンパク質受容体を介したシグナル伝達は、ＳＭＡＤファミリーの一員であるタンパク質の動員をもたらす。ＢＭＰｓ、ＢＭＰＲｓおよびＳＭＡＤｓを含むシグナル伝達経路は、心臓、中枢神経系、および軟骨の発生のみならず、出生後の骨発生においても重要な役割を担う。骨形態形成タンパク質は、胚発生時の胚性パターンニングおよび早期骨格形成においても重要な役割を担う。よって、ＢＭＰシグナル伝達の破壊は、発生途中の胚のボディプランに影響し得る。例えば、ＢＭＰ４およびその阻害因子であるノギン（ｎｏｇｇｉｎ）およびコーディン（ｃｈｏｒｄｉｎ）は、胚の極性の制御（いわゆる背側から腹側へのパターンニング）を手助けする。特にＢＭＰ−４およびその阻害因子は、神経管形成および神経板の発生において主な役割を担う。ＢＭＰ−４は、外胚葉細胞が皮膚細胞へと発生するようにシグナルを与えるが、その下側の中胚葉による阻害因子の分泌がＢＭＰ−４の活性をブロックし、外胚葉がその正常な経路である神経細胞の発生を継続するようにする。ＢＭＰ４は通常、早期胚発生において腹周縁帯ならびに目、心血および耳嚢に見られる。
一例では、骨形態形成タンパク質は、５ｎｇ／ｍｌから５０ｎｇ／ｍｌの間、１０ｎｇ／ｍｌから２０ｇ／ｍｌの間、１８ｎｇ／ｍｌから２７ｎｇ／ｍｌの間、２６ｎｇ／ｍｌから３６ｇ／ｍｌの間、３５ｎｇ／ｍｌから４５ｇ／ｍｌの間、約９ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ、約１１ｎｇ／ｍｌ、約１９ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ、約２１ｎｇ／ｍｌ、約２８ｎｇ／ｍｌ、約２９ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ、約４８ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、または約５１ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。骨形態形成タンパク質の一例はＢＭＰ４であるが、これに限定されるものではない。よって別の例において、ＢＭＰ４は５ｎｇ／ｍｌから５０ｎｇ／ｍｌの間、１０ｎｇ／ｍｌから２０ｇ／ｍｌの間、１８ｎｇ／ｍｌから２７ｎｇ／ｍｌの間、２６ｎｇ／ｍｌから３６ｎｇ／ｍｌの間、３５ｎｇ／ｍｌから４５ｇ／ｍｌの間、約９ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ、約１１ｎｇ／ｍｌ、約１９ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ、約２１ｎｇ／ｍｌ、約２８ｎｇ／ｍｌ、約２９ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ、約４８ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、または約５１ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。
本願において「血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）」という用語は、細胞によって産生され、血管の形成を促進するシグナルタンパク質を意味する。言い換えれば、ＶＥＧＦは、成長因子（システインノット成長因子の血小板由来成長因子ファミリー）のサブファミリーである。これら成長因子は、（胚性循環器系のｄｅ ｎｏｖｏ形成である）脈管形成および（既に存在する脈管構造からの血管の成長である）血管形成の両方において重要なシグナル伝達タンパク質である。
一例では、血管内皮増殖因子は、３５ｎｇ／ｍｌから５５ｎｇ／ｍｌの間、３７ｎｇ／ｍｌから４７ｎｇ／ｍｌの間、４４ｎｇ／ｍｌから５１ｎｇ／ｍｌの間、５０．５ｎｇ／ｍｌから５２ｎｇ／ｍｌの間、５１．９ｎｇ／ｍｌから５３ｎｇ／ｍｌの間、５３．５ｎｇ／ｍｌから５４ｎｇ／ｍｌの間、約４０ｎｇ／ｍｌ、約４５ｎｇ／ｍｌ、約４８ｎｇ／ｍｌ、約４９ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌまたは約５１ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。
血管内皮増殖因子の一例はＶＥＧＦ１６５であるが、これに限定されるものではない。このような例示において、ＶＥＧＦ１６５は、２０ｎｇ／ｍｌから３５ｎｇ／ｍｌの間、３２から３８ｎｇ／ｍｌの間、３５ｎｇ／ｍｌから５５ｎｇ／ｍｌの間、３７ｎｇ／ｍｌから４７ｎｇ／ｍｌの間、４４ｎｇ／ｍｌから５１ｎｇ／ｍｌの間、４８ｎｇ／ｍｌから５１ｎｇ／ｍｌの間、５０．５ｎｇ／ｍｌから５２ｎｇ／ｍｌの間、５１．９ｎｇ／ｍｌから５３ｎｇ／ｍｌの間、５３．５ｎｇ／ｍｌから５４ｎｇ／ｍｌの間、約２９ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ、約３５ｎｇ／ｍｌ、約３８ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ、約４５ｎｇ／ｍｌ、約４８ｎｇ／ｍｌ、約４９ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌまたは約５１ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。
本願において「アクチビンＡ」という用語は、ＦＳＨの生合成と分泌を増強し、月経周期の制御に参加する２量体タンパク質複合体を意味する。アクチビンの発揮するその他の複数の機能としては、細胞増殖、分化、アポトーシス、代謝、ホメオスタシス、免疫応答、創傷治癒、および内分泌機能における役割が知られている。同定されているアクチビンの型は、アクチビンＡ、アクチビンＢ、およびアクチビンＡＢであり、アクチビンＡは２つのベータ−Ａ（βＡ）サブユニットを含む。スーパーファミリーの他のメンバーと同様に、アクチビンは２種の細胞表面膜貫通受容体（Ｉ型およびＩＩ型）と相互作用する。これら受容体は固有のセリン／スレオニンキナーゼ活性をその細胞質ドメインに有し、それぞれアクチビン１型受容体（例えば、ＡＣＶＲ１、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＡＣＶＲ１Ｃ）およびアクチビン２型受容体（例えば、ＡＣＶＲ２ＡおよびＡＣＶＲ２Ｂ）である。アクチビンはＩＩ型受容体に結合し、Ｉ型アクチビン受容体の動員、リン酸化および活性化につながるカスケード反応を開始する。これが次に、２種の細胞質ＳＭＡＤタンパク質であるＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３と相互作用し、そしてリン酸化する。その後Ｓｍａｄ３は核に移動し、多量体化によってＳＭＡＤ４と相互作用し、その結果、多種多様な遺伝子の発現を担う転写因子複合体として調節される。
一例では、アクチビンＡは、０．００１ｎｇ／ｍｌから５０ｎｇ／ｍｌの間、０．５ｎｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌの間、８ｎｇ／ｍｌから１８ｎｇ／ｍｌの間、１７ｎｇ／ｍｌから２７ｎｇ／ｍｌの間、２６ｎｇ／ｍｌから３６ｎｇ／ｍｌの間、３５ｎｇ／ｍｌから４６ｎｇ／ｍｌの間、４４ｎｇ／ｍｌから４９ｎｇ／ｍｌの間、約３８ｎｇ／ｍｌ、約３９ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ、約４１ｎｇ／ｍｌ、約４２ｎｇ／ｍｌまたは約４３ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。別の例では、アクチビンＡは、０．１ｎｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌの間、０．５ｎｇ／ｍｌから８ｎｇ／ｍｌの間、２．５ｎｇ／ｍｌから６ｎｇ／ｍｌの間、３ｎｇ／ｍｌから７ｎｇ／ｍｌの間、４ｎｇ／ｍｌから８ｎｇ／ｍｌの間、３ｎｇ／ｍｌから９ｎｇ／ｍｌの間、約３ｎｇ／ｍｌ、約４ｎｇ／ｍｌ、約４．２５ｎｇ／ｍｌ、約４．５ｎｇ／ｍｌ、約４．７５ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ、約５．２５ｎｇ／ｍｌまたは約５．５ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。
本願において「ホルモン」という用語は、多細胞生物の腺によって産生され、循環器系によって遠方の標的臓器に運搬されて、その生理学および行動を制御するシグナル伝達分子のクラスに属するいかなるメンバーをも意味する。ホルモンは、多様な化学構造の化合物を含み、主として３種に分類することができる：エイコサノイド、ステロイド、およびアミノ酸／タンパク質誘導体（アミン、ペプチドおよびタンパク質を含むが、これらに限定されるものではない）。
一例では、ホルモンは、０．０５ｎｇ／ｍｌから２ｎｇ／ｍｌの間、０．１ｎｇ／ｍｌから１．５ｎｇ／ｍｌの間、０．２５ｎｇ／ｍｌから１ｎｇ／ｍｌの間、０．２ｎｇ／ｍｌから０．８ｎｇ／ｍｌの間、０．４ｎｇ／ｍｌから０．６ｇ／ｍｌの間、０．３ｎｇ／ｍｌから１ｎｇ／ｍｌの間、約０．３８ｎｇ／ｍｌ、約０．３９ｎｇ／ｍｌ、約０．４０ｎｇ／ｍｌ、約０．４１ｎｇ／ｍｌ、約０．４２ｎｇ／ｍｌ、約０．４３ｎｇ／ｍｌ、約０．４４ｎｇ／ｍｌ、約０．４５ｎｇ／ｍｌ、約０．４６ｎｇ／ｍｌ、約０．４７ｎｇ／ｍｌ、約０．４８ｎｇ／ｍｌ、約０．４９ｎｇ／ｍｌ、約０．５０ｎｇ／ｍｌ、または約０．５１ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。
別の例では、ホルモンはβ−エストラジオールである。このような例においては、β−エストラジオールは、０．０５ｎｇ／ｍｌから２ｎｇ／ｍｌの間、０．１ｎｇ／ｍｌから１．５ｎｇ／ｍｌの間、０．２５ｎｇ／ｍｌから１ｎｇ／ｍｌの間、０．２ｎｇ／ｍｌから０．８ｎｇ／ｍｌの間、０．４ｎｇ／ｍｌから０．６ｇ／ｍｌの間、０．３ｎｇ／ｍｌから１ｎｇ／ｍｌの間、約０．３８ｎｇ／ｍｌ、約０．３９ｎｇ／ｍｌ、約０．４０ｎｇ／ｍｌ、約０．４１ｎｇ／ｍｌ、約０．４２ｎｇ／ｍｌ、約０．４３ｎｇ／ｍｌ、約０．４４ｎｇ／ｍｌ、約０．４５ｎｇ／ｍｌ、約０．４６ｎｇ／ｍｌ、約０．４７ｎｇ／ｍｌ、約０．４８ｎｇ／ｍｌ、約０．４９ｎｇ／ｍｌ、約０．５０ｎｇ／ｍｌ、または約０．５１ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。
本願において、「塩基性線維芽細胞増殖因子」という用語は、ＦＧＦ２遺伝子のコードする成長因子およびシグナル伝達タンパク質を意味する。塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、ＦＧＦ２としても知られる）は、広い分裂促進および細胞生存活性を有することが知られており、胚発生、細胞成長、形態形成、組織治癒、腫瘍成長および浸潤を含む多様な生物プロセスに関与することが知られている。塩基性線維芽細胞増殖因子は、ヒト胚性幹細胞培養培地の成分としても知られており、細胞が未分化の状態に残るために必要な成長因子の１つである。グレムリンの発現を誘導することが示されており、その結果、骨形態形成タンパク質による分化の誘導が阻害される。塩基性線維芽細胞増殖因子は、例えば、ＢＭＰ４と共に、幹細胞の中胚葉系統への分化を促進することが示されている。
一例では、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）またはその変異体は、２ｎｇ／ｍｌから１５ｎｇ／ｍｌの間、５ｎｇ／ｍｌから１４ｇ／ｍｌの間、８ｎｇ／ｍｌから１１ｎｇ／ｍｌの間、６ｎｇ／ｍｌから１０ｇ／ｍｌの間、約５ｎｇ／ｍｌ、約６ｎｇ／ｍｌ、約７ｎｇ／ｍｌ、約８ｎｇ／ｍｌ、約９ｎｇ／ｍｌ、約９．５ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ、約１０．２５ｎｇ／ｍｌ、約１０．５ｎｇ／ｍｌ、約１１ｎｇ／ｍｌ、約１２ｎｇ／ｍｌ、または約１３ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。別の例においては、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）またはその変異体は、ｂＦＧＦの熱安定性キメラ変異体、または安定キメラ線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）である。
本願において「サイトカイン」という用語は、細胞シグナル伝達において重要な小タンパク質（約５〜２０ｋＤａ）の広く、厳密ではないカテゴリーを意味する。これらは細胞によって放出され、他の細胞の行動に影響を与え、ときには放出した細胞自身にも影響を与える。サイトカインは、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンフォカイン、腫瘍壊死因子を含むが、通常、ホルモンまたは成長因子は含まない。サイトカインは、マクロファージ、Ｂ−リンパ球、Ｔ−リンパ球およびマスト細胞等の免疫細胞のみならず、内分泌細胞、繊維芽細胞および多様な間質細胞を含む、広範にわたる細胞によって産生される。あるサイトカインは、１種以上の細胞によって産生され得る。サイトカインは、体液性免疫応答と細胞性免疫応答とのバランスを調節し、特定の細胞集団の成熟、成長および応答性も調節する。いくつかのサイトカインは、他のサイトカインの活性を複雑な方式で増強又は阻害するが、その方式は、重要な細胞シグナル伝達分子でもあるホルモンとは異なる。ホルモンはより低濃度で循環し、特定の種類の細胞によって産生される傾向にある。
一例では、サイトカインは５ｎｇ／ｍｌから５０ｎｇ／ｍｌの間、１０ｎｇ／ｍｌから２０ｇ／ｍｌの間、１８ｎｇ／ｍｌから２７ｎｇ／ｍｌの間、２６ｎｇ／ｍｌから３６ｇ／ｍｌの間、３５ｎｇ／ｍｌから４５ｇ／ｍｌの間、約９ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ、約１１ｎｇ／ｍｌ、約１９ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ、約２１ｎｇ／ｍｌ、約２８ｎｇ／ｍｌ、約２９ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ、約４８ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、または約５１ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。
別の例では、サイトカインは幹細胞因子（ＳＣＦ）である。このような例において、幹細胞因子（ＳＣＦ）は、５ｎｇ／ｍｌから５０ｎｇ／ｍｌの間、１０ｎｇ／ｍｌから２０ｇ／ｍｌの間、１８ｎｇ／ｍｌから２７ｎｇ／ｍｌの間、２６ｎｇ／ｍｌから３６ｇ／ｍｌの間、３５ｎｇ／ｍｌから４５ｇ／ｍｌの間、約９ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ、約１１ｎｇ／ｍｌ、約１９ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ、約２１ｎｇ／ｍｌ、約２８ｎｇ／ｍｌ、約２９ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ、約４８ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、または約５１ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。
さらに別の例において、細胞培養培地はＢＭＰ４と、アクチビンＡと、ＣＨＩＲ９９０２１と、ＶＥＧＦ１６５とを含む。別の例において、ＢＭＰ４は２６から３６ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在し、アクチビンＡは３５から４６ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在し、ＣＨＩＲ−９９０２１は８μＭから１４μＭの間の濃度で存在し、ＶＥＧＦ１６５は４８ｎｇ／ｍｌから５１ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在する。さらに別の例においては、ＢＭＰ４は約３０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し、アクチビンＡは約４０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し、ＣＨＩＲ９９０２１は約１２μＭの濃度で存在し、ＶＥＧＦ１６５は約５０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。
一例では、本願で開示する方法は、本願で開示する細胞培養培地の使用を必要とし、当該細胞培養培地は、ＢＭＰ４と、アクチビンＡと、ＣＨＩＲ９９０２１と、ＶＥＧＦ１６５とを含む。一例では、ＢＭＰ４は２６から３６ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在し、アクチビンＡは３５から４６ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在し、ＣＨＩＲ−９９０２１は８μＭから１４μＭの間の濃度で存在し、ＶＥＧＦ１６５は４８ｎｇ／ｍｌから５１ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在する。
さらに別の例では、細胞培養培地はＢＭＰ４と、アクチビンＡと、ＶＥＧＦ１６５とを含む。このような例では、ＢＭＰ４は２６ｎｇ／ｍｌから３６ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在し、アクチビンＡは３５から４６ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在し、ＶＥＧＦ１６５は４８ｎｇ／ｍｌから５１ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在する。別の例では、ＢＭＰ４は約３０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し、アクチビンＡは約４０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し、ＶＥＧＦ１６５は約５０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。
別の例では、細胞培養培地はＢＭＰ４と、アクチビンＡと、ｂＦＧＦと、βエストラジオールと、幹細胞因子（ＳＣＦ）と、ＶＥＧＦ１６５とを含む。一例では、ＢＭＰ４は１８ｎｇ／ｍｌから２７ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在し、アクチビンＡは３ｎｇ／ｍｌから７ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在し、ｂＦＧＦは５ｎｇ／ｍｌから１４ｇ／ｍｌの間の濃度で存在し、βエストラジオールは０．２ｎｇ／ｍｌから０．８ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在し、ＳＣＦは２６ｎｇ／ｍｌから３６ｇ／ｍｌの間の濃度で存在し、ＶＥＧＦ１６５は３２から３８ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在する。別のこのような例では、ＢＭＰ４は約２０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し、アクチビンＡは約５ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し、ｂＦＧＦは約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し、βエストラジオールは約０．４ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し、幹細胞因子（ＳＣＦ）は約２０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し、ＶＥＧＦ１６５は約３０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。
従って、本願においては、多能性幹細胞を造血前駆細胞に分化させる方法も開示し、当該方法は、懸濁撹拌下で実施され、以下の工程を含む。
ａ．多能性幹細胞を提供する任意の工程と、
ｂ．工程ａで得た細胞を本願に記載の細胞培養培地に２４時間（０日目から１日目に）暴露して、Ｔ−ブラキウリ（Ｔ−Ｂｒａ、原条／早期中胚葉マーカー）陽性細胞を得る工程と、
ｃ．工程ｂの細胞を本願に記載の細胞培養培地に２４時間（１日目から２日目に）暴露する工程と、
ｄ．工程ｃのマイクロキャリア付着細胞を本願に記載の細胞培養培地に４８時間（２日目から４日目に）暴露し、工程ｂからｄで中胚葉を誘導し、
ｅ．細胞培養培地を除去し、工程ｄで得られたＫＤＲ＋ＰＤＧＦＲα−造血前駆細胞を単離する工程。
別の例では、多能性幹細胞を造血前駆細胞に分化させる方法を開示し、当該方法は、懸濁撹拌下で実施され、以下の工程を含む。
ａ．多能性幹細胞を本願に記載の細胞培養培地に２４時間（０日目から１日目に）暴露して、Ｔ−ブラキウリ（Ｔ−Ｂｒａ、原条／早期中胚葉マーカー）陽性細胞を得る工程と、
ｂ．工程ａの細胞を本願に記載の細胞培養培地に２４時間（１日目から２日目に）暴露する工程と、
ｃ．工程ｂのマイクロキャリア付着細胞を本願に記載の細胞培養培地に４８時間（２日目から４日目に）暴露し、工程ａからｂで中胚葉を誘導する工程と、
ｄ．細胞培養培地を除去し、工程ｃで得られたＫＤＲ＋ＰＤＧＦＲα−造血前駆細胞を単離する工程。
別の例では、多能性幹細胞を造血前駆細胞に分化させる方法を開示し、当該方法は、懸濁撹拌下で実施され、以下の工程を含む。
ａ．多能性幹細胞を提供する任意の工程と、
工程ａで単離した多能性幹細胞から本願に記載の方法に従って中胚葉誘導を行い、ＫＤＲ＋ＰＤＧＦＲα−造血前駆細胞を得る工程と、
工程ｂで単離した細胞に対して造血細胞誘導を行い、ＣＤ３４／ＣＤ４３／ＣＤ４５造血前駆細胞を得る工程と、
工程ｃで単離した細胞から本願に記載の方法に従って赤芽球増殖を誘導し、ＣＤ２３５ａ＋ＣＤ７１＋赤芽球細胞を得る工程と、
工程ｄで単離した細胞から本願に記載の方法に従って赤芽球成熟を誘導し、ＣＤ２３５ａ＋ＤＲＡＱ５陰性除核赤芽球細胞を得る工程と、
細胞培養培地を除去し、工程ｅで得られたＣＤ２３５ａ＋ＤＲＡＱ５陰性除核赤芽球細胞を単離する工程。
さらに別の例では、多能性幹細胞を造血前駆細胞に分化させる方法が開示され、当該方法は、懸濁撹拌下で実施され、以下の工程を含む。
a．懸濁撹拌に付した培養細胞から単離した多能性幹細胞に対して中胚葉誘導を行い、ＫＤＲ＋ＰＤＧＦＲα−造血前駆細胞を得る工程と、
ｂ．工程ａで単離した細胞に対して造血細胞誘導を行い、ＣＤ３４／ＣＤ４３／ＣＤ４５造血前駆細胞を得る工程と、
ｃ．工程ｂで単離した細胞に対して赤芽球増殖を誘導し、ＣＤ２３５ａ＋ＣＤ７１＋赤芽球細胞を得る工程と、
ｄ．工程ｃで単離した細胞に対して赤芽球成熟を誘導し、ＣＤ２３５ａ＋ＤＲＡＱ５陰性除核赤芽球細胞を得る工程と、
ｅ．細胞培養培地を除去し、工程ｄで得られたＣＤ２３５ａ＋ＤＲＡＱ５陰性除核赤芽球細胞を単離する工程。
撹拌タンクバイオリアクターに類似したプラットホームを得るために、ヒト人工多能性幹細胞の全ての増殖および分化を１２５ｍｌのスピナーフラスコで実施した（図２９）。ヒト人工多能性幹細胞−マイクロキャリア（ＨｉＰＳＣｓ−ＭＣ）培養物を、ｍＴｅＳＲ１培地中、連続振盪下のスピナーフラスコで７日間増殖させた。同じスピナーフラスコ内でのさらに３日間の培地交換を経て、ｈｉＰＳＣ−ＭＣ凝集体は造血細胞を運命づけられた中胚葉に分化された。ヒト人工多能性幹細胞−マイクロキャリア（ＨｉＰＳＣｓ−ＭＣ）凝集体由来の単一細胞は、次に同じスピナーフラスコに再度植え付けられ、定期的な培地交換を伴う、振盪条件下で１０日間の造血細胞誘導に付された。連続振盪下の赤芽球増殖は、赤芽球増殖培地への交換および定期的な培地交換を伴う、さらなる１４日間の培養によって達成された。３０日目には、細胞数で１０００倍の増殖倍率を達成することができた（データは示さない）。別の実験では、乳酸およびアンモニアレベルをモニタリングし、それらを阻害レベル以下に維持しながら、完全な培地交換を行うことで、スピナーフラスコで高細胞密度を達成可能であることが示された。５０ｍｌの培養容量では、１．７×１０７細胞／ｍｌ（１．７ｅ７細胞／ｍｌ）という非常に高い細胞密度と、８．５×１０８細胞（８．５ｅ８細胞）という総細胞数を達成可能であることが示された。３０日目には、分化した細胞の＞７３％がＣＤ２３５ａ赤血球細胞であり、主として胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ、＞８５％）の発現と、いくらかの検出可能なレベルのヘモグロビンＡ（ＨｂＡ；１６％）の発現を示した。同じスピナーフラスコによる振盪条件下での成熟に続いて、５％から１０％の除核赤血球を見ることができる。分化赤血球の酸素結合プロファイルは、成人赤血球と比べて左側にずれでおり、これは酸素に対するより高い親和性を示し、高レベルの胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）と一致している。
一例では、多穴超低接着表面培養細胞容器（例えば、６穴プレート）、ローラーボトル、混合タンクバイオリアクター等のバイオリアクター、ウェーブバイオリアクター、振盪フラスコおよびスピナーフラスコからなる群より選ばれる培養細胞容器で方法を実施する。
さらに、マイクロキャリアと、本願に開示する細胞培養培地の１種以上とを含むキットも開示する。本願に開示する成分は、保存安定性を有する処方または状態で提供することができる。例えば、細胞培養培地は、濃縮溶液として、希釈のための適切な基礎培地と共に提供される。別の例では、濃縮溶液は２０×、５０×または１００×の濃縮溶液である。さらに別の例では、細胞培養培地は凍結（即時使用可能な）溶液として提供される。細胞培養培地のいかなる成分も基礎培地とは別に提供することができる。細胞培養培地の成分は、凍結乾燥物質として提供することもできる。
臍帯血およびｈｉＰＳＣ由来赤芽球のスケーラブルな震盪懸濁培養プラットホームにおける改善された除核効率
本項は、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）から分化した赤芽球および臍帯血由来（ＣＢ）赤芽球から非アポトーシス性除核赤血球を高パーセンテージで誘導するための方法について記載する。文献に記載の従来のアプローチ、即ち、（ＥＰＯ、インスリン、ホロトランスフェリンに加えて）１０〜１５％のヒト血清／血漿を含む培地での赤芽球の培養を使用した際の除核効率は、臍帯血由来赤芽球（＜４０％の除核赤血球）およびｈｉＰＳＣ赤芽球（＜１０％の除核赤血球）では通常は非常に低い。臍帯血由来／ｈｉＰＳＣ赤芽球を、連続振盪下のマイクロキャリアで培養したＯＰ９マウス間質細胞系（ＡＴＣＣ：ＣＲ−２７４９）と共培養する方法を試験した。このような懸濁撹拌共培養システムにおいては、非アポトーシス性（アネキシンＶ陰性）除核赤芽球（ＤＲＡＱ５陰性）のパーセンテージが、ｈｉＰＳＣ赤芽球では６．３±０．３％（従来法）から５９．３±１．５％に増加し、臍帯血由来分化赤芽球では４４．６±０．８％（従来法）から８４．５±０．５％に増加した。従来のアプローチと同様に細胞を最終成熟させると、非常に高いパーセンテージのアポトーシス性細胞が検出された。ＯＰ９との共培養は、アポトーシス性細胞の割合を有意に減少させることが判明した。論理に縛られるものではないが、実験データは、ＯＰ９によるこの抗アポトーシス性効果は、細胞−細胞接触によるものというよりは、パラクリン効果による可能性を示した。さらに、ＯＰ９との共培養のプロセスに振盪を含めることは、除核効率を有意に改善することが示された。
単層培養ＯＰ９および／またはＭＳ−５等の他の間質細胞系の上の、臍帯血由来／ｈｉＰＳＣ赤芽球の共培養は、除核を有意に改善することが示された。しかし、単層培養に関連する限られた表面積ゆえに、このアプローチは、大量の除核赤血球を誘導するためにプロセスの規模を拡大するには、限界がある。一方、本願に開示する、ＯＰ９をマイクロキャリア上で培養するアプローチは、除核赤血球を誘導するためのスケーラブルとなり得る震盪懸濁培養プラットホームの開発を可能にする。よって、これまでに、除核効率を上げるためのスケーラブルなプラットホームの開発のための、ＯＰ９または他の間葉幹細胞（ＭＳＣｓ）と赤芽球との懸濁共培養に関する記載は存在しない。
Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の制御による、マイクロキャリア培養における複数のヒト多能性幹細胞系の赤血球分化
Ｏ陰性Ｒｈ因子Ｄ陰性（Ｏ陰性）ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣｓ）の分化は、輸血用途に有用な万能ドナー赤血球（ＲＢＣｓ）を作製し得る。赤血球の産生について報告されているアプローチの中では、異種物不含および条件限定で開発された胚様体（ＥＢ）仲介分化アプローチが、将来の臨床展開に最も有望である。しかし、強制的な凝集などによる胚様体作製のための従来のアプローチも、大規模の懸濁培養での成功は示されていない。３次元（３Ｄ）−凝集体としての、または限定細胞外マトリックス（ＥＣＭ）被覆マイクロキャリア（ＭＣｓ）上でのｈｉＰＳＣの培養は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）および胚様体の懸濁培養による増殖をスケールアップする手段となる可能性がある。ｈＰＳＣ−ＭＣ凝集体はＢＭＰ４ベースのプロトコルで分化させたときに、造血前駆体および赤芽球に分化し得ることがすでに示されている。しかし、連続振盪条件下で初めに増殖させた複数のｈＰＳＣ細胞系を分化させる試みの繰り返しは、赤血球分化のばらつきを示した。論理に縛られるものではないが、振盪せん断応力が、ＳＭＡＤ７の発現を誘導し得ると仮定した。ＳＭＡＤ７は、中胚葉分化の初期ステージでＢＭＰ４によって活性化されるＴＧＦ−βシグナル伝達経路の成分であるＳＭＡＤ１、５および８の全てのリン酸化に対して阻害効果を示すことが知られている。よって、振盪培養におけるＢＭＰ４シグナル伝達の阻害は、不十分な中胚葉誘導および分化結果のばらつきの理由である可能性がある。振盪下で初めに増殖させたヒト多能性幹細胞−マイクロキャリア（ｈＰＳＣ−ＭＣ）凝集体の赤血球分化のための最適プロトコルをここに示し、これは万能赤血球の大規模産生のための基礎またはプロセスとなる。
本願に開示する方法は、図２６に示したように、当業界で報告されて来た方法とは異なる。図２６Ｂは、本願開示の方法と従来技術（Olivier et al, 2016）の方法とを直接比較する模式図である。従来技術に開示の方法と、本発明の方法との違いは、例えば、本願開示の方法は、中胚葉誘導にヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣｓ）およびマイクロキャリア−ｈｉＰＳＣを胚様体（ＥＢｓ）のマイクロキャリア培養物を使用することであるが、これに限定されるものではない。別の例では、本願開示の方法の全ての工程を連続振盪下の懸濁培養で実施することである。本願開示の方法と従来技術に開示の方法との違いの別の例は、本願に開示する中胚葉誘導のための０日および１日目の条件、赤芽球増殖培地、成熟培地の条件が、従来技術に記載のものと異なる点にある。
図３９Ａは、中胚葉誘導および続く赤血球分化における振盪の影響を評価するために実施した実験研究をまとめたものである。静置、３日間振盪、または７日間振盪の条件に由来するヒト多能性幹細胞−マイクロキャリア（ｈＰＳＣ−ＭＣ）凝集体のヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）増殖ステージ（図３９Ｂ）を、多能性を維持したヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）系であるｈＥＳ−３（図３９Ｃ）において比較することで、ＢＭＰ４ベースのプロトコルを用いた７日間の連続振盪は、静置条件由来の培養物をＢＭＰ４ベースのプロトコルで分化させたときと比べて、原条／中胚葉マーカーであるＴ−Ｂｒａ９および造血中胚葉マーカーであるＫＤＲ１０（図３９Ｄ）の発現のみならず、続く造血前駆体（図３９Ｅ〜Ｇ）および赤芽球分化（図３９Ｇ〜Ｈ）も妨げることが示された。上述した仮説に合致し、振盪培養は、静置培養と比べて、阻害性ＳＭＡＤ７のレベルを増加させた。振盪培養においてＢＭＰ４シグナル伝達は悪影響を受けており、ＳＭＡＤ１／５のリン酸化は静置培養でしか顕著でなかった（図３８ＡおよびＣ）。
振盪培養による不十分な分化結果を改善するために、多因子実験計画（ＤｏＥ）アプローチを使用して、連続振盪させたｈＥＳ−３（図２ＢとＣおよび表３）およびＯ陰性ｈｉＰＳＣ系であるＤ５（図６）に由来するｈＰＳＣ−ＭＣ−凝集体培養物の造血中胚葉誘導を改善し得る因子の組み合わせをスクリーニングした。
表３−多因子ＤｏＥ解析は、ｈＥＳ−３−ＭＣ振盪培養における、改善された造血中胚葉誘導および造血分化の重要因子として、ＣＨＩＲ−９９０２１を同定する。アクチビンＡ（ｎｇ／ｍｌ）、２４時間維持するＣＨＩＲ−９９０２１（μＭ）、２４〜４８時間維持するＣＨＩＲ−９９０２１（μＭ）および実験開始時に添加するＢＭＰ４（ｎｇ／ｍｌ）の濃度の異なる種々のＤｏＥ条件、ならびにフローサイトメトリーで決定した分化後４日目に対応するＫＤＲ＋細胞のパーセント、および１×１０５細胞の初期播種に続くＢＧＭでの１４日間の増殖後の、ウェル当たりの総造血前駆体を示す表である。
Figure 2021510527
ＤｏＥ研究によって、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３−ベータ（ＧＳＫ−３β）の選択的阻害因子であり、且つ典型的なＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の活性化因子であるＣＨＩＲ−９９０２１（ＣＨＩＲ）は、ＢＭＰ４およびアクチビンＡと組み合わせて使用されたときに、ＫＤＲ＋細胞の改善された発生（図２Ｂおよび図６Ｃ）および続く造血前駆体の作製（図２Ｃ、Ｄ）において最も重要因子であることが同定された。さらにＫＤＲ＋細胞集団のより高い初期パーセントと、産生された造血前駆体のより高い総数とを相関させることも可能であった（Ｐ＝０．００１）（図２Ｄ）。ＣＨＩＲ−９９０２１は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣｓ）の心筋細胞および造血細胞への分化のための原条／中胚葉発生を誘導することも示された。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路成分であるＴＣＦ−１やＬＥＦ−１等、さらにはＷｎｔシグナル伝達の直接の標的であるＴ−ＢＲＡ等が、ＣＨＩＲによる誘導から２４時間という早期に検出された（図３８ＡおよびＢ）。本願に開示のＣＨＩＲベースのプロトコルは、植え付けたヒト多能性幹細胞ごとに同様の赤芽球産生（Ｐ＞０．０５）をもたらし、これは静置条件（１１．５±２．６）または振盪条件（８．０±２．１）に由来のｈＥＳ−３マイクロキャリア凝集体の分化に続くものである。一方、ＢＭＰ４ベースの分化では、効率的な増殖は、静置（７．７±１．９）および非振盪（１．２±０．７）条件（Ｐ＜０．０５）でのみ観察された（図２３）。振盪マイクロキャリア培養で増殖させたヒト多能性幹細胞の向上した赤血球分化に対するＣＨＩＲの効果を立証するために、ＤｏＥ研究の２９の条件（図６Ａ）について、Ｄ５（ヒト人工多能性幹細胞系）を用いて評価した。その後、詳細な研究のために６の条件を選んだ。条件１、２および４はＢＭＰ４／アクチビンＡプロトコルに基づくものであり、条件７、１６および１８はＣＨＩＲ仲介プロトコルであった（表１）。ＢＭＰ４／アクチビンＡプロトコルは、誘導後４８時間の非常に少量の原条／中胚葉誘導（Ｔ−Ｂｒａ＋細胞：６．６６〜８．３６％）と、誘導後９６時間の低い造血中胚葉誘導（ＫＤＲ＋細胞が５．３３〜１３．８％）をもたらした（表１）。これらの条件は、造血転写因子ＳＣＬおよびＲＵＮＸ１の非常に低い誘導をさらにもたらし、メチルセルロースベースのブラスト成長培地（ＢＧＭ）における２週間の培養に続く造血前駆体の増殖は無しまたは低く、続く赤芽球増殖に失敗した（表１）。一方、ＣＨＩＲベースのプロトコルは、高い原条／中胚葉誘導（２日目に４４．９〜８９．６％のＴ−Ｂｒａ＋細胞）、高い造血中胚葉誘導（４日目に１８．６〜２９．４％のＫＤＲ＋細胞）、ＣＤ３１、ＳＣＬ／Ｔａｌ−１および（造血発生の主要調節因子として知られる）ＲＵＮＸ１のより高い誘導倍率、および分化後１４日目の造血前駆体の改善された増殖をもたらした（表１）。試験したＣＨＩＲベースの条件の内、条件＃７（１２ｍＭのＣＨＩＲで２４時間）および＃１８（６ｍＭのＣＨＩＲで４８時間）は、赤血球分化および増殖（３４日目の増殖倍率がそれぞれ２８４．４±９．２対９５．８±１．２）をもたらし（表１）、条件＃７が条件＃１８に対して、有意に高い赤芽球数を示した（４．３１×１０７細胞に対して１．４２×１０８細胞、分化後３４日、Ｐ＝０．０００３）（図３Ａ）。条件＃７で分化させた赤芽球は、培養５６日目に６２３４３±１５０７０の積算増殖倍率を達成した。
振盪条件由来のヒト多能性幹細胞−マイクロキャリア（ｈＰＳＣ−ＭＣ）凝集体の赤血球分化の条件を最適化したため、７種の核型が正常なＯ陰性ｈｉＰＳＣ系（ＢＲ２、ＢＲ７、Ｄ５、Ｄ９、Ｄ１１、Ｄ１２、Ｘ１３）、１種の市販のｈｉＰＳＣ系（ＩＭＲ９０）およびｈＥＳＣ系（ｈＥＳ−３）の分化を試験した。マイクロキャリア上、振盪条件下で７日間増殖させヒト多能性幹細胞系は多能性を維持し、５．３から１２．５の増殖倍率を達成し、平均凝集体径は２５５〜５１０ｍｍの範囲内であった（図４Ａ）。異なるｈＰＳＣ細胞系から作製したＨＰＳＣ−ＭＣ凝集体を、３種のＣＨＩＲ用量（５、１０および１５ｍＭで２４時間）を用いて分化させた。試験したすべての細胞系について、１５ｍＭのＣＨＩＲが、５ｍＭのＣＨＩＲと比べて、有意に高い（Ｐ＜０．０５）Ｔ−Ｂｒａ＋細胞をもたらした（図４Ｂ）。血脈管前駆体の指標となるＫＤＲ＋ＰＤＧＦＲα−細胞の発現は、Ｔ−Ｂｒａ＋細胞の傾向を反映しており、１５ｍＭのＣＨＩＲが、５ｍＭのＣＨＩＲと比べて、有意に高い（Ｐ＜０．０５）ＫＤＲ＋ＰＤＧＦＲα−細胞を示した（図４Ｃ）。分化した細胞の造血細胞誘導について、ＣＤ３１および造血転写因子ＳＣＬ、ＧＡＴＡ２、ＲＵＮＸ１およびＬＭＯ２（分化後４日目）の発現をＲＴ−ＰＣＲで評価したところ、試験した大部分の細胞系において、ＣＨＩＲの用量の増加に伴いより高い倍率の上方制御が示された（図９）。Ｄ９およびＩＭＲ９０を除く他の全てのｈＰＳＣ細胞系において、１５ｍＭのＣＨＩＲで誘導したときに、５ｍＭのＣＨＩＲと比べて、分化後１４日目の造血前駆体の増殖倍率が有意に増加した（Ｐ＜０．０５）（図４Ｄ）。赤血球分化に続き、Ｘ１３は積算増殖倍率が１２６０５±２１２６に達成し、これは試験した他の細胞系のいずれよりも高かった（図４Ｆ）。９種の細胞系の内の６種（Ｄ５、Ｄ９、Ｘ１３、ＢＲ７、ＩＭＲ９０、ｈＥＳ−３）は赤芽球への分化に成功し（図４Ｇ）、ＣＤ２３５ａの発現と、高レベルのＨｂＦを有していた（表２）。最も性能の高い細胞系であるＸ１３は、植え付けたヒト多能性幹細胞あたり７６０７±１０１６個のＣＤ２３５ａ＋赤血球細胞を誘導することができた（表２）。ヘモグロビンサブタイプの免疫ブロット評価では、ヒト多能性幹細胞から分化した赤芽球の大部分がアルファ、ガンマおよびエプシロンヘモグロビンを発現し、成人赤芽球と比べて少量のベータ−ヘモグロビンを発現した（図４０ＡおよびＣ）。
ＢＲ７およびＸ１３から分化した赤芽球は、ベータ−ヘモグロビンサブタイプの発現もいくらか示したことに着目されたい（図４０）。ヒト多能性幹細胞分化赤芽球の酸素平衡曲線は、その酸素結合親和性（Ｐ５０値が１０．１〜１３．４の範囲）が、成人ＲＢＣ（Ｐ５０： １９．６±０．２）よりも高いことを示した（図４０ＡおよびＢ）。初期ヒト間葉幹細胞（ＭＳＣｓ）との１８日間の共培養に続き、２８〜４０．６％の赤芽球はＣＤ２３５ａ＋且つＤＲＡＱ５（細胞透過性核染色）陰性であり、これは除核赤血球細胞であることの指標である（図４０ＡおよびＤ）。この結果は、核染色のないＣＤ２３５ａ＋赤血球を示した、細胞のギムザ染色（図４０Ｅ）および高成熟赤芽球免疫蛍光染色によってさらに補強された（図４０Ｆ）。
本願において実例をもとに説明した発明は、本願において具体的に説明されていないものの、１または複数の要素、または１または複数の限定無しに適切に実施することができる。よって、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」等は、拡張された、限定の無い記載として読まれなければならない。さらに、ここで使用する用語および表現は、限定のためではなく、表現のために使用される用語であり、このような用語および表現の使用には、ここに示され、記載された要件またはその部分と同等のものを排除する意図はなく、請求項に記載の発明の範囲内の種々の変更が可能であることを認識されたい。従って、好ましい態様および任意の要件によって本発明を具体的に開示したが、ここの開示に包含される発明の変更や変種は当業者によって予測され得るものであり、上記変更や変種は本発明の範囲に含まれるものとすることを理解されたい。
本願で使用する、単数を表す“ａ”“ａｎ”および“ｔｈｅ”は、文脈が明確に示さない限り、複数への参照も含むものである。例えば、「遺伝子マーカー（ａ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ）」という用語は、複数の遺伝子マーカーを含み、混合物およびそれらの組み合わせも含む。
本願で使用する「約」という用語は、処方の成分の濃度に関する文脈においては、典型的には記載されている値の±５％、より典型的には記載されている値の±４％、より典型的には記載されている値の±３％、より典型的には記載されている値の±２％、さらに典型的には記載されている値の±１％、さらに典型的には記載されている値の±０．５％を意味する。
本願の開示を通じて、ある態様は範囲形式で開示される。範囲形式の記載は便宜および簡潔さのためであり、開示されている幅の範囲に対する融通性のない限定ととらえてはならない。よって、範囲に関する記載は、範囲内に含まれる個別の数値のみならず、可能なすべての副範囲をも具体的に開示するものとみなさなければならない。例えば、１〜６という範囲に関する記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６等の副範囲のみならず、範囲内の個別の数値、例えば、１、２、３、４、５および６をも具体的に開示するものとみなさなければならない。これは範囲の大きさには関係なく適用される。
いくつかの態様は、本願において広く且つ一般的にも記載されている。一般的開示に含まれる、より限定的な種類および亜属である分類のそれぞれも、本願開示を構成するものである。これらには実施態様の一般記載が含まれるが、本願に具体的に記載されているか否かにかかわらず、当該属からは主題が除かれることを前提または負の限定とする。
本願において、本発明を広く且つ一般的に記載した。一般的開示に含まれる、より限定的な種類および亜属である分類のそれぞれも、本願開示を構成するものである。これらには実施態様の一般記載が含まれるが、本願に具体的に記載されているか否かにかかわらず、当該属からは主題が除かれることを前提または負の限定とする。
他の態様も、後述する請求項および限定的ではない実施例に含まれる。さらに、発明の要件または様相がマーカッシュグループを用いて記載されているとき、当業者は、マーカッシュグループの個別のメンバーまたはメンバーのサブグループによっても発明が記載されていることを認識する。
単層多能性培養細胞
Ｏ陰性ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）系（Ｄ５、Ｄ９、Ｄ１１、Ｄ１２、Ｘ１３、ＢＲ２、ＢＲ７）は、（シンガポール国立大学の倫理委員会の承認のもとで）同意を得たヒトドナーのフィンガープリック（ｆｉｎｇｅｒ−ｐｒｉｃｋ）血液に由来のＣＤ７１＋赤芽球から、センダイウイルスによる４種の再プログラミング因子の形質転換によって再プログラミング化したものである。
まとめると、合計１０ｍｌの指先末梢血を滅菌実験室環境下で採取した。サンプルは、２５０ｇで５分間の遠心分離の前に、２ｍｌの１×赤血球（ＲＢＣ）溶解バッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中で１０分間溶解した。遠心の直後に溶解バッファーを吸引した。精製細胞を５００ｍｌの細胞増殖培地に再懸濁し、２４穴の組織培養プレートの１つのウェルに植え付けた。ＳｔｅｍＳｐａｎ無血清増殖培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）含有フィンガープリック（ＦＰ）血液用細胞増殖培地に、１×ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）（Ｇｉｂｃｏ）、１×Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１×非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、５０ｍｇ／ｍｌのＬ−アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、５０ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、１０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン−３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、４０ｎｇ／ｍｌのインスリン様成長因子−１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、２Ｕ／ｍｌのエリスロポエチン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、および１ｍＭのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し、１０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン−６（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）は添加有りまたは無しとした。培地交換は、半分の培地を注意深くピペットで抜き取り、新鮮な培地で置き換えることで毎日行った。１２から１６日後に、細胞集団が２０，０００〜３０，０００細胞に達したら、センダイウイルスによる形質転換に付した。
合計２０，０００〜３０，０００個の細胞をＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびｃ−ＭＹＣセンダイウイルス（ＣｙｔｏＴｕｎｅ−ｉＰＳ再プログラミングキット、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で形質転換させた。各因子の感染多重度は１０（各因子につき約５ｍｌ）とした。２４時間後に新鮮細胞増殖培地に交換することで、形質転換を終了させた。３日目に、６穴組織培養プレート中の４または５ウェルの放射ＣＦ１−マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦｓ、ウェル当たりの植え付け密度は２００，０００）に細胞を移動し、比率１：１の増殖培地およびヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）培地（ダルベッコ変法イーグル培地［ＤＭＥＭ］／Ｆ１２に２０％のノックアウト血清代替品、１００ｍＭの非必須アミノ酸含有最小必須培地、１００ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、１×Ｌ−グルタミンおよび１０ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子を添加）で培養した。
２日後に、培地交換によって培地をｈＥＳＣ培地に交換し、その後毎日交換した。１４日目からは、比率１：１のＭＥＦ調整ｈＥＳＣ培地およびｍＴｅＳＲ１で再プログラミングを継続した。６穴の培養に用いた培地の容量はウェル当たり２ｍｌとした。形態学的にヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣｓ）に類似したヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）コロニーが一度出現したら、コロニーを機械的に選択し、増殖のためにＭＥＦに再度プレーティングした。
ヒト胚性幹細胞系であるｈＥＳ−３および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）系であるＩＭＲ９０−ｉＰＳＣを得た。すべてのヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）系をｍＴｅＳＲＴＭ１培地（米国、ＳＴＥＭＣＥＬＬＴＭ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて培養した。本願に記載するように、選択した細胞系に対してＧ分染法核型解析を行った。
マイクロキャリア多能性培養細胞
簡単に説明すると、Ａｃｃｕｔａｓｅ（米国、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による酵素処理後の単層培養由来のヒト多能性幹細胞の１００万個の単細胞を、５ｍｌのｍＴｅＳＲ１培地、１０μＭのＲＯＣＫ阻害因子 Ｙ２７６３２（ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および細胞外マトリックス被覆ポリスチレンマイクロキャリアであるｉＰＳ−Ｓｐｈｅｒｅｓ（シンガポール国、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を含む、６穴の超低接着表面（ＵＬＡ）プレート（米国、Ｃｏｒｎｉｎｇ）の各ウェルに植え付け、製造社の指示書に従って培養した。ヒト多能性幹細胞−マイクロキャリア（ＨＰＳＣ−ＭＣ）凝集体は、実験で使用する前に、１１０ｒｐｍの振盪プラットホームによる連続振盪下、または毎日の培地交換を行いながらの静置条件下で、７日間培養した。
プロトコルを用いた、ｈＰＳＣ−ＭＣ凝集体の造血中胚葉誘導
ＢＭＰ４をベースとするプロトコルを用いたｈＰＳＣ−ＭＣ凝集体の中胚葉誘導は既に報告されている。１００万個のＨＰＳＣ−ＭＣ凝集体を、５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４および５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５を含むＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ造血幹細胞増殖培地（米国、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中、静置条件下で培養した。４８時間後に培地の半分を除去し、５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５および２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（全てのサイトカインはＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を含むＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ培地で交換した。ＨＰＳＣ−ＭＣ凝集体は、造血前駆体分化に使用する前に、さらに４８時間培養した。
実験計画を用いた、造血中胚葉誘導および造血前駆体の作製における多因子評価
初期のＢＭＰ４、アクチビンＡおよびＣＨＩＲ−９９０２１の用量および暴露期間について、下記応答因子に対する効果を評価するために、分解能ＩＶの一部実施法による実験計画（ＤｏＥ）をＭＯＤＤＥソフトウエア（ドイツ国、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて実施した。応答因子：中胚葉誘導の４日後のＫＤＲ＋細胞の誘導、または分化から２週間後に生成された総造血前駆細胞数。
ＣＨＩＲ仲介最適化プロトコルを用いた造血中胚葉誘導
ＭＯＤＤＥ（登録商標）ソフトウエアによって作製された、実験計画（ＤｏＥ）の結果の解析および選択した条件の評価は、初めに連続振盪下で増殖させたヒト多能性幹細胞−マイクロキャリア（ｈＰＳＣ−ＭＣ）凝集体の造血中胚葉誘導のための最適なプロトコルの開発を可能にした。３ｍｌのＳｔｅｍｌｉｎｅ（登録商標）ＩＩ培地中の約２００万から４００万個のｈＰＳＣ−ＭＣ凝集体を次のように分化させた。１日目：３０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５、１２μＭのＣＨＩＲ−９９０２１（米国、Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、５０ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ、２日目：３０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５、５０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、３日目：３０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５および２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ。分化後４日目には、ＴｒｙｐＬＥＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）処理によって誘導し、４０μｍのセルストレイナー（ドイツ国、Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−ｏｎｅ）によって濾した単細胞を、本願に記載のように、造血前駆体および赤芽球の増殖ならびに赤芽球の最終成熟に使用した。造血細胞および赤芽球の分化は、フローサイトメトリー、定量的リアルタイムＰＣＲ、免疫ブロッティングおよび顕微鏡画像によってモニタリングした。分化赤芽球の酸素結合親和性は、Ｈｅｍｏｘアナライザー（米国、ＴＣＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ）で測定した。
ＢＭＰ４プロトコルを用いた、ｈＰＳＣ−ＭＣ凝集体の造血中胚葉誘導
１００万個のＨＰＳＣ−ＭＣ凝集体を、５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４および５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５含有ＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ造血幹細胞増殖培地（米国、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で培養した。４８時間後に、培地の半分を除去し、５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５および２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（全てのサイトカインがＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）含有ＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ培地に交換した。ＨＰＳＣ−ＭＣ凝集体は、造血前駆体増殖に使用する前にさらに４８時間培養した。
メチルセルロース培地における造血前駆体増殖
ＨＰＳＣ−ＭＣ凝集体は、ＴｒｙｐＬＥによる処理によって単細胞に解離させた。３７℃で５分のＥｘｐｒｅｓｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による処理の後、４０μｍのセルストレイナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ-one）を通し、細胞のペレット化のために１３００ｒｐｍで３分遠心分離し、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で一度すすいでから、ＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ培地に再懸濁した。１００μｌのＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ培地中の２０万個の細胞を、６穴の超低接着表面プレートに移し、本願に記載のように、ブラスト成長培地（ＢＧＭ）中、静置条件下で２週間培養した。
赤芽球の分化および増殖
造血前駆体を、５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および３Ｕ／ｍｌのＥＰＯ（米国、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含有する等量のＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ培地とさらに７日間混合した。次に細胞をＰＢＳで１０倍に希釈し、３０００ｒｐｍで１０分の遠心分離によってペレット化した。赤芽球細胞を、６穴の超低接着表面プレートに静置条件下で、３ｍｌのＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ培地に２．５×１０５細胞／ｍｌの濃度で植え付けた。培地は、１×血清代替物３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．３％ｖ／ｖのＥｘ−ＣＹＴＥ成長増強培地添加剤（米国、Ｍｅｒｃｋ）、１００ｎｇ／ｍのＳＣＦ、３Ｕ／ｍｌのＥＰＯ、１μＭのヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２００μｇ／ｍｌのホロトランスフェリン（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）および１×ペニシリン−ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有した。細胞は４日ごとに新鮮培地に再懸濁され、細胞濃度が２×１０６細胞／ｍｌを超えると、２．５×１０５細胞／ｍｌの濃度で再度植え付けられた。積算増殖倍率は、実験期間にわたる継代の間に達成された増殖倍率を乗算することで計算した。
造血中胚葉誘導および造血前駆体の作製に対する、実験計画（ＭＯＤＤＥソフトウエア）を用いた多因子評価
初期ＢＭＰ４、アクチビンＡおよびＣＨＩＲ−９９０２１の用量および暴露期間の下記応答因子に対する効果を評価するために、分解能ＩＶの一部実施法による実験計画（ＤｏＥ）を、ＭＯＤＤＥソフトウエア（ドイツ国、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて実施した。応答因子：中胚葉誘導の４日後のＫＤＲ＋細胞の誘導、または分化から２週間後に作製された総造血前駆細胞数。ＭＯＤＤＥソフトウエアは、試験因子の種々の組み合わせのいろいろな実験条件を作製し、単一因子または２因子の相互作用が応答因子に対して統計的に意味のある効果（陽性または陰性）を発揮するか否かを同定することを可能にする。Ｒ２スコア＞０．５の計算モデルは、有意な適合を示すモデルであり、Ｑ２スコア＞０．１は有意なモデルであることを示すが、Ｑ２＞０．５は、未来予測精度の概算に良いモデルであることを示し、モデル有効性スコアが＜０．２５であることは、モデルの問題及び再現性（全体のばらつきと比べた複製間のばらつき）が統計的に有意であることを示し、０．５超であるべきである。
５×１０５細胞に相当する、（７日間の連続振盪条件から誘導した）ヒト多能性幹細胞−マイクロキャリア（ＨＰＳＣ−ＭＣ）凝集体を、２４穴の超低接着表面中のＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ培地に植え付けて、図２Ａおよび図６Ａ、さらには表３に詳細を示した多因子条件を用いて分化させた。次の因子／用量および期間を試験した：ＢＭＰ４で４日間（１０〜５０ｎｇ／ｍｌ）、アクチビンＡで最初の４８時間（０〜８０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲ−９９０２１で最初の２４時間（０〜１５μＭ）およびＣＨＩＲ−９９０２１で２４時間から４８時間（０〜１５μＭ）。４日間の分化の間、ＶＥＧＦ１６５の濃度は５０ｎｇ／ｍｌで維持し、２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを２日目に添加し、分化の４日目まで維持した。ＭＯＤＤＥ（登録商標）ソフトウエアによって作成された、実験計画（ＤｏＥ）の結果の解析および選択した条件の評価は、初めに連続振盪下で増殖させたｈＰＳＣ−ＭＣ凝集体の造血中胚葉誘導のための最適プロトコルの開発を可能にした。３ｍｌのＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ培地中の約２００万から４００万のｈＰＳＣ−ＭＣ凝集体を次のように分化させた。１日目：３０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５、１２μＭのＣＨＩＲ−９９０２１（米国、Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、５０ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ、２日目：３０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５、５０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、３日目：３０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５および２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ。
分化後４日目には、マイクロキャリアから細胞を分離するための、マイクロキャリア凝集体のＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ処理、および４０μｍのセルストレイナー（ドイツ国、Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ-one）によるろ過によって、単一細胞を得た。分化した細胞を、４％のパラホルムアルデヒドで室温、３０分間固定し、遠心分離し、ＰＢＳで１度すすぎ、ＫＤＲのフローサイトメトリー解析まで、１％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）含有ＰＢＳ中、４℃で保存した。造血前駆体の作製には、各実験条件の単一細胞１×１０５個を、上述したように１２穴の超低接着表面プレートの各ウェル内のブラスト成長培地（ＢＧＭ）に植え付けた。造血培養物は、Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ ＮＣ−３０００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）を用いて増殖細胞の総数を計数するまで、２週間増殖させた。その後、ＣＤ３１およびＣＤ４３のフローサイトメトリー解析のために細胞を固定化した。増殖倍率は、初期播種量である１×１０５細胞に対する、２週間後に得られた総細胞数として計算した。
赤芽球の最終成熟
最終成熟および除核は、赤芽球を初期ヒト間葉幹細胞（ＭＳＣｓ）と３週間共培養することで誘導した。１０％のＦＣＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加したアルファ最小必須培地（α−ＭＥＭ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で初めに培養した間葉幹細胞を、６穴プレートにウェル当たり１×１０５細胞で植え付けた。イスコーブ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と、８％のヒト血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１×脂質ミックス（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、６Ｕ／ｍｌのＥＰＯ、５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、１０００μｇ／ｍｌのホロトランスフェリンおよび１×ペニシリン−ストレプトマイシンとを含む除核培地で、１×１０６細胞／ｍｌに再懸濁した赤芽球を、あらかじめ植え付けておいた間葉幹細胞と共培養した。細胞は、２〜３週間の期間にわたり、毎週、新鮮培地への交換と同時に、植え付けたばかりの間葉幹細胞（ＭＳＣｓ、ウェル当たり１×１０５細胞）に移した。
ＲＮＡ抽出および定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
細胞サンプルをトリゾール試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で溶解し、ＲＮＡ抽出まで−８０℃で保存した。ＤＮＡｓｅ処理によるＲＮＡ抽出は、Ｄｉｒｅｃｔ−ｚｏｌ ＲＮＡ抽出キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を製造社の説明書に従って使用して実施した。ＲＮＡサンプルは、ＮａｎｏＤｒｏｐ ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＯＤ２６０ｎｍを測定することで定量した。
５００ｎｇの総ＲＮＡをｉＳｃｒｉｐｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ ｃＤＮＡ合成キット（米国、ＢｉｏＲａｄ）を用いた第１鎖ｃＤＮＡ合成に使用した。ＲＮＡｓｅフリーの水で１：１０に希釈したｃＤＮＡサンプルを、表４に詳細に記載した遺伝子特異的プライマーを用いる定量的リアルタイムＰＣＲに使用した。
リアルタイムＰＣＲＴに用いた遺伝子特異的プライマー
Figure 2021510527
早期造血マーカーの相対量は、上記表４に列挙した遺伝子特異的プライマー、ｉＴＡＱ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢｉｏＲａｄ）およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ ＦＡＳＴ リアルタイムＰＣＲシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて解析した。ＧＡＰＤＨをサンプル量の正規化のためのハウスキーピング遺伝子として使用した。遺伝子発現の相対変化は、デルタ−デルタｃ（ｔ）法で求めた。
免疫ブロット
解析用のタンパク質サンプルは、凍結細胞ペレットの２×Ｌａｅｍｍｌｉバッファー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）による溶解後に抽出し、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて定量した。５０μｇの細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードし、二フッ化ポリビニリデンメンブラン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移した。５％のスキムミルクにより室温で２時間、メンブランをブロックし、一次抗体［１：８００希釈のベータグロブリン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＳＣ−２１７５７）、１：４００希釈のガンマグロブリン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＳＣ−２１７５６）、１：２０００希釈のアルファグロブリン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＳＣ−３１１１０）、１：４００希釈のエプシロングロブリン（Ａｂｃａｍ、ａｂ１５６０４１）および１：２０００希釈のアクチン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＳＣ−１６１５）］と室温で１．５時間インキュベートした。次にブロットを、希釈率１：１００００の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、またはＨＲＰ標識抗ヤギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とインキュベートした。免疫複合体は、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて検出し、ＣＬＸｐｏｓｕｒｅフィルム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に補足した。バンド強度はＩｍａｇｅＪ ソフトウエア（ｈｔｔｐｓ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）を用いて測定し、ロード対照（アクチン）に対して正規化し、総ヘモグロビンバンドに対するパーセンテージとして報告した。
キャピラリーウエスタンブロット
キャピラリーウエスタンブロットは、完全自動化システムであるＰｅｇｇｙ Ｓｕｅ（米国、Ｐｒｏｔｅｉｎｓｉｍｐｌｅ，Ｒ＆Ｄ）を用いて実施した。タンパク質の分離、検出および定量は、サイズ排除（１２〜２３０ｋＤａ）に基づき、製造社のプロトコル（ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎｓｉｍｐｌｅ．ｃｏｍ）に従って実施した。細胞溶解物は、１×フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１×ホスファターゼ阻害剤および１×プロテアーゼ阻害剤（ＢｉｏＳｐｅｓ）を含む１×細胞溶解バッファー（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて調製した。１ｍｇ／ｍｌの総タンパク質サンプル（ＤＴＴおよびＳＤＳで９５℃で変性）をキャピラリー電気泳動で分離し、ブロッキングバッファーでブロックし、１次ウサギモノクローナル抗体［１：１００希釈のブラキウリ（Ｄ２Ｚ３Ｊ）、ＴＣＦ１／ＴＣＦ７（Ｃ６３Ｄ９）、ＴＣＦ３／ＴＣＦＦ７Ｌ１（Ｄ１５Ｇ１１）、Ｌｅｆ１（Ｃ１２Ａ５）、ＳＭＡＤ１（Ｄ５９Ｄ７）、１：５０希釈のｐＳＭＡＤ１／５ Ｓｅｒ ４６３／４６５（４１Ｄ１０）、１：５０００希釈のＧＡＰＤＨ（Ｄ１６Ｈ１１）］（全てＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）［１：５０希釈のＳＭＡＤ７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）］、次に西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体でプローブ化し、ルミノール／ペルオキシダーゼ基質で検出した。化学発光シグナルの同定および定量は、Ｃｏｍｐａｓｓ ソフトウエア（Ｐｒｏｔｅｉｎｓｉｍｐｌｅ）で行い、これは化学発光シグナルをウエスタンブロット像に変換する。
フローサイトメトリー
フローサイトメトリー用のサンプルは、４％パラホルムアルデヒド（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で３０分間固定し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ中、４℃で保存した。多能性の測定には、サンプルを次の希釈率の１次抗体と室温（２５℃）で２０分インキュベートした：１：１００のＯｃｔ４（米国、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１：５０のＴｒａ１−６０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、１：１００のＳＳＥＡ４（米国、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）。ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）による洗浄に続き、１：５００希釈のウサギ抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ複合体（ＤＡＫＯ）を用いて１次抗体を検出した。ＦＡＣＳバッファーによる洗浄および４０μｍの篩によるろ過に続き、サンプルをＮｏｖｏＣｙｔｅフローサイトメーター（米国、ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）に流し、ＦｌｏｗＪｏソフトウエアを用いて解析した。
中胚葉および造血細胞の表面マーカーのフローサイトメトリーによる解析のために、細胞を１：５０希釈の直接標識抗体と室温で１５分間インキュベートした。以下のヒト抗体を使用した：Ｔ−ブラキウリ−ＦＩＴＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＫＤＲ−ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、ＣＤ３１−ＰＥ、ＣＤ４３−ＦＩＴＣ、ＣＤ４５−ＰＥ、ＣＤ７１−ＡＰＣ、ＣＤ２３５ａ−ＦＩＴＣ（すべて米国、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）。以下の抗体をアイソタイプ対照として使用した：マウスＩｇＧ１−ＦＩＴＣおよびＰＥ（ドイツ国、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、マウスＩｇＧ２ｂｋ−ＦＩＴＣおよびマウスＩｇＧ２ａｋ−ＡＰＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。ヘモグロビンの解析には、細胞を１％のＢＳＡおよび０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳで透過処理し、１：５０希釈の胎児ヘモグロビン−ＦＩＴＣ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）または成人ヘモグロビン−ＰＥ抗体（米国、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とインキュベートした。
除核細胞の検出は、１：１００に希釈したＣＤ２３５ａ−ＦＩＴＣおよび１：５０００に希釈した細胞透過性核染料であるＤＲＡＱ−５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した生細胞のフローサイトメトリー解析により行った。
免疫組織化学および顕微鏡イメージング
１００μｌのＰＢＳ中の細胞サンプルを、Ｃｙｔｏｓｐｉｎ ４ ｃｙｔｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、５００ｒｐｍ、３分でスライド上に広げた。細胞を１００％のメタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で５分間固定し、蒸留水ですすぎ、室温で保存した。スライドをギムザ染色で２０分染色し、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）ですすぎ、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ ＨａｒｄＳｅｔ Ａｎｔｉｆａｄｅ封入基剤（ＶＥＣＴＯＲ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびカバーガラスで封入する前に風乾させた。スライドはＡｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ倒立顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を用いて画像化した。
最終成熟赤芽球の免疫蛍光イメージングはＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ−Ｅ蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）を用いて行った。
そのほかの細胞像はＥＶＯＳＲ細胞イメージングシステム（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて撮影した。ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）−マイクロキャリア凝集体の平均径の計算はＩｍａｇｅＪソフトウエアを用いて行い、各細胞系につき、少なくとも４０個のヒト多能性幹細胞−マイクロキャリア凝集を解析した。
酸素平衡曲線
ｈＰＳＣ分化赤芽球の酸素結合および解離平衡曲線を作製するために、ＨｅｍｏｘアナライザーモデルＢ装置（ＴＣＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ）を用いた。ＨＥＭＯＸ溶液（ＴＣＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ）中の約１×１０７個の赤芽球細胞を酸素飽和条件下、圧縮空気を用いて流し（ｒｕｎ）、次に窒素ガスを用いて脱酸素条件に付した。Ｈｅｍｏｘ解析ソフトウエアを用いて、ｐ５０値（５０％のオキシヘモグロビン飽和レベルをもたらす酸素圧）を計算した。成人末梢血（ドナー由来）を対照として流した。全てのサンプルを２回測定した。
核型の解析
本実験に使用したヒト多能性幹細胞系をＧ分染法核型解析（シンガポール国、ＫＫＨ女性および小児病院、病理学および臨床検査医学部）に回し、そこで典型的には２０個の分裂中期について、全体的な染色体異常および異数性を評価した。
統計解析
統計解析はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）で実施した。スチューデントの独立２群検定を等分散の２群を比較するために使用し、分散が等しくないと考えられるときには、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用した。Ｐ値が０．０５未満（ｐ＜０．０５）のときを有意とした。
ＯＰ９マウス間質細胞系のマイクロキャリア培養のためのプロトコル
培養ＯＰ９（ＡＴＣＣ：ＣＲ−２７４９）を、２０％のＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）および１×ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したアルファ−ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用い、市販の組織培養フラスコ中で単層培養した。単一細胞をＴｒｙｐＬＥＴＭ、３７℃で５分の酵素処理により誘導した。２０万個の細胞を、５ｍｌのアルファＭＥＭ−２０％ＦＣＳ培地および２０ｍｇのＳｏｌｏｈｉｌｌ（登録商標）Ｐｌａｓｔｉｃ Ｐｌｕｓマイクロキャリア（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含む、６穴の超低接着表面プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の各ウェルに植え付けた。細胞をマイクロキャリアに付着させるために、ロッキングプラットホームを用いて、プレートを３７℃、７５ｒｐｍで振盪させた。ＯＰ９−ＭＣｓ培養物は、赤芽球との共培養に使用する前に、２日間連続振盪下で培養した。
ＯＰ９−ＭＣ共培養によるｈｉＰＳＣ／ＣＢ赤芽球の最終成熟のためのプロトコル
ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）赤芽球の誘導および培養は、ＰＣＴ出願明細書の段落［０２０３］に記載されている。
ヒト人工多能性幹細胞赤芽球を、連続振盪下、スピナー培養フラスコで培養した。臍帯血（ＣＢ）赤芽球の分化は、スピナー培養フラスコ中、連続振盪下で実施すること以外は、既に報告されているプロトコルに従って実施した。
まとめると、細胞を１％の脱イオン化ＢＳＡ、１２０ｍｇ／ｍｌの鉄飽和ヒトトランスフェリン、９００ｎｇ／ｍｌの硫酸鉄、９０ｎｇ／ｍｌの硝酸鉄および１０ｍｇ／ｍｌのインスリン（Ｓｉｇｍａ）を添加した変法無血清培地で培養した。増殖手法は３つの工程からなる。第１の工程（０〜８日間）では、１０４細胞／ｍｌのＣＤ３４＋細胞を１０−６Ｍのヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ）、１００ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子（ＳＣＦ）、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および３ＩＵ／ｍｌのエリスロポエチン（Ｅｐｒｅｘ）の存在下で培養した。４日目に、１容量の培養細胞を、ヒドロコルチゾン、ＳＣＦ、ＩＬ−３およびエリスロポエチンを含む、４容量の新鮮培地に希釈した。第２工程（３日間）では、細胞を５×１０４、１×１０５、２×１０５または３×１０５／ｍｌの濃度（それぞれ臍帯血細胞、白血球除去（ＬＫ）細胞、骨髄細胞および末梢血細胞）で再懸濁し、エリスロポエチン添加新鮮培地中の付着間質層上で共培養した。第３工程（最大１０日）では、サイトカインを含まない新鮮培地中の付着間質層上で共培養した。
培養物は３７℃、５％のＣＯ２の空気流下で維持した。付着細胞層は、１０％ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の正常成人全骨髄から確立した、ＭＳ−５間質細胞系または間葉間質細胞（ＭＳＣｓ）からなるものであった。付着ＭＳＣは、少なくとも２回の連続した継代によって増殖および純化させた。
赤芽球を６穴の超低接着表面プレートに移し、成熟培地に２×１０６細胞／ｍｌの濃度（５ｍｌ容量）で植え付け、６穴プレートの１つのウェルから得られたＯＰ９−ＭＣ凝集体（２×１０５細胞／ウェルで初めに植え付け、２日間培養したもの）と共培養した。プレートをロッキングプラットホームで、３７℃、７５ｒｐｍで浸透させた。最終成熟は、培養３日毎に完全な培地交換を行いながら、３週間実施した。除核を評価するためのフローサイトメトリー解析およびギムザ染色のために、（４０μＭの篩によるろ過により得られた）単一細胞を毎週回収した。
最終成熟培地の処方：１０％のヒト血漿（ｉＤＮＡ）、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、１０μｇ／ｍｌのヒト組み換えインスリン（Ｇｉｂｃｏ）、５００μｇ／ｍｌのホロトランスフェリン、４Ｕ／ｍｌのヒト組み換えＥＰＯ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、５％ｖ／ｖのヘパリン、１μＭのミフェプリストンを添加したＩＭＤＭ。
除核赤血球（ＲＢＣｓ）富化のためのプロトコル
生／死亡細胞および有核細胞の混合物を不織布（ＮＷＦ）フィルタ（シンガポール国、Ａｎｔｏｓｈｉｎ）に通すことで、除核赤血球（ＲＢＣｓ）を分離した。簡単に説明すると、不織布（ＮＷＦ）フィルタを１０ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）ですすいだ。１０ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水中の濃度１０７細胞／ｍｌの細胞を、３０ｍｌのシリンジを低速で用いてゆっくりと不織布フィルタに通し、ろ過液を回収した。続いて不織布フィルタを１０ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水ですすぎ、ろ過液と同じチューブに回収した。ろ過された細胞を、１５００ｒｐｍ、室温で５分の遠心で落とした。回収した赤血球を、アデニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むクエン酸リン酸デキストロース溶液に再懸濁し、さらなる分析のために４℃で保存した。
除核赤血球（ＲＢＣｓ）の評価のためのプロトコル
フローサイトメトリー
細胞懸濁液を４０μＭでろ過することで得た未固定の単一細胞をリン酸緩衝化生理食塩水に再懸濁し、フローサイトメトリーに使用した。簡単に説明すると、（９６穴のｖ底プレートの）ウェル当たり約１００，０００細胞を１５００ｒｐｍ、３分で落とした。細胞ペレットを、１：１００希釈のアネキシンＶ−ＦＩＴＣ標識抗体（Ｅ−ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（アポトーシス評価用）、または１：１００希釈のＣＤ２３５ａ−ＦＩＴＣ標識抗体（Ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含む１００μｌの１×アネキシンＶ結合バッファー（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に再懸濁し、暗環境下、２５℃で２０分間静置した。細胞を１５００ｒｐｍ、３分で落とし、その後、２００μｌの１×アネキシンＶ結合バッファーで洗浄した。細胞を最終的に、１：５０００に希釈したＤＲＡＱ５（Ｅ−ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含有する２００μｌの１×結合バッファーに再懸濁した。細胞はＮｏｖｏｃｙｔｅフローサイトメーターで評価し、４８８ｎｍおよび６４７ｎｍで検出した。
ギムザ染色
サイトスピン遠心分離機を用いて、３５０ｇ、５分で約５０，０００〜１００，０００細胞を顕微鏡スライド上に落とした。細胞を１００％のメタノールで５分間固定し、風乾した。固定した細胞を、ｐＨ７．２のリン酸緩衝化生理食塩水バッファー（Ｓｉｇｍａ）で１：１０に希釈したギムザ染色液（Ｓｉｇｍａ）で、２５℃、１５分間染色した。染色された細胞をｐＨ７．２のリン酸緩衝化生理食塩水バッファーですすぎ、その後、明視野顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ）で可視化／イメージ化した。
Ｏ陰性ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣｓ）から赤血球細胞を作製するための、拡張可能な震盪懸濁培養分化プラットホームの開発用プロトコル
ヒト人工多能性幹細胞−マイクロキャリア（ｈｉＰＳＣ−ＭＣ）凝集体の造血中胚葉誘導
ヒト人工多能性幹細胞−マイクロキャリア（ｈｉＰＳＣ−ＭＣ）凝集体（１×１０６細胞／ｍｌまたは１ｅ６細胞／ｍｌ）を、ＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ造血幹細胞増殖培地（ＳＬ２）を加えた中胚葉誘導培地（サイトカインはすべてＳｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）に移した。移した先は、７５ｒｐｍで連続振盪下の６穴超低接着表面プレート（５ｍｌ）または３６ｒｐｍで連続振盪下の１２５ｍｌのスピナーフラスコ（５０ｍｌ）のいずれかであった。毎日の培地交換は次の内容とした。０日目：ＳＬ２＋３０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４＋５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ−１６５＋４０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ＋１２〜１５μＭのＣＨＩＲ−９９０２１、１日目：ＳＬ２＋３０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４＋５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ−１６５＋４０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、２日目：ＳＬ２＋２０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４＋３０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５＋５ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ＋１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ＋２０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ＋０．４ｎｇ／ｍｌのβ−エストラジオール。サンプルを１日目および３日目に回収し、それぞれＴ−ブラキウリ（Ｔ−Ｂｒａ）およびＫＤＲ／ＰＤＧＦＲα細胞のそれぞれのフローサイトメトリー解析に付した。
ヒト人工多能性幹細胞−マイクロキャリア（ｈｉＰＳＣ−ＭＣ）凝集体由来細胞の造血細胞誘導
分化から３日目に、ｈｉＰＳＣ−ＭＣ凝集体に対してＴｒｙｐＬＥＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による処理を３７℃で５分行って単一細胞を得、４０μＭのセルストレイナー（ドイツ国、Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−ｏｎｅ）で濾した。６穴の超低接着表面プレート（５ｍｌ）、５０ｍｌの振盪フラスコ（１０ｍｌ）または１２５ｍｌのスピナーフラスコ（５０ｍｌ）のいずれかの造血細胞誘導培地に、１．２５×１０５から２．５×１０５細胞／ｍｌの濃度で細胞を植え付けた。（断りがない限り）完全な培地交換を次の内容で行った。３日目：ＳＬ２＋２０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４＋３０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ−１６５＋１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ＋３０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ＋１０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ２＋１０ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ＋５Ｕ／ｍｌのヘパリン＋５０μＭのＩＢＭＸ＋０．４ｎｇ／ｍｌのβ−エストラジオール、５日目：ＳＬ２＋１２０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４＋１８０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ−１６５＋６０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ＋１８０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ＋６０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ２＋６０ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ＋３０Ｕのヘパリン＋３００μＭのＩＢＭＸ＋２．４ｎｇ／ｍｌのβ−エストラジオールを１：６までつぎ足し、７日目：ＳＬ２＋２０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４＋３０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ＋１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ＋３０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ＋１０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ２＋１０ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ＋５Ｕ／ｍｌのヘパリン＋５０μＭのＩＢＭＸ＋０．４ｎｇ／ｍｌのβ−エストラジオール＋１μＭのＳｔｅｍ Ｒｅｇｅｎｉｎ１（ＳＲ１）（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈ）、９日目：ＳＬ２＋２０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４＋３０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５＋１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ＋３０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ＋１０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ２＋１０ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ＋５Ｕ／ｍｌのヘパリン＋５０μＭのＩＢＭＸ＋０．４ｎｇ／ｍｌのβ−エストラジオールを１：２までつぎ足し。
ｈｉＰＳＣ−ＭＣ凝集由来細胞の赤血球誘導
６穴の超低接着表面プレート（５ｍｌ）、５０ｍｌの振盪フラスコ（１０ｍｌ）または１２５ｍｌのスピナーフラスコ（５０〜１００ｍｌ）のいずれかに、１．２５×１０５〜２．５×１０５細胞／ｍｌの細胞を赤血球誘導培地に植え付けた。（断りがない限り）完全な培地交換を次の内容で行った。１１日目：ＳＬ２＋６．７ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４＋３０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ＋５０μＭのＩＢＭＸ＋１μＭのヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）＋１６．７ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ３Ｌ＋６．７ｎｇ／ｍｌのＩＬ３＋４Ｕ／ｍｌのＥＰＯ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、１３日目：ＳＬ２＋４０．２ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４＋１８０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ＋３００μＭのＩＢＭＸ＋６μＭのヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）＋１００．２ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ３Ｌ＋４０．２ｎｇ／ｍｌのＩＬ３＋２４Ｕ／ｍｌのＥＰＯ＋３μＭのプルリポチンを１：６までつぎ足し、１５日目から先：ＳＬ２＋１×血清代替物３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）＋０．３％のｖ／ｖのＥｘＣｙｔｅ試薬（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）＋１μＭのヒドロコルチゾン＋１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ＋４Ｕ／ｍｌのＥＰＯ＋１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ３＋０．２ｍｇ／ｍｌのホロトランスフェリン（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）＋１×ペニシリンおよびストレプトマイシン。１５日目から先は、完全な培地交換を３日に一度行った。高い細胞密度の培養には、細胞密度が５×１０６細胞／ｍｌ（５ｅ６細胞／ｍｌ）を超えたら、完全な培地交換を毎日実施した。高い積算増殖倍率のためには、細胞密度が５×１０６細胞／ｍｌ（５ｅ６細胞／ｍｌ）を超えたら、常に細胞を１×１０６細胞／ｍｌ（１ｅ６細胞／ｍｌ）に戻すように植え付けた。積算増殖倍率は、実施した実験の期間にわたり、継代間で達成された増殖倍率を乗算することで計算した。
配列番号１： ＣＤ３１フォーワードプライマー
配列番号２： ＣＤ３１リバースプライマー
配列番号３： ＧＡＴＡ２フォーワードプライマー
配列番号４： ＧＡＴＡ２リバースプライマー
配列番号５： ＧＡＴＡ１フォーワードプライマー
配列番号６： ＧＡＴＡ１リバースプライマー
配列番号７： ＬＭＯ２フォーワードプライマー
配列番号８： ＬＭＯ２リバースプライマー
配列番号９： ＳＣＬ／Ｔａｌ−１フォーワードプライマー
配列番号１０： ＳＣＬ／Ｔａｌ−１リバースプライマー
配列番号１１： ＲｕｎＸ１フォーワードプライマー
配列番号１２： ＲｕｎＸ１リバースプライマー
配列番号１３： ヘモグロビンサブタイプアルファのフォーワードプライマー
配列番号１４： ヘモグロビンサブタイプアルファのリバースプライマー
配列番号１５： ヘモグロビンサブタイプガンマのフォーワードプライマー
配列番号１６： ヘモグロビンサブタイプガンマのリバースプライマー
配列番号１７： ヘモグロビンサブタイプエプシロンのフォーワードプライマー
配列番号１８： ヘモグロビンサブタイプエプシロンのリバースプライマー
配列番号１９： ヘモグロビンサブタイプベータのフォーワードプライマー
配列番号２０： ヘモグロビンサブタイプベータのリバースプライマー
配列番号２１： ＧＡＰＤＨフォーワードプライマー
配列番号２２： ＧＡＰＤＨリバースプライマー

Claims (41)

  1. 多能性幹細胞を造血前駆細胞に分化させるための方法であって、前記方法が懸濁撹拌下で実施され、中胚葉誘導のステージにおいて、ＧＳＫ−３阻害因子またはＷｎｔ経路活性化因子を添加する、方法。
  2. 前記多能性幹細胞を造血前駆細胞に分化させるための方法は、以下のステージを含む、請求項１に記載の方法。
    ａ．中胚葉誘導ステージ、
    ｂ．造血細胞誘導ステージ、
    ｃ．赤芽球誘導ステージ、および
    ｄ．赤芽球成熟ステージ。
  3. 多能性幹細胞増殖ステージにおいて、前記多能性幹細胞を１．５×１０５〜４×１０６細胞／ｍｌの濃度に増殖させる、請求項２に記載の方法。
  4. 前記中胚葉誘導ステージが、多能性幹細胞増殖ステージで得られた前記多能性幹細胞からの中胚葉形成の誘導をもたらし、その結果、ＫＤＲ＋ＰＤＧＦＲα−造血前駆細胞が得られる、請求項２または３に記載の方法。
  5. 前記造血細胞誘導ステージが、前記中胚葉誘導ステージで得られた造血前駆細胞の増殖をもたらし、その結果、ＣＤ３４／ＣＤ４３／ＣＤ４５造血前駆細胞が得られる、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 赤芽球増殖ステージが、前記造血細胞誘導ステージで得られた造血前駆細胞の増殖をもたらし、その結果、ＣＤ２３５ａ＋ＣＤ７１＋赤芽球細胞が得られる、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記赤芽球成熟ステージが、赤芽球増殖ステージで得られた成熟ＣＤ２３５ａ＋赤芽球細胞の最終成熟および除核をもたらし、その結果、除核ＣＤ２３５ａ＋赤芽球細胞が得られる、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記方法は、前記中胚葉誘導ステージにおいて細胞培養培地を使用することを含み、前記細胞培養培地は、下記成分を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
    骨形態形成タンパク質、
    ＧＳＫ−３阻害因子またはＷｎｔ経路活性化因子、
    アクチビンＡ、および
    血管内皮増殖因子。
  9. 前記ＧＳＫ−３阻害因子が、下記化合物からなる群より選ばれる１種またはそれらの組み合わせである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
    バルプロ酸ナトリウム、スタウロスポリン、ＫＴ ５７２０（ＣＡＳ １０８０６８−９８−０）、ＧＳＫ−３阻害因子ＩＸ（ＣＡＳ ６６７４６３−６２−９）、Ｒｏ ３１−８２２０（ＣＡＳ １３８４８９−１８−６）、ＳＢ−２１６７６３（ＣＡＳ ２８０７４４−０９−４）、ＣＩＤ ７５５６７３（ＣＡＳ ５２１９３７−０７−５）、カンパウロン（ＣＡＳ １４２２７３−２０−９）、塩化リチウム、ＧＳＫ−３ベータ阻害因子ＸＩＩ（ＴＷＳ１１９、ＣＡＳ ６０１５１４−１９−６）、ＧＳＫ−３阻害因子ＸＶＩ（ＣＡＳ２５２９１７−０６−９）、１０Ｚ−ヒメニアルディシン（ＣＡＳ ８２００５−１２−７）、インディルビン（ＣＡＳ ４７９−４１−４）、ＣＨＩＲ−９８０１４（ＣＡＳ ２５２９３５−９４−７）、ＧＳＫ−３ベータ阻害因子ＶＩ（ＣＡＳ ６２６７３−６９−２）、マンザミンＡ（ＣＡＳ １０４１９６−６８−１）、インディルビン−３’モノキシム（ＣＡＳ １６０８０７−４９−８）、ＧＳＫ−３阻害因子Ｘ（ＣＡＳ ７４０８４１−１５−０）、ＧＳＫ−３阻害因子ＸＶ、ＳＢ−４１５２８６（ＣＡＳ ２６４２１８−２３−７）、１−アザ−カンパウロン（ＣＡＳ ６７６５９６−６５−９）、ＴＷＳ１１９ジトリフルオロ酢酸（ＣＡＳ ６０１５１４−１９−６）、５−イオド−インディルビン−３’−モノキシム、ＧＳＫ−３ベータ阻害因子Ｉ（ＣＡＳ ３２７０３６−８９−５）、９−シアノプロン、インディルビン−５−スルホン酸ナトリウム、ＧＳＫ−３ベータ阻害因子ＶＩＩ（ＣＡＳ ９９−７３−０）、Ｃｄｋ１／５阻害因子（ＣＡＳ ４０２５４−９０−８）、ヒメニジン（ＣＡＳ １０７０１９−９５−４）、塩酸ビスマレイミドＸ（ＣＡＳ １３１８４８−９７−０）、３Ｆ８（ＣＡＳ １５９１０９−１１−２）、イソグラニュラチミド（ＣＡＳ ２４４１４８−４６−７）、ＣＲ８、（Ｒ）−異性体（ＣＡＳ ２９４６４６−７７−８）Ｌ−７７９，４５０（ＣＡＳ ３０３７２７−３１−３）、インディルビン−３’モノキシム−５−スルホン酸（ＣＡＳ ３３１４６７−０５−１）、ＧＳＫ−３阻害因子ＩＩ（ＣＡＳ ４７８４８２−７５−６）、ＧＳＫ−３ベータ阻害因子ＶＩＩＩ（ＣＡＳ ４８７０２１−５２−３）、アロイシンＡ（ＣＡＳ ４９６８６４−１６−５）、ＧＳＫ−３ベータ阻害因子ＸＩ（ＣＡＳ ６２６６０４−３９−５）、ＧＳＫ−３阻害因子ＩＸ（ＣＡＳ ７１０３２３−６１−８）、アルステルパウロン、２−シアノエチル（ＣＡＳ ８５２５２９−９７−０）、ＴＣＳ ２００２（ＣＡＳ １００５２０１−２４−０）、ＴＣＳ ２１３１１（ＣＡＳ １２６０１８１−１４−３）、Ａ １０７０７２２（ＣＡＳ １３８４４２４−８０−９）、Ｒｏ−３１−８２２０（ＣＡＳ １３８４８９−１８−６）、エンザスタウリン（ＣＡＳ １３８４８９−１８−６）、ＭｅＢＩＯ（ＣＡＳ ６６７４６３−９５−８）、Ｃｄｋ２／９阻害因子（ＣＡＳ ５０７４８７−８９−０）、Ｃｄｋ１／２阻害因子ＩＩＩ（ＣＡＳ ４４３７９８−５５−８）、塩酸ＰＨＡ７６７４９１（ＣＡＳ ８４５７１４−００−３）、ＡＲ−ＡＯ １４４１８−ｄ３、インドール−３−アセタミド（ＣＡＳ ８７９−３７−８）、ヒメニアルディシン類似体１（ＣＡＳ ６９３２２２−５１−４）、ＣＨＩＲ−９９０２１（６−［［２−［［４−（２，４−ジクロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾル−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］−３−ピリジンカルボニトリルおよびＣＴ９９０２１としても知られる、ＣＡＳ ２５２９１７−０６−９）、ＣＨＩＲ−９８０１４（ＣＡＳ ５５６８１３−３９−９）、（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−オキシム（Ｂｉｏ、ＣＡＳ ６６７４６３−６２−９）、バイオ−アセトキシム（ＣＡＳ ６６７４６３−８５−６）、ＳＢ２１６７６３（ＣＡＳ ２８０７４４−０９−４）。
  10. 前記ＧＳＫ−３阻害因子がＣＨＩＲ−９９０２１またはその誘導体である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記Ｗｎｔ経路活性化因子が、ＩＱ−１およびＷｎｔ３ａからなる群より選ばれる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記骨形態形成タンパク質がＢＭＰ４である、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記血管内皮増殖因子がＶＥＧＦ１６５である、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記細胞培養培地が、ＢＭＰ４、アクチビンＡ、ＣＨＩＲ９９０２１およびＶＥＧＦ１６５を含む、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. ＢＭＰ４が２６〜３６ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在し、アクチビンＡが３５〜４６ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在し、ＣＨＩＲ−９９０２１が８μＭ〜１４μＭの間の濃度で存在し、ＶＥＧＦ１６５が４８ｎｇ／ｍｌ〜５１ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在する、請求項８〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 多能性幹細胞の造血前駆細胞への分化のための細胞培養培地であって、マイクロキャリア胚様体（ＥＢ）を用いて多能性幹細胞から造血前駆細胞を形成するものであり、下記成分を含む細胞培養培地。
    骨形態形成タンパク質、
    ＣＨＩＲ９９０２１、（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインディルビン−３’−オキシム（Ｂｉｏ、ＣＡＳ ６６７４６３−６２−９）、カンパウロン（ＣＡＳ １４２２７３−２０−９）、ＧＳＫ−３ベータ阻害因子ＸＩＩ（ＴＷＳ１１９；ＣＡＳ ６０１５１４−１９−６）、バイオ−アセトキシム（ＣＡＳ ６６７４６３−８５−６）、ＣＨＩＲ−９８０１４、ＳＢ２１６７６３（ＣＡＳ ２８０７４４−０９−４）、およびＧＳＫ−３ベータ阻害因子ＶＩＩＩ（ＣＡＳ ４８７０２１−５２−３）からなる群より選ばれるＧＳＫ−３キナーゼ阻害因子またはそれらの組み合わせ、あるいはＷｎｔ経路活性化因子、
    アクチビンＡ、並びに
    血管内皮増殖因子。
  17. 前記造血前駆細胞が、ＫＤＲ＋ＰＤＧＦＲα−造血前駆細胞である、請求項１６に記載の細胞培養培地。
  18. 震盪懸濁培養用である、請求項１６または１７に記載の細胞培養培地。
  19. 前記骨形態形成タンパク質がＢＭＰ４である、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の細胞培養培地。
  20. 前記Ｗｎｔ経路活性化因子が、ＩＱ−１およびＷｎｔ３ａからなる群より選ばれる、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の細胞培養培地。
  21. 前記血管内皮増殖因子がＶＥＧＦ１６５である、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の細胞培養培地。
  22. 前記細胞培養培地が、ＢＭＰ４、アクチビンＡ、ＣＨＩＲ９９０２１およびＶＥＧＦ１６５を含む、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の細胞培養培地。
  23. ＢＭＰ４が２６〜３６ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在し、アクチビンＡが３５〜４６ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在し、ＣＨＩＲ−９９０２１が８μＭ〜１４μＭの間の濃度で存在し、ＶＥＧＦ１６５が４８ｎｇ／ｍｌ〜５１ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在する、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の細胞培養培地。
  24. 多能性幹細胞の造血前駆細胞への分化のための細胞培養培地であって、マイクロキャリア胚様体（ＥＢ）または多能性幹細胞を用いて多能性幹細胞から造血前駆細胞を形成するものであり、下記成分を含む細胞培養培地。
    骨形態形成タンパク質、
    アクチビンＡ、および
    血管内皮増殖因子。
  25. 前記骨形態形成タンパク質がＢＭＰ４である、請求項２４に記載の細胞培養培地。
  26. 前記血管内皮増殖因子がＶＥＧＦ１６５である、請求項２４または２５に記載の細胞培養培地。
  27. 前記細胞培養培地が、ＢＭＰ４、アクチビンＡおよびＶＥＧＦ１６５を含む、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の細胞培養培地。
  28. 前記ＢＭＰ４が２６〜３６ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在し、前記アクチビンＡが３５〜４６ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在し、前記ＶＥＧＦ１６５が４８ｎｇ／ｍｌ〜５１ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の細胞培養培地。
  29. マイクロキャリア胚様体（ＥＢ）または多能性幹細胞を用いて多能性幹細胞から造血前駆細胞を形成する、多能性幹細胞の造血前駆細胞への分化のための細胞培養培地であって、下記成分を包含する細胞培養培地。
    骨形態形成タンパク質、
    アクチビンＡ、
    ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）またはその変異体、
    ホルモン、
    サイトカイン、および
    血管内皮増殖因子。
  30. 前記骨形態形成タンパク質がＢＭＰ４である、請求項２９に記載の細胞培養培地。
  31. 前記ホルモンがβエストラジオールである、請求項２９または３０に記載の細胞培養培地。
  32. 前記塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）またはその変異体が、ｂＦＧＦの熱安定性キメラ変異体または安定キメラ線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）である、請求項２９に記載の細胞培養培地。
  33. 前記サイトカインが幹細胞因子（ＳＣＦ）である、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の細胞培養培地。
  34. 前記血管内皮増殖因子がＶＥＧＦ１６５である、請求項２９〜３３のいずれか一項に記載の細胞培養培地。
  35. 細胞培養培地がＢＭＰ４、アクチビンＡ、ｂＦＧＦ、βエストラジオール、ＳＣＦおよびＶＥＧＦ１６５を含む、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の細胞培養培地。
  36. 前記ＢＭＰ４が１８ｎｇ／ｍｌ〜２７ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在し、前記アクチビンＡが３ｎｇ／ｍｌ〜７ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在し、前記ｂＦＧＦが５ｎｇ／ｍｌ〜１４ｇ／ｍｌの間の濃度で存在し、前記βエストラジオールが０．２ｎｇ／ｍｌ〜０．８ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在し、前記ＳＣＦが２６ｎｇ／ｍｌ〜３６ｇ／ｍｌの間の濃度で存在し、前記ＶＥＧＦ１６５が３２〜３８ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在する、請求項２９〜３５のいずれか一項に記載の細胞培養培地。
  37. 多能性幹細胞を造血前駆細胞に分化させるための方法であって、懸濁撹拌下で実施され、
    ａ．請求項１５〜３１のいずれかで定義した細胞培養培地に多能性幹細胞を２４時間（０日目〜１日目に）暴露し、Ｔ−ブラキウリ（Ｔ−Ｂｒａ、原条／早期中胚葉マーカー）陽性細胞を得る工程と、
    ｂ．工程ａの細胞を、請求項４８〜５７のいずれかに記載の細胞培養培地に２４時間（１日目〜２日目に）暴露する工程と、
    ｃ．工程ｃのマイクロキャリア付着細胞を請求項５８〜７６のいずれかに記載の細胞培養培地に４８時間（２日目〜４日目に）暴露し、工程ａおよび工程ｂで中胚葉誘導を誘導する工程と、
    ｄ．細胞培養培地を除去し、工程ｃで得られたＫＤＲ＋ＰＤＧＦＲα−造血前駆細胞を単離する工程と
    を含む、方法。
  38. 多能性幹細胞を造血前駆細胞に分化させるための方法であって、懸濁撹拌下で実施され、
    （ａ）懸濁撹拌に付した培養細胞から単離した多能性幹細胞に対して中胚葉誘導を実施し、ＫＤＲ＋ＰＤＧＦＲα−造血前駆細胞を得る工程と、
    （ｂ）工程（ａ）で単離した細胞に対して造血細胞誘導を実施し、ＣＤ３４／ＣＤ４３／ＣＤ４５造血前駆細胞を得る工程と、
    （ｃ）工程（ｂ）で単離した細胞に対して赤芽球増殖を誘導し、ＣＤ２３５ａ＋ＣＤ７１＋赤芽球細胞を得る工程と、
    （ｄ）工程（ｃ）で単離した細胞に対して赤芽球成熟を誘導し、ＣＤ２３５ａ＋ＤＲＡＱ５陰性除核赤芽球細胞を得る工程と、
    （ｅ）細胞培養培地を除去し、工程（ｄ）で得られたＣＤ２３５ａ＋ＤＲＡＱ５陰性除核赤芽球細胞を単離する工程と
    を含む、方法。
  39. 前記多能性幹細胞がマイクロキャリアに付着している、請求項３７または３８に記載の方法。
  40. 前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法、請求項１６〜３６のいずれか一項に記載の細胞培養培地、または請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. マイクロキャリアと、請求項１６〜３６のいずれか一項に記載の細胞培養培地とを含むキット。
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