CN111876416B - 激活γ-珠蛋白基因表达的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种激活γ‑珠蛋白基因转录的新方法。本发明采用含有GATA或其反义互补序列TATC的单链寡核苷酸(ssODN)作为指导信息，在γ‑珠蛋白基因调控区进行基因编辑形成含有GATA的增强子元件，能够促进γ‑珠蛋白基因在成熟红细胞中表达。利用本发明技术进行基因编辑后的造血干细胞具有正常功能，且在分化成红细胞后能显著提高胎儿血红蛋白的表达，因此可用于β‑地中海贫血和镰刀红细胞贫血的临床治疗。

Description

激活γ-珠蛋白基因表达的方法和组合物
技术领域
本发明涉及基因编辑技术领域，涉及一种用于激活γ-珠蛋白基因表达的方法、组合物及其应用。该方法采用含有GATA或其反义互补序列TATC的单链寡核苷酸(ssODN)作为指导信息，在γ-珠蛋白基因启动子区进行基因编辑形成含有GATA的红系增强子元件，能够促进γ-珠蛋白基因在成熟红细胞中表达。
背景技术
血红蛋白(hemoglobin，简称Hb)是红细胞内携带和运输氧气的特殊蛋白质。血红蛋白由珠蛋白(globin)和血红素构成。成人体内的血红蛋白主要是由2个α-珠蛋白和2个β-珠蛋白组成的四聚体(α2β2)，成为成人血红蛋白(HbA)。β-珠蛋白的基因(HBB)的突变可引起β-血红蛋白障碍(也称β-血红蛋白病)，包括镰状细胞病(Sickle Cell Disease，SCD)和β-地中海贫血(β-thalassemia，简称β-thal)。镰状细胞性贫血是由β-珠蛋白结构基因的点突变引起的，导致产生异常的血红蛋白(HbS)。β-地中海贫血是由β-珠蛋白基因表达的部分或完全缺陷引起的，导致成人血红蛋白(HbA)缺陷或缺失。血红蛋白的珠蛋白链减少或缺失会导致血红蛋白结构异常，这种含有异常血红蛋白的红细胞变形性降低，寿命减短，在骨髓中可能出现原位溶血，进入到外周血液循环后被脾脏等脏器提前破坏，致使贫血、体内铁沉积甚至发育异常。血红蛋白病影响全球数百万人口，目前每年大约有330,000儿童出生患有血红蛋白病，严重威胁人类的健康甚至生命。地中海贫血和镰状细胞病患者主要通过规范性长期输血和去铁治疗来缓解病症，但这种方式不但不能治愈，同时还会带来较高的安全隐患。异体造血干细胞移植是目前唯一能根治地中海贫血和镰状细胞病的治疗技术，然而由于骨髓配型成功率低和免疫排斥风险等因素的限制，在临床上难以大范围应用。因此迫切需要发展新的安全和有效的治疗方法。
人类发育过程中，血红蛋白并不是一直以2个α-珠蛋白和2个β-珠蛋白的形式组成的。在胚胎发育期间和出生后不久，血红蛋白是由两个α-珠蛋白链和两个γ-珠蛋白链组成的四聚体的形式存在(α2γ2)，称之为胎儿血红蛋白(HbF)，它相比于HbA有更强的氧亲和力。随着胎儿的发育，γ-珠蛋白基因逐渐沉默而不表达，而相同基因组位点附近的β-珠蛋白基因逐渐升高表达，在婴儿出生后约半年后，血液中血红蛋白的组成和比例逐渐稳定下来，HbF被成人血红蛋白(HbA)替换，只剩余极低水平HbF(占总血红蛋白的1％以下)。
研究发现，有些人群中一些特殊的位点出现突变，γ-珠蛋白基因转录被激活，导致血红蛋白中HbF比例升高，被称之为遗传性胎儿血红蛋白持续增多(hereditarypersistence of fetal hemoglobin，HPFH)。比如，γ-珠蛋白基因启动子区发现了一些不同类型的突变，如-114至-10213bp del c.、4bp del c.-225至-222、c.-114C>T、c.-117G>A、c.-158C>T、c.-167C>T、c.-170G>A、c.-175T>G、c.-175T>C、c.-195C>G、c.-196C>T、c.-198T>C、c.-201C>T等，这些天然存在的突变不同程度地提高HbF在总血红蛋白的比例。临床研究发现，少数β-地中海贫血或者镰刀型贫血症患者由于恰好基因组中存在HPFH突变，HbF的表达弥补了HbA的不足，在一定程度上减轻或者缓解了病人的贫血症状，或减少了输血需求。受到该发现的启发，科学家们不断探索各种能够诱导HbF表达的方法来达到治疗β-血红蛋白病的目的。如目前临床上有用羟基脲等药物诱导HbF表达治疗β-血红蛋白病，然而大多数病人中诱导HbF的水平较低，不能够彻底改善病人的状况。
基因编辑技术为血红蛋白病等遗传病的治疗带来了新希望和新方法。近几年基因编辑技术获得突破性的发展，使得人为改变基因组中特定位点的碱基序列成为可能，并且越来越容易。目前发展相对成熟的基因编辑技术有ZFN(锌指核酸酶)、TALEN(转录激活因子样效应物核酸酶)和CRISPR(规律成簇间隔短回文重复)/Cas系统(CRISPR-Cas系统)。通过设计特异的基因编辑系统，将活细胞中目标基因组DNA位点切开形成双链断裂(DSB)，细胞可以利用非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)修复机制对DNA缺口进行修复，可随机形成序列的插入、缺失、碱基替换等突变。如在进行基因编辑的同时提供人为设计的DNA供体模板(donor template)，细胞可利用同源介导的修复(homology-directedrepair，HDR)机制完成修复，从而在目标位点引入预期的碱基突变形式。
目前，通过基因编辑增强红细胞中HbF表达的治疗策略，国际上有几种不同的方法。(1)删除或者破坏人类第2号染色体上BCL11A基因内含子中的红细胞系增强子元件，减少红细胞中BCL11A的表达，解除BCL11A对γ-珠蛋白基因的转录抑制作用。(2)删除或者破坏γ-珠蛋白基因启动子区中一些序列，阻止转录抑制因子的结合，或者引入天然存在的HPFH突变类型，如-114至-102位点13个碱基对删除(13bp del c.)。(3)制造3.5kb至13.6kb大片段的DNA删除，删除γ-珠蛋白基因和β-珠蛋白之间的含有不明抑制子的序列，以促使γ-珠蛋白基因与远端LCR增强子结合。这些方法显示出激活HbF表达的效果，但是这些方法的长期功效或/和安全性尚不清楚，需要进一步发展新的方法。
发明内容
本发明提供一种通过基因编辑激活γ-珠蛋白基因转录的方法。本发明利用含有GATA或其反义互补序列TATC的单链寡核苷酸(ssODN)，通过基因编辑技术(例如CRISPR-Cas基因编辑系统)，在γ-珠蛋白基因启动子区恰当的位置制造少数碱基的突变(删除、替换、插入等)，被编辑后在γ-珠蛋白基因启动子区的正义链或者反义链上形成含有GATA的红系增强子元件，如NTG-N(7-8)–WGATAR或NAG-N(7-8)–WGATAR的序列结构，能够促进γ-珠蛋白基因在成熟红细胞中转录，使红细胞中HbF表达升高。其中，W为T或A；R为A或G；N为A、G、C或T，更优选为C或T；N(7-8)是指7至8个任意碱基。
如图1所示，本发明的原理是基于CRISPR-Cas等基因编辑技术，结合本发明设计的单链寡核苷酸(ssODN)，对CD34+造血干细胞等具有红细胞分化能力的干细胞、祖细胞进行高效基因编辑，在编码人类γ-珠蛋白的HBG1和HBG2基因(位于人类11号染色体)启动子中制造突变，在启动子的正义链或者反义链上人为创造一个NTG-N(7-8)–WGATAR或NAG-N(7-8)–WGATAR的序列结构，该序列作为增强子，可以在目的细胞分化为红细胞后招募GATA1等激活因子促进γ-珠蛋白表达。
本发明提供一种含有GATA或TATC序列的ssODN，该ssODN可用于γ-珠蛋白基因的基因编辑。本发明中ssODN结构上包含5′同源臂、替换序列、3′同源臂。其中GATA或TATC序列可以位于ssODN上任意位置，包括替换序列、5′同源臂、3′同源臂，以及5′同源臂与替换序列连接处、3′同源臂与替换序列连接处。单侧同源臂的长度可以是20至300nt，在本发明的实施例中，ssODN同源臂的长度是40nt左右。在本发明的一些实施例中，含有GATA或TATC序列的ssODN选自SEQ ID NO:40～SEQ ID NO:65所示序列。在其中一些实施例中，ssODN的5′和3′是硫代磷酸(Phosphorothioate)修饰的。
本发明公开了一种用于γ-珠蛋白基因编辑的组合物。该组合物中包含ssODN，sgRNA，以及CRISPR-Cas核酸酶。在本发明的一些实施例中，所述基因编辑系统sgRNA靶向的位点位于SEQ ID NO：32至SEQ ID NO:39所示序列中。在本发明的一些实施例中，所述sgRNA是SEQ ID NO：69～SEQ ID NO:76所示序列。在本发明的一些实施例中，所述Cas9蛋白为来源于Streptococcus pyogenes的Cas9蛋白。
本发明公开了一种用于γ-珠蛋白基因编辑的电转方法。该方法利用电穿孔技术，将ssODN，sgRNA，以及CRISPR-Cas核酸酶形成的组合物高效转染入人类造血干细胞中，介导高效的基因编辑。
本发明还公开了一种造血干细胞，采用电转方法将上述包含ssODN、sgRNA、以及CRISPR-Cas核酸酶的组合物转入造血干细胞中，该细胞中γ-珠蛋白基因启动子区含有激活性GATA元件，能够在分化成红细胞时提升γ-珠蛋白基因的表达。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的ssODN与基因编辑系统(例如CRISPR-Cas、TALEN、ZFN等)一起导入细胞中，可以指导γ-珠蛋白基因启动子区的基因编辑，在特定的位点突变形成具有激活作用的GATA元件。本发明的一些实施例中，利用电转技术将ssODN和CRISPR-Cas基因编辑系统导入人类造血干细胞，在γ-珠蛋白基因启动子区获得高效的基因编辑，在特定的位点引入突变形成了预期的含有GATA的红系增强子元件，该造血干细胞分化成红细胞后，γ-珠蛋白基因表达显著提高，血红蛋白中HbF比例显著提高。
附图说明
图1示意本发明的技术原理。
图2A显示基因编辑靶向区域为HBG1和HBG2基因-92至-66之间的野生型序列，所用gRNA靶向序列的位置，以及基因编辑后期望得到的突变序列。
图2B显示基因编辑靶向区域为HBG1和HBG2基因-129至-98之间的野生型序列，所用gRNA靶向序列的位置，以及基因编辑后期望得到的突变序列。
图2C显示基因编辑靶向区域为HBG1和HBG2基因-175至-153之间的野生型序列，所用gRNA靶向序列的位置，以及基因编辑后期望得到的突变序列。
图2D显示基因编辑靶向区域为HBG1和HBG2基因-192至-160之间的野生型序列，所用gRNA靶向序列的位置，以及基因编辑后期望得到的突变序列。
图2E显示基因编辑靶向区域为HBG1基因-428至-406和HBG2基因-432至-410之间的野生型序列，所用gRNA靶向序列的位置，以及基因编辑后期望得到的突变序列。
图3显示293T细胞中转染CRISPR-Cas质粒对HBG1和HBG2基因组的编辑效率数据，所述数据来自于293T细胞使用Lipofectamine 2000TM转染CRISPR-Cas质粒四天后基因组DNA的INDEL检测结果，图中显示了总体插入缺失突变所占百分比(总突变％)。
图4显示293T细胞中同时转染CRISPR-Cas质粒及ssODN对HBG2基因组的编辑效率数据，所述数据来自于293T细胞使用Lipofectamine 2000TM转染CRISPR-Cas质粒及ssODN四天后HBG2的INDEL检测结果。
图5显示K562细胞中同时转染CRISPR-Cas质粒及ssODN对HBG2基因组的编辑效率数据，所述数据来自于K562细胞使用Lonza 4D电穿孔转染CRISPR-Cas质粒及ssODN四天后HBG2的INDEL检测结果。
图6显示K562细胞中电转导入核糖核蛋白(RNP)及ssODN后HBG2基因组的编辑效率数据，所述数据来自于ssODN和CRISPR-Cas/sgRNA RNP通过电穿孔转入K562细胞四天后HBG2的INDEL检测结果。
图7A-C显示动员外周血CD34+细胞(mPBSC)中电转导入RNP及ssODN后HBG2基因编辑效率数据，所述数据来自于ssODN和CRISPR-Cas/sgRNA RNP通过电穿孔转入mPBSC后，诱导红细胞分化5天后基因组DNA的INDEL检测结果。图7A和7B是sanger测序图谱，图7C是经synthego软件分析后的INDEL比例结果。
图8显示动员外周血CD34+细胞(mPBSC)基因编辑后γ-珠蛋白mRNA表达数据，所述数据来自于ssODN和CRISPR-Cas/sgRNA RNP通过电穿孔转入mPBSC后，诱导红细胞分化18天后mRNA的qRT-PCR检测结果，图中γ-珠蛋白mRNA的表达以GAPDH表达水平作为内参，以不编辑的细胞中γ-珠蛋白mRNA的表达作为参照进行标准化，n＝3。
图9显示动员外周血CD34+细胞(mPBSC)基因编辑后HbF表达数据，所述数据来自于ssODN和CRISPR-Cas/sgRNA RNP通过电穿孔转入mPBSC后，诱导红细胞分化18天后HPLC检测血红蛋白检测结果，图中HbF表达是其占总血红蛋白的百分比。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
以下实施例所用原料，均为市售购得。
本文提供了使用基因编辑技术(例如CRISPR-Cas介导基因编辑技术，结合本发明设计的单链寡核苷酸(ssODN)，对CD34+造血干细胞等具有红细胞分化能力的干细胞、祖细胞进行高效基因编辑，在编码人类γ-珠蛋白的HBG1和HBG2基因(位于人类11号染色体)启动子中制造突变，在启动子的正义链或者反义链上人为创造一个NTG-N(7-8)–WGATAR或NAG-N(7-8)–WGATAR的序列结构(图1)，该序列作为增强子，可以在目的细胞分化为红细胞后招募GATA1等转录激活因子促进γ-珠蛋白表达。
GATA-1是一种在红细胞系统中特异高表达的转录调控因子,在红细胞分化过程中发挥着重要作用。红细胞中α-和β-珠蛋白、亚铁血红素生物合成酶等红细胞中特异性高表达的基因均受到GATA-1的直接转录激活。GATA-1作为转录因子，选择性地结合于染色质DNA上的WGATAR序列元件(其中W代表T或者A，R代表A或者G，也可以用T/A(GATA)A/G表示；其反义互补序列为YTATCW，其中Y代表T或者C，也可用T/C(TATC)T/A表示)上，比如人β-珠蛋白基因的调控区中也发现了多个GATA位点。值得注意的是，并不是含有GATA序列的基因都会被GATA-1激活。这是因为，GATA序列在基因组上分布非常广泛，往往需要与上下游的序列(顺式元件)形成一定形式的序列组合(元件组合)来发挥作用。比如，GATA序列附近有CACCC或GC盒等顺式调控元件，通常可招募GATA-1与转录因子EKLF共同结合。如GATA序列附近有E-box元件(CAGNTG，N代表任意碱基)，或half E-box元件(NTG)，则招募GATA-1与转录因子TAL1共同结合。ChIP-seq研究基因组水平GATA-1和TAL1的结合位点表明，大约四分之三的GATA-1/TAL1共结合位点存在一个明显的序列规律，WGATA序列上游7-8个碱基处往往存在half E-box元件(NTG)，可以用NTG-N(7-8)-WGATA表示。有实验证明，这种序列是激活性GATA元件，可促进基因在红细胞中的表达。如BCL11A内含子中的+58增强子中含有CTG-N(7)-TGATAA序列，破坏该序列中的GATA基序可以显著降低红细胞中BCL11A的表达。
HBG1和HBG2基因转录起始位点上游1400个碱基的序列相似度非常高，被认为是启动子区域。本申请的发明人研究发现，γ-珠蛋白基因启动子区本身含有多个GATA序列(或TATC)，同时也含有非常多的TG序列，但是γ-珠蛋白在成熟红细胞中几乎不表达。本申请的发明人通过深入研究发现，γ-珠蛋白基因启动子上的GATA(或TATC)和TG序列在位置和方向上没有形成有效的激活性GATA元件(比如TG-N(7-8)-WGATAR)，因此不能招募GATA-1/TAL1等在成熟红细胞中高表达的转录激活因子结合(共结合)到γ-珠蛋白基因启动子区，因此γ-珠蛋白在成熟红细胞中被沉默，几乎不表达。
本申请的发明人通过深入研究发现，HBG1和HBG2启动子区域存在一些位点，其正义链或者反义链中的序列如果经过少数几个碱基的替换、删除、插入等改变，便可以形成NTG-N(7-8)–WGATAR或NAG-N(7-8)–WGATAR的序列结构。本申请的发明人认为，如果利用基因编辑系统对这些位点进行切割形成DSB，通过添加供体DNA模板(如单链寡核苷酸ssODN)指导这些位点进行HDR修复，可能将一定比例的基因组编辑成预期的序列结构，最终γ-珠蛋白基因启动子区由于形成了如NTG-N(7-8)–WGATAR或NAG-N(7-8)–WGATAR的序列，可以作为增强子招募GATA-1/TAL1等在成熟红细胞中高表达的转录激活因子结合(共结合)到γ-珠蛋白基因启动子区，从而促进γ-珠蛋白在成熟红细胞中高表达。
基因编辑从目的上来讲，可以分为两大类，一类是破坏靶位点的序列或结构，称之为敲除(knock out)。另一类目的是要在靶位点引入特定的序列突变，称之为敲入(knockin)。要引入特定的序列突变，最常见的方法是同时引入一个DNA供体模板，细胞可以利用同源重组的机制，将模板中的序列替换到基因组中，实现敲入。用于HDR的DNA模板可以是质粒DNA，线性化的双链DNA，AAV递送的DNA，或者单链寡核苷酸(ssODN)。ssODN在基因编辑中的应用越来越多，其效率高、合成方便，特别适用于体外培养细胞中的基因编辑。
ssODN结构上包含5′同源臂、替换序列、3′同源臂。同源臂是与待编辑的靶位点两侧的DNA区域同源的序列，用于定位到染色体上目标位点。5′同源臂和3′同源臂在染色体上对应的序列在位置上通常是不连续的，中间有一定的间隔，如1-20个核苷酸的间隔，这些间隔序列是基因编辑的靶标(拟编辑序列)，即希望通过基因编辑被替换掉的序列。ssODN上5′同源臂的3′末端与3′同源臂的5′末端之间的“替换序列”是基因编辑希望得到的结果。基因编辑的同时添加ssODN，可以诱导基因编辑时进行同源重组修复，修复的结果使细胞基因组中拟编辑序列被修复成替换序列。ssODN中替换序列的长度可以小于拟编辑的序列，这种情况下基因编辑的结果是原基因组中拟编辑序列的删除或者/和替换。ssODN中替换序列的长度可以是0碱基，这种情况下基因组上拟编辑序列被删除。ssODN中替换序列的长度可以大于拟编辑的序列，这种情况下基因编辑的结果是拟编辑序列被替换或者/和插入序列。
本发明适用于“CRISPR-Cas”、TALEN、ZFN等位点特异性核酸酶介导的基因编辑系统。“CRISPR-Cas”是一种基因编辑技术，包括但不限于各种自然存在或人工设计的CRISPR-Cas系统，如CRISPR-Cas9系统、CRISPR-Cas12系统等。CRISPR-Cas9的工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。tracrRNA和crRNA的作用也可以由一条人为合成的具有引导作用的sgRNA来替代。使用其它CRISPR-Cas系统时需要设计与之对应的sgRNA或者crRNA。使用TALEN或ZFN等系统时需要根据本发明公布的编辑位点设计对应的TALEN或ZFN核酸酶。
实施例1：用于将激活性GATA元件引入γ-珠蛋白基因启动子的ssODN和CRISPR-Cas系统筛选
通过对HBG1和HBG2转录起始位点上游约1.4kb内序列(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)的分析，发明人发现了很多区段的序列满足经过少数几个碱基的替换、删除、插入等改变，便可以形成NTG-N(7-8)–WGATAR或NAG-N(7-8)–WGATAR的序列结构。通过分析这些区段中目标突变碱基附近是否具备NGG(spCas9识别的PAM)序列，以及切点是否正中所需编辑的目标序列，最终获得了五个最有可能实现高效基因编辑的候选靶向区域(图2A至2E)，按照距离转录起始位点由近至远分别是：一号区域，HBG1和HBG2启动子-92至-66之间(图2A)；二号区域，HBG1和HBG2启动子-129至-98之间(图2B)；三号区域，HBG1和HBG2启动子-175至-153之间(图2C)；四号区域，HBG1基因和HBG2基因-192至-160之间(图2D)；五号区域，HBG1基因-428至-406和HBG2基因-432至-410之间(图2E)。
根据五个候选区域内本身的序列特征，以及CRISPR-Cas9基因编辑系统预测的切点位置，分析得到每个区域内序列比较适合的突变目标类型，如表1所示(SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:31)。其中下划线表示需要替换的碱基，是基因编辑后希望得到的结果。本发明中替换碱基长度是0-6个碱基，实现的效果是删除、替换、插入，或者删除、替换、插入的组合。
表1.HBG1和HBG2启动子上野生型序列及编辑后获得的序列
Figure BDA0002563988520000071
Figure BDA0002563988520000081
为了达到在表1所选区域内编辑位点附近切开DNA双链形成DSB，本发明选择切割效率较高的spCas9 CRISPR-Cas系统(来源于Streptococcus pyogenes)，分析切割效率可能较高的靶位点，选择site_1至site_8作为候选靶位点，其识别的靶标位点DNA序列及PAM序列(NGG)如表2所示(SEQ ID NO:32至SEQ ID NO:39)。
表2.HBG1和HBG2启动子上sgRNA识别的靶位点
SEQ ID 位点 sgRNA识别位点及PAM(5′-3′) DNA链
SEQ ID NO:32 site_1 ACTGGATACTCTAAGACTAT TGG 反义链
SEQ ID NO:33 site_2 CTTGTCAAGGCTATTGGTCA AGG 反义链
SEQ ID NO:34 site_3 GTTTGCCTTGTCAAGGCTAT TGG 反义链
SEQ ID NO:35 site_4 TGGTCAAGTTTGCCTTGTCA AGG 反义链
SEQ ID NO:36 site_5 CTTGACCAATAGCCTTGACA AGG 正义链
SEQ ID NO:37 site_6 TATCTGTCTGAAACGGTCCC TGG 正义链
SEQ ID NO:38 site_7 ATGCAAATATCTGTCTGAAA CGG 正义链
SEQ ID NO:39 site_8 TCCCTGAACTTTTCAAAAAT TGG 正义链
根据表1所示的期望突变类型，以及表2中sgRNA识别的DNA链(正义链或反义链)，设计对应的指导基因编辑修复ssODN(表3,SEQ ID NO:40至SEQ ID NO:65)。本发明中ssODN结构上包含5′同源臂、替换序列、3′同源臂。其中GATA或TATC序列可以位于ssODN上任意位置，包括替换序列、5′同源臂、3′同源臂，以及5′同源臂与替换序列连接处、3′同源臂与替换序列连接处。ssODN两侧同源臂可以是对称的，或者是非对称的(两侧长短不一)，为了系统对比的方便性，本发明中统一使用对称同源臂的ssODN进行实验。ssODN两侧同源臂长度可以是20-300nt，为了系统对比的方便性，本发明中实施例使用两侧同源臂长度约为40nt的ssODN进行示例。ssODN可以是编辑区域DNA的正义链或者是反义链(同源臂序列与对应的正义链相同或者与反义链相同)，本发明中ssODN统一选择与sgRNA识别位点相同的DNA链作为ssODN母版序列。ssODN中的序列除两侧同源臂序列外，替换碱基可以是0个、1个、2个、3个、4个、5个、6个碱基，实现的效果是删除、替换、插入，或者删除、替换、插入的组合。实现的效果可以是改变基因组上1个以上的碱基，比如1-20个碱基的删除或者替换。如表3所示序列(SEQ ID NO:40至SEQ ID NO:65)，下划线标示的碱基是两侧同源臂，长度在40nt左右，两侧同源臂之间的未用下划线标示的碱基是替换碱基，其中ssODN_16的两侧同源臂之间的替换碱基是0个。ssODN的两端前三个核苷酸使用硫代磷酸(Phosphorothioate)修饰以增强ssODN的稳定性和提高其在基因编辑中的活性。
表3.ssODN序列及与之配合的gRNA编号
Figure BDA0002563988520000091
Figure BDA0002563988520000101
Figure BDA0002563988520000111
使用sgRNA-spCas9载体(PX459，pSpCas9(BB)-2A-Puro)表达表2中靶位点对应的sgRNA，该载体表达spCas9蛋白，同时可表达长度为100nt的sgRNA，其5′端为20nt的指导序列，后面80nt为通用的sgRNA骨架序列(SEQ ID NO:66,GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU)。克隆sgRNA的方法是：分别合成gRNA对应的指导链序列oligo(同表2中20nt靶位点序列)和互补链oligo(指导链序列的5’-端加cacc，若指导链5’-端第一个核苷酸不是鸟嘌呤G，则在指导链的5’-端加caccG；在互补链的5’-端加aaac，若指导链5’-端加了一个G，则在互补链的3’-端加C与之互补配对)。将两种oligo等量混合，95℃热变形退火处理，然后连入采用限制性内切酶Bbs I消化过的PX459载体，并通过菌落PCR及sanger测序鉴定是否克隆成功。PCR使用SEQ ID NO:67(5′-3′：GGACTATCATATGCTTACCGTAAC)和SEQ ID NO:68(5′-3′：GGCGGGCCATTTACCGTAAG)作为引物。克隆成功后即获得8种质粒，分别表达SEQ ID NO:69至SEQ ID NO:76的sgRNA(表4)。
表4.PX459载体表达的sgRNA
Figure BDA0002563988520000112
Figure BDA0002563988520000121
将表达8种质粒分别转染293T细胞，方法参考Lipofectamine 2000TM试剂盒的方法。转染后的细胞培养4天，收集细胞提取基因组DNA。分别使用SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78，以及SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:78，采用KOD Plus高保真酶PCR法扩增HBG1和HBG2启动子基因片段，得到的PCR产物纯化后分别使用SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:79进行测序。测序结果得到的文件经synthego软件分析基因编辑效率，如图3所示，除sgRNA-8的编辑效率相对较低外(约20％)，其它组编辑总体突变(插入缺失，Indel)效率在40-50％左右。
表5.PCR及sanger测序引物
SEQ ID 位点 sgRNA识别位点及PAM(5′-3′)
SEQ ID NO:77 HBG1_F TACTGCGCTGAAACTGTGGCTT
SEQ ID NO:78 HBG1/2_R CTTCCCAGGGTTTCTCCTCCAG
SEQ ID NO:79 HBG2_F TGCACTGAAACTGTTGCTTTATAGGA
实施例2：ssODN与sgRNA-spCas9载体共转293T细胞进行基因编辑
将上述8种sgRNA-spCas9载体分别与恰当的ssODN共转染入293T细胞中以检测添加ssODN后是否可以诱导基因编辑后形成预期的突变类型(发生HDR修复)。根据sgRNA切点的位置，将8种sgRNA-spCas9载体按照表6中所示的sgRNA+ssODN组合方法，分别形成30种组合。利用Lipofectamine 2000TM试剂，在转染质粒的同时添ssODN，将ssODN和质粒一同递送到细胞中。转染后的细胞培养4天，收集细胞提取基因组DNA。由于HBG1和HBG2的基因编辑效率几乎是正相关的，而且往往HBG2的基因编辑效率稍高于HBG1(图3)，因此后续实验只选择HBG2基因组基因编辑效率进行对比，按照实施例1中的方法，PCR扩增HBG2启动子基因片段，纯化进行测序。测序结果经synthego软件分析基因编辑效率显示，添加ssODN与sgRNA-spCas9载体共转染可以提升编辑效率，同时大多数组诱导约10-20％的基因编辑形成预期的突变类型(图4)。
表6.ssODN与sgRNA-spCas9载体共转组合
Figure BDA0002563988520000131
Figure BDA0002563988520000141
实施例3：电穿孔将ssODN与sgRNA-spCas9载体共转入K562细胞进行基因编辑
利用脂质体(如Lipofectamine 2000TM试剂)将质粒转入悬浮细胞的效率比较低，通常转染悬浮细胞时一般采用电穿孔法导入。取实施例2中部分sgRNA与ssODN的组合，通过lonza-4D电转仪导入K562细胞，使用仪器自带的K562细胞转染程序。转染后的细胞培养4天，收集细胞提取基因组DNA，PCR扩增HBG2启动子基因片段进行测序。测序结果经synthego软件分析基因编辑效率显示，K562中电转sgRNA-1、sgRNA-2、sgRNA-5与ssODN的组合可达到较高编辑效率(图5)，略高于293T细胞，电转ssODN与sgRNA-spCas9载体诱导形成预期的突变类型也略微高于293T细胞。
实施例4：电穿孔将ssODN与spCas9蛋白/sgRNA RNP共转入K562细胞实现高效基因编辑
相对于质粒表达CRISPR-Cas系统，以核糖核蛋白(RNP)的形式递送CRISPR-Cas系统被证实基因编辑效率高而且不易诱导细胞凋亡。利用商业化的spCas9蛋白及化学合成的sgRNA-1、sgRNA-2、sgRNA-5(序列同表4中对应的sgRNA，但末端进行化学修饰)，分别在体外孵育包装RNP-1、RNP-2、RNP-5。通过电穿孔将RNP与部分ssODN组合递送入K562细胞。转染后的细胞培养4天，收集细胞提取基因组DNA，PCR扩增HBG2启动子基因片段进行测序。测序结果经synthego软件分析基因编辑效率显示(图6)，相对于没有添加ssODN的组合，K562中电转RNP时加入ssODN显著地提高总体基因编辑效率约两倍(图6)。同时，电转ssODN和RNP可以诱导更高比例的基因编辑形成预期的突变类型(图6)。
实施例5：电穿孔将ssODN与spCas9蛋白/sgRNA RNP导入人类造血干/祖细胞实现高效基因编辑并显著提高HBG表达
动员外周血来源的人CD34阳性细胞(mPBSC)复苏后，在富含人类细胞因子(SCF、TPO、Flt3L,各100ng/ml)的StemSpan无血清扩增培养基(SFEM)中培养两天，采用lonza-4D电转仪自带的EO-100程序将ssODN与spCas9/sgRNA RNP递送到mPBSC细胞中。电转完成后在富含人类细胞因子(SCF/TPO/Flt3L,各100ng/ml)的SFEM中恢复培养一天，然后分成三阶段诱导mPBSC向红细胞分化。第一阶段：在含有EPO、SCF、人AB血清、胰岛素、转铁蛋白、肝素、IL-3、氢化可的松等添加物的IMDM培养液中培养7天。在诱导分化第5天取出2x 10e5细胞提取基因组DNA，然后PCR扩增HBG2启动子片段送sanger测序。与K562细胞中的结果类似，mPBSC细胞中电转ssODN与spCas9/sgRNA RNP可产生高效的基因编辑，其中部分组基因编辑形成预期的突变类型达到30％(图7A-C)。
电转过的mPBSC细胞及未处理的mPBSC细胞(对照，NC)经过第一阶段分化诱导7天后，在含有EPO、SCF、人AB血清、胰岛素、转铁蛋白、肝素等添加物的IMDM培养液中培养4天，最后在在含有EPO、人AB血清、胰岛素、转铁蛋白、肝素等添加物的IMDM培养液中培养7天。诱导分化18天后，电转过的mPBSC细胞及未处理的mPBSC细胞离心后均可见明显深红色，其中含有大量红细胞，表明电转加工过的mPBSC细胞可正常分化为红细胞。
在诱导分化接近结束的时候，取部分细胞提取mRNA，用逆转录-实时定量PCR(RT-qPCR)检测HBG mRNA的表达水平。相对于没有转染的细胞(NC)，RNP-2与ssODN_6、ssODN_13、ssODN_14、ssODN_15、ssODN_17共转染均提高了HBG mRNA的表达水平(图8)，HBG mRNA升高最高可达3倍以上。
使用糖化血红蛋白A1c检测系统(VARIANT II TURBO HbA1c kit-2.0)，对RNP-2组电转的造血干细胞分化成红细胞后的血红蛋白进行HPLC法检测，结果显示，相对于未进行基因编辑的细胞，添加ssODN进行基因编辑后，胎儿血红蛋白的含量(HbF)都有显著提高，在27％-36％之间，相对于对照组13.3％有2倍以上的上调(图9)。
上述实施例的结果表明，本发明提供了一种与现有技术不同的增强γ-珠蛋白基因表达的基因编辑方法。本发明公布的ssODN用于γ-珠蛋白基因编辑时，可以指导基因编辑后在HBG1和HBG2基因调控区预定的位点形成预期的突变，从而形成了激活性GATA元件，该元件在基因编辑的细胞(例如造血干细胞)分化成红细胞后发挥正调控作用，激活或显著提升γ-珠蛋白基因表达。因此，该发明在β-血红蛋白病的基因治疗中有潜在应用价值。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Figure BDA0002563988520000161
Figure BDA0002563988520000171
Figure BDA0002563988520000181
Figure BDA0002563988520000191
Figure BDA0002563988520000201
Figure BDA0002563988520000211
Figure BDA0002563988520000221
Figure BDA0002563988520000231
Figure BDA0002563988520000241
Figure BDA0002563988520000251
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Figure BDA0002563988520000291
Figure BDA0002563988520000301
Figure BDA0002563988520000311
Figure BDA0002563988520000321
Figure BDA0002563988520000331
Figure BDA0002563988520000341
Figure BDA0002563988520000351
序列表
<110> 广州瑞风生物科技有限公司
<120> 用于激活γ-珠蛋白基因表达的方法和组合物
<130> 2020
<160> 79
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1500
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
tctttctggc cttttagcca tctgtatcaa tgagcagata taagctttac acaggatcat 60
gaaggatgaa agaatttcac caatattata ataatttcaa tcaacctgat agcttagggg 120
ataaactaat ttgaagatac agcttgcctc cgataagcca gaattccaga gcttctggca 180
ttataatcta gcaaggttag agatcatgga tcactttcag agaaaaacaa aaacaaacta 240
accaaaagca aaacagaacc aaaaaaccac cataaatact tcctaccctg ttaatggtcc 300
aatatgtcag aaacagcact gtgttagaaa taaagctgtc taaagtacac taatattcga 360
gttataatag tgtgtggact attagtcaat aaaaacaacc cttgcctctt tagagttgtt 420
ttccatgtac acgcacatct tatgtcttag agtaagattc cctgagaagt gaacctagca 480
tttatacaag ataattaatt ctaatccaca gtacctgcca aagaacattc taccatcatc 540
tttactgagc atagaagagc tacgccaaaa ccctgggtca tcagccagca cacacactta 600
tccagtggta aatacacatc atctggtgta tacatacata cctgaatatg gaatcaaata 660
tttttctaag atgaaacagt catgatttat ttcaaatagg tacggataag tagatattga 720
ggtaagcatt aggtcttata ttatgtaaca ctaatctatt actgcgctga aactgtggct 780
ttatagaaat tgttttcact gcactattga gaaattaaga gataatggca aaagtcacaa 840
agagtatatt caaaaagaag tatagcactt tttccttaga aaccactgct aactgaaaga 900
gactaagatt tgtcccgtca aaaatcctgg acctatgcct aaaacacatt tcacaatccc 960
tgaacttttc aaaaattggt acatgcttta gctttaaact acaggcctca ctggagctag 1020
agacaagaag gtaaaaaacg gctgacaaaa gaagtcctgg tatcctctat gatgggagaa 1080
ggaaactagc taaagggaag aataaattag agaaaaactg gaatgactga atcggaacaa 1140
ggcaaaggct ataaaaaaaa ttagcagtat cctcttgggg gccccttccc cacactatct 1200
caatgcaaat atctgtctga aacggtccct ggctaaactc cacccatggg ttggccagcc 1260
ttgccttgac caatagcctt gacaaggcaa acttgaccaa tagtcttaga gtatccagtg 1320
aggccagggg ccggcggctg gctagggatg aagaataaaa ggaagcaccc ttcagcagtt 1380
ccacacactc gcttctggaa cgtctgaggt tatcaataag ctcctagtcc agacgccatg 1440
ggtcatttca cagaggagga caaggctact atcacaagcc tgtggggcaa ggtgaatgtg 1500
<210> 2
<211> 1500
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
atctttctgg tcttttagcc gcctaacact ttgagcagat ataagcctta cacaggatta 60
tgaagtctga aaggattcca ccaatattat tataattcct atcaacctga taggttaggg 120
gaaggtagag ctctcctcca ataagccaga tttccagagt ttctgacgtc ataatctacc 180
aaggtcatgg atcgagttca gagaaaaaac aaaagcaaaa ccaaacctac caaaaaataa 240
aaatcccaaa gaaaaaataa agaaaaaaac agcatgaata cttcctgcca tgttaagtgg 300
ccaatatgtc agaaacagca ctgagttaca gataaagatg tctaaactac agtgacatcc 360
cagctgtcac agtgtgtgga ctattagtca ataaaacagt ccctgcctct taagagttgt 420
tttccatgca aatacatgtc ttatgtctta gaataagatt ccctaagaag tgaacctagc 480
atttatacaa gataattaat tctaatccat agtatctggt aaagagcatt ctaccatcat 540
ctttaccgag catagaagag ctacaccaaa accctgggtc atcagccagc acatacactt 600
atccagtgat aaatacacat catcgggtgc ctacatacat acctgaatat aaaaaaaata 660
cttttgctga gatgaaacag gcgtgattta tttcaaatag gtacggataa gtagatattg 720
aagtaaggat tcagtcttat attatattac ataacattaa tctattcctg cactgaaact 780
gttgctttat aggatttttc actacactaa tgagaactta agagataatg gcctaaaacc 840
acagagagta tattcaaaga taagtatagc acttcttatt tggaaaccaa tgcttactaa 900
atgagactaa gacgtgtccc atcaaaaatc ctggacctat gcctaaaaca catttcacaa 960
tccctgaact tttcaaaaat tggtacatgc tttaacttta aactacaggc ctcactggag 1020
ctacagacaa gaaggtgaaa aacggctgac aaaagaagtc ctggtatctt ctatggtggg 1080
agaagaaaac tagctaaagg gaagaataaa ttagagaaaa attggaatga ctgaatcgga 1140
acaaggcaaa ggctataaaa aaaattaagc agcagtatcc tcttgggggc cccttcccca 1200
cactatctca atgcaaatat ctgtctgaaa cggtccctgg ctaaactcca cccatgggtt 1260
ggccagcctt gccttgacca atagccttga caaggcaaac ttgaccaata gtcttagagt 1320
atccagtgag gccaggggcc ggcggctggc tagggatgaa gaataaaagg aagcaccctt 1380
cagcagttcc acacactcgc ttctggaacg tctgaggtta tcaataagct cctagtccag 1440
acgccatggg tcatttcaca gaggaggaca aggctactat cacaagcctg tggggcaagg 1500
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
ttgaccaata gtcttagagt atccagt 27
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttgaccaata gtgatagagt atccagt 27
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttgaccaata gagatagagt atccagt 27
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttgaccaata agatagagta tccagt 26
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttgaccaata tgatagagta tccagt 26
<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
cagccttgcc ttgaccaata gccttgacaa gg 32
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cagccttgcc ttgacagata gccttgacaa gg 32
<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cagccttgcc ttgactgata gccttgacaa gg 32
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cagccttgcc ttgagagata gccttgacaa gg 32
<210> 12
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cagccttgcc ttgagtgata gccttgacaa gg 32
<210> 13
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cagccttgcc ttgaaagata gccttgacaa gg 32
<210> 14
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cagccttgcc ttgaatgata gccttgacaa gg 32
<210> 15
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cagccttgcc ttgatagata gccttgacaa gg 32
<210> 16
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cagccttgcc ttgattgata gccttgacaa gg 32
<210> 17
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cagccttgcc ttgataaata gccttgacaa gg 32
<210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cagccttgcc ttgataaaat agccttgaca agg 33
<210> 19
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cagccttgcc ttgataatag ccttgacaag g 31
<210> 20
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cagccttgcc ttgatagcct tgacaagg 28
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cagccttgcc ttgataagg 19
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cagccttgcc ttgataaagg 20
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 23
tatctgtctg aaacggtccc tgg 23
<210> 24
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tatctgtctg aaacggtaga taaccctgg 29
<210> 25
<211> 33
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 25
cactatctca atgcaaatat ctgtctgaaa cgg 33
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cactatctca atgcaacaga aacgg 25
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 27
tccctgaact tttcaaaaat tgg 23
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tccctgaact tttcagataa ttgg 24
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tccctgaact tttcagataa attgg 25
<210> 30
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tccctgaact tttcagataa aattgg 26
<210> 31
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tccctgaact tttcagatag aattgg 26
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 32
actggatact ctaagactat tgg 23
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 33
cttgtcaagg ctattggtca agg 23
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 34
gtttgccttg tcaaggctat tgg 23
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 35
tggtcaagtt tgccttgtca agg 23
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 36
cttgaccaat agccttgaca agg 23
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 37
tatctgtctg aaacggtccc tgg 23
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 38
atgcaaatat ctgtctgaaa cgg 23
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 39
tccctgaact tttcaaaaat tgg 23
<210> 40
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
cctagccagc cgccggcccc tggcctcact ggatactcta tcactattgg tcaagtttgc 60
cttgtcaagg ctattggtca aggc 84
<210> 41
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
cctagccagc cgccggcccc tggcctcact ggatactcta tctctattgg tcaagtttgc 60
cttgtcaagg ctattggtca aggc 84
<210> 42
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
cctagccagc cgccggcccc tggcctcact ggatactcta tcttattggt caagtttgcc 60
ttgtcaaggc tattggtcaa ggc 83
<210> 43
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
cctagccagc cgccggcccc tggcctcact ggatactcta tcatattggt caagtttgcc 60
ttgtcaaggc tattggtcaa ggc 83
<210> 44
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
ctctaagact attggtcaag tttgccttgt caaggctatc tgtcaaggca aggctggcca 60
acccatgggt ggagtttagc ca 82
<210> 45
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
ctctaagact attggtcaag tttgccttgt caaggctatc agtcaaggca aggctggcca 60
acccatgggt ggagtttagc ca 82
<210> 46
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
ctctaagact attggtcaag tttgccttgt caaggctatc tctcaaggca aggctggcca 60
acccatgggt ggagtttagc ca 82
<210> 47
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
ctctaagact attggtcaag tttgccttgt caaggctatc actcaaggca aggctggcca 60
acccatgggt ggagtttagc ca 82
<210> 48
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
ctctaagact attggtcaag tttgccttgt caaggctatc tttcaaggca aggctggcca 60
acccatgggt ggagtttagc ca 82
<210> 49
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
ctctaagact attggtcaag tttgccttgt caaggctatc attcaaggca aggctggcca 60
acccatgggt ggagtttagc ca 82
<210> 50
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
ctctaagact attggtcaag tttgccttgt caaggctatc tatcaaggca aggctggcca 60
acccatgggt ggagtttagc ca 82
<210> 51
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
ctctaagact attggtcaag tttgccttgt caaggctatc aatcaaggca aggctggcca 60
acccatgggt ggagtttagc ca 82
<210> 52
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
ctctaagact attggtcaag tttgccttgt caaggctatt tatcaaggca aggctggcca 60
acccatgggt ggagtttagc ca 82
<210> 53
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
ctctaagact attggtcaag tttgccttgt caaggctatt ttatcaaggc aaggctggcc 60
aacccatggg tggagtttag cca 83
<210> 54
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
ctctaagact attggtcaag tttgccttgt caaggctatt atcaaggcaa ggctggccaa 60
cccatgggtg gagtttagcc a 81
<210> 55
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
ctctaagact attggtcaag tttgccttgt caaggctatc aaggcaaggc tggccaaccc 60
atgggtggag tttagcca 78
<210> 56
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
cctcactgga tactctaaga ctattggtca agtttgcctt atcaaggcaa ggctggccaa 60
cccatgggtg gagtttagcc a 81
<210> 57
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
cctcactgga tactctaaga ctattggtca agtttgcctt tatcaaggca aggctggcca 60
acccatgggt ggagtttagc ca 82
<210> 58
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
tggctaaact ccacccatgg gttggccagc cttgccttga taaggcaaac ttgaccaata 60
gtcttagagt atccagtgag g 81
<210> 59
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
tggctaaact ccacccatgg gttggccagc cttgccttga taaaggcaaa cttgaccaat 60
agtcttagag tatccagtga gg 82
<210> 60
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
tccccacact atctcaatgc aaatatctgt ctgaaacggt agataaccct ggctaaactc 60
cacccatggg ttggccagcc ttgcct 86
<210> 61
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
tatcctcttg ggggcccctt ccccacacta tctcaatgca acagaaacgg tccctggcta 61
aactccaccc atgggttggc cagc 84
<210> 62
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
cctatgccta aaacacattt cacaatccct gaacttttca gataattggt acatgcttta 60
actttaaact acaggcctca ctg 83
<210> 63
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
cctatgccta aaacacattt cacaatccct gaacttttca gataaattgg tacatgcttt 60
aactttaaac tacaggcctc actg 84
<210> 64
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
cctatgccta aaacacattt cacaatccct gaacttttca gataaaattg gtacatgctt 60
taactttaaa ctacaggcct cactg 85
<210> 65
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
cctatgccta aaacacattt cacaatccct gaacttttca gatagaattg gtacatgctt 60
taactttaaa ctacaggcct cactg 85
<210> 66
<211> 80
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60
ggcaccgagu cggugcuuuu 80
<210> 67
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
ggactatcat atgcttaccg taac 24
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
ggcgggccat ttaccgtaag 24
<210> 69
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
acuggauacu cuaagacuau guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 70
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
cuugucaagg cuauugguca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 71
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
guuugccuug ucaaggcuau guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 72
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
uggucaaguu ugccuuguca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 73
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
cuugaccaau agccuugaca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 74
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
uaucugucug aaacgguccc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 75
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
augcaaauau cugucugaaa guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 76
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
ucccugaacu uuucaaaaau guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 77
<211> 22
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 77
tactgcgctg aaactgtggc tt 22
<210> 78
<211> 22
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 78
cttcccaggg tttctcctcc ag 22
<210> 79
<211> 26
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 79
tgcactgaaa ctgttgcttt atagga 26

Claims (15)

1.一种用于非诊断治疗的激活γ-珠蛋白基因表达的方法，该方法包括如下操作：通过基因编辑技术在γ-珠蛋白基因调控区的正义链或反义链人工形成NTG-N(7-8)–WGATAR序列或NAG-N(7-8)–WGATAR序列，使γ-珠蛋白基因的调控区形成包含NTG-N(7-8)–WGATAR序列或NAG-N(7-8)–WGATAR序列或对应的反义互补序列的增强子元件；WGATAR序列对应的反义互补序列为YTATCW，其中W为T或A，R为A或G，Y为T或C，所述N为A、G、C或T；
所述方法中使用包含选自SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:26所示序列，或者其反义互补序列的ssODN；
所述方法中使用选自SEQ ID NO：69至SEQ ID NO：75所示序列中的任一种或多种sgRNA。
2.一种用于γ珠蛋白基因调控区基因编辑的组合物，其特征在于，包括ssODN和sgRNA，所述ssODN中含有NTG-N(7-8)–WGATAR序列或NAG-N(7-8)–WGATAR序列或对应的反义互补序列；
WGATAR序列对应的反义互补序列为YTATCW，其中W为T或A，R为A或G，Y为T或C，所述N为A、G、C或T；
所述ssODN为包含SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:22，SEQ IDNO:24，SEQ ID NO:26所示序列，或者其反义互补序列的序列；
所述sgRNA为选自SEQ ID NO：69至SEQ ID NO：75所示序列中的任一种或多种。
3.如权利要求2所述的组合物，其中所述ssODN为选自SEQ ID NO:40至SEQ ID NO:65所示序列，或者其反义互补序列。
4.如权利要求2所述的组合物，其中所述ssODN进行了化学修饰，其5′和3′端是硫代磷酸修饰的核苷酸。
5.如权利要求4所述的组合物，所述基因编辑采用CRISPR-Cas编辑系统进行。
6.如权利要求5所述的组合物，所述CRISPR-Cas编辑系统是CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12系统。
7.如权利要求5所述的组合物，所述组合物中CRISPR-Cas编辑系统是指导RNA以及Cas蛋白组成的核糖核蛋白复合物。
8.如权利要求5所述的组合物，所述组合物中CRISPR-Cas编辑系统是编码Cas蛋白的mRNA以及gRNA组成的RNA复合物。
9.如权利要求5所述的组合物，所述组合物中CRISPR-Cas编辑系统是表达Cas蛋白及gRNA的质粒。
10.如权利要求4所述的组合物，所述sgRNA是化学合成的，或者体外转录的。
11.一种激活γ-珠蛋白基因的试剂盒，其特征在于，包括：
(1)如权利要求2-10任一项所述的组合物；
(2)表达Cas9或Cas12蛋白的载体，Cas9或Cas12蛋白，Cas9或Cas12蛋白对应的mRNA中的至少一种。
12.一种造血干细胞，其特征在于，其通过采用电转方法将如权利要求2-10任一项所述的组合物转入造血干细胞中而得到。
13.如权利要求2-10任一项所述的组合物在制备用于治疗β-地中海贫血或者镰刀型贫血症的细胞或药物中的用途。
14.如权利要求11所述的试剂盒在制备用于治疗β-地中海贫血或者镰刀型贫血症的细胞或药物中的用途。
15.如权利要求12所述的造血干细胞在制备用于治疗β-地中海贫血或者镰刀型贫血症的细胞或药物中的用途。
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