JP2023530969A - γ－グロビン遺伝子発現を活性化する方法、および組成物 - Google Patents

γ－グロビン遺伝子発現を活性化する方法、および組成物 Download PDF

Info

Publication number
JP2023530969A
JP2023530969A JP2022577265A JP2022577265A JP2023530969A JP 2023530969 A JP2023530969 A JP 2023530969A JP 2022577265 A JP2022577265 A JP 2022577265A JP 2022577265 A JP2022577265 A JP 2022577265A JP 2023530969 A JP2023530969 A JP 2023530969A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
ssodn
sequence
gene
seq
sgrna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2022577265A
Other languages
English (en)
Inventor
梁峻彬
古博
徐輝
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Reforgene Medicine Co Ltd
Original Assignee
Guangzhou Reforgene Medicine Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Reforgene Medicine Co Ltd filed Critical Guangzhou Reforgene Medicine Co Ltd
Publication of JP2023530969A publication Critical patent/JP2023530969A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/41—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • A61K38/42—Haemoglobins; Myoglobins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

【課題】本発明は、γ－グロビン遺伝子転写を活性化する新方法を開示する。【手段】本発明は、ＧＡＴＡまたはそのアンチセンス相補配列ＴＡＴＣを含有する一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）をガイド情報として用い、γ－グロビン遺伝子調節領域において遺伝子編集を行ってＧＡＴＡを含有するエンハンサー要素を形成することにより、γ－グロビン遺伝子の成熟した赤血球における発現を促進することができる。本発明に係る技術を利用して遺伝子編集した造血幹細胞は、正常な機能を有し、且つ赤血球に分化した後、胎児ヘモグロビンの発現を顕著に向上させることができるため、β－地中海貧血症および鎌型赤血球貧血症の臨床治療に用いることができる。【選択図】図１

Description

本発明は、遺伝子編集の技術分野に関し、γ－グロビン遺伝子発現を活性化するための方法、組成物およびその使用に関する。当該方法は、ＧＡＴＡまたはそのアンチセンス相補配列ＴＡＴＣを含有する一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）をガイド情報として用い、γ－グロビン遺伝子のプロモーター領域において遺伝子編集を行い、ＧＡＴＡを含有する赤血球系エンハンサー要素を形成することにより、γ－グロビン遺伝子の成熟した赤血球における発現を促進することができる。
ヘモグロビン（ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ、単にＨｂと呼ばれる）は、赤血球内で酸素ガスを携帯し搬送するための特殊なタンパク質である。ヘモグロビンは、グロビン（ｇｌｏｂｉｎ）およびヘムからなる。成人の体内のヘモグロビンは、主に２つのα－グロビンおよび２つのβ－グロビンからなるテトラマー（α２β２）であり、成人ヘモグロビン（ＨｂＡ）と呼ばれる。β－グロビンの遺伝子（ＨＢＢ）の変異は、鎌状赤血球症（Ｓｉｃｋｌｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｅａｓｅ：ＳＣＤ）およびβ－地中海貧血症（β－ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ、単にβ－ｔｈａｌと呼ばれる）を含むβ－ヘモグロビン障害（β－ヘモグロビン症とも呼ばれる）を引き起こす可能性がある。鎌型赤血球貧血症は、β－グロビン構造遺伝子の点変異により引き起こされるものであり、異常のヘモグロビン（ＨｂＳ）を発生することがある。β－地中海貧血症は、β－グロビン遺伝子発現の一部または全部の欠陥により引き起こされるものであり、成人ヘモグロビン（ＨｂＡ）の欠陥または欠損を引き起こすことがある。ヘモグロビンのグロビン鎖の減少または欠損は、ヘモグロビンの構造が異常となることを引き起こす可能性がある。このような異常のヘモグロビンを含有する赤血球は、変形性が低下し、寿命が短く、骨髄中にインサイツ溶血が発生する可能性があり、末梢血液循環に進入した後、脾臓などの臓器により繰り上げて破壊され、貧血、体内の鉄沈着、ひいては発育異常を引き起こす可能性がある。ヘモグロビン症は、世界の数百万の人口に影響を及ぼしており、現在、毎年約３３０，０００の子供がヘモグロビン症で生まれ、人類の健康や生命を深刻に脅かしている。地中海貧血症および鎌状赤血球症の患者は、主に、規範的な長期輸血と脱鉄治療によって病状を緩和するが、このような形態によって病状が治癒できないだけでなく、高いセキュリティリスクが存在している。異体造血幹細胞移植は、現在、地中海貧血症および鎌状赤血球症を根治できる唯一の治療技術であるが、骨髄マッチング成功率が低く、および免疫拒絶リスクが存在するなどの要素の制限により、臨床では、広く適用することが困難である。その為、新たな安全的で有効な治療方法を開発する必要性が大きくなっている。
ヒトの発育過程では、ヘモグロビンは、常に、２つのα－グロビンおよび２つのβ－グロビンの形態で構成されているわけではない。胚の発育期間および出生直後、ヘモグロビンは、２つのα－グロビン鎖および２つのγ－グロビン鎖からなるテトラマーの形態（α２γ２）で存在し、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）と呼ばれ、ＨｂＡに対してより強い酸素親和力を持っている。胎児の発育に伴い、γ－グロビン遺伝子がだんだん発現せずに沈黙するが、同じゲノムサイト付近のβ－グロビン遺伝子の発現がだんだん上昇し、赤ちゃんの生後約半年以降、血液におけるヘモグロビンの成分および割合がだんだん安定し、ＨｂＦが成人ヘモグロビン（ＨｂＡ）で置換され、極めて低いレベルのＨｂＦだけが残されている（総ヘモグロビンの１％以下を占める）。
検討から分かるように、一部の人たちのうち、ある特殊なサイトに変異が現れ、γ－グロビン遺伝子転写が活性化されて、ヘモグロビンにおけるＨｂＦの割合が向上してしまう（遺伝性高胎児ヘモグロビン血症：ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ ｆｅｔａｌ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ、ＨＰＦＨとも呼ばれる）。たとえば、γ－グロビン遺伝子のプロモーター領域において幾つかの異なる種類の変異、たとえば－１１４～－１０２ １３ｂｐ ｄｅｌ ｃ ．、４ｂｐ ｄｅｌ ｃ ．－２２５～－２２２、ｃ ．－１１４Ｃ＞Ｔ、ｃ ．－１１７Ｇ＞Ａ、ｃ ．－１５８Ｃ＞Ｔ、ｃ ．－１６７Ｃ＞Ｔ、ｃ ．－１７０Ｇ＞Ａ、ｃ ．－１７５Ｔ＞Ｇ、ｃ ．－１７５Ｔ＞Ｃ、ｃ ．－１９５Ｃ＞Ｇ、ｃ ．－１９６Ｃ＞Ｔ、ｃ ．－１９８Ｔ＞Ｃ、ｃ ．－２０１Ｃ＞Ｔなどが発見されている。これらの自然に存在する変異は、異なる程度でＨｂＦの総ヘモグロビンに対する割合を向上させることができる。臨床検討から分かるように、少数のβ－地中海貧血症または鎌型赤血球貧血症の患者は、ゲノムにＨＰＦＨ変異がちょうどよく存在するため、ＨｂＦの発現がＨｂＡの不足を補い、ある程度で患者の貧血病状を軽減または緩和したり、輸血のニーズを低減したりすることができる。この発見に啓発されると、科学者らは、β－ヘモグロビン症を治療する目的を達成するために、継続して各種のＨｂＦ発現を誘導可能な方法を探索している。たとえば、現在、臨床ではヒドロキシ尿素などの薬物を用いてＨｂＦ発現を誘導してβ－ヘモグロビン症を治療することがあるが、数多くの患者に対してＨｂＦの誘導レベルが低く、患者の状況を徹底的に改善することができない。
遺伝子編集技術は、ヘモグロビン症などの遺伝病の治療に対して新希望および新方法をもたらしている。近年、遺伝子編集技術は、画期的な開発し、ゲノムにおける特定のサイトの塩基配列を人為的に変更することが可能となるとともに、ますます容易になる。現在、発展が相対的に成熟した遺伝子編集技術は、ＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ）、ＴＡＬＥＮ（転写活性因子様エフェクターヌクレアーゼ）およびＣＲＩＳＰＲ（クラスター化され、規則的に間隔が空いている短い回文の反復）／Ｃａｓシステム（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）である。特異の遺伝子編集システムを設計し、生細胞における目標ゲノムＤＮＡサイトを切断して二本鎖切断（ＤＳＢ）を形成することにより、細胞が非相同末端結合（ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ：ＮＨＥＪ）修復仕組みを利用して、ＤＮＡ欠陥を修復し、配列の挿入、欠損、塩基置換などの変異をランダム形成することができる。たとえば、遺伝子編集を行うと同時に、人為的に設計されたＤＮＡドナーテンプレート（ｄｏｎｏｒ ｔｅｍｐｌａｔｅ）を提供することにより、細胞が相同組換え修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ：ＨＤＲ）仕組みを利用して修復を完成することで、目標サイトに所望する塩基変異形態を導入することができる。
現在、遺伝子編集によって赤血球におけるＨｂＦ発現を補強する治療策略としては、国際的に幾つかの異なる方法がある。（１）ヒト２番染色体におけるＢＣＬ１１Ａ遺伝子のイントロンにおける赤血球系エンハンサー要素を削除または破壊し、赤血球におけるＢＣＬ１１Ａの発現を低減させ、ＢＣＬ１１Ａのγ－グロビン遺伝子転写に対する抑制作用を解除する。（２）γ－グロビン遺伝子のプロモーター領域における一部の配列を削除または破壊し、転写抑制因子の結合を阻止したり、自然に存在するＨＰＦＨ変異種類、たとえば－１１４～－１０２サイトの１３塩基対の削除（１３ｂｐ ｄｅｌ ｃ．）を導入したりする。（３）３．５ｋｂ～１３．６ｋｂの大きなセグメントのＤＮＡ削除を製造し、γ－グロビン遺伝子とβ－グロビンとの間の不明の抑制因子を含有する配列を削除して、γ－グロビン遺伝子が遠端ＬＣＲエンハンサーと結合することを促進する。これらの方法は、ＨｂＦ発現を活性化する効果を示しているが、その長期間効果または／および安全性がまだ明確ではなく、新たな方法をさらに開発する必要がある。
本発明は、遺伝子編集によってγ－グロビン遺伝子転写を活性化する方法を提供する。本発明は、ＧＡＴＡまたはそのアンチセンス相補配列ＴＡＴＣを含有する一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を利用して、遺伝子編集技術（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子編集システム）によって、γ－グロビン遺伝子のプロモーター領域における適当な箇所に少数の塩基の変異（削除、置換、挿入など）を製造し、編集した後にγ－グロビン遺伝子のプロモーター領域のセンス鎖またはアンチセンス鎖にＧＡＴＡを含有する赤血球系エンハンサー要素、例えば、ＮＴＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡＲまたはＮＡＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡＲの配列構造を形成することで、γ－グロビン遺伝子の成熟した赤血球における転写を促進し、赤血球におけるＨｂＦ発現を向上させることができる。そのうち、Ｗは、ＴまたはＡであり、Ｒは、ＡまたはＧであり、Ｎは、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴであり、ＣまたはＴであることがより好ましい。Ｎ（７－８）とは、７～８個の任意の塩基を指す。
図１に示すように、本発明の原理は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓなどの遺伝子編集技術に基づき、本発明に係る一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を結び付けて、ＣＤ３４＋造血幹細胞などの赤血球分化能力を有する幹細胞、前駆細胞に対して効率的な遺伝子編集を行い、コードされたヒトγ－グロビンのＨＢＧ１及びＨＢＧ２遺伝子（ヒト１１番染色体に位置する）プロモーターにおいて変異を製造し、プロモーターのセンス鎖またはアンチセンス鎖において１つのＮＴＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡＲまたはＮＡＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡＲの配列構造を人為的に創造する。当該配列は、エンハンサーとして、目的細胞が赤血球に分化した後にＧＡＴＡ１などの活性化因子を募集してγ－グロビン発現を促進することである。
本発明は、ＧＡＴＡまたはＴＡＴＣ配列を含有するｓｓＯＤＮを提供する。当該ｓｓＯＤＮは、γ－グロビン遺伝子の遺伝子編集に用いることができる。本発明では、ｓｓＯＤＮ構造には、５′相同アーム、置換配列、３′相同アームが含まれる。そのうち、ＧＡＴＡまたはＴＡＴＣ配列は、ｓｓＯＤＮにおける任意の箇所、たとえば置換配列、５′相同アーム、３′相同アーム、及び５′相同アームと置換配列との結合箇所、３′相同アームと置換配列との結合箇所に位置してもよい。片側の相同アームの長さは、２０～３００ｎｔであってもよい。本発明の実施例において、ｓｓＯＤＮ相同アームの長さは、４０ｎｔ程度である。本発明の一部の実施例において、ＧＡＴＡまたはＴＡＴＣ配列が含まれたｓｓＯＤＮは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５で表される配列から選ばれる。そのうちの一部の実施例において、ｓｓＯＤＮの５′および３′は、チオリン酸（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）で修飾されたものである。
本発明は、γ－グロビン遺伝子編集用組成物を開示する。当該組成物には、ｓｓＯＤＮ、ｓｇＲＮＡ、およびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼが含まれる。本発明の一部の実施例において、前記遺伝子編集システムにおけるｓｇＲＮＡ標的サイトがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９で表される配列に位置する。本発明の一部の実施例において、前記ｓｇＲＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６で表される配列である。本発明の一部の実施例において、前記Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９タンパク質である。
本発明は、γ－グロビン遺伝子編集用電気的転写方法を開示する。当該方法は、電気的穿孔技術を用いて、ｓｓＯＤＮ、ｓｇＲＮＡ、およびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼからなる組成物をヒト造血幹細胞に効率的にトランスフェクションし、効率的な遺伝子編集を誘導する。
本発明は、造血幹細胞をさらに開示する。電気的転写方法を用いて、上記ｓｓＯＤＮ、ｓｇＲＮＡ、およびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼを含む組成物を造血幹細胞に導入し、当該細胞におけるγ－グロビン遺伝子のプロモーター領域に活性ＧＡＴＡ要素が含まれ、赤血球に分化する際にγ－グロビン遺伝子の発現を向上させることができる。
従来技術と比べ、本発明は、以下の有益な効果を有する。
本発明に係るｓｓＯＤＮは、遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮなど）と共に細胞に導入されることにより、γ－グロビン遺伝子のプロモーター領域の遺伝子編集をガイドして、特定のサイトに変異して活性化作用を有するＧＡＴＡ要素を形成することができる。本発明の一部の実施例において、電気的転写技術を用いてｓｓＯＤＮおよびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子編集システムをヒト造血幹細胞に導入し、γ－グロビン遺伝子のプロモーター領域において効率的な遺伝子編集を取得し、特定のサイトに変異を導入して所望するＧＡＴＡを含有する赤血球系エンハンサー要素を形成し、当該造血幹細胞が赤血球に分化した後、γ－グロビン遺伝子の発現が顕著に向上し、ヘモグロビンにおけるＨｂＦの割合が顕著に向上することができる。
本発明の技術原理を示す図である。 （Ａ）遺伝子編集標的領域ＨＢＧ１およびＨＢＧ２遺伝子－９２～－６６の間の野生株配列、用いられるｇＲＮＡ標的配列の位置、および遺伝子編集後に所望する変異配列を示す図である。 （Ｂ）遺伝子編集標的領域ＨＢＧ１およびＨＢＧ２遺伝子－１２９～－９８の間の野生株配列、用いられるｇＲＮＡ標的配列の位置、および遺伝子編集後に所望する変異配列を示す図である。 （Ｃ）遺伝子編集標的領域ＨＢＧ１およびＨＢＧ２遺伝子－１７５～－１５３の間の野生株配列、用いられるｇＲＮＡ標的配列の位置、および遺伝子編集後に所望する変異配列を示す図である。 （Ｄ）遺伝子編集標的領域ＨＢＧ１およびＨＢＧ２遺伝子－１９２～－１６０の間の野生株配列、用いられるｇＲＮＡ標的配列の位置、および遺伝子編集後に所望する変異配列を示す図である。 （Ｅ）遺伝子編集標的領域ＨＢＧ１遺伝子－４２８～－４０６およびＨＢＧ２遺伝子－４３２～－４１０の間の野生株配列、用いられるｇＲＮＡ標的配列の位置、および遺伝子編集後に所望する変異配列を示す図である。 ２９３Ｔ細胞においてＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓプラスミドをトランスフェクションすることによるＨＢＧ１およびＨＢＧ２ゲノムの編集効率データを示す図である。前記データは、２９３Ｔ細胞においてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００TMでＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓプラスミドを４日間トランスフェクションした後のゲノムＤＮＡのＩＮＤＥＬ検出結果からのものである。図において挿入欠損変異全体の占める百分率（総変異％）が示される。 ２９３Ｔ細胞においてＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓプラスミドをｓｓＯＤＮとともにトランスフェクションすることによるＨＢＧ２ゲノムの編集効率データを示す図である。前記データは、２９３Ｔ細胞においてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００TMでＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓプラスミドおよびｓｓＯＤＮを４日間トランスフェクションした後のＨＢＧ２のＩＮＤＥＬ検出結果からのものである。 Ｋ５６２細胞においてＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓプラスミドをｓｓＯＤＮとともにトランスフェクションすることによるＨＢＧ２ゲノムの編集効率データを示す図である、前記データは、Ｋ５６２細胞においてＬｏｎｚａ ４Ｄ電気的穿孔でＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓプラスミドおよびｓｓＯＤＮを４日間トランスフェクションした後のＨＢＧ２のＩＮＤＥＬ検出結果からのものである。 Ｋ５６２細胞において電気的転写でリボヌクレオチドタンパク質（ＲＮＰ）およびｓｓＯＤＮを導入した後のＨＢＧ２ゲノムの編集効率データを示す図である。前記データは、ｓｓＯＤＮおよびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ／ｓｇＲＮＡ ＲＮＰが電気的穿孔でＫ５６２細胞に導入された後の４日間後のＨＢＧ２のＩＮＤＥＬ検出結果からのものである。 （Ａ）～（Ｃ）は動員末梢血ＣＤ３４＋細胞（ｍＰＢＳＣ）において電気的転写でＲＮＰおよびｓｓＯＤＮが導入された後のＨＢＧ２遺伝子の編集効率データを示す図である。前記データは、ｓｓＯＤＮおよびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ／ｓｇＲＮＡ ＲＮＰが電気的穿孔でｍＰＢＳＣに導入されて、赤血球の分化を誘導した後の５日間後のゲノムＤＮＡのＩＮＤＥＬ検出結果からのものである。（Ａ）および（Ｂ）は、ｓａｎｇｅｒシーケンシングマップであり、（Ｃ）は、ｓｙｎｔｈｅｇｏソフトウェアにより分析されたＩＮＤＥＬ割合結果である。 動員末梢血ＣＤ３４＋細胞（ｍＰＢＳＣ）において遺伝子編集された後のγ－グロビンｍＲＮＡ発現データを示す図である。前記データは、ｓｓＯＤＮおよびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ／ｓｇＲＮＡ ＲＮＰが電気的穿孔でｍＰＢＳＣに導入された後、赤血球の分化を誘導した後の１８日間後のｍＲＮＡのｑＲＴ－ＰＣＲ検出結果からのものである。図において、γ－グロビンｍＲＮＡの発現は、ＧＡＰＤＨ発現レベルを内部参照として、編集しない細胞におけるγ－グロビンｍＲＮＡの発現を参照として標準化を行い、そのうち、ｎ＝３である。 動員末梢血ＣＤ３４＋細胞（ｍＰＢＳＣ）において遺伝子編集された後のＨｂＦ発現データを示す図である。前記データは、ｓｓＯＤＮおよびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ／ｓｇＲＮＡ ＲＮＰが電気的穿孔でｍＰＢＳＣに導入された後、赤血球の分化を誘導した後の１８日間後のＨＰＬＣでヘモグロビンを検出した検出結果からのものである。図において、ＨｂＦ発現は、総ヘモグロビンを占める百分率である。
以下、本発明を容易に理解するために、関連図面を参照しながら、本発明についてより詳しく説明する。図面において本発明の好適な実施例が示される。しかし、本発明は、数多くの異なる形態で実現することができ、本明細書に記載される実施例に限定されない。逆に、これらの実施例の提供は、本発明に係る内容に対する理解をより徹底的、全面的にすることを目的とする。
別途定義されない限り、本明細書に使用する全ての技術的用語及び科学的用語は、本発明の技術分野に属する当業者が通常理解できるものと同じ意味を有する。本明細書において、本発明の説明書に使用する用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、本発明を限定するものではない。本明細書に使用する用語「および／または」は、１つ又は複数の関連した項目における任意のもの、およびすべての組合せを含む。
以下の実施例に用いられる原料は、いずれも市販されたものである。
本明細書では、遺伝子編集技術、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ誘導遺伝子編集技術を用い、本発明に係る一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を結び付けて、ＣＤ３４＋造血幹細胞などの赤血球の分化能力を有する幹細胞、前駆細胞に対して効率的な遺伝子編集を行い、コードされたヒトγ－グロビンのＨＢＧ１およびＨＢＧ２遺伝子（ヒト１１番染色体に位置する）プロモーターにおいて変異を製造し、プロモーターのセンス鎖またはアンチセンス鎖において１つのＮＴＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡＲまたはＮＡＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡＲの配列構造（図１）を人為的に創造する。当該配列は、エンハンサーとして、目的細胞が赤血球に分化した後にＧＡＴＡ１などの転写活性化因子を募集してγ－グロビン発現を促進することができる。
ＧＡＴＡ－１は、赤血球システムにおいて特異性高発現の転写調節因子であり、赤血球の分化過程で重要な役割を果たす。赤血球において、α－グロビン、β－グロビン、ヘム生合成酵素などの赤血球における特異性高発現の遺伝子がいずれもＧＡＴＡ－１により直接的に転写して活性化される。ＧＡＴＡ－１は、転写因子として、選択的に染色質ＤＮＡにおけるＷＧＡＴＡＲ配列要素（そのうち、Ｗは、ＴまたはＡを代表し、Ｒは、ＡまたはＧを代表し、Ｔ／Ａ（ＧＡＴＡ）Ａ／Ｇで表されてもよく、そのアンチセンス相補配列は、ＹＴＡＴＣＷであり、そのうち、Ｙは、ＴまたはＣを代表し、Ｔ／Ｃ（ＴＡＴＣ）Ｔ／Ａで表されてもよい）に結合し、例えば、ヒトβ－グロビン遺伝子の調節領域にも複数のＧＡＴＡサイトが発見されている。注意すべきことに、ＧＡＴＡ配列を含有する遺伝子がＧＡＴＡ－１により活性化されるわけではない。それは、ＧＡＴＡ配列のゲノムにおける分布が非常に広く、上流・下流の配列（シス要素）と一定の形態の配列組合せ（要素組合せ）を形成して役割を果たす必要があるからである。例えば、ＧＡＴＡ配列の付近にＣＡＣＣＣまたはＧＣボックスなどのシス調節要素があり、通常、ＧＡＴＡ－１を募集して転写因子ＥＫＬＦと共同結合することができる。例えば、ＧＡＴＡ配列の付近にＥ－ｂｏｘ要素（ＣＡＧＮＴＧ、Ｎは、任意の塩基を代表する）、またはｈａｌｆ Ｅ－ｂｏｘ要素（ＮＴＧ）があれば、ＧＡＴＡ－１を募集して転写因子ＴＡＬ１と共同結合する。ＣｈＩＰ－ｓｅｑによりゲノムレベルＧＡＴＡ－１とＴＡＬ１の結合サイトを検討することによれば、約四分の三のＧＡＴＡ－１／ＴＡＬ１の共結合サイトに明らかな配列規律が存在し、ＷＧＡＴＡ配列の上流における７～８塩基に往々にしてｈａｌｆ Ｅ－ｂｏｘ要素（ＮＴＧ）が存在し、ＮＴＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡで表されてもよい。試験によると、このような配列が活性ＧＡＴＡ要素であり、赤血球における遺伝子の発現を促進することができることが証明される。例えば、ＢＣＬ１１Ａイントロンにおける＋５８エンハンサーには、ＣＴＧ－Ｎ（７）－ＴＧＡＴＡＡ配列が含まれ、当該配列におけるＧＡＴＡモチーフを破壊することにより、赤血球におけるＢＣＬ１１Ａの発現を顕著に低下させることができる。
ＨＢＧ１およびＨＢＧ２遺伝子の転写開始サイトの上流における１４００塩基の配列は、類似度が非常に高く、プロモーター領域と考えられる。本願の発明者らは、検討によって、γ－グロビン遺伝子のプロモーター領域自身に複数のＧＡＴＡ配列（またはＴＡＴＣ）が含まれると同時に、非常に多くのＴＧ配列が含まれるが、γ－グロビンが成熟した赤血球においてほとんど発現しないことを発見する。本願の発明者らは、鋭意検討によって、γ－グロビン遺伝子のプロモーターにおけるＧＡＴＡ（またはＴＡＴＣ）及びＴＧ配列が位置と方向に有効な活性ＧＡＴＡ要素（例えばＴＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡＲ）を形成しないので、ＧＡＴＡ－１／ＴＡＬ１などの成熟した赤血球における高発現の転写活性化因子を募集してγ－グロビン遺伝子のプロモーター領域に結合（共結合）することができず、γ－グロビンが成熟した赤血球に沈黙し、ほとんど発現しないことを発見する。
本願の発明者らは、鋭意検討によって、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２プロモーター領域に一部のサイトが存在し、そのセンス鎖またはアンチセンス鎖における配列が少数の塩基で変更（置換、削除、挿入など）されれば、ＮＴＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡＲまたはＮＡＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡＲの配列構造を形成することができることを発見する。本願の発明者らは、遺伝子編集システムを用いてこれらのサイトを切断してＤＳＢを形成すれば、供与体ＤＮＡテンプレート（例えば、一本鎖オリゴヌクレオチド ｓｓＯＤＮ）を添加してこれらのサイトがＨＤＲ修復を行うようにガイドすることにより、一定の割合のゲノムを所望する配列構造に編集し、最終、γ－グロビン遺伝子のプロモーター領域においてＮＴＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡＲまたはＮＡＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡＲのような配列が形成されているので、エンハンサーとしてＧＡＴＡ－１／ＴＡＬ１などの成熟した赤血球における高発現の転写活性化因子を募集してγ－グロビン遺伝子のプロモーター領域に結合（共結合）することで、γ－グロビンの成熟した赤血球における高発現を促進することができると考える。
目的から見ると、遺伝子編集は、２種類に分けられる。１種類は、標的サイトの配列または構造を破坏するものであり、ノックアウト（ｋｎｏｃｋ ｏｕｔ）と呼ばれる。他の１種類は、標的サイトに特定の配列変異を導入するものであり、ノックイン（ｋｎｏｃｋ ｉｎ）と呼ばれる。特定の配列変異を導入する場合、よく見られる方法は、１つのＤＮＡドナーテンプレートを同時に導入することにより、細胞が相同組み換えの仕組みを利用して、テンプレートにおける配列をゲノムに置換し、ノックインを実現することができるものである。ＨＤＲに用いられるＤＮＡテンプレートは、プラスミドＤＮＡ、線形化二本鎖ＤＮＡ、ＡＡＶにより搬送されたＤＮＡ、または一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）であってもよい。ｓｓＯＤＮは、遺伝子編集における使用がますます多くなり、その効率が高く、合成しやすく、特に体外培養細胞における遺伝子編集に適用される。
ｓｓＯＤＮ構造には、５′相同アーム、置換配列、３′相同アームが含まれる。相同アームは、編集待ちの標的サイトの両側におけるＤＮＡ領域と相同する配列であり、染色体における目標サイトに位置決めするために用いられる。５′相同アームおよび３′相同アームは染色体において対応する配列が位置的に通常連続せず、中間で一定の間隔、例えば１～２０のヌクレオチドの間隔がある。これらの間隔配列は、遺伝子編集の標的（擬似編集配列）であり、すなわち、遺伝子編集により置換された配列である。ｓｓＯＤＮ上５′相同アームの３′末端と３′相同アームの５′末端との間の「置換配列」は、遺伝子編集が所望する結果である。遺伝子編集しながら、ｓｓＯＤＮを添加して、遺伝子編集時の相同組み換え修復を誘導し、修復の結果から、細胞ゲノムにおける擬似編集配列が置換配列に修復されることができる。ｓｓＯＤＮにおける置換配列の長さは、擬似編集配列よりも小さくてもよい。この場合、遺伝子編集の結果は、元のゲノムにおける擬似編集配列の削除または／および置換である。ｓｓＯＤＮにおける置換配列の長さは、０塩基であってもよい。この場合、ゲノムにおける擬似編集配列が削除される。ｓｓＯＤＮにおける置換配列の長さは、擬似編集配列よりも大きくてもよい。この場合、遺伝子編集の結果は、擬似編集配列が置換または／および挿入されるものである。
本発明は、「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ」、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮなどのサイト特異性ヌクレアーゼにより誘導される遺伝子編集システムに用いられる。「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ」は、遺伝子編集技術であり、様々な自然に存在するかまたは人為的に設計されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２システムなどを含むがそれらに限定されない。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の動作原理は、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ－ｄｅｒｉｖｅｄ ＲＮＡ）が塩基ペアリングによりｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＲＮＡ）と結合してｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ複合体を形成し、この複合体は、ヌクレアーゼＣａｓ９タンパク質がｃｒＲＮＡとペアリングした配列標的サイトに二本鎖ＤＮＡをせん断するようにガイドする。ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡの作用は、人為的に合成された、ガイド作用を有する一本のｓｇＲＮＡで代替することができる。他のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを使用する時に、対応するｓｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡを設計する必要がある。ＴＡＬＥＮまたはＺＦＮなどのシステムを使用する時に、本発明に係る編集サイトに基づいて対応するＴＡＬＥＮまたはＺＦＮヌクレアーゼを設計する必要がある。
実施例１：活性ＧＡＴＡ要素をγ－グロビン遺伝子のプロモーターに導入するためのｓｓＯＤＮおよびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの選別
ＨＢＧ１およびＨＢＧ２転写開始サイトの上流における約１．４ｋｂ内の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １おいよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を分析することにより、発明者は、多くのセクターにおける配列が、幾つかの塩基で変更され（置換、削除、挿入など）、ＮＴＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡＲまたはＮＡＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡＲの配列構造を形成することができることを発見した。これらのセクターにおける目標変異塩基の付近にＮＧＧ（ｓｐＣａｓ９で識別されたＰＡＭ）配列があるか否か、および切断点が編集する必要のある目標配列にちょうどよく位置するか否かを分析することにより、最終に効率的な遺伝子編集を実現する可能性が最も高い候補標的領域（図２の（Ａ）～（Ｅ））を５つ取得した。距離に応じて、転写開始サイトは、近いから遠いまで、それぞれ以下の通りである。１番領域：ＨＢＧ１およびＨＢＧ２プロモーター－９２～－６６（図２の（Ａ））、２番領域：ＨＢＧ１およびＨＢＧ２プロモーター－１２９～－９８（図２の（Ｂ））、３番領域：ＨＢＧ１およびＨＢＧ２プロモーター－１７５～－１５３（図２の（Ｃ））、４番領域：ＨＢＧ１遺伝子およびＨＢＧ２遺伝子－１９２～－１６０（図２の（Ｄ））、５番領域：ＨＢＧ１遺伝子－４２８～－４０６、およびＨＢＧ２遺伝子－４３２～－４１０（図２の（Ｅ））。
５つの候補領域内の自身の配列特徴、およびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集システムが予測する切断点の箇所によれば、分析して各領域内の配列が適当な変異目標タイプ、例えば、表１に示すもの（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３ ～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）を取得した。そのうち、下線は、置換の必要がある塩基を示し、遺伝子編集後に所望する結果である。本発明において、置換塩基の長さが０～６塩基であり、実現する効果は、削除、置換、挿入、または削除、置換、挿入の組合せである。
表１に選ばれた領域内の編集サイトの付近にＤＮＡ二本鎖を切断してＤＳＢを形成する目的を達成するために、本発明は、切断効率が高いｓｐＣａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する）を選択し、切断効率が高い可能性がある標的サイトを分析し、ｓｉｔｅ＿１～ｓｉｔｅ＿８を候補標的サイトとして選択した。識別した標的サイトＤＮＡ配列およびＰＡＭ配列（ＮＧＧ）は表２に示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２ ～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）。
表１に示される所望変異タイプ、および表２におけるｓｇＲＮＡで識別されたＤＮＡ鎖（センス鎖またはアンチセンス鎖）によれば、対応するガイド遺伝子編集を設計してｓｓＯＤＮ（表３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０ ～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５）を修復した。本発明におけるｓｓＯＤＮ構造には、５′相同アーム、置換配列、３′相同アームが含まれた。そのうち、ＧＡＴＡまたはＴＡＴＣ配列は、ｓｓＯＤＮにおける任意の箇所、たとえば置換配列、５′相同アーム、３′相同アーム、および５′相同アームと置換配列との結合箇所、３′相同アームと置換配列との結合箇所に位置してもよい。ｓｓＯＤＮ両側における相同アームは、対称的であってもよいし、非対称的であってもよい（両側における長さが異なる）。システムの比較の利便性のために、本発明において対称的な相同アームのｓｓＯＤＮを用いて試験を行った。ｓｓＯＤＮ両側における相同アームの長さが２０～３００ｎｔであってもよい。システムの比較の利便性のために、本発明の実施例において両側における相同アームの長さが約４０ｎｔのｓｓＯＤＮを用いて例示した。ｓｓＯＤＮは、編集領域ＤＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖であってもよく（相同アーム配列が対応するセンス鎖と同一であるか、アンチセンス鎖と同一である）、本発明におけるｓｓＯＤＮは、ｓｇＲＮＡの識別サイトと同一のＤＮＡ鎖をｓｓＯＤＮマスタ配列として選択した。ｓｓＯＤＮにおける配列は、両側における相同アーム配列以外、置換塩基が０、１、２、３、４、５、６の塩基であってもよく、実現した効果は、削除、置換、挿入、または削除、置換、挿入の組合せである。実現した効果は、ゲノムにおける１つ以上の塩基を変更すること、例えば１～２０塩基の削除または置換であってもよい。表３に示す配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０ ～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５）については、下線に示される塩基は、両側における相同アームであり、長さが４０ｎｔ程度であり、両側における相同アーム間の下線で示されていない塩基は、置換塩基であり、そのうち、ｓｓＯＤＮ＿１６の両側における相同アーム間の置換塩基が０である。ｓｓＯＤＮの両端における最初の３つのヌクレオチドは、チオリン酸（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）で修飾されてｓｓＯＤＮの安定性を補強し、その遺伝子編集における活性を向上させることができる。
ｓｇＲＮＡ－ｓｐＣａｓ９担体（ＰＸ４５９、ｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）－２Ａ－Ｐｕｒｏ）を用いて表２における標的サイトに対応するｓｇＲＮＡを発現した。当該担体は、ｓｐＣａｓ９タンパク質を発現しながら、長さが１００ｎｔのｓｇＲＮＡを発現することができる。その５′端は、２０ｎｔのガイド配列である。後の８０ｎｔは、汎用のｓｇＲＮＡ骨格配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡ ＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ）である。ｓｇＲＮＡのクローン方法は、それぞれｇＲＮＡに対応するガイド鎖配列ｏｌｉｇｏ（表２における２０ｎｔ標的サイト配列と同様）および相補鎖ｏｌｉｇｏを合成した（ガイド鎖配列の５′端にｃａｃｃを導入し、ガイド鎖の５′端における１番目のヌクレオチドがグアニンＧではなければ、ガイド鎖の５′端にｃａｃｃＧを添加し、相補鎖の５′端にａａａｃを導入し、ガイド鎖の５′端に１つのＧが添加されれば、相補鎖の３′端にＣを添加してそれと相補しペアリングした）。２種類のｏｌｉｇｏを同等混合し、９５℃で熱変形焼鈍処理を行った後、制限酵素Ｂｂｓ Ｉで消化されたＰＸ４５９担体に連結し、細菌コロニーＰＣＲおよびｓａｎｇｅｒシーケンシングでクローンに成功したか否かを確定した。ＰＣＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７（５′－ ３′： ＧＧＡＣＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＴＴＡＣＣＧＴＡＡＣ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８（５′－ ３′： ＧＧＣＧＧＧＣＣＡＴＴＴＡＣＣＧＴＡＡＧ）をプライマーとして用いた。クローンに成功した後、８種類のプラスミドを取得し、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６のｓｇＲＮＡを発現した（表４）。
発現された８種類のプラスミドを２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。その方法は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００TMキットの方法をご参照ください。トランスフェクションした細胞を４日間培養し、細胞を収集してゲノムＤＮＡを抽出した。それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８を用いて、ＫＯＤ Ｐｌｕｓ高忠実度酵素ＰＣＲ法でＨＢＧ１およびＨＢＧ２プロモーター遺伝子セグメントを拡張し、得たＰＣＲ生成物を精製した後、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９を用いてシーケンシングを行った。シーケンシング結果から得たファイルに対して、ｓｙｎｔｈｅｇｏソフトウェアで遺伝子編集効率を分析した。図３に示すように、ｓｇＲＮＡ－８の編集効率が相対的に低い（約２０％）以外、他のグループにおける編集全体変異（挿入欠損、Ｉｎｄｅｌ）効率が４０～５０％程度である。
実施例２： ｓｓＯＤＮをｓｇＲＮＡ－ｓｐＣａｓ９担体とともに２９３Ｔ細胞にトランスフェクションして遺伝子編集を行う
上述した８種類のｓｇＲＮＡ－ｓｐＣａｓ９担体を適当なｓｓＯＤＮとともに２９３Ｔ細胞にトランスフェクションすることにより、ｓｓＯＤＮを添加した後に、遺伝子編集後に所望する変異タイプを形成する（ＨＤＲ修復を発生する）ようにガイドするか否かを検出した。ｓｇＲＮＡ切断点の箇所によれば、８種類のｓｇＲＮＡ－ｓｐＣａｓ９担体を、表６に示されたｓｇＲＮＡ ＋ ｓｓＯＤＮ組合せ方法に応じてそれぞれ３０種類の組合せに形成した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００TM試薬を用いて、プラスミドをトランスフェクションしながらｓｓＯＤＮを添加し、ｓｓＯＤＮをプラスミドとともに細胞に搬送した。トランスフェクションした細胞を４日間培養し、細胞を収集してゲノムＤＮＡを抽出した。ＨＢＧ１およびＨＢＧ２の遺伝子編集効率がほとんど正相関であり、往々してＨＢＧ２の遺伝子編集効率がＨＢＧ１よりもやや高いため（図３）、後続の試験においてＨＢＧ２ゲノム遺伝子編集効率のみを選択して比較した。実施例１における方法によれば、ＰＣＲでＨＢＧ２プロモーター遺伝子セグメントを拡張し、精製してシーケンシングを行った。シーケンシング結果から分かるように、ｓｙｎｔｈｅｇｏソフトウェアで遺伝子編集効率を分析することにより、ｓｓＯＤＮおよびｓｇＲＮＡ－ｓｐＣａｓ９担体を添加してトランスフェクションすることは、編集効率を向上させながら、数多くのグループにおいて１０～２０％の遺伝子編集を誘導して所望する変異タイプを形成することができる（図４）。
実施例３：電気的穿孔でｓｓＯＤＮおよびｓｇＲＮＡ－ｓｐＣａｓ９担体をＫ５６２細胞にトランスフェクションして遺伝子編集を行う
リポソーム（たとえばＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００TM試薬）を利用してプラスミドを懸濁細胞にトランスフェクションする効率が低く、通常、懸濁細胞にトランスフェクションする際に、電気的穿孔法が用いられた。実施例２における一部のｓｇＲＮＡとｓｓＯＤＮの組合せを取り、ｌｏｎｚａ－４Ｄ電気的転写装置でＫ５６２細胞に導入し、装置におけるＫ５６２細胞トランスフェクションプログラムを用いた。トランスフェクションした細胞を４日間培養し、細胞を収集してゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲでＨＢＧ２プロモーター遺伝子セグメントを拡張してシーケンシングを行った。シーケンシング結果から分かるように、ｓｙｎｔｈｅｇｏソフトウェアで遺伝子編集効率を分析し、Ｋ５６２にｓｇＲＮＡ－１、ｓｇＲＮＡ－２、ｓｇＲＮＡ－５とｓｓＯＤＮの組合せを電気的転写することにより、高い編集効率を達することができ（図５）、２９３Ｔ細胞よりもやや高く、ｓｓＯＤＮおよびｓｇＲＮＡ－ｓｐＣａｓ９担体を電気的転写して所望する変異タイプを形成するように誘導することも２９３Ｔ細胞よりもやや高い。
実施例４：電気的穿孔でｓｓＯＤＮおよびｓｐＣａｓ９タンパク質／ｓｇＲＮＡ ＲＮＰをＫ５６２細胞にトランスフェクションして効率的な遺伝子編集を実現する
プラスミド発現ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに対して、リボヌクレオチドタンパク質（ＲＮＰ）の形態で搬送するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、遺伝子編集効率が高く、アポトーシスを誘導しにくい。商業化されたｓｐＣａｓ９タンパク質、および化学合成されたｓｇＲＮＡ－１、ｓｇＲＮＡ－２、ｓｇＲＮＡ－５を用いて（配列が表４に対応するｓｇＲＮＡと同一であるが、末端が化学修飾されておらず）、それぞれ体外にＲＮＰ－１、ＲＮＰ－２、ＲＮＰ－５をインキュベーションし包装した。電気的穿孔でＲＮＰおよび一部のｓｓＯＤＮの組合せをＫ５６２細胞に搬送した。トランスフェクションした細胞を４日間培養し、細胞を収集してゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲでＨＢＧ２プロモーター遺伝子セグメントを拡張してシーケンシングを行った。シーケンシング結果から分かるように、ｓｙｎｔｈｅｇｏソフトウェアで遺伝子編集効率を分析し（図６）、ｓｓＯＤＮが添加されていない組合せに対して、Ｋ５６２にＲＮＰを電気的転写する際にｓｓＯＤＮを添加することにより、遺伝子編集効率全体を顕著に約２倍向上させることができる（図６）。それと同時に、ｓｓＯＤＮおよびＲＮＰは、より高い割合の遺伝子編集を誘導して所望する変異タイプを形成することができる（図６）。
実施例５：電気的穿孔でｓｓＯＤＮおよびｓｐＣａｓ９タンパク質／ｓｇＲＮＡ ＲＮＰをヒト造血幹細胞／前駆細胞に導入して効率的な遺伝子編集を実現し、ＨＢＧ発現を顕著に向上させる
動員末梢血に由来するヒトＣＤ３４陽性細胞（ｍＰＢＳＣ）が蘇生した後、ヒト細胞因子（ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌ、各１００ｎｇ／ｍｌ）をたくさん含んだＳｔｅｍＳｐａｎ無血清拡張培地（ＳＦＥＭ）に２日間培養し、ｌｏｎｚａ－４Ｄ電気的転写装置におけるＥＯ－１００プログラムでｓｓＯＤＮおよびｓｐＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ ＲＮＰにｍＰＢＳＣ細胞に搬送した。電気的転写が完了した後、ヒト細胞因子（ＳＣＦ／ＴＰＯ／Ｆｌｔ３Ｌ、各１００ｎｇ／ｍｌ）をたくさん含んだＳＦＥＭにおいて継続して１日間培養した後、以下の３つの段階でｍＰＢＳＣが赤血球に分化するように誘導した。第１段階：ＥＰＯ、ＳＣＦ、ヒトＡＢ血清、インシュリン、トランスフェリン、ヘパリン、ＩＬ－３、水素化コルチゾンなどの添加物を含有するＩＭＤＭ培養液に７日間培養した。分化を誘導した後の５日目、２×１０ｅ５細胞を取ってゲノムＤＮＡを抽出した後、ＰＣＲでＨＢＧ２プロモーターセグメントを拡張し、ｓａｎｇｅｒに搬送してシーケンシングを行った。Ｋ５６２細胞における結果と類似し、ｍＰＢＳＣ細胞にｓｓＯＤＮおよびｓｐＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ ＲＮＰを電気的転写することは、効率的な遺伝子編集を発生することができ、そのうちの一部のグループにおいて遺伝子編集で所望する変異タイプを形成することが３０％に達した（図７の（Ａ）～（Ｃ））。
電気的転写されたｍＰＢＳＣ細胞、および処理されていないｍＰＢＳＣ細胞（対照、ＮＣ）が第１段階に分化誘導された後の７日後、ＥＰＯ、ＳＣＦ、ヒトＡＢ血清、インシュリン、トランスフェリン、ヘパリンなどの添加物を含有するＩＭＤＭ培養液に４日間培養した。最後、ＥＰＯ、ヒトＡＢ血清、インシュリン、トランスフェリン、ヘパリンなどの添加物を含有するＩＭＤＭ培養液に７日間培養した。分化誘導した後の１８日後、電気的転写されたｍＰＢＳＣ細胞、および処理されていないｍＰＢＳＣ細胞が遠心後に明らかな濃赤色を示した。そのうち、大量の赤血球を含有し、電気的転写されたｍＰＢＳＣ細胞が正常に赤血球に分化できることが証明された。
分化誘導が終わりに近づくと、一部の細胞を取ってｍＲＮＡを抽出し、逆転写－リアルタイム定量化ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）でＨＢＧ ｍＲＮＡの発現レベルを検出した。トランスフェクションされていない細胞（ＮＣ）に対して、ＲＮＰ－２をｓｓＯＤＮ＿６、ｓｓＯＤＮ＿１３、ｓｓＯＤＮ＿１４、ｓｓＯＤＮ＿１５、ｓｓＯＤＮ＿１７とともにトランスフェクションすることにより、ＨＢＧ ｍＲＮＡの発現レベルを向上させ（図８）、ＨＢＧ ｍＲＮＡが最も高く３倍以上向上することができる。
糖化ヘモグロビンＡ１ｃ検出システム（ＶＡＲＩＡＮＴ ＩＩ ＴＵＲＢＯ ＨｂＡ１ｃ ｋｉｔ－２．０）を用いて、ＲＮＰ－２グループに電気的転写された造血幹細胞を赤血球に分化させた後のヘモグロビンに対してＨＰＬＣ法検出を行った。その結果、遺伝子編集されていない細胞に対して、ｓｓＯＤＮが添加されて遺伝子編集された後、胎児ヘモグロビンの含有量（ＨｂＦ）が顕著に向上し、２７％～３６％であり、対照グループの１３．３％に対して２倍以上向上した（図９）。
上記実施例の結果から分かるように、本発明は、従来技術と異なるγ－グロビン遺伝子発現を向上させる遺伝子編集方法を提供する。本発明に係るｓｓＯＤＮは、γ－グロビン遺伝子編集に用いられる場合、遺伝子編集した後にＨＢＧ１およびＨＢＧ２遺伝子調節領域における所定のサイトに所望する変異を形成するようにガイドすることで、活性ＧＡＴＡ要素を形成することができる。当該要素は、遺伝子編集された細胞（たとえば、造血幹細胞）が赤血球に分化した後に正の調節作用を果たし、γ－グロビン遺伝子発現を活性化させたり、顕著に向上させたりすることができる。その為、本発明は、β－ヘモグロビン症の遺伝子治療において潜在的な適用価値を有する。
上記実施形態の各技術的特徴は、任意に組み合わせることができる。説明を簡単にするために、上記各実施形態における各技術的特徴の全ての組合可能な形態については記載されていないが、これら技術的特徴の組み合わせに矛盾がない限り、本明細書に記載の範囲とみなされるべきである。
上述した実施例は、本発明のいくつかの実施形態の例示にすぎず、その説明は、具体的且つ詳細であるが、本発明の範囲を限定するものではないと理解すべきである。当業者であれば、本発明の思想から逸脱しない前提で、いくつかの変形及び改善を行うことができ、これらはすべて本発明の保護範囲に属することは明らかである。したがって、本発明の保護範囲は、請求の範囲により決定されるべきである。
本発明は、遺伝子編集の技術分野に関し、γ－グロビン遺伝子発現を活性化するための方法、組成物およびその使用に関する。
ヘモグロビン（ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ、単にＨｂと呼ばれる）は、赤血球内で酸素ガスを携帯し搬送するための特殊なタンパク質である。ヘモグロビンは、グロビン（ｇｌｏｂｉｎ）およびヘムからなる。成人の体内のヘモグロビンは、主に２つのα－グロビンおよび２つのβ－グロビンからなるテトラマー（α２β２）であり、成人ヘモグロビン（ＨｂＡ）と呼ばれる。β－グロビンの遺伝子（ＨＢＢ）の変異は、鎌状赤血球症（Ｓｉｃｋｌｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｅａｓｅ：ＳＣＤ）およびβ－地中海貧血症（β－ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ、単にβ－ｔｈａｌと呼ばれる）を含むβ－ヘモグロビン障害（β－ヘモグロビン症とも呼ばれる）を引き起こす可能性がある。鎌型赤血球貧血症は、β－グロビン構造遺伝子の点変異により引き起こされるものであり、異常のヘモグロビン（ＨｂＳ）を発生することがある。β－地中海貧血症は、β－グロビン遺伝子発現の一部または全部の欠陥により引き起こされるものであり、成人ヘモグロビン（ＨｂＡ）の欠陥または欠損を引き起こすことがある。ヘモグロビンのグロビン鎖の減少または欠損は、ヘモグロビンの構造が異常となることを引き起こす可能性がある。このような異常のヘモグロビンを含有する赤血球は、変形性が低下し、寿命が短く、骨髄中にインサイツ溶血が発生する可能性があり、末梢血液循環に進入した後、脾臓などの臓器により繰り上げて破壊され、貧血、体内の鉄沈着、ひいては発育異常を引き起こす可能性がある。ヘモグロビン症は、世界の数百万の人口に影響を及ぼしており、現在、毎年約３３０，０００の子供がヘモグロビン症で生まれ、人類の健康や生命を深刻に脅かしている。地中海貧血症および鎌状赤血球症の患者は、主に、規範的な長期輸血と脱鉄治療によって病状を緩和するが、このような形態によって病状が治癒できないだけでなく、高いセキュリティリスクが存在している。異体造血幹細胞移植は、現在、地中海貧血症および鎌状赤血球症を根治できる唯一の治療技術であるが、骨髄マッチング成功率が低く、および免疫拒絶リスクが存在するなどの要素の制限により、臨床では、広く適用することが困難である。その為、新たな安全的で有効な治療方法を開発する必要性が大きくなっている。
ヒトの発育過程では、ヘモグロビンは、常に、２つのα－グロビンおよび２つのβ－グロビンの形態で構成されているわけではない。胚の発育期間および出生直後、ヘモグロビンは、２つのα－グロビン鎖および２つのγ－グロビン鎖からなるテトラマーの形態（α２γ２）で存在し、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）と呼ばれ、ＨｂＡに対してより強い酸素親和力を持っている。胎児の発育に伴い、γ－グロビン遺伝子がだんだん発現せずに沈黙するが、同じゲノムサイト付近のβ－グロビン遺伝子の発現がだんだん上昇し、赤ちゃんの生後約半年以降、血液におけるヘモグロビンの成分および割合がだんだん安定し、ＨｂＦが成人ヘモグロビン（ＨｂＡ）で置換され、極めて低いレベルのＨｂＦだけが残されている（総ヘモグロビンの１％以下を占める）。
検討から分かるように、一部の人たちのうち、ある特殊なサイトに変異が現れ、γ－グロビン遺伝子転写が活性化されて、ヘモグロビンにおけるＨｂＦの割合が向上してしまう（遺伝性高胎児ヘモグロビン血症：ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ ｆｅｔａｌ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ、ＨＰＦＨとも呼ばれる）。たとえば、γ－グロビン遺伝子のプロモーター領域において幾つかの異なる種類の変異、たとえば－１１４～－１０２ １３ｂｐ ｄｅｌ ｃ ．、４ｂｐ ｄｅｌ ｃ ．－２２５～－２２２、ｃ ．－１１４Ｃ＞Ｔ、ｃ ．－１１７Ｇ＞Ａ、ｃ ．－１５８Ｃ＞Ｔ、ｃ ．－１６７Ｃ＞Ｔ、ｃ ．－１７０Ｇ＞Ａ、ｃ ．－１７５Ｔ＞Ｇ、ｃ ．－１７５Ｔ＞Ｃ、ｃ ．－１９５Ｃ＞Ｇ、ｃ ．－１９６Ｃ＞Ｔ、ｃ ．－１９８Ｔ＞Ｃ、ｃ ．－２０１Ｃ＞Ｔなどが発見されている。これらの自然に存在する変異は、異なる程度でＨｂＦの総ヘモグロビンに対する割合を向上させることができる。臨床検討から分かるように、少数のβ－地中海貧血症または鎌型赤血球貧血症の患者は、ゲノムにＨＰＦＨ変異がちょうどよく存在するため、ＨｂＦの発現がＨｂＡの不足を補い、ある程度で患者の貧血病状を軽減または緩和したり、輸血のニーズを低減したりすることができる。この発見に啓発されると、科学者らは、β－ヘモグロビン症を治療する目的を達成するために、継続して各種のＨｂＦ発現を誘導可能な方法を探索している。たとえば、現在、臨床ではヒドロキシ尿素などの薬物を用いてＨｂＦ発現を誘導してβ－ヘモグロビン症を治療することがあるが、数多くの患者に対してＨｂＦの誘導レベルが低く、患者の状況を徹底的に改善することができない。
遺伝子編集技術は、ヘモグロビン症などの遺伝病の治療に対して新希望および新方法をもたらしている。近年、遺伝子編集技術は、画期的な開発し、ゲノムにおける特定のサイトの塩基配列を人為的に変更することが可能となるとともに、ますます容易になる。現在、発展が相対的に成熟した遺伝子編集技術は、ＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ）、ＴＡＬＥＮ（転写活性因子様エフェクターヌクレアーゼ）およびＣＲＩＳＰＲ（クラスター化され、規則的に間隔が空いている短い回文の反復）／Ｃａｓシステム（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）である。特異の遺伝子編集システムを設計し、生細胞における目標ゲノムＤＮＡサイトを切断して二本鎖切断（ＤＳＢ）を形成することにより、細胞が非相同末端結合（ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ：ＮＨＥＪ）修復仕組みを利用して、ＤＮＡ欠陥を修復し、配列の挿入、欠損、塩基置換などの変異をランダム形成することができる。たとえば、遺伝子編集を行うと同時に、人為的に設計されたＤＮＡドナーテンプレート（ｄｏｎｏｒ ｔｅｍｐｌａｔｅ）を提供することにより、細胞が相同組換え修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ：ＨＤＲ）仕組みを利用して修復を完成することで、目標サイトに所望する塩基変異形態を導入することができる。
現在、遺伝子編集によって赤血球におけるＨｂＦ発現を補強する治療策略としては、国際的に幾つかの異なる方法がある。（１）ヒト２番染色体におけるＢＣＬ１１Ａ遺伝子のイントロンにおける赤血球系エンハンサー要素を削除または破壊し、赤血球におけるＢＣＬ１１Ａの発現を低減させ、ＢＣＬ１１Ａのγ－グロビン遺伝子転写に対する抑制作用を解除する。（２）γ－グロビン遺伝子のプロモーター領域における一部の配列を削除または破壊し、転写抑制因子の結合を阻止したり、自然に存在するＨＰＦＨ変異種類、たとえば－１１４～－１０２サイトの１３塩基対の削除（１３ｂｐ ｄｅｌ ｃ．）を導入したりする。（３）３．５ｋｂ～１３．６ｋｂの大きなセグメントのＤＮＡ削除を製造し、γ－グロビン遺伝子とβ－グロビンとの間の不明の抑制因子を含有する配列を削除して、γ－グロビン遺伝子が遠端ＬＣＲエンハンサーと結合することを促進する。これらの方法は、ＨｂＦ発現を活性化する効果を示しているが、その長期間効果または／および安全性がまだ明確ではなく、新たな方法をさらに開発する必要がある。
本発明は、遺伝子編集によってγ－グロビン遺伝子転写を活性化する方法を提供する。本発明は、有効な活性ＧＡＴＡ要素またはそのアンチセンス相補配列を含有する一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を利用して、遺伝子編集技術（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子編集システム）によって、γ－グロビン遺伝子のプロモーター領域における適当な箇所に少数の塩基の変異（削除、置換、挿入など）を製造し、編集した後にγ－グロビン遺伝子のプロモーター領域のセンス鎖またはアンチセンス鎖に、例えば、ＮＴＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡＲまたはＮＡＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡＲの配列構造を含む有効な活性ＧＡＴＡ要素を含有する赤血球系エンハンサーを形成することで、γ－グロビン遺伝子の成熟した赤血球における転写を促進し、赤血球におけるＨｂＦ発現を向上させることができる。そのうち、Ｗは、ＴまたはＡであり、Ｒは、ＡまたはＧであり、Ｎは、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴであり、ＣまたはＴであることがより好ましい。Ｎ（７－８）とは、７～８個の任意の塩基を指す。
図１に示すように、本発明の原理は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓなどの遺伝子編集技術に基づき、本発明に係る一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を結び付けて、ＣＤ３４＋造血幹細胞などの赤血球分化能力を有する幹細胞、前駆細胞に対して効率的な遺伝子編集を行い、コードされたヒトγ－グロビンのＨＢＧ１及びＨＢＧ２遺伝子（ヒト１１番染色体に位置する）プロモーターにおいて変異を製造し、プロモーターのセンス鎖またはアンチセンス鎖において１つのＮＴＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡＲまたはＮＡＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡＲの配列構造を人為的に創造する。当該配列は、エンハンサーとして、目的細胞が赤血球に分化した後にＧＡＴＡ１およびＴＡＬ１などの活性化因子を募集してγ－グロビン発現を促進することである。
本発明は、ＮＴＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡＲ配列、ＮＡＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡＲ配列または対応する逆相補配列を含有するｓｓＯＤＮを提供する。当該ｓｓＯＤＮは、γ－グロビン遺伝子の遺伝子編集に用いることができる。本発明では、ｓｓＯＤＮ構造には、５′相同アーム、置換配列（ＨＢＧ１またはＨＢＧ２遺伝子における１段の塩基配列を置換するために用いられる）、３′相同アームが含まれる。そのうち、前記ｓｓＯＤＮ構造におけるＮＴＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡＲ配列、ＮＡＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡＲ配列または対応する逆相補配列のうちのＧＡＴＡまたはＴＡＴＣ配列は、ｓｓＯＤＮにおける任意の箇所、たとえば置換配列、５′相同アーム、３′相同アーム、及び５′相同アームと置換配列との結合箇所、３′相同アームと置換配列との結合箇所に位置してもよい。片側の相同アームの長さは、２０～３００ｎｔであってもよい。本発明の実施例において、ｓｓＯＤＮ相同アームの長さは、４０ｎｔ程度である。本発明の一部の実施例において、前記ｓｓＯＤＮは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５で表される配列から選ばれる。そのうちの一部の実施例において、ｓｓＯＤＮの５′および３′は、チオリン酸（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）で修飾されたものである。
本発明は、γ－グロビン遺伝子編集用組成物を開示する。当該組成物には、ｓｓＯＤＮ、ｓｇＲＮＡ、およびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼが含まれる。本発明の一部の実施例において、前記遺伝子編集システムにおけるｓｇＲＮＡ標的サイトがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９のうちのいずれか１つで表される配列に位置する。本発明の一部の実施例において、前記ｓｇＲＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６のうちのいずれか１つで表される配列である。本発明の一部の実施例において、前記Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９タンパク質である。本発明において、ｇＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ、ガイドＲＮＡまたは指導ＲＮＡ）は、Ｃａｓヌクレアーゼと結合してガイドするＲＮＡであり、例えばｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ、単分子ガイドＲＮＡ）である。
本発明は、γ－グロビン遺伝子編集用電気的転写方法を開示する。当該方法は、電気的穿孔技術を用いて、ｓｓＯＤＮ、ｓｇＲＮＡ、およびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼからなる組成物をヒト造血幹細胞に効率的にトランスフェクションし、効率的な遺伝子編集を誘導する。
本発明は、造血幹細胞をさらに開示する。電気的転写方法を用いて、上記ｓｓＯＤＮ、ｓｇＲＮＡ、およびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼを含む組成物を造血幹細胞に導入し、当該細胞におけるγ－グロビン遺伝子のプロモーター領域に活性ＧＡＴＡ要素が含まれ、赤血球に分化する際にγ－グロビン遺伝子の発現を向上させることができる。
従来技術と比べ、本発明は、以下の有益な効果を有する。
本発明に係るｓｓＯＤＮは、遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮなど）と共に細胞に導入されることにより、γ－グロビン遺伝子のプロモーター領域の遺伝子編集をガイドして、特定のサイトに変異して有効な活性化作用を有するＧＡＴＡ要素（例えば、ＮＴＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡＲ配列またはＮＡＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡＲ配列）を形成することができる。本発明の一部の実施例において、電気的転写技術を用いてｓｓＯＤＮおよびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子編集システムをヒト造血幹細胞に導入し、γ－グロビン遺伝子のプロモーター領域において効率的な遺伝子編集を取得し、特定のサイトに変異を導入して所望するＮＴＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡＲ配列またはＮＡＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡＲ配列を含有する赤血球系エンハンサー要素を形成し、当該造血幹細胞が赤血球に分化した後、γ－グロビン遺伝子の発現が顕著に向上し、ヘモグロビンにおけるＨｂＦの割合が顕著に向上することができる。
本発明の技術原理を示す図である。 （Ａ）遺伝子編集標的領域ＨＢＧ１およびＨＢＧ２遺伝子－９２～－６６の間の野生株配列、用いられるｇＲＮＡ標的配列の位置、および遺伝子編集後に所望する変異配列を示す図である。 （Ｂ）遺伝子編集標的領域ＨＢＧ１およびＨＢＧ２遺伝子－１２９～－９８の間の野生株配列、用いられるｇＲＮＡ標的配列の位置、および遺伝子編集後に所望する変異配列を示す図である。 （Ｃ）遺伝子編集標的領域ＨＢＧ１およびＨＢＧ２遺伝子－１７５～－１５３の間の野生株配列、用いられるｇＲＮＡ標的配列の位置、および遺伝子編集後に所望する変異配列を示す図である。 （Ｄ）遺伝子編集標的領域ＨＢＧ１およびＨＢＧ２遺伝子－１９２～－１６０の間の野生株配列、用いられるｇＲＮＡ標的配列の位置、および遺伝子編集後に所望する変異配列を示す図である。 （Ｅ）遺伝子編集標的領域ＨＢＧ１遺伝子－４２８～－４０６およびＨＢＧ２遺伝子－４３２～－４１０の間の野生株配列、用いられるｇＲＮＡ標的配列の位置、および遺伝子編集後に所望する変異配列を示す図である。 ２９３Ｔ細胞においてＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓプラスミドをトランスフェクションすることによるＨＢＧ１およびＨＢＧ２ゲノムの編集効率データを示す図である。前記データは、２９３Ｔ細胞においてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００TMでＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓプラスミドを４日間トランスフェクションした後のゲノムＤＮＡのＩＮＤＥＬ検出結果からのものである。図において挿入欠損変異全体の占める百分率（総変異％）が示される。 ２９３Ｔ細胞においてＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓプラスミドをｓｓＯＤＮとともにトランスフェクションすることによるＨＢＧ２ゲノムの編集効率データを示す図である。前記データは、２９３Ｔ細胞においてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００TMでＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓプラスミドおよびｓｓＯＤＮを４日間トランスフェクションした後のＨＢＧ２のＩＮＤＥＬ検出結果からのものである。 Ｋ５６２細胞においてＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓプラスミドをｓｓＯＤＮとともにトランスフェクションすることによるＨＢＧ２ゲノムの編集効率データを示す図である、前記データは、Ｋ５６２細胞においてＬｏｎｚａ ４Ｄ電気的穿孔でＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓプラスミドおよびｓｓＯＤＮを４日間トランスフェクションした後のＨＢＧ２のＩＮＤＥＬ検出結果からのものである。 Ｋ５６２細胞において電気的転写でリボヌクレオチドタンパク質（ＲＮＰ）およびｓｓＯＤＮを導入した後のＨＢＧ２ゲノムの編集効率データを示す図である。前記データは、ｓｓＯＤＮおよびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ／ｓｇＲＮＡ ＲＮＰが電気的穿孔でＫ５６２細胞に導入された後の４日間後のＨＢＧ２のＩＮＤＥＬ検出結果からのものである。 （Ａ）～（Ｃ）は動員末梢血ＣＤ３４＋細胞（ｍＰＢＳＣ）において電気的転写でＲＮＰおよびｓｓＯＤＮが導入された後のＨＢＧ２遺伝子の編集効率データを示す図である。前記データは、ｓｓＯＤＮおよびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ／ｓｇＲＮＡ ＲＮＰが電気的穿孔でｍＰＢＳＣに導入されて、赤血球の分化を誘導した後の５日間後のゲノムＤＮＡのＩＮＤＥＬ検出結果からのものである。（Ａ）および（Ｂ）は、ｓａｎｇｅｒシーケンシングマップであり、（Ｃ）は、ｓｙｎｔｈｅｇｏソフトウェアにより分析されたＩＮＤＥＬ割合結果である。 動員末梢血ＣＤ３４＋細胞（ｍＰＢＳＣ）において遺伝子編集された後のγ－グロビンｍＲＮＡ発現データを示す図である。前記データは、ｓｓＯＤＮおよびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ／ｓｇＲＮＡ ＲＮＰが電気的穿孔でｍＰＢＳＣに導入された後、赤血球の分化を誘導した後の１８日間後のｍＲＮＡのｑＲＴ－ＰＣＲ検出結果からのものである。図において、γ－グロビンｍＲＮＡの発現は、ＧＡＰＤＨ発現レベルを内部参照として、編集しない細胞におけるγ－グロビンｍＲＮＡの発現を参照として標準化を行い、そのうち、ｎ＝３である。 動員末梢血ＣＤ３４＋細胞（ｍＰＢＳＣ）において遺伝子編集された後のＨｂＦ発現データを示す図である。前記データは、ｓｓＯＤＮおよびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ／ｓｇＲＮＡ ＲＮＰが電気的穿孔でｍＰＢＳＣに導入された後、赤血球の分化を誘導した後の１８日間後のＨＰＬＣでヘモグロビンを検出した検出結果からのものである。図において、ＨｂＦ発現は、総ヘモグロビンを占める百分率である。
以下、本発明を容易に理解するために、関連図面を参照しながら、本発明についてより詳しく説明する。図面において本発明の好適な実施例が示される。しかし、本発明は、数多くの異なる形態で実現することができ、本明細書に記載される実施例に限定されない。逆に、これらの実施例の提供は、本発明に係る内容に対する理解をより徹底的、全面的にすることを目的とする。
別途定義されない限り、本明細書に使用する全ての技術的用語及び科学的用語は、本発明の技術分野に属する当業者が通常理解できるものと同じ意味を有する。本明細書において、本発明の説明書に使用する用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、本発明を限定するものではない。本明細書に使用する用語「および／または」は、１つ又は複数の関連した項目における任意のもの、およびすべての組合せを含む。
以下の実施例に用いられる原料は、いずれも市販されたものである。
本明細書では、遺伝子編集技術、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ誘導遺伝子編集技術を用い、本発明に係る一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を結び付けて、ＣＤ３４＋造血幹細胞などの赤血球の分化能力を有する幹細胞、前駆細胞に対して効率的な遺伝子編集を行い、コードされたヒトγ－グロビンのＨＢＧ１およびＨＢＧ２遺伝子（ヒト１１番染色体に位置する）プロモーターにおいて変異を製造し、プロモーターのセンス鎖またはアンチセンス鎖において１つのＮＴＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡＲまたはＮＡＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡＲの配列構造（図１）を人為的に創造する。当該配列は、エンハンサーとして、目的細胞が赤血球に分化した後にＧＡＴＡ１およびＴＡＬ１などの転写活性化因子を募集してγ－グロビン発現を促進することができる。
ＧＡＴＡ－１は、赤血球システムにおいて特異性高発現の転写調節因子であり、赤血球の分化過程で重要な役割を果たす。赤血球において、α－グロビン、β－グロビン、ヘム生合成酵素などの赤血球における特異性高発現の遺伝子がいずれもＧＡＴＡ－１により直接的に転写して活性化される。ＧＡＴＡ－１は、転写因子として、選択的に染色質ＤＮＡにおけるＷＧＡＴＡＲ配列要素（そのうち、Ｗは、ＴまたはＡを代表し、Ｒは、ＡまたはＧを代表し、Ｔ／Ａ（ＧＡＴＡ）Ａ／Ｇで表されてもよく、そのアンチセンス相補配列は、ＹＴＡＴＣＷであり、そのうち、Ｙは、ＴまたはＣを代表し、Ｔ／Ｃ（ＴＡＴＣ）Ｔ／Ａで表されてもよい。これから分かるように、本発明における「アンチセンス相補」とは、本分野における通常の「逆相補」である）に結合し、例えば、ヒトβ－グロビン遺伝子のプロモーター領域にも複数のＧＡＴＡサイトが発見されている。注意すべきことに、ＧＡＴＡ配列を含有する遺伝子がＧＡＴＡ－１により活性化されるわけではない。それは、ＧＡＴＡ配列のゲノムにおける分布が非常に広く、上流・下流の配列（シス要素）と一定の形態の配列組合せ（要素組合せ）を形成して役割を果たす必要があるからである。例えば、ＧＡＴＡ配列の付近にＣＡＣＣＣまたはＧＣボックスなどのシス調節要素があり、通常、ＧＡＴＡ－１を募集して転写因子ＥＫＬＦと共同結合することができる。例えば、ＧＡＴＡ配列の付近にＥ－ｂｏｘ要素（ＣＡＧＮＴＧ、Ｎは、任意の塩基を代表する）、またはｈａｌｆ Ｅ－ｂｏｘ要素（ＮＴＧ）があれば、ＧＡＴＡ－１を募集して転写因子ＴＡＬ１と共同結合する。ＣｈＩＰ－ｓｅｑによりゲノムレベルＧＡＴＡ－１とＴＡＬ１の結合サイトを検討することによれば、約四分の三のＧＡＴＡ－１／ＴＡＬ１の共結合サイトに明らかな配列規律が存在し、ＷＧＡＴＡ配列の上流における７～８塩基に往々にしてｈａｌｆ Ｅ－ｂｏｘ要素（ＮＴＧ）が存在し、ＮＴＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡで表されてもよい。試験によると、このような配列が活性ＧＡＴＡ要素であり、赤血球における一部の遺伝子の発現を促進することができることが証明される。例えば、ＢＣＬ１１Ａイントロンにおける＋５８エンハンサーには、ＣＴＧ－Ｎ（７）－ＴＧＡＴＡＡ配列が含まれ、当該配列におけるＧＡＴＡモチーフを破壊することにより、赤血球におけるＢＣＬ１１Ａの発現を顕著に低下させることができる。
ＨＢＧ１およびＨＢＧ２遺伝子の転写開始サイトの上流における１４００塩基の配列は、類似度が非常に高く、プロモーター領域と考えられる。本願の発明者らは、検討によって、γ－グロビン遺伝子のプロモーター領域自身に複数のＧＡＴＡ配列（またはＴＡＴＣ）が含まれると同時に、非常に多くのＴＧ配列が含まれるが、γ－グロビンが成熟した赤血球においてほとんど発現しないことを発見する。本願の発明者らは、鋭意検討によって、γ－グロビン遺伝子のプロモーターにおけるＧＡＴＡ（またはＴＡＴＣ）及びＴＧ配列が位置と方向に有効な活性ＧＡＴＡ要素（例えばＴＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡＲ）を形成しないので、ＧＡＴＡ－１／ＴＡＬ１などの成熟した赤血球における高発現の転写活性化因子を募集してγ－グロビン遺伝子のプロモーター領域に結合（共結合）することができず、γ－グロビンが成熟した赤血球に沈黙し、ほとんど発現しないことを発見する。
本願の発明者らは、鋭意検討によって、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２プロモーター領域に一部のサイトが存在し、そのセンス鎖またはアンチセンス鎖における配列が少数の塩基で変更（置換、削除、挿入など）されれば、ＮＴＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡＲまたはＮＡＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡＲの配列構造を形成することができることを発見する。本願の発明者らは、遺伝子編集システムを用いてこれらのサイトを切断してＤＳＢを形成すれば、供与体ＤＮＡテンプレート（例えば、一本鎖オリゴヌクレオチド ｓｓＯＤＮ）を添加してこれらのサイトがＨＤＲ修復を行うようにガイドすることにより、一定の割合のゲノムを所望する配列構造に編集し、最終、γ－グロビン遺伝子のプロモーター領域においてＮＴＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡＲまたはＮＡＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡＲのような配列が形成されているので、エンハンサーとしてＧＡＴＡ－１／ＴＡＬ１などの成熟した赤血球における高発現の転写活性化因子を募集してγ－グロビン遺伝子のプロモーター領域に結合（共結合）することで、γ－グロビンの成熟した赤血球における高発現を促進することができると考える。
目的から見ると、遺伝子編集は、２種類に分けられる。１種類は、標的サイトの配列または構造を破坏するものであり、ノックアウト（ｋｎｏｃｋ ｏｕｔ）と呼ばれる。他の１種類は、標的サイトに特定の配列変異を導入するものであり、ノックイン（ｋｎｏｃｋ ｉｎ）と呼ばれる。特定の配列変異を導入する場合、よく見られる方法は、１つのＤＮＡドナーテンプレートを同時に導入することにより、細胞が相同組み換えの仕組みを利用して、テンプレートにおける配列をゲノムに置換し、ノックインを実現することができるものである。ＨＤＲに用いられるＤＮＡテンプレートは、プラスミドＤＮＡ、線形化二本鎖ＤＮＡ、ＡＡＶにより搬送されたＤＮＡ、または一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）であってもよい。ｓｓＯＤＮは、遺伝子編集における使用がますます多くなり、その効率が高く、合成しやすく、特に体外培養細胞における遺伝子編集に適用される。
ｓｓＯＤＮ構造には、５′相同アーム、置換配列、３′相同アームが含まれる。相同アームは、編集待ちの標的サイトの両側におけるＤＮＡ領域と相同する配列であり、染色体における目標サイトに位置決めするために用いられる。５′相同アームおよび３′相同アームは染色体において対応する配列が位置的に通常連続せず、中間で一定の間隔、例えば１～２０のヌクレオチドの間隔がある。これらの間隔配列は、遺伝子編集の標的（擬似編集配列）であり、すなわち、遺伝子編集により置換された配列である。ｓｓＯＤＮ上５′相同アームの３′末端と３′相同アームの５′末端との間の「置換配列」は、遺伝子編集が所望する結果である。遺伝子編集しながら、ｓｓＯＤＮを添加して、遺伝子編集時の相同組み換え修復を誘導し、修復の結果から、細胞ゲノムにおける擬似編集配列が置換配列に修復されることができる。ｓｓＯＤＮにおける置換配列の長さは、擬似編集配列よりも小さくてもよい。この場合、遺伝子編集の結果は、元のゲノムにおける擬似編集配列の削除または／および置換である。ｓｓＯＤＮにおける置換配列の長さは、０塩基であってもよい。この場合、ゲノムにおける擬似編集配列が削除される。ｓｓＯＤＮにおける置換配列の長さは、擬似編集配列よりも大きくてもよい。この場合、遺伝子編集の結果は、擬似編集配列が置換または／および挿入されるものである。
本発明は、「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ」、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮなどのサイト特異性ヌクレアーゼにより誘導される遺伝子編集システムに用いられる。「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ」は、遺伝子編集技術であり、様々な自然に存在するかまたは人為的に設計されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２システムなどを含むがそれらに限定されない。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の動作原理は、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ－ｄｅｒｉｖｅｄ ＲＮＡ）が塩基ペアリングによりｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＲＮＡ）と結合してｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ複合体を形成し、この複合体は、ヌクレアーゼＣａｓ９タンパク質がｃｒＲＮＡとペアリングした配列標的サイトに二本鎖ＤＮＡをせん断するようにガイドする。ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡの作用は、人為的に合成された、ガイド作用を有する一本のｓｇＲＮＡで代替することができる。他のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを使用する時に、対応するｓｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡを設計する必要がある。ＴＡＬＥＮまたはＺＦＮなどのシステムを使用する時に、本発明に係る編集サイトに基づいて対応するＴＡＬＥＮまたはＺＦＮヌクレアーゼを設計する必要がある。
実施例１：活性ＧＡＴＡ要素をγ－グロビン遺伝子のプロモーターに導入するためのｓｓＯＤＮおよびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの選別
ＨＢＧ１およびＨＢＧ２転写開始サイトの上流における約１．４ｋｂ内の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １おいよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を分析することにより、発明者は、多くのセクターにおける配列が、幾つかの塩基で変更され（置換、削除、挿入など）、ＮＴＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡＲまたはＮＡＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡＲの配列構造を形成することができることを発見した。これらのセクターにおける目標変異塩基の付近にＮＧＧ（ｓｐＣａｓ９で識別されたＰＡＭ）配列があるか否か、および切断点が編集する必要のある目標配列にちょうどよく位置するか否かを分析することにより、最終に効率的な遺伝子編集を実現する可能性が最も高い候補標的領域（図２の（Ａ）～（Ｅ））を５つ取得した。距離に応じて、転写開始サイトは、近いから遠いまで、それぞれ以下の通りである。１番領域：ＨＢＧ１およびＨＢＧ２プロモーター－９２～－６６（図２の（Ａ））、２番領域：ＨＢＧ１およびＨＢＧ２プロモーター－１２９～－９８（図２の（Ｂ））、３番領域：ＨＢＧ１およびＨＢＧ２プロモーター－１７５～－１５３（図２の（Ｃ））、４番領域：ＨＢＧ１遺伝子およびＨＢＧ２遺伝子－１９２～－１６０（図２の（Ｄ））、５番領域：ＨＢＧ１遺伝子－４２８～－４０６、およびＨＢＧ２遺伝子－４３２～－４１０（図２の（Ｅ））。
５つの候補領域内の自身の配列特徴、およびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集システムが予測する切断点の箇所によれば、分析して各領域内の配列が適当な変異目標タイプ、例えば、表１に示すもの（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３ ～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）を取得した。そのうち、下線は、置換の必要がある塩基を示し、遺伝子編集後に所望する結果である。本発明において、置換塩基の長さが０～６塩基であり、実現する効果は、削除、置換、挿入、または削除、置換、挿入の組合せである。
表１に選ばれた領域内の編集サイトの付近にＤＮＡ二本鎖を切断してＤＳＢを形成する目的を達成するために、本発明は、切断効率が高いｓｐＣａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する）を選択し、切断効率が高い可能性がある標的サイトを分析し、ｓｉｔｅ＿１～ｓｉｔｅ＿８を候補標的サイトとして選択した。識別した標的サイトＤＮＡ配列およびＰＡＭ配列（ＮＧＧ）は表２に示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２ ～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）。
表１に示される所望変異タイプ、および表２におけるｓｇＲＮＡで識別されたＤＮＡ鎖（センス鎖またはアンチセンス鎖）によれば、対応するガイド遺伝子編集を設計してｓｓＯＤＮ（表３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０ ～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５）を修復した。本発明におけるｓｓＯＤＮ構造には、５′相同アーム、置換配列、３′相同アームが含まれた。そのうち、ｓｓＯＤＮ構造におけるＮＴＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡＲ配列、ＮＡＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡＲ配列または対応する逆相補配列のうちのＧＡＴＡまたはＴＡＴＣ配列は、ｓｓＯＤＮにおける任意の箇所、たとえば置換配列、５′相同アーム、３′相同アーム、および５′相同アームと置換配列との結合箇所、３′相同アームと置換配列との結合箇所に位置してもよい。ｓｓＯＤＮ両側における相同アームは、対称的であってもよいし、非対称的であってもよい（両側における長さが異なる）。システムの比較の利便性のために、本発明において対称的な相同アームのｓｓＯＤＮを用いて試験を行った。ｓｓＯＤＮ両側における相同アームの長さが２０～３００ｎｔであってもよい。システムの比較の利便性のために、本発明の実施例において両側における相同アームの長さが約４０ｎｔのｓｓＯＤＮを用いて例示した。ｓｓＯＤＮは、編集領域ＤＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖であってもよく（相同アーム配列が対応するセンス鎖と同一であるか、アンチセンス鎖と同一である）、本発明におけるｓｓＯＤＮは、ｓｇＲＮＡの識別サイトと同一のＤＮＡ鎖をｓｓＯＤＮマスタ配列として選択した。ｓｓＯＤＮにおける配列は、両側における相同アーム配列以外、置換塩基が０、１、２、３、４、５、６の塩基であってもよく、実現した効果は、削除、置換、挿入、または削除、置換、挿入の組合せである。実現した効果は、ゲノムにおける１つ以上の塩基を変更すること、例えば１～２０塩基の削除または置換であってもよい。表３に示す配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０ ～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５）については、下線に示される塩基は、両側における相同アームであり、長さが４０ｎｔ程度であり、両側における相同アーム間の下線で示されていない塩基は、置換塩基であり、そのうち、ｓｓＯＤＮ＿１６の両側における相同アーム間の置換塩基が０である。ｓｓＯＤＮの両端における最初の３つのヌクレオチドは、チオホスフェート（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）で修飾されてｓｓＯＤＮの安定性を補強し、その遺伝子編集における活性を向上させることができる。
ｓｇＲＮＡ－ｓｐＣａｓ９担体（ＰＸ４５９、ｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）－２Ａ－Ｐｕｒｏ）を用いて表２における標的サイトに対応するｓｇＲＮＡを発現した。当該担体は、ｓｐＣａｓ９タンパク質を発現しながら、長さが１００ｎｔのｓｇＲＮＡを発現することができる。その５′端は、２０ｎｔのガイド配列である。後の８０ｎｔは、汎用のｓｇＲＮＡ骨格配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡ ＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ）である。ｓｇＲＮＡのクローン方法は、それぞれｇＲＮＡに対応するガイド鎖配列ｏｌｉｇｏ（表２における２０ｎｔ標的サイト配列と同様）および相補鎖ｏｌｉｇｏを合成した（ガイド鎖配列の５′端にｃａｃｃを導入し、ガイド鎖の５′端における１番目のヌクレオチドがグアニンＧではなければ、ガイド鎖の５′端にｃａｃｃＧを添加し、相補鎖の５′端にａａａｃを導入し、ガイド鎖の５′端に１つのＧが添加されれば、相補鎖の３′端にＣを添加してそれと相補しペアリングした）。２種類のｏｌｉｇｏを同等混合し、９５℃で熱変形焼鈍処理を行った後、制限酵素Ｂｂｓ Ｉで消化されたＰＸ４５９担体に連結し、細菌コロニーＰＣＲおよびｓａｎｇｅｒシーケンシングでクローンに成功したか否かを確定した。ＰＣＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７（５′－ ３′： ＧＧＡＣＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＴＴＡＣＣＧＴＡＡＣ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８（５′－ ３′： ＧＧＣＧＧＧＣＣＡＴＴＴＡＣＣＧＴＡＡＧ）をプライマーとして用いた。クローンに成功した後、８種類のプラスミドを取得し、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６のｓｇＲＮＡを発現した（表４）。
発現された８種類のプラスミドを２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。その方法は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００TMキットの方法をご参照ください。トランスフェクションした細胞を４日間培養し、細胞を収集してゲノムＤＮＡを抽出した。それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８を用いて、ＫＯＤ Ｐｌｕｓ高忠実度酵素ＰＣＲ法でＨＢＧ１およびＨＢＧ２プロモーター遺伝子セグメントを拡張し、得たＰＣＲ生成物を精製した後、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９を用いてシーケンシングを行った。シーケンシング結果から得たファイルに対して、ｓｙｎｔｈｅｇｏソフトウェアで遺伝子編集効率を分析した。図３に示すように、ｓｇＲＮＡ－８の編集効率が相対的に低い（約２０％）以外、他のグループにおける編集全体変異（挿入欠損、Ｉｎｄｅｌ）効率が４０～５０％程度である。
実施例２： ｓｓＯＤＮをｓｇＲＮＡ－ｓｐＣａｓ９担体とともに２９３Ｔ細胞にトランスフェクションして遺伝子編集を行う
上述した８種類のｓｇＲＮＡ－ｓｐＣａｓ９担体を適当なｓｓＯＤＮとともに２９３Ｔ細胞にトランスフェクションすることにより、ｓｓＯＤＮを添加した後に、遺伝子編集後に所望する変異タイプを形成する（ＨＤＲ修復を発生する）ようにガイドするか否かを検出した。ｓｇＲＮＡ切断点の箇所によれば、８種類のｓｇＲＮＡ－ｓｐＣａｓ９担体を、表６に示されたｓｇＲＮＡ ＋ ｓｓＯＤＮ組合せ方法に応じてそれぞれ３０種類の組合せに形成した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００TM試薬を用いて、プラスミドをトランスフェクションしながらｓｓＯＤＮを添加し、ｓｓＯＤＮをプラスミドとともに細胞に搬送した。トランスフェクションした細胞を４日間培養し、細胞を収集してゲノムＤＮＡを抽出した。ＨＢＧ１およびＨＢＧ２の遺伝子編集効率がほとんど正相関であり、往々してＨＢＧ２の遺伝子編集効率がＨＢＧ１よりもやや高いため（図３）、後続の試験においてＨＢＧ２ゲノム遺伝子編集効率のみを選択して比較した。実施例１における方法によれば、ＰＣＲでＨＢＧ２プロモーター遺伝子セグメントを拡張し、精製してシーケンシングを行った。シーケンシング結果から分かるように、ｓｙｎｔｈｅｇｏソフトウェアで遺伝子編集効率を分析することにより、ｓｓＯＤＮおよびｓｇＲＮＡ－ｓｐＣａｓ９担体を添加してトランスフェクションすることは、編集効率を向上させながら、数多くのグループにおいて１０～２０％の遺伝子編集を誘導して所望する変異タイプを形成することができる（図４）。
実施例３：電気的穿孔でｓｓＯＤＮおよびｓｇＲＮＡ－ｓｐＣａｓ９担体をＫ５６２細胞にトランスフェクションして遺伝子編集を行う
リポソーム（たとえばＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００TM試薬）を利用してプラスミドを懸濁細胞にトランスフェクションする効率が低く、通常、懸濁細胞にトランスフェクションする際に、電気的穿孔法が用いられた。実施例２における一部のｓｇＲＮＡとｓｓＯＤＮの組合せを取り、ｌｏｎｚａ－４Ｄ電気的転写装置でＫ５６２細胞に導入し、装置におけるＫ５６２細胞トランスフェクションプログラムを用いた。トランスフェクションした細胞を４日間培養し、細胞を収集してゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲでＨＢＧ２プロモーター遺伝子セグメントを拡張してシーケンシングを行った。シーケンシング結果から分かるように、ｓｙｎｔｈｅｇｏソフトウェアで遺伝子編集効率を分析し、Ｋ５６２にｓｇＲＮＡ－１、ｓｇＲＮＡ－２、ｓｇＲＮＡ－５とｓｓＯＤＮの組合せを電気的転写することにより、高い編集効率を達することができ（図５）、２９３Ｔ細胞よりもやや高く、ｓｓＯＤＮおよびｓｇＲＮＡ－ｓｐＣａｓ９担体を電気的転写して所望する変異タイプを形成するように誘導することも２９３Ｔ細胞よりもやや高い。
実施例４：電気的穿孔でｓｓＯＤＮおよびｓｐＣａｓ９タンパク質／ｓｇＲＮＡ ＲＮＰをＫ５６２細胞にトランスフェクションして効率的な遺伝子編集を実現する
プラスミド発現ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに対して、リボヌクレオチドタンパク質（ＲＮＰ）の形態で搬送するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、遺伝子編集効率が高く、アポトーシスを誘導しにくい。商業化されたｓｐＣａｓ９タンパク質、および化学合成されたｓｇＲＮＡ－１、ｓｇＲＮＡ－２、ｓｇＲＮＡ－５を用いて（配列が表４に対応するｓｇＲＮＡと同一であるが、末端が化学修飾されておらず）、それぞれ体外にＲＮＰ－１、ＲＮＰ－２、ＲＮＰ－５をインキュベーションし包装した。電気的穿孔でＲＮＰおよび一部のｓｓＯＤＮの組合せをＫ５６２細胞に搬送した。トランスフェクションした細胞を４日間培養し、細胞を収集してゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲでＨＢＧ２プロモーター遺伝子セグメントを拡張してシーケンシングを行った。シーケンシング結果から分かるように、ｓｙｎｔｈｅｇｏソフトウェアで遺伝子編集効率を分析し（図６）、ｓｓＯＤＮが添加されていない組合せに対して、Ｋ５６２にＲＮＰを電気的転写する際にｓｓＯＤＮを添加することにより、遺伝子編集効率全体を顕著に約２倍向上させることができる（図６）。それと同時に、ｓｓＯＤＮおよびＲＮＰは、より高い割合の遺伝子編集を誘導して所望する変異タイプを形成することができる（図６）。
実施例５：電気的穿孔でｓｓＯＤＮおよびｓｐＣａｓ９タンパク質／ｓｇＲＮＡ ＲＮＰをヒト造血幹細胞／前駆細胞に導入して効率的な遺伝子編集を実現し、ＨＢＧ発現を顕著に向上させる
動員末梢血に由来するヒトＣＤ３４陽性細胞（ｍＰＢＳＣ）が蘇生した後、ヒト細胞因子（ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌ、各１００ｎｇ／ｍｌ）をたくさん含んだＳｔｅｍＳｐａｎ無血清拡張培地（ＳＦＥＭ）に２日間培養し、ｌｏｎｚａ－４Ｄ電気的転写装置におけるＥＯ－１００プログラムでｓｓＯＤＮおよびｓｐＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ ＲＮＰにｍＰＢＳＣ細胞に搬送した。電気的転写が完了した後、ヒト細胞因子（ＳＣＦ／ＴＰＯ／Ｆｌｔ３Ｌ、各１００ｎｇ／ｍｌ）をたくさん含んだＳＦＥＭにおいて継続して１日間培養した後、以下の３つの段階でｍＰＢＳＣが赤血球に分化するように誘導した。第１段階：ＥＰＯ、ＳＣＦ、ヒトＡＢ血清、インシュリン、トランスフェリン、ヘパリン、ＩＬ－３、水素化コルチゾンなどの添加物を含有するＩＭＤＭ培養液に７日間培養した。分化を誘導した後の５日目、２×１０ｅ５細胞を取ってゲノムＤＮＡを抽出した後、ＰＣＲでＨＢＧ２プロモーターセグメントを拡張し、ｓａｎｇｅｒに搬送してシーケンシングを行った。Ｋ５６２細胞における結果と類似し、ｍＰＢＳＣ細胞にｓｓＯＤＮおよびｓｐＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ ＲＮＰを電気的転写することは、効率的な遺伝子編集を発生することができ、そのうちの一部のグループにおいて遺伝子編集で所望する変異タイプを形成することが３０％に達した（図７の（Ａ）～（Ｃ））。
電気的転写されたｍＰＢＳＣ細胞、および処理されていないｍＰＢＳＣ細胞（対照、ＮＣ）が第１段階に分化誘導された後の７日後、ＥＰＯ、ＳＣＦ、ヒトＡＢ血清、インシュリン、トランスフェリン、ヘパリンなどの添加物を含有するＩＭＤＭ培養液に４日間培養した。最後、ＥＰＯ、ヒトＡＢ血清、インシュリン、トランスフェリン、ヘパリンなどの添加物を含有するＩＭＤＭ培養液に７日間培養した。分化誘導した後の１８日後、電気的転写されたｍＰＢＳＣ細胞、および処理されていないｍＰＢＳＣ細胞が遠心後に明らかな濃赤色を示した。そのうち、大量の赤血球を含有し、電気的転写されたｍＰＢＳＣ細胞が正常に赤血球に分化できることが証明された。
分化誘導が終わりに近づくと、一部の細胞を取ってｍＲＮＡを抽出し、逆転写－リアルタイム定量化ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）でＨＢＧ ｍＲＮＡの発現レベルを検出した。トランスフェクションされていない細胞（ＮＣ）に対して、ＲＮＰ－２をｓｓＯＤＮ＿６、ｓｓＯＤＮ＿１３、ｓｓＯＤＮ＿１４、ｓｓＯＤＮ＿１５、ｓｓＯＤＮ＿１７とともにトランスフェクションすることにより、ＨＢＧ ｍＲＮＡの発現レベルを向上させ（図８）、ＨＢＧ ｍＲＮＡが最も高く３倍以上向上することができる。
糖化ヘモグロビンＡ１ｃ検出システム（ＶＡＲＩＡＮＴ ＩＩ ＴＵＲＢＯ ＨｂＡ１ｃ ｋｉｔ－２．０）を用いて、ＲＮＰ－２グループに電気的転写された造血幹細胞を赤血球に分化させた後のヘモグロビンに対してＨＰＬＣ法検出を行った。その結果、遺伝子編集されていない細胞に対して、ｓｓＯＤＮが添加されて遺伝子編集された後、胎児ヘモグロビンの含有量（ＨｂＦ）が顕著に向上し、２７％～３６％であり、対照グループの１３．３％に対して２倍以上向上した（図９）。
上記実施例の結果から分かるように、本発明は、従来技術と異なるγ－グロビン遺伝子発現を向上させる遺伝子編集方法を提供する。本発明に係るｓｓＯＤＮは、γ－グロビン遺伝子編集に用いられる場合、遺伝子編集した後にＨＢＧ１およびＨＢＧ２遺伝子プロモーター領域における所定のサイトに所望する変異を形成するようにガイドすることで、活性ＧＡＴＡ要素（例えば、ＮＴＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡＲ配列またはＮＡＧ－Ｎ（７－８）－ＷＧＡＴＡＲ配列）を形成することができる。当該要素は、遺伝子編集された細胞（たとえば、造血幹細胞）が赤血球に分化した後に正の調節作用を果たし、γ－グロビン遺伝子発現を活性化させたり、顕著に向上させたりすることができる。その為、本発明は、β－ヘモグロビン症の遺伝子治療において潜在的な適用価値を有する。
上記実施形態の各技術的特徴は、任意に組み合わせることができる。説明を簡単にするために、上記各実施形態における各技術的特徴の全ての組合可能な形態については記載されていないが、これら技術的特徴の組み合わせに矛盾がない限り、本明細書に記載の範囲とみなされるべきである。
上述した実施例は、本発明のいくつかの実施形態の例示にすぎず、その説明は、具体的且つ詳細であるが、本発明の範囲を限定するものではないと理解すべきである。当業者であれば、本発明の思想から逸脱しない前提で、いくつかの変形及び改善を行うことができ、これらはすべて本発明の保護範囲に属することは明らかである。したがって、本発明の保護範囲は、請求の範囲により決定されるべきである。

Claims (29)

  1. γ－グロビン遺伝子発現を活性化する方法であって、
    遺伝子編集技術によってγ－グロビン遺伝子調節領域におけるセンス鎖またはアンチセンス鎖に、ＧＡＴＡまたはＴＡＴＣ配列を人為的に導入して、γ－グロビン遺伝子の調節領域においてＧＡＴＡモチーフを含むエンハンサー要素を形成することを含む、方法。
  2. ＧＡＴＡまたはＴＡＴＣ配列の導入は、配列の削除、配列の挿入、配列の変異、またはそれらの組合せにより実現される、
    請求項１に記載の方法。
  3. ＧＡＴＡモチーフは、ＷＧＡＴＡＲ配列、または対応するアンチセンス相補配列ＹＴＡＴＣＷであり、ただし、Ｗは、ＴまたはＡであり、Ｒは、ＡまたはＧであり、Ｙは、ＴまたはＣである、
    請求項１に記載の方法。
  4. 前記エンハンサー要素には、ＮＴＧモチーフまたはＮＡＧモチーフ、または対応するアンチセンス相補配列がさらに含まれ、
    ただし、Ｎは、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴである、
    請求項１に記載の方法。
  5. 前記ＧＡＴＡモチーフとＮＴＧモチーフまたはＮＡＧモチーフとの距離が７～８塩基であり、且つ前記ＮＴＧモチーフまたはＮＡＧモチーフが前記ＧＡＴＡモチーフの上流に位置する、
    請求項４に記載の方法。
  6. ＧＡＴＡまたはＴＡＴＣ配列が含まれる、遺伝子編集用ｓｓＯＤＮ。
  7. 前記ｓｓＯＤＮには、５′相同アーム、置換配列、３′相同アームが含まれる、
    請求項６に記載のｓｓＯＤＮ。
  8. 前記ｓｓＯＤＮにおける５′相同アームと３′相同アームとが対称的または非対称的であり、５′相同アームと３′相同アームの長さが２０～３００ｎｔである、
    請求項７に記載のｓｓＯＤＮ。
  9. 前記ｓｓＯＤＮにおける５′相同アームまたは３′相同アームは、擬似編集領域ＤＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖から選ばれる、
    請求項７に記載のｓｓＯＤＮ。
  10. 前記ｓｓＯＤＮにおける置換配列の塩基の数が０～６である、
    請求項７に記載のｓｓＯＤＮ。
  11. 前記ｓｓＯＤＮにおける５′相同アームの３′末端と３′相同アームの５′末端との距離が０～２０塩基である、
    請求項７に記載のｓｓＯＤＮ。
  12. 前記ｓｓＯＤＮには、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で表される配列、またはそのアンチセンス相補配列から選ばれるものが含まれる、
    請求項６に記載のｓｓＯＤＮ。
  13. 前記ｓｓＯＤＮには、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５で表される配列、またはそのアンチセンス相補配列から選ばれるものが含まれる、
    請求項６に記載のｓｓＯＤＮ。
  14. 前記ｓｓＯＤＮが化学修飾されたものであり、その５′および３′端がホスホロチオエートで修飾されたヌクレオチドである、
    請求項６に記載のｓｓＯＤＮ。
  15. ＨＢＧ１またはＨＢＧ２調節領域におけるＤＮＡセンス鎖またはアンチセンス鎖と一部または全部相補するガイド配列が含まれる、
    ｓｇＲＮＡ。
  16. 前記ＨＢＧ１調節領域における配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で表される、
    請求項１５に記載のｓｇＲＮＡ。
  17. 前記ＨＢＧ２調節領域における配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で表される、
    請求項１５に記載のｓｇＲＮＡ。
  18. 前記ｓｇＲＮＡ分子のガイドＲＮＡ配列の対応するＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９で表される配列から選ばれるものと一部または全部同様である、請求項１５に記載のｓｇＲＮＡ。
  19. 前記ｓｇＲＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６で表される配列から選ばれるいずれか１種または複数種である、
    請求項１５に記載のｓｇＲＮＡ。
  20. 請求項６～１４のいずれか一項に記載のｓｓＯＤＮ、および標的ＨＢＧ１またはＨＢＧ２遺伝子調節領域における遺伝子編集システムが含まれる、
    遺伝子編集用組成物。
  21. 前記遺伝子編集システムは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ編集システム、ＴＡＬＥＮ編集システム、ＺＦＮ編集システムである、
    請求項２０に記載の組成物。
  22. 前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ編集システムは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２システムである、
    請求項２１に記載の組成物。
  23. 前記組成物のうち、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ編集システムは、ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質からなるリボ核タンパク質複合体である、
    請求項２１に記載の組成物。
  24. 前記組成物のうち、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ編集システムは、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡおよびｇＲＮＡからなるＲＮＡ複合体である、
    請求項２１に記載の組成物。
  25. 前記組成物のうち、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ編集システムは、Ｃａｓタンパク質およびｇＲＮＡを発現するプラスミドである、
    請求項２１に記載の組成物。
  26. 前記組成物には、請求項１５～１９のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡが含まれ、
    前記ｓｇＲＮＡは、化学合成されたもの、またはインビトロ転写されたものである、
    請求項２０に記載の組成物。
  27. γ－グロビン遺伝子を活性化するキットであって、
    （１）請求項６～１４のいずれか一項に記載のｓｓＯＤＮと、
    （２）請求項１５～１９のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡと、
    （３）Ｃａｓ９またはＣａｓ１２タンパク質を発現する担体、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２タンパク質、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２タンパク質に対応するｍＲＮＡのうちの少なくとも１種と、を含む、
    ことを特徴とするキット。
  28. 電気的転写方法により請求項２０～２６のいずれか一項に記載の組成物を造血幹細胞に導入して得られる、ことを特徴とする造血幹細胞。
  29. 請求項６～１４のいずれか一項に記載のｓｓＯＤＮ、請求項１５～１９のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡ、請求項２０～２６のいずれか一項に記載の組成物、請求項２７に記載のキット、請求項２８に記載の造血幹細胞の、β－地中海貧血症または鎌型赤血球貧血症を治療するための細胞または薬物の調製における使用。
JP2022577265A 2020-07-01 2020-07-14 γ－グロビン遺伝子発現を活性化する方法、および組成物 Pending JP2023530969A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010616648.7 2020-07-01
CN202010616648.7A CN111876416B (zh) 2020-07-01 2020-07-01 激活γ-珠蛋白基因表达的方法和组合物
PCT/CN2020/101936 WO2022000572A1 (zh) 2020-07-01 2020-07-14 激活γ-珠蛋白基因表达的方法和组合物

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023530969A true JP2023530969A (ja) 2023-07-20

Family

ID=73157578

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022577265A Pending JP2023530969A (ja) 2020-07-01 2020-07-14 γ－グロビン遺伝子発現を活性化する方法、および組成物

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20230310506A1 (ja)
EP (1) EP4177343A1 (ja)
JP (1) JP2023530969A (ja)
CN (2) CN111876416B (ja)
AU (1) AU2020455671A1 (ja)
WO (1) WO2022000572A1 (ja)
ZA (1) ZA202213480B (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022272042A2 (en) * 2021-06-25 2022-12-29 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Primordial germ cells
CN115851706A (zh) * 2021-09-24 2023-03-28 华东师范大学 一种碱基编辑系统及其应用
CN114848851A (zh) * 2022-04-29 2022-08-05 广州医科大学附属第三医院（广州重症孕产妇救治中心、广州柔济医院） 治疗β-地中海贫血的药物
CN116790593B (zh) * 2023-06-28 2024-05-10 贵州医科大学 一种激活γ珠蛋白表达的sgRNA及其CRISPR/Cas9复合体与应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2018011114A (es) * 2016-03-14 2019-02-20 Editas Medicine Inc Métodos y composiciones relacionadas con crispr/cas para el tratamiento de beta hemoglobinopatías.
WO2017191503A1 (en) * 2016-05-05 2017-11-09 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
AU2018352592A1 (en) * 2017-10-16 2020-06-04 Beam Therapeutics, Inc. Uses of adenosine base editors
CN109722414A (zh) * 2017-10-27 2019-05-07 博雅辑因（北京）生物科技有限公司 一种高效制备成熟红细胞的方法以及用于制备成熟红细胞的培养基
CN110106203B (zh) * 2019-05-24 2023-08-11 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所） 一种新型hbb过表达载体及其设计方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
ZA202213480B (en) 2023-09-27
WO2022000572A1 (zh) 2022-01-06
US20230310506A1 (en) 2023-10-05
AU2020455671A1 (en) 2023-02-02
EP4177343A1 (en) 2023-05-10
CN111876416B (zh) 2021-09-03
CN111876416A (zh) 2020-11-03
CN115943209A (zh) 2023-04-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240002843A1 (en) Compositions and methods for the treatment of hemoglobinopathies
KR102532663B1 (ko) 베타 이상헤모글로빈증의 치료를 위한 crispr/cas-관련 방법 및 조성물
AU2016225179B2 (en) Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
JP2023530969A (ja) γ－グロビン遺伝子発現を活性化する方法、および組成物
Antoniou et al. Base and prime editing technologies for blood disorders
WO2017191503A1 (en) Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
US20210180091A1 (en) Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
US20210130817A1 (en) Gene Editing System and Gene Editing Method
US20220259578A1 (en) Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
Antoniou et al. Base-editing-mediated dissection of a γ-globin cis-regulatory element for the therapeutic reactivation of fetal hemoglobin expression
CN112391410B (zh) 一种sgRNA及其在修复内含子异常剪接中的应用
Suwito et al. A Review of CRISPR Cas9 for SCA: Treatment Strategies and Could Target β-globin Gene and BCL11A Gene using CRISPR Cas9 Prevent the Patient from Sickle Cell Anemia?
EP4373846A1 (en) A method for in vivo gene therapy to cure scd without myeloablative toxicity
Suwito et al. Choirotussanijjah. A Review of CRISPR Cas9 for SCA: Treatment Strategies and Could Target β-globin Gene and BCL11A Gene using CRISPR Cas9 Prevent the Patient from Sickle Cell Anemia? Open Access Maced J Med Sci. 2023 Feb 03; 11 (F): 95-106
CN117940566A (zh) 用于治疗血红蛋白病的系统和方法
CN115873850A (zh) 腺嘌呤碱基编辑系统及其应用
CN118127006A (zh) 用于治疗β-血红蛋白病的CRISPR/CAS相关方法和组合物

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20221214

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20221214

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20231121

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240115

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20240305

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20240523